JP3345832B2 - 突然変異部位に特異的に作用する酵素を使用する突然変異検出のためのクロマトグラフィーの方法 - Google Patents
突然変異部位に特異的に作用する酵素を使用する突然変異検出のためのクロマトグラフィーの方法Info
- Publication number
- JP3345832B2 JP3345832B2 JP2000509864A JP2000509864A JP3345832B2 JP 3345832 B2 JP3345832 B2 JP 3345832B2 JP 2000509864 A JP2000509864 A JP 2000509864A JP 2000509864 A JP2000509864 A JP 2000509864A JP 3345832 B2 JP3345832 B2 JP 3345832B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- mutation
- sample
- mipc
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 219
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 93
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 93
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 86
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 77
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 38
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 30
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 66
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 30
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 22
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 20
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 108010064144 endodeoxyribonuclease VII Proteins 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 11
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 9
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 8
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 8
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 7
- FNYIAYUBGLWKRU-UHFFFAOYSA-N [Rh].C1(C(C=CC=2C3=CC=C4C=CC=CC4=C3C=CC12)=N)=N.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1 Chemical compound [Rh].C1(C(C=CC=2C3=CC=C4C=CC=CC4=C3C=CC12)=N)=N.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1 FNYIAYUBGLWKRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 101710180995 Endonuclease 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000889812 Enterobacteria phage T4 Endonuclease Proteins 0.000 description 5
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 5
- 102000010645 MutS Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010038272 MutS Proteins Proteins 0.000 description 5
- JECHGJGSEAVOKJ-UHFFFAOYSA-N [Rh+3].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C=CC(C1=N)=N)=C1C=C2 Chemical compound [Rh+3].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C=CC(C1=N)=N)=C1C=C2 JECHGJGSEAVOKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N diazene Chemical compound N=N RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 4
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 4
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 4
- CORJQCWZMQLVFT-UHFFFAOYSA-N [Ru].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 Chemical compound [Ru].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 CORJQCWZMQLVFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- MMCMTDZEDJDJEM-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-1,2-dione;2-pyridin-2-ylpyridine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.C1=CC=C2C(C=CC(C3=O)=O)=C3C=CC2=C1.C1=CC=C2C(C=CC(C3=O)=O)=C3C=CC2=C1 MMCMTDZEDJDJEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016077 MutL Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010010712 MutL Proteins Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NZHYAOXEEGHBHU-UHFFFAOYSA-N [Ru+3].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 Chemical compound [Ru+3].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 NZHYAOXEEGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 108010041758 cleavase Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 3
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ARPVDVRJXWLFNL-UHFFFAOYSA-N [Rh+3].C1=CC=CC2=CC=C3C4=CC=CC=C4C=CC3=C21 Chemical compound [Rh+3].C1=CC=CC2=CC=C3C4=CC=CC=C4C=CC3=C21 ARPVDVRJXWLFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFZQBLSUHUXVQM-UHFFFAOYSA-N [Rh].C1(C(C=CC=2C3=CC=C4C=CC=CC4=C3C=CC12)=O)=O.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1 Chemical group [Rh].C1(C(C=CC=2C3=CC=C4C=CC=CC4=C3C=CC12)=O)=O.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1.N1=C(C=CC=C1)C1=NC=CC=C1 OFZQBLSUHUXVQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- -1 and MutY Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N chrysene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=C3C4=CC=CC=C4C=CC3=C21 WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZGMNNQOPOLCIG-UHFFFAOYSA-N chrysene-5,6-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)C(=O)C2=C1C=CC1=CC=CC=C21 HZGMNNQOPOLCIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- PZSJYEAHAINDJI-UHFFFAOYSA-N rhodium(3+) Chemical compound [Rh+3] PZSJYEAHAINDJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- NEOGGGHDLGYATP-UHFFFAOYSA-N 1,6-dimethylimidazo[4,5-b]pyridin-2-amine Chemical compound CC1=CN=C2N=C(N)N(C)C2=C1 NEOGGGHDLGYATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 235000000434 Melocanna baccifera Nutrition 0.000 description 1
- 241001497770 Melocanna baccifera Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QLWGRVJCTFKHHV-UHFFFAOYSA-N [Ru+2].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 Chemical compound [Ru+2].N1=CC=CC2=C1C1=NC=3C=CC=CC3N=C1C1=C2N=CC=C1.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12.N1=CC=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12 QLWGRVJCTFKHHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150013854 mutS gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
めの改良されたクロマトグラフィーの方法に関する。
けDNA断片中の突然変異を検出する能力は、医学、な
らびに物理および社会科学で非常に重要である。ヒトゲ
ノムプロジェクト(Human Genome Pro
ject)は莫大な量の遺伝情報を提供しており、その
情報は突然変異とヒトの疾患との間の関連を評価するた
めの新たな基準を設定している(ガイヤー(Guye
r)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 92:10841(1995))。例えば、多くの
疾患の最終的な根源は、野生型と異なる遺伝暗号により
記述される(コットン(Cotton)、TIG 1
3:43(1977))。疾患の遺伝的基礎を理解する
ことは治療の出発点であり得る。同様に、遺伝暗号中の
差異の決定は、進化および集団の研究への強力かつおそ
らく決定的な洞察を提供し得る(クーパー(Coope
r)ら、Human Genetics vol.6
9:201(1985))。これら、および遺伝暗号化
(genetic coding)に関する他の論点を理解することは、
野生型に関してのあるDNA断片中の異形、すなわち突
然変異を同定する能力を基礎とする。従って、正確、再
現可能かつ信頼できる様式で突然変異を検出する方法論
に対する必要性が存在する。
れるサブユニットを含んで成るポリマーである。DNA
中で見出される4種のデオキシヌクレオチドは、共通の
環状糖すなわちデオキシリボースを含んで成り、これは
4種の塩基、すなわち下でそれぞれA、G、CおよびT
と称されるアデニン(プリン)、グアニン(プリン)、
シトシン(ピリミジン)およびチミン(ピリミジン)の
いずれかに共有結合される。リン酸基は、別のデオキシ
ヌクレオチドの5’−ヒドロキシルで1個のデオキシヌ
クレオチドの3’−ヒドロキシルを結合してポリマー鎖
を形成する。二本鎖DNAにおいては、2本の鎖がいわ
ゆる相補的塩基の間の水素結合によりらせん構造中に一
緒に保持される。塩基の相補性はそれらの化学構造によ
り決定される。二本鎖DNAにおいては、各AはTと対
をなし、また、各GはCと対をなす。すなわちプリンは
ピリミジンと対をなす。理想的には、DNAは、人体も
しくは他の生存する生物体で細胞分割の間にDNAポリ
メラーゼにより正確なコピーで複製される。DNA鎖は
また、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビ
トロでも複製され得る。
くない塩基対形成が起こり、これは、新たな鎖のさらな
る複製の後に、親のものとの塩基配列中の遺伝する差異
を含有する二本鎖DNAの子孫をもたらす。塩基対配列
中のこうした遺伝する変化は突然変異と呼ばれる。
呼ばれる。1本の鎖の塩基配列が他の鎖の塩基配列に完
全に相補的である場合、その二重鎖はホモ二重鎖と呼ば
れる。二重鎖が相補的でない最低1個の塩基対を含有す
る場合、その二重鎖はヘテロ二重鎖と呼ばれる。ヘテロ
二重鎖が、DNA複製の間に、誤りがDNAポリメラー
ゼ酵素によりなされそして非相補的塩基が複製されてい
るポリヌクレオチド鎖に付加される場合に形成され得
る。化学的損傷、UV損傷およびイオン化放射もまた障
害を引き起こし得、これは通常修復される。ヘテロ二重
鎖の修復は通常迅速であるが、しかし、誤った塩基に合
致するよう修復されるのは元の配列でありうる。修復に
おける誤りは突然変異につながりうる。ヘテロ二重鎖の
さらなる複製は、理想的には、ヘテロ接合であるホモ二
重鎖を生じることができる。すなわち、これらのホモ二
重鎖は、元の親DNA鎖に比較して変えられた配列を有
することができる。親DNAが天然に存在する集団で優
位を占める配列を有する場合には、それは一般に「野生
型」と呼ばれる。
ある。DNA突然変異の例は、「点突然変異」もしくは
「単一塩基対突然変異」を包含するがしかしこれらに制
限されず、その中では間違った塩基対形成が存在する。
最も普遍的な点突然変異は、1個のプリンもしくはピリ
ミジン塩基が別のものに取って代わる「転位」、および
1個のプリンがピリミジンの代わりに用いられる(そし
て逆もまた同じ)「転換」を含んで成る。点突然変異は
また、1個の塩基がDNA鎖に付加もしくはこれから欠
失される突然変異も含んで成る。こうして「挿入」もし
くは「欠失」は「フレームシフト突然変異」としてもま
た知られる。複数の塩基対に影響を及ぼす突然変異もま
た起こり得、そして重要でありうるとは言え、それらは
点突然変異より小さな頻度で起こる。突然変異のより詳
細な論考は、モドリッチ(Modrich)への米国特
許第5,459,039号(1995)およびコットン
(Cotton)への米国特許第5,698,400号
(1997)で見出され得る。これらの参考文献および
その中に含有される参考文献は本明細書にそっくりその
まま組み込まれる。
生をコードする。とりわけ、DNA鎖のエキソン部分の
DNA配列は、タンパク質中の対応するアミノ酸配列を
コードする。従って、DNA配列中の突然変異はタンパ
ク質のアミノ酸配列の変化をもたらしうる。アミノ酸配
列中のこうした変化は、完全に良性でありうるか、ある
いは、タンパク質を不活性化しうるかまたは生命を脅か
すもしくは致死的であるようにその機能を変えうる。他
方、DNA鎖のイントロン部分の突然変異は生物学的影
響を有することを期待されないとみられる。なぜなら、
イントロン区分はタンパク質産生のための暗号を含有し
ないからである。にもかかわらず、イントロン区分中の
突然変異の検出は、例えば遺伝子発現の制御の研究、も
しくは法医学的検討で重要でありうる。
ること、疾患の起源を理解すること、および潜在的治療
の開発において、大きく興味深くかつ重要である。DN
Aサンプル中の突然変異の検出および類似性もしくは差
異の同定は、疾患抵抗性かつ/もしくはより多く産する
作物株を開発することにより世界の食糧供給を増大させ
ること、法廷科学、進化および集団の研究、ならびに一
般に学術的研究においてもまた決定的に重要である(ガ
イヤー(Guyer)ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 92:10841(1995);
コットン(CottoN)、TIG 13:43(19
97))。
いDNA配列中の変化は、ときに「多形」と呼ばれる。
本発明においては、DNA配列中のいかなる変化も、そ
れらが負の結果を有するにしろしないにしろ、「突然変
異」と呼ばれる。本発明の方法は、生物学的影響もしく
はその欠如に関係なく突然変異を検出する能力を有する
ことが理解されるべきである。簡略化のために、「突然
変異」という用語は、全体を通して、対照鎖に比較して
あるDNA鎖の塩基対中のある変化を意味するために使
用されるであろう。本発明の文脈上、「突然変異」とい
う用語は、「多形」という用語、または技術のいずれか
の他の類似のもしくは同等の用語を包含するものと理解
されるべきである。
電気泳動を使用して行われている。キャピラリー電気泳
動もまた、DNAの混合物を分離かつ分析するのに使用
されている。
操作上困難であり、かつ、高度に熟練した人員を必要と
する。加えて、当該分析は冗長でありかつ長い設定時間
を必要とする。90塩基対の断片の変性キャピラリーゲ
ル電気泳動分析は30分以上かかり、また、変性ゲル電
気泳動分析は5時間もしくはそれ以上かかりうる。ゲル
技法の長い分析時間は、ゲル中でのDNA断片の動きが
幾何学的関係においてそれらの長さに逆比例するという
事実によりさらに悪化される。従って、より長いDNA
断片の分析時間はしばしば擁護でき得ない。
え、これらの技術は必ずしも、再現可能もしくは正確で
あるわけではない。なぜなら、ゲルの調製および分析を
行うことは、一操作者から別の者まで高度に変動性であ
り得るからである。
プローチは、ある酵素がDNA二本鎖中の塩基対配列の
逸脱を認識し得るという公知の事実を基礎とする。突然
変異の存在のこの認識は2種の形態を取り得る。酵素
は、突然変異部位もしくはその付近でDNA二本鎖を切
断するか、または、塩基対のミスマッチ部位でそのDN
A二本鎖に結合するかのいずれかであることができる。
また、突然変異の存在もしくは非存在を決定するのにゲ
ルを基礎とした分析技術にも頼ってきた。上で既に論考
された、ゲルを基礎とした分析方法に関する制限に加
え、ゲルを基礎とした方法の感度はMIPCに比較して
相対的に低い。従って、ゲル電気泳動が突然変異の存在
についてあるサンプルを分析するのに使用される場合、
そのサンプルは、生成物の鎖の最大の集積を可能にする
ために、延長された時間の間、酵素と接触したままにさ
れなければならない。しかしながら、酵素との延長され
た接触は非特異的切断をもたらし得、これは分析結果の
不明確さを創製する。
析方法を提供することが、本発明の一目的である。
かつ、高処理量の突然変異検出アッセイもしくは多数の
サンプルをスクリーニングすることを必要とする他の分
析での使用のために自動化され得る突然変異検出方法を
提供することが、本発明の付加的な一目的である。
Aサンプル中の突然変異の存在を決定するための二本鎖
DNAのサンプルの分析方法を提供する。当該方法は、
(a)前記サンプルを突然変異部位結合試薬と接触させ
ること、ならびに(b)段階(a)の生成物をクロマト
グラフィーで分離かつ検出することを含んで成る。当該
方法は、さらに、段階(b)の分離された生成物を標準
と比較する段階を含んで成る。
イオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matc
hed Ion Polynucleotide Ch
romatography)、サイズ排除クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは逆相
クロマトグラフィーにより実施され得る。DNAサンプ
ルは、段階(a)に先立ち対応する野生型DNAとハイ
ブリダイゼーションされ得る。
薬は、前記突然変異部位の近傍内で結合するタンパク質
試薬である。当該タンパク質試薬は、エンドヌクレアー
ゼ、制限酵素、リボヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵
素、リゾルベース、ヘリカーゼ、リガーゼ、および不適
正に特異的な抗体から成る群から選択される。当該タン
パク質試薬は部位特異的突然変異誘発により改変され得
る。好ましい一態様において、当該タンパク質試薬は、
前記突然変異部位の近傍内でDNAサンプルの最低1本
の鎖を切断する。
位結合試薬は、突然変異の近傍内で結合もしくは切断す
る非タンパク質性の化学試薬である。こうした試薬は挿
入剤(intercalator)を包含する。特定の例は、塩基対配
列を認識しかつ突然変異部位の近傍内でインターカレー
ションする有機金属DNA挿入剤の分類を包含する。こ
うした化合物の特定の例はロジウムもしくはルテニウム
を含有し、そして、ビス(2,2’−ビピリジル)クリ
センキノンジイミンロジウム(III)、ビス(2,2’
−ビピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(II
I)、(2,2’−ビピリジル)ビス(フェナントレン
キノン)ジイミンロジウム(III)、ビス(フェナント
ロリン)ジピリドフェナジンルテニウム(II)、ビス
(フェナントロリン)ジピリドフェナジンルテニウム
(III)を包含する。本発明のさらなる一態様において
は、適切な波長の光へのDNA/挿入剤複合体の曝露
が、DNA鎖を結合部位もしくはその付近で切断させ
る。
プル中の突然変異の存在を決定するためのDNAサンプ
ルのクロマトグラフィーの分析方法を提供し、当該方法
は、(a)DNAサンプルを、当該サンプルの分離され
た成分を表わすピークもしくは他の形状を含んで成る第
一クロマトグラムを生じさせるクロマトグラフィーの方
法を使用して分離すること;(b)前記DNAサンプル
を突然変異部位結合試薬と接触させること;(c)段階
(a)のクロマトグラフィーの方法により段階(b)の
生成物を分離して第二クロマトグラムを生じさせること
を含んで成る。当該方法は、さらに、段階(c)のクロ
マトグラムを段階(a)のクロマトグラムと比較するこ
とを含んで成り、ここで、段階(c)のクロマトグラム
の保持時間またはピークもしくは他の形状の数の変化
が、前記サンプル中の突然変異の存在を示す。
排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーおよび逆相クロマトグラフィーから成る群から選択さ
れ得る。本発明の好ましいクロマトグラフィーの方法
は、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィ
ー(MIPC)である。
ルは、当該分析を開始するのに先立ち、対応する野生型
とハイブリダイゼーションされる。
ンパク質性の化学試薬であり得る。化学試薬の例は、ロ
ジウムもしくはルテニウムを含有する有機金属DNA挿
入剤を包含する。こうした挿入剤はビス(2,2’−ビ
ピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(III)を
含んで成る。
その化学試薬は突然変異部位もしくはその付近で結合す
る。当該サンプルは、従って、それが突然変異を含有す
る場合に変えられる。当該サンプルの変えられた形態が
MIPCにより分離かつ検出され得る。
を認識する場合、当該酵素は、突然変異部位もしくはそ
の付近でDNA二重鎖を切断するか、またはヘテロ二重
鎖中の塩基対の不適合の部位もしくはその付近でDNA
二重鎖の単一の鎖にニックを入れる。当該酵素はまた、
突然変異もしくはその付近でも結合し得る。当該サンプ
ルは、従って、それが突然変異を含有する場合に変えら
れる。当該サンプルの変えられた形態がMIPCにより
分離かつ検出され得る。
レアーゼ、制限酵素、リボヌクレアーゼ、ミスマッチ修
復酵素、リゾルベース、ヘリカーゼ、リガーゼおよびミ
スマッチに特異的な抗体を包含する。より具体的には、
当該酵素は、T4エンドヌクレアーゼ7、T7エンドヌ
クレアーゼ1、S1、マングマメエンドヌクレアーゼ、
MutY、MutS、MutH、MutL、クリーベー
ス(cleavase)およびHINF1から成る群から選択され
得る。 (発明の詳細な記述)その最も一般的な形態において、
本発明は突然変異検出の改良された方法に関し、ここ
で、クロマトグラフィーが、酵素もしくは化学試薬と接
触されているサンプルのDNA断片を分離かつ検出する
のに使用される。より具体的には、本発明は改良された
突然変異検出方法に関し、それは、突然変異部位もしく
はその付近でDNAを切断するもしくはDNAに結合す
ることにより突然変異を認識し得る酵素もしくは化学試
薬と接触されているサンプルでの、DNA断片の大きさ
を基礎としたMIPC分離および検出に依存する。下で
より十分に論考されるであろうとおり、本発明の方法
は、サンプルを、突然変異を含有するDNAサンプルを
切断しないがしかし野生型を切断するのみである酵素、
例えば制限酵素と接触させることにより突然変異を検出
するのにもまた使用され得る。
ロマトグラフィー(MIPC)と呼ばれるクロマトグラ
フィーの方法が、一般に二本鎖ポリヌクレオチド、およ
びとりわけDNAの混合物を効果的に分離するために導
入され、そこではその分離は塩基対長さを基礎とする
(ボン(Bonn)への米国特許第5,585,236
号(1996);フーバー(Huber)ら、Chro
matographia 37:653(1993);
フーバー(Huber)ら、Anal.Bioche
m.212:351(1993))。これらの参考文献
およびその中に含有される参考文献はそっくりそのまま
本明細書に組み込まれる。MIPCはゲルを基礎とする
分離方法に伴う欠点のいずれかにより制限されない。
イオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー」という用
語は、非極性分離媒体を使用する一本鎖および二本鎖ポ
リヌクレオチドを分離するための方法と定義され、ここ
で、当該方法は、対イオン剤、および分離媒体からポリ
ヌクレオチドを遊離させるために有機溶媒を使用する。
MIPC分離は10分未満、および頻繁には5分未満で
完了され得る。MIPC系(WAVE(商標)DNA断
片分析系、トランスゲノミック インク(Transg
enomic,Inc.)カリフォルニア州サンノゼ)
は、カラムおよび液体領域を囲むコンピュータ制御され
るオーブンを装備される。
し、これは、有機ポリマー、被覆もしくは共有結合され
た有機ポリマーまたは共有結合されたアルキルおよび/
もしくはアリール基を含んで成る非極性表面を有するシ
リカ媒体、非極性シリカゲルもしくは有機ポリマーを含
んで成る連続的モノリスもしくはロッドカラムを包含す
る。MIPCで使用される分離媒体は多孔質もしくは非
多孔質であり得る。MIPCの分離方法、MIPC分離
媒体およびMIPC系の詳細な記述は、ジェルデ(Gj
erde)への米国特許第5,772,889号(19
98)および1998年4月10日に申請された同時係
属中の米国特許出願第09/058,580号;199
8年4月10日に申請された第09/058,337
号;1998年4月24日に申請された第09/06
5,913号;1998年5月18日に申請された第0
9/081,040号;1998年5月18日に申請さ
れた第09/081,039号;1998年5月18日
に申請された第09/080,547号、ならびに、1
998年8月4日に申請された「改良された突然変異検
出方法(improved Mutation Det
ection Method)」と題された代理人処理
予定事項表第TRAN1−103号により同定される米
国特許出願に見出される。この特許およびこれらの出願
の完全な内容はこれにより引用により組み込まれる。M
IPCの系および分離媒体は商業的に入手可能である
(トランスゲノミック インク(Transgenom
ic,Inc.)カリフォルニア州サンノゼ)。MIP
C分析全体はデスクトップコンピュータおよびサンプル
自動注入器によって自動化され得る。各サンプルについ
ての分析データは実時間で分析され得るか、もしくは、
収集され得そしてより後の時間での分析のためにコンピ
ュータの記憶装置に記憶され得る。
物体で有害な影響を生じさせる、野生型からのDNA配
列の変動を示すのに使用される。「多形」という用語
は、しばしば、良性であるDNA中の配列の変動を示す
のに使用される。本発明においては、「突然変異」とい
う用語は、野生型から変動しかつ「多形」を包含する塩
基配列を有するいかなるDNA断片も指すことが理解さ
れるべきである。本発明の「突然変異」は、PCRのよ
うなインビトロの方法で産生されたものを包含する、全
部の突然変異を包含する。
か、すなわち野生型に関しての塩基対配列中の変動の制
限しない例は、DNA複製の間になされる誤りを包含
し、そこでは、非相補的塩基がDNA鋳型に付加され
る、1塩基が欠失される、もしくは1塩基が挿入され
る。突然変異のより詳細な論考は、モドリッチ(Mod
rich)への米国特許第5,459,039号(19
95)およびコットン(Cotton)への米国特許第
5,698,400号(1997)に見出され得る。こ
れらの参考文献およびその中に含有される参考文献はそ
っくりそのまま本明細書に組み込まれる。全部の型の突
然変異が、本発明の方法により検出され得る。
それ以上の突然変異の存在についてのDNAサンプルの
改良されたクロマトグラフィーの分析方法を提供する。
当該方法は、DNAサンプルを、突然変異部位を認識す
るための突然変異部位結合試薬と接触させて生成物を生
じさせることを含んで成る。当該生成物は、切断生成物
であり得るか、もしくは、DNAに結合された突然変異
結合部位結合試薬から成る複合体であり得る。当該生成
物はその中の成分を分離かつ検出するためにクロマトグ
ラフィー分離される。分離された生成物がその後標準と
比較される。標準は、一般に、突然変異部位結合試薬と
の接触前のDNAサンプルである。標準と比較した、突
然変異部位結合試薬との接触後のサンプルのクロマトグ
ラム中の保持時間もしくはピークの数の変化が、少なく
とも1個の突然変異部位の存在を示す。
は、突然変異部位の近傍で結合するタンパク質試薬であ
る。例は、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、リボヌクレ
アーゼ、ミスマッチ修復酵素、リゾルベース、ヘリカー
ゼ、リガーゼおよび不適正に特異的な抗体を包含する。
結合に加え、当該タンパク質試薬は、突然変異部位の近
傍でサンプルの最低1本の鎖で切断もまたし得る。関連
する一態様においては、当該サンプルが、突然変異部位
結合試薬と接触されている前に対応する野生型とハイブ
リダイゼーションされる。
ー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマ
トグラフィーを包含するいかなるクロマトグラフィーの
方法も本発明の方法で使用され得るとは言え、好ましい
クロマトグラフィー段階はMIPCを含んで成る。ゲル
電気泳動を基礎とする分離は、本明細書で使用されると
ころのクロマトグラフィーの定義から除外される。
発明の重要な一局面は、配列認識酵素で処理されたサン
プルがMIPCもしくはDMIPCにより直接分析され
得ることである。分析に先立ちいかなる内在する試薬も
しくは副生成物も除去することは必要でない。これは異
常である。なぜなら、こうした内在する物質、とりわけ
タンパク質は、通常、HPLC分離を妨害するからであ
る。この発見は、突然変異検出スクリーニングアッセイ
における複数のサンプルの管理されていない自動化され
た分析を可能にする。
変異部位の近傍で結合する非タンパク質性の化学試薬を
使用することによってもまた実施され得る。こうした試
薬は、塩基配列を認識する化学挿入剤を包含し、そし
て、突然変異の存在を検出するための有効な手段であ
る。こうした化合物は、一般にロジウムもしくはルテニ
ウムを含有する有機金属物質により例示される。こうし
た部位認識有機金属挿入剤の特定の制限しない一例は、
ビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキノンジイミン
ロジウム(III)である。
適する波長を有する光に曝露される場合に、突然変異部
位の近傍でサンプルを切断もし得る。こうした波長の一
例は、水銀/キセノンアーク灯により生じられるような
約365nmである。
はそれ以上の突然変異の存在についてのDNAサンプル
の改良されたクロマトグラフィーの分析方法を提供す
る。当該方法は、DNAサンプルをクロマトグラフィー
の方法を使用して分離して、サンプルの分離された成分
を表わすピークもしくは他の形状を含んで成る第一クロ
マトグラムを生じさせることを含んで成る。当該サンプ
ルは、その後、DNA塩基配列を認識する突然変異部位
結合試薬と接触されて生成物を生じさせる。こうした突
然変異部位結合試薬は、野生型に関してのDNA配列の
変動を認識し得る酵素もしくは化学試薬であり得る。当
該サンプルを突然変異部位結合試薬と接触させることか
ら生じる生成物をクロマトグラフィーにより分離するこ
とは、第二クロマトグラムを生じさせる。第一クロマト
グラムと比較して第二クロマトグラム中のピークの数も
しくはそれらの保持時間の変化が存在する場合には、そ
のサンプルは突然変異を含有する。
換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを
包含する、二本鎖DNA断片の分離を遂げ得るいかなる
クロマトグラフィーの方法も、本発明の突然変異検出分
析で使用され得る。しかしながら、本発明の好ましい方
法はMIPCを使用する。従って、後に続く論考は、本
発明の方法を実施するためのMIPCの使用に焦点を当
てることができ、そして、上述された態様のそれぞれに
言及する。
断片を分離するため、突然変異検出分析における不明確
さが、突然変異部位もしくはハイブリダイゼーションか
ら生じる不適当に組み合わせられた塩基に特異的である
酵素もしくは化学試薬との接触前および後のサンプルの
クロマトグラムを比較する場合に排除される。ピークの
数で観察されるいかなる変化も、切断されたより短い断
片を表わすはずである。接触前および後のクロマトグラ
ムが、同一の数の、しかし異なる保持時間を有するピー
クを示す場合には、観察された変化はより大きな断片、
例えば酵素もしくは化学試薬が結合された断片を表わす
はずである。
を含有するDNAサンプルを対応する野生型とハイブリ
ダイゼーションさせることが必要である。MIPCは塩
基対長さによりDNA断片を分離するため、酵素もしく
は化学試薬とのDNAサンプルのいかなる反応も、その
酵素もしくは化学試薬との接触前のサンプルのクロマト
グラムに比較して、サンプルのMIPCクロマトグラム
中の保持時間および/もしくは断片の数の変化を生じさ
せることができる。本発明においては、酵素および化学
物質は突然変異の部位と選択的に反応し、その結果、ク
ロマトグラム中のいかなる変化も突然変異の存在を示
す。酵素もしくは化学試薬とサンプルを接触させる前に
生じられたクロマトグラムに比較して、酵素もしくは化
学試薬とサンプルを接触させた後のMIPCクロマトグ
ラム中の変化が存在しない場合には、そのサンプルは突
然変異を含有しない。
集され得、そしてそれらの配列が慣習的技術により実証
され得る。
が、推定の突然変異を含有するサンプルDNA断片をそ
の対応する野生型断片とハイブリダイゼーションさせる
ことにより形成される。サンプルおよび野生型の混合物
が約95℃に加熱される場合に、DNA二重鎖が変性し
て一本鎖ポリヌクレオチド断片を形成する。約50℃も
しくはより下にゆっくりと冷却する際に、その単一の鎖
が再アニーリングしてホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の
混合物を形成する。ヘテロ二重鎖はヘテロ二重鎖の突然
変異部位、すなわちDNA二重鎖中の塩基対のミスマッ
チ部位を含有する。このハイブリダイゼーション方法は
実施例1に記述され、かつ、図1に図解で描かれる。
が突然変異を含有する場合は、突然変異を認識する酵素
もしくは化学試薬が、突然変異部位で、もしくは突然変
異部位の近傍内でそのDNA鎖を切断し、それにより元
のサンプル中に存在したより少ない塩基対をそれぞれ有
するより多数の断片を創製する。あるいは、酵素もしく
は化学試薬が切断することなしに突然変異の部位に結合
する場合には、生じる結合された断片は元の断片より大
きくなることができ、そして、疎水性もまた変えられう
る。MIPCは、酵素もしくは化学試薬により認識され
た突然変異を検出するのに理想的に適する。なぜなら、
MIPCは大きさおよび疎水的相互作用を基礎としてD
NA断片を分離するからである。
リコートがその後、MIPCを使用して分析される。典
型的には、こうしたクロマトグラムは単一ピークを示す
ことができる。なぜなら、全部の断片が同一の塩基対長
さを有するからである。ハイブリダイゼーションされた
サンプルが、その後、ヘテロ二重鎖中の塩基対の不適正
を認識する酵素と接触される。ヘテロ二重鎖中の1個も
しくはそれ以上の塩基対の変動、例えば不適正を認識し
得る多くの酵素が当該技術分野で既知である。ヘテロ二
重鎖中の塩基対のミスマッチ部位を認識する酵素の制限
しない例は、T4エンドヌクレアーゼ7、T7エンドヌ
クレアーゼ1、大腸菌(E.coli)MutLタンパ
ク質、大腸菌(E.coli)MutSタンパク質、S
1ヌクレアーゼ、マングマメエンドヌクレアーゼ、チミ
ングリコシラーゼおよびクリーベース酵素を包含する。
本発明で使用され得る酵素の徹底的な提示は、以下の参
考文献、すなわち、コットン(Cotton)、Mut
ation Detection、pp67−95、オ
ックスフォード ユニバーシティ プレス(Oxfor
d University Press)、(199
7);マーシャル(Marshal)ら、Geneti
cs and Development 6:275
(1996);マーシャル(Marshal)ら、Na
ture Genetics 6:177(199
5);ユール(Youil)ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 92:87(1995);
コットン(Cotton)への米国特許第5,217,
863号(1993);コットン(Cotton)への
米国特許第5,698,400号(1997);ダール
バーグ(Dahlberg)への米国特許第5,71
9,028号(1998);ブロウ(Brow)ら、B
iomedical Products p.22、1
997年9月に提示される。突然変異を検出するための
方法の包括的総説が最近刊行された(Laborato
ry Methods For The Detect
ion Of Mutations and Poly
morphisms in DNA、テイラー(G.
R.Taylor)編、CRCプレス(CRC Pre
ss)、1997)。これらの参考文献およびその中に
含有される参考文献は本明細書にそっくりそのまま組み
込まれる。こうした酵素は突然変異部位もしくはその付
近でDNA断片を切断し、それにより元のハイブリダイ
ゼーションされたサンプル中に存在したよりも多くの断
片を創製する。そのように生じられた断片はサンプル断
片から発するため、それらは必ずより小さい。酵素との
接触後のMIPCによるDNAサンプル混合物の分析
は、今や、そのサンプル中に存在する各突然変異部位に
ついて(n+1)本のピークを示すことができ、ここで
「n」は元のサンプル中の突然変異部位の数である。切
断された断片は、全部、元のサンプル断片より小さいた
め、MIPCクロマトグラム中のピークは、全部、元の
サンプル断片より短い保持時間を有することができる。
本発明の本局面の別の態様においては、MIPCが、全
部の鎖が変性される上昇された温度(例えば65℃)
で、当該酵素との接触前および後の双方で得られる反応
混合物のアリコートで実施され得る、
されたいかなる酵素も、不適当に組み合わせられた塩
基、Dループ、単一の塩基、1個の挿入もしくは欠失に
より異なるDNAの2本の鎖の間で形成されたヘテロ二
重鎖の近傍でヘテロ二重鎖を切断することについての候
補である。
ーゼは、一本鎖DNAの伸長された領域をもつヘテロ二
重鎖につながる複数の連続した塩基の変化もしくは挿入
/欠失が期待される場合に有用でありうる(コットン
(Cotton)、Mutation Detecti
on、オックスフォード ユニバーシティ プレス(O
xford University Press)、ニ
ューヨーク、p.88(1997))。
クレアーゼもまた、DNAヘテロ二重鎖中の不適当に組
み合わせられた塩基の検出に使用されうる。マングマメ
ヌクレアーゼは、ミスマッチ部位で一本鎖DNAを消化
するのに使用されてきた。この方法は、配列の情況に高
度に依存性である(シェンク(Shenk)ら、Col
d Spring Harb.Symp.Quant.
Biol.1:61−67(1975))。
然変異についてのDNAの迅速なスクリーニングのため
の有用な試薬でありうる(マシャル(Mashal)
ら、Nature Genetics 9:177(1
995))。T4エンドヌクレアーゼVII(T4E7)
のようなリゾルベースは、組換え事象後に形成されるホ
リデー(Holiday)構造の形態にあるDNAを切
断することが可能である(ユール(Youil)ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 92:
87(1995))。それらはまた、10%と50%と
の間の効率で、全部の単一の塩基対の不適正も切断す
る。例えば、正常のおよび突然変異されたDYS271
配列からのPCR増幅されたDNA断片が、実施例2お
よび4に記述されるように混合され、変性され、そして
アニーリングされて、T4E7による切断のための不適
正を生じさせる。リゾルベースは2本のヘテロ二重鎖中
の鎖の1から4個までを切断することができる。4個の
潜在的部位の1個のみが切断される場合でさえ、これは
突然変異の存在を検出するのに十分である(コットン
(Cotton)、Mutation Detecti
on、オックスフォード ユニバーシティ プレス(O
xford University Press)、ニ
ューヨーク、p.91−93(1997))。
の変化を同定するのに使用されうる。突然変異の性質お
よび部位が、切断されたDNA断片の大きさから決定さ
れ得る(Laboratory Methods fo
r the Detection of Mutati
ons and Polymorphisms in
DNA、テイラー(G.R.Taylor)(編)、C
RCプレス(CRC Press)、ニューヨーク、p
p.195−205(1997))。これらの酵素はミ
スマッチ部位で1本の鎖にニックを入れる。変性に際し
て1本の鎖が切断される。
末端に一緒に結合する。二重鎖DNA中のニックが、そ
のニックのいずれかの側の3’および5’端を結合する
ことにより封止されうる。ニックを取り巻く適合される
塩基対の要求が、ニックを封止することの失敗によりミ
スマッチ存在を示すのに使用され得る。ニックは、目的
の部位にわたる3’端をもつオリゴヌクレオチドを、隣
接してアニーリングされた別のオリゴヌクレオチドにア
ニーリングすることにより形成され得る(プリチャード
(Pritchard)ら、Nucleic Acid
s Research 25:3403(199
7))。
ある上の酵素に加えて、配列特異的なエンドヌクレアー
ゼが、突然変異が配列認識モチーフとともに位置される
(sited)の場合に、ホモ二重鎖中の断片長さの多形を生
じさせることができる。この断片長さの多形はDMIP
Cを使用して検出され得る。
中の突然変異が制限酵素を使用するMIPCにより検出
される。制限酵素は、DNA中の特定のヌクレオチド配
列を認識し、そしてその認識された配列の一端もしくは
その付近でDNAの二本鎖を切断する。突然変異がサン
プル中に存在する場合、制限酵素はDNA鎖を切断する
ことができない。なぜなら、自明のこととして、突然変
異は野生型の断片と異なるヌクレオチド配列を有し、そ
してこの突然変異は制限酵素により認識されることがで
きないからである。従って、サンプルのMIPCクロマ
トグラムは、制限酵素での処理前に単一ピークを生じさ
せることができる。突然変異がサンプル中に存在しない
場合、MIPCクロマトグラムは1本以上のピークを生
じさせることができる。なぜなら、その制限酵素はそれ
が認識するヌクレオチド配列を認識することができ、そ
して、当該DNA断片をこうした配列の位置もしくはそ
の付近で切断することができるからである。突然変異が
存在する場合、MIPCクロマトグラムは、サンプルが
制限酵素と接触された後に野生型より少ないピークを生
じさせることができる。なぜなら、切断が突然変異部位
で起こらないことができるからである。この態様の一利
点は、突然変異がヘテロ二重鎖およびヘテロ接合のホモ
二重鎖の双方で検出され得ることである。
対応する野生型を無傷で残す一方で突然変異を含有する
DNA断片を切断するのに使用され得る。この態様にお
いて、突然変異体断片中の塩基配列を認識するがしかし
野生型断片中ではしないことが既知である制限酵素が選
択される。これゆえに、野生型に関して推定の突然変異
を含有するサンプルが、突然変異の塩基対配列のみを認
識する制限酵素と接触される。酵素との接触前の野生型
もしくはサンプルのMIPC分析は、単一ピークを示す
クロマトグラムを生じさせることができる。酵素との接
触後のサンプルのMIPC分析は、サンプルが突然変異
を含有しない場合に1本のピークを示すクロマトグラム
を生じさせることができる。酵素との接触後のサンプル
のMIPC分析は、サンプルが突然変異を含有する場合
に(n+1)本のピークを示すクロマトグラムを生じさ
せることができる。なぜなら、切断が、酵素により認識
される各突然変異部位もしくはその付近で起こることが
できるからである。こうしたアプローチはマリス(Mu
llis)により記述され(米国特許第4,683,2
02号(1987))、ここでは、鎌状赤血球遺伝子中
の突然変異体配列を認識するHinfI制限酵素が、臨
床サンプル中の鎌状赤血球の突然変異の存在を立証する
のに使用された。その場合には、サンプルおよび野生型
がHinfIで処理され、そしてゲル電気泳動により分
析された。このゲルのオートラジオグラフは、野生型の
レーンで単一のバンドを、しかしサンプルのレーンで2
本のバンドを示し、サンプル中の突然変異の存在を示
す。当該分析が、関連するDNA断片を分離かつ検出す
るのにMIPCを使用することにより電気泳動に関して
大きく単純化され得ることは、本発明の重要な一局面で
ある。マリス(Mullis)の参考文献およびその中
に含有される参考文献はそっくりそのまま本明細書に組
み込まれる。
然変異部位もしくはその付近でヘテロ二重鎖に「ニック
を入れる」酵素と接触されたDNAヘテロ二重鎖を含有
するハイブリダイゼーションされた混合物中でMIPC
を使用して検出され得る。「ニック」という用語は、他
方の鎖を無傷で残す一方で突然変異部位もしくはその付
近でのヘテロ二重鎖の一方の鎖のみの酵素的切断を指
す。例は、短い曝露時間内のT4エンドヌクレアーゼ7
もしくはT7エンドヌクレアーゼ1、MutY、および
チミングリコシラーゼを包含する。この態様において
は、DNA断片のハイブリダイゼーションされた混合物
のアリコートがMIPCにより分析される。この分析か
ら得られるクロマトグラムは単一ピークを示す。なぜな
ら、全部の断片が同じ塩基対長さを有するからである。
混合物の別のアリコートがニックを入れる酵素と接触さ
れる。発明者は、驚くべきことに、ニックを入れられた
二本鎖DNA断片がニックを入れられないDNAに関し
てより短い保持時間を有することを発見した。この混合
物が突然変異を含有する場合は、(n+1)本のピーク
がMIPCクロマトグラムで見られることができ、各ピ
ークは処理されないサンプルより短い保持時間を有し、
そしてここでnはヘテロ二重鎖中の塩基対のミスマッチ
数に等しい。サンプル混合物が突然変異を含有しない場
合には、単一のピークがMIPCクロマトグラムで見ら
れることができる。このピークは、処理されないサンプ
ルにより生じられるピークと同一の保持時間を有するこ
とができる。本発明の本局面の別の態様においては、M
IPCが、酵素との接触前および後の双方で、全部の鎖
が編成される上昇された温度(例えば65℃)で、反応
混合物のアリコートで実施され得る。
変異が、突然変異を検出することが可能である酵素が切
断することなく突然変異部位もしくはその付近でDNA
断片に結合もしくはそれと複合体形成する場合に、MI
PCにより検出され得る。こうした酵素の制限しない例
は、RNアーゼA、ならびにMutY、MutS、Mu
tL、MutHおよびチミングリコシラーゼのようなミ
スマッチ修復酵素を包含する。配列認識酵素は、モドリ
ッチ(Modrich)への米国特許第5,459,0
39号(1995)で論考される。この参考文献および
その中に含有される参考文献は本明細書にそっくりその
まま組み込まれる。この態様においては、DNAサンプ
ルが野生型とハイブリダイゼーションされて、突然変異
が存在する場合にはホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の混
合物、もしくは突然変異が存在しない場合には変化され
ないホモ二重鎖を生じさせる。DNAサンプルは、突然
変異結合酵素との接触前にMIPCにより分析される場
合に1本のピークを生じさせることができる。突然変異
がサンプル中に存在しない場合、MIPCクロマトグラ
ムは酵素との接触後に変化を示さないことができる。突
然変異がサンプル中に存在する場合、MIPCクロマト
グラムは、酵素と接触されていないサンプルに比較し
て、移動された、例えばより長い保持時間の1本のピー
クを示すことができる。このより長い保持時間のピーク
は、酵素が結合された突然変異含有断片を表わす。図2
は、酵素との接触前のサンプルのMIPCクロマトグラ
ム、および酵素が結合されたDNA断片のより長い保持
時間に移動されたピークを示すクロマトグラムを示す。
突然変異結合部位に結合する酵素は時間のある長さの後
にDNA鎖を切断しうるとは言え、MIPC分析がサン
プルを酵素と接触させることの早い時間、例えば2ない
し10分以内で実施される場合には、DNA/酵素複合
体の結合された形態を検出することがなお可能である。
好ましくは、MIPC分析は、サンプルを酵素と接触さ
せることの5、そして至適には2分以内に実施される。
変異部位結合酵素は、ホルムアルデヒドのような慣習的
架橋剤を使用して、DNAとの結合された複合体中で不
活性化かつ安定化され得る(オーランドー(Orlan
do)ら Cell 75:1187(1993))。
法により改変されてもはや切断し得ないがしかし結合す
るその能力を保持する不活性酵素を提供し得ることもま
た真価を認められることができる。こうした改変された
酵素の使用もまた本発明の方法で使用され得、そしてジ
ロー・パニス(Giraud−Panis)ら(J.B
iol.Chem.271:33148(1996))
により記述されるとおり、部位特異的突然変異誘発によ
り改変されたT4エンドヌクレアーゼVII(T4E7)
により例示される。
ispair)認識タンパク質の形態に関し、それらは、結合
された誤った対認識タンパク質の近傍でDNA二重鎖の
最低1本の鎖を改変するための内在する(inherent)手段
を提供するように変えられている。本発明の本局面の主
要な一態様において、変えられた誤った対認識タンパク
質は、大腸菌(E.coli)のmutS遺伝子の改変
された産物であるか、もしくはそれにヒドロキシル基切
断機能が付加される別の機能的に相同な改変されたタン
パク質であり;また、このDNAの誤った対の位置推定
方法でのDNA改変段階は、さらに、この改変されたタ
ンパク質を、基切断機能がそのタンパク質の近傍でDN
Aの最低1本の鎖を切断するような条件下でDNAと接
触させることを含んで成る。DNA結合タンパク質への
ヒドロキシル基遊離機能の付加方法は、当該技術分野で
既知であり、モドリッチ(Modrich)への米国特
許第5,459,039号(1995)に総説される。
切断を引き起こし得ることが報告された(ユール(Yo
uil)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
92:87(1995))。こうした非特異的切断は、
推定の突然変異を含有するサンプルの分析で不明確さを
創製し得る。本発明の好ましい一態様においては、従っ
て、サンプルが、多様な時間間隔で、MIPCを使用し
て酵素との接触後に分析される。こうした間隔は、0、
2、5、7、10、15、20、25、30、40、5
0および60分であり得る。非特異的切断は、一般に、
特異的切断よりずっとより遅いため、非特異的切断に対
する特異的切断の比が最大である分析時間が決定され得
る。そのように決定されたサンプリング時間が、その
後、その後のスクリーニングで使用され得る。
は、当該方法の検出感度のため、および、サンプルあた
りの分析時間がわずか約5分であるため、MIPCを使
用して可能である。こうした分析は、実際的意味で、そ
れらの比較的低い感度および長い分析時間(数時間)の
ため、ゲルを基礎とした分析方法を使用して可能でな
い。発明者により発見されたとおり、MIPCを使用す
ることの主要な一利点は、当該方法のより大きな感度
が、酵素との最小限の接触後にサンプル中のいかなる切
断生成物も観察することを可能にすることである。好ま
しい一態様においては、実施例5に具体的に説明される
とおり、MIPCクロマトグラム中のいかなる変化も酵
素との接触の数分以内で分析され得、そして、非特異的
切断に対する特異的切断の比の時間経過が得られること
ができる。この方法は、非特異的切断に関しての当該分
析での不明確さを最小限にする。
Cは、野生型に関するヌクレオチド配列中の変動を認識
する非タンパク質性の化学試薬での推定の突然変異を含
有するDNA鎖の処理後にDNA中の突然変異を検出す
るのに使用され得る。ヘテロ二重鎖中の突然変異部位も
しくはその付近のインターカレーション部位で二重鎖D
NAに結合する化学試薬が当該技術分野で既知である。
こうした化合物の制限しない例は、ビス(2,2’−ビ
ピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(III)、
ビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキノンジイミン
ロジウム(III)、(2,2’−ビピリジル)ビス(フ
ェナントレンキノン)ジイミンロジウム(III)、ビス
(フェナントロリン)ジピリドフェナジンルテニウム
(II)、ビス(フェナントロリン)ジピリドフェナジン
ルテニウム(III)を包含する。部位選択的有機金属挿
入剤の合成および突然変異検出特性は、以下の参考文
献、すなわちJ.Am Chem.Soc.119:1
2986(1997);J.Am.Chem.Soc.
119:2921(1997);Inorg.Che
m.37:29(1998)に、バートン(Barto
n)らにより記述される。これらの参考文献およびその
中の参考文献は本明細書にそっくりそのまま組み込まれ
る。
−ビピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(II
I)である。この化合物の合成および突然変異検出特性
はジャクソン(Jackson)ら(J.Am.Che
m.Soc.119:12986(1997))により
記述される。この参考文献およびその中に含有される参
考文献は本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。部
位選択的な非共有結合的インターカレーションが、ヘテ
ロ二重鎖中の塩基対の不適正により引き起こされるらせ
んの不安定化により起こることが考えられる。ミスマッ
チ認識は、嵩高いクリセン挿入剤が結合することを可能
にする不適正により引き起こされるらせんの不安定化の
程度と幅広く相関されるようである。光切断は、インタ
ーカレーションされた複合体を、水銀/キセノンアーク
灯を用いて365nmで照射することにより遂げられ得
る。ジャクソン(Jackson)とバートン(Bar
ton)は、クリセン−ロジウム(III)挿入剤が、3
65nmでのDNAクリセン−ロジウム(III)複合体の
照射に際してのこれらの部位もしくはその付近での切断
により明示されるとおり、CC、CA、TT、TA、A
AおよびTCの不適正を認識することを見出した。
PCが、ロジウムもしくはルテニウムを含有する化学的
部位認識挿入剤により認識される突然変異を検出するの
に使用され得る。こうした挿入剤の制限しない一例は、
ビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキノンロジウム
(III)である。本態様において、推定の突然変異を含
有するDNA断片がハイブリダイゼーションされる。ハ
イブリダイゼーションされたサンプルのMIPC分析
は、単一ピークを示すクロマトグラムを生じさせること
ができる。なぜなら、ハイブリダイゼーションされたサ
ンプル中の全部の断片が同一の塩基対長さを有するから
である。ハイブリダイゼーションされたサンプルがその
後、ビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキノンロジ
ウム(III)のような部位認識挿入剤と接触される。M
IPC分析は、突然変異がサンプル中に存在しない場合
に単一ピークを示すクロマトグラムを生じさせることが
できる。突然変異が存在する場合には、このクロマトグ
ラムは野生型と比較して異なった保持時間を有する1本
のピークを示すことができる。あるいは、ビス(2,
2’−ビピリジル)クリセンキノンロジウム(III)と
接触されたサンプルが365nmで照射され得る。サンプ
ルが突然変異を含有しない場合は、野生型に比較してク
ロマトグラム中に変化が存在しないことができる。サン
プルが突然変異を含有する場合、そのクロマトグラムは
(n+1)本のピークを示すことができる。なぜなら、
切断が、サンプル中に存在する各突然変異部位で起こる
ことができるからである。
本発明の重要な一局面は、配列認識有機金属挿入剤で処
理されたサンプルが、MIPCもしくはDMIPCによ
り直接分析され得ることである。分析に先立ちいかなる
内在する試薬もしくは副生成物も除去することは必要で
ない。これは異常である。なぜなら、こうした内在する
物質、すなわち有機金属化合物は、通常、HPLC分離
で妨害するためである。この発見は、突然変異検出スク
リーニングアッセイにおける複数のサンプルの管理され
ていない自動化された分析を可能にする。
ル中に存在する場合に、化学試薬および酵素により生じ
られるDNA断片を分離かつ検出するためのMIPCの
使用に焦点を当てた。配列認識酵素もしくは化学試薬に
より生じられるDNA断片の必要な分離を遂げることが
可能である他の形態のクロマトグラフィーを使用して、
本明細書に記述された同一の様式で突然変異を検出する
こともまた可能である。従って、本発明の関連する態様
においては、DNA断片が、上述された化学的および酵
素の突然変異部位結合試薬のそれぞれおよびいずれかと
接触され得る。突然変異検出剤との接触前および後のサ
ンプルの分析が、その後、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、多孔質分離媒体でのイオン交換クロマトグラフィ
ー、非多孔質分離媒体でのイオン交換クロマトグラフィ
ー、および逆相クロマトグラフィーを使用して実施され
る。これらのクロマトグラフィーの方法は、ヒラバヤシ
(Hirabayashi)ら、(Anal.Bioc
hem.178:336(1989))、オヒミャ(O
himya)ら、(同上、189:126(199
0))、カトー(Kato)ら、J.Chromato
g.、168:264(1989)およびウェストマン
(Westman)ら、(同上、166:158(19
87))記述されるとおり、DNA断片を分離するのに
使用されている。これらの参考文献およびその中に含有
される参考文献は本明細書にそっくりそのまま組み込ま
れる。突然変異を検出するためのクロマトグラフィーの
分析方法の使用は前に報告されていない。
学的突然変異認識のシナリオのそれぞれにおいて、突然
変異の存在もしくは非存在についての分析は、以前、ゲ
ル電気泳動、変性ゲル電気泳動もしくは対応するキャピ
ラリー電気泳動技術により実施された。これらの分析技
術の重大な欠点は上に論考された(Laborator
y Methods For The Detecti
on Of Mutations and Polym
orphisms in DNA、テイラー(G.R.
Taylor)編、CRCプレス(CRC Pres
s)、1997)。一般にクロマトグラフィーの方法、
およびとりわけMIPCは、当該分析を大きく単純化
し、そして、正確さ、再現性、感度、データの収集およ
び記憶、ならびに処理量を向上させる。酵素もしくは化
学物質により認識された突然変異を検出するためのMI
PCの使用は前に報告されておらず、そして、突然変異
検出技術における大きな改良を提供する。
は、本発明の方法による突然変異検出を実施するために
変動され得ることが明らかであることができる。ある酵
素は、突然変異部位で結合して(しかし切断しない)、
非変性条件下のMIPCにより結合されないdsDNA
から分離され得るdsDNA−酵素複合体を形成するこ
とが既知である。他の酵素は結合しそしてその後切断す
る。結合された酵素および切断されたDNA生成物の双
方がMIPCを使用して観察され得る。MIPC分離
は、酵素がDNA−酵素複合体から遊離される上昇され
た「酵素遊離温度」で実施され得るが、しかし、DNA
は二重鎖としてのままである。あるいは、酵素切断の生
成物が、DNA生成物の全部がMIPC分離の間に変性
されるように上昇された温度で分析され得る。本明細書
で記述されるところの非タンパク質性の化学挿入剤は、
切断なしで突然変異部位でdsDNAに結合して、非変
性条件下のMIPCにより結合されないDNAから分離
され得るDNA−挿入剤複合体を形成し得る。いくつか
の場合には、結合された挿入剤が光活性化されて突然変
異部位の近傍でDNAを切断し得る。その生成物が、非
変性条件もしくは変性条件下のMIPCを使用して分析
され得る。
で、ニック形成もしくは切断の結果であるDNA種が、
クロマトグラム中のピークの数の変化もしくは変えられ
た保持時間により同定される。DNAと挿入剤もしくは
DNAとタンパク質との間の複合体もまた、非変性条件
下で変えられた保持時間を示す。
大された温度を使用して、漸進的により変性する条件下
で分離する能力も提供する。上昇されたpH、尿素、ホ
ルムアミドもしくは対イオンのような他の条件もまた使
用され得る。完全に変性する条件下で、DNA上の結合
部位からの不適正結合タンパク質および不適正切断酵素
の解離が起こることができる。変性条件下での二重鎖D
NAの解離は、前に相補鎖とアニーリングされたニック
を入れられた鎖の遊離につながり、MIPCにより3本
もしくはそれ以上のピークに分離され得る3種もしくは
それ以上の独立した単一の鎖にされた種を生じさせる。
述のうちに明らかになることができ、それらは本発明の
具体的説明のため与えられ、かつ、それの制限となるこ
とを意図されない。
は実験室で実施された。現在時制で記述される処置は実
験室で未だ実施されておらず、そしてこの出願の申請で
実施するよう構成的に縮小される。
eAmp](商標)(PCR試薬キット(部品番号N8
01−0055)、それは、アンプリタック[Ampl
iTaq](商標)DNAポリメラーゼ、ジーンアンプ
(GeneAmp)、10×PCR緩衝液、dNTP、
ならびにDNA鋳型およびプライマーを包含した)中
で、パーキン−エルマー アプライド バイオシステム
ズ(Perkin−Elmer Applied Bi
osystems)(カリフォルニア州フォスターシテ
ィ)から購入した。DNA鋳型を、10mMトリス−HC
l、pH8.0(カタログ番号0291、テクノヴァ
(Teknova)、米国カリフォルニア州ハーフムー
ンベイ)、1mMEDTA、pH8.0(カタログ番号0
306、テクノヴァ(Teknova))、10mMNa
Cl(カタログ番号S7653、シグマ(Sigm
a)、米国ミズーリ州セントルイス)中で100ng/mL
に希釈した。500bpの産物を、対照プライマー#1
(5’−GATGAGTTCGTGTCCCTACAA
CTGG−3’)および対照プライマー#2(5’−G
GTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC−
3’)からのDNA対照鋳型(バクテリオファージλD
NA)から増幅した。
の順序、すなわち、53μLのddH20、10μLの1
0×PCR緩衝液、200μMの各dNTP、2.5U/
100μLのアンプリタック[AmpliTaq](商
標)、1μMの対照プライマー#1、1μMの対照プライ
マー#2、および1ngのDNA対照鋳型で、PCRチュ
ーブ(部品番号TFI−0201、MJリサーチ(MJ
Research)、米国マサチューセッツ州ウォー
タータウン)に添加した。増幅を、15もしくは35の
PCR周期を使用して、MJリサーチ(MJ Rese
arch)(米国マサチューセッツ州ウォータータウ
ン)PTC−100サーモサイクラー(Thermoc
ycler)で実施した。
ルドリッチ コーポレーション(Sigma−Aldr
ich Corp.)、ミズーリ州セントルイス、カタ
ログ番号R5628)を、30部分の二重蒸留水で希釈
した。1部分の希釈された酵素を2部分のPCR産物に
添加した。500bpのPCR産物は、塩基37、4
7、452および457にHaeIIIの4個の切断部位
を有する。酵素との接触前の500bpのDNA断片を
含有するPCR産物のアリコートを、50℃でMIPC
カラムに適用し、そして、溶媒A(0.1M酢酸トリエ
チルアンモニウム(TEAA))および溶媒B(25%
アセトニトリル中0.1MTEAA)を用いて、Aおよ
びBを含んで成る以下の勾配、すなわち
で稼働するUV検出器を使用してDNA断片を検出し
た。
00bpのサンプルのMIPCクロマトグラムは、約9
分の保持時間を有する単一ピークを示した。
の2分後の500bpのサンプルのMIPCクロマトグ
ラムを示す。溶出条件は上述されたものと同一であっ
た。約11分の保持時間を有する単一の主ピークが見ら
れた。より長い保持時間への観察された移動は酵素が結
合されたサンプルを示す。
析 およそ1:1の比で対応する野生型断片と組み合わせら
れたホモ接合の突然変異体DNA断片(位置168にA
からGへの突然変異をもつ)の混合物を含有するDYS
271の209bpの突然変異標準(当該混合物はトラ
ンスゲノミック インク(transgenomic,
Inc.)、カリフォルニア州サンノゼから突然変異標
準(Mutation Standard)として入手
可能であり;当該突然変異はザイエルシュタッド(Se
ielstad)ら、Hum.Mol.Genet.
3:2159(1994)により記述される)を、3〜
5分間95℃で加熱し、その後45分にわたり25℃に
冷却した。2種のホモ二重鎖および2種のヘテロ二重鎖
の混合物を、図2に図解で示されるようなハイブリダイ
ゼーション方法により生じさせた。
(138ngのDNA)を、52℃でMIPCカラム(5
0mm×4.6mm直径)DNASeq(商標)(トランス
ゲノミック インク(Transgenomic,In
c.)カリフォルニア州サンノゼ)に注入した。WAV
E(商標)DNA断片分析系(トランスゲノミック イ
ンク(Transgenomic,Inc.))を使用
して実施されたクロマトグラフィーを、UV検出器を使
用して260nmでモニターした。カラムを、以下の勾
配、すなわち
よび溶媒B:0.1MTEAA、25%アセトニトリル
で0.75mL/分で溶出した。 実施例3 ロジウム挿入剤およびMIPCによる分析を使用する突
然変異の検出 ビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキノンジイミン
ロジウム(III)を、ジャクソン(Jackson)と
バートン(Barton)(J.Am.Chem.So
c.119:12986(1997))により記述され
るとおり合成する。
然変異をもつバクテリオファージλ(塩基対31500
−32500)(FMC コープ バイオプロダクツ
(FMC Corp.BioProducts)、メー
ン州ロックランドから入手可能)をPCRによって増幅
する。当該λ配列は、オコナー(O’Conner)ら
によりBiophys.J 74:A285(199
8)、および突然変異検出97(Mutation D
etection 97)第4回国際ワークショップ、
ヒトゲノム機構(Human Genome Orga
nization)、1997年5月29〜6月2日、
チェコ共和国ブルノ、ポスター第29番でFMC コー
プ(FMC Corp.)により発表された。
PCR条件を下の表に記述する。全部の成分を組み合わ
せ、そしてボルテックス攪拌して良好な混合を確実に
し、そして遠心分離する。アリコートをその後、以下の
表に示されるとおりPCRチューブに分配する:
き、そして温度循環プログラムを開始した。循環プログ
ラムパラメータを下の表に示す。すなわち
を下に示す。すなわち、溶離液A:0.1MTEAA;
溶離液B:0.1MTEAA、25%アセトニトリル;
流速:0.900mL/分;勾配:
11−32110)は、λの位置32061に対応する
位置51にAからCの突然変異を有する。下の図は使用
されたプライマーを列挙する。すなわち
サンプルのアリコートを、MIPCを使用して分析す
る。そのクロマトグラムは約4.8分に単一ピークを示
す。
プルの別のアリコート(10μM)を、pH7の50mM
トリス、20mM酢酸ナトリウム、18mM塩化ナトリウム
中の1μMのビス(2,2’−ビピリジル)クリセンキ
ノンジイミンロジウム(III)と組み合わせる。反応を
11分間攪拌し、その後オリエル(Oriel)水銀/
キセノンアーク灯を用いて365nmで13分間照射す
る。MIPCを使用するこの反応混合物の分析は2本の
ピークを示し、それぞれは処理されないサンプルのピー
クより短い保持時間を有する。この結果は、サンプル中
の一対のミスマッチ存在を示す。
Cによる分析を使用する突然変異の検出 ハイブリダイゼーションされたDNA、DYS271の
209bpの突然変異標準(位置168にAからGの突
然変異をもつ)のアリコートを調製し、そして実施例2
に記述されるとおりMIPCにより分析した。このクロ
マトグラムは約7.5分に単一ピークを示した。
(0.01μg/μL)の10μLのアリコートに、3μL
のトリス−EDTA緩衝液、2μL(500U/μL)の
T4E7酵素を含んで成る混合物を添加した。反応体積
全体は約15μLであった。反応を37℃で65分間イ
ンキュベーションした。反応混合物をその後、25分後
および再度65分後に、実施例2に記述されたとおりM
IPCにより分析した。反応の25分後のMIPCクロ
マトグラム(図3)は、約6.25分に1本のピークを
示し、これは期待される168bpの断片に相当する。
反応の65分後のMIPCクロマトグラム(図4)は、
6.25分の168bpの断片のピークの大きさの増大
を示した。この結果は、当該サンプル中の単一の突然変
異部位の存在を示す。
52℃で実施した。UV検出は260nmでであった。カ
ラムを、実施例2で記述されたとおり、溶媒A(0.1
MTEAA)および溶媒B(0.1MTEAA中25%ア
セトニトリル)を含んで成る勾配で溶出した。
ョンされたDNAサンプルに適用した。そのMIPCク
ロマトグラムは単一ピークを示し、処理されないサンプ
ルの保持時間に匹敵した。この結果は、このサンプルが
突然変異を含有しないことを示す。
れる非特異的切断に対する特異的切断の至適な比のMI
PCの決定 ヘテロ二重鎖DNAサンプルを、反応を60分間進行さ
せることを除き、上の実施例4で記述されたとおり正確
にT4E7で処理する。反応のアリコートを、0、2、
5、7、10、15、20、25、30、40、50お
よび60分後に取り出しそしてMIPCを使用して分析
する。非特異的切断に対する特異的切断によるピークの
比を、標準的コンピュータソフトウェアを使用するクロ
マトグラムのピークの積分により決定する。そのように
決定される最大の比に対応する反応時間を書き留め(not
e)、そしてスクリーニングアッセイでの、もしくはいず
れかの選ばれた目的上のその後のサンプル反応を分析す
るのに使用する。
方、これらの態様は例のみとして提示されたことが理解
されるべきである。以下、本発明の主な特徴または好ま
しい態様を列挙する。 1.(a)二本鎖DNAのサンプルを、二本鎖DNAの
突然変異部位の近傍内に結合する突然変異部位結合試薬
と接触させる段階、ならびに (b)段階(a)の生成物を、該突然変異部位結合試薬
が該突然変異部位に結合したままクロマトグラフィーで
分離かつ検出する段階、 を含んで成る二本鎖DNAのサンプル中の突然変異の存
在を決定するための二本鎖DNAサンプルの分析方法。 2.段階(b)の分離された生成物を標準と比較する段
階をさらに含む前記1の方法。 3.段階(b)が、マッチドイオンポリヌクレオチドク
ロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、もしくは逆相クロマトグ
ラフィーによる分析を含んで成る前記1の方法。 4.段階(b)が、マッチドイオンポリヌクレオチドク
ロマトグラフィーによる分析を含んで成る前記1の方
法。 5.該突然変異部位結合試薬が、該突然変異部位の近傍
内で結合しかつ段階(b)の分析の間結合されたままで
あるタンパク質試薬である前記4の方法。 6.DNAサンプルを、段階(a)の前に対応する野生
型DNAとハイブリダイゼーションさせることを含んで
成る、前記1の方法。 6.該突然変異部位結合試薬が、該突然変異部位の近傍
内で結合するタンパク質試薬である、前記1の方法。 8.該タンパク質試薬が、エンドヌクレアーゼ、制限酵
素、リボヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、リゾルベ
ース、ヘリカーゼ、タリーベースおよびリガーゼから成
る群から選択される、前記7の方法。 9.該前記タンパク質試薬が部位特異的突然変異誘発に
より改変されている、前記7の方法。 10.該突然変異部位結合試薬が、タンパク質試薬であ
る前記1の方法。 11.該タンパク質試薬が、エンドヌクレアーゼ、制限
酵素、リボヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、リゾル
ベース、ヘリカーゼ、クリーベースおよびリガーゼから
成る群から選択される、前記10の方法。 12.酵素が、T4エンドヌクレアーゼ7、T7エンド
ヌクレアーゼ1、S1ヌクレアーゼ、マングマメエンド
ヌクレアーゼ、MutYタンパク質、MutSタンパク
質、MutHタンパク質、MutLタンパク質、クリー
ベースおよびHIFNF1から成る群から選択される、
前記11の方法。 13.該突然変異部位結合試薬が非タンパク質性の化学
試薬である前記1の方法。 14.該化学試薬が前記突然変異の近傍内で結合する前
記13の方法。 15.該化学試薬がDNA挿入剤である前記13の方
法。 16.該化学試薬が有機金属試薬である前記13の方
法。 17.該挿入剤がロジウムもしくはルテニウムを含有す
る前記16の方法。 18.該挿入剤が、ビス(2,2’−ビピリジル)クリ
センキノンジイミンロジウム(III)、ビス(2,2’
−ビピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(II
I)、(2,2’−ビピリジル)ビス(フェナントレン
キノン)ジイミンロジウム(III)、ビス(フェナント
ロリン)ジピリドフェナジンルテニウム(III)、およ
びビス(フェナントロリン)ジピリドフェナジンルテニ
ウム(III)から成る群から選択される前記16の方
法。 19.DNAサンプル中の突然変異の存在を決定するた
めのDNAサンプルのクロマトグラフィーの分析方法で
あって、 (a)該サンプルを、該サンプルの分離された成分を表
わすピークもしくは他の形状を含んで成る第1クロマト
グラムを生じさせるクロマトグラフィーを使用して分離
させ、 (b)該サンプルを、DNAサンプル中の突然変異部位
の近傍内に結合する突然変異部位結合試薬と接触させ、 (c)段階(b)の生成物を、該突然変異部位結合試薬
が該突然変異部位に結合したまま段階(a)のクロマト
グラフィーにより分離させて第二クロマトグラムを生じ
させ、 (d)段階(c)のクロマトグラムを段階(a)のクロ
マトグラムと比較する段階 を含んでなり、ここで、段階(c)のクロマトグラムの
保持時間またはピークもしくは他の形状の数の変化が該
サンプル中の突然変異の存在を示す、 ことを特徴とする分析方法。 20.クロマトグラフィーがマッチドイオンポリヌクレ
オチドクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは逆相ク
ロマトグラフィーから成る群から選択される前記19の
方法。 21.クロマトグラフィーがマッチドイオンポリヌクレ
オチドクロマトグラフィーである前記19の方法。 22.DNAサンプルを野生型DNAとハイブリダイズ
する前記19の方法。 23.突然変異部位結合試薬が酵素である、前記19の
方法。 24.突然変異部位結合試薬が非タンパク質性の化学試
薬である、前記19の方法。 25.酵素が塩基対のミスマッチ部位もしくはその付近
で結合する前記23の方法。 26.酵素が、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、リボヌ
クレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、リゾルベース、ヘリ
カーゼおよびリガーゼから成る群から選択される前記2
3の方法。 27.酵素が、T4エンドヌクレアーゼ7、T7エンド
ヌクレアーゼ1、S1ヌクレアーゼ、マングマメエンド
ヌクレアーゼ、MutYタンパク質、MutSタンパク
質、MutHタンパク質、MutLタンパク質、クリー
ベースおよびHINF1から成る群から選択される前記
23の方法。 28.化学試薬が塩基対のミスマッチ部位もしくはその
付近で結合する前記24の方法。 29.化学試薬が、ロジウムもしくはルテニウムを含有
するDNA挿入剤である前記24の方法。 30.挿入剤が、ビス(2,2’−ビピリジル)クリセ
ンキノンジイミンロジウム(III)、ビス(2,2’−
ビピリジル)クリセンキノンジイミンロジウム(II
I)、(2,2’−ビピリジル)ビス(フェナントレン
キノン)ジイミンロジウム(III)、ビス(フェナント
ロリン)ジピリドフェナジンルテニウム(III)、およ
びビス(フェナントロリン)ジピリドフェナジンルテニ
ウム(III)から成る群から選択される前記29の方
法。 [図面の簡単な説明]
つ突然変異を含有するDNA断片のMIPCクロマトグ
ラムである(上の概観図(profile))。下の概観図は、
酵素との接触2分後のHaeIII酵素に結合された突然
変異を含有するDNA断片のMIPCクロマトグラムで
ある。
ヘテロ二重鎖の産生を示す、ホモ接合の突然変異体鎖と
の野生型DNA鎖のハイブリダイゼーションの図解表示
である。
との25分の反応後のDYS271の209塩基対の突
然変異標準のMIPCクロマトグラムである。
との65分の反応後のDYS271の209塩基対の突
然変異標準のMIPCクロマトグラムである。
Claims (2)
- 【請求項1】 (a)二本鎖DNAのサンプルを、二本
鎖DNAの突然変異部位の近傍内に結合する突然変異部
位結合試薬と接触させる段階、ならびに (b)段階(a)の生成物を、該突然変異部位結合試薬
が該突然変異部位に結合したままクロマトグラフィーで
分離かつ検出する段階、 を含んで成る二本鎖DNAのサンプル中の突然変異の存
在を決定するための二本鎖DNAサンプルの分析方法。 - 【請求項2】 DNAサンプル中の突然変異の存在を決
定するためのDNAサンプルのクロマトグラフィーの分
析方法であって、 (a)該サンプルを、該サンプルの分離された成分を表
わすピークもしくは他の形状を含んで成る第1クロマト
グラムを生じさせるクロマトグラフィーを使用して分離
させ、 (b)該サンプルを、DNAサンプル中の突然変異部位
の近傍内に結合する突然変異部位結合試薬と接触させ、 (c)段階(b)の生成物を、該突然変異部位結合試薬
が該突然変異部位に結合したまま段階(a)のクロマト
グラフィーにより分離させて第二クロマトグラムを生じ
させ、 (d)段階(c)のクロマトグラムを段階(a)のクロ
マトグラムと比較する段階 を含んでなり、ここで、段階(c)のクロマトグラムの
保持時間またはピークもしくは他の形状の数の変化が該
サンプル中の突然変異の存在を示す、 ことを特徴とする分析方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5567697P | 1997-08-18 | 1997-08-18 | |
US60/055,676 | 1997-08-18 | ||
US6241397P | 1997-10-14 | 1997-10-14 | |
US60/062,413 | 1997-10-14 | ||
PCT/US1998/017062 WO1999009203A1 (en) | 1997-08-18 | 1998-08-18 | Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001515217A JP2001515217A (ja) | 2001-09-18 |
JP3345832B2 true JP3345832B2 (ja) | 2002-11-18 |
Family
ID=26734515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000509864A Expired - Fee Related JP3345832B2 (ja) | 1997-08-18 | 1998-08-18 | 突然変異部位に特異的に作用する酵素を使用する突然変異検出のためのクロマトグラフィーの方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1017841A4 (ja) |
JP (1) | JP3345832B2 (ja) |
AU (1) | AU744476B2 (ja) |
CA (1) | CA2298630A1 (ja) |
WO (1) | WO1999009203A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1226275B1 (en) * | 1999-10-12 | 2008-09-10 | TRANSGENOMIC, Inc. | Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by anion-exchange chromatography |
AU2001227679A1 (en) * | 2000-02-25 | 2001-09-03 | General Atomics | Mutant nucleic binding enzymes and use thereof in diagnostic, detection and purification methods |
US6808884B2 (en) | 2000-12-08 | 2004-10-26 | California Institute Of Technology | Methods and compositions for detecting polynucleotide duplex damage and errors |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4395486A (en) * | 1981-08-19 | 1983-07-26 | Medical College Of Ga. Research Inst., Inc. | Method for the direct analysis of sickle cell anemia |
AT398973B (de) * | 1992-11-18 | 1995-02-27 | Bonn Guenther Dr | Verfahren zur trennung von nukleinsäuren |
GB9408344D0 (en) * | 1994-04-27 | 1994-06-15 | St James S University Hospital | Nucleic acid assays |
US5824530A (en) * | 1995-09-01 | 1998-10-20 | Variagenics, Inc. | Overexpression of recombinant bacteriophage T4 endonuclease VII and uses thereof |
-
1998
- 1998-08-18 JP JP2000509864A patent/JP3345832B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-18 AU AU90219/98A patent/AU744476B2/en not_active Ceased
- 1998-08-18 WO PCT/US1998/017062 patent/WO1999009203A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-08-18 CA CA002298630A patent/CA2298630A1/en not_active Abandoned
- 1998-08-18 EP EP98942090A patent/EP1017841A4/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
J.Am.Chem.Soc.,Vol.119(March 1997)p.2921−2925 |
Prec.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.92(January 1995)p.87−91 |
Prec.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93(1996)p.4374−4379 |
TREND IN GENETICS Vol.13,No.2(1997)p.43−46 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU9021998A (en) | 1999-03-08 |
JP2001515217A (ja) | 2001-09-18 |
EP1017841A1 (en) | 2000-07-12 |
EP1017841A4 (en) | 2002-01-09 |
WO1999009203A1 (en) | 1999-02-25 |
AU744476B2 (en) | 2002-02-28 |
CA2298630A1 (en) | 1999-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6027898A (en) | Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes and chemicals | |
JP2622327B2 (ja) | 核酸配列の増幅手段 | |
JP2546576B2 (ja) | 核酸配列のクローニング方法 | |
EP1364046B1 (en) | Methods for genetic analysis of dna to detect sequence variances | |
US6632610B2 (en) | Methods of identification and isolation of polynucleotides containing nucleic acid differences | |
KR102592367B1 (ko) | 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 | |
US20070065816A1 (en) | Methods for genotyping | |
JP7232643B2 (ja) | 腫瘍のディープシークエンシングプロファイリング | |
WO1993022457A1 (en) | Screening for genetic variation | |
JP2018518967A (ja) | ヌクレアーゼを使用する野生型dnaの選択的分解および突然変異体対立遺伝子の濃縮 | |
JPH04506456A (ja) | 突然変異のスペクトルの決定 | |
JP2003510063A (ja) | 古細菌のdnaポリメラーゼによる修飾ヌクレオチドの取り込み及びそれに関する方法 | |
JP2005531314A (ja) | 配列の相違を検出する方法 | |
JPH0467960B2 (ja) | ||
Butz et al. | Brief summary of the most important molecular genetic methods (PCR, qPCR, microarray, next-generation sequencing, etc.) | |
JPH025863A (ja) | 相補的鎖からなる関連する対象および参照高分子の処理方法 | |
JP3345832B2 (ja) | 突然変異部位に特異的に作用する酵素を使用する突然変異検出のためのクロマトグラフィーの方法 | |
US6287822B1 (en) | Mutation detection method | |
EP1030933A1 (en) | Analysis of nicked dna by matched ion polynucleotide chromatography | |
US6455692B1 (en) | Method of concentrating polynucleotides using MIPC | |
WO2000031300A2 (en) | Genotyping by mass spectrometric analysis of short dna fragments | |
RU2193069C2 (ru) | Способ обнаружения мутаций дезоксирибонуклеиновых кислот с помощью рестриктаз и набор для проведения способа | |
JP4650420B2 (ja) | 塩基判定方法及び塩基判定用キット | |
JP2007295838A (ja) | 核酸増幅を利用した核酸ミスマッチ検出方法 | |
US20040038258A1 (en) | Methods for detecting DNA polymorphisms |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080906 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080906 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090906 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100906 Year of fee payment: 8 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |