CN113866413A - 一种结直肠癌诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种结直肠癌诊断标志物及其应用。本发明通过对结直肠癌患者血浆外泌体进行label‑free蛋白质谱的检测数据处理及分析，得到标准化的蛋白表达谱数据，进而筛选出差异表达的蛋白——CPS1和TNC。之后通过实验检测CPS1联合TNC在结直肠癌与癌旁组织样本以及患者血清样本中的表达差异，结果显示CPS1和TNC在结直肠癌组织中的表达水平均明显高于癌旁组织中的表达水平，且实验结果还表明其表达水平与晚期、淋巴结转移、远处转移呈正相关，可以作为结直肠癌早期筛查，预后评估指标。二者联合使用较单独其特异性、敏感度均有显著提升，具有无创、便捷等优点。

Description

一种结直肠癌诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种结直肠癌诊断标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署估计，其发病率、死亡率约占全部恶性肿瘤的前三位。随着我国近30年经济和生活的改善，结直肠癌在我国的发病和死亡情况均呈上升趋势，位居我国恶性肿瘤发病第三位和死亡第五位，严重威胁着人们的健康和生命。结直肠癌在全球范围内具有明显的地域分布差异，高发地区主要为澳大利亚、新西兰、欧洲及北美等地区，而在非洲、中南亚等地区发病率较低。研究发现，2010年我国结直肠癌粗发病率为20.90/10万，中国人口标化率为16.14/10万；粗死亡率为10.05/10万，中国人口标化率为7.55/10万，发病率和死亡率均高于发展中国家的平均水平。大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期，失去了最佳的治疗时机，导致五年生存率不到20％，预后较差。因此，探索结直肠癌快速诊断的评估方法，提高诊疗水平，提高存活率，是当前研究的热点和难点。

目前临床上用于结直肠癌诊断的方法包括：光学检查和形态学检查，常规的检查方法主要有排泄物便潜血检查、排泄物免疫学检查、钡剂双重造影检查、弹性乙状结肠镜检查、结肠镜检查和CT结肠成像。但是，上述检测方法仍存在一定局限性，如便潜血检查分离过程繁琐，易受细菌、食物及肠道粘液等干扰；结肠镜检查对设备和检测人员技术的要求较高，误诊率较大。

随着结直肠癌发病机制的研究越来越广泛，分子生物标记物在其中的重要性越来越明显。这些标记物已成为结直肠癌诊断和治疗的重要靶点。近年来，外泌体在肿瘤中的作用越来越受到重视。外泌体是由不同类型细胞分泌的直径约30-100nm的脂质双层膜囊泡。越来越多的证据表明，癌源性外泌体通过转移和交换致癌分子，包括蛋白质、脂质、核酸(circRNAs、lncRNA、microRNAs、mRNA)、转录因子等多种生物功能大分子，在肿瘤细胞间通讯中发挥关键作用，从而参与促进肿瘤发生、肿瘤增殖、转移、血管生成、免疫逃逸。研究发现经常使用的外泌体生物标志物是异质的，并且在不同细胞类型中具有特异性。许多证据证实了癌源性外泌体蛋白质的功能，这些外泌体蛋白向微环境传递细胞信号以同步表型模式。有报道称，外泌体蛋白在血液中是稳定的，有望成为临床检测的新型生物标志物。蛋白质除了发挥执行者的作用外，还具有调节免疫系统，清除病毒或微生物病原体感染，恶性肿瘤细胞的转化等重要功能。因此，我们认为外泌体蛋白可能是一类新的潜在的生物标志物或肿瘤治疗靶点。

中国专利申请：201410009149.6公开了一种结直肠癌相关的标志物的应用，该标志物为PPP1R12A。具体地讲，该标志物的DNA相对拷贝数与结直肠癌患者化疗之后的生存期呈负相关。本发明还涉及结直肠癌组织样本中检测PPP1R12A的试剂盒、方法和应用。该试剂盒中含有检测PPP1R12A和内参基因GAPDH引物对，本发明通过研究发现了PPP1R12A与结直肠癌以及结直肠癌化疗疗效之间的关系，设计出检测PPP1R12A的引物对，用该引物对设计出的试剂盒能够用于检测结直肠癌肿瘤，使通过PPP1R12A检测结直肠癌成为可能。

现有技术：线粒体蛋白CPS-1与结直肠癌临床病理特征及预后的关系探讨，熊丹阳等通过回顾性分析2004.01.01-2009.12.31期间在医院肿瘤内科住院的111例CRC患者的临床资料，并以免疫组化方法检测CRC癌组织、癌旁组织、淋巴结组织和远处转移组织中CPS-1的表达；采用Kaplan-Meier生存曲线分析CPS-1的表达与CRC患者总生存期及无进展生存期的关系，单因素及多因素分析评估CPS-1的表达与CRC预后的关系。结果:在111例CRC患者中,有82例(73.9％)患者表达CPS-1；CPS-1的阳性表达与分化程度(P＝0.002)、侵犯深度(P＝0.002)、淋巴结转移(P＝0.001)和TNM分期(P＝0.019)密切相关；CPS-1阳性表达的患者较阴性表达患者的5年OS及PFS低(P<0.001)。有57例(51.4％)患者高表达CPS-1，CPS-1的高表达与分化程度(P＝0.003)、淋巴结转移(P＝0.009)和TNM分期(P＝0.006)密切相关；CPS-1高表达的患者较低表达患者的5年OS和PFS低(P<0.001)。多因素分析显示,CPS-1的阳性表达是OS(P＝0.020,HR:4.261)及PFS(P＝0.037,HR:2.861)的独立预后因素；CPS-1的高表达是OS(P＝0.030,HR:0.442)及PFS(P＝0.047,HR:1.981)的独立预后因素。结论:CPS-1在CRC组织中的阳性表达及高表达和CRC的发生发展相关，CPS-1阳性表达及高表达可能预测CRC患者的疾病进展及预后不良。但一方面，该文献中所报道的是线粒体蛋白CPS-1与结直肠癌的关系，线粒体蛋白即胞内蛋白，而本发明探讨的是胞外蛋白。另一方面，更为重要的是，本发明通过联合两种外泌体蛋白CPS1和TNC共同作为结直肠癌的诊断标志物，其特异性以及敏感度均有大幅度提升。

本发明根据对结直肠癌患者血浆外泌体进行label-free蛋白质谱的检测数据处理及分析，得到标准化的蛋白表达谱数据，进而筛选出差异表达的蛋白——CPS1和TNC。通过分析CPS1和TNC在结直肠癌患者中的表达，提供一种特异性强、灵敏度高的结直肠癌诊断生物标志物及其应用。关于本发明一种结直肠癌诊断标志物及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种结直肠癌诊断标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了一种检测试剂组合在制备早期诊断结直肠癌的试剂盒中的应用，所述检测试剂组合是由检测外泌体蛋白CPS1表达量和外泌体蛋白TNC表达量的试剂组成，所述检测试剂组合是作为试剂盒实现早期诊断结直肠癌唯一的关键成分。

优选地，待检样品是患者血清或患者血浆。

优选地，所述检测试剂组合是外泌体蛋白CPS1和TNC的特异性探针或引物。

优选地，外泌体蛋白CPS1引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其完全互补序列；外泌体蛋白TNC引物序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其完全互补序列；

Forward,5′-ATTCCTTGGTGTGGCTGAAC-3′(SEQ ID NO:1),

Reverse,5′-ATGGAAGAGAGGCTGGGATT-3′(SEQ ID NO:2)；

Forward:5′GCAGCTCCACACTCCAGGTA3′(SEQ ID NO:3)，

Reverse:5′TTCAGCAGAATTGGGGATTT3′(SEQ ID NO:4)。

进一步地，所述的试剂盒还包括特异性检测内参蛋白Actin的检测试剂。

优选地，所述内参蛋白Actin的引物序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或其完全互补序列。

Forward,5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′(SEQ ID NO:5),

Reverse,5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(SEQ ID NO:6)；

优选地，所述的试剂盒还包括使用说明书。

第二方面，本发明提供了一种生物标志物在制备早期诊断结直肠癌的试剂或试剂盒中的应用，所述的生物标志物是由外泌体蛋白CPS1和外泌体蛋白TNC组成。

优选地，待检样品是患者血清或患者血浆。

第三方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的早期诊断结直肠癌的方法，所述的方法是以外泌体蛋白CPS1和外泌体蛋白TNC的表达量作为生物标志物。

本发明根据对结直肠癌患者血浆外泌体进行label-free蛋白质谱的检测数据处理及分析，得到标准化的蛋白表达谱数据，进而筛选出差异表达的蛋白——CPS1和TNC。通过分析CPS1、TNC在结直肠癌患者中的表达，提供一种特异性强、灵敏度高的结直肠癌诊断生物标志物及其应用。

本发明优点在于：

1、本发明将外泌体蛋白CPS1和TNC联合使用作为检测CRC的诊断标志物，具有高灵敏度(0.929)和高特异性(0.686)，ROC曲线下面积0.873，较单一标志物灵敏度、特异性均有显著提升，为结直肠癌的早期诊断和/或治疗提供一条全新的途径。

2、本发明的分子标记物在结直肠癌肿瘤组织及血清中的表达明显高于相应的正常对照，且其表达量表达水平与晚期、淋巴结转移、远处转移呈正相关，可以作为结直肠癌早期筛查，预后评估指标，能够很好的应用于临床上。

附图说明

附图1是外泌体鉴定。

附图2A-2B是label-free蛋白质谱检测外泌体CPS1、TNC在CRC患者血浆中的表达。

附图3是外泌体CPS1/TNC在CRC患者组织中的表达。

附图4是ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 外泌体蛋白CPS1和TNC的筛选

1本发明首先将从上海市同济医院获取的结直肠癌患者血浆外泌体样本进行label-free蛋白质谱检测的数据处理及分析。按照蛋白质谱的处理及分析流程控制方法，导入蛋白质谱数据，经过信号值筛选和标准化得到理论上有效的蛋白，在此基础上进行差异表达分析，见图1。

2蛋白的筛选方法具体包括以下步骤：

2.1分别收集结直肠癌患者血浆外泌体样本，提取总蛋白。

2.2对所获得的蛋白进行质量检测并标记。

2.3采用景杰公司的label-free蛋白质谱检测技术，在标准条件下进行检测分析。

2.4对所述的蛋白数据文件进行质量分析并剔除低质量信号数据，获得经过筛选的信号数据，并将所述的经过筛选的数据进行前景值和背景值校正，得到消除噪音污染的蛋白信号数据。

2.5将校正过的信号数据进行标准化，并去除极值，得到理论上有效的蛋白表达值。

最终筛选出来的差异表达的蛋白——CPS1和TNC。通过分析该基因在人结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞生物学功能的调节作用的研究，发现CPS1、TNC的表达在癌组织及患者血清中表现为上调。

接着，我们对CPS1、TNC进行了体外细胞功能学的研究，采用WB检测CPS1、TNC在结直肠癌细胞系中差异表达。结果表明结直肠癌细胞系中CPS1、TNC的表达量均显著上调。

进一步检测CPS1、TNC在结直肠癌与癌旁组织样本以及患者血清样本中的表达差异，结果显示CPS1、TNC在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平(见图2A、2B和图3)。故可将该蛋白作为生物标志物以用于诊断结直肠癌。

此外，当联合外泌体蛋白CPS1和TNC使用，结果显示较单独使用时的灵敏度(0.929vs0.914、0.729)、特异性(0.686vs0.744、0.750)、ROC曲线下面积(0.873vs0.821、0.766)具有显著提升(见图4)。

实施例2 基于外泌体蛋白CPS1和TNC诊断CRC的方法

1按照常规方法进行血清外泌体提取。

2按照常规方法进行外泌体蛋白CPS1和TNC提取。

3按照诊断阈值0.655，如血清外泌体中CPS1联合TNC相对于内参蛋白Actin的相对表达量>0.655，则患有CRC，反之，如血清外泌体中CPS1联合TNC相对于内参蛋白Actin的相对表达量≤0.655，则未患CRC。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市同济医院

<120> 一种结直肠癌诊断标志物及其应用

<130> /

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attccttggt gtggctgaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaagaga ggctgggatt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagctccac actccaggta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagcagaa ttggggattt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagctacga gctgcctgac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims (10)

1.一种检测试剂组合在制备早期诊断结直肠癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂组合是由检测外泌体蛋白CPS1表达量和外泌体蛋白TNC表达量的试剂组成，所述检测试剂组合是作为试剂盒实现早期诊断结直肠癌唯一的关键成分。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，待检样品是患者血清或患者血浆。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂组合是外泌体蛋白CPS1和TNC的特异性探针或引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，外泌体蛋白CPS1引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其完全互补序列；外泌体蛋白TNC引物序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其完全互补序列。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括特异性检测内参蛋白Actin的检测试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述内参蛋白Actin的引物序列为SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或其完全互补序列。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括使用说明书。

8.一种生物标志物在制备早期诊断结直肠癌的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物标志物是由外泌体蛋白CPS1和外泌体蛋白TNC组成。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，待检样品是患者血清或患者血浆。

10.一种非诊断和治疗目的的早期诊断结直肠癌的方法，其特征在于，所述的方法是以外泌体蛋白CPS1和外泌体蛋白TNC的表达量作为生物标志物。

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