JP3410178B2 - 牛プロスタグランジンＦ２α受容体 - Google Patents
牛プロスタグランジンＦ２α受容体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、牛プロスタグランジンＦ2α受
容体蛋白およびそれをコードするＤＮＡに関するもので
ある。更に詳しくは、本発明は、牛プロスタグランジン
Ｆ2α受容体蛋白をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有
する発現ベクター、該発現ベクターを含有する形質転換
体、並びに該形質転換体を培養することにより該受容体
を製造する方法に関するものである。さらに、本発明
は、このようにして製造された牛プロスタグランジンＦ
2α受容体に関するものである。
容体蛋白およびそれをコードするＤＮＡに関するもので
ある。更に詳しくは、本発明は、牛プロスタグランジン
Ｆ2α受容体蛋白をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有
する発現ベクター、該発現ベクターを含有する形質転換
体、並びに該形質転換体を培養することにより該受容体
を製造する方法に関するものである。さらに、本発明
は、このようにして製造された牛プロスタグランジンＦ
2α受容体に関するものである。
【０００２】プロスタグランジンＦ2αはプロスタグラ
ンジンＥ2と共に１９６０年代初期に最初に単離された
プロスタグランジンの１つであることから「古典的プロ
スタグランジン」と呼ばれている。豚や羊から抽出され
た平滑筋収縮物質や「ｉｒｉｎ」と名付けられたウサギ
虹彩から抽出された平滑筋収縮物質がプロスタグランジ
ンＦ2αと判明して以来、プロスタグランジンＦ2αが子
宮、気管と気管支、腸管や血管などの平滑筋を収縮させ
ることがよく知られている。数多くの動物において、プ
ロスタグランジンＦ2αが卵巣の黄体退縮に重要な役割
をもつことは２０年以上も前から良く知られている。さ
らに、プロスタグランジンＦ2αは静止期のスイス３Ｔ
３細胞のＤＮＡ合成や細胞増殖を引き起こし、中枢神経
系では痛みに関わっている。このように、プロスタグラ
ンジンＦ2αは様々の組織において細胞膜表面の受容体
を介して多彩な生物学的作用を誘発する。プロスタグラ
ンジンＦ2αが平滑筋収縮作用を持つことから、臨床に
おいても、陣痛誘発や帝王切開後の子宮収縮促進、腸管
の蠕動運動の亢進に用いられている。最近、黄体細胞を
含めて数多くの細胞において、プロスタグランジンＦ
2αがイノシトールリン脂質代謝を介して細胞内Ｃａ2+
濃度を上昇させることが報告されているが、プロスタグ
ランジンＦ2α受容体の分子構造はほとんど分かってい
ない。黄体はプロスタグランジンＦ2α受容体が非常に
多く、種々の動物種のプロスタグランジンＦ2α結合活
性に関する研究はほとんどすべてこの黄体を用いて行な
われてきた。
ンジンＥ2と共に１９６０年代初期に最初に単離された
プロスタグランジンの１つであることから「古典的プロ
スタグランジン」と呼ばれている。豚や羊から抽出され
た平滑筋収縮物質や「ｉｒｉｎ」と名付けられたウサギ
虹彩から抽出された平滑筋収縮物質がプロスタグランジ
ンＦ2αと判明して以来、プロスタグランジンＦ2αが子
宮、気管と気管支、腸管や血管などの平滑筋を収縮させ
ることがよく知られている。数多くの動物において、プ
ロスタグランジンＦ2αが卵巣の黄体退縮に重要な役割
をもつことは２０年以上も前から良く知られている。さ
らに、プロスタグランジンＦ2αは静止期のスイス３Ｔ
３細胞のＤＮＡ合成や細胞増殖を引き起こし、中枢神経
系では痛みに関わっている。このように、プロスタグラ
ンジンＦ2αは様々の組織において細胞膜表面の受容体
を介して多彩な生物学的作用を誘発する。プロスタグラ
ンジンＦ2αが平滑筋収縮作用を持つことから、臨床に
おいても、陣痛誘発や帝王切開後の子宮収縮促進、腸管
の蠕動運動の亢進に用いられている。最近、黄体細胞を
含めて数多くの細胞において、プロスタグランジンＦ
2αがイノシトールリン脂質代謝を介して細胞内Ｃａ2+
濃度を上昇させることが報告されているが、プロスタグ
ランジンＦ2α受容体の分子構造はほとんど分かってい
ない。黄体はプロスタグランジンＦ2α受容体が非常に
多く、種々の動物種のプロスタグランジンＦ2α結合活
性に関する研究はほとんどすべてこの黄体を用いて行な
われてきた。
【０００３】本発明者らは、プロスタグランジンＦ2α
受容体の分子的性質を明らかにし、中枢並びに末梢での
プロスタグランジンＦ2αの多彩な作用、特に受精、着
床、妊娠等の生殖生理の研究をさらに押し進めると共
に、妊娠や女性生殖器疾患の治療において、副作用の少
ないプロスタグランジンＦ2α受容体に特異的なアゴニ
スト、アンタゴニストの開発を含め、重要な知見を得る
ことを目的として研究を行い、ポリメラーゼ連鎖反応と
クロスハイブリダイゼーション法を用い牛プロスタグラ
ンジンＦ2α受容体ｃＤＮＡをクローニングし、その塩
基配列を決定すると共に、該受容体の薬理学的性質、そ
のｍＲＮＡの組織分布を明らかにした。具体的には、最
近、プロスタグランジンＦ2αが属するプロスタノイド
受容体が相次いで報告されていることから、それらの塩
基配列をもとにポリメラーゼ連鎖反応を行ない牛黄体に
特異的なＤＮＡ断片を取り出し、それをプローブにして
牛黄体ｃＤＮＡライブラリーから牛プロスタグランジン
Ｆ2α受容体をコードするｃＤＮＡをクローニングし、
かつその配列を決定することに成功し、本発明を完成し
た。
受容体の分子的性質を明らかにし、中枢並びに末梢での
プロスタグランジンＦ2αの多彩な作用、特に受精、着
床、妊娠等の生殖生理の研究をさらに押し進めると共
に、妊娠や女性生殖器疾患の治療において、副作用の少
ないプロスタグランジンＦ2α受容体に特異的なアゴニ
スト、アンタゴニストの開発を含め、重要な知見を得る
ことを目的として研究を行い、ポリメラーゼ連鎖反応と
クロスハイブリダイゼーション法を用い牛プロスタグラ
ンジンＦ2α受容体ｃＤＮＡをクローニングし、その塩
基配列を決定すると共に、該受容体の薬理学的性質、そ
のｍＲＮＡの組織分布を明らかにした。具体的には、最
近、プロスタグランジンＦ2αが属するプロスタノイド
受容体が相次いで報告されていることから、それらの塩
基配列をもとにポリメラーゼ連鎖反応を行ない牛黄体に
特異的なＤＮＡ断片を取り出し、それをプローブにして
牛黄体ｃＤＮＡライブラリーから牛プロスタグランジン
Ｆ2α受容体をコードするｃＤＮＡをクローニングし、
かつその配列を決定することに成功し、本発明を完成し
た。
【０００４】即ち、本発明の第一の目的は、牛プロスタ
グランジンＦ2α受容体をコードするＤＮＡを提供する
ものである。また本発明は、該牛プロスタグランジンＦ
2α受容体をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター
を提供するものである。さらに、本発明は、該発現ベク
ターで形質転換された、牛プロスタグランジンＦ2α受
容体を産生し得る形質転換体を提供するものである。更
に本発明は、該形質転換体を培養し、培養物から牛プロ
スタグランジンＦ2α受容体を単離することからなる牛
プロスタグランジンＦ2α受容体の製造方法、およびこ
の方法によって製造された牛プロスタグランジンＦ2α
受容体を提供するものである。
グランジンＦ2α受容体をコードするＤＮＡを提供する
ものである。また本発明は、該牛プロスタグランジンＦ
2α受容体をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター
を提供するものである。さらに、本発明は、該発現ベク
ターで形質転換された、牛プロスタグランジンＦ2α受
容体を産生し得る形質転換体を提供するものである。更
に本発明は、該形質転換体を培養し、培養物から牛プロ
スタグランジンＦ2α受容体を単離することからなる牛
プロスタグランジンＦ2α受容体の製造方法、およびこ
の方法によって製造された牛プロスタグランジンＦ2α
受容体を提供するものである。
【０００５】本発明の牛プロスタグランジンＦ2α受容
体をコードするＤＮＡの配列は図１および図２に記載さ
れている。本発明者らは牛卵巣黄体からｍＲＮＡを抽出
して精製し、このｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成
した。すでにクローニングされているプロスタノイド受
容体の塩基配列を精査して共通する塩基配列を見いだ
し、そのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメ
ラーゼ連鎖反応を行なって、牛卵巣黄体に特異的なＤＮ
Ａ断片（ＳＮ４６３）を得た。一方、５〜６キロベース
の大きさに分画した牛黄体由来のｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ
アダプターを付加した後、λ―ＺＡＰＩＩファージＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ切断部位に結合させ、ｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。このようにして得られた牛黄体ファー
ジを大腸菌株ＸＬ―１ｂｌｕｅに感染させ、１５ｃｍプ
レートにいれた寒天培地中で培養した後、ニトロセルロ
ース膜にブロットして32Ｐで標識したＳＮ４６３をプロ
ーブにして厳しい条件でハイブリダイゼーションを行な
った。その結果、牛プロスタグランジンＦ2α受容体を
コードするｃＤＮＡを含む単一組換λ―ＺＡＰＩＩファ
ージクローン、それに由来するプラズミドｐＢＳ−ｂＰ
ＧＦ２α（ＢＣ２２１１）を得た。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２
α（ＢＣ２２１１）が組み込まれている大腸菌（Ｅsche
richia coli Ｋ１２）ＸＬ―１ｂｌｕｅ／ｐＢＳ−ｂＰ
ＧＦ２αは、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９６８号と
して寄託されている（寄託日：平成５年１１月１７
日）。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）から牛プ
ロスタグランジンＦ2αｃＤＮＡフラグメントを切り出
して動物細胞発現ベクターｐＥＦ―ＢＯＳに組み込み、
牛プロスタグランジンＦ2α受容体蛋白を発現し得るベ
クターｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αを製造した。ｐＥ
Ｆ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αが組み込まれている大腸菌
（Ｅscherichia coli Ｋ１２）ＤＨ５α／ｐＥＦ・ＢＯ
Ｓ―ｂＰＧＦ２αは、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
６９号として寄託されている（寄託日：平成５年１１月
１７日）。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）の制
限酵素地図、およびｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αの構
築模式図および制限酵素地図を図３に示す。
体をコードするＤＮＡの配列は図１および図２に記載さ
れている。本発明者らは牛卵巣黄体からｍＲＮＡを抽出
して精製し、このｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成
した。すでにクローニングされているプロスタノイド受
容体の塩基配列を精査して共通する塩基配列を見いだ
し、そのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメ
ラーゼ連鎖反応を行なって、牛卵巣黄体に特異的なＤＮ
Ａ断片（ＳＮ４６３）を得た。一方、５〜６キロベース
の大きさに分画した牛黄体由来のｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ
アダプターを付加した後、λ―ＺＡＰＩＩファージＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ切断部位に結合させ、ｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。このようにして得られた牛黄体ファー
ジを大腸菌株ＸＬ―１ｂｌｕｅに感染させ、１５ｃｍプ
レートにいれた寒天培地中で培養した後、ニトロセルロ
ース膜にブロットして32Ｐで標識したＳＮ４６３をプロ
ーブにして厳しい条件でハイブリダイゼーションを行な
った。その結果、牛プロスタグランジンＦ2α受容体を
コードするｃＤＮＡを含む単一組換λ―ＺＡＰＩＩファ
ージクローン、それに由来するプラズミドｐＢＳ−ｂＰ
ＧＦ２α（ＢＣ２２１１）を得た。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２
α（ＢＣ２２１１）が組み込まれている大腸菌（Ｅsche
richia coli Ｋ１２）ＸＬ―１ｂｌｕｅ／ｐＢＳ−ｂＰ
ＧＦ２αは、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９６８号と
して寄託されている（寄託日：平成５年１１月１７
日）。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）から牛プ
ロスタグランジンＦ2αｃＤＮＡフラグメントを切り出
して動物細胞発現ベクターｐＥＦ―ＢＯＳに組み込み、
牛プロスタグランジンＦ2α受容体蛋白を発現し得るベ
クターｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αを製造した。ｐＥ
Ｆ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αが組み込まれている大腸菌
（Ｅscherichia coli Ｋ１２）ＤＨ５α／ｐＥＦ・ＢＯ
Ｓ―ｂＰＧＦ２αは、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
６９号として寄託されている（寄託日：平成５年１１月
１７日）。ｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）の制
限酵素地図、およびｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αの構
築模式図および制限酵素地図を図３に示す。
【０００６】この様にして得られた形質転換体培養物か
ら牛プロスタグランジンＦ2α受容体を発現する細胞を
調製し、後述の如く特異的結合能（図５ａ）および細胞
内情報物質の合成促進能（図５ｂ）を有する牛プロスタ
グランジンＦ2α受容体を得た。
ら牛プロスタグランジンＦ2α受容体を発現する細胞を
調製し、後述の如く特異的結合能（図５ａ）および細胞
内情報物質の合成促進能（図５ｂ）を有する牛プロスタ
グランジンＦ2α受容体を得た。
【０００７】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、
如何なる意味においても本発明を限定するものではな
い。
く説明する。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、
如何なる意味においても本発明を限定するものではな
い。
【０００８】実施例 １ 牛プロスタグランジンＦ2α
受容体ｃＤＮＡのクローニング （Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応に用いるオリゴヌクレチド
のデザイン これまで知られているプロスタノイド受容体（いずれも
７回膜貫通型受容体）、マウスＥＰ1、ＥＰ2、ＥＰ3、
牛ＥＰ3、牛ＴＸＡ2、ヒトＴＸＡ2受容体の膜貫通部分
ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩの塩基配列をもとにして、
最も共通性のある領域を選びポリメラーゼ連鎖反応に用
いるプライマーのデザインを行なった。以下に示すプラ
イマー用のオリゴヌクレオチドの合成はＤＮＡ合成機
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い
て行なった。 センスのプライマー： III: (GC)(TC)G(GC)CATG(GA)(GC)C(ATG)(TC)(AGC)GAGCG IV: CA(AG)T(AG)(GC)CC(GTC)GG(GC)(AT)C(GTC)TGGTG(T
C)TT アンチセンスのプライマー： VIA: T(GC)(GC)AGCAGAT(GC)A(AG)C(AG)(AC) VIB: (AC)(AC)CAT(AG)AT(GC)CCCAG(GT)AGCTG VIIA: ATCCTGGACCC(CA)TGG(AG)T(GT)TACATCCT VIIB: TGGC(CT)(AT)C(AGC)(TC)(GT)GAACCAGAT(TC)CT （上記配列式において、（）はそこに記載されているヌ
クレオチドのいずれかが選択されることを示す。）
受容体ｃＤＮＡのクローニング （Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応に用いるオリゴヌクレチド
のデザイン これまで知られているプロスタノイド受容体（いずれも
７回膜貫通型受容体）、マウスＥＰ1、ＥＰ2、ＥＰ3、
牛ＥＰ3、牛ＴＸＡ2、ヒトＴＸＡ2受容体の膜貫通部分
ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩの塩基配列をもとにして、
最も共通性のある領域を選びポリメラーゼ連鎖反応に用
いるプライマーのデザインを行なった。以下に示すプラ
イマー用のオリゴヌクレオチドの合成はＤＮＡ合成機
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い
て行なった。 センスのプライマー： III: (GC)(TC)G(GC)CATG(GA)(GC)C(ATG)(TC)(AGC)GAGCG IV: CA(AG)T(AG)(GC)CC(GTC)GG(GC)(AT)C(GTC)TGGTG(T
C)TT アンチセンスのプライマー： VIA: T(GC)(GC)AGCAGAT(GC)A(AG)C(AG)(AC) VIB: (AC)(AC)CAT(AG)AT(GC)CCCAG(GT)AGCTG VIIA: ATCCTGGACCC(CA)TGG(AG)T(GT)TACATCCT VIIB: TGGC(CT)(AT)C(AGC)(TC)(GT)GAACCAGAT(TC)CT （上記配列式において、（）はそこに記載されているヌ
クレオチドのいずれかが選択されることを示す。）
【０００９】（Ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応による鋳型ｃ
ＤＮＡの増複 プロスタグランジンＦ2α受容体が多く発現しているこ
とが知られている黄体とその対照として殆ど発現してい
ないと思われる牛心臓と副腎髄質ノンクロマフィン細胞
からｍＲＮＡを調製してそれを鋳型にしてｃＤＮＡを作
製した。牛黄体の場合には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ
Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の精製キットで得
られたｍＲＮＡ２μｇを鋳型に用い、オリゴ（ｄＴ）１
７をプライマーとして逆転写酵素反応により０．４μｇ
のｃＤＮＡを得た。この一部のｃＤＮＡ２０ｎｇを鋳型
にし、上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマ
ーの可能なかぎりの組み合わせでポリメラーゼ連鎖反応
を行なって牛黄体ｃＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連
鎖反応は９５℃１分、４８℃ ２分、７２℃２分の条件
で２５回行なった。牛黄体特異的ＤＮＡを得るために、
すでにクローニングされている牛ＴＸＡ2受容体、受容
体牛ＥＰ3受容体およびマウスＥＰ1受容体ｃＤＮＡをプ
ローブにして牛黄体、心臓、ノンクロマフィン細胞ｃＤ
ＮＡのポリメラーゼ連鎖反応産物のサザンブロット解析
を行なった。その結果、センスＩＶとアンチセンスＶＩ
Ｂをプライマーにして増複して得られたｃＤＮＡ断片Ｓ
Ｎ４６３（２３０塩基）が黄体に特異的であることが分
かった。このＳＮ４６３断片は牛ＴＸＡ2受容体と塩基
にして５５％、アミノ酸にして３６％の相同性を有し
た。ポリメラーゼ連鎖反応産物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製のＴＡクローニングキットを用いて直接ＰＣＲ―Ｉ
Ｉベクターに組み込みその青白発色反応で陽性クローン
を選択した。予想する塩基の大きさを持つ陽性クローン
の塩基配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製ＤＮＡ塩基配列解析装置モデル７３７―Ａにより決定
した。
ＤＮＡの増複 プロスタグランジンＦ2α受容体が多く発現しているこ
とが知られている黄体とその対照として殆ど発現してい
ないと思われる牛心臓と副腎髄質ノンクロマフィン細胞
からｍＲＮＡを調製してそれを鋳型にしてｃＤＮＡを作
製した。牛黄体の場合には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ
Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の精製キットで得
られたｍＲＮＡ２μｇを鋳型に用い、オリゴ（ｄＴ）１
７をプライマーとして逆転写酵素反応により０．４μｇ
のｃＤＮＡを得た。この一部のｃＤＮＡ２０ｎｇを鋳型
にし、上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマ
ーの可能なかぎりの組み合わせでポリメラーゼ連鎖反応
を行なって牛黄体ｃＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連
鎖反応は９５℃１分、４８℃ ２分、７２℃２分の条件
で２５回行なった。牛黄体特異的ＤＮＡを得るために、
すでにクローニングされている牛ＴＸＡ2受容体、受容
体牛ＥＰ3受容体およびマウスＥＰ1受容体ｃＤＮＡをプ
ローブにして牛黄体、心臓、ノンクロマフィン細胞ｃＤ
ＮＡのポリメラーゼ連鎖反応産物のサザンブロット解析
を行なった。その結果、センスＩＶとアンチセンスＶＩ
Ｂをプライマーにして増複して得られたｃＤＮＡ断片Ｓ
Ｎ４６３（２３０塩基）が黄体に特異的であることが分
かった。このＳＮ４６３断片は牛ＴＸＡ2受容体と塩基
にして５５％、アミノ酸にして３６％の相同性を有し
た。ポリメラーゼ連鎖反応産物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製のＴＡクローニングキットを用いて直接ＰＣＲ―Ｉ
Ｉベクターに組み込みその青白発色反応で陽性クローン
を選択した。予想する塩基の大きさを持つ陽性クローン
の塩基配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製ＤＮＡ塩基配列解析装置モデル７３７―Ａにより決定
した。
【００１０】（Ｃ）牛プロスタグランジンＦ2α受容体
ｃＤＮＡのクローニング 牛黄体ｍＲＮＡ２μｇを鋳型にしてＢｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のス
ーパスクリプト（キット）を用いてｃＤＮＡを合成した
後、長いＤＮＡを得るために庶糖密度勾配遠心を行なっ
た。５〜６キロベースの大きさを含むｃＤＮＡ画分の両
平滑末端にＰｒｏｍｅｇａ社製アダプターライゲーショ
ンキットを用いてＥｃｏＲＩアダプターを付加した後、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のλ―ＺＡＰＩＩファージＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させ、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。この組
換えファージＤＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ギガパ
ックＩＩゴールドキットを用いて試験管内パッケージン
グし、感染性ファージ粒子とした。このようにして得ら
れたｃＤＮＡを含むλ―ＺＡＰＩＩファージを大腸菌株
ＸＬ―１ｂｌｕｅに感染させ、１５ｃｍプレートにいれ
た寒天培地中で培養した。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルロース膜ＢＡ―８５にフ
ァージＤＮＡをブロットした後、32Ｐで標識したＳＮ４
６３をプローブにして厳しい条件でハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。５６万のファージライブラリーから１
５個の陽性クローンを選択した。陽性ファージクローン
をヘルパーファージＲ４０８と大腸菌に共感染させるこ
とによりファージＤＮＡからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプ
ラスミドＤＮＡを回収した。そのうち２キロベース以上
の長いインサートを持つ３つのクローンＢＣ２２１１、
ＢＣ３１１１、ＢＣ４１１１の塩基配列をＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ塩基配列解析装置
モデル ７３７―Ａ により決定した。
ｃＤＮＡのクローニング 牛黄体ｍＲＮＡ２μｇを鋳型にしてＢｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のス
ーパスクリプト（キット）を用いてｃＤＮＡを合成した
後、長いＤＮＡを得るために庶糖密度勾配遠心を行なっ
た。５〜６キロベースの大きさを含むｃＤＮＡ画分の両
平滑末端にＰｒｏｍｅｇａ社製アダプターライゲーショ
ンキットを用いてＥｃｏＲＩアダプターを付加した後、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のλ―ＺＡＰＩＩファージＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させ、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。この組
換えファージＤＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ギガパ
ックＩＩゴールドキットを用いて試験管内パッケージン
グし、感染性ファージ粒子とした。このようにして得ら
れたｃＤＮＡを含むλ―ＺＡＰＩＩファージを大腸菌株
ＸＬ―１ｂｌｕｅに感染させ、１５ｃｍプレートにいれ
た寒天培地中で培養した。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルロース膜ＢＡ―８５にフ
ァージＤＮＡをブロットした後、32Ｐで標識したＳＮ４
６３をプローブにして厳しい条件でハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。５６万のファージライブラリーから１
５個の陽性クローンを選択した。陽性ファージクローン
をヘルパーファージＲ４０８と大腸菌に共感染させるこ
とによりファージＤＮＡからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプ
ラスミドＤＮＡを回収した。そのうち２キロベース以上
の長いインサートを持つ３つのクローンＢＣ２２１１、
ＢＣ３１１１、ＢＣ４１１１の塩基配列をＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ塩基配列解析装置
モデル ７３７―Ａ により決定した。
【００１１】実施例 ２ 牛プロスタグランジンＦ2α
受容体をコードするｃＤＮＡを発現し得る発現ベクター
の構築 図３ａは単離した牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドクローンｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α
（ＢＣ２２１１）の制限酵素地図である。次に図３ｂに
示す哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＭ８に伸長因子Ｅ
Ｆ―１αのプロモーターを含む領域を組み込んだｐＥＦ
―ＢＯＳ（０．１μｇ）のＮｏｔＩ部位に、プロスタグ
ランジンＦ2α受容体の蛋白翻訳領域を含むｐＢＳ−ｂ
ＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）由来の２．２キロベースの
ＥｃｏＲＩＤＮＡの断片をＥｃｏＲＩ―ＮｏｔＩアダプ
ターを用いて組み込み、牛プロスタグランジンＦ2α受
容体蛋白を発現し得るベクターｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧ
Ｆ２αを構築した。このときの挿入様式は図３ｃに示す
ようにＥＦ―１αのプロモーターの下流に牛プロスタグ
ランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡの翻訳開始コドン（ＡＴ
Ｇ）が接続されているものである。
受容体をコードするｃＤＮＡを発現し得る発現ベクター
の構築 図３ａは単離した牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドクローンｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α
（ＢＣ２２１１）の制限酵素地図である。次に図３ｂに
示す哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＭ８に伸長因子Ｅ
Ｆ―１αのプロモーターを含む領域を組み込んだｐＥＦ
―ＢＯＳ（０．１μｇ）のＮｏｔＩ部位に、プロスタグ
ランジンＦ2α受容体の蛋白翻訳領域を含むｐＢＳ−ｂ
ＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）由来の２．２キロベースの
ＥｃｏＲＩＤＮＡの断片をＥｃｏＲＩ―ＮｏｔＩアダプ
ターを用いて組み込み、牛プロスタグランジンＦ2α受
容体蛋白を発現し得るベクターｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧ
Ｆ２αを構築した。このときの挿入様式は図３ｃに示す
ようにＥＦ―１αのプロモーターの下流に牛プロスタグ
ランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡの翻訳開始コドン（ＡＴ
Ｇ）が接続されているものである。
【００１２】実験例 ３ 発現ベクターを挿入した形質
転換体の調製および該形質転換体を培養して得られる牛
プロスタグランジンＦ2α受容体の特性化 （ａ）カエルの卵による電気生理学的手法による特性化 クローンｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）ＤＮＡ
をＮｏｔＩとＳａｌＩ部位で切断した後、Ｊｕｌｉｕｓ
らの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、５５８―５６４
（１９８８））に従って試験管内でＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合
成し、得られたＲＮＡを約１μｇ／μｌになるように濃
度を合わせた後カエルの卵に５０ｎｇずつ注入した。摂
氏１８度で２２―２７時間卵を培養した後、カエルの卵
を反応容器に移した。カエルの卵の膜電位を―６０ｍＶ
に固定した後、潅流液中に１０μＭの牛プロスタグラン
ジンＦ2αを加えると図４Ｃに示すような内向きのＣa2+
依存性Ｃl-電流がｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１
１）より調製されたセンスＲＮＡを注入した場合にのみ
認められた。一方アンチセンスＲＮＡを注入した場合
（図４ａ）やＢＣ２２１１より短いクローンＢＣ４１１
１のセンスＲＮＡ を注入した場合（図４ｂ）には内向
き電流の変化は認められなかったことから、ｐＢＳ−ｂ
ＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）がプロスタグランジンＦ
2α受容体をコードするＤＮＡを有していることが分か
った。
転換体の調製および該形質転換体を培養して得られる牛
プロスタグランジンＦ2α受容体の特性化 （ａ）カエルの卵による電気生理学的手法による特性化 クローンｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）ＤＮＡ
をＮｏｔＩとＳａｌＩ部位で切断した後、Ｊｕｌｉｕｓ
らの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、５５８―５６４
（１９８８））に従って試験管内でＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合
成し、得られたＲＮＡを約１μｇ／μｌになるように濃
度を合わせた後カエルの卵に５０ｎｇずつ注入した。摂
氏１８度で２２―２７時間卵を培養した後、カエルの卵
を反応容器に移した。カエルの卵の膜電位を―６０ｍＶ
に固定した後、潅流液中に１０μＭの牛プロスタグラン
ジンＦ2αを加えると図４Ｃに示すような内向きのＣa2+
依存性Ｃl-電流がｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１
１）より調製されたセンスＲＮＡを注入した場合にのみ
認められた。一方アンチセンスＲＮＡを注入した場合
（図４ａ）やＢＣ２２１１より短いクローンＢＣ４１１
１のセンスＲＮＡ を注入した場合（図４ｂ）には内向
き電流の変化は認められなかったことから、ｐＢＳ−ｂ
ＰＧＦ２α（ＢＣ２２１１）がプロスタグランジンＦ
2α受容体をコードするＤＮＡを有していることが分か
った。
【００１３】（ｂ）哺乳動物細胞ＣＯＳ―７での特性化
１５ｃｍの培養皿に培養したサル培養細胞ＣＯＳ―７細
胞（１Ｘ１０6細胞／プレート）に１プレートあたり５
μｇのｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αをＤＥＡＥ―デキ
ストラン法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６８４―７０４，１９８
７）によりトランスフェクションした。発現するプロス
タグランジンＦ2α受容体の特性を［3Ｈ］プロスタグラ
ンジンＦ2α結合試験（図５ａ）およびプロスタグラン
ジンＦ2αによる細胞内イノシトールリン酸の産生（図
５ｂ）で調べた。まず膜上に発現している［3Ｈ］プロ
スタグランジンＦ2α結合活性を以下の方法で調べた
（Ｎｅｇｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１２０７７―１２０８４、１９８７）。４８時間培
養後に、ＣＯＳ―７細胞の細胞膜を調製した後、反応は
１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）１００μｌ中で５ｎＭ［3Ｈ］プロスタグラ
ンジンＦ2αと様々の濃度の非標識プロスタグランジン
を２５―４０μｇの細胞膜に加えて２３℃で１時間行な
った。細胞膜に結合した［3Ｈ］プロスタグランジンＦ
2αを結合していないものと分けるためにＷｈａｔｔｍ
ａｎ ＧＦ／Ｂフィルター（直径２．５ｃｍ）で反応液
を漉過した。フィルターを氷冷した上記のリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６．０）５ｍｌで３回洗浄した後、漉紙の上
の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定し
た。結果を図５ａに示す。［3Ｈ］プロスタグランジン
Ｆ2α結合活性はプロスタグランジンＦ2α、Ｄ2、Ｅ2、
トロンボキサンＡ2のアゴニストＳＴＡ2の順で阻害さ
れ、プロスタグランジンＩ2のアゴニスト、シカプロス
トでは全く抑制されなかった。この結果は以前に種々の
黄体において報告された結果とよく一致した。トランス
フェクションしていないＣＯＳ―７細胞には［3Ｈ］プ
ロスタグランジンＦ2αの結合は認められなかった。プ
ロスタグランジンＦ2αによるイノシトールリン酸の産
生実験については次の如く行った。６ウエル培養皿にＣ
ＯＳ―７細胞（５Ｘ１０4細胞／ウエル）を播種して１
日後、ｍｙｏ−［3Ｈ］イノシトール（３７ｋＢｑ／プ
レート）とイノシトールを含まないダルベッコの改良イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）で１０％透析胎児ウシ血清存在
下に細胞を２４時間ラベルした。細胞を洗浄後、１０ｍ
ＭＬｉＣｌ存在下に、３７℃で種々の濃度のプロスタグ
ランジンＦ2αによる刺激を１０分間行った。反応は終
濃度０．５％トリクロロ酢酸により停止させ、ジエチル
エーテルでトリクロロ酢酸を除去し、ｐＨの中和後、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ１Ｘ８カラムによりイノシトールモ
ノリン酸、イノシトールビスリン酸、イノシトールトリ
スリン酸をそれぞれ５ｍＭテトラホウ酸二ナトリウム／
１８０ｍＭギ酸ナトリウム、０．１Ｍギ酸／０．４Ｍギ
酸アンモニウム、および０．１Ｍギ酸／１．０Ｍギ酸ア
ンモニウムにより段階的に溶出し、それぞれの溶出液の
放射能を測定した。その結果、トランスフェクションし
たＣＯＳ―７細胞ではプロスタグランジンＦ2αの用量
に依存してイノシトールリン酸の産生を促進したが、ト
ランスフェクションしていないＣＯＳ―７細胞ではその
促進はみられなかった（図５ｂ）。
胞（１Ｘ１０6細胞／プレート）に１プレートあたり５
μｇのｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αをＤＥＡＥ―デキ
ストラン法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６８４―７０４，１９８
７）によりトランスフェクションした。発現するプロス
タグランジンＦ2α受容体の特性を［3Ｈ］プロスタグラ
ンジンＦ2α結合試験（図５ａ）およびプロスタグラン
ジンＦ2αによる細胞内イノシトールリン酸の産生（図
５ｂ）で調べた。まず膜上に発現している［3Ｈ］プロ
スタグランジンＦ2α結合活性を以下の方法で調べた
（Ｎｅｇｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１２０７７―１２０８４、１９８７）。４８時間培
養後に、ＣＯＳ―７細胞の細胞膜を調製した後、反応は
１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）１００μｌ中で５ｎＭ［3Ｈ］プロスタグラ
ンジンＦ2αと様々の濃度の非標識プロスタグランジン
を２５―４０μｇの細胞膜に加えて２３℃で１時間行な
った。細胞膜に結合した［3Ｈ］プロスタグランジンＦ
2αを結合していないものと分けるためにＷｈａｔｔｍ
ａｎ ＧＦ／Ｂフィルター（直径２．５ｃｍ）で反応液
を漉過した。フィルターを氷冷した上記のリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６．０）５ｍｌで３回洗浄した後、漉紙の上
の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定し
た。結果を図５ａに示す。［3Ｈ］プロスタグランジン
Ｆ2α結合活性はプロスタグランジンＦ2α、Ｄ2、Ｅ2、
トロンボキサンＡ2のアゴニストＳＴＡ2の順で阻害さ
れ、プロスタグランジンＩ2のアゴニスト、シカプロス
トでは全く抑制されなかった。この結果は以前に種々の
黄体において報告された結果とよく一致した。トランス
フェクションしていないＣＯＳ―７細胞には［3Ｈ］プ
ロスタグランジンＦ2αの結合は認められなかった。プ
ロスタグランジンＦ2αによるイノシトールリン酸の産
生実験については次の如く行った。６ウエル培養皿にＣ
ＯＳ―７細胞（５Ｘ１０4細胞／ウエル）を播種して１
日後、ｍｙｏ−［3Ｈ］イノシトール（３７ｋＢｑ／プ
レート）とイノシトールを含まないダルベッコの改良イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）で１０％透析胎児ウシ血清存在
下に細胞を２４時間ラベルした。細胞を洗浄後、１０ｍ
ＭＬｉＣｌ存在下に、３７℃で種々の濃度のプロスタグ
ランジンＦ2αによる刺激を１０分間行った。反応は終
濃度０．５％トリクロロ酢酸により停止させ、ジエチル
エーテルでトリクロロ酢酸を除去し、ｐＨの中和後、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ１Ｘ８カラムによりイノシトールモ
ノリン酸、イノシトールビスリン酸、イノシトールトリ
スリン酸をそれぞれ５ｍＭテトラホウ酸二ナトリウム／
１８０ｍＭギ酸ナトリウム、０．１Ｍギ酸／０．４Ｍギ
酸アンモニウム、および０．１Ｍギ酸／１．０Ｍギ酸ア
ンモニウムにより段階的に溶出し、それぞれの溶出液の
放射能を測定した。その結果、トランスフェクションし
たＣＯＳ―７細胞ではプロスタグランジンＦ2αの用量
に依存してイノシトールリン酸の産生を促進したが、ト
ランスフェクションしていないＣＯＳ―７細胞ではその
促進はみられなかった（図５ｂ）。
【００１４】本発明者らは、以上のようにして牛プロス
タグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡをクローン化し、牛
プロスタグランジンＦ2α受容体を発現するベクターを
構築し、この牛プロスタグランジンＦ2α受容体の分子
的性質を調べた。この牛プロスタグランジンＦ2α受容
体ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）は２２２２塩基からなり、
牛プロスタグランジンＦ2α受容体蛋白をコードする１
０８６塩基のほか、５’および３’末端側に２４と１１
１２塩基の翻訳されない部分を含んでいる。またこのプ
ロスタグランジンＦ2α受容体は分子量４０、９８３の
３６２アミノ酸残基からなる蛋白であることがわかった
（図１および図２）。牛プロスタグランジンＦ2α受容
体のアミノ酸配列には７個の疎水性領域が存在し、Ｇ蛋
白共役型受容体であることがわかった。Ｎ末端側に２つ
の糖鎖が結合する可能性のある部位が存在し、Ｃ末端側
にはプロテインキナーゼでリン酸化されうる４つのセリ
ン／スレオニン残基が存在する。また第７膜貫通部分に
ある第２９１番目のアルギニン残基はプロスタノイド受
容体に共通してみとめられ、プロスタグランジンＦ2α
の１位のカルボン酸を認識するものと考えられている。
第３細胞内ループおよび第３細胞外ループが非常に小さ
いのはプロスタグランジンＦ2α受容体の特徴である。
このｃＤＮＡクローンはプロスタグランジンＦ2α受容
体分子の機能とその発現調節に有用であろう。さらに、
プロスタグランジンＦ2α受容体の分子構造をもとに、
プロスタグランジンＦ2α受容体に特異的な拮抗薬や副
作用のない部位特異的な作動薬の開発に役立つと思われ
る。
タグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡをクローン化し、牛
プロスタグランジンＦ2α受容体を発現するベクターを
構築し、この牛プロスタグランジンＦ2α受容体の分子
的性質を調べた。この牛プロスタグランジンＦ2α受容
体ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）は２２２２塩基からなり、
牛プロスタグランジンＦ2α受容体蛋白をコードする１
０８６塩基のほか、５’および３’末端側に２４と１１
１２塩基の翻訳されない部分を含んでいる。またこのプ
ロスタグランジンＦ2α受容体は分子量４０、９８３の
３６２アミノ酸残基からなる蛋白であることがわかった
（図１および図２）。牛プロスタグランジンＦ2α受容
体のアミノ酸配列には７個の疎水性領域が存在し、Ｇ蛋
白共役型受容体であることがわかった。Ｎ末端側に２つ
の糖鎖が結合する可能性のある部位が存在し、Ｃ末端側
にはプロテインキナーゼでリン酸化されうる４つのセリ
ン／スレオニン残基が存在する。また第７膜貫通部分に
ある第２９１番目のアルギニン残基はプロスタノイド受
容体に共通してみとめられ、プロスタグランジンＦ2α
の１位のカルボン酸を認識するものと考えられている。
第３細胞内ループおよび第３細胞外ループが非常に小さ
いのはプロスタグランジンＦ2α受容体の特徴である。
このｃＤＮＡクローンはプロスタグランジンＦ2α受容
体分子の機能とその発現調節に有用であろう。さらに、
プロスタグランジンＦ2α受容体の分子構造をもとに、
プロスタグランジンＦ2α受容体に特異的な拮抗薬や副
作用のない部位特異的な作動薬の開発に役立つと思われ
る。
【００１５】さらに、本発明者らは、ノ−ザンブロット
解析により牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｍＲＮＡ
の組織分布を調べた（図６）。牛プロスタグランジンＦ
2α受容体ｍＲＮＡに相当する５ｋｂのバンドが、黄体
に多量に発現していることが判明したが、黄体のない卵
巣や他の組織では見つからなかった。リボプローブを用
いて牛卵巣組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ンを行なうと、ノ−ザンブロット解析の結果と一致して
黄体細胞の細胞質に特異的に陽性反応が認められたが、
黄体の他の細胞では見られなかった（図７）。プロスタ
グランジンＦ2α受容体は直接黄体に作用してプロゲス
テロンの産生を抑制し黄体退縮を引き起こす内因性物質
としてよく知られている。プロスタグランジンＦ2α受
容体の分布の組織化学的な解析は生殖生理機能だけでな
く、中枢神経系や末梢系の生理機能や病態生理の理解を
増進させるものと考えられる。
解析により牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｍＲＮＡ
の組織分布を調べた（図６）。牛プロスタグランジンＦ
2α受容体ｍＲＮＡに相当する５ｋｂのバンドが、黄体
に多量に発現していることが判明したが、黄体のない卵
巣や他の組織では見つからなかった。リボプローブを用
いて牛卵巣組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ンを行なうと、ノ−ザンブロット解析の結果と一致して
黄体細胞の細胞質に特異的に陽性反応が認められたが、
黄体の他の細胞では見られなかった（図７）。プロスタ
グランジンＦ2α受容体は直接黄体に作用してプロゲス
テロンの産生を抑制し黄体退縮を引き起こす内因性物質
としてよく知られている。プロスタグランジンＦ2α受
容体の分布の組織化学的な解析は生殖生理機能だけでな
く、中枢神経系や末梢系の生理機能や病態生理の理解を
増進させるものと考えられる。
【図１】 牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ
（ＢＣ２２１１）の塩基およびアミノ酸配列の模式図。
（ＢＣ２２１１）の塩基およびアミノ酸配列の模式図。
【図２】 牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ
（ＢＣ２２１１）の塩基およびアミノ酸配列の模式図。
（ＢＣ２２１１）の塩基およびアミノ酸配列の模式図。
【図３】 牛プロスタグランジンＦ2α受容体蛋白をコ
ードしうるｃＤＮＡｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１
１）の制限酵素地図（ａ）およびｐＥＦ―ＢＯＳ（ｂ）
より作製したｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αの模式図
（ｃ）。
ードしうるｃＤＮＡｐＢＳ−ｂＰＧＦ２α（ＢＣ２２１
１）の制限酵素地図（ａ）およびｐＥＦ―ＢＯＳ（ｂ）
より作製したｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２αの模式図
（ｃ）。
【図４】 単離した牛プロスタグランジンＦ2α受容体
ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）より試験管内で転写されたＲ
ＮＡをカエルの卵に注入した後、１０μＭに反応して見
られた電流変化を示すグラフ。カエルの卵に注入したｍ
ＲＮＡの種類と量：（ａ）ＢＣ２２１１のアンチセンス
ｍＲＮＡ、３．５ｎｇ、（ｂ）ＢＣ４１１１のセンスｍ
ＲＮＡ、４．３ｎｇ、（ｃ）ＢＣ２２１１のセンスｍＲ
ＮＡ、１．７ｎｇ。
ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）より試験管内で転写されたＲ
ＮＡをカエルの卵に注入した後、１０μＭに反応して見
られた電流変化を示すグラフ。カエルの卵に注入したｍ
ＲＮＡの種類と量：（ａ）ＢＣ２２１１のアンチセンス
ｍＲＮＡ、３．５ｎｇ、（ｂ）ＢＣ４１１１のセンスｍ
ＲＮＡ、４．３ｎｇ、（ｃ）ＢＣ２２１１のセンスｍＲ
ＮＡ、１．７ｎｇ。
【図５】 牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ
（ＢＣ２２１１）を導入されたＣＯＳ―７細胞の細胞膜
の［3Ｈ］プロスタグランジンＦ2α結合活性を示すグラ
フ（ａ）とプロスタグランジンＦ2αのイノシトールリ
ン酸産生に対する濃度応答曲線を示すグラフ（ｂ）。白
丸は牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ（ＢＣ
２２１１）を導入されたＣＯＳ―７細胞、黒丸は牛プロ
スタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）
を導入されていないＣＯＳ―７細胞。
（ＢＣ２２１１）を導入されたＣＯＳ―７細胞の細胞膜
の［3Ｈ］プロスタグランジンＦ2α結合活性を示すグラ
フ（ａ）とプロスタグランジンＦ2αのイノシトールリ
ン酸産生に対する濃度応答曲線を示すグラフ（ｂ）。白
丸は牛プロスタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ（ＢＣ
２２１１）を導入されたＣＯＳ―７細胞、黒丸は牛プロ
スタグランジンＦ2α受容体ｃＤＮＡ（ＢＣ２２１１）
を導入されていないＣＯＳ―７細胞。
【図６】 ノ−ザンブロットによる牛臓器とノンクロマ
フィン細胞におけるプロスタグランジンＦ2α受容体ｍ
ＲＮＡの分布を撮影した写真の模写図である。 １） 肝臓、２） 黄体のない卵巣、３） 子宮、
４） 脾臓、５） 大腸、６） 小腸、７） 肺、８）
大動脈、 ９） 大脳、１０） 小脳、１１） 胃、１
２） 黄体、１３） 副腎髄質のノンクロマフィン細
胞。
フィン細胞におけるプロスタグランジンＦ2α受容体ｍ
ＲＮＡの分布を撮影した写真の模写図である。 １） 肝臓、２） 黄体のない卵巣、３） 子宮、
４） 脾臓、５） 大腸、６） 小腸、７） 肺、８）
大動脈、 ９） 大脳、１０） 小脳、１１） 胃、１
２） 黄体、１３） 副腎髄質のノンクロマフィン細
胞。
【図７】 リボプローブによる牛卵巣におけるプロスタ
グランジンＦ2α受容体のｉｎ ｓｉｔｕハイブりダイ
ゼーションの結果を撮影した写真の模写図であり、ａ）
は黄体／アンチセンスＲＮＡプローブ、ｂ）は黄体顆粒
膜細胞／アンチセンスＲＮＡプローブ、ｃ）は黄体／セ
ンスＲＮＡプローブを表す。
グランジンＦ2α受容体のｉｎ ｓｉｔｕハイブりダイ
ゼーションの結果を撮影した写真の模写図であり、ａ）
は黄体／アンチセンスＲＮＡプローブ、ｂ）は黄体顆粒
膜細胞／アンチセンスＲＮＡプローブ、ｃ）は黄体／セ
ンスＲＮＡプローブを表す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (9)
- 【請求項１】 以下の式： 【化１】 【化２】 において、 アミノ酸番号１−３６２で示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質、またはアミノ酸番号１−３６２で示
されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつプロスタグランジンＦ２αとの結合活性を有す
るタンパク質、 をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含有する発現
ベクター。 - 【請求項３】 プラズミドｐＢＳ−ｂＰＧＦ２αである
請求項２に記載の発現ベクター。 - 【請求項４】 プラズミドｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂＰＧＦ２
αである請求項２に記載の発現ベクター。 - 【請求項５】 請求項２〜４のいずれかに記載の発現ベ
クターを含有する形質転換体。 - 【請求項６】 大腸菌株ＸＬ１−ｂｌｕｅ／ｐＢＳ―ｂ
ＰＧＦ２αである請求項５に記載の形質転換体。 - 【請求項７】 大腸菌株ＤＨ５α／ｐＥＦ・ＢＯＳ―ｂ
ＰＧＦ２αである請求項５に記載の形質転換体。 - 【請求項８】 請求項５〜７のいずれかに記載の形質転
換体を培地中で培養し、得られた培養物から牛プロスタ
グランジンＦ２α受容体を単離することからなる牛プロ
スタグランジンＦ２α受容体の製造方法。 - 【請求項９】 以下の式： 【化３】 【化４】 において、 アミノ酸番号１−３６２で示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質、またはアミノ酸番号１−３６２で示
されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつプロスタグランジンＦ２αとの結合活性を有す
るタンパク質、 である、単離された牛プロスタグランジンＦ２α受容
体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29179693A JP3410178B2 (ja) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | 牛プロスタグランジンＦ２α受容体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29179693A JP3410178B2 (ja) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | 牛プロスタグランジンＦ２α受容体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135979A JPH07135979A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3410178B2 true JP3410178B2 (ja) | 2003-05-26 |
Family
ID=17773549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29179693A Expired - Fee Related JP3410178B2 (ja) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | 牛プロスタグランジンＦ２α受容体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3410178B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003000263A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-01-07 | Institute Of Tsukuba Liaison Co Ltd | プロスタグランジンＦ２α受容体異性体 |
-
1993
- 1993-11-22 JP JP29179693A patent/JP3410178B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07135979A (ja) | 1995-05-30 |
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