JP3348157B2 - 蛋白質の検出方法及び蛋白質検出用キット - Google Patents
蛋白質の検出方法及び蛋白質検出用キットInfo
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Description
白質検出用キットに関する。
要素である衣、食、住のうち衣、住は環境、その他の条
件である程度は閑却できるが、食は日常、必須不可欠で
ある。
適度な栄養源を含むと共に、健康に危害を与えることが
あってはならない。我が国の公衆衛生状態はめざましく
進歩改善をみせているが、こと食品衛生の面では、質的
観点から完全に衛生的とは言えない。
様、飲食関連の添加物、容器、包装環境等は衛生的に品
質、性状を管理する必要がある。
象物)に直接反応試薬を付着させるため、検体の汚染、
残留試薬の安全性が問題であり、反応試薬の着色物が検
体に残り、水等で簡単に落とせない等の問題もあった。
また上記検出方法では定量性に乏しく、検出結果がでる
までに3〜72時間以上かかる場合があった。
体に移しとって蛋白質の有無を検出する方法が特開平8
−21837号に記載されており、試料の汚染、残留試
薬の安全性に優れ、且つ定量性があり、反応試薬の着色
物が試料に残ることがなく、蛋白質の検出時間が迅速で
あった。しかし、検出媒体の吸水部の材質は、天然セル
ロース(綿花、綿糸など)が主であり、これらの繊維を
絡めるなど吸水保水性を高めたもの、即ち綿棒などが用
いられてきた。その結果、バックグラウンドが高いの
で、測定レンジが狭く、また再現性が悪いなどの問題点
があった。
は、バックグラウンドが低く、再現性の高い蛋白質の検
出方法及び蛋白質検出用キットを提供することにある。
細書記載の構成により達成される。
の対象部分から蛋白質を検出媒体に該蛋白質を移し、予
め調製された蛋白質反応発色試薬溶液中に蛋白質が転移
した検出媒体を好ましくは20〜80℃、更に好ましく
は30〜60℃、1〜60分間接触させた後、発色した
濃度を、例えば蛋白質量に対応した発色濃度を示す色見
本(蛋白質定量のための)、検量線(蛋白質量−発色濃
度)、分光光度計、カラーメーターで該試料に付着した
蛋白質量を1〜60分間の短時間で定量できる蛋白質の
検出方法である。
が付着しているか調べたいものである。
白質を移しとれる水に溶けない合成高分子が好ましい。
本発明に用いられる合成高分子としは、繊維又は薄層状
に容易に加工しうる合成高分子が好ましく、主に合成繊
維が用いられる。合成繊維としては例えば、 ・ナイロン :−(NH(CH2)xNH−CO(C
H2)y−CO)− ・ポリエステル :−(CO−O)−多価アルコールと
多塩基酸の重縮合体 ・アクリル :アクリロニトリルCH2=CHCNのポ
リマー ・ポリビニルアルコール :−(CH2C(OH)H)
− ・ポリウレタン :−(NHCOO)−いわゆるウレタ
ン結合を有するポリマー ・ポリ塩化ビニリデン :−(CH2CHCl2)−塩化
ビニリデンのラジカル重合体 ・ポリ塩化ビニル :−(CH2CHCl)−塩化ビニ
ルの重合体 ・ポリフルオロエチレン : ・ポリプロピレン :−(CH3CHCHCH2)−プロ
ピレンの重合体 ・ポリエチレン :−(CH2CH2)− 及びこれらの組み合わせによる共重合体などが挙げられ
る。
リビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビ
ニル、ポリプロピレン、ポリエチレンである。中でもバ
ックグランドレベルが低く、再現性が特に好ましいのは
ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンである。
が吸着すればどのようなものでもよいが、吸水部に吸水
保水性を持たせることが好ましい。例えば材質が繊維状
のものを寄せ集め、棒状の支持体の先端につけ綿棒のよ
うな形状にすると好ましい。膜状のものは微細な孔をも
うける、スリットを入れる等の加工で十分吸水保水性の
機能は確保出来る。検出媒体に用いられる吸着材料の形
態としては、例えば、綿状、布状、スポンジ状、フィル
ター状などが挙げられる。
しとる方法としては例えば、ぬぐう、圧着させる、吸い
とる方法等がある。ぬぐう方法としては例えば綿棒等綿
状の検出媒体を付けたスワブを使う、或いはメンブレン
フィルター等を使う方法がある。圧着させる方法として
は例えば布状の検出媒体をつけたテープ、押面にスポン
ジ状の検出媒体をつけたスタンプ、プラスチックフィル
ムを適当な大きさ(例えば2×5cm)にカットしたも
のの1部分に綿状、布状、或いはスポンジ状の検出媒体
をつけたストリップベース等で圧着させる方法がある。
更に、検出媒体をつけたローラで圧着させる方法があ
る。吸いとる方法としては例えば、吸水性の綿棒、フィ
ルターで吸いとる、スポイト等でサンプルを直接吸いと
り、本発明の検出媒体に移しとる方法がある。
面活性剤水溶液を垂らしてしばらく時間をおいた後、該
表面の蛋白質を浮かせて吸いとることが本発明の効果を
奏する。
潤しうる性質を有していることが好ましく、かつ本発明
の検出媒体は予め水性媒体で湿潤されていることが好ま
しい。
水、精製水(例えば蒸留水、脱イオン水等)、界面活性
剤水溶液、水溶性有機溶媒(例えば、アセトン、エタノ
ール、プロピルアルコール、メチルエチルケトン等)水
溶液(1〜95%溶液)が挙げられる。
ては例えば以下のものが具体的に挙げられる。
酸エステル 6.ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル 7.ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル 8.ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル 9.ポリエチレングリコール脂肪酸エステル 10.ポリオキシエチレンアルキルエーテル 11.ポリオキシエチレンフィトステロール・フィトス
タノール 12.ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキ
ルエーテル 13.ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル 14.ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油 15.ポリオキシエチレンラノリン・ラノリンアルコー
ル・ミツロウ誘導体 16.ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミ
ド 17.ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアル
デヒド縮合物 18.単一鎖長ポリオキシエチレンアルキルエーテル 上記のアルキルとしては直鎖、分岐の炭素数1〜18を
表す。
ホン酸塩 7.アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテルリン酸塩 上記のアルキルとしては直鎖、分岐の炭素数1〜8を表
す。
す。
が挙げられる。
100(和光純薬工業(株)、Tween−20(和光
純薬工業(株)、Nonidet P−40(ベーリン
ガー・マンハイム山之内(株)) アニオン界面活性剤:Triton X−770(シグ
マ) カチオン界面活性剤:塩化ベンザルコニウム 両性界面活性剤:AM−301(日光ケミカルズ
(株)) 本発明の蛋白質検出方法は当業界公知の方法が適用され
る。薬品を使った蛋白質検出方法としては、ビウレット
反応法、ローリー法、クマシー法、BCA法、ニンヒド
リン反応方法などが挙げられる。これらの方法に用いら
れる試薬は適宜調合し、蛋白質反応発色試薬溶液として
本発明の蛋白質の検出に使用される。
白質量の感度を高める、発色反応時間の短縮等の目的で
ほう酸ナトリウムを0.1%〜5%添加することもあ
る。
検出媒体、蛋白質反応発色用試薬、蛋白質反応発色試薬
調製容器、蛋白質を移しとった検出媒体と蛋白質反応発
色試薬溶液と反応させる容器(例えばキャップがついて
いるガラス又はプラスチックチューブ)、蛋白質反応発
色試薬滴定用プレート、色見本、試薬の表面の蛋白質を
検出媒体に移させる為に、こする面積が一定になるよう
な枠体が一式となっているものをいい、具体的には実施
例で詳述する。
るが、本発明の態様はこれに限定されない。
0対2の割合で混合したものを蛋白質反応発色試薬Rと
して用いる。発色液は波長562nmにおいて、その吸
光度を測定する。
値は各重量%) 2,2′ビシンコニン酸2ナトリウム 1 Na2CO3・H2O 2 酒石酸ナトリウム 0.16 NaOH 0.4 NaHCO3 0.95 また、pH調整は5% NaOH水溶液又はNaHCO
3を添加溶解することでpH11.25に合わせる。
として用いる。
各キットに使用した。
ンプリング時には指、手などが試薬、サンプリングの媒
体に、直接触れないように十分注意する。
は、次の構成である。即ち、図1(a)中の5の試薬B
(点眼ビン形状の容器に充填)、6の生理食塩水(点眼
ビン形状の容器に充填)、サンプリングスワブ1(形
状:綿棒状のもの、綿球は綿状ポリエステル、柄はプラ
スティック製2mmφ長さ7.5cm)、キャップ2が
ついた3のガラスチューブ10φ×70mm(4の試薬
Aを1ml充填してある)から構成されている。
ど、温度が60℃に安定設定できるもの)、分光光度計
(波長562nm吸光度が測定可能のもの)、カラーメ
ーター(図1(b))、標準カラースケール(図1
(c))、試験管立てを用意する。
(b))、標準カラースケール(図1(c))がセット
されている。図1(b)、図1(c)において1aは標
準カラースケール、1bはライト、1cは比色窓、1d
は標準カラースケールホルダー、1eは試験管ホルダ
ー、1fは蛋白質量表示、1gは比色の度合を示すもの
である。
滴添加し、軽く振とうして混ぜる。サンプリングスワブ
1に生理食塩水6を2〜3滴(100μl程度)を含ま
せ、試料のおよそ7cm平方の面積をくまなく拭う。そ
の際、目安として、拭う強さはサンプリングスワブ1の
柄がしなう程度、拭き取り動作が20往復で目的面積を
くまなく拭える程度で、サンプリングスワブ1を往復さ
せる。先のガラスチューブ3に、そのサンプリングスワ
ブ1をそのまま浸す。ブランクとして未処理のサンプリ
ングスワブ1を用意し、同様にガラスチューブ3に浸
す。次いでそれぞれガラスチューブを恒温槽で60℃、
5分間の条件で加温する。ガラスチューブを室温で冷ま
し、カラーメーターにて発色度合をブランクと比較す
る。このとき、カラーメーターには標準カラースケール
を予め用意しておき、これと比較することによりサンプ
リングスワブ1に吸着した蛋白質の半定量が可能であ
る。
長の吸光度を測定する事により、予め求めておいた蛋白
質検量線から、サンプリングスワブ1に吸着した蛋白質
量を正確に測定することができる。
と準備 本キットは次の構成である。即ち、10φ×75mmガ
ラスチューブ9に生理食塩水10が500μlが入って
おり、キャップ7の下段には8、12の試薬A、Bを封
入した可撓性ケース11が装着してある。キャップ7の
底には、サンプリングスワブ13が固定されている。キ
ャップ7の両側を握ることにより可撓性ケース11が潰
れ、中の上記試薬A、Bがガラスチューブ9内へ落ち、
サンプリングスワブ13と接触する仕組みとなってい
る。14は検出部分である。
ど、温度が60℃に安定設定できるもの)、分光光度
計:波長562nm吸光度が測定可能のもの、カラーメ
ーター、標準カラースケール(必要に応じて)、試験管
立てを用意する。
3の先端に対し、上記標準型キット(2−1)のキット
操作法に示した要領で試料からサンプルする。サンプリ
ングスワブ13をガラスチューブへ戻し、キャップ7を
閉める。8、12の試薬A、Bの入った可撓性ケース1
1を潰して、該試薬A、Bをガラスチューブ9内へ落と
す。該ガラスチューブを軽く振って上記試薬A、Bを撹
拌した後、該ガラスチューブを恒温槽で60℃、5分間
の条件で加温する。該ガラスチューブを室温で冷まし、
カラーメーターにて発色程度をブランクと比較する。こ
のとき、カラーメーターには標準カラースケールを予め
用意しておき、これと比較することによりサンプリング
スワブに吸着した蛋白質の半定量が可能である。
長の吸光度を測定する事により、予め求めておいた蛋白
質検量線から、サンプリングスワブ13に吸着した蛋白
量を正確に測定することができる。14は検出部分であ
る。
と準備 本キットは次の構成である。即ち、15の試薬A、5の
試薬B(点眼ビン形状の容器に充填)、試薬R充填容器
17(点眼ビン形状の容器)、生理食塩水6(点眼ビン
形状の容器に充填)、サンプリングスワブ1(形状は2
−1標準型キット内備品と同様)、ガラスチューブ:1
0φ×70mmである。
ど、温度が60℃に安定設定できるもの)、カラーメー
ター、標準カラースケール(必要に応じて)、試験管立
てを用意する。
薬Bを2〜3滴落とし、軽く混ぜる。こうして作った試
薬Rは常温で10日間は安定である。サンプリングスワ
ブ1に生理食塩水6を2〜3滴落とし湿らせた後、上記
標準型キット(2−1)のキット操作法の要領で試料か
らサンプリングスワブ1にサンプルする。次いで試薬R
充填容器17から試薬R2〜3滴をサンプリングスワブ
1の先端に落とす。直ちにサンプリングスワブ1の先端
で発色反応が開始するので、先端が汚れないように基盤
等に立てかけ、室温あるいは、必要に応じてガラスチュ
ーブに入れて恒温槽で60℃、1〜30分間の条件で加
温する。サンプリングスワブ1に吸着した蛋白質量に応
じて、サンプリングスワブ1の先端がごく薄い緑から赤
紫へ着色する。必要があれば、標準カラースケールで発
色の度合を比較することにより、半定量が可能である。
と準備 本キットは次の構成である。即ち、15の試薬A、5の
試薬B(点眼ビン形状の容器に充填)、生理食塩水6
(点眼ビン形状の容器に充填)、サンプリングスワブ2
0(綿状ポリエステルを綿球状にしたもの)、発色反応
トレイ19、ピンセット18である。
ど、温度が60℃に安定設定できるもの)、カラーメー
ター、標準カラースケール(必要に応じて)を用意す
る。
れ、次いで5の試薬Bを2〜3滴添加する。発色反応ト
レイ19を軽く振とうして、該試薬A、Bを混ぜる。サ
ンプリングスワブ20(綿球)をピンセット18で摘
み、該サンプリングスワブに生理食塩水6を2〜3滴含
ませる。上記標準型キット(2−1)のキット操作法に
ある要領で試料からサンプリングスワブにサンプルす
る。サンプリングスワブ20(綿球)を上記発色反応ト
レイ19の窪みに落とす。室温で、必要であれば恒温槽
で60℃、1〜30分間の条件でトレイを加温する。室
温で冷まし、カラーメーターにて発色の度合をブランク
と比較する。このとき、カラーメーターには標準カラー
スケールを予め用意しておき、これと比較することによ
りサンプリングスワブに吸着した蛋白質の半定量が可能
である。
と準備 本キットは次の構成である。即ち図5(a)、(b)に
おいて、15の試薬A、5の試薬B(それぞれ点眼ビン
形状の容器に充填)、試薬R充填容器17(点眼ビン形
状の容器)、生理食塩水6(点眼ビン形状の容器に充
填)、ポリエチレンフィルムベースを2×5cmにカッ
トし、端部を2cm残して手で持つ部分とし、残部にポ
リエステルをフィルター状に成型したものを接着したサ
ンプリングフィルターストリップ、発色反応プレートか
ら構成されている。
ど、温度が60℃に安定設定できるもの)、カラーメー
ター、標準カラースケール(必要に応じて)を用意す
る。
試薬A(点眼ビン形状の容器に充填)を1ml、5の試
薬B(点眼ビン形状の容器に充填)を2〜3滴落とし、
軽く混ぜる。こうして作った試薬Rは常温で10日間は
安定である。次いで、ストリップをチャック付きケース
24から取り出し、サンプリングフィルター21に生理
食塩水6(点眼ビン形状の容器に充填)を2〜3滴落と
し湿らせる。ストリップベースホルダー23を持ち、サ
ンプリングフィルター21の面を試料にあてて、擦り付
ける。要領は上記標準型キット(2−1)のキット操作
法に示したサンプリング方法に従う。ステンレス製又は
ガラス製の平らな蛋白質反応発色試薬滴定用プレート
に、サンプルしたストリップベース22を乗せ、試薬R
充填容器17から試薬Rを2〜3滴落とす。その後、室
温で、又は必要であれば恒温槽で60℃、1〜30分間
の条件で発色反応トレイを加温する。標準カラースケー
ルを予め用意しておき、これと発色の度合を比較するこ
とによりサンプリングフィルター21に吸着した蛋白質
の半定量が可能である。
と準備 本キットは 2−5.備品のサンプリングフィルター2
1をスタンプホルダーに装着したもので、その他は2−
5と同様である。
眼ビン形状の容器)に、15の試薬A(点眼ビン形状の
容器に充填)を1ml、5の試薬B(点眼ビン形状の容
器に充填)を2〜3滴落とし、軽く混ぜる。こうして作
った試薬Rは常温で10日間は安定である。次いでスタ
ンプホルダー25を取り出し、サンプリングフィルター
26に生理食塩水6(点眼ビン形状の容器に充填)を2
〜3滴落とし湿らせる。スタンプホルダー25を持ち、
サンプリングフィルター26の面を試料にあてて、擦り
付ける。要領は上記標準型キット(2−1)のキット操
作法に示したサンプリング方法に従う。フィルター面
に、試薬Rを2〜3滴落とす。その後、室温で、又は必
要であれば恒温槽で60℃、1〜30分間の条件でホル
ダーを加温する。標準カラースケールを予め用意してお
き、これと発色の度合を比較することによりフィルター
に吸着した蛋白質の半定量も可能である。
ンドと発色形態の比較検討 発色形態と試料からのサンプリング方法について比較し
た。検討には前記、標準型の測定キット(2−1)を用
いた。
SA(ウシ血清アルブミン)水溶液(100mg/m
l)を1ml入れて均一に延ばし、乾燥機内で乾燥させ
た。対照(ブランク)としてBSAを含まない水溶液に
対して同様な処理を行った。これらを試料として供し
た。
(比較対象)をそれぞれ使用した。
スワブをそのままチューブへ入れて、手順に従い検出反
応を行った。ブランクにはサンプリングスワブを入れな
いものを用いた。分光光度計を用いて、562nm波長
の吸光度を測定することにより、発色反応及びバックグ
ラウンドのレベルを調べ結果を表1に示す。
する基の影響を受け、発色反応の吸光度は高いが、バッ
クグラウンドも高く、合成繊維系スワブに比べて測定誤
差が大きくなる。一方、合成繊維系スワブはバックグラ
ウンドが低いので、相対的に正確な測定ができる。
た。
て実施例1と同様に、 a.ポリエステル b.ポリビニルアルコール c.天
然綿糸(比較対象)を使用した。
スワブ吸水部に対し、蛋白質標準液(BSA水溶液(ウ
シ血清アルブミン、蛋白質濃度1mg/ml))を50
μlずつゆっくり完全に吸収させた。各スワブに対し、
n=10で調べた。次いで、標準型キット(2−1)を
用いて用法に従い蛋白質を検出した。測定には実施例1
と同様に分光光度計を用いた。n=10の測定値(吸光
度)のばらつきを表2に示した。
糸と比べると明らかにばらつきが少なく良好である。
する蛋白質検出に対するノイズを調べた。
て実施例1と同様に、 a.ポリエステル b.ポリビニルアルコール c.天
然綿糸(比較対象)を使用した。
キット(2−3)を用い、各サンプリングスワブに試薬
のみを滴下して、手順に従い検出反応を行った。目視に
より、バックグラウンドのレベルを調べた。目視による
確認は、発色が緑(未反応の試薬の色)であれば−、緑
にきわめて薄い紫色が混ざった色は±、更に紫色の濃度
順に+〜+++とし5段階で示した。結果を表3に示し
た。
スと比べて、合成繊維系スワブ特にポリエステル繊維か
らなる吸水部を有するサンプリングスワブのバックグラ
ウンドが低いことがわかる。
質検出用キットは、バックグラウンドが低く、再現性の
高い良好な効果を有する。
型)構成図である。
良型)構成図である。
易型)構成図である。
球型)構成図である。
トリップ型)構成図である。
タンプ型)構成図である。
Claims (10)
- 【請求項1】 試料表面の蛋白質の検出方法において、
試料表面の対象部分から蛋白質を、検出媒体のポリエス
テルからなる検出部分に移しとり、該移しとった検出部
分に蛋白質と反応し発色する試薬を接触させ、発色によ
り前記試料の表面に付着した蛋白質を検出することを特
徴とする蛋白質の検出方法。 - 【請求項2】 試料表面の蛋白質の検出方法において、
試料表面の対象部分から蛋白質を、検出媒体のポリエス
テルからなる検出部分に移しとり、該移しとった検出部
分に蛋白質と反応し発色する試薬を接触させ、発色によ
り前記試料の表面に付着した蛋白質を検出する蛋白質の
検出方法であって、前記試料表面の蛋白質を検出部分に
移しとる方法が、ぬぐう方法であることを特徴とする蛋
白質の検出方法。 - 【請求項3】 前記検出媒体の検出部分が吸水性である
ことを特徴とする請求項1〜2いずれかに記載の蛋白質
の検出方法。 - 【請求項4】 前記検出部分が試料表面の対象部分を移
し取る前に予め水性媒体で湿潤されていることを特徴と
する請求項1〜3いずれかに記載の蛋白質の検出方法。 - 【請求項5】 前記検出部分が繊維状のポリエステル又
は微細な多孔部を無数に有するポリエステルからなるこ
とを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の蛋白質
の検出方法。 - 【請求項6】 試料表面の対象部分から蛋白質を移しと
るための検出部分を有するポリエステルからなる検出媒
体、及び該移しとった検出部分に接触させ蛋白質と反応
し発色する試薬とを有することを特徴とする蛋白質検出
用キット。 - 【請求項7】 前記検出媒体の検出部分が吸水性である
ことを特徴とする請求項6に記載の蛋白質検出用キッ
ト。 - 【請求項8】 前記検出部分が試料表面の対象部分を移
し取る前に予め水性媒体で湿潤されていることを特徴と
する請求項6〜7いずれかに記載の蛋白質検出用キッ
ト。 - 【請求項9】 前記検出部分が繊維状のポリエステル又
は微細な多 孔部を無数に有するポリエステルからなるこ
とを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載の蛋白質
検出用キット。 - 【請求項10】 前記検出部分が試料の表面から蛋白質
を移しとる前に予め水性媒体で湿潤されていることを特
徴とする請求項6〜9いずれかに記載の蛋白質検出用キ
ット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP08939096A JP3348157B2 (ja) | 1995-04-19 | 1996-04-11 | 蛋白質の検出方法及び蛋白質検出用キット |
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JP9369095 | 1995-04-19 | ||
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CN110923128A (zh) * | 2019-04-25 | 2020-03-27 | 苏州格锐思生物科技有限公司 | 一种土壤过氧化氢酶活性测定试剂盒及其检测方法 |
-
1996
- 1996-04-11 JP JP08939096A patent/JP3348157B2/ja not_active Expired - Fee Related
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