CN1226316A - 检测妇科癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的检测患者存在的妇科癌症的方法。本方法包括检测患者血浆样品中存在的溶血磷脂酸,该方法适用于检测卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌及腹膜癌。在一个优选的实施方案,该方法包括:由患者提供一份血样、在使血样中的血小板最少释放溶血磷脂酸进入血浆的条件下由血样获得血浆样品、从血浆提取脂质及检测脂质提取物中的溶血磷脂酸的存在。也提供一个由生物体液提取溶血磷脂酸的新方法。该方法包括酸化生物体液并且由酸化的样品和用有机溶剂从酸化样品中提取溶血磷脂酸,该方法可以用于从生物体液中提取大于89%的溶血磷脂酸。

Description

检测妇科癌症的方法
本发明背景
妇科癌症如卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌及腹膜癌为美国和欧洲妇女中最常见的引起癌症死亡的原因。据估计1996年在美国仅卵巢癌就导致14800人死亡。这种悲惨结果至少部分由于不能在肿瘤发展的早期检测卵巢癌。当卵巢癌在早期被诊断出时，其治愈率近90％。相反，对进展期疾病的妇女5年随访显示不超过15％的较差的存活率。因此，早期诊断是最有效的改善卵巢癌预后的方法之一。
阴道超声方法(transvaginal sonography)是目前用于检测卵巢癌的已有技术中最灵敏的方法。然而，阴道超声法是非特异性的，即它可以检测良性瘤也可以检测恶性肿瘤。因此，用阴道超声法检测卵巢肿瘤必须再经第二种能够区分良性瘤与恶性瘤的诊断方法的检测。此外，阴道超声法是很昂贵的，因而不适于作为大量病人的普查。
一般，通过外科的方法例如由外科法取自病人的肿块的活组织检验或肿块的抽吸及细胞学检验来区分良性卵巢肿瘤与恶性卵巢肿瘤。然而，这些技术是高侵入性的、昂贵的，并且在用抽吸术时可导致癌变细胞释放进入腹腔。
高分子量粘蛋白样糖蛋白-抗原决定簇CA 125是现行筛查卵巢癌所选择的血清生物标记。然而CA 125检测受到两个主要的限制。首先它不很敏感。例如，升高的血清CA 125水平，即高于临界值(cut offpoint)35U/ml的水平存在于少于50％的卵巢癌Ⅰ期患者中(Taylor,K.J.W.及Schwartz,P.E.,“Screening for Early Ovarian Cancer,”Radiology,192:1-10,1994)。此外，CA 125检测不是非常特异的。例如，约25％患有良性妇科疾病的患者也有CA 125血清水平的升高。另外，肝病如肝硬变尽管没有腹水，血清CA 125水平仍升至高于35U/ml(Taylor,K.J.W.及Schwartz,P.E.,“Screening for Early Ovarian Cancer,”Radiology,192:1-10,1994)。
因而，期望有一种新的、简便的、非侵入性的或边缘侵入性的检测妇科癌症，特别是卵巢癌症的方法，该方法应是对卵巢癌的早期阶段足够敏感的，并且对鉴别良性与恶性妇科癌症有足够特异性的方法。
本发明概述
本发明提供新的、简便的、边缘侵入性的用于检测患者妇科癌症的存在的方法。该方法包括检验患者血浆样品中溶血磷脂酸的存在。
优选的方法包括：提供得自患者的血样，由该血样得到基本上不含血小板的血浆样品，由该血浆样品制备脂质提取物及在所述脂质提取物中检测溶血磷脂酸的存在。因为本法在卵巢癌早期阶段患者中对检测卵巢癌是足够灵敏的，对区分良性妇科与恶性妇科癌症有足够特异性的且是边缘侵入性的，因此该方法对筛查卵巢癌的患者特别有用。
本方法也用于检测患者中子宫内膜癌、腹膜癌、及宫颈癌的存在。因而本方法对筛查多种妇科癌症是有用的。
也提供由生物体液(biological fluid)提取溶血磷脂酸的新方法。所述包括酸化生物体液并用有机溶剂由该酸化的样品中提取溶血磷脂酸的方法可用于在生物体液中提取多于80％的溶血磷脂酸。本发明的详细说明
本发明提供新的、简便的用于检测患者妇科癌症特别是卵巢癌存在的方法。该方法包括检测得自患者的血浆样品中溶血磷脂酸的存在。优选该血浆样品基本不含血小板。如此处所述，当在得自患者的原血样中含有少于95％的血小板时，血浆样品基本不含血小板。在优选的实施例中，所述方法包括提供得自患者的全血样，由该全血样得到基本上不含血小板的血浆样品，由该血浆样品提取脂质及检测在所述脂质提取物中溶血磷脂酸的存在。
优选所述血浆样品于存在所述全血样中血小板最小释放溶血磷脂酸的条件下得到。此种条件包括，例如，将患者的全血样收集在含抗凝剂的试管中。合适的抗凝剂包括，例如，肝素和螯合剂。优选所述全血样在螯合剂，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或枸橼酸钠的存在下收集，更优选EDTA，因为螯合剂既可减少所述样品中磷酯酶的活性又可防止所述全血样的血凝。
所述血浆一般由离心全血样以沉淀全血样中的血细胞并收集在全血样中占血浆主要部分的上清液得到。
优选所述血浆由下述方法得自所述血样，所述方法包括，第一次离心步骤以提供血细胞和血小板的沉淀及第一次的上清液，及第二次离心步骤，其中第一次上清液经离心提供第二次血小板沉淀及血浆上清液。优选第一次离心步骤的速度在400-1000xg之间，更优选在约500-650xg之间，最优选在约550-约600xg之间。然后将所述上清液移出试管并以6500-10000xg之间，更优选在约7000-8500xg之间的速度第二次离心。该两步离心方法减少了由血小板释放溶血磷脂酸，并因此使得样品中溶血磷脂酸的测定更精确。
然后优选通过由所述血浆样品中回收至少80％溶血磷脂酸的脂质提取方法，提取在血浆样品中的几乎全部脂质，特别是磷脂。更优选该脂质提取方法回收血浆样品中至少85％的LPA。优选的脂质提取方法的例子包括下述步骤：酸化所述血浆样品；与有机溶剂混合该酸化的血浆样品得到水相和有机相，其中所述磷脂优先分布于有机相；及回收有机相得到一个在血浆样品中含有多于80％的溶血磷脂酸的脂质提取物。优选用盐酸酸化所述血浆样品。优选在酸化的血浆样品中最终酸的浓度为约0.2N-约2.0N，更优选约1.3N-约2.0N。
由酸化的血浆样品中提取溶血磷脂酸的合适有机溶剂包括例如丁醇、异丙醇及包含极性有机溶剂如甲醇，和非极性有机溶剂如氯仿的混合有机溶剂。优选所述有机溶剂为甲醇和氯仿的比率是2∶1的混合物。
接着，在此也称作“LPA”的所述溶血磷脂酸经使用常规技术例如，经薄层层析法分离由有机相的其它磷脂中分出。初步研究中的标准物包括溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酸、棕榈酰-LPA、油酰-LPA和硬脂酰-LPA经单向平面TLC分离，该研究显示LPA的Rf值对于棕榈酰LPA和硬脂酰-LPA为0.14，对于油酰-LPA为0.13。初步研究也显示每一类LPA位移的速率低于溶血磷脂酰胆碱的并且以不同于溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺的速率迁移。在磷脂标准物经双向平面TLC的初步研究也显示经此种方法即经单向平面TLC制备的LPA不含任何其它磷脂。
然后在LPA组分中的溶血磷脂酸用常规技术定量。所用的定量技术取决于受试者所提供的血样的量。例如，如果所述血样的量是2ml或更少，优选使用能够检测皮摩尔量的LPA的定量技术。合适的检测皮摩尔量LPA的技术包括，例如，水解分离的LPA组分并接着通过气相层析法定量水解物中的每一脂肪酸的量。如果所述血样的量是20ml或更多，能够检测毫微摩尔量LPA的技术例如，LPA组分的全磷测定的方法是合适的。
此处介绍的方法可用于检测妇科癌症如子宫颈癌、子宫内膜癌、腹膜癌及卵巢癌，即卵巢上皮癌。卵巢上皮癌包括浆液瘤、粘液瘤、子宫内膜瘤、透明细胞瘤、未分化癌、混合上皮瘤及未分类(unclassified)上皮瘤。
此处介绍的方法对于评估患者卵巢肿块的恶性程度以及在患者肿瘤发展的早期(外科)阶段，即外科Ⅰ期和Ⅱ期，及发展的后期阶段，即外科Ⅲ期和Ⅳ期，检测卵巢癌特别有用。外科分期表示疾病的严重程度，Ⅰ期为最轻程度，Ⅳ期为最严重程度。按照由InternationalFederation of Gynecology and Obsterics建立的标准，卵巢癌仅限于卵巢，在Ⅰ期卵巢癌中可以有或没有腹水。在Ⅱ期有癌肿的骨盆扩散并可能扩散到子宫和输卵管。Ⅲ期卵巢癌的特征是腹腔转移。Ⅳ期有腹腔外癌肿远处转移。
在此介绍的方法是简单的、边缘侵入性的及仅需要得自患者的血样。因而这样的方法对于筛查以前没有被诊断患有癌症特别是具患妇科癌症尤其是卵巢癌危险性的患者也是有用的。此类患者包括有家族病史的高危妇女、不排卵周期的绝经前妇女及绝经后妇女。
本发明由下述实施例进一步说明。然而此类实施例并不解释为任何意义上对本发明宗旨或范围的限制。
                        实施例
血浆样品得自84位女性患者提供的血样。用含有7.2mg EDTA的5ml真空接受管(vacutainer tube)由每一位患者收集大约2ml的全血样。由全血样得到血浆样品
全血样以580xg离心5分钟得到血细胞和血小板沉淀及上清液。所得上清液转移至硅化微离心管，并以8000xg离心5分钟得到第二次的沉淀及血浆上清液。所得血浆上清液或者立即进行试验或者在-70℃储存。由血浆样品提取LPA
脂质的提取，特别是由血浆样品中提取LPA在0-4℃进行。每1ml血浆样品通过加入0.2ml 12N的HCl酸化得到具有最终HCl浓度约为2.0N的血浆样品。混合后，将4ml含有2∶1比例的甲醇/氯仿的混合有机溶剂加至该酸化的血浆中，并将该混合物涡旋混合1分钟，在冰上孵育10分钟。将1ml氯仿和1.25ml H2O加至该混合物中。充分混合后，该混合物于4℃、在1000xg离心10分钟。下层有机层转移至新的玻璃管中，并于40℃、在氮气下干燥得到磷脂提取物。
此提取方法的总回收率及重现性通过向三个平行的缺乏内源性油酰-LPA的血浆样品中加入10nmol合成油酰-LPA来检测。该样品由本方法提取，并且每一样品的油酰-LPA的量是定量的。此分析显示由本提取方法的LPA的平均回收率为92.7％，相对标准误差为±5.6％。脂质提取物中LPA的分离
将每一份脂质提取物溶于50μl甲醇/氯仿为2∶1的混合物中，并将其置于得自EM Science,Darmstadt,Germany的预先铺有硅胶60的TLC板(20×20cm，层厚250mm)上的单泳道(single lane)上。将50μl含有得自Avanti Polar-Lipids,Inc.的10-50μlg油酰-LPA的2∶1甲醇/氯仿的等份试样置于该板的一外侧的泳道上并将50μl含有得自Sigma ChemicalCompany的10-50μg溶血磷脂酰胆碱的氯仿的等份试样置于相对的对外侧的泳道上。所述油酰-LPA和溶血磷脂酰胆碱用作确定板上的LPA组分的位移参照。该脂质用氯仿-甲醇-氢氧化铵混合物(65∶35∶5.5)于室温展开约3小时。然后外侧含有油酰-LPA和溶血磷脂酰胆碱标准物的泳道用0.1％的8-苯胺基-1-萘-磺酸喷涂并在紫外灯下显色。
将在载有得自血浆样品的脂质提取物的所述泳道上的每一份分离的LPA组分从板上刮下并分别置于得自Kimble,Vineland,NewJersey的15ml一次性玻璃离心管内。该LPA组分包括在板上的位移在相当于标准油酰-LPA的Rf的距离及延伸至小于标准溶血磷脂酰胆碱的Rf的距离的所有脂质。测定每一份样品分离的LPA的量
将2ml 1M的醇制KOH加至含有分离的LPA组分的每一试管内。然后该试管于60℃孵育1小时，以水解试管中存在的LPA。冷却后，将5μl含有二十二烷酸甲酯在氯仿中(1.5mg/ml)的内标溶液、1ml 6N的HCl、5ml H2O及5ml乙醚加至水解物中。将该混合物涡旋30秒，并于1000xg离心10分钟。然后，将上层液转移至新的玻璃管中，并在40℃于氮气下干燥。将含有得自LPA的脂肪酸的残留物溶于0.6ml石油醚中，并且该溶解的脂肪酸经将1mlBCl3-甲醇试剂加入每一试管中并于100℃孵育10分钟进行甲基转移化。BCl3-甲醇得自Supelco Inc.,Bellefonte,PA.。所述脂肪酸甲酯用1ml石油醚提取。该混合物涡旋10秒钟，并于1000xg离心5分钟。上层转移至3.7ml螺旋口(screw-topped)Supelco样品管瓶中并在40℃于氮气下干燥。然后残留物溶于25μl氯仿中，并用5-15μl氯仿进行气相色谱分析。由LPA水解释放的脂肪酸的GC分析
使用配有熔融硅胶柱(25m×0.2mm)(在得自Supelco Inc.的100/120 Chromosorb WAW上涂有3％SP-2310,2％SP-2300)的Hewlett-Packard Model 5710A气相色谱仪检测每一样品中的各个脂肪酸的量。气相色谱条件如下：色谱炉起始温度是185℃；2分钟后，温度以2℃/分的速度升至230℃；并持续4分钟；进样器温度为200℃；检测器温度为300℃；氮载气的流动速率是30ml/分钟，50 PSI；空气流速为240ml/分钟，24PSI；氢气流速为30ml/分钟，15PSI。使用离子焰检测器检测脂肪酸甲酯。使用得自Nu Check Prep.Inc.Elysian,MN.的两种脂肪酸甲酯标准混合物制得标准曲线。所述两种标准混合物包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、花生四烯酸甲酯及二十二烷酸(behanate)甲酯的不同组合。保留时间为：对棕榈酸甲酯是3.8分钟，对硬脂酸甲酯是6.7分钟，对油酸甲酯是7.3分钟，对亚油酸甲酯是8.3分钟，对花生四烯酸甲酯是14.0分钟及对二十二烷酸甲酯(内标)是15.3分钟。
在每一样品中的各个脂肪酸的浓度经计算并相加得到每一血浆样品中的总LPA浓度。每一样品中的各类LPA及总LPA的浓度(μM)见表Ⅰ。
每一女性患者也经过一种或多种常规诊断方法以确定其是否健康或患有活动性疾病。该诊断方法包括，(合适时)临床检查、临床化学及任何检查到的肿块的外科评价。在这些常规诊断方法的基础上，患者被诊断为健康或为表Ⅰ中所列疾病之一的活动形式。
                    表Ⅰ
           实施例患者血浆中LPA浓度(μM)
  诊断症状  LPA(P)  LPA(S)  LPA(O)  LPA(L)  LPA(A)  LPA(D) 总LPA
 1．卵巢癌Ⅰ期
    #1  9.97  12.84  4.39  2.83  2.29  B.D. 32.32
    #2  10.78  10.28  1.84  B.D.  B.D.  B.D. 22.9
    #3  1.39  0.40  0.87  2.01  B.D.  B.D. 4.67
 2．卵巢癌Ⅱ期
    #1  0.78  2.17  0.68  0.98  0.41  B.D. 5.02
 3．卵巢癌Ⅲ期
    #1  8.87  9.15  3.98  4.17  3.32  B.D. 29.49
    #2  7.90  6.97  3.46  8.97  6.45  B.D. 33.75
    #3  9.59  6.96  1.59  1.64  2.56  B.D. 22.34
    #4  11.09  7.62  5.72  11.78  6.85  B.D. 43.06
    #5  5.64  4.14  B.D.  B.D.  B.D.  B.D. 9.78
    #6  3.10  4.62  1.58  3.18  1.59  B.D. 14.07
    #7  2.13  1.80  0.39  0.91  B.D.  B.D. 5.23
    #8  0.81  1.56  0.77  B.D.  B.D.  B.D. 3.14
    #9  3.30  6.22  2.28  5.40  5.17  B.D. 22.37
    #10  2.37  4.33  1.56  0.77  0.92  B.D. 9.95
    #11  5.34  8.32  2.68  1.85  2.39  B.D. 20.58
    #12  8.97  10.23  11.39  13.50  8.96  3.12 56.17
    #13  1.08  0.89  0.31  0.25  B.D.  B.D. 2.53
    #14  B.D.  1.82  0.43  2.42  2.42  B.D. 5.84
 4．卵巢癌Ⅳ期
    #1  3.61  4.91  2.09  1.16  B.D.  B.D. 11.77
 5．腹膜癌
    #1  14.22  9.93  3.08  3.79  1.94  B.D. 32.96
                       表Ⅰ，续
诊断症状  LPA(P)  LPA(S) LPA(O)  LPA(L) LPA(A) LPA(D) 总LPA
    #2  3.19  6.29 0.68  6.25  B.D. B.D. 16.41
    #3  2.65  2.29 0.13  B.D.  B.D. B.D. 5.07
    #4  12.81  11.45 12.50  14.92  9.19 2.34 63.21
    #5  0.70  1.17 B.D.  B.D.  B.D. B.D. 1.87
    #6  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
    #7  3.89  4.01 3.94  4.51  2.84 B.D. 19.19
    #8  3.11  3.15 1.72  2.40  1.70 B.D. 12.08
    #9  1.16  B.D. B.D.  B.D.  0.28 B.D. 1.44
6．子宫内膜癌
    #1  8.46  9.45 3.85  4.83  2.23 B.D. 28.82
    #2  11.01  11.31 2.33  1.03  B.D. B.D. 25.68
    #3  6.84  15.84 12.62  18.88  9.05 B.D. 63.23
    #4  7.68  7.27 3.53  5.67  7.24 B.D. 31.39
    #5  1.71  1.65 0.59  B.D.  B.D. B.D. 3.95
    #6  6.19  7.65 2.59  5.27  2.89 B.D. 24.59
    #7  21.15  5.16 16.41  20.98  B.D. B.D. 54.56
7．子宫颈癌
    #1  5.94  5.60 2.99  1.19  2.10 B.D. 17.82
    #2  12.45  11.18 6.72  10.44  6.53 B.D. 47.32
    #3  0.86  1.14 B.D.  B.D.  B.D. B.D. 2.00
    #4  15.29  12.98 8.27  5.68  8.97 B.D. B.D.
8．健康
    #1  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
    #2  B.D.  B.D. 0.42  B.D.  B.D. B.D. 0.42
    #3  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
    #4  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
    #5  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
    #6  B.D.  1.94 0.21  B.D.  B.D. B.D. 2.15
    #7  B.D.  B.D. B.D.  B.D.  B.D. B.D. B.D.
                        表Ⅰ，续
诊断症状 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D) 总LPA
    #8  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #9  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #10  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #11  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #12  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #13  B.D. B.D. 0.42 B.D. B.D. B.D. 0.42
    #14  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #15  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #16  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #17  0.48 0.69 B.D. B.D. B.D. B.D. 1.17
    #18  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #19  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #20  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #21  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #22  4.93 B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. 4.93
    #23  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
9．良性GYN疾病
    #1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #2  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
10．肉瘤
    #1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #2  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #4  B.D. 2.08 0.99 1.43 3.48 B.D. 7.97
11．乳房癌
    #1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #2  B.D. B.D. 0.42 B.D. B.D. B.D. 0.42
诊断症状 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D) 总LPA
    #3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #4  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #5  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #6  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #7  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #8  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #9  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #10  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #11  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
12．白血病
    #1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #2  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
    #4  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
LPA(P)：棕榈酰-LPALPA(S)：硬脂酰-LPALPA(O)：油酰-LPALPA(L)：亚油酰-LPALPA(A)：花生四烯酰(arachidyl)-LPALPA(D)：二十二烷六烯酰(docosahexanyl)-LPAB.D.：低于检测N.A.：不可得到
诊断为患有妇科癌症的患者血浆中每一类LPA的平均浓度±SE及诊断为未患有妇科癌症的患者血浆中每一类LPA的平均浓度±SE见表Ⅱ。患有妇科癌症的患者血浆中LPA的平均浓度±SE及未患有妇科癌症的患者血浆中总LPA的平均浓度±SE见表Ⅲ。统计学效能(statistical power)计算通过由W.J.Conover在Practical Nonparametric中介绍的Wilcoxon Rank Sum统计学检验来完成。此处LPA水平在检出水平以下时用0.1μm来计算。
                           表Ⅱ
            实施例患者血浆中单独LPA种类的
平均浓度
诊断症状 N  LPA 平均   SE  SD  中等  最小  最大
健康 23  LPA(P) 0.33  0.21  1.01  0.10  0.10  4.93
 LPA(S) 0.21  0.08  0.40  0.10  0.10  1.94
 LPA(O) 0.10  0.00  0.02  0.10  0.10  0.21
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
卵巢癌 19  LPA(P) 5.10  0.88  3.85  3.61  0.10  11.09
 LPA(S) 5.54  0.83  3.61  4.91  0.40  12.84
 LPA(O) 2.43  0.61  2.66  1.59  0.10  11.39
 LPA(L) 3.27  0.91  3.96  1.85  0.10  13.50
 LPA(A) 2.32  0.62  2.70  1.59  0.10  8.96
 LPA(D) 0.26  0.16  0.69  0.10  0.10  3.12
腹膜癌 9  LPA(P) 4.65  1.73  5.19  3.11  0.10  14.22
 LPA(S) 4.28  1.38  4.14  3.15  0.10  11.45
 LPA(O) 2.48  1.34  4.02  0.68  0.10  12.50
 LPA(L) 3.59  1.61  4.83  2.40  0.10  14.92
 LPA(A) 1.82  0.98  2.95  0.28  0.10  9.19
 LPA(D) 0.35  0.25  0.75  0.10  0.10  2.34
子宫内膜癌 7  LPA(P) 9.01  2.29  6.05  7.68  1.71  21.15
 LPA(S) 8.33  1.71  4.52  7.65  1.65  15.84
 LPA(O) 5.99  2.27  6.02  3.53  0.59  16.41
 LPA(L) 8.11  3.16  8.37  5.27  0.10  20.98
诊断症状 N  LPA 平均  SE  SD  中等  最小  最大
 LPA(A) 3.10  1.38  3.66  2.23  0.10  9.05
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.00  0.10  0.10
子宫颈癌 4  LPA(P) 8.64  3.25  6.50  9.20  0.86  15.29
 LPA(S) 7.73  2.70  5.40  8.39  1.14  12.98
 LPA(O) 4.52  1.84  3.69  4.86  0.10  8.27
 LPA(L) 4.35  2.36  4.72  3.44  0.10  10.44
 LPA(A) 4.43  2.02  4.05  4.32  0.10  8.97
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
良性妇科疾病 3  LPA(P) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(S) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(O) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
肉瘤 4  LPA(P) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(S) 0.60  0.50  0.99  0.10  0.10  2.08
 LPA(O) 0.32  0.22  0.45  0.10  0.10  0.99
 LPA(L) 0.43  0.33  0.67  0.10  0.10  1.43
 LPA(A) 0.95  0.85  1.69  0.10  0.10  3.48
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
乳房癌 11  LPA(P) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(S) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(O) 0.18  0.03  0.10  0.10  0.10  0.43
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
诊断症状 N  LPA 平均  SE  SD 中等  最小  最大
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.00  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.00  0.10  0.10
白血病 4  LPA(P) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(S) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(O) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
LPA(P)：棕榈酰-LPALPA(S)：硬脂酰-LPALPA(O)：油酰-LPALPA(L)：亚油酰-LPALPA(A)：花生四烯酰-LPALPA(D)：二十二烷六烯酰-LPAB.D.：低于检测N.A.：不可得到
                       表Ⅲ
         患者血浆中总LPA的平均浓度(μM)
   诊断症状     N  平均  SE  SD  中等  最小  最大
    健康     23  0.45  0.23  1.09  0.10  0.10  4.93
    卵巢癌     19  18.68  3.43  14.97  14.07  2.53  56.17
    腹膜癌     9  16.93  6.79  20.37  12.08  0.10  63.21
  子宫内膜癌     7  33.17  7.51  19.86  28.82  3.95  63.23
   子宫颈癌     4  29.58  11.83  23.67  32.57  2.00  51.19
 良性妇科疾病     3  0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
    肉瘤     4  4.83  1.05  5.04  3.62  0.10  19.92
    乳房癌     11  0.13  0.03  0.10  0.10  0.10  0.43
    白血病     4  0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
LPA(P)：棕榈酰-LPALPA(S)：硬脂酰-LPALPA(O)：油酰-LPALPA(L)：亚油酰-LPALPA(A)：花生四烯酰-LPALPA(D)：二十二烷六烯酰-LPAB.D.：低于检测N.A.：不可得到
如表Ⅰ中所见，在每一位患有Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期卵巢癌的患者中发现其LPA总水平可检测。这样每一位诊断为具有早期卵巢癌或晚期卵巢癌的患者其血浆中LPA的水平是可检测的。在患有卵巢癌的患者中没有发现假阴性。对于Ⅰ期及Ⅱ期卵巢癌的患者LPA的总浓度范围为4.67-32.32μM。对于Ⅲ期及Ⅳ期卵巢癌的患者LPA的总浓度范围为2.53-56.17μM。此外，发现全部卵巢癌患者的硬脂酰LPA的水平可检测，并且在19位卵巢癌患者中发现18位患者的LPA种类中的棕榈酰-LPA和油酰-LPA的水平可检测。
相反，在23位确定为健康的受试者中的19位，在其血浆中的LPA水平不可检测。而剩下的4位健康受试者的血浆中仅有低浓度的LPA，范围在0.42-4.93μM。尚不知道这些值是表示假阳性还是这些个体有用其他通常用于诊断患者的常规方法所不能检测到的妇科癌症。另外，在诊断为患有卵巢癌的患者血浆中的总LPA及每一种LPA的平均浓度明显高于健康者血浆中的总LPA及每一种LPA的平均浓度。这些结果确证本方法是高度灵敏的，并因此可用于鉴别这些患有卵巢癌的妇科肿瘤的患者，包括仍处于发展的早期阶段的卵巢癌患者。本结果也显示检测患者血浆中棕榈酰-LPA或硬脂酰-LPA或油酰-LPA或它们的组合的存在的方法也适用于检测卵巢癌。
LPA也可在诊断为患有子宫颈癌及子宫内膜癌的每一位患者的血浆中检出，及在9位诊断为患有腹膜癌患者中的8位的血浆中检出。血浆中LPA水平没有检测出的一名患者的腹膜癌已经完全被去除(debulked)。这个结果显示LPA在癌症已经完全由外科手术除去的患者血浆中是不存在的。这样，本发明方法适用于监测经外科手术除去癌症的妇科癌症患者的复发。患有子宫颈癌及子宫内膜癌的患者的血浆中LPA的浓度范围为2.00-63.23μM。
相反，在17位诊断为非妇科癌症的癌症，即乳腺癌、白血病及子宫肉瘤患者中的15位患者中不存在可检测的LPA水平。此外，在任何患有良性妇科疾病子宫纤维瘤的患者中不存在可检测的LPA水平。由于由4位患有源于结缔组织的妇科肉瘤及患有良性子宫纤维瘤患者中的三位的血浆中不存在可检测的血浆总LPA水平，因而据信各个妇科器官的恶性上皮细胞可能是患有卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌及腹膜癌的患者血浆中LPA的来源。
由于其灵敏性、简单性及其低费用，本发明适用于筛查妇科癌症的患者。因为用于本发明的血样和用于CA125试验的血样可同时由患者采集，在患者由本发明方法进行妇科癌症筛查的同时也可进行CA125试验。另外，本发明方法也可单独用于检测妇科癌症。
因为LPA在良性妇科疾病的患者血浆中是不存在的，本发明方法对于患有妇科肿块的患者区分良性妇科疾病与恶性妇科疾病是有用的。应用此种方法区分恶性与良性卵巢肿块可减少患者进行的现今通用的诊断卵巢肿瘤恶性变的更贵的技术如阴道超声法、或更具侵入性的技术，如肿瘤活组织检验或肿瘤抽吸术的需求量。
尽管本发明一直着眼于介绍许多优选的实施例，它们对于进行本发明的发明者而言构成现今已知最好的方式，应该理解对于在本领域具有常规技术的人员可以在不背离经权利要求限定的本发明的范围的基础上进行各种变化和修改是显然易见的，该权利要求补充于此。

Claims (15)

1．包括下述步骤的检测患者妇科癌症存在的方法，所述步骤如下：
(a)提供得自患者的血样；
(b)制备得自所述血样的血浆样品；及
(c)检测在所述血浆样品中存在的溶血磷脂酸。
2．权利要求1的方法，其中所述妇科癌症选自卵巢癌、腹膜癌、子宫内膜癌、子宫颈癌及其组合。
3．权利要求1的方法，其中所述血浆样品由所述血样经包括下述步骤的方法制得，所述步骤如下：
(a)以介于400×g和1000×g之间的速度第一次离心所述血样得到第一血细胞和血小板的沉淀及第一次的上清液；及
(b)以介于6500和10000×g之间的速度第二次离心步骤(a)的第一次的上清液得到第二次沉淀和第二次的上清液；
(c)收集由步骤(b)得到的所述第二次的上清液得到所述血浆样品。
4．权利要求1的方法，其中在所述血浆样品中存在的溶血磷脂酸经包括下述步骤的方法检测：
(a)制备得自所述血浆样品的脂质提取物；
(b)检测在所述脂质提取物中存在的溶血磷脂酸。
5．权利要求4的方法，其中在所述脂质提取物中存在的溶血磷脂酸经包括下述步骤的方法检测：
(a)分离所述脂质提取物成磷脂组分；及
(b)检测在所述磷脂组分中存在的溶血磷脂酸。
6．权利要求4的方法，其中在所述脂质提取物中存在的溶血磷脂酸经包括下述步骤的方法检测：
(a)分离所述脂质提取物成磷脂组分；及
(b)检测在所述磷脂组分中存在的棕榈酰-LPA，或硬脂酰-LPA，或油酰-LPA或其组合。
7．权利要求1的方法，其中所述妇科癌症为卵巢癌。
8．权利要求3的方法，其中所述妇科癌症为卵巢癌。
9．权利要求4的方法，其中所述妇科癌症为卵巢癌。
10．权利要求5的方法，其中所述妇科癌症为卵巢癌。
11．包括下述步骤的由生物体液样品提取LPA的方法：
(a)用足够量的酸酸化所述生物体液样品生成酸化的所述样品，其中在所述样品中酸最终的浓度为约0.2-2.0N；
(b)用有机溶剂混合所述酸化样品得到水相和有机相；
(c)由所述有机相分离所述水相得到在所述生物体液样品中含有大于80％的LPA的有机相提取物。
12．权利要求11的方法，其中所述生物体液样品为基本上无血小板的血浆样品。
13．权利要求11的方法，其中所述酸化样品中酸的最终的浓度为约1.3-约2.0N。
14．包括下述步骤的检测患者妇科癌症的方法：
(a)提供得自患者的基本上不含血小板的血浆样品；
(b)制备得自所述血浆样品的脂质提取物；及
(c)检测在所述脂质提取物中存在的溶血磷脂酸。
15．权利要求14的方法，其中所述妇科癌症为卵巢癌。
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