JP3258089B2 - ウイルス感染症治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス感染症治療剤
に関し、更に詳細には、人間を含む哺乳動物全般に幅広
く感染し、種々の疾患の原因となるヘルペスウイルスの
増殖を阻害することのできるヘルペスウイルス感染症治
療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘルペスウイルスはきわめて病原性が高
く危険なウイルスであることが知られており、このウイ
ルスによって引き起こされる疾病としては、角膜潰瘍、
結膜炎症等の眼科系疾患、各種皮膚炎の他、ヘルペスウ
イルスに脳神経細胞が侵されることに起因する心身障害
等が知られている。

【０００３】現在、ヘルペスウイルスの増殖を阻害する
ヘルペスウイルス感染症治療剤としては、有機合成品で
あるアシクロビルのみが認められており、これが広く利
用されている。

【０００４】しかし、このアシクロビルは、人体に対す
る副作用、毒性が強く、多量に投与すると種々の問題を
引き起こす虞があった。 たとえばアシクロビルが核酸
合成のアンタゴニストであることに起因する催奇形性等
の問題があり、その応用を限りあるものとしている。

【０００５】このような事情から、アシクロビルにとっ
て代わる化合物の開発が求められているにもかかわら
ず、現在までアシクロビルに代わる薬剤が提供されてい
なかった。

【０００６】一方、アシクロビルの使用量を低下せしめ
る方法として、アシクロビルの薬効を増強することので
きる化合物を見出だし、それを相乗剤として使用するこ
とにより、その適用量を極力抑えてアシクロビルの毒性
の問題を解決することも考えられる。

【０００７】しかし、アシクロビルの相乗剤としては特
開平３−１４８２９５号公報に記載の化合物が知られて
いた程度であり、この化合物の作用も優れているとはい
いがたく、安全性が高くかつ強力な効果を有する相乗剤
は見いだされていないのが現状である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、ヘルペスウイ
ルスに対して有効な増殖阻害効果を示し、かつ安全性の
高い化合物の提供や、アシクロビルの使用量を極力減ら
すことのできる手段の開発が強く求められており、課題
として残されていた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの問
題を解決するに当り、まず、毒性の問題を回避するに
は、生体自身が有するか、あるいは食糧として常時摂取
しているものの中に含まれている生理活性物質を利用す
ることが必要であると考えた。

【００１０】そして、この考えに基づき、上記の生理活
性物質について、広くその抗ヘルペスウイルス作用を検
索していたところ、植物中に含まれるシステインプロテ
イナーゼインヒビター（フィトシスタチン）がヘルペス
ウイルスに対して強力な増殖阻害効果を持つこと、およ
びこのものが感染症からの治癒効果を持つことを明らか
にすることに成功し、フィトシスタチンが明確な抗ヘル
ペス剤であると断定するにいたった。

【００１１】また、このフィトシスタチンをアシクロビ
ルと組合せればアシクロビルの使用量を飛躍的に減少せ
しめることができることも見出した。

【００１２】本発明は、上記知見に基づいて完成された
ものであり、その第一の目的は、フィトシスタチンを含
有するヘルペスウイルス感染症治療剤を提供するもので
ある。

【００１３】また、本発明の第二の目的は、フィトシス
タチンと抗ウイルス性アシクロヌクレオシドとを含有す
ることを特徴とするヘルペスウイルス感染症治療剤を提
供するものである。

【００１４】従来、フィトシスタチンの有する生理活性
作用についてはすでにいくつか報告されている。 例え
ば、フィトシスタチンに含まれるオリザシスタチンにつ
いては、これらがピコルナウイルスに属するポリオウイ
ルスの増殖を抑制することが報告されている〔近藤 平
人,阿部 啓子,荒井綜一：蛋白質 核酸 酵素,第３６巻,
２５１９〜２５２４頁（１９９１）および Kondo H.,Ij
iri S.,Abe K.,MaedaH. and Arai S.:FEBS LETTERS 29
9,48-50(1992)〕。

【００１５】しかし、ウイルスの組織特異性や宿主特異
性から見て、このものが他の構造の異なる種のウイル
ス、例えばヘルペスウイルスに対し作用するかどうかは
全く予測すらできないものであった。

【００１６】本発明において有効成分として用いられる
フィトシスタチンは、イネ、オオムギ、コムギ、ジャガ
イモあるいはトウモロコシなどの栽培植物に由来するも
のであっても良く、また近年報告されているバラ科植物
等の観賞植物に含まれているものであっても良い。

【００１７】上記フィトシスタチン中でも、稲 [Oryza
sativa L. japonica] 種子に由来するオリザシスタチン
は、植物中に初めて見いだされたシステインプロテイナ
ーゼインヒビター（シスタチン）として知られるもので
ある。 このオリザシスタチンは、それまで知られてい
た動物由来のシスタチンとは異なる性質を示し、これま
でに２種類の存在が報告されており、それぞれオリザシ
スタチン−Ｉ〔Abe,K.,Emori,Y., Kondo,H., Suzuki,K.
and Arai,S., J.Biol.Chem.,262, 16793-16797(198
7)〕、オリザシスタチン−ＩＩ〔Kondo H., Abe,K., Ni
shimura,I., Watanabe,H., Emori,Y. and Soichi, A.,
J.Biol.Chem.,265,15832-15837(1990)〕と命名されてお
り、この何れを利用しても良い。

【００１８】また、その他の栽培植物であるジャガイ
モ、コムギ、オオムギあるいはトウモロコシといったも
のにもシスタチンが存在することが報告されており、こ
れらを利用しても良い。 なお、これらはその一次構
造、遺伝子構造などから、オリザシスタチンの類似性が
報告され、オリザシスタチンを中心とする「フィトシス
タチン・ファミリー(phytocystatin family)」とされて
いる。

【００１９】更に、最近報告された他の植物シスタチ
ン、例えばバラ科のフジの花の種子に存在が報告された
シスタチン〔Hirashiki,I., Ogata,F., Yoshida,N., Ma
kisumi,S., Ito,A.:J.Biochem., 108,604-608 (1990)〕
中には、部分配列ながらオリザシスタチン−Ｉと非常に
よく似ているものの存在が報告されているので、これら
のものをフィトシスタチンとして利用しても良い。

【００２０】本発明のヘルペスウイルス感染症治療剤に
配合されるフィトシスタチンは、上記の各植物の植物体
中から抽出したものであっても、また、上記各植物の遺
伝子を利用し、遺伝子工学的手法により製造したもので
あってもよい。

【００２１】例えば、米の種子に含まれる前記の２つの
オリザシスタチンは、パパイン(papain)、カテプシン
（cathepsin)などのシステインプロテイナーゼの活性を
強く阻害するタンパク質性のシステインプロテイナーゼ
インヒビターであることが知られており、更に、オリザ
シスタチン−ＩのＮ末端のメチオニンよりＣ末端のアラ
ニンまでの合計１０２残基のアミノ酸配列やオリザシス
タチン−ＩＩのＮ末端のメチオニンよりＣ末端のアラニ
ンまでの１０７残基のアミノ酸配列が知られているので
遺伝子工学的手法によりこれらを調製することは容易で
ある。

【００２２】具体的に、オリザシスタチンの調製法を示
せば次の通りである。 なお、他の植物からのフィトシ
スタチンもこれに準じて得ることができる。

【００２３】すなわち、オリザシスタチンは、阿部らの
方法〔Abe,K., Kondo,H. and Arai,S., Agric.Biol.Che
m., 51, 2763-2768 (1987)〕に従い、稲完熟種子より抽
出するか、または、サムブルークら（Sambrook et a
l.）のモレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）第２版（Cold Spring Harbor, 1989）に記載の方法
を用い、阿部らの方法〔Abe,K.,Emori,Y., Kondo,H., S
uzuki,K. and Arai,S.,J.Biol.Chem.,262, 16793-16797
(1987)〕および近藤らの方法〔Kondo H., Abe,K., Nis
himura,I., Watanab,H., Emori,Y. and Soichi, A., J.
Biol.Chem.,265,15832-15837 (1990) 〕に従って、公知
のオリザシスタチンをコードする遺伝子を用いる遺伝子
工学的手法により大腸菌内で発現させて取得することが
できる。

【００２４】遺伝子工学的手法によるオリザシスタチン
の収量は抽出法の収量の約１０万倍であるので、遺伝子
工学的手法により得たものを利用することがより好適で
ある。 また、このフィトシスタチンは、完全精製品に
限らず、粗精製品や部分精製品であってもよい。

【００２５】本発明のヘルペスウイルス感染症治療剤の
調製は、上記の様にして得られたフィトシスタチンを有
効成分とし、これに適当な担体を用いて公知方法により
製剤化することによりおこなわれる。

【００２６】このヘルペスウイルス感染症治療剤は、外
用剤、経口投与剤あるいは注射剤として用いることがで
きる。このうち、外用剤としては、必要に応じて、外用
液剤、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、点眼
剤、座剤、パップ剤、擦剤、噴霧剤、エアゾール剤また
は外用粉剤などの剤型とすることができる。

【００２７】一方、経口投与剤とする場合は、必要に応
じて、粉剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、液剤（水またはシロ
ップ溶液）などの形態とすることができる。これらの各
製剤は常法により調製することができ、所望されるかま
たは必要とされる場合には香味剤、防腐剤、沈澱防止
剤、濃厚化剤または乳化剤を含むことができる。

【００２８】また、注射剤とする場合は、液状担体とし
て一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシ
トール、マンニトール等の糖類溶液などを用いることが
望ましく、更に、イノシトール、マンニトール、グルコ
ース、マンノース、シュクロース等の糖類、フェニルア
ラニン等のアミノ酸類の賦形剤とともに凍結乾燥し、そ
れを使用時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理
食塩水、ブドウ糖液、電解質溶液、アミノ酸溶液等に溶
解、投与する凍結乾燥製剤とすることもできる。

【００２９】本発明のヘルペスウイルス感染症治療剤中
のフィトシスタチン含量は、特に制約はないが、完全精
製品として、外用剤中に０.０００１％〜５％程度、注
射剤中には０.００００１％〜５％程度用いるのが好ま
しく、経口投与剤としては、１０ｍｇ〜１０ｇを１日量
として用いるのが好ましい。

【００３０】本発明のフィトシスタチンはまた、治療上
核酸合成の阻害作用を有する抗ウイルス性アシクロヌク
レオシド、例えばアシクロビル、ガンシクロビル等と併
用することにより、それらの作用を相乗的かつ飛躍的に
高めることができる。

【００３１】例えばアシクロビルの抗ヘルペスウイルス
効果は、フィトシスタチンとの併用により少なくとも１
０倍以上に高まるので、副作用のためにアシクロビルの
適用量が限られるという問題点を本発明のフィトシスタ
チンとの併用により解決することができる。

【００３２】本発明の、フィトシスタチンと抗ウイルス
性アシクロヌクレオシドを組み合わせることを特徴とす
るヘルペスウイルス感染症治療剤は、外用、内服用およ
び注射用のいずれにしても、上記の種々の剤型で投与で
きる。

【００３３】フィトシスタチンが完全精製品であるとし
て、外用剤あるいは注射剤中のフィトシスタチンとアシ
クロヌクレオシドの２種混合物の含有量は、０.０００
１％〜５％程度が好ましく、該２種混合物の内服量は、
１日量として１０ｍｇ〜１０ｇを用いるのが好ましい。
また、アシクロヌクレオシドとフィトシスタチン（完
全精製品）の混合割合は、重量比で１：１〜１：１００
０までの範囲で配合するのが適当である。

【００３４】本発明のヘルペスウイルス感染症治療剤の
好ましい具体例として、点眼剤を挙げることができる。
この点眼剤においては、フィトシスタチン（完全精製
品）を精製水中あるいは生理食塩水中０.０００１％〜
５％程度含有させることが好ましく、必要により抗酸化
剤、緩衝剤等の任意成分を適宜含有させることもでき
る。

【００３５】叙上の如くして得られる、本発明のヘルペ
スウイルス感染症治療剤は、ヘルペスウイルスによって
引き起こされる人や動物の目の角膜潰瘍、結膜炎症、皮
膚炎や、ヘルペスウイルスによって脳神経細胞が侵され
ることに起因する心身障害の治療剤、あるいは予防剤と
して使用される。

【００３６】また、フィトシスタチンとアシクロビルを
組み合わせたヘルペスウイルス感染症治療剤は、アシク
ロビルの有する抗ウイルス効果を相乗的に高めるので、
アシクロビルの使用量を減らすことができ、安全性の高
いヘルペスウイルス感染症治療剤とすることが可能とな
る。

【００３７】

【実施例】次に実施例および参考製造例をあげ、本発明
を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等になんら
制約されるものではない。

【００３８】製 造 参 考 例 オ リ ザ シ ス タ チ ン の 製 造 例 ： （１）コメ種子全ＲＮＡの抽出 稲種子から全ＲＮＡを抽出するには、日本型栽培稲の開
花後２週目の登熟期にあたる種子を用いて行なうことが
できる。まず、登熟途中の種子３ｇをコーヒー豆粉砕機
を用いて粉状に粉砕し、これに飽和フェノール溶液１５
ｍｌを加えて攪拌し、１００ｍＭトリスヒドロキシアミ
ノメタン塩酸緩衝液（ｐＨ８.０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１
％ラウリル硫酸ナトリウムを含む）を１５ｍｌ加え、粉
砕し、激 しく上下に１０分間振とうした後、遠心（４,
０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ.、４℃）し、水層を得る。

【００３９】次いで、その水層に対してフェノール溶液
１５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離を３回繰り返した後
に得られた水層に対して４５ｍｌのエタノールを添加
し、再度遠心した後、沈澱画分を凍結乾燥し、約３ｍｇ
の稲種子全ＲＮＡを得た。

【００４０】（２）稲種子のｃＤＮＡライブラリーの調
製 上記全ＲＮＡからのｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡライブラ
リーの作製は公知の方法によって行なうことができる。
そのような方法は、例えば、サムブルークら（Sambroo
k et al.）のモレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）第２版（Cold Spring Harbor, 1989）に記載
されている。

【００４１】具体的には、（１）で得られた全ＲＮＡよ
りポリＡ ＲＮＡを分画し、これを鋳型としてｃＤＮＡ
を合成し、クローニング用のファージベクター、例えば
λｇｔ １０に組み込み、大腸菌、例えばＣ６００Ｈｆ
１株を宿主としてこれを形質転換する。 これをχ−ブ
ロスの寒天培地（純水１ｌにトリペプトン２５ｇ、酵母
エキス１０ｇ、グルコース１ｇ、硫酸マグネシウム４.
９ｇ、塩化ナトリウム２.５ｇを溶かし、ｐＨ７.５に調
整し、寒天を３％添加したもの）上で培養することによ
り約１２万個の独立なプラークよりなる稲種子のｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することができる。

【００４２】（３）オリザシスタチンのｃＤＮＡのスク
リーニング プラークの大きさが直径２ｍｍとなった時点で寒天培地
上にナイロンメンブレンフィルターをのせ、３分後にこ
れをはがし、アルカリ変性溶液（０.５ＭのＮａＯＨ溶
液に１.５ＭのＮａＣｌを含むもの）に５分間浸した
後、風乾した。次に、中和溶液（１.５Ｍのトリス塩酸
緩衝液、１.５ＭのＮａＣｌを含むもの）に２０分間浸
し中和した。 これを２ＸＳＳＣ溶液（１ｌの水に１７.
５ｇのＮａＣｌと８.８ｇのクエン酸ナトリウムを含む
もの）に浸した後、十分に風乾し、更に８０℃で６０分
間加熱処理し、ＵＶランプで１０分間照射することによ
りＤＮＡをナイロンフィルターに固定する。

【００４３】オリザシスタチンをコードするｃＤＮＡを
スクリーニングするために用いるプローブは、オリザシ
スタチン−Ｉについては既に公知となっているオリザシ
スタチン−Ｉ遺伝子の塩基配列（Abe,K.,Emori,Y.,Kond
o,H.,Suzuki,K. and Arai,S., J.Biol.Chem.,262,16793
-16797 (1987) ）をもとに２０マー程度の長さのオリ
ゴヌクレオチドプローブ、 例えば、５'−ＡＡＧＣＴＣ
ＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧ−３'を合成
し、用いることができる。 オリザシスタチン−ＩＩに
ついても同様に既に公知となっている遺伝子の塩基配列
（Kondo,H.,Abe,K.,Nishimura,I.,Emori,Y., and Ara
i,S., J.Biol.Chem., 265, 15832 - 15837 (1990) ）を
もとに約２０マー程度のオリゴヌクレオチドプローブ、
例えば、５'−ＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣ
ＧＧＧＴＴＣ−３'を合成し用いることができる。

【００４４】ナイロンフィルターに固定された稲種子の
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、これらのオ
リゴヌクレオチドプローブを用い、例えば、サムブルー
クら（Sambrook et al.）のモレキュラー・クローニン
グ（Molecular Cloning）第２版（Cold Spring Harbor,
1989）に記載されている方法に基づいて行なうことが
できる。 具体的には、放射性同位元素化合物γ−³²Ｐ
−デオキシＣＴＰを用いてオリゴヌクレオチドプローブ
を標識し、４２℃の温度でハイブリダイゼーションを行
い、オートラジオグラフィーによって検出される陽性シ
グナルをプレート上のプラークと照合する。

【００４５】陽性シグナルに対応するプレート上のソフ
トアガロースをＳＭ溶液（０.１ＭのＮａＣｌ、８.１ｍ
Ｍの硫酸マグネシウム）５μｌに懸濁し、クロロホルム
を一滴加え、溶解することにより、オリザシスタチン−
ＩをコードするｃＤＮＡインサートを含むファージクロ
ーンを得ることができる。 オリザシスタチン−ＩＩに
ついても同様にファージクローンを得ることができる。

【００４６】得られたファージクローンを適当な制限酵
素、例えばＥｃｏＲＩで消化し、その消化断片をクロー
ニング用のプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１８など
にサブクローニングして、既に公知となっているものと
同様のオリザシスタチン−Ｉ、およびオリザシスタチン
−ＩＩの最長をコードするプラスミドを得ることができ
る。

【００４７】（４）発現プラスミドの調製 オリザシスタチン−Ｉおよびオリザシスタチン−ＩＩを
大腸菌内で発現させるための発現プラスミドの構築もサ
ムブルークら（Sambrook et al.）のモレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）第２版（Cold Spring
Harbor, 1989）に記載されている方法にしたがって行
なうことができる。

【００４８】具体的には、発現ベクタ−として既に公知
となっているｐＫＫ ２３３−２プラスミドを用い、こ
のマルチクローニングサイトの制限酵素切断点であるＮ
ｃｏＩとＰｓｔＩに上記（３）で得たｐＵＣ１８プラス
ミドベクターにクローニングされたオリザシスタチン−
Ｉおよびオリザシスタチン−ＩＩをコードする遺伝子を
挿入することにより行う。

【００４９】その挿入方法は次の通りである。 すなわ
ち、オリザシスタチン−Ｉの場合、そのアミノ酸配列の
開始メチオニンの位置に相当する塩基配列に制限酵素Ｎ
ｃｏＩサイトを挿入することにより始める。 ＮｃｏＩ
サイトの構築方法はサムブルークら（Sambrook et a
l.）のモレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）第２版（Cold Spring Harbor, 1989）に記載されて
いる部位指定変異法により行なうことができる。 この
場合、用いる合成オリゴヌクレオチドプローブは５'−
ＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣ−３'を使用することによ
り、容易に塩基配列をＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＧＣか
らＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣと変えることができ、
ＣＣＡＴＧＧというＮｃｏＩ制限酵素サイトを構築する
ことができる。

【００５０】そして、ｐＵＣ１８プラスミドベクター
に、クローニングされたオリザシスタチン−Ｉをコード
する塩基配列をＮｃｏＩとＰｓｔＩサイトで消化するこ
とにより得られる断片をｐＫＫ２３３−２プラスミドの
ＮｃｏＩとＰｓｔＩサイトに挿入することによりオリザ
シスタチン−Ｉの発現プラスミドを完成させることがで
きる。

【００５１】この発現プラスミドを用いることにより、
天然の稲に存在するものと同じ１０２残基のアミノ酸よ
りなるオリザシスタチン−Ｉを大腸菌内で生産させるこ
とができる。オリザシスタチン−ＩＩに関しても同様に
行なうことができる。 この場合、合成オリゴヌクレオ
チドプローブとして５'−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧ
ＧＡ−３'を用いることにより、容易にＧＧＣＧＡＴＧ
ＧＣＣＧＡＧＧＡの塩基配列をＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧ
ＡＧＧＡと変えることができる。 この発現プラスミド
を用いることにより、天然の稲に存在するものと同じ１
０７残基のアミノ酸よりなるオリザシスタチン−ＩＩを
大腸菌内で生産させることができる。

【００５２】（５）大腸菌内での生産のための形質転換
大腸菌株の調製 大腸菌、例えばＹＡ２１株を３０ｍｌのＳＯＢ液体培地
（１ｌの水あたり、２０ｇのバクトトリプトン、１０ｇ
の酵母エキス、０.６ｇのＮａＣｌ、０.２ｇのＫＣｌを
含む）中、３７℃で、４時間培養し、５５０ｎｍで測定
した吸光度が約０.４程度の菌濁度となるように大腸菌
の菌体液を調製する。 この菌体液を遠心し、得られた
菌体を１０ｍＭの硫酸マグネシウム水溶液に懸濁し、４
℃にて１５分間静置する。 再び遠心後、菌体を２ｍｌ
の５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液に懸濁し、４℃で１０
分間静置する。

【００５３】この菌濁液２１０μｌに（４）で調製した
オリザシスタチン−Ｉあるいはオリザシスタチン−ＩＩ
のそれぞれのインサートを含む発現プラスミドを添加
し、４℃で３０分間静置することにより大腸菌を形質転
換させる。 つづいて、４２℃で８０秒間熱処理し、再
び４℃にて２分間静置した後、ＳＯＣ（ＳＯＢに１０ｍ
Ｍのグルコースを含む）を８００μｌ加え、３７℃にて
１時間振とう培養し、形質転換菌を１.５％寒天を含む
χ−ブロス寒天培地上、３７℃で、１８時間培養してコ
ロニーを得る。

【００５４】（６）大腸菌内で生産するための培養方法 上記（５）でコロニーとして得られたオリザシスタチン
−Ｉあるいはオリザシスタチン−ＩＩのそれぞれの形質
転換菌を８００ｍｌのχ−ブロス液体培地中、３７℃で
８時間培養する。 続いて、この菌体懸濁培養液を４０
ｌの発現用培地（水１ｌあたり、２５ｇのポリペプト
ン、１０ｇの酵母エキス、４.９ｇの硫酸マグネシウ
ム、１５.２ｇのリン酸水素ナトリウム１２水和物、１.
２ｇのリン酸二水素カリウム、１ｇの塩化アンモニウ
ム、０.７５ｇの塩化ナトリウム、０.０８３５ｇの塩化
マグネシウム６水和物、０.１１５ｇの硫酸ナトリウ
ム、０.４ｍｌのシリコンＫＭ７２を含む）に添加し、
３７℃で１８時間培養する。 この際、密閉された５０
リットルジャーを用いる。 また、培養終了４時間前に
ＩＰＴＧ（イソプロピルガラクトピラノシド）を最終容
量１ｍＭとなるように添加する。

【００５５】（７）菌体内に生産されたオリザシスタチ
ンの抽出方法 上記（６）で得られた菌体培養液を、連続遠心（４℃、
８,０００ｒｐｍ、約５時間）することにより菌体を回
収する。 この様にして４０リットルの培養液から約６
００ｇ湿重量の菌体を得る。

【００５６】この６００ｇ湿重量の菌体を４リットルの
菌抽出液（トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７.８）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、３ｍＭメルカプトエタノールを含む）中に懸
濁し、ガラスビーズを充填させたダイノミルにて菌体を
破砕し、菌体内生産物を抽出する。 オリザシスタチン
−Ｉとオリザシスタチン−ＩＩは水溶性タンパク質であ
るため容易に抽出液中に溶解させることができる。

【００５７】（８）オリザシスタチンの精製方法 上記（７）で得られたオリザシスタチン抽出液を８０℃
で１０分間熱処理し、遠心（７,０００ｒｐｍ、１０分
間、４℃）後、オリザシスタチン画分を含んだ上清液を
得る。 この上清液に対して３％のポリエチレンイミン
水溶液を５容量％添加し、室温にて１０分間攪拌後、遠
心（８,０００ｒｐｍ、１０分間,４℃）することにより
不要な核酸を除く。

【００５８】このオリザシスタチンを含む上清液に対し
て、２５％から７５％の濃度にて硫酸アンモニウム分画
を行い、オリザシスタチンを含む最終沈澱画分を８００
ｍｌのＤＥＡＥ用緩衝液（２５ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ
７.５）、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭメルカプトエタノー
ルを含む）に溶かす。

【００５９】（９）カラムクロマトグラフィーによる精
製法 上記（８）のＤＥＡＥ用緩衝液で平衡化した、ＤＥＡＥ
セルロースカラム（７φ×５０ｃｍ）に（８）で得られ
たオリザシスタチン抽出液を供する。 オリザシスタチ
ンの溶出は０Ｍから０.６ＭのＮａＣｌを用いたリニア
ーグラディエントにより行なう。

【００６０】オリザシスタチン−Ｉおよびオリザシスタ
チン−ＩＩは、ともに０.２Ｍの塩濃度にて溶出される
画分に含まれている。 続いて、このオリザシスタチン
溶液を集め、最終濃度３０％となるように硫酸アンモニ
ウムを加える。 疎水クロマト用緩衝液（２５ｍＭトリ
スー塩酸（ｐＨ７.５）、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭメル
カプトエタノール、３０％硫酸アンモニウムを含む）に
て平衡化したブチルトヨパール ６５０Ｍカラム（５φ
×３０ｃｍ）に３０％硫酸アンモニウムを加えたオリザ
シスタチン溶液を供する。 溶出は３０％から０％の硫
酸アンモニウム濃度のリニアーグラディエントにて行な
う。 オリザシスタチン−Ｉおよびオリザシスタチン−
ＩＩともに１７％の硫酸アンモニウム濃度にて溶出され
る画分に含まれている。

【００６１】このオリザシスタチン画分をＱＡＥ用緩衝
液（２５ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８.２）、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む）に対して透析し、この緩衝液にて平衡化し
たＱＡＥセルロースカラム（５φ×４０ｃｍ）に供す
る。 溶出は０Ｍから０.６ＭのＮａＣｌによるリニアー
グラディエントにより行なう。 オリザシスタチン−Ｉ
およびオリザシスタチン−ＩＩともに０.４Ｍの塩濃度
にて溶出される画分に含まれている。 この様にして本
発明に用いたオリザシスタチン−Ｉあるいはオリザシス
タチン−ＩＩの精製品を４０リットル培養、すなわち菌
体湿重量６００ｇあたり、それぞれ約４ｇずつ得ること
ができる。

【００６２】実 施 例 １ インビトロの系においてヘルペスウイルスの増殖に及ぼ
すオリザシスタチンの影響：サルの腎臓上皮細胞を９６
穴のマイクロテストプレート（ヌンク社製）の穴中で、
１０％牛胎児血清（FCS）を添加したイーグルＭＥＭ培
地中で培養した。 単相の状態に広がるまで培養し、こ
の細胞に対してヘルペスシンプレックスウイルスのタイ
プ１（Helpes simplex virus type-1, HSV-1）福田株
のウイルス液を感染率（m.o.i）として０.１、ウイルス
量として一つの培養穴当り２×１０³個プラーク形成単
位となるようにして接種した。 感染条件は３７℃の温
度において６０分間の培養によりおこなった。 その
後、１０μＭの濃度でオリザシスタチンＩを含む培地
中、３７℃で２４時間培養した。

【００６３】対照区として、オリザシスタチンＩに代
え、オボインヒビター、Ｅ−６４、大豆種子トリプシン
インヒビター、オボマクログロブリン、ロイペプチン、
ペプスタチンＡ、アンチパインを各濃度で含む培地で培
養したものを用いた。 また、同じく対照区として、ウ
イルス感染後の細胞を阻害剤を添加しない培地で培養し
たものを用いた。 培養終了後、細胞を凍結し、その後
融解し増殖したウイルスを放出させ、別の細胞に対する
感染値を測定することによりウイルス量（プラーク形成
単位）を定量し、オリザシスタチンの抗ウイルス効果を
検討した。 その結果を第１表に示す。

【００６４】

【００６５】この結果から明らかなように、ヘルペスウ
イルスは培地濃度１０μＭの濃度のオリザシスタチン−
Ｉによって８５％阻害される。このように、オリザシス
タチン−Ｉの場合、対照区として用いた他の生理活性物
質に比較して、かなり強いウイルス増殖阻害効果を持つ
ことは明白である。

【００６６】実 施 例 ２ オリザシスタチンの各種濃度におけるヘルペスシンプレ
ックスウイルス−タイプ１増殖抑制効果：実施例１と同
様の培養条件にてサル腎臓上皮細胞を９６穴の組織培養
プレート内にて単相の細胞状態になるまで培養し、ヘル
ペスシンプレックスウイルスータイプ１のウイルス液を
感染率０.１（m.o.i＝0.1）で接種することにより細胞
に感染させ、ウイルス液を除去した後、５、１０、２
０、４０μＭの各種濃度でオリザシスタチンＩを含有す
る培地中で２４時間培養する。 その後、細胞を凍結さ
せ、続いて融解し、細胞内で増殖した娘ウイルスを放出
させ、娘ウイルスの新たな細胞に対する感染価をプラー
ク形成能を測定することによりウイルス量を定量した。
その結果を第２表に示す。

【００６７】

【００６８】第２表より、ウイルスを感染させた場合、
培地１ｍｌ当りのウイルスによるプラーク形成数が１.
５×１０⁶個である場合において、培地中のオリザシス
タチン−Ｉの濃度が５μＭの場合では５.３×１０⁵個、
１０μＭでは２.１×１０⁵個、２０μＭでは９.４×１
０⁴個、４０μＭでは５.７×１０³個となり著しい増殖
阻害効果を示した。

【００６９】この結果から、オリザシスタチン−Ｉは培
地中濃度５μＭの低濃度で顕著なヘルペスウイルス増殖
阻害効果を示すことが明かとなった。

【００７０】実 施 例 ３ インビトロ（in vitro）の系に於けるヘルペスウイルス
の増殖に対するオリザシスタチンとアシクロビルの相乗
抑制効果：実施例１と同様に、サル腎臓上皮細胞を単相
状態になるまで培養し、その細胞に対してヘルペスシン
プレックスウイルスータイプ１（福田株）のウイルス液
を感染率（m.o.i.）０.１にて接種し、３７℃で６０分
間充分に感染吸着させた後、ウイルス液を洗浄により除
去し、１０μＭの濃度のオリザシスタチン−Ｉ、および
０.１４μＭの濃度のアシクロビルを同時に添加し、２
４時間、４８時間、６０時間培養後のウイルス量をプラ
ーク形成能により算定する。 その結果を第３表に示
す。

【００７１】

【００７２】この結果より明らかなように、阻害剤を加
えない対照区においては、２４時間接種した場合のウイ
ルスによるプラーク形成能が、培地１ｍｌあたりのプラ
ーク形成数を単位として５.５×１０⁵個であったが、１
０μＭのオリザシスタチン−Ｉを含む培地ではこれが
８.２×１０⁴個となり、０.１４μＭのアシクロビルを
含む培地では４.２×１０⁴個となる。 そして、１０μ
Ｍのオリザシスタチン−Ｉと０.１４μＭのアシクロビ
ルを共に含む培地では９.２×１０²個と著しい増殖阻害
効果の相乗効果が観察された。 この効果は、４８時間
または６０時間ウイルスを接種し感染した場合のウイル
スによるプラーク形成能を測定した場合に於いても観察
される。よって、ヘルペスウイルスに対してオリザシス
タチンとアシクロビルを同時に処方すると、この増殖阻
害効果が相乗されることは明白である。

【００７３】実 施 例 ４ 脳炎マウスを用いたインビボの系におけるオリザシスタ
チンのヘルペスシンプレックスウイルスータイプ１感染
症治癒効果：脳炎マウス（ｄｄｙ種、オス）の目表面の
角膜を２６番ゲージの針にて擦過する。 その後、ヘル
ペスシンプレックスウイルスータイプ１のウイルス液を
一つの目あたり５×１０⁴プラーク形成単位である力価
にて点眼接種し、ウイルス接種後０日目より７日目まで
１日に１回、０.６ナノモルのオリザシスタチンを点眼
処方し、または、０.５マイクロモルのアシクロビルを
静脈注射することで処方した。そして、ウイルス接種後
２０日目までのマウスの生死を観察し生存率を算定し
た。 その結果を図１に示す。

【００７４】図１により明らかなように、ウイルス感染
後、阻害剤を点眼しない場合には、ウイルス感染後９日
目にて全てのマウスがウイルス感染症により死亡した
が、アシクロビルまたはオリザシスタチンを処方したも
のは、２０日目において、アシクロビルの場合生存率５
０％、オリザシスタチンの場合２０％の生存率があるこ
とが観察される。

【００７５】また、阻害剤を点眼しない場合、ウイルス
感染後、７日目で急に生存率が３８％となり急に減少す
るが、阻害剤を処方する場合には致死までの日数の増
加、すなわち顕著な延命効果が、アシクロビルの場合は
７日目では１００％の生存率、オリザシスタチンの場合
は７日目で７５％の生存率となったように、顕著な効果
が観察される。

【００７６】実 施 例 ５ ウイルス感染症治療剤（錠剤）：オリザシスタチンＩ
（またはＩＩ）３０重量部、結晶乳糖 １２０部、結晶
セルロース １４７部およびステアリン酸マグネシウウ
ム ３部をＶ型混合機で打錠し、１錠３００ｍｇの錠剤
を得た。

【００７７】実 施 例 ６ 軟 膏 剤 ： オリザシスタチンＩ（またはＩＩ） １.０ ｇ 白色ワセリン ２５.０ ｇ ステアリルアルコール ２０.０ ｇ プロピレングリコール １２.０ ｇ ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ４.０ ｇ モノステアリン酸グリセリン １.０ ｇ パラオキシ安息香酸メチル ０.１ ｇ パラオキシ安息香酸プロピル ０.１ ｇ 精 製 水 全 量 １００ ｇ

【００７８】実 施 例 ７ ローション剤 ： オリザシスタチンＩ（またはＩＩ） １.０ ｇ サラシミツロウ ０.１ ｇ セチルアルコール １.５ ｇ ラウリル硫酸ナトリウム ０.５ ｇ グリセリン ５.０ｍｌ 精 製 水 全 量 １００ｍｌ

【００７９】実 施 例 ８ ウイルス感染症治療用点眼剤： 精製オリザシスタチンＩ（またはＩＩ） １００ｍｇ イプシロン−アミノカプロン酸 ２ ｇ アミノエチルスルホン酸 １００ｍｇ マレイン酸クロルフェニラミン ３０ｍｇ 精 製 水 全量 １００ｍｌ

【００８０】実 施 例 ９ ウイルス感染症治療用目軟膏剤： オリザシスタチンＩ（またはＩＩ） ３.０ ｇ アシクロビル ０.３ ｇ 眼科用白色ワセリン ２５ ｇ ステアリルアルコール ２２ ｇ ラウリル硫酸ナトリウム １.５ ｇ パラオキシ安息香酸エチル ０.０２５ ｇ （またはパラオキシ安息香酸メチル） パラオキシ安息香酸プロピル ０.０１５ ｇ 精 製 水 全 量 １００ ｇ

【００８１】実 施 例 １０ 点 眼 剤 オリザシスタチンＩ（またはＩＩ） １０ｍｇ グリチルリチン酸ジカリウム ２５０ｍｇ アミノエチルスルホン酸 １０００ｍｇ マレイン酸クロルフェニラミン ３０ｍｇ 塩酸テトラヒドロゾリン ２５ｍｇ コンドロイチン硫酸ナトリウム ５００ｍｇ 精 製 水 全 量 １００ｍｌ

【００８２】実 施 例 １１ 注 射 剤 オリザシスタチンＩ（またはＩＩ）３重量部に精製水を
加え、全量を２０００部としてこれを溶解させる。溶解
後、ミリポアフィルターＧＳタイプを用いて除菌濾過す
る。この濾液２ｇを１０ｍｌ容のバイアル瓶にとり、凍
結乾燥して１バイアルあたりオリザシスタチンＩ ３ｍ
ｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。

【００８３】

【発明の効果】本発明のヘルペスウイルス感染症治療剤
は、植物中に存在するシステインプロテイナーゼインヒ
ビターであるフィトシスタチンの細胞中でのヘルペスウ
イルスの増殖を阻害する作用によるものであるが、フィ
トシスタチンは細胞あるいは生体に対して毒性が極めて
低いため、安全なヘルペスウイルス感染症治療剤として
利用することできるものである。

【００８４】また、従来技術として抗ヘルペス剤として
使用されてきたアシクロビルとの併用により、アシクロ
ビルの有するヘルペスウイルス阻害効果を相乗的に増加
させることも明白となった。

【００８５】従って、本発明のヘルペスウイルス感染症
治療剤は、各種ヘルペスウイルス感染症の治療や、発症
予防に利用することができ、また、健康人へのヘルペス
ウイルス初期感染症の阻止を目的とする長期投与も可能
となる。更に、ヘルペスウイルスによる感染が問題とな
っている植物に対し、ウイルス感染病を予防する薬剤と
しての利用も期待できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスの角膜に感染したヘルペスシンプレック
スウイルスータイプ１による脳炎症に対するオリザシス
タチン−Ｉおよびアシクロビルの治癒効果を示す図面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ａ６１Ｋ 38/55 Ａ６１Ｋ 37/64 31:52） 31:52） (56)参考文献 特開 昭61−176527（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−148295（ＪＰ，Ａ) 近藤 平人 ら，オリザシスタチン− 構造と機能の解明された初めての植物シ スタチン−，蛋白質核酸酵素，1991，36 （15），ｐｐ．2519−2524 ＭＡＴＳＵＹＡＭＡ，Ｔ．，ｅｔ ａ ｌ．，ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＣＹＳＴ ＥＩＮＥ ＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ ＩＮ ＨＩＢＩＴＯＲ ＯＮ ＲＥＰＬＩＣＡ ＴＩＯＮ ＯＦ ＨＥＲＰＥＳ ＳＩＭ ＰＬＥＸ ＶＩＲＵＳ，Ｊ．ＩＮＶＥＳ Ｔ．ＤＥＲＭＡＴＯＬ．，Ａｐｒｉｌ 1992，98（４），ｐ．659（ＡＢＳＴＲ ＡＣＴ Ｎｏ．648) ＢＪＯＲＣＫ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．, Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ，ａ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉ ｔｏｒ，Ｂｌｏｃｋｓ Ｒｅｐｌｉｃａ ｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍ ｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ．，1990，64（２），ｐｐ．941−943 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 A61K 9/00 - 9/08 A61K 31/00 - 31/529 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オリザシスタチンとアシクビルとを含有
   することを特徴とするヘルペスウイルス感染症治療剤。
2. 【請求項２】 外用剤である請求項第１項記載のヘルペ
   スウイルス感染症治療剤。
3. 【請求項３】 点眼剤である請求項第１項ないし第２項
   の何れかの項記載のヘルペスウイルス感染症治療剤。