JP3401017B2 - 婦人科ガンを検出する方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
婦人科ガン（例えば、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮内
膜ガン、および腹膜ガン）は、米国および欧州の女性の
間での最も頻度の高いガンによる死亡原因のひとつであ
る。卵巣ガンのみでも、米国の1996年において、14,800
人の死亡原因であると見積もられている。この暗い結果
は、少なくとも一部には、腫瘍発達の早期の段階で卵巣
ガンを検出することが不可能であることによる。卵巣ガ
ンが早期の段階で診断される場合、治癒の割合は90％に
達する。対称的に、進行した病気を有する女性の５年間
の見通しは、依然として15％より低い生存率というほど
低いままである。従って、早期の診断は、卵巣ガンの予
後を改善するのに最も効果的な手段のひとつである。
膜ガン、および腹膜ガン）は、米国および欧州の女性の
間での最も頻度の高いガンによる死亡原因のひとつであ
る。卵巣ガンのみでも、米国の1996年において、14,800
人の死亡原因であると見積もられている。この暗い結果
は、少なくとも一部には、腫瘍発達の早期の段階で卵巣
ガンを検出することが不可能であることによる。卵巣ガ
ンが早期の段階で診断される場合、治癒の割合は90％に
達する。対称的に、進行した病気を有する女性の５年間
の見通しは、依然として15％より低い生存率というほど
低いままである。従って、早期の診断は、卵巣ガンの予
後を改善するのに最も効果的な手段のひとつである。
経膣超音波検査は、卵巣腫瘍を検出するのに用いられ
る現在利用可能な技術のなかでも最も感度のよいもので
ある。しかし、経膣超音波検査は非特異的である。すな
わち、経膣超音波検査は悪性腫瘍と同様に良性のものも
検出する。従って、経膣超音波検査による卵巣腫瘍の検
出は、悪性腫瘍と良性腫瘍とを区別することが可能な第
２の診断手順に付随されなくてはならない。さらに、経
膣超音波検査は非常に高価であり、それゆえ多数の患者
を検診する手段として有用ではない。
る現在利用可能な技術のなかでも最も感度のよいもので
ある。しかし、経膣超音波検査は非特異的である。すな
わち、経膣超音波検査は悪性腫瘍と同様に良性のものも
検出する。従って、経膣超音波検査による卵巣腫瘍の検
出は、悪性腫瘍と良性腫瘍とを区別することが可能な第
２の診断手順に付随されなくてはならない。さらに、経
膣超音波検査は非常に高価であり、それゆえ多数の患者
を検診する手段として有用ではない。
代表的に、良性卵巣腫瘍は外科的手順（例えば、塊の
生検、または塊の吸引術、および外科的に患者から採取
した細胞の細胞診）によって悪性卵巣腫瘍と区別され
る。しかし、これらの技術は非常に侵襲的および高価
で、吸引術の場合には腹膜にガン性細胞を放つことにつ
ながり得る。
生検、または塊の吸引術、および外科的に患者から採取
した細胞の細胞診）によって悪性卵巣腫瘍と区別され
る。しかし、これらの技術は非常に侵襲的および高価
で、吸引術の場合には腹膜にガン性細胞を放つことにつ
ながり得る。
抗原決定基CA 125は、高分子量ムチン様糖タンパク質
であり、卵巣ガンについてスクリーニングするための現
在最上の血清バイオマーカーである。しかし、CA 125検
査は、２つの主な限界を受ける。まず、CA 125検査は、
それほど感度がよくない。例えば、上昇した血清CA 125
のレベルは、すなわち35U/mlという合格点を越えるレベ
ルは、現在ステージＩの卵巣ガンを持つ患者の50％未満
にしか存在しない（Taylor,K.J.W.およびSchwartz,P.
E.,「Screening for Early Ovarian Cancer,」Radiolog
y,192:1〜10,1994）。さらにCA 125検査は、それほど特
異的でない。例えば、良性婦人科疾患を有する患者の約
25％もまた、CA 125の上昇した血清レベルを有する。さ
らに、肝硬変のような肝疾患は、腹水なしの場合でさ
え、35U/mlを越えるCA 125血清レベルを上昇させる（Ta
ylor,K.J.W.およびSchwartz,P.E.,「Screening for Ear
ly Ovarian Cancer,」Radiology,192:1〜10,1994）。
であり、卵巣ガンについてスクリーニングするための現
在最上の血清バイオマーカーである。しかし、CA 125検
査は、２つの主な限界を受ける。まず、CA 125検査は、
それほど感度がよくない。例えば、上昇した血清CA 125
のレベルは、すなわち35U/mlという合格点を越えるレベ
ルは、現在ステージＩの卵巣ガンを持つ患者の50％未満
にしか存在しない（Taylor,K.J.W.およびSchwartz,P.
E.,「Screening for Early Ovarian Cancer,」Radiolog
y,192:1〜10,1994）。さらにCA 125検査は、それほど特
異的でない。例えば、良性婦人科疾患を有する患者の約
25％もまた、CA 125の上昇した血清レベルを有する。さ
らに、肝硬変のような肝疾患は、腹水なしの場合でさ
え、35U/mlを越えるCA 125血清レベルを上昇させる（Ta
ylor,K.J.W.およびSchwartz,P.E.,「Screening for Ear
ly Ovarian Cancer,」Radiology,192:1〜10,1994）。
従って、婦人科ガン、特に卵巣ガンを検出する、新規
で、簡単で、非侵襲的またはわずかに侵襲的な方法を持
つことが望ましく、それは被検体を卵巣ガン早期の段階
で同定するほど十分に感度がよく、婦人科ガンを良性と
悪性に区別するほど十分に特異的であるものが望まれ
る。
で、簡単で、非侵襲的またはわずかに侵襲的な方法を持
つことが望ましく、それは被検体を卵巣ガン早期の段階
で同定するほど十分に感度がよく、婦人科ガンを良性と
悪性に区別するほど十分に特異的であるものが望まれ
る。
発明の要旨
本発明は、患者の婦人科ガンの存在を検出するため
の、新しく、簡単で、わずかに侵襲的な方法を提供す
る。本方法は、患者の血漿サンプル中のリゾホスファチ
ジン酸の存在を検出する工程を包含する。
の、新しく、簡単で、わずかに侵襲的な方法を提供す
る。本方法は、患者の血漿サンプル中のリゾホスファチ
ジン酸の存在を検出する工程を包含する。
好ましい方法は、以下を包含する：患者から血液標本
を提供する工程；血液標本から実質的に血小板を含まな
い血漿サンプルを得る工程；上記の血漿サンプルから脂
質抽出物を調製する工程；および、上記の脂質抽出物中
のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程。本方法
は、悪性婦人科ガンと良性婦人科ガンとを区別するほど
十分に特異的であり、そしてわずかに侵襲的である方法
である。
を提供する工程；血液標本から実質的に血小板を含まな
い血漿サンプルを得る工程；上記の血漿サンプルから脂
質抽出物を調製する工程；および、上記の脂質抽出物中
のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程。本方法
は、悪性婦人科ガンと良性婦人科ガンとを区別するほど
十分に特異的であり、そしてわずかに侵襲的である方法
である。
本方法はまた、被検体中の子宮内膜ガン、腹膜ガン、
および子宮頸ガンの存在も検出する。従って、本方法
は、一種より多くの婦人科ガンについてスクリーニング
するのに有用である。
および子宮頸ガンの存在も検出する。従って、本方法
は、一種より多くの婦人科ガンについてスクリーニング
するのに有用である。
生物学的流体からリゾホスファチジン酸を抽出する新
規な方法もまた、提供する。生物学的流体を酸性化する
工程および酸性化したサンプルからリゾホスファチジン
酸を有機溶媒で抽出する工程を包含する方法は、生物学
的流体中のリゾホスファチジン酸の80％より多くを抽出
するのに有用である。
規な方法もまた、提供する。生物学的流体を酸性化する
工程および酸性化したサンプルからリゾホスファチジン
酸を有機溶媒で抽出する工程を包含する方法は、生物学
的流体中のリゾホスファチジン酸の80％より多くを抽出
するのに有用である。
発明の詳細な説明
本発明は、患者の婦人科ガンの存在を検出するため
の、新規で簡単な方法を提供する。本方法は、患者から
の血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出
する工程を包含する。好ましくは、血漿サンプルは、実
質的に血小板を含まない。本明細書中で記載のように、
血漿サンプルは、それが患者から得た元々の血液標本中
に存在する血小板の95％未満を含む場合に、実質的に血
小板を含まない。好ましい実施態様では、方法は、患者
から全血標本を得る工程、全血標本から実質的に血小板
を含まない血漿サンプルを得る工程、血漿サンプルから
脂質を抽出する工程、および脂質抽出物中のリゾホスフ
ァチジン酸の存在を検出する工程を包含する。
の、新規で簡単な方法を提供する。本方法は、患者から
の血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出
する工程を包含する。好ましくは、血漿サンプルは、実
質的に血小板を含まない。本明細書中で記載のように、
血漿サンプルは、それが患者から得た元々の血液標本中
に存在する血小板の95％未満を含む場合に、実質的に血
小板を含まない。好ましい実施態様では、方法は、患者
から全血標本を得る工程、全血標本から実質的に血小板
を含まない血漿サンプルを得る工程、血漿サンプルから
脂質を抽出する工程、および脂質抽出物中のリゾホスフ
ァチジン酸の存在を検出する工程を包含する。
好ましくは、血漿サンプルは、全血標本中に存在する
血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する
条件下で得られる。そのような条件は、例えば、血液凝
固阻止薬を含む管中に被検体から全血標本を採集する工
程を包含する。適切な血液凝固阻止薬は、例えば、ヘパ
リンおよびキレート化剤を含む。全血標本は、キレート
化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、また
はクエン酸ナトリウム、より好ましくはEDTA）の存在下
で採集するのが好ましい。なぜなら、キレート化剤はサ
ンプル中のホスホリパーゼ活性を低下させ、かつ全血標
本の凝固を妨げるからである。
血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する
条件下で得られる。そのような条件は、例えば、血液凝
固阻止薬を含む管中に被検体から全血標本を採集する工
程を包含する。適切な血液凝固阻止薬は、例えば、ヘパ
リンおよびキレート化剤を含む。全血標本は、キレート
化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、また
はクエン酸ナトリウム、より好ましくはEDTA）の存在下
で採集するのが好ましい。なぜなら、キレート化剤はサ
ンプル中のホスホリパーゼ活性を低下させ、かつ全血標
本の凝固を妨げるからである。
血漿は、代表的には全血標本を遠心分離して、全血標
本中の血球をペレット化すること、および上清を採集す
ることによって得られる。この上清は、全血標本中の血
漿の大部分を占める。
本中の血球をペレット化すること、および上清を採集す
ることによって得られる。この上清は、全血標本中の血
漿の大部分を占める。
好ましくは、血漿は、その手順は血球および血小板の
ペレットおよび第１の上清を提供するための第１の遠心
分離工程、ならびに血小板の第２のペレットおよび血漿
上清を提供するための、第１の上清を遠心分離する第２
の遠心分離工程を含む手順によって血液標本から得られ
る。第１の遠心分離工程の速度は、好ましくは400〜100
0×ｇの間、より好ましくは約500〜650×ｇ、最も好ま
しくは約550〜約600×ｇである。次いで、上清を管から
取り出し、そして第２の遠心分離を、6500〜10000×ｇ
の間、より好ましくは約7000〜8500×ｇの速度で行う。
２段階の遠心分離手順は、血小板からのリゾホスファチ
ジン酸の放出を最小化し、従ってサンプル中のリゾホス
ファチジン酸のより正確な決定を可能にする。
ペレットおよび第１の上清を提供するための第１の遠心
分離工程、ならびに血小板の第２のペレットおよび血漿
上清を提供するための、第１の上清を遠心分離する第２
の遠心分離工程を含む手順によって血液標本から得られ
る。第１の遠心分離工程の速度は、好ましくは400〜100
0×ｇの間、より好ましくは約500〜650×ｇ、最も好ま
しくは約550〜約600×ｇである。次いで、上清を管から
取り出し、そして第２の遠心分離を、6500〜10000×ｇ
の間、より好ましくは約7000〜8500×ｇの速度で行う。
２段階の遠心分離手順は、血小板からのリゾホスファチ
ジン酸の放出を最小化し、従ってサンプル中のリゾホス
ファチジン酸のより正確な決定を可能にする。
次いで、血漿サンプル中の実質的にすべての脂質（特
に、リン脂質）が、好ましくは、血漿サンプルから少な
くとも80％のリゾホスファチジン酸を回収する脂質抽出
手順によって抽出される。より好ましくは、脂質抽出手
順は血漿サンプル中の少なくとも85％のLPAを回収す
る。好ましい脂質抽出手順の例は、以下の工程を包含す
る：血漿サンプルを酸性化する工程；酸性化した血漿サ
ンプルを有機溶媒と混合して、水相および有機相を提供
する工程（ここで、リン脂質は優先的に有機相に分配す
る）；および、有機相を回収し、血漿サンプル中のリゾ
ホスファチジン酸の80％より多くを含む脂質抽出物を提
供する工程。好ましくは、血漿サンプルを酸性化するた
めに、塩酸を用いる。好ましくは、酸性化された血漿サ
ンプルの最終的な酸濃度は、約0.2N〜約2.0N、より好ま
しくは約1.3Nから約2.0Nである。
に、リン脂質）が、好ましくは、血漿サンプルから少な
くとも80％のリゾホスファチジン酸を回収する脂質抽出
手順によって抽出される。より好ましくは、脂質抽出手
順は血漿サンプル中の少なくとも85％のLPAを回収す
る。好ましい脂質抽出手順の例は、以下の工程を包含す
る：血漿サンプルを酸性化する工程；酸性化した血漿サ
ンプルを有機溶媒と混合して、水相および有機相を提供
する工程（ここで、リン脂質は優先的に有機相に分配す
る）；および、有機相を回収し、血漿サンプル中のリゾ
ホスファチジン酸の80％より多くを含む脂質抽出物を提
供する工程。好ましくは、血漿サンプルを酸性化するた
めに、塩酸を用いる。好ましくは、酸性化された血漿サ
ンプルの最終的な酸濃度は、約0.2N〜約2.0N、より好ま
しくは約1.3Nから約2.0Nである。
酸性化された血漿サンプルからリゾホスファチジン酸
を抽出するために適切な有機溶媒は、例えばブタノー
ル、イソプロパノール、ならびに極性有機溶媒（例え
ば、メタノール）および非極性有機溶媒（例えば、クロ
ロホルム）を含む混合有機溶媒を含む。好ましくは、有
機溶媒はメタノールおよびクロロホルム（2:1の比）の
混合物である。
を抽出するために適切な有機溶媒は、例えばブタノー
ル、イソプロパノール、ならびに極性有機溶媒（例え
ば、メタノール）および非極性有機溶媒（例えば、クロ
ロホルム）を含む混合有機溶媒を含む。好ましくは、有
機溶媒はメタノールおよびクロロホルム（2:1の比）の
混合物である。
本明細書中で「LPA」とも言及されるリゾホスファチ
ジン酸は、次いで、従来技術（例えば、薄層クロマトグ
ラフィーによる分離）を用いて有機相中の他のリン脂質
から分離される。リゾホスファチジルコリン、リゾホス
ファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、
リゾホスファチジルエタノールアミン、ならびにリゾホ
スファチジン酸、パルミトイル−LPA、オレオイル−LP
A、およびステアロイル−LPAを含む標準物質を１次元TL
Cによって分離した予備研究は、LPAのRf値がパルミトイ
ル−LPAおよびステアロイル−LPAについては0.14、そし
てオレオイル−LPAについては0.13であることを示し
た。予備研究は、各LPA種が、リゾホスファチジルコリ
ンの速度よりも遅い速度で、およびリゾホスファチジル
イノシトール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスフ
ァチジルエタノールアミンと異なる速度で移動すること
もまた示した。リン脂質標準物質を２次元TLCに供した
予備研究もまた、この様式で（すなわち、１次元TLCに
よって）調製したLPAが任意の他のリン脂質を含まない
ことを示した。
ジン酸は、次いで、従来技術（例えば、薄層クロマトグ
ラフィーによる分離）を用いて有機相中の他のリン脂質
から分離される。リゾホスファチジルコリン、リゾホス
ファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、
リゾホスファチジルエタノールアミン、ならびにリゾホ
スファチジン酸、パルミトイル−LPA、オレオイル−LP
A、およびステアロイル−LPAを含む標準物質を１次元TL
Cによって分離した予備研究は、LPAのRf値がパルミトイ
ル−LPAおよびステアロイル−LPAについては0.14、そし
てオレオイル−LPAについては0.13であることを示し
た。予備研究は、各LPA種が、リゾホスファチジルコリ
ンの速度よりも遅い速度で、およびリゾホスファチジル
イノシトール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスフ
ァチジルエタノールアミンと異なる速度で移動すること
もまた示した。リン脂質標準物質を２次元TLCに供した
予備研究もまた、この様式で（すなわち、１次元TLCに
よって）調製したLPAが任意の他のリン脂質を含まない
ことを示した。
LPA画分中のリゾホスファチジン酸の量は、次いで、
従来技術を用いることで数量化される。用いられる数量
化の技術は、被検体によって提供される血液標本の量に
依存する。例えば、血液標本の大きさが2ml以下である
場合、LPAをピコモル量で検出可能な数量化の技術を用
いることが好ましい。LPAをピコモル量で検出するのに
適切な技術は、例えば、単離されたLPA画分を加水分解
し、次いで加水分解物中の各脂肪酸の量をガスクロマト
グラフィーによって数量化することを含む。血液標本の
大きさが20ml以上である場合、LPAをナノモル量で検出
可能な技術（例えば、LPA画分中の全亜リン酸定量）が
適切である。
従来技術を用いることで数量化される。用いられる数量
化の技術は、被検体によって提供される血液標本の量に
依存する。例えば、血液標本の大きさが2ml以下である
場合、LPAをピコモル量で検出可能な数量化の技術を用
いることが好ましい。LPAをピコモル量で検出するのに
適切な技術は、例えば、単離されたLPA画分を加水分解
し、次いで加水分解物中の各脂肪酸の量をガスクロマト
グラフィーによって数量化することを含む。血液標本の
大きさが20ml以上である場合、LPAをナノモル量で検出
可能な技術（例えば、LPA画分中の全亜リン酸定量）が
適切である。
本明細書中で開示される方法は、婦人科ガン（例え
ば、子宮頸ガン、子宮内膜ガンおよび腹膜ガン）を検出
するのに有用である。上皮卵巣ガンは、漿腫瘍、粘液性
腫瘍、子宮内膜（endometroid）腫瘍、明細胞腫瘍、未
分化ガン、混合上皮腫瘍、および未分類上皮腫瘍を含
む。
ば、子宮頸ガン、子宮内膜ガンおよび腹膜ガン）を検出
するのに有用である。上皮卵巣ガンは、漿腫瘍、粘液性
腫瘍、子宮内膜（endometroid）腫瘍、明細胞腫瘍、未
分化ガン、混合上皮腫瘍、および未分類上皮腫瘍を含
む。
外科的な段階は、病気の重篤度を示しており、Stage
Iは最も低く重篤であり、そしてStage IVは最も高く重
篤である。International Federation of Gynecology a
nd Obstetricsによって確立された基準によれば、卵巣
ガンは卵巣に限定されており、Stage Iの卵巣ガンでは
腹水を含むことも含まないこともあり得る。Stage IIに
おいては、ガンの骨盤への移転が存在し、そして子宮ま
たは卵管への転移もあり得る。Stage IIIの卵巣ガン
は、腹部への転移によって特徴づけられる。Stage IVに
おいては、腹腔の外側へのガンの遠隔転移がある。
Iは最も低く重篤であり、そしてStage IVは最も高く重
篤である。International Federation of Gynecology a
nd Obstetricsによって確立された基準によれば、卵巣
ガンは卵巣に限定されており、Stage Iの卵巣ガンでは
腹水を含むことも含まないこともあり得る。Stage IIに
おいては、ガンの骨盤への移転が存在し、そして子宮ま
たは卵管への転移もあり得る。Stage IIIの卵巣ガン
は、腹部への転移によって特徴づけられる。Stage IVに
おいては、腹腔の外側へのガンの遠隔転移がある。
本明細書中で開示される方法は、簡単で、わずかに侵
襲的で、そして被検体からの血液標本のみを必要とす
る。従って、そのような方法は、以前にガンを保有して
いると診断されたことのない患者、特に婦人科ガンの危
険がある患者のスクリーニングにもまた有用である。そ
のような患者は、この病気の家族歴によって高い危険に
ある女性、無排卵周期で閉経前の女性、および閉経後の
女性を含む。
襲的で、そして被検体からの血液標本のみを必要とす
る。従って、そのような方法は、以前にガンを保有して
いると診断されたことのない患者、特に婦人科ガンの危
険がある患者のスクリーニングにもまた有用である。そ
のような患者は、この病気の家族歴によって高い危険に
ある女性、無排卵周期で閉経前の女性、および閉経後の
女性を含む。
本発明は、下記の実施例によってさらに記載される。
しかし、その実施例は、いかなる方法でも、本発明の精
神または展望のいずれをも限定するものとみなされ得な
い。
しかし、その実施例は、いかなる方法でも、本発明の精
神または展望のいずれをも限定するものとみなされ得な
い。
実施例
血漿サンプルを、84人の女性の被検体から提供される
血液標本から得た。約2mlの全血標本を、7.2mgのEDTAを
含む5ml真空容器管（vacutainer tube）中に各被検体か
ら収集した。
血液標本から得た。約2mlの全血標本を、7.2mgのEDTAを
含む5ml真空容器管（vacutainer tube）中に各被検体か
ら収集した。
全血標本からの血漿サンプルの取得
全血標本を５分間580×ｇで遠心分離し、血球および
血小板のペレットならびに上清を提供した。上清をシリ
コン処理した微量遠心分離管に移し、そして５分間8000
×ｇで遠心分離し、第２のペレットおよび血漿上清を提
供した。血漿上清を、すぐに処理するか、または−70℃
で貯蔵するかのいずれかをした。
血小板のペレットならびに上清を提供した。上清をシリ
コン処理した微量遠心分離管に移し、そして５分間8000
×ｇで遠心分離し、第２のペレットおよび血漿上清を提
供した。血漿上清を、すぐに処理するか、または−70℃
で貯蔵するかのいずれかをした。
血漿サンプルからのLPAの抽出
血漿サンプルからの脂質、特にLPAの抽出を、０〜４
℃で実施した。血漿の各1mLのサンプルを、0.2mLの12N
HClを加えることにより酸性化し、約2.0Nの最終HCl濃度
の血漿サンプルを提供した。混合後、酸性化した血漿に
2:1の比率のメタノール／クロロホルムを含む混合有機
溶媒4mLを加え、そして混合物を１分間ボルテックス
し、そして氷上で10分間インキュベートした。1mLのク
ロロホルムおよび1.25mLのH2Oを、混合物に加えた。十
分に混合した後、混合物を４℃で10分間1000×ｇで遠心
分離した。下の有機層を新たなガラス管に移し、そして
窒素下40℃で乾燥させ、リン脂質抽出物を提供した。
℃で実施した。血漿の各1mLのサンプルを、0.2mLの12N
HClを加えることにより酸性化し、約2.0Nの最終HCl濃度
の血漿サンプルを提供した。混合後、酸性化した血漿に
2:1の比率のメタノール／クロロホルムを含む混合有機
溶媒4mLを加え、そして混合物を１分間ボルテックス
し、そして氷上で10分間インキュベートした。1mLのク
ロロホルムおよび1.25mLのH2Oを、混合物に加えた。十
分に混合した後、混合物を４℃で10分間1000×ｇで遠心
分離した。下の有機層を新たなガラス管に移し、そして
窒素下40℃で乾燥させ、リン脂質抽出物を提供した。
この抽出手順の全回収率および再現性を、内因性のオ
レオイル−LPAを欠く３点平行の血漿サンプルに10nmol
の合成オレオイル−LPAを加えることによって試験し
た。サンプルを本手順により抽出し、そして各サンプル
中のオレオイル−LPAの量を定量した。この分析は、本
抽出手順によるLPAの平均回収が92.7％（±5.6％の標準
誤差）であることを示した。
レオイル−LPAを欠く３点平行の血漿サンプルに10nmol
の合成オレオイル−LPAを加えることによって試験し
た。サンプルを本手順により抽出し、そして各サンプル
中のオレオイル−LPAの量を定量した。この分析は、本
抽出手順によるLPAの平均回収が92.7％（±5.6％の標準
誤差）であることを示した。
脂質抽出物中のLPAの単離
各脂質抽出物を50μｌの2:1メタノール／クロロホル
ム混合物中に溶解し、そしてEM Science,Darmstadt,Ger
manyから得た事前コートしたシリカゲル60TLCプレート
（20×20cm、層の厚さ250mm）の単一レーンにロードし
た。Avanti Polar−Lipids,Inc.から得たオレオイル−L
PA10〜50μｌを含有する2:1メタノール／クロロホルム
混合物の50μｌアリコートをプレートの１つの外側のレ
ーンにロードし、そしてSigma Chemical Companyから得
たリゾホスファチジルコリン10〜50μｇを含有するクロ
ロホルムの50μｌアリコートをプレートの反対の外側の
レーンにロードした。オレオイル−LPAおよびリゾホス
ファチジルコリンを、プレート上のLPA画分の位置を決
定するための移動度の参照として使用した。脂質を、室
温で、約３時間、クロロホルム−メタノール−水酸化ア
ンモニウム（65:35:5.5）の混合物を用いて展開した。
次いで、オレオイル−LPAおよびリゾホスファチジルコ
リンの標準品を含む外側のレーンに0.1％８−アニリノ
−１−ナフタレン−スルホン酸を噴霧し、そしてこれを
紫外線下で可視化した。
ム混合物中に溶解し、そしてEM Science,Darmstadt,Ger
manyから得た事前コートしたシリカゲル60TLCプレート
（20×20cm、層の厚さ250mm）の単一レーンにロードし
た。Avanti Polar−Lipids,Inc.から得たオレオイル−L
PA10〜50μｌを含有する2:1メタノール／クロロホルム
混合物の50μｌアリコートをプレートの１つの外側のレ
ーンにロードし、そしてSigma Chemical Companyから得
たリゾホスファチジルコリン10〜50μｇを含有するクロ
ロホルムの50μｌアリコートをプレートの反対の外側の
レーンにロードした。オレオイル−LPAおよびリゾホス
ファチジルコリンを、プレート上のLPA画分の位置を決
定するための移動度の参照として使用した。脂質を、室
温で、約３時間、クロロホルム−メタノール−水酸化ア
ンモニウム（65:35:5.5）の混合物を用いて展開した。
次いで、オレオイル−LPAおよびリゾホスファチジルコ
リンの標準品を含む外側のレーンに0.1％８−アニリノ
−１−ナフタレン−スルホン酸を噴霧し、そしてこれを
紫外線下で可視化した。
血漿サンプルからの脂質抽出物をロードしたレーン中
の各々の単離されたLPA画分を、プレートからKimble,Vi
neland,New Jerseyからの別々の15mlディスポーザブル
ガラス遠心分離管中にかきとった。LPA画分は、オレオ
イル−LPA標準品のRfに対応するプレートの距離まで移
動した、そしてリゾホスファチジルコリン標準品のRfま
で伸長するがより短いすべての脂質を含んだ。
の各々の単離されたLPA画分を、プレートからKimble,Vi
neland,New Jerseyからの別々の15mlディスポーザブル
ガラス遠心分離管中にかきとった。LPA画分は、オレオ
イル−LPA標準品のRfに対応するプレートの距離まで移
動した、そしてリゾホスファチジルコリン標準品のRfま
で伸長するがより短いすべての脂質を含んだ。
各サンプルから単離したLPA量の測定
2mLの1MエタノールKOHを、単離されたLPA画分を含む
各管に加えた。次いで、その管を60℃で１時間インキュ
ベートし、管中に存在するLPAを加水分解した。冷却
後、メチルベヘネート（クロロホルム中1.5mg/mL）を含
む内部標準溶液５μｌ、1mLの6N HCl、5mLのH2O、およ
び5mLのエチルエーテルを加水分解物に加えた。混合物
を30秒間ボルテックスし、そして1000×ｇで10分間遠心
分離した。次いで、上層を新たなガラス管に移し、そし
て窒素下40℃で乾燥した。残留物（これは、LPAから遊
離した脂肪酸を含んでいた）を、0.6mLの石油エーテル
中に溶解し、そして溶解した脂肪酸を、各管に1mLのBCl
3−メタノール試薬を加え、そして100℃で10分間インキ
ュベートすることにより、メチル基転移した。BCl3−メ
タノールを、Supelco Inc.,Bellefonte,PAから得た。脂
肪酸メチルエステルを、1mLの石油エーテルで抽出し
た。混合物を10秒間ボルテックスし、そして1000×ｇで
５分間遠心分離した。最上層を、ねじぶた式のSupelco
サンプルバイアル3.7mLに移し、そして窒素下40℃で乾
燥した。次いで、残余物を25μｌのクロロホルム中に溶
解し、そして５〜15μｌのクロロホルム溶液をガスクロ
マトグラフィーによる分析用に使用した。
各管に加えた。次いで、その管を60℃で１時間インキュ
ベートし、管中に存在するLPAを加水分解した。冷却
後、メチルベヘネート（クロロホルム中1.5mg/mL）を含
む内部標準溶液５μｌ、1mLの6N HCl、5mLのH2O、およ
び5mLのエチルエーテルを加水分解物に加えた。混合物
を30秒間ボルテックスし、そして1000×ｇで10分間遠心
分離した。次いで、上層を新たなガラス管に移し、そし
て窒素下40℃で乾燥した。残留物（これは、LPAから遊
離した脂肪酸を含んでいた）を、0.6mLの石油エーテル
中に溶解し、そして溶解した脂肪酸を、各管に1mLのBCl
3−メタノール試薬を加え、そして100℃で10分間インキ
ュベートすることにより、メチル基転移した。BCl3−メ
タノールを、Supelco Inc.,Bellefonte,PAから得た。脂
肪酸メチルエステルを、1mLの石油エーテルで抽出し
た。混合物を10秒間ボルテックスし、そして1000×ｇで
５分間遠心分離した。最上層を、ねじぶた式のSupelco
サンプルバイアル3.7mLに移し、そして窒素下40℃で乾
燥した。次いで、残余物を25μｌのクロロホルム中に溶
解し、そして５〜15μｌのクロロホルム溶液をガスクロ
マトグラフィーによる分析用に使用した。
加水分解によってLPAから遊離された脂肪酸のGC分析
各々のサンプル中の各脂肪酸量を測定するために、Su
pelco Inc.からの100/120Chromosorb WAWに３％SP−231
0、２％SP−2300でコーティングした融合シリカカラム
（25m×0.2mm）を備えた、Hewlett−Packard Model5710
Aガスクロマトグラフを使用した。ガスクロマトグラフ
の条件は以下の通りであった：オーブンの開始温度は18
5℃であった;2分後、温度を２℃／分で230℃まで上昇さ
せ、そして４分間保持した；インジェクター温度は200
℃であった；検出器温度は、300℃であった；窒素がキ
ャリアガスであり、50PSI下、流速30ml/分であった；空
気流速は24PSI下、240ml/分であった；水素流は15Psi
下、30ml/分であった。脂肪酸メチルエステルを検出す
るために、フレームイオン化検出器を用いた。Nu Check
Prep Inc..Elysian,MNから得た、２つの脂肪酸メチル
エステル標準混合物を用いて、２つの標準曲線を得た。
２つの標準混合物は、パルミチン酸メチル、ステアリン
酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、アラ
キドン酸メチル、およびベヘン酸（behanete）メチルの
エステルの異なる組み合わせを含んだ。保持時間は、パ
ルミチン酸メチルについては3.8分、ステアリン酸メチ
ルについては6.7分、オレイン酸メチルについては7.3
分、リノール酸メチルについては8.3分、アラキドン酸
メチルについては14.0分、およびベヘン酸メチル（内部
標準）については15.3分であった。
pelco Inc.からの100/120Chromosorb WAWに３％SP−231
0、２％SP−2300でコーティングした融合シリカカラム
（25m×0.2mm）を備えた、Hewlett−Packard Model5710
Aガスクロマトグラフを使用した。ガスクロマトグラフ
の条件は以下の通りであった：オーブンの開始温度は18
5℃であった;2分後、温度を２℃／分で230℃まで上昇さ
せ、そして４分間保持した；インジェクター温度は200
℃であった；検出器温度は、300℃であった；窒素がキ
ャリアガスであり、50PSI下、流速30ml/分であった；空
気流速は24PSI下、240ml/分であった；水素流は15Psi
下、30ml/分であった。脂肪酸メチルエステルを検出す
るために、フレームイオン化検出器を用いた。Nu Check
Prep Inc..Elysian,MNから得た、２つの脂肪酸メチル
エステル標準混合物を用いて、２つの標準曲線を得た。
２つの標準混合物は、パルミチン酸メチル、ステアリン
酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、アラ
キドン酸メチル、およびベヘン酸（behanete）メチルの
エステルの異なる組み合わせを含んだ。保持時間は、パ
ルミチン酸メチルについては3.8分、ステアリン酸メチ
ルについては6.7分、オレイン酸メチルについては7.3
分、リノール酸メチルについては8.3分、アラキドン酸
メチルについては14.0分、およびベヘン酸メチル（内部
標準）については15.3分であった。
各サンプル中の各脂肪酸の濃度を計算し、そして各血
漿サンプル中の全LPAの濃度を得るために合算した。各L
PA種および各サンプル中の全LPAのμＭでの濃度を、表
Ｉに示す。
漿サンプル中の全LPAの濃度を得るために合算した。各L
PA種および各サンプル中の全LPAのμＭでの濃度を、表
Ｉに示す。
各女性被検体とも、健常であるかまたは活性な疾患を
有しているかを決定するために、１つ以上の慣習的診断
手順を受けた。その診断手順は、適切であれば、任意の
検出される塊の臨床検査、臨床化学、および外科的評価
を含んだ。これらの慣習的診断手順に基づいて、患者を
表Ｉに列挙される疾患のうちの１つの活性な形態を有す
ると、または健常であると診断した。
有しているかを決定するために、１つ以上の慣習的診断
手順を受けた。その診断手順は、適切であれば、任意の
検出される塊の臨床検査、臨床化学、および外科的評価
を含んだ。これらの慣習的診断手順に基づいて、患者を
表Ｉに列挙される疾患のうちの１つの活性な形態を有す
ると、または健常であると診断した。
婦人科ガンを有すると診断された患者の血漿中の各LP
A種の平均濃度±SE、および婦人科ガンを有さないと診
断された患者の血漿中の各LPA種の平均濃度±SEを表II
に示す。婦人科ガンを有する患者の血漿中の全LPAの平
均濃度±SE、および婦人科ガンを有さない患者の血漿中
の全LPAの平均濃度±SEを表IIIに示す。Practical Nonp
arametric中でW.J.Conoverによって記載されているよう
な、Wilcoxon Rank Sum統計検定を用いて、統計学的ベ
キ計算（statistical power calculations）を実施し
た。LPAレベルが検出以下の場合、0.1μｍを計算中で用
いた。
A種の平均濃度±SE、および婦人科ガンを有さないと診
断された患者の血漿中の各LPA種の平均濃度±SEを表II
に示す。婦人科ガンを有する患者の血漿中の全LPAの平
均濃度±SE、および婦人科ガンを有さない患者の血漿中
の全LPAの平均濃度±SEを表IIIに示す。Practical Nonp
arametric中でW.J.Conoverによって記載されているよう
な、Wilcoxon Rank Sum統計検定を用いて、統計学的ベ
キ計算（statistical power calculations）を実施し
た。LPAレベルが検出以下の場合、0.1μｍを計算中で用
いた。
表Ｉに示すように、Ｉ期、II期、III期、またはIV期
の卵巣ガンを有する各患者において、検出可能なレベル
の全LPAが見出さた。従って、早期の卵巣ガンまたは後
期の卵巣ガンを有すると診断された患者の全員が、患者
の血漿中に検出可能なレベルのLPAを有した。卵巣ガン
を有するいずれの患者においても、偽陰性は観測されな
かった。Ｉ期およびII期の卵巣ガンを有する被検体中の
全LPAの濃度は、4.67〜32.32μＭの範囲であった。III
期およびIV期のガンを有する被検体中の全LPAの濃度
は、2.53〜56.17μＭの範囲であった。さらに、卵巣ガ
ンを有する患者すべてにおいて検出可能なレベルのステ
アロイル−LPAが見出され、そして卵巣ガンを有する患
者19人中18人において、検出可能なレベルのLPA種のパ
ルミトイル−LPAおよびオレオイルーLPAが見出された。
の卵巣ガンを有する各患者において、検出可能なレベル
の全LPAが見出さた。従って、早期の卵巣ガンまたは後
期の卵巣ガンを有すると診断された患者の全員が、患者
の血漿中に検出可能なレベルのLPAを有した。卵巣ガン
を有するいずれの患者においても、偽陰性は観測されな
かった。Ｉ期およびII期の卵巣ガンを有する被検体中の
全LPAの濃度は、4.67〜32.32μＭの範囲であった。III
期およびIV期のガンを有する被検体中の全LPAの濃度
は、2.53〜56.17μＭの範囲であった。さらに、卵巣ガ
ンを有する患者すべてにおいて検出可能なレベルのステ
アロイル−LPAが見出され、そして卵巣ガンを有する患
者19人中18人において、検出可能なレベルのLPA種のパ
ルミトイル−LPAおよびオレオイルーLPAが見出された。
対照的に、健常であると分類された23人の被検体のう
ち19人は、それらの血漿中に検出可能なレベルのLPAを
有さなかった。残りの４人の健常な患者は、それらの血
漿中に0.42〜4.93μＭの範囲の、低濃度のLPAを有し
た。これらの値が偽陽性を示すかどうか、またこれらの
個体が、患者を診断するために使用される他の慣習的な
手順によって検出されない婦人科ガンを有したかどうか
は未知である。さらに、卵巣ガンを有すると診断された
患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度は、健常
患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度より、有
意に高かった。これらの結果は、その卵巣ガンがなお発
達の早期にある患者を含む、婦人科ガンの卵巣ガンを有
する患者を固定するために、本発明の方法が非常に感度
がよく、それゆえ有用であるということを確証する。こ
の結果はまた、患者の血漿中のパルミトイル−LPAもし
くはステアロイル−LPAもしくはオレオイル−LPA、また
はそれらの組み合わせの存在を検出する方法もまた、卵
巣ガンを検出するために有用であることを示す。
ち19人は、それらの血漿中に検出可能なレベルのLPAを
有さなかった。残りの４人の健常な患者は、それらの血
漿中に0.42〜4.93μＭの範囲の、低濃度のLPAを有し
た。これらの値が偽陽性を示すかどうか、またこれらの
個体が、患者を診断するために使用される他の慣習的な
手順によって検出されない婦人科ガンを有したかどうか
は未知である。さらに、卵巣ガンを有すると診断された
患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度は、健常
患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度より、有
意に高かった。これらの結果は、その卵巣ガンがなお発
達の早期にある患者を含む、婦人科ガンの卵巣ガンを有
する患者を固定するために、本発明の方法が非常に感度
がよく、それゆえ有用であるということを確証する。こ
の結果はまた、患者の血漿中のパルミトイル−LPAもし
くはステアロイル−LPAもしくはオレオイル−LPA、また
はそれらの組み合わせの存在を検出する方法もまた、卵
巣ガンを検出するために有用であることを示す。
LPAは、子宮頸ガンおよび子宮内膜ガンを有すると診
断された被検体の全員の血漿、ならびに腹膜ガンを有す
ると診断された９人の被検体のうちの８人の血漿中でも
また、検出された。腹膜ガンは、血漿中に検出可能なレ
ベルのLPAを有さなかった１人の患者中で、全体的に脱
塊（debulk）されていた。この結果は、そのガンが外科
手術によって完全に除去された患者の血漿中に、LPAは
存在しないことを示唆する。従って、本発明の方法は、
ガンの外科的除去を受けた患者中の、婦人科ガンの再発
をモニターするために有用である。子宮頸ガンおよび子
宮内膜ガンを有する被検体の血漿中のLPA濃度は、2.00
〜63.23μＭの範囲であった。
断された被検体の全員の血漿、ならびに腹膜ガンを有す
ると診断された９人の被検体のうちの８人の血漿中でも
また、検出された。腹膜ガンは、血漿中に検出可能なレ
ベルのLPAを有さなかった１人の患者中で、全体的に脱
塊（debulk）されていた。この結果は、そのガンが外科
手術によって完全に除去された患者の血漿中に、LPAは
存在しないことを示唆する。従って、本発明の方法は、
ガンの外科的除去を受けた患者中の、婦人科ガンの再発
をモニターするために有用である。子宮頸ガンおよび子
宮内膜ガンを有する被検体の血漿中のLPA濃度は、2.00
〜63.23μＭの範囲であった。
対照的に、婦人科ガン以外のガン、すなわち、乳ガ
ン、白血病、および子宮肉腫を有すると診断された17人
の患者のうち15人の患者において、検出可能なレベルの
LPAは存在しなかった。さらに、良性婦人科疾患である
子宮類線維を有する被検体のいずれにおいても、検出可
能なレベルのLPAは存在しなかった。結合組織に由来す
る婦人科肉腫、および良性子宮類線維を有する４人の患
者のうち３人由来の血漿は、それらの血漿中に検出可能
なレベルの全LPAを有さなかったので、それぞれの婦人
科器官の悪性上皮細胞が、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮
内膜ガン、および腹膜ガンを有する患者の血漿中のLPA
の供給源であり得ると考えられる。
ン、白血病、および子宮肉腫を有すると診断された17人
の患者のうち15人の患者において、検出可能なレベルの
LPAは存在しなかった。さらに、良性婦人科疾患である
子宮類線維を有する被検体のいずれにおいても、検出可
能なレベルのLPAは存在しなかった。結合組織に由来す
る婦人科肉腫、および良性子宮類線維を有する４人の患
者のうち３人由来の血漿は、それらの血漿中に検出可能
なレベルの全LPAを有さなかったので、それぞれの婦人
科器官の悪性上皮細胞が、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮
内膜ガン、および腹膜ガンを有する患者の血漿中のLPA
の供給源であり得ると考えられる。
その感度、簡便さ、および低コストのために、本発明
の方法は婦人科ガンについて患者をスクリーニングする
ために有用である。本発明の方法のためおよびCA 125試
験のための血液標本を、患者から同時に採取し得るの
で、本発明の方法によって婦人科ガンについて患者をス
クリーニングするときに、CA 125試験もまた実施され得
る。あるいは、本発明の方法は婦人科ガンを検出するた
めに単独で使用され得る。
の方法は婦人科ガンについて患者をスクリーニングする
ために有用である。本発明の方法のためおよびCA 125試
験のための血液標本を、患者から同時に採取し得るの
で、本発明の方法によって婦人科ガンについて患者をス
クリーニングするときに、CA 125試験もまた実施され得
る。あるいは、本発明の方法は婦人科ガンを検出するた
めに単独で使用され得る。
LPAは良性婦人科ガンを有する患者の血漿中に存在し
ないので、本発明の方法は、婦人科塊（mass）を有する
患者において、良性である婦人科疾患と悪性である婦人
科疾患とを区別するためにもまた有用である。
ないので、本発明の方法は、婦人科塊（mass）を有する
患者において、良性である婦人科疾患と悪性である婦人
科疾患とを区別するためにもまた有用である。
本発明は、本発明を実施するために本発明者らに現在
既知の最良の態様を構成する、多くの好ましい実施態様
に関して記載されているが、当業者に明白であるような
種々の変形および改変が、本明細書に添付される請求の
範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱すること
なしになされ得ることは、理解されるべきである。
既知の最良の態様を構成する、多くの好ましい実施態様
に関して記載されているが、当業者に明白であるような
種々の変形および改変が、本明細書に添付される請求の
範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱すること
なしになされ得ることは、理解されるべきである。
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(72)発明者 キャセイ， グラハム
アメリカ合衆国 オハイオ 44022，
モアランド ヒルズ，スカイライン ド
ライブ 55
(56)参考文献 岡山県立大学保険福祉学部紀要 第１
巻第１号 第29−34頁 1994年
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48
G01N 33/49
Claims (7)
- 【請求項１】被検体中の婦人科ガンの存在を検出する方
法であって、以下の工程： （ａ）該被検体から採られた血液標本から血漿サンプル
を調製する工程；および （ｂ）該血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在
を検出する工程 を包含し、ここで、該婦人科ガンが、腹膜ガン、子宮内
膜ガン、子宮頸ガン、およびそれらの組み合わせからな
る群から選択される、方法。 - 【請求項２】以下の工程： （ａ）血球および血小板の第１のペレットならびに第１
の上清を得るために、前記血液標本を400×ｇから1000
×ｇの間の第１の速度で遠心分離する工程；および （ｂ）第２のペレットならびに第２の上清を得るため
に、工程（ａ）の該第１の上清を6500×ｇから10000×
ｇの間の第２の速度で遠心分離する工程； （ｃ）前記血漿サンプルを提供するために、工程（ｂ）
から該第２の上清を収集する工程 を包含するプロセスによって該血液標本から該血漿サン
プルを調製する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】以下の工程： （ａ）前記血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工
程； （ｂ）該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を
検出する工程 を包含するプロセスによって該血漿サンプル中のリゾホ
スファチジン酸の存在を検出する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】以下の工程： （ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；
および （ｂ）該リン脂質画分中のリゾホスファチジン酸の存在
を検出する工程 を包含するプロセスによって該脂質抽出物中のリゾホス
ファチジン酸の存在を検出する、請求項３に記載の方
法。 - 【請求項５】以下の工程： （ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；
および （ｂ）該リン脂質画分中のパルミトイル−LPA、もしく
はステアロイル−LPA、もしくはオレオイル−LPA、また
はそれらの組み合わせの存在を検出する工程 を包含するプロセスによって前記脂質抽出物中のリゾホ
スファチジン酸の存在を検出する、請求項３に記載の方
法。 - 【請求項６】被検体中の婦人科ガンを検出する方法であ
って、以下の工程： （ａ）該被検体から採られた、実質的に血小板を含まな
い血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；および （ｂ）該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を
検出する工程 を包含し、ここで、該婦人科ガンが、腹膜ガン、子宮内
膜ガン、子宮頸ガン、およびそれらの組み合わせからな
る群から選択される、方法。 - 【請求項７】腹膜ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、お
よびそれらの組み合わせからなる群から選択される婦人
科ガンを検出する方法であって、該方法は、 被験体由来の血液サンプルにおけるLPAを検出する工程
であって、該血液サンプルは、抗凝固剤を含む、工程、 を包含する、方法。
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