JP3425765B2 - 熱不安定性ウラシル―ｄｎａグリコシラーゼ、その生産方法およびｄｎａからウラシルを除去するためのその使用 - Google Patents
熱不安定性ウラシル―ｄｎａグリコシラーゼ、その生産方法およびｄｎａからウラシルを除去するためのその使用Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を有す
る熱不安定性酵素、グラム陽性菌から該酵素を単離する
方法、ならびにウラシルを含むDNAから、特に特異的増
幅（例:PCR）後に得られたDNA断片からウラシルを検出
または除去するための改良法に関する。
る熱不安定性酵素、グラム陽性菌から該酵素を単離する
方法、ならびにウラシルを含むDNAから、特に特異的増
幅（例:PCR）後に得られたDNA断片からウラシルを検出
または除去するための改良法に関する。
ウラシル−DNAグリコシラーゼ（UNG;EC 3.2.2.3）
は、高度に保存された、きわめて特異的な、広く行き渡
っているDNA修復酵素である。その生物学的機能はDNAか
らウラシル塩基を特異的に除去することである。シトシ
ンの自然発生的な脱アミノ化によって、またはDNA合成
中に誤ってdUTPが導入されることによって、ウラシルが
DNA中に形成されることがある。シトシンの脱アミノ化
は前突然変異誘発性（promutagenic）のU:Gミスマッチ
（誤った塩基対合）をもたらし、これは、修復されない
と、次回のDNA合成においてトランジション突然変異が
生じる（Lindahl,T.（1993）Nature 362,709−715）。
は、高度に保存された、きわめて特異的な、広く行き渡
っているDNA修復酵素である。その生物学的機能はDNAか
らウラシル塩基を特異的に除去することである。シトシ
ンの自然発生的な脱アミノ化によって、またはDNA合成
中に誤ってdUTPが導入されることによって、ウラシルが
DNA中に形成されることがある。シトシンの脱アミノ化
は前突然変異誘発性（promutagenic）のU:Gミスマッチ
（誤った塩基対合）をもたらし、これは、修復されない
と、次回のDNA合成においてトランジション突然変異が
生じる（Lindahl,T.（1993）Nature 362,709−715）。
UNGは特にPCR混合物中の汚染物を除去するためにPCR
法の枠組み内で用いられている。増幅された標的DNAに
よるPCR混合物のいわゆるキャリオーバー汚染（carry−
over contamination）は、偽陽性の結果を招くことがあ
る。このキャリオーバー汚染を制御することができる
が、そのためには、全部のPCR産物にdUTPを組み込み
（それによりdTTPがdUTPにより置換される）、すでに混
合されているPCR反応物をUNGで処理し、続いてUNGを熱
不活性化する。この方法では、UNGが全部のウラシル含
有DNAからウラシルを切断するが、天然（すなわち標
的）DNAには何の影響も及ぼさない。生じた塩基脱落部
４位（abasic site）によりDNAポリメラーゼによるDNA
の複製がブロックされる。このキャリオーバー防止技術
は、PCRから得られたPCR産物が汚染により偽陽性の結果
をもたらすのを防止する（Longoら，（1990）Gene 93,1
25−128）。この方法には通常大腸菌由来のUNGが用いら
れている（WO 92/0181,EP0 415 755）。等温増幅（isot
hermal amplification）のためのUNGの同様の使用も記
載されている（EP 0 624 643）。
法の枠組み内で用いられている。増幅された標的DNAに
よるPCR混合物のいわゆるキャリオーバー汚染（carry−
over contamination）は、偽陽性の結果を招くことがあ
る。このキャリオーバー汚染を制御することができる
が、そのためには、全部のPCR産物にdUTPを組み込み
（それによりdTTPがdUTPにより置換される）、すでに混
合されているPCR反応物をUNGで処理し、続いてUNGを熱
不活性化する。この方法では、UNGが全部のウラシル含
有DNAからウラシルを切断するが、天然（すなわち標
的）DNAには何の影響も及ぼさない。生じた塩基脱落部
４位（abasic site）によりDNAポリメラーゼによるDNA
の複製がブロックされる。このキャリオーバー防止技術
は、PCRから得られたPCR産物が汚染により偽陽性の結果
をもたらすのを防止する（Longoら，（1990）Gene 93,1
25−128）。この方法には通常大腸菌由来のUNGが用いら
れている（WO 92/0181,EP0 415 755）。等温増幅（isot
hermal amplification）のためのUNGの同様の使用も記
載されている（EP 0 624 643）。
今日知られているUNGの大部分は、一本鎖および二本
鎖DNAからウラシルを効率よく切断することに対して適
度に高い特異性を備えており、それゆえ、特異的増幅法
を最適化するためにおおむね使用可能である。対照的
に、UNGは他の「正常」なDNA塩基やRNA中のウラシルに
対してはいかなる活性も示さない。
鎖DNAからウラシルを効率よく切断することに対して適
度に高い特異性を備えており、それゆえ、特異的増幅法
を最適化するためにおおむね使用可能である。対照的
に、UNGは他の「正常」なDNA塩基やRNA中のウラシルに
対してはいかなる活性も示さない。
原核および真核生物から単離された一連のUNGならび
にウイルス由来のいくつかのUNGがすでに記載されてい
る。微生物のUNGとしては、特に大腸菌由来のもの（T.L
indahl,PNAS 71（９）,3649−3653（1974）;Lindahlら,
J.Biol.Chem.252（10）,3286−3294（1977））、枯草菌
由来のもの（Coneら,Biochemistry 16（４）,3194−320
1（1977））、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bac
illus stearothermophilus）由来のもの（Kaboevら,FEB
S Letters 132（２）,337−340（1981））、サーモトリ
ックス・チオパラ（Thermothrix thiopara）由来のもの
（Kaboevら,J.Bacteriology 164（１）,421−424（198
5））およびミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus l
uteus）由来のもの（Leblancら,J.Biol.Chem.257
（７）,3477−3483（1982））が知られている。加え
て、ヒト由来のUNG（Krokanら,Nucl.Acid Res.9（11）,
2599−2613（1981））およびウイルス由来の一部のUNG
も記載されている。さらに、UNGの特異性および触媒作
用の構造的根拠が最近になって解明された（Savvaら,Na
ture 373,487−493;Molら,Cell 80,869−878（199
5））。
にウイルス由来のいくつかのUNGがすでに記載されてい
る。微生物のUNGとしては、特に大腸菌由来のもの（T.L
indahl,PNAS 71（９）,3649−3653（1974）;Lindahlら,
J.Biol.Chem.252（10）,3286−3294（1977））、枯草菌
由来のもの（Coneら,Biochemistry 16（４）,3194−320
1（1977））、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bac
illus stearothermophilus）由来のもの（Kaboevら,FEB
S Letters 132（２）,337−340（1981））、サーモトリ
ックス・チオパラ（Thermothrix thiopara）由来のもの
（Kaboevら,J.Bacteriology 164（１）,421−424（198
5））およびミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus l
uteus）由来のもの（Leblancら,J.Biol.Chem.257
（７）,3477−3483（1982））が知られている。加え
て、ヒト由来のUNG（Krokanら,Nucl.Acid Res.9（11）,
2599−2613（1981））およびウイルス由来の一部のUNG
も記載されている。さらに、UNGの特異性および触媒作
用の構造的根拠が最近になって解明された（Savvaら,Na
ture 373,487−493;Molら,Cell 80,869−878（199
5））。
しかしながら、大部分のUNGはPCRのような増幅法のキ
ャリオーバー防止法において使用するための要件を満た
していない。というのは、それらの純度が不十分であっ
たり、その他の性質、特にそれらの熱不安定性があまり
に低かったりするからである。こうして、例えば95℃で
10分間および後続のPCRといったはげしい熱処理後でさ
えも、UNGの残留活性が依然として検出される（Thornto
nら,Bio Techniques 13（２）,180−183（1992））。UN
Gの残留活性、すなわちウラシルを含むPCR産物の連続し
た分解は、約70〜72℃の高温でPCR反応後の対応する混
合物をさらにインキュベートすることにより通常防止さ
れる。さらに、PCR混合物/PCR産物を約４℃で貯蔵する
ときでさえPCR産物がさらに分解されることが観察され
た。それゆえ、−20℃ほどのかなり低い温度で貯蔵しか
つ／またはUNGの残留活性をクロロホルムやフェノール
を添加することで阻害することが推奨されている。その
上、より適切な熱不安定性変異体の探索はまだ成功を収
めていない（Duncanら,J.Bacteriology 134（３）,1039
−1045（1978）;WO 92/01814）。
ャリオーバー防止法において使用するための要件を満た
していない。というのは、それらの純度が不十分であっ
たり、その他の性質、特にそれらの熱不安定性があまり
に低かったりするからである。こうして、例えば95℃で
10分間および後続のPCRといったはげしい熱処理後でさ
えも、UNGの残留活性が依然として検出される（Thornto
nら,Bio Techniques 13（２）,180−183（1992））。UN
Gの残留活性、すなわちウラシルを含むPCR産物の連続し
た分解は、約70〜72℃の高温でPCR反応後の対応する混
合物をさらにインキュベートすることにより通常防止さ
れる。さらに、PCR混合物/PCR産物を約４℃で貯蔵する
ときでさえPCR産物がさらに分解されることが観察され
た。それゆえ、−20℃ほどのかなり低い温度で貯蔵しか
つ／またはUNGの残留活性をクロロホルムやフェノール
を添加することで阻害することが推奨されている。その
上、より適切な熱不安定性変異体の探索はまだ成功を収
めていない（Duncanら,J.Bacteriology 134（３）,1039
−1045（1978）;WO 92/01814）。
かくして、現在入手可能なUNGの活性を完全に消し去
ることはできず、できたとしてもこのプロセス全体をさ
らに複雑にする追加の手段を用いるときに限られる。
ることはできず、できたとしてもこのプロセス全体をさ
らに複雑にする追加の手段を用いるときに限られる。
したがって、本発明の課題は、DNAからウラシルを除
去する際の現技術水準が抱えた問題点を大幅に解決また
は回避することを可能にするウラシル−DNAグリコシラ
ーゼ活性を有する酵素を提供することであった。
去する際の現技術水準が抱えた問題点を大幅に解決また
は回避することを可能にするウラシル−DNAグリコシラ
ーゼ活性を有する酵素を提供することであった。
この課題は、グラム陽性菌から95％以上の純度（SDS
−ゲル）で得られ、半減期が40℃で５分より短いか、45
℃で約２分またはそれより短い、ウラシル−DNAグリコ
シラーゼ活性を有する熱不安定性酵素により達成され
る。加えて、ミクロコッカス（Micrococcus）属のアー
スロバクター（Arthrobacter）属が特に考慮される。酵
素源として微生物DSM 10239（BMTU 3346）を用いるとき
特に有利であることが判明した。DSM 10239はドイッチ
ェ・サムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウ
ント・ゼルクルツレンGmbH（Deutsche sammlung Fur Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH）（Mascheroder
Weg 1b,D−38124 Braunschweig）に寄託されている。
−ゲル）で得られ、半減期が40℃で５分より短いか、45
℃で約２分またはそれより短い、ウラシル−DNAグリコ
シラーゼ活性を有する熱不安定性酵素により達成され
る。加えて、ミクロコッカス（Micrococcus）属のアー
スロバクター（Arthrobacter）属が特に考慮される。酵
素源として微生物DSM 10239（BMTU 3346）を用いるとき
特に有利であることが判明した。DSM 10239はドイッチ
ェ・サムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウ
ント・ゼルクルツレンGmbH（Deutsche sammlung Fur Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH）（Mascheroder
Weg 1b,D−38124 Braunschweig）に寄託されている。
本発明による酵素は通常約10℃以下、好ましくは約４
℃で精製される。最初に、当業者には公知の手段で細胞
を破壊する。これは高圧プレスまたはホモジナイザーを
使って機械的に行うことが好ましい。続いて、DNA成分
を、例えばポリミン（Polymin）沈降により、分離す
る。更なる精製のために、上清をまずヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイ
トUltrogel）にかけ、次にアニオン交換クロマトグラフ
ィー（好ましくは、Ｑ−Sepharose ff high loadによ
る）と疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。後
者のクロマトグラフィーは例えばフェニルSepharose ff
で行うことができる。
℃で精製される。最初に、当業者には公知の手段で細胞
を破壊する。これは高圧プレスまたはホモジナイザーを
使って機械的に行うことが好ましい。続いて、DNA成分
を、例えばポリミン（Polymin）沈降により、分離す
る。更なる精製のために、上清をまずヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイ
トUltrogel）にかけ、次にアニオン交換クロマトグラフ
ィー（好ましくは、Ｑ−Sepharose ff high loadによ
る）と疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。後
者のクロマトグラフィーは例えばフェニルSepharose ff
で行うことができる。
この酵素の精製についての細部は次のとおりである。
一定量の細胞を乾燥重量の形で凍結状態にてpH範囲を
約7.2〜8.0に十分に緩衝化する低濃度物質（例えば、SH
試薬を含有するリン酸緩衝液）を用いて懸濁する。次い
で、リゾチームと共にインキュベートして細胞を破壊す
る。そのためには通常約４℃で30分行うことで十分であ
る。実際の細胞破壊は例えば高圧プレスまたはホモジナ
イザーを使って機械的に行う。細胞溶解の程度は一般的
に約30％である。
約7.2〜8.0に十分に緩衝化する低濃度物質（例えば、SH
試薬を含有するリン酸緩衝液）を用いて懸濁する。次い
で、リゾチームと共にインキュベートして細胞を破壊す
る。そのためには通常約４℃で30分行うことで十分であ
る。実際の細胞破壊は例えば高圧プレスまたはホモジナ
イザーを使って機械的に行う。細胞溶解の程度は一般的
に約30％である。
核酸成分を分離するために、これらを非変性条件下で
沈降させる。この場合には希薄なポリミン溶液を用いた
段階的沈降が特に適していると判明した。短時間のイン
キュベーションと遠心分離後に、バイオマスを懸濁する
のに用いた緩衝液に対して上清を透析する。この透析は
通常約16時間で完了することがわかった。透析物はヒド
ロキシアパタイトUltrogelカラムにより分離する。いず
れの場合も、初めに、溶液（該溶液中に分離しようとす
る画分も存在する）を用いて適当なクロマトグラフィー
材料を平衡化する。酵素含有画分は約10mMから1Mの直線
勾配の緩衝液（例えば、約pH7.5のリン酸緩衝液）によ
り溶出される。酵素含有画分を合わせ、約pH8.0に緩衝
化する溶液に対して透析する。この場合の緩衝液として
は、トリス/HClや、pH7.8〜8.4の緩衝能を有するトリエ
タノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミンまたは
その他の有機もしくは無機緩衝液も適している。透析物
を合わせた後、この透析物緩衝液で平衡化したアニオン
交換カラム（例えば、Ｑ−Sepharose ff high load）に
かけ、次第に濃度を高めた塩化ナトリウムの直線勾配を
用いて溶出する。溶出液画分を合わせ、硫酸アンモニウ
ム（最終濃度:1.3M）と混合して疎水性のカラム材料に
アプライする。この場合のカラム材料としてフェニルSe
pharose ffが特に適しているとわかった。このカラム材
料を、特に約1Mの硫酸アンモニウムを追加的に含有する
リン酸カリウム緩衝液のような緩衝液で平衡化する。カ
ラム材料にローディングした後、漸増量のグリセロール
を含有する直線勾配を用いて約pH6.0で溶出する。適当
な酵素活性をもつ画分を合わせ、少なくとも100mMの塩
化ナトリウムと少なくとも40％のグリセロールを含有す
る適当な緩衝系に対して透析する。この透析緩衝液は酵
素の保存緩衝液としても適していることがわかった。た
だし、その混合物が弱アルカリ性pH範囲に緩衝化する約
10〜250mMの緩衝物質、例えばHepes、Trisまたはトリエ
タノールアミン、約0.1〜5mMの有機錯化剤（例:EDT
A）、約0.5〜5.0mMの濃度のSH基を安定化するまたはSS
基を還元する試薬、200〜350mMの塩化ナトリウムおよび
約45〜55％のグリセロールから構成される場合である。
約300mMの塩化ナトリウムと約50％（v/v）のグリセロー
ルと場合により約0.1〜5.0mg/mlのウシ血清アルブミン
を含有する混合物は酵素の保存に特に有利であることが
判明した。UNG酵素を、顕著な活性の低下なしに、この
ような緩衝液中約＋４℃から−20℃で最高１年間保存す
ることができる。
沈降させる。この場合には希薄なポリミン溶液を用いた
段階的沈降が特に適していると判明した。短時間のイン
キュベーションと遠心分離後に、バイオマスを懸濁する
のに用いた緩衝液に対して上清を透析する。この透析は
通常約16時間で完了することがわかった。透析物はヒド
ロキシアパタイトUltrogelカラムにより分離する。いず
れの場合も、初めに、溶液（該溶液中に分離しようとす
る画分も存在する）を用いて適当なクロマトグラフィー
材料を平衡化する。酵素含有画分は約10mMから1Mの直線
勾配の緩衝液（例えば、約pH7.5のリン酸緩衝液）によ
り溶出される。酵素含有画分を合わせ、約pH8.0に緩衝
化する溶液に対して透析する。この場合の緩衝液として
は、トリス/HClや、pH7.8〜8.4の緩衝能を有するトリエ
タノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミンまたは
その他の有機もしくは無機緩衝液も適している。透析物
を合わせた後、この透析物緩衝液で平衡化したアニオン
交換カラム（例えば、Ｑ−Sepharose ff high load）に
かけ、次第に濃度を高めた塩化ナトリウムの直線勾配を
用いて溶出する。溶出液画分を合わせ、硫酸アンモニウ
ム（最終濃度:1.3M）と混合して疎水性のカラム材料に
アプライする。この場合のカラム材料としてフェニルSe
pharose ffが特に適しているとわかった。このカラム材
料を、特に約1Mの硫酸アンモニウムを追加的に含有する
リン酸カリウム緩衝液のような緩衝液で平衡化する。カ
ラム材料にローディングした後、漸増量のグリセロール
を含有する直線勾配を用いて約pH6.0で溶出する。適当
な酵素活性をもつ画分を合わせ、少なくとも100mMの塩
化ナトリウムと少なくとも40％のグリセロールを含有す
る適当な緩衝系に対して透析する。この透析緩衝液は酵
素の保存緩衝液としても適していることがわかった。た
だし、その混合物が弱アルカリ性pH範囲に緩衝化する約
10〜250mMの緩衝物質、例えばHepes、Trisまたはトリエ
タノールアミン、約0.1〜5mMの有機錯化剤（例:EDT
A）、約0.5〜5.0mMの濃度のSH基を安定化するまたはSS
基を還元する試薬、200〜350mMの塩化ナトリウムおよび
約45〜55％のグリセロールから構成される場合である。
約300mMの塩化ナトリウムと約50％（v/v）のグリセロー
ルと場合により約0.1〜5.0mg/mlのウシ血清アルブミン
を含有する混合物は酵素の保存に特に有利であることが
判明した。UNG酵素を、顕著な活性の低下なしに、この
ような緩衝液中約＋４℃から−20℃で最高１年間保存す
ることができる。
本発明の方法を用いると、UNG酵素が95％以上の純度
（SDS−PAGEによる）で得られる。この方法で単離され
た酵素は約37℃の至適温度、約pH6.5の至適pHで比活性
が少なくとも５×104unit/mgである。この酵素の見かけ
分子量は、SDS−PAGEで測定して約23400ダルトンであっ
て、23000〜24000ダルトンの範囲である。
（SDS−PAGEによる）で得られる。この方法で単離され
た酵素は約37℃の至適温度、約pH6.5の至適pHで比活性
が少なくとも５×104unit/mgである。この酵素の見かけ
分子量は、SDS−PAGEで測定して約23400ダルトンであっ
て、23000〜24000ダルトンの範囲である。
本発明による酵素の更なる利点は、それが外来酵素活
性をほとんど含んでいない点である。すなわち、UNGの
総活性に対して２％未満、多くの場合には0.1％未満の
外来酵素活性しか存在しないことを明らかにすることが
できた。とりわけ、次の酵素の活性が検出されなかっ
た。すなわち、DNアーゼ、ニッキング（nicking）活
性、一本鎖DNアーゼ、RNアーゼおよびエキソヌクレアー
ゼである。
性をほとんど含んでいない点である。すなわち、UNGの
総活性に対して２％未満、多くの場合には0.1％未満の
外来酵素活性しか存在しないことを明らかにすることが
できた。とりわけ、次の酵素の活性が検出されなかっ
た。すなわち、DNアーゼ、ニッキング（nicking）活
性、一本鎖DNアーゼ、RNアーゼおよびエキソヌクレアー
ゼである。
本発明によるUNG酵素の更なる利点は、その熱安定性
が低いことである。約40℃では該酵素の半減期は５分未
満であり、一方約45℃でインキュベートしたときには約
２分またはそれ以下、しばしば約60秒またはそれ以下の
半減期が測定された。これらの安定性データは、塩化マ
グネシウムと塩化カリウムを追加的に含むトリス/HCl緩
衝液（pH範囲8.3〜8.9）中で測定されたものである。
が低いことである。約40℃では該酵素の半減期は５分未
満であり、一方約45℃でインキュベートしたときには約
２分またはそれ以下、しばしば約60秒またはそれ以下の
半減期が測定された。これらの安定性データは、塩化マ
グネシウムと塩化カリウムを追加的に含むトリス/HCl緩
衝液（pH範囲8.3〜8.9）中で測定されたものである。
本発明によるUNGは、ウラシルを含有するDNAを検出し
たり、DNAから特にウラシルを含有するPCR産物からウラ
シル塩基を除去するのに適している。そのためには、UN
GをpH7.5〜9.2に緩衝化する系中に入れる。その場合、P
CRに使用される当業者に公知の緩衝系が特に適している
ことがわかった（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,
T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Co
ld Spring Harbor Laboratory press,1989）。とりわ
け、30mM以上の塩化カリウムと約0.5〜3mMの塩化マグネ
シウムを追加した５〜100mMの濃度範囲のトリス−HClの
ような有機または無機緩衝液が有利であるとわかった。
UNGは好ましくは約５〜40U/ml、特に好ましくは約20U/m
lの濃度とする。たいていの場合、ウラシルを含有する
汚染性DNAを分解するには、約10〜30℃の温度で約１〜3
0分インキュベートすることで十分であることがわかっ
た。続いて、それを約１〜10分間、好ましくは約２分
間、約95℃に加熱することによりUNGを失活させる。こ
の方法において、本発明によるUNGは数時間（約４時
間）の比較的長時間にわたり（約４℃で）インキュベー
トした後にいかなる残留活性も含まないという利点を有
することが判明した。この性質はいわゆるキャリーオー
バー防止法において特に有利であることが見いだされ
た。なぜならば、公知のUNG、例えば大腸菌から得られ
たUNG酵素は熱処理によって容易には失活させることが
できず、そのため相当高い残留活性が依然存在するから
である。その上、本発明による酵素を用いてDNA（例え
ば、PCR産物）を処理した後に存在する比較的低い残留
活性は、保存可能性の向上または長期化といった面でも
有利である。
たり、DNAから特にウラシルを含有するPCR産物からウラ
シル塩基を除去するのに適している。そのためには、UN
GをpH7.5〜9.2に緩衝化する系中に入れる。その場合、P
CRに使用される当業者に公知の緩衝系が特に適している
ことがわかった（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,
T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Co
ld Spring Harbor Laboratory press,1989）。とりわ
け、30mM以上の塩化カリウムと約0.5〜3mMの塩化マグネ
シウムを追加した５〜100mMの濃度範囲のトリス−HClの
ような有機または無機緩衝液が有利であるとわかった。
UNGは好ましくは約５〜40U/ml、特に好ましくは約20U/m
lの濃度とする。たいていの場合、ウラシルを含有する
汚染性DNAを分解するには、約10〜30℃の温度で約１〜3
0分インキュベートすることで十分であることがわかっ
た。続いて、それを約１〜10分間、好ましくは約２分
間、約95℃に加熱することによりUNGを失活させる。こ
の方法において、本発明によるUNGは数時間（約４時
間）の比較的長時間にわたり（約４℃で）インキュベー
トした後にいかなる残留活性も含まないという利点を有
することが判明した。この性質はいわゆるキャリーオー
バー防止法において特に有利であることが見いだされ
た。なぜならば、公知のUNG、例えば大腸菌から得られ
たUNG酵素は熱処理によって容易には失活させることが
できず、そのため相当高い残留活性が依然存在するから
である。その上、本発明による酵素を用いてDNA（例え
ば、PCR産物）を処理した後に存在する比較的低い残留
活性は、保存可能性の向上または長期化といった面でも
有利である。
本発明はさらに、特定の核酸断片を増幅するためのキ
ット（試薬）、特に上記の改善されたキャリオーバー防
止条件下でPCRを実施するためのキットに関する。通常
のヌクレオシド三リン酸に加えて、キットはヌクレオシ
ド三リン酸dUTP、耐熱性ポリメラーゼ、本発明による熱
不安定性UNG、ならびに適当な反応緩衝液を含んでな
る。とりわけ、このキットは0.1〜5U/μｌの濃度で熱不
安定性UNGを含有する。加えて、このキットは10mMの濃
度でヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dGTPを含み、さ
らに30mMの濃度でヌクレオシド三リン酸dUTPを含有す
る。その上、このキットは汚染除去、UNGの熱失活およ
びPCRを実施するための緩衝液を含有する。この緩衝液
はpH7.5〜9.2の範囲の弱アルカリ性、好ましくはpH8.3
〜8.9に緩衝化される。この場合、適当な緩衝液は例え
ば10mM Tris/HClである。さらに、この緩衝液は約10〜1
00mMのKCl（50mMが好適である）と1.0〜5mMのMgCl2を含
有する。使用するのに適したポリメラーゼは、テルムス
・アクアチクス（Thermus aquaticus）から単離されたT
aq−DNAポリメラーゼであり、その濃度は２〜10U/μ
ｌ、好ましくは5U/μｌである。
ット（試薬）、特に上記の改善されたキャリオーバー防
止条件下でPCRを実施するためのキットに関する。通常
のヌクレオシド三リン酸に加えて、キットはヌクレオシ
ド三リン酸dUTP、耐熱性ポリメラーゼ、本発明による熱
不安定性UNG、ならびに適当な反応緩衝液を含んでな
る。とりわけ、このキットは0.1〜5U/μｌの濃度で熱不
安定性UNGを含有する。加えて、このキットは10mMの濃
度でヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dGTPを含み、さ
らに30mMの濃度でヌクレオシド三リン酸dUTPを含有す
る。その上、このキットは汚染除去、UNGの熱失活およ
びPCRを実施するための緩衝液を含有する。この緩衝液
はpH7.5〜9.2の範囲の弱アルカリ性、好ましくはpH8.3
〜8.9に緩衝化される。この場合、適当な緩衝液は例え
ば10mM Tris/HClである。さらに、この緩衝液は約10〜1
00mMのKCl（50mMが好適である）と1.0〜5mMのMgCl2を含
有する。使用するのに適したポリメラーゼは、テルムス
・アクアチクス（Thermus aquaticus）から単離されたT
aq−DNAポリメラーゼであり、その濃度は２〜10U/μ
ｌ、好ましくは5U/μｌである。
かくして、要約すると、ウラシル−DNAグリコシラー
ゼ活性を有する本発明による熱不安定性酵素は、公知の
酵素よりも熱処理により失活させることが驚くほど簡単
である。さらに、キャリオーバー防止法において本発明
による酵素を使用することで、PCRを実施した後に実質
的により低い残留活性が存在することを示すことができ
た。これにより、PCR産物の量および質の面での相当の
向上が達成される。なぜならば、特に、ウラシルを含有
するPCR産物がUNGの残留活性（および／または再活性
化）のためにPCR後に分解されないからである。
ゼ活性を有する本発明による熱不安定性酵素は、公知の
酵素よりも熱処理により失活させることが驚くほど簡単
である。さらに、キャリオーバー防止法において本発明
による酵素を使用することで、PCRを実施した後に実質
的により低い残留活性が存在することを示すことができ
た。これにより、PCR産物の量および質の面での相当の
向上が達成される。なぜならば、特に、ウラシルを含有
するPCR産物がUNGの残留活性（および／または再活性
化）のためにPCR後に分解されないからである。
図面の説明
図１
DSM 10239および大腸菌に由来するUNGの熱失活の比
較。
較。
それぞれの場合に、PCR緩衝液100μｌ中にDSM 10239由
来または大腸菌由来のUNGを1U加えて、40または45℃で
インキュベートした。所定の時間にサンプルを採取し、
残留活性を測定した。DSM 10239由来のUNG:−▲−（40
℃）、−■−（45℃）；大腸菌由来のUNG:−△−（40
℃）、−□−（45℃） 図2A 熱失活およびPCR後のUNGの残留活性の測定。
来または大腸菌由来のUNGを1U加えて、40または45℃で
インキュベートした。所定の時間にサンプルを採取し、
残留活性を測定した。DSM 10239由来のUNG:−▲−（40
℃）、−■−（45℃）；大腸菌由来のUNG:−△−（40
℃）、−□−（45℃） 図2A 熱失活およびPCR後のUNGの残留活性の測定。
それぞれの場合に、PCR混合物にDSM 10239由来または大
腸菌由来のUNGを2U加えた。その後UNGを95℃で２分失活
させた。続いて、PCR（長さが103塩基対の断片を用いて
増幅）を実施した。PCR後サンプルを４℃に冷却した。
レーンA1〜４はDSM 10239由来のUNGを含有する混合物の
実験を示す。レーンB1〜４は大腸菌由来のUNGの対応す
る実験を示し、レーンC1〜４はUNGを含まない対照混合
物を示す。レーンA1、B1、C1はインキュベーション時間
Ｔ＝０のサンプルを示し、レーンA2、B2、C2はインキュ
ベーション時間Ｔ＝１時間後のサンプルを示し、レーン
A3、B3、C3は４時間のインキュベート後のサンプルを示
し、そしてレーンA4、B4、C4は16時間のインキュベート
後のサンプルを示す。大腸菌由来のUNGの場合は、この
ような分解産物がＴ＝０の時点ですでに存在する。レー
ンＤおよびＥは、DSM 10239由来のUNG（レーンＤ）およ
び大腸菌由来のUNG（レーンＥ）をPCR後に添加したとき
のPCR産物分解の時間経過を示す。
腸菌由来のUNGを2U加えた。その後UNGを95℃で２分失活
させた。続いて、PCR（長さが103塩基対の断片を用いて
増幅）を実施した。PCR後サンプルを４℃に冷却した。
レーンA1〜４はDSM 10239由来のUNGを含有する混合物の
実験を示す。レーンB1〜４は大腸菌由来のUNGの対応す
る実験を示し、レーンC1〜４はUNGを含まない対照混合
物を示す。レーンA1、B1、C1はインキュベーション時間
Ｔ＝０のサンプルを示し、レーンA2、B2、C2はインキュ
ベーション時間Ｔ＝１時間後のサンプルを示し、レーン
A3、B3、C3は４時間のインキュベート後のサンプルを示
し、そしてレーンA4、B4、C4は16時間のインキュベート
後のサンプルを示す。大腸菌由来のUNGの場合は、この
ような分解産物がＴ＝０の時点ですでに存在する。レー
ンＤおよびＥは、DSM 10239由来のUNG（レーンＤ）およ
び大腸菌由来のUNG（レーンＥ）をPCR後に添加したとき
のPCR産物分解の時間経過を示す。
図2B
図2Aと同様の実験手順。ただし、UNGの失活時間を95
℃で10分とした。レーンＡ、Ｂは図2AのレーンＡ、Ｂに
対応する。DSM 10239由来のUNGは、Ｔ＝０とＴ＝４時間
の範囲でPCR断片のいかなる分解産物も含まないことが
はっきりとわかる。
℃で10分とした。レーンＡ、Ｂは図2AのレーンＡ、Ｂに
対応する。DSM 10239由来のUNGは、Ｔ＝０とＴ＝４時間
の範囲でPCR断片のいかなる分解産物も含まないことが
はっきりとわかる。
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
実施例１
熱不安定性ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性の精製
酵素単位の定義：
1Uとは、一本鎖のウラシル含有DNA（DUT陰性、UNG陰
性の大腸菌CJ236中で生育させたバクテリオファージM1
3）１μｇを37℃、60分で完全に分解するのに要するウ
ラシル−DNAグリコシラーゼの量として定義される。
性の大腸菌CJ236中で生育させたバクテリオファージM1
3）１μｇを37℃、60分で完全に分解するのに要するウ
ラシル−DNAグリコシラーゼの量として定義される。
試験容量:50μｌ濃度60mM Tris/HCl,pH8.0;1mM EDTA,
1mM DTT,0.1mg/ml BSA 37℃で60分インキュベートした後、16.5μｌのM NaOHを
加えて37℃で５分インキュベートし、その後氷上で停止
させ、続いて16.5μｌの0.6M HClを加えた。それを１％
アガロースゲル上で評価した。
1mM DTT,0.1mg/ml BSA 37℃で60分インキュベートした後、16.5μｌのM NaOHを
加えて37℃で５分インキュベートし、その後氷上で停止
させ、続いて16.5μｌの0.6M HClを加えた。それを１％
アガロースゲル上で評価した。
精製：
ウラシル−DNAグリコシラーゼの精製は４℃で行っ
た。ここに記載する方法はDSM 10239からのウラシルグ
リコシラーゼの精製に関する。
た。ここに記載する方法はDSM 10239からのウラシルグ
リコシラーゼの精製に関する。
精製法は次のステップを含んでなる：
高圧プレスでの細胞の破壊、DNAを分離するためのポ
リミン（Polymin）沈降、HA−Ultrogel上でのクロマト
グラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Se
pharose ff high load）および疎水性相互作用クロマト
グラフィー（フェニルSepharose ff）によるUNGの精
製。
リミン（Polymin）沈降、HA−Ultrogel上でのクロマト
グラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Se
pharose ff high load）および疎水性相互作用クロマト
グラフィー（フェニルSepharose ff）によるUNGの精
製。
溶液：
緩衝液1:10mMリン酸カリウム,pH7.5,1mM β−メルカ
プトエタノール 緩衝液2:10mM Tris/HCl,pH8.0/4℃,1mM β−メルカプ
トエタノール 緩衝液3:100mMリン酸カリウム,pH6.0,1M硫酸アンモニ
ウム,1mM β−メルカプトエタノール 緩衝液4:100mMリン酸カリウム,pH6.0,10％グリセロー
ル,1mM β−メルカプトエタノール 保存緩衝液:50mM Hepes/KOH,pH8.0,1mM EDTA,1mM DT
T,300mM NaCl,50％グリセロール 40％のバイオマス（乾燥重量）を400mlの緩衝液１と
混合し、解凍し、懸濁した。この懸濁液に100mgのリゾ
チームを加え、４℃で30分攪拌した。続いて、細胞を高
圧プレスに２回通過させて破壊した。この方法では圧力
を550kg/cm2とした。こうした条件の下での細胞溶解の
程度は通常20〜30％である。
プトエタノール 緩衝液2:10mM Tris/HCl,pH8.0/4℃,1mM β−メルカプ
トエタノール 緩衝液3:100mMリン酸カリウム,pH6.0,1M硫酸アンモニ
ウム,1mM β−メルカプトエタノール 緩衝液4:100mMリン酸カリウム,pH6.0,10％グリセロー
ル,1mM β−メルカプトエタノール 保存緩衝液:50mM Hepes/KOH,pH8.0,1mM EDTA,1mM DT
T,300mM NaCl,50％グリセロール 40％のバイオマス（乾燥重量）を400mlの緩衝液１と
混合し、解凍し、懸濁した。この懸濁液に100mgのリゾ
チームを加え、４℃で30分攪拌した。続いて、細胞を高
圧プレスに２回通過させて破壊した。この方法では圧力
を550kg/cm2とした。こうした条件の下での細胞溶解の
程度は通常20〜30％である。
続いてポリミン沈降を行った。10％ポリミン−Ｐ溶液
10mlを滴下した。沈降が不完全な場合は、ポリミンを各
回2mlを再添加した。滴定が完了した後、沈降物を４℃
で約30分静置させた。その後この懸濁液を13,000×ｇ、
４℃で30分遠心した。遠心分離の上清を合計５×５リッ
トルの緩衝液１に対して透析した（持続時間16時間）。
透析物を緩衝液１で平衡化したHA−Ultrogelカラム（2.
6×10cm）にアプライし、約500mlの緩衝液１で洗った。
続いて、緩衝液１と緩衝液１＋1Mリン酸カリウム,pH7.5
の直線勾配を用いて全容量1.5リットルで酵素を溶出し
た。
10mlを滴下した。沈降が不完全な場合は、ポリミンを各
回2mlを再添加した。滴定が完了した後、沈降物を４℃
で約30分静置させた。その後この懸濁液を13,000×ｇ、
４℃で30分遠心した。遠心分離の上清を合計５×５リッ
トルの緩衝液１に対して透析した（持続時間16時間）。
透析物を緩衝液１で平衡化したHA−Ultrogelカラム（2.
6×10cm）にアプライし、約500mlの緩衝液１で洗った。
続いて、緩衝液１と緩衝液１＋1Mリン酸カリウム,pH7.5
の直線勾配を用いて全容量1.5リットルで酵素を溶出し
た。
流量は5ml/分とし、画分サイズは10ml/画分とした。
酵素は50〜150mMのリン酸カリウムにおいて溶出され
た。プールした溶液を４×２リットルの緩衝液２に対し
て透析した。透析した溶液を緩衝液２で平衡化したＱ−
Sepharose ff high load（2.6×10cm）にアプライし、
このカラムを約500mlの緩衝液２で洗った。
た。プールした溶液を４×２リットルの緩衝液２に対し
て透析した。透析した溶液を緩衝液２で平衡化したＱ−
Sepharose ff high load（2.6×10cm）にアプライし、
このカラムを約500mlの緩衝液２で洗った。
続いて、緩衝液２と緩衝液２＋1M NaClの直線勾配を
用いて全容量1.5リットルで酵素を溶出した。流量は約1
0.0ml/分とし、画分サイズは10mlとした。
用いて全容量1.5リットルで酵素を溶出した。流量は約1
0.0ml/分とし、画分サイズは10mlとした。
酵素は200〜300mMのNaCl濃度で溶出された。
プールした画分に４℃で攪拌しながら固体の硫酸アン
モニウムを1.3Mの最終濃度となるまで添加し、溶解し
た。この溶液を緩衝液３で平衡化したフェニルSepharos
e ffカラム（1.6×10cm）にアプライした。約200mlの緩
衝液３で洗浄した後、緩衝液３と緩衝液４の直線勾配を
用いて容量100mlで酵素を溶出した。流量は約2.5ml/分
とし、画分サイズは4mlとした。活性画分を合わせ、保
存緩衝液に対して透析した。精製されたUNGは＋４℃か
ら−20℃の間の保存緩衝液中で安定していた。
モニウムを1.3Mの最終濃度となるまで添加し、溶解し
た。この溶液を緩衝液３で平衡化したフェニルSepharos
e ffカラム（1.6×10cm）にアプライした。約200mlの緩
衝液３で洗浄した後、緩衝液３と緩衝液４の直線勾配を
用いて容量100mlで酵素を溶出した。流量は約2.5ml/分
とし、画分サイズは4mlとした。活性画分を合わせ、保
存緩衝液に対して透析した。精製されたUNGは＋４℃か
ら−20℃の間の保存緩衝液中で安定していた。
上記の方法により、分子量約23.4kdaのウラシル−DNA
グリコシラーゼが95％以上の純度（８〜25％のSDS−PAG
E,Pharmaciaからのphastgel,Phastgelsystem）および５
×104unit/mg以上の比活性（クーマシーによるタンパク
質定量）でもって得られる。さらに、この酵素は汚染性
の外来酵素活性（ニッキング活性、エキソヌクレアーゼ
およびエンドヌクレアーゼ）を含んでいない。
グリコシラーゼが95％以上の純度（８〜25％のSDS−PAG
E,Pharmaciaからのphastgel,Phastgelsystem）および５
×104unit/mg以上の比活性（クーマシーによるタンパク
質定量）でもって得られる。さらに、この酵素は汚染性
の外来酵素活性（ニッキング活性、エキソヌクレアーゼ
およびエンドヌクレアーゼ）を含んでいない。
汚染性外来酵素活性の測定：
混入している外来酵素活性の存在を調べる試験は、10
mM Tris−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mM DTEを含有する溶
液中で実施した。個々の酵素画分（20μｌ）を適当な核
酸と共にインキュベートした。いわゆるニッキング活性
の測定には、１μｇのpBR322を37℃で16時間インキュベ
ートした。一本鎖および二本鎖ヌクレアーゼは、M13mp9
−ss DNAと、対応してλ/EcoR I,Hind IIを用いて試験
した。インキュベーションは37℃で16時間行った。サン
プルを５μｇのMS 2RNAと共に37℃で１時間インキュベ
ートすることでRNアーゼが存在しないことを調べた。エ
キソヌクレアーゼの試験では、サンプルを１μｇの
［3H］標識DNAと共に37℃で４時間インキュベートし、
放出された［3H］標識ヌクレオチドを測定した。
mM Tris−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mM DTEを含有する溶
液中で実施した。個々の酵素画分（20μｌ）を適当な核
酸と共にインキュベートした。いわゆるニッキング活性
の測定には、１μｇのpBR322を37℃で16時間インキュベ
ートした。一本鎖および二本鎖ヌクレアーゼは、M13mp9
−ss DNAと、対応してλ/EcoR I,Hind IIを用いて試験
した。インキュベーションは37℃で16時間行った。サン
プルを５μｇのMS 2RNAと共に37℃で１時間インキュベ
ートすることでRNアーゼが存在しないことを調べた。エ
キソヌクレアーゼの試験では、サンプルを１μｇの
［3H］標識DNAと共に37℃で４時間インキュベートし、
放出された［3H］標識ヌクレオチドを測定した。
実施例２
UNGの熱不安定性
DSM 10239由来のUNGの熱不安定性（熱によって失活さ
れる能力）を放射性試験系を用いて測定した。
れる能力）を放射性試験系を用いて測定した。
そのために、放射性試験基質をランダム・プライムド
・ラベリング（random primed labelling）により作製
した。5mlの反応容量中には、2.5mgのウシ胸腺DNA、0.5
μＭずつのdCTP,dATP,dGTP、2.6nMの3H−dUTP、23nMのd
UTP、1mlのヘキサヌクレオチド混合物（62.5OD/ml）お
よび5KUのクレノウ断片が含まれていた。この反応混合
物を37℃で１時間インキュベートした。組み込まれなか
ったヌクレオチドをSephadex G50（2.5×10cm）（４℃
の10mM Tris/HCl,pH8.0で平衡化したSephadex G50）で
のクロマトグラフィーにより分離した。標識DNAを含む
画分を回収し、凍結乾燥により濃縮した。
・ラベリング（random primed labelling）により作製
した。5mlの反応容量中には、2.5mgのウシ胸腺DNA、0.5
μＭずつのdCTP,dATP,dGTP、2.6nMの3H−dUTP、23nMのd
UTP、1mlのヘキサヌクレオチド混合物（62.5OD/ml）お
よび5KUのクレノウ断片が含まれていた。この反応混合
物を37℃で１時間インキュベートした。組み込まれなか
ったヌクレオチドをSephadex G50（2.5×10cm）（４℃
の10mM Tris/HCl,pH8.0で平衡化したSephadex G50）で
のクロマトグラフィーにより分離した。標識DNAを含む
画分を回収し、凍結乾燥により濃縮した。
試験手順：
試験混合物（50μｌ）は、５μｌの標識ウシ胸腺DNA
（10,000cpmが0.82pMolの3H−ウラシルに相当する）,60
mM Tris/HCl,pH8.0,1mM EDTA,1mM DTT,0.1mg/ml BSAを
含んでいた。適当に希釈したUNGを添加した後、この反
応混合物を37℃で10分インキュベートした。
（10,000cpmが0.82pMolの3H−ウラシルに相当する）,60
mM Tris/HCl,pH8.0,1mM EDTA,1mM DTT,0.1mg/ml BSAを
含んでいた。適当に希釈したUNGを添加した後、この反
応混合物を37℃で10分インキュベートした。
続いて、氷上で反応を停止させ、100μｌの沈降DNA
（1mg/ml）を加え、300μｌの10％トリクロロ酢酸（TC
A）を加えた。氷上（４℃）で10分インキュベートした
後、それを卓上遠心機で５分遠心し、シンチレーション
計数管で計測するために400μｌの上清を使用した。
（1mg/ml）を加え、300μｌの10％トリクロロ酢酸（TC
A）を加えた。氷上（４℃）で10分インキュベートした
後、それを卓上遠心機で５分遠心し、シンチレーション
計数管で計測するために400μｌの上清を使用した。
キャリオーバー防止法においては、PCR用の適当な緩
衝液中でUNGを使用した。それゆえ、本発明によるUNGの
失活反応速度論はPCRに適した緩衝液中で実施された。P
CR緩衝液は10mM Tris/HCl,pH8.3,1.5mM MgCl2,50mM KCl
を含んでいた。
衝液中でUNGを使用した。それゆえ、本発明によるUNGの
失活反応速度論はPCRに適した緩衝液中で実施された。P
CR緩衝液は10mM Tris/HCl,pH8.3,1.5mM MgCl2,50mM KCl
を含んでいた。
1UのUNGを100μｌのPCR緩衝液中に加え、様々な温度
でインキュベートした。サンプルを所定の時間で採取
し、上記の試験系を用いて残留活性を測定した（表
１）。本発明によるUNGに関して次の半減期が測定され
た。すなわち、45℃で0.5分、40℃で２分（図１）。大
腸菌由来のUNGの場合は次の半減期が測定された。すな
わち、45℃で８分、40℃で27分。
でインキュベートした。サンプルを所定の時間で採取
し、上記の試験系を用いて残留活性を測定した（表
１）。本発明によるUNGに関して次の半減期が測定され
た。すなわち、45℃で0.5分、40℃で２分（図１）。大
腸菌由来のUNGの場合は次の半減期が測定された。すな
わち、45℃で８分、40℃で27分。
実施例３
失活およびPCR後の本発明のUNGの残留活性
下記の系は、熱失活および後続のPCRの後のUNGの残留
活性を検出するのに役立つ。この方法では、ウラシルを
含有するPCR産物の分解をモニターした。PCR産物は組み
込まれたジゴキシゲニン（DIG）標識を測定することで
検出される。この標識付けはPCRにおいて5'末端をDIGで
標識したプライマーを用いることにより行われた。第２
プライマーには標識がない。ウラシルを含有するPCR産
物の分解は、分解産物を検出することによりモニターし
た。この場合には、配列決定用のゲルを用いて分解産物
を分離し、抗DIG化学発光系によりDIG標識を検出した。
活性を検出するのに役立つ。この方法では、ウラシルを
含有するPCR産物の分解をモニターした。PCR産物は組み
込まれたジゴキシゲニン（DIG）標識を測定することで
検出される。この標識付けはPCRにおいて5'末端をDIGで
標識したプライマーを用いることにより行われた。第２
プライマーには標識がない。ウラシルを含有するPCR産
物の分解は、分解産物を検出することによりモニターし
た。この場合には、配列決定用のゲルを用いて分解産物
を分離し、抗DIG化学発光系によりDIG標識を検出した。
pUC−18ベクターの多重クローニング部位からの長さ1
03塩基対の配列を増幅した。そのために、プライマーと
してpUC配列決定用の5'−ジゴキシゲニン標識プライマ
ー（配列:5'−DIG−ｄ［GTAAAACGA CGGCCAGT］−3'）お
よびpUC逆配列決定用のプライマー（配列:d［CAGGAAAC
AGCTATGAC］−3'）を用いた。100μｌの混合物は、10mM
Tris/HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2を含有するPCR
緩衝液；各200μＭのヌクレオチドdATP,dCTP,dGTPおよ
び600μＭのdUTP;2.5UのTaq−DNAポリメラーゼ,1ngのpU
C 18−DNA/Pst1,2UのUNGおよび各１μＭの２種のプライ
マーを含んでいた。その後、サンプルをサーモサイクラ
ー（例えば、Perkin Elmer 9600）に移した。UNGを95℃
で２〜10分以内に熱失活させた。続いて、103塩基対の
断片を増幅させるためにPCRを行った。PCRは94℃で１
分、50℃で１分、および72℃で３分を25サイクル行っ
た。その後サンプルを４℃で保存し、PCR産物の分解を
検出するために適当な時点でサンプルを採取した。20μ
ｌの対応サンプルを５μｌの0.6M NaOHと混合し、37℃
で５分インキュベートした後氷上で終結させ、次に５μ
ｌの0.6M HClと４μｌのホルムアミドストッパー溶液を
加えた。その後一本鎖を得るためにサンプルを95℃で３
分加熱した。
03塩基対の配列を増幅した。そのために、プライマーと
してpUC配列決定用の5'−ジゴキシゲニン標識プライマ
ー（配列:5'−DIG−ｄ［GTAAAACGA CGGCCAGT］−3'）お
よびpUC逆配列決定用のプライマー（配列:d［CAGGAAAC
AGCTATGAC］−3'）を用いた。100μｌの混合物は、10mM
Tris/HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2を含有するPCR
緩衝液；各200μＭのヌクレオチドdATP,dCTP,dGTPおよ
び600μＭのdUTP;2.5UのTaq−DNAポリメラーゼ,1ngのpU
C 18−DNA/Pst1,2UのUNGおよび各１μＭの２種のプライ
マーを含んでいた。その後、サンプルをサーモサイクラ
ー（例えば、Perkin Elmer 9600）に移した。UNGを95℃
で２〜10分以内に熱失活させた。続いて、103塩基対の
断片を増幅させるためにPCRを行った。PCRは94℃で１
分、50℃で１分、および72℃で３分を25サイクル行っ
た。その後サンプルを４℃で保存し、PCR産物の分解を
検出するために適当な時点でサンプルを採取した。20μ
ｌの対応サンプルを５μｌの0.6M NaOHと混合し、37℃
で５分インキュベートした後氷上で終結させ、次に５μ
ｌの0.6M HClと４μｌのホルムアミドストッパー溶液を
加えた。その後一本鎖を得るためにサンプルを95℃で３
分加熱した。
1.5μｌのサンプルを８％配列決定ゲルにアプライ
し、分離した（泳動時間2500V,26mAで50分）。DIG標識P
CR産物およびDIG標識分解産物のその後の検出は、DIG T
aq DNA配列決定キット（Boehringer Mannheim）およびD
IG発光検出キット（Boehringer Mannheim）のプロトコ
ールに従って行った。
し、分離した（泳動時間2500V,26mAで50分）。DIG標識P
CR産物およびDIG標識分解産物のその後の検出は、DIG T
aq DNA配列決定キット（Boehringer Mannheim）およびD
IG発光検出キット（Boehringer Mannheim）のプロトコ
ールに従って行った。
図2Aはこのような実験の結果を示す。この場合、PCR
混合物を４℃で保存し、０時間、１時間、４時間および
16時間後にサンプルを採取した。
混合物を４℃で保存し、０時間、１時間、４時間および
16時間後にサンプルを採取した。
DSM 10239由来のUNG（レーンA1〜４）と比較するため
に大腸菌由来のUNG（レーンB1〜４）を用いた。UNGを含
まない混合物（レーンC1〜４）を対照として用いた。大
腸菌UNGと対照的に、本発明のUNGの場合には０〜４時間
の時点で分解産物がほとんど出現しなかった。こうし
て、95℃で２分の熱失活により、本発明のUNGは大腸菌
由来のUNGと比べて顕著な利点を有する（図2A）。失活
工程を延長する（例えば、95℃で10分）ことにより、本
発明のUNGの最低残留活性をさらに低下させることがで
きる（図2B）。
に大腸菌由来のUNG（レーンB1〜４）を用いた。UNGを含
まない混合物（レーンC1〜４）を対照として用いた。大
腸菌UNGと対照的に、本発明のUNGの場合には０〜４時間
の時点で分解産物がほとんど出現しなかった。こうし
て、95℃で２分の熱失活により、本発明のUNGは大腸菌
由来のUNGと比べて顕著な利点を有する（図2A）。失活
工程を延長する（例えば、95℃で10分）ことにより、本
発明のUNGの最低残留活性をさらに低下させることがで
きる（図2B）。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 9/24
Ｃ１２Ｒ 1:265）
(72)発明者 フレイ，ブルノ
ドイツ連邦共和国 ディー―82377 ペ
ンツベルク，ホックフェルトシュトラー
セ 50
(72)発明者 カルザ，クラウス
ドイツ連邦共和国 ディー―83670 バ
ト バイブルン，ホックフェルタンガー
３
(56)参考文献 特表 平６−501612（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 9/00 - 9/99
C12P 19/00 - 19/64
C12Q 1/00 - 1/70
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (19)
- 【請求項１】ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を有
し、SDS−PAGEで測定したときの分子量が23,000〜24,00
0ダルトンであり、かつ純度が95％以上である精製酵素
であって、アースロバクター（Arthrobacter）属または
ミクロコッカス（Micrococcus）属の微生物から得ら
れ、かつ約40℃における半減期が５分未満で、約45℃に
おける半減期が約２分以下である上記酵素。 - 【請求項２】汚染性の外来酵素活性の含有量が２％未満
であり、比活性が少なくとも５×104U/mgタンパク質で
ある、請求項１に記載の酵素。 - 【請求項３】アースロバクター（Arthrobacter）属また
はミクロコッカス（Micrococcus）属の微生物から得ら
れる、請求項１または２に記載の酵素。 - 【請求項４】菌株DSM 10239から単離される、請求項
１、２または３に記載の酵素。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載のウラ
シル−DNAグリコシラーゼ活性を有する熱不安定性酵素
の安定化された溶液であって、該酵素が弱アルカリ性範
囲に緩衝化する約10〜250mMの緩衝物質、0.1〜5mMの錯
化剤、約0.5〜5mMのSH基を安定化する試薬、少なとも10
0mMの塩化ナトリウム、45〜55％（v/v）のグリセロール
および場合により0.1〜5.0mg/mlのウシ血清アルブミン
を含有する混合物中に含まれている、上記安定化酵素溶
液。 - 【請求項６】約50mM Hepes/KOH,pH8.0、約1mM EDTA、約
1mMジチオトレイトール、約300mM塩化ナトリウムおよび
約50％（v/v）のグリセロールを含有する、請求項５に
記載の安定化酵素溶液。 - 【請求項７】約40℃における半減期が５分未満で、約45
℃における半減期が２分未満であるウラシル−DNA−グ
リコシラーゼ活性を有する熱不安定性酵素をグラム陽性
菌から単離する方法であって、細胞の破壊およびDNAの
分離後に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
アニオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマト
グラフィーを実施することを含んでなる上記方法。 - 【請求項８】ポリミン（Polymin）沈降を用いてDNAを分
離する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】アニオン交換クロマトグラフィーをＱ−Se
pharose ff（high load）で行う、請求項７または８に
記載の方法。 - 【請求項１０】疎水性クロマトグラフィー工程をフェニ
ルSepharose ffで行う、請求項７、８または９に記載の
方法。 - 【請求項１１】グラム陽性菌DSM 10239を用いる、請求
項７、８、９または10に記載の方法。 - 【請求項１２】ウラシル含有DNAを含む混合物を下記酵
素と共に約10〜30℃で約１〜30分インキュベートし、そ
して約95℃に約１〜10分加熱することにより、ウラシル
含有DNAを検出するための、またはDNAからウラシル塩基
を除去するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載
のウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を有する熱不安定
性酵素の使用方法。 - 【請求項１３】ウラシル含有DNAが特異的に増幅されたD
NAである、請求項12に記載の使用方法。 - 【請求項１４】約４℃で約30秒〜４時間インキュベート
したとき、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性がもはや
検出できない、請求項12または13に記載の使用方法。 - 【請求項１５】次の成分： （ａ）適当な保存緩衝液中に含まれる請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の熱不安定性酵素； （ｂ）ヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dGTPおよびdU
TP; （ｃ）耐熱性DNAポリメラーゼ；および （ｄ）pH7.5〜9.2の範囲に緩衝化する緩衝物質（反応緩
衝液）； を含んでなる、特定の核酸または対応する断片を増幅す
るためのキット。 - 【請求項１６】熱不安定性酵素が約0.1〜5.0U/μｌの濃
度で存在する、請求項15に記載のキット。 - 【請求項１７】ヌクレオシド三リン酸dATP、dCTPおよび
dGTPがそれぞれdUTPの濃度の三分の一の濃度である、請
求項15または16に記載のキット。 - 【請求項１８】約２〜10U/μｌ（最終濃度）の耐熱性DN
Aポリメラーゼが存在する、請求項15〜17のいずれか１
項に記載のキット。 - 【請求項１９】反応緩衝液がさらに約10〜100mMの塩化
カリウムおよび／または約1.0〜5.0mMの塩化マグネシウ
ムを含有する、請求項15〜19のいずれか１項に記載のキ
ット。
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