JP3355749B2 - カテコールアミン類の分析方法 - Google Patents
カテコールアミン類の分析方法Info
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Description
分析方法に関するものであり、詳しくは液体クロマトグ
ラフィ−、特に高速液体クロマトグラフィ−によるカテ
コールアミン類の分析方法に関するものである。
れているカテコールアミン類の分析法としては、高速液
体クロマトグラフィー法でカテコールアミン類を分画し
た後、電気化学検出器で測定する方法や、カテコールア
ミン類を蛍光誘導体化剤と反応させてカテコールアミン
誘導体とした後、蛍光検出器で測定する方法等が知られ
ている。蛍光検出器で測定する方法には、カテコールア
ミン類を液体クロマトグラフィーで分画する前に蛍光誘
導体化するプレラベル法や、液体クロマトグラフィーで
分画した後に蛍光誘導体化するポストラベル法がある。
また、化学発光測定法としては、蛍光誘導体化したカテ
コールアミン類を過シュウ酸エステルと反応させ、生じ
る発光を測定する方法がある。
では、カテコールアミン類に対し特異性が低いため、液
体クロマトグラフィーで分画する前に測定試料中のカテ
コールアミン類を効率よく抽出する為の前処理操作が必
要となるが、該操作は繁雑で熟練を要するという課題
や、試料中の成分により電極が汚染され、測定感度が低
下し易いという課題がある。
ルアミン類を蛍光検出器で測定する測定法では、蛍光誘
導体化の時にカテコールアミン類以外の夾雑物も誘導体
化されてしまうため、分離精度が悪いという課題があ
る。ポストラベル法では、カテコールアミン類を液体ク
ロマトグラフィーで分画後に蛍光誘導体化するため、オ
ンラインで検出する場合、蛍光誘導体成分が希釈され検
出感度が低下するという課題がある。
体化反応後、更に化学発光反応を生じさせるため、該方
法を実施する場合には多数の送液ポンプが必要となり、
かつ反応システムが複雑となる等の課題がある。
点を解決するために鋭意検討した結果、液体クロマトグ
ラフィ−により分画したカテコールアミン類を、カテコ
ールアミン類と反応することで過酸化水素を発生する物
質と反応させて過酸化水素を発生させることによれば、
発生する過酸化水素はカテコールアミン量に相当するた
め、後に過酸化水素と反応することで発光を生じる化学
発光試薬を使用して発光量を測定することにより溶液中
のカテコールアミン含有量を定量できることを見出だ
し、本発明を完成した。
コールアミン類の分析法であり、カテコールアミン類を
含有する溶液から液体クロマトグラフィーによりカテコ
ールアミン類を分画し、分画されたカテコールアミン類
画分にカテコールアミン類と反応することで過酸化水素
を発生する物質を反応させ、該反応により発生した過酸
化水素に過酸化水素と反応することで発光を生じる化学
発光試薬を混合して混合発光体を形成し、該混合発光体
を発光検出器に供して発光を測定することを特徴とす
る、カテコールアミン類の化学発光分析方法である。以
下、本発明を詳細に説明する。
も化学発光反応によりカテコールアミン類を分析する方
法を提供するものである。カテコールアミン類とは、ベ
ンゼン環に2個の水酸基が相隣接して存在し、その側鎖
にアミンを含む一連の生理活性物質、例えばエピネフィ
リン、ノルエピネフィリン、ドーパミン等に加え、ベン
ゼン環に水酸基を持った様な、例えばピロガロール、プ
ルプロガリン、ヒドロキノン等を意味する。従ってカテ
コールアミン類を含有する溶液とは、前述のカテコール
アミン類を含有するものであれば良く、例えば尿、血漿
等の生体試料等の他、合成されたカテコールアミン類を
含む試薬溶液等である。
溶液を液体クロマトグラフィ−用の分離カラムで分画し
た後、分画されたカテコールアミン類画分にカテコール
アミン類と反応することで過酸化水素を発生する物質を
反応させる。ここで使用する分離用カラムは、好ましく
はシリカゲルにオクタデシル基を導入したゲルをカラム
に充填したものを例示できるが、その他、例えばセルロ
ース、アガロース、シリカゲル、ポリビニールアルコー
ル、ポリヒドロキシメタクリレート等を基材とした、カ
ルボキシメチル型、スルホプロピル型等のイオン交換基
を充填したもの等、前述のカテコールアミン類、特にエ
ピネフィリン、ノルエピネフィリン、ドーパミン等が分
離できれば良い。なお、溶液中の夾雑物とカテコールア
ミン類を分離できるものがに特に好ましい。
液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液等どが挙げられるが、カテコールアミン類が分離でき
るものであれば特に限定されるものではない。
化水素を発生する物質としては、イミダゾール、エチレ
ン尿素、2ーニトロフラン、ピペラジン等の環状の有機
化合物で、環の構成要素として炭素以外に窒素、酸素等
の異種原子を含む複素環化合物が例示できる。特にイミ
ダゾールやエチレン尿素は、カテコールアミン類を分画
するための溶離液としても使用できる。
ては、50℃以上が良く、特に80〜100℃が好まし
い。また反応pHとしては8以上が良く、特にpH9〜
11が好ましい。
素に過酸化水素と反応することで発光を生じる化学発光
試薬を混合して混合発光体を形成し、該混合発光体を発
光検出器に供して発光を測定する。
発光試薬としては、ルミノール(5−アミノ−2,3,
−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン)ルシゲニン
(N,N−ジメチル−9,9−ジアクリジニウム硝酸
塩)等のような、化学発光試薬そのものが過酸化水素と
反応し発光するものの他、シュウ酸誘導体と蛍光物質を
含有する試薬のように、両者の共存下で過酸化水素によ
り発光するもののいずれであっても良い。
ロ−2−(3,6,9−トリオキサデシロキシカルボニ
ル)フェニル]オキザレート(TDPO)、ビス(2,
4,6−トリクロロフェニル)オキザレート(TCP
O)等が使用でき、蛍光物質としてはペリレン、ルブレ
ン(5,6,11,12−テトラフェニルナフタセ
ン)、ローダミンB等、蛍光波長が長波長側のものが例
示できるが、過酸化水素により発光するものであれば特
に制限されない。
置の一例を図1に基づき説明する。試料注入装置7から
注入された試料は、送液ポンプ4によって溶離液1と共
に分離カラム8に導入され分離される。分離されたカテ
コールアミン類は送液ポンプ5で送られる、カテコール
アミン類と反応することで過酸化水素を発生する物質を
含むpH調製液2と混合され、反応槽9の中にある反応
コイル10で過酸化水素を発生する。発生した過酸化水
素は、送液ポンプ6で送られる化学発光試薬3と混合し
発光する。その発光量を発光検出器11で測定するので
ある。
するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施した。カラム8としては、TSKgel ODS−
80Ts(東ソー(株)製、内径4.6mm、長さ15
cm)を、試料導入装置7としてはAS−8010(東
ソー(株)製)を、発光検出器11としてはSー340
0(相馬光学(株)製)を、反応槽9としてRE−80
10(東ソー(株)製)を用い、反応は90℃で行っ
た。
M(東ソー(株)製)を用い、各送液ポンプの流速とし
ては、送液ポンプ4は1.0ml/min、送液ポンプ
5及び6は0.5ml/minに設定した。
液に過塩素酸ナトリウムが100mMとなるように溶解
した、pH2.5の溶離液を用いた。pH調製液2とし
ては0.4Mの水酸化ナトリウム溶液に0.4Mの炭酸
水素ナトリウム溶液を加えpHを12に調製したものを
用いた。また化学発光試薬としては、ペリレンとビス
[4−ニトロ−2−(3,6,9,−トリオキサデシロ
キシカルボニル)フェニル]オキザレート(TDPO)
がそれぞれ0.012mM、0.3mMとなるように、
アセトニトリルと酢酸エチルを2:1の割合で混合した
液に溶解して用いた。
l/ml、ノルエピネフィリン10nmol/ml、ド
ーパミン10nmol/mlを含むものを用い、注入量
は20μlとした。
行った結果を図2に示す。図2は、ノルエピネフィリ
ン、エピネフィリン、ドーパミンの順で分画されたクロ
マトグラムを示すものである。
によれば、液体クロマトグラフィーにおける分離用カラ
ムでカテコールアミン類を分画後、分画されたカテコー
ルアミン類の量に相当する過酸化水素を発生させ、かつ
発生した過酸化水素に相当する発光を生じさせることに
より、カテコールアミン類の定量分析が可能である。
特異的であるから、操作前にカテコールアミン類を抽出
する等の前処理操作は不要であり、従って実施に際して
は熟練を必要としないという効果を有し、かつ電極等を
使用しないから、試料溶液中の夾雑物質による電極の汚
染により感度が低下することもない。
ベルするものではないから、プレラベル法やポストラベ
ル法のような理由で感度が低下することもない。
ような、比較的簡単な構成の測定系により実施し得ると
いう効果も有する。
要図である。
れぞれ200pmolのエピネフィリン、ノルエピネフ
ィリン、ドーパミンの3成分を含む溶液を分析した結果
を示すクロマトグラムである。
Claims (1)
- 【請求項1】 カテコールアミン類を含有する溶液から
液体クロマトグラフィーによりカテコールアミン類を分
画し、分画されたカテコールアミン類画分にカテコール
アミン類と反応することで過酸化水素を発生する物質を
反応させ、該反応により発生した過酸化水素に過酸化水
素と反応することで発光を生じる化学発光試薬を混合し
て混合発光体を形成し、該混合発光体を発光検出器に供
して発光を測定することを特徴とする、カテコールアミ
ン類の化学発光分析方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP00024594A JP3355749B2 (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | カテコールアミン類の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP00024594A JP3355749B2 (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | カテコールアミン類の分析方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07198702A JPH07198702A (ja) | 1995-08-01 |
JP3355749B2 true JP3355749B2 (ja) | 2002-12-09 |
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ID=11468574
Family Applications (1)
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JP00024594A Expired - Fee Related JP3355749B2 (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | カテコールアミン類の分析方法 |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3355749B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57149950A (en) * | 1981-03-11 | 1982-09-16 | Horiba Ltd | Method for determination of hydrogen peroxide |
JP2565446B2 (ja) * | 1992-02-25 | 1996-12-18 | 日本分光株式会社 | カテコールアミン測定方法 |
-
1994
- 1994-01-06 JP JP00024594A patent/JP3355749B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JPH07198702A (ja) | 1995-08-01 |
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