JP3245398B2

JP3245398B2 - ネオスポラのジヒドロフォレートレダクターゼ−チミジレートシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチド分子

Info

Publication number: JP3245398B2
Application number: JP34500498A
Authority: JP
Inventors: バラクリシュナン・ラジェンドラ・クリシュナン; ベッキー・アン・ダーッチ; スーザン・クリスチーン・ヨーダー
Original assignee: ファイザー・プロダクツ・インク
Priority date: 1997-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2002-01-15
Anticipated expiration: 2018-12-04
Also published as: CN1225945A; BR9805135A; AU738142B2; AU9520598A; JPH11266879A; CA2253011A1; EP0924295A2; AR017709A1; US6436410B1; NZ333160A; EP0924295A3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、動物の健康に関す
る分野内にあり、病気に関するワクチン組成物および診
断に関係する。より特別には、本発明は、ネオスポラ
（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）のジヒドロフォレートレダクター
ゼ−チミジレートシンターゼ（ＤＨＦＲ−ＴＳ）タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チド分子であって、そのポリヌクレオチド分子がネオス
ポラ症に対するワクチンの製造に、および診断用試薬と
して有用である、前記ポリヌクレオチド分子に関係す
る。

【０００２】

【従来の技術】ネオスポラは、哺乳動物の流産、新生児
死亡、先天性感染症、および脳炎疾病の主な原因として
認識された動物の病原性原生動物寄生虫である（Ｄｕｂ
ｅｙおよびＬｉｎｄｓａｙ、１９９６、Ｖｅｔ．Ｐａｒ
ａｓｉｔｏｌ．，６７，１−５９；ＤｕｂｅｙおよびＬ
ｉｎｄｓａｙ、１９９３、ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙＴ
ｏｄａｙ，９，４５２−４５８）。Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍ
は、イヌに感染し、そして先天的に子犬に感染してお
り、時には、麻痺を起こす。Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍのタキ
ゾイトを、先天的感染の子犬から単離した（Ｌｉｎｄｓ
ａｙおよびＤｕｂｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ
ｏｌ．，７５，１６３−１６５）。ネオスポラは、乳牛
の流産の主な原因である。ネオスポラ−関連疾病の症
例、例えばネオスポラ症もまた、ヤギ、ヒツジおよびウ
マで報告されている。

【０００３】Ｎ．ｃａｎｉｍｕｎは、病原体、Ｔｏｘｏ
ｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉと表面的には類似している
が、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍおよびＴ．ｇｏｎｄｉｉは、抗
原性および超微細構造の両方で互いに識別された（Ｄｕ
ｂｅｙおよびＬｉｎｄｓａｙ、１９９３、上記）。さら
に、流産したウシ胎児の脳から単離されインビトロで連
続的に培養された、ネオスポラ様原生動物寄生虫は、
Ｔ．ｇｏｎｄｉｉおよびＨａｍｍｏｎｄｉａｈａｍｍ
ｏｎｄｉの両方とは異なった、抗原性および超微細構造
であることが示され、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍに最も類似し
ていた（Ｃｏｎｒａｄら、１９９３、Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌｏｇｙ，１０６，２３９−２４９）。さらに、核小サ
ブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子の分析は、乳牛およ
びイヌから単離されたネオスポラ株間にヌクレオチドの
差を示さなかったが、ネオスポラとＴ．ｇｏｎｄｉｉの
間では一貫した差が示された（Ｍａｒｓｈら、１９９
５、Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，８１，５３０−５３
５）。

【０００４】ウシの流産および先天性疾病におけるウシ
のネオスポラ単離物の病因的役割が確認された（Ｂａｒ
ｒら、１９９４、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，６，２０７−２１５）。中枢神経系ネオスポラ症
の齧歯動物モデルが、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍに感染した同
系のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、開発された（Ｌｉｎ
ｄｓａｙら、１９９５、Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，８
１，３１３−３１５）。さらに、妊娠した異系および同
系のマウス内のＮ．ｃａｎｉｎｕｍの移植伝染を研究す
るためのモデルは、それぞれ、Ｃｏｌｅら、１９９５、
Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，８１，７３０−７３２、お
よびＬｏｎｇら、１９９６、Ｊ．ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．，８２，６０８−６１１、に記載されている。さら
に、自然に獲得されたネオスポラ誘導の乳牛流産と密接
に類似する実験的Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍの子ヤギモデル
は、Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．
Ｒｅｓ．，５６，１１７６−１１８０、に示されてい
る。

【０００５】Ｔ．ｇｏｎｄｉｉおよびネオスポラのよう
な原生動物では、主要代謝酵素であるジヒドロフォレー
トレダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジレートシンタ
ーゼ（ＴＳ）が、２つの別個の酵素ドメイン：即ち、"
ＤＨＦＲドメイン"および"ＴＳドメイン"：の同一タン
パク質分子上に帰属することが知られている。Ｔ．ｇｏ
ｎｄｉｉでは、ＤＨＦＲおよびＴＳドメインは、〜７０
アミノ酸の結合領域によって分けられると報告されてい
る（Ｒｏｏｓ、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６８，６２６９−６２８０）。二価性タンパク質は、
欠失のための標的としての少なくとの一つの原生動物の
種内に提供されて、生ワクチンに用いるための弱毒化さ
れた株を作り出した。このように、Ｔｉｔｕｓら、１９
９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９
２，１０２６７−１０２７１は、Ｌ．ｍａｊｏｒの毒性
株に対するワクチンに用いるためのｄｈｆｒ−−ｔｓ−
ヌル変異細胞を主に作り出す、原生動物寄生虫であるリ
ーシュマニアからのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の同族組換え
による標的化欠失について記載している。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ネオスポラの
ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
好ましい実施態様では、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタ
ンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列またはファージ
λＮｃｌＨＤＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１
２）内に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によってコード
されるＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のアミノ酸配列を含
む。非制限の実施態様では、単離されたポリヌクレオチ
ド分子は、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレ
オチド配列を含む。好ましい実施態様では、ネオスポラ
のＤＮＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１の約２４０
５から約８１９９迄のヌクレオチド配列、またはファー
ジλＮｃｌＨＤＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１
２）内に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド
配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。さらなる非
制限の実施態様では、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド分子は、配列番号２のヌクレオ
チド配列を含む。

【０００７】さらに、本発明は、配列番号１の約ｎｔ２
４０５から約ｎｔ８１９９迄に認められるＤＨＦＲ−Ｔ
Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列、またはファージλＮｃｌ
ＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）内に存
在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列、また
は配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド分子と実質的に相同である単離されたポリヌクレオチ
ド分子を提供する。

【０００８】さらに、本発明は、配列番号３のアミノ酸
配列、またはファージλＮｃｌＨＤＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ
寄託番号２０９５１２）内に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺
伝子によってコードされるＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の
アミノ酸配列を持つ、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタン
パク質と実質的に相同であるポリヌクレオチドをコード
するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチ
ド分子を提供する。

【０００９】さらに、本発明は、前述の任意のポリヌク
レオチド分子の相当部分であるヌクレオチド配列からな
るポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様
では、ポリヌクレオチド分子は、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質のＤＨＦＲドメインあるいはＴＳドメインからなる
ポリペプチドのような、任意の前述のネオスポラのＤＨ
ＦＲ−ＴＳタンパク質のペプチドフラグメントまたは実
質的に相同なポリペプチド、をコードするヌクレオチド
配列からなる。

【００１０】任意の前述のＤＨＦＲ−ＴＳ関連ポリヌク
レオチド分子のヌクレオチド配列に加えて、本発明のポ
リヌクレオチド分子は、例えば、配列番号１に示す隣接
ヌクレオチド配列またはその部分の様な、Ｎ．ｃａｎｉ
ｎｕｍ内のＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子に原位置で生来隣接し
ているヌクレオチド配列を、さらに含むことができる、
または代わりに前記ヌクレオチド配列からなることがで
きる。

【００１１】さらに、本発明は、クローニングベクタ
ー、発現ベクターを含む本発明のポリヌクレオチド分子
のクローニングおよび発現するための組成物および方
法、ならびに前記ベクターを含む形質転換された宿主細
胞を提供する。非制限の実施態様では、本発明は、例え
ば、λＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ２０９５１２）と
名付けられたλファージクローニングベクターのよう
な、Ｎ．Ｃａｎｉｎｕｍ株ＮＣ−１のＤＨＦＲ−ＴＳ遺
伝子のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子を
含むクローニングベクターを提供する。

【００１２】さらに、本発明は、ネオスポラのＤＨＦＲ
−ＴＳタンパク質のアミノ酸配列を含む部分的にまたは
実質的に精製されたタンパク質を提供する。非制限の実
施態様では、タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列
またはファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番
号２０９５１２）に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によ
ってコードされるようなＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のア
ミノ酸配列を含む。さらに、本発明は、ネオスポラのＤ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質と実質的に相同であるポリヌク
レオチドを提供する。さらに、本発明は、例えば単離さ
れたネオスポラのＤＨＦＲドメインあるいはＴＳドメイ
ンからなるポリペプチドのような、前述の任意のタンパ
ク質のペプチドフラグメントまたはポリペプチドを提供
する。

【００１３】さらに、本発明は、ネオスポラのＤＨＦＲ
−ＴＳタンパク質に対する、または前記タンパク質のペ
プチドフラグメントに対する抗体を提供する。

【００１４】さらに、本発明は、例えば、配列番号１の
約ｎｔ２４０５から約ｎｔ８１９９迄に示されるよう
な、あるいはファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ
寄託番号２０９５１２）内に存在するような、ＤＨＦＲ
−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド分子、または、任意の前記のヌクレオチド配列の相当
部分であるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
分子、の様な任意の前述のポリヌクレオチド分子を含む
が、一つあるいはそれより多くのヌクレオチドの欠失、
挿入および／または置換によって修飾されたか、また
は、ポリヌクレオチド分子が野生型ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝
子内に挿入された場合あるいは野生型ＤＨＦＲ−ＴＳ遺
伝子の部分を置換するために用いられた場合、結果とし
て、部分的に欠損したあるいは完全に欠損したタンパク
質をコードするか、またはタンパク質を全くコードしな
いか、あるいは生成しない、修飾されたＤＨＦＲ−ＴＳ
遺伝子配列を生ずるポリヌクレオチド分子のような、
Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍ内のＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子に原位置
で生来隣接する一つあるいはそれより多くのヌクレオチ
ド配列からなる、遺伝子構築物を提供する。そのような
遺伝子構築物は、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子またはその部分
が部分的あるいは完全に無力になり、そうすることによ
って結果としてｄｈｆｒ−またはｔｓ−またはｄｈｆｒ
−−ｔｓ−変異体表現型（以後、まとめてｄｈｆｒ−−
ｔｓ−表現型と呼ぶ）のいずれかを示す細胞を生ずる、
修飾されたネオスポラ細胞の作成に有用である。

【００１５】さらに、本発明は、天然のＤＨＦＲ−ＴＳ
遺伝子またはその部分が部分的あるいは完全に無力にな
った修飾された生きたネオスポラ細胞を提供する。好ま
しい実施態様では、ネオスポラ細胞は、本発明の遺伝子
構築物での相同組換えを通してのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子
の崩壊の結果として、ｄｈｆｒ−−ｔｓ−変異体表現型
を示す。そのような修飾された生きたネオスポラの細胞
は、ネオスポラ症から哺乳動物を防御するためのワクチ
ン組成物に有用である。さらに、本発明は、修飾された
生きたネオスポラ細胞を調製する方法を提供する。

【００１６】さらに、本発明は、ネオスポラ症に対する
ワクチンであって、免疫学的に有効な量の本発明の修飾
された生きたネオスポラ細胞および獣医学的に許容しう
るキャリヤーを含む、上記のワクチンを提供する。さら
に、本発明は、ネオスポラ症、さらに所望であれば哺乳
動物を苦しめる可能性のある一つあるいはそれより多く
の疾病または病的状況から哺乳動物を防御するための組
み合わせワクチンであって、本発明の修飾された生きた
ネオスポラ細胞を含む、免疫学的に有効な量の第一成
分；哺乳動物を苦しめる可能性のある病気または病的状
況に対して予防応答を誘導する能力を持つ免疫学的に有
効な量の第二成分、および獣医学的に許容しうるキャリ
ヤーを含む、上記の組み合わせワクチンを提供する。さ
らに、本発明は、本発明のワクチンを製造する方法であ
って、免疫悪的に有効な量の本発明の修飾された生きた
ネオスポラ細胞を、獣医学的に許容しうるキャリヤーと
組み合わせることを含む、前記のワクチン製造方法を提
供する。さらに、本発明は、哺乳動物にネオスポラ症に
対するワクチンを接種する方法であって、本発明のワク
チンを哺乳動物に投与することを含む、前記のワクチン
接種方法を提供する。

【００１７】さらに、本発明は、哺乳動物にネオスポラ
症に対するワクチンを接種するためのキットであって、
免疫学的に有効な量の本発明の修飾された生きたネオス
ポラ細胞を含む組成物を持つ第一の容器、および獣医学
的に許容しうるキャリヤーまたは希釈剤を含む第二の容
器を含む、前記のワクチン接種用キットを提供する。

【００１８】

【発明の実施の形態】１．ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ
をコードするポリヌクレオチド分子本発明は、（ｉ）ネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌ
クレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
を含む、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオ
チド分子；（ii）前述の任意のポリヌクレオチド分子と
実質的に相同である単離されたポリヌクレオチド分子；
（iii）ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質と実質
的に相同であるポリヌクレオチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子；お
よび（iv）前述の任意のネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳタン
パク質のペプチドフラグメントまたは実質的に相同であ
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる
ポリヌクレオチド分子を含む、前述の任意のポリヌクレ
オチド分子の相当部分であるヌクレオチド配列からなる
ポリヌクレオチド分子：を提供する。

【００１９】本明細書中で用いられている、用語「遺伝
子」、「ポリヌクレオチド分子」、「ヌクレオチド配
列」、「コード配列」および「コード領域」は、一本鎖
または二本鎖のいずれかであることのできるＤＮＡおよ
びＲＮＡの両方の分子を含むつもりである。また、本明
細書中で用いられている、用語「遺伝子」、「コード配
列」および「コード領域」は、適当な調節エレメントを
持つ機能的に作用するアソシエーション内に置かれた場
合、宿主細胞発現系内で、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ
タンパク質に、またはネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタン
パク質と実質的に相同であるポリペプチドに、または前
述のネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のペプチドフ
ラグメントあるいは実質的に相同なポリペプチドに、転
写され翻訳される（ＤＮＡ）か、または翻訳される（Ｒ
ＮＡ）ことのできる、ポリヌクレオチド分子をさすつも
りである。ポリヌクレオチド分子は、限定するわけでは
ないが、一つまたはそれより多くの原核生物の配列、真
核生物の配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列（エキ
ソンまたはイントロン）、および化学的に合成されたＤ
ＮＡおよびＲＮＡ配列、またはその任意の組み合わせを
含むことができる。

【００２０】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
は、ネオスポラの任意の種または株からのヌクレオチド
配列を持つことができるが、好ましくは、Ｎ．ｃａｎｉ
ｎｕｍの様なネオスポラの病原性の種からのヌクレオチ
ド配列である。本発明のポリヌクレオチド分子を単離す
るか、または誘導することのできるＮ．ｃａｎｉｎｕｍ
株の非制限の例としては、ＮＣ−１株があげられ、ｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２３０１Ｐａｒｋｌ
ａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０
８５２，ＵＳＡ）、寄託番号ＣＲＬ−１２２３１の宿主
ＭＡＲＣ−１４５のサル腎臓細胞内から得ることができ
る。また、ＮＣ−１株は、Ｄｕｂｅｙら、１９８８、
Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９８３：１
２５９−６３に記載されており、ここに参照として採用
される。別の方法として、本発明の実施に用いられるネ
オスポラの病原性株または種は、上記の文献に記載され
ているような標準的な単離技術を用いて、感染した動物
の器官、組織または体液から、単離することもできる。

【００２１】本発明は、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様
では、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質は、配列
番号３のアミノ酸配列またはファージλＮｃｌＤＨＦＲ
ＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）内に存在する様
なＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によってコードされたＤＨＦＲ
−ＴＳタンパク質のアミノ酸配列を含む。非制限の実施
態様では、単離されたポリヌクレオチド分子は、ネオス
ポラのＤＨＦＲーＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含
む。好ましい実施態様では、単離されたポリヌクレオチ
ド分子は、配列番号１の約ｎｔ２４０５から約ｎｔ８１
９９迄のヌクレオチド配列、またはファージλＮｃｌＤ
ＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）内に存在
する様なＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列と同
一であるヌクレオチド配列を含む、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍ
ＮＣ−１株のＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配
列を含む。配列番号１内に於いて、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝
子の予想されるＤＨＦＲドメインは、約ｎｔ２４０５か
ら約ｎｔ４６６４迄にコードされており、ＤＨＦＲ−Ｔ
Ｓ遺伝子の予想されるＴＳドメインは、約ｎｔ４６６５
から約ｎｔ８１９９までにコードされている。さらなる
非制限の実施態様では、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチド分子は、配列番号２のヌクレ
オチド配列を含み、その中での予想されるＤＨＦＲドメ
インは、約ｎｔ１から約ｎｔ９６９迄にコードされてお
り、予想されるＴＳドメインは、約ｎｔ９７０から約ｎ
ｔ１８３６迄にコードされている。

【００２２】さらに、本発明は、配列番号１の約ｎｔ２
４０５から約ｎｔ８１９９までに示されるようなＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列、またはファージλ
ＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）
内に存在する様なＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド
配列、または配列番号２のヌクレオチド配列、を含むポ
リヌクレオチド分子と実質的に相同である単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供する。ＤＨＦＲ−ＴＳ−関連
ポリヌクレオチド分子をさす場合に用いられる用語「実
質的に相同」とは、（ａ）配列番号１の約ｎｔ２４０５
から約ｎｔ８１９９迄に示された、またはファージλＮ
ｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）あ
るいは配列番号２のヌクレオチド配列内に存在する様
な、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列のよう
に、同一のタンパク質をコードするが、遺伝子コードの
縮重によるヌクレオチド配列の一つまたはそれより多く
のサイレント変化を含む；または、（Ｂ）配列番号１の
約ｎｔ２４０５から約ｎｔ８１９９迄に示された、また
はファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２
０９５１２）あるいは配列番号２のヌクレオチド配列内
に存在する様な、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド
配列のように、同一のタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を持つポリヌクレオチド分子補体と、中程度の
ストリンジェント条件下、即ち、０．５ＭＮａＨＰＯ
４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ中、６５゜Ｃで、フィルター結合させたＤＮ
Ａとハイブリダイゼーションさせ、そして０．２ｘＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳ中、４２゜Ｃで洗浄する前記条件下
でハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９、
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第一巻、ＧｒｅｅｎＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．、およびＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，２．１０．３、を参照のこ
と）、そして本発明の実施に有用である：ヌクレオチド
配列を持つポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい
実施態様では、実質的に相同なポリヌクレオチド分子
は、配列番号１の約ｎｔ２４０５から約ｎｔ８１９９迄
に示された、またはファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（Ａ
ＴＣＣ寄託番号２０９５１２）あるいは配列番号２のヌ
クレオチド配列内に存在する様な、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝
子のヌクレオチド配列のように、同一のタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子
補体と、高いストリンジェント条件下、即ち、０．５Ｍ
ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ
中、６５゜Ｃでフィルター結合したＤＮＡへハイブリダ
イゼーションさせ、そして０．１ｘＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳ中、６８゜Ｃで洗浄する前記条件下でハイブリダイ
ズし（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）、本発明の
実施に有用である。

【００２３】本明細書中に用いられているように、ポリ
ヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド分子をネオスポ
ラに感染した動物からの体液または組織サンプル内のネ
オスポラ特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するため
の診断用試薬として用いることができるか、または以下
の４節に記載のように、ポリヌクレオチドを、本発明の
修飾された生きたネオスポラ細胞の調製に有用な遺伝子
構築物を調製するために用いることができ、「本発明の
実施に有用」である。

【００２４】本発明の実質的に相同なポリヌクレオチド
分子は、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉからのＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオ
チド分子を含まない。

【００２５】さらに、本発明は、配列番号３のアミノ酸
配列、またはファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ
寄託番号２０９５１２）内に存在するようなＤＨＦＲ−
ＴＳ遺伝子によってコードされるようなＤＨＦＲ−ＴＳ
タンパク質のアミノ酸配列、を持つネオスポラのＤＨＦ
Ｒ−ＴＳタンパク質を実質的に相同であるポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリ
ヌクレオチド分子を提供する。ポリペプチドをさす用語
として本明細書中で用いられている、用語「実質的に相
同」とは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、またはフ
ァージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９
５１２）内に存在するようなＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によ
ってコードされるようなＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のア
ミノ酸配列、を持つＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のアミノ
酸配列と、好ましくは少なくとも約７０％、より好まし
くは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約
９０％、同一であり、そして実質的に相同なポリペプチ
ドが本発明の実施に有用である；および／または（ｂ）
配列番号３のアミノ酸配列、またはファージλＮｃｌＤ
ＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）内に存在
するようなＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によってコードされる
ようなＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のアミノ酸配列、を持
つネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質内に存在する
一つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、別のアミノ
酸残基と保守的に置換され、そしてポリペプチドが本発
明の実施に有用である：アミノ酸配列を持つポリペプチ
ドをさす。

【００２６】保守的アミノ酸置換は、この技術分野では
周知である。例えば、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタン
パク質の一つまたはそれより多くのアミノ酸配列を、類
似のチャージ、サイズまたは極性を持つアミノ酸残基と
保守的に置換することができ、その結果得られたポリペ
プチドは、本発明の実施への有用性を残していると、合
理的に期待できる。そのような置換をす繰り出すルール
は、その他にもいろいろありが、Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．
Ｄ．，１９７８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏ
ｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、第５巻、
増補３版、に記載されているそれらに含まれている。よ
り具体的には、保守的アミノ酸置換は、一般的には、ア
ミノ酸側鎖に関連性のあるアミノ酸ファミリー内で置換
する、アミノ酸の置換である。遺伝的にコードされるア
ミノ酸は、一般的には、４つのグループ：（１）酸性＝
アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および
（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ
ン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分け
られる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロ
シンは、芳香族アミノ酸としてもまた、分類される。任
意の特定のグループ内での一つまたはそれより多くの置
換、例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの
置換、または、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置
換、またはセリンでのスレオニンの置換、または、構造
的に関連するアミノ酸残基によるその他の任意のアミノ
酸残基の置換は、一般的には、得られたポリペプチドの
本発明の実施への有用性に有意の影響を与えないであろ
う。

【００２７】本明細書中に用いられているタンパク質ま
たはポリペプチドは、タンパク質またはポリペプチド
を、例えば、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の
２つの酵素的ドメインのいずれかを特異的に標的とする
阻害剤をスクリーニングすること、または全タンパク質
あるいはその中の２つの酵素ドメインの一つのいずれか
に対する抗体の力価を高めること、を含む任意の一つま
たはそれより多くの様々な目的に用いることができ、
「本発明の実施に有用」であると考えられる。

【００２８】さらに、本発明は、前述の任意のポリヌク
レオチド分子の相当部分であるヌクレオチド配列からな
るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中に用い
られている前述の任意のポリヌクレオチド分子の「相当
(substantial) 部分」とは、特定のＤＨＦＲ−ＴＳ関連
ポリヌクレオチド分子の完全より少ないヌクレオチド配
列からなるが、ＤＨＦＲ−ＴＳ関連ポリヌクレオチド分
子のヌクレオチド配列の少なくとも約３０％、より好ま
しくは少なくとも約５０％を含み、さらに、有用性がポ
リヌクレオチド分子に関して上に定義されるように、本
発明の実施に有用である、ポリヌクレオチド分子を意味
する。好まし実施態様では、ポリヌクレオチド分子は、
前述の任意のネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の
ペプチドフラグメント、または、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質のＤＨＦＲドメインあるいはＴＳドメインからなる
ポリペプチドのような実質的に相同なポリペプチド、を
コードするヌクレオチド配列からなる。本明細書中に用
いられている用語「ペプチドフラグメント」は、ネオス
ポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の完全なアミノ酸配列
または実質的に相同なポリペプチドの一つまたはそれよ
り多くのサブ配列からなるポリペプチドをさし、そのサ
ブ配列は全長の分子より短い長さであり、さらに、有用
性がポリヌクレオチド分子に関して上に定義されるよう
に、得られたペプチドフラグメントは本発明の実施に有
用である。それ故、全長の分子を、"ｎ"のアミノ酸残基
を持つとして現すと、そのペプチドフラグメントは、本
発明の実施に有用であるような、ｎ−１のアミノ酸残基
を持つポリペプチドを含む、全長の配列より少ない任意
のポリペプチドであろう。本発明のペプチドフラグメン
トは、好ましくは、長さが少なくとも約１０のアミノ酸
残基である。非制限の実施態様では、ペプチドフラグメ
ントは、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のＤＨ
ＦＲドメインまたはＴＳドメインからなる。

【００２９】ペプチドフラグメントがＤＨＦＲ−ＴＳタ
ンパク質または実質的に相同のポリペプチドの一つより
多くのサブ配列からなる、そのペプチドフラグメントを
コードするポリペプチド分子を作ることができ、その結
果、いくつかのサブ配列を共に持ち、また、全長のタン
パク質またはポリペプチド内では隣接していない相当す
るサブ配列をペプチドフラグメント内で互いに隣接させ
ることができる。さらに、ペプチドフラグメントをコー
ドするポリヌクレオチド分子を作ることができ、そうす
ることによって、ペプチドフラグメントを含む異なるサ
ブ配列が、全長のタンパク質またはポリペプチドと比較
して互いに異なる相対順序に配列されるか、または、コ
ードするペプチドフラグメントは特定のサブ配列の複数
コピーを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチド
分子は、ＤＨＦＲドメインあるいはＴＳドメインのいず
れかの複数のコピー、そこから選択されたエピトープ領
域、またはその組み合わせ、をコードすることができ
る。

【００３０】さらに、本発明は、天然のタンパク質のサ
ブ配列を互いに関連させて再配列した全長（ｎ）のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、さらに長
さが最大で約２ｎのポリペプチドを含む、天然タンパク
質より長いポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
分子、を含む。そのようなポリペプチドは、タンパク質
全体、個々のドメイン、エピトープ領域またはそのいく
つかの組み合わせのいずれかの複数コピーを含むことが
できる。

【００３１】前述の任意のＤＨＦＲ−ＴＳ関連ポリヌク
レオチド分子のヌクレオチド配列に加えて、本発明のポ
リヌクレオチド分子は、さらに、例えば、配列番号１に
示した隣接するヌクレオチド配列、またはその部分のよ
うな、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍ内でＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子に
原位置で生来隣接する配列から選択された一つまたはそ
れより多くのヌクレオチド配列を含むことができる、ま
たは、からなることができる。

【００３２】さらに、本発明のポリヌクレオチド分子の
配列は、増幅技術のプライマーとして、または病気の差
別的診断のプローブとして用いることができ、さらに本
明細書の開示によって当業者らが容易にデザインするこ
とのできる、オリゴヌクレオチド分子の構築に必要な情
報を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ま
しくは、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さである。
増幅は、例えば、Ｉｎｎｉｓら編、１９９５、ＰＣＲ
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ；および、Ｅｒｌｉ
ｃｈ編、１９９２、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｏ
ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ（文献はここに参照として採用する）、に
記載されているポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の様な標
準技術を適用することによって、適当に設計されたオリ
ゴヌクレオチドを用いて行うことができる。診断に関し
ては、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅に用い
て、脳組織、肺組織、胎盤組織、血液、脳脊髄液、粘
膜、尿、用水、等のような、動物組織または体液のサン
プル内のネオスポラ特異的ポリヌクレオチド分子の存在
を検出することができる。特異的増幅による生成物は、
ネオスポラに感染しているという診断を支持するものと
して用いられ、それに対して、増幅生成物が存在しない
ことは、感染していないということを指摘するであろ
う。一般的には、ＰＣＲに関しては、適当に設計された
プライマー、増幅されるヌクレオチド配列を含む鋳型、
ならびに適当なＰＣＲ酵素およびバッファーを含む混合
物、標準的なプロトコールに従って調製し処理して、鋳
型であるネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳポリヌクレオチド
分子またはその部分を増幅する。この技術分野で知られ
ているその他の増幅技術、例えばリガーゼ鎖反応、もま
た、代わりに用いることができる。

【００３３】「ポリヌクレオチド分子」に続く引例のす
べては、特に示されない限り、配列番号１の約ｎｔ２
４０５から約ｎｔ８１９９迄に示される、あるいはファ
ージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５
１２）内に存在する、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオ
チド配列、または配列番号２のヌクレオチド配列、を含
むポリヌクレオチド分子；配列番号１の約ｎｔ２４０５
から約ｎｔ８１９９迄に示されるＤＨＦＴ−ＴＳ遺伝子
のヌクレオチド配列、あるいはファージλＮｃｌＤＨＦ
ＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）内に存在する
ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列、を含むポリ
ヌクレオチド分子と実質的に相同であるポリヌクレオチ
ド分子；配列番号３のアミノ酸配列、あるいはファージ
λＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１
２）内に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子をコードするよ
うなＤＨＦＲーＴＳタンパク質のアミノ酸配列、を持つ
ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質と実質的に相同
であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド分子；および、前述の任意のネオス
ポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のペプチドフラグメン
トまたは実質的に相同なポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を含む、前
述の任意のポリヌクレオチド分子の相当部分であるヌク
レオチド配列からなるポリヌクレオチド分子：を含む、
本発明の前述の任意のポリヌクレオチド分子を含むつも
りである。

【００３４】「ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質」、「タンパ
ク質」または「ポリペプチド」に続くすべての引例は、
特に示さない限り、配列番号３のアミノ酸配列、または
ファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０
９５１２）に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子によってコ
ードされるＤＨＦＲーＴＳタンパク質のアミノ酸配列、
を持つタンパク質；前述の任意のタンパク質と実質的に
相同であるペプチド；および前述の任意のタンパク質ま
たはポリペプチドのペプチドフラグメント：を含むつも
りである。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド分子の作成ならびに操作は、熟練者の内にあ
あるが、さらに、その他にもいろいろあるが、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上
記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ、第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｉｎｎｉｓ
ら、１９９５、上記；およびＥｒｌｉｃｈ、１９９２、
上記（これらはここに参照として採用する）に記載の既
知の遺伝子技術に従って行うこともできる。

【００３６】２．組換え発現系２．１．クローニングベクターおよび発現ベクターさらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含
む、組換えクローニングベクターおよび発現ベクターを
提供する。非制限の実施態様では、本発明によって提供
されるクローニングベクターは、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍ
ＮＣ−１株の完全なＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のヌクレオチ
ド配列を持つポリヌクレオチド分子を含む、ファージλ
ＮｃｌＤＮＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）
である。

【００３７】好ましくは、本発明の発現ベクターが構築
され、そうすることによって、ポリヌクレオチド分子
は、転写および翻訳に必要な一つまたはそれより多くの
調節エレメントと共に、機能的に作用するアソシエーシ
ョン内にある。発現ベクターは、形質転換された宿主細
胞のような発現系内で用いられて、組み換えられて発現
したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質を生成する。

【００３８】本明細書中に用いられている、用語「調節
エレメント」は、限定するつもりはないが、誘導および
非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター、な
らびに、ポリヌクレオチドコード配列の発現の運転およ
び／または調節を提供するこの技術分野で知られている
その他のエレメント、をコードするヌクレオチド配列を
含む。本明細書中に用いられている、ＤＨＦＲ−ＴＳコ
ード配列は、ＤＨＦＲ−ＴＳコード配列の転写またはそ
のｍＲＮＡの翻訳またはその両方を有効に調節し提供す
る、一つまたはそれより多くの調節エレメントと共に、
「機能的に作用するアソシエーション」内にある。

【００３９】適当な調節エレメントを持つ機能的に作用
するアソシエーション内に特定のコード配列を含む発現
ベクターを構築する方法は、この技術分野では周知であ
り、これらは、本発明を実施するために用いることがで
きる。そのような方法には、その他にもいろいろある
が、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、上記；Ａｕｓｕｂ
ｅｌら、１９８９、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら。
１９８９、上記：に記載の、インビトロでの組換え技
術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えが含ま
れる。

【００４０】本発明のポリヌクレオチド分子のコード配
列を発現するために用いることのできる様々な発現ベク
ターが、この技術分野で知られており、その他にもいろ
いろあるが、細菌または酵母を形質転換するためのＤＨ
ＦＲ−ＴＳコード配列を含む組換えバクテリオファージ
ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡ発現ベ
クター；ならびに、例えば、昆虫細胞にトランスフェク
ションするためのＤＨＦＲ−ＴＳコード配列を含むバキ
ュロウイルス、または、哺乳動物の細胞にトランスフェ
クションするためのＤＨＦＲ−ＴＳコード配列を含むア
デノウイルスまたは牛痘の様な、組換えウイルス発現ベ
クター：が含まれる。

【００４１】本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう
に工作できる典型的な原核生物発現ベクターには、その
他にもいろいろあるが、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３
２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）、ならびにｐ
ＰＬおよびｐＫＫ２３３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれる。

【００４２】本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう
に工作できる典型的な真核生物の発現ベクターには、そ
の他にもいろいろあるが、エクジソン誘導の哺乳動物発
現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｉｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）、シトメガロウイルスのプロモーター−エンハンサ
ーに基づく系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびバキュロウイルス−基
本発現系（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。

【００４３】これらおよびその他のベクターの調節エレ
メントは、それらの強度および特異性を変えることがで
きる。用いられる宿主／ベクター系によって、数多くの
任意の適当な転写および翻訳エレメントを用いることが
できる。例えば、哺乳動物細胞系にクローニングする場
合、哺乳動物細胞のゲノムから単離されたプロモーター
（例えばマウスのメタロチオネインプロモーター）、ま
たはこれらの細胞内で増殖するウイルスから単離された
プロモーター（例えばワクチニアウイルス７．５Ｋプロ
モーターあるいはモノネイ(Moloney) マウスサルコーマ
ウイルスのロングターミナルリピート(long terminal r
epeat)、を用いることができる。また、組換えＤＮＡま
たは合成技術によって得られたプロモーターを用いる
と、挿入された配列の転写を提供することもできる。さ
らに、あるプロモーターからの発現を、特定の誘発物質
の存在下で高めることもできる（例えばメタロチオネイ
ンプロモーターでの亜鉛およびカドミウムイオン）。

【００４４】転写調節領域またはプロモーターの非制限
の例としては、細菌では、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ
７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左および右プ
ロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ
−ｌａｃ融合プロモーター等；酵母では、ＡＤＨ−Ｉお
よび−IIプロモーターのような解糖酵素プロモーター、
ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロ
モータ等；哺乳動物細胞では、ＳＶ４０早期および晩期
プロモーター、アデノウイルスの主要晩期プロモーター
等；が含まれる。

【００４５】特定の開始シグナルもまた、挿入されたＤ
ＨＦＲ−ＴＳコード配列の充分な翻訳には必要とされ
る。典型的には、これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コ
ドンおよび隣接配列が含まれる。開始コドンそれ自身お
よび隣接配列を含む本発明のポリヌクレオチド分子を適
当な発現ベクター内に挿入する場合、さらなる翻訳調節
シグナルは必要とされないであろう。しかしながら、コ
ード配列の一部分のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コド
ンを含む外因性の翻訳調節シグナルを必要とするであろ
う。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドン
は、天然および合成の両方の様々な起源から得ることが
できる。さらに、開始コドンは、挿入物全体のインフレ
ーム翻訳を確立するために、ＤＨＦＲ−ＴＳコード領域
のリーディングフレームと共にフェーズ内に存在しなく
てはならない。

【００４６】融合タンパク質発現ベクターを用いると、
ＤＨＦＲ−ＴＳ融合タンパク質を発現させることができ
る。精製された融合タンパク質を用いると、ＤＨＦＲ−
ＴＳタンパク質に対する抗血清の力価を高めること、Ｄ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質の生化学的性質を研究するこ
と、酵素活性の異なるＤＨＦＲ−ＴＳ融合タンパク質を
加工すること、または発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク
質の同定あるいは精製を助けること、ができる。可能性
のある融合タンパク質発現ベクターには、制限するつも
りはないが、β−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合
物、マルトース−結合タンパク質融合物、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ融合物ならびにポリヒスチジ
ン融合物（キャリヤー領域）をコードする配列採用ベク
ターが含まれる。この技術分野で知られている方法を用
いると、そのようなＤＨＦＲ−ＴＳ融合タンパク質をコ
ードする発現ベクターを構築することができる。

【００４７】上記のように、融合タンパク質は、発現し
たタンパク質の精製を助けるのに有用であることができ
る。例えば、ＤＨＦＲ−ＴＳ−マルトース結合タンパク
質融合物は、アミロース樹脂を用いて精製することがで
き；ＤＨＦＲ−ＴＳ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ融合タンパク質は、グラタチオン−アガロースビ
ーズを用いて精製することができ；そして、ＤＨＦＲ−
ＴＳ−ポリヒスチジン融合物は、二価のニッケル樹脂を
用いて精製することができる。代わりの方法として、キ
ャリヤータンパク質またはペプチドに対する抗体を、融
合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製
に用いることもできる。例えば、モノクローナル抗体の
標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を、調節
エレメントと共に機能的に作用するアソシエーション内
で、発現ベクター内に工作し位置付けることができ、そ
の結果、発現したエピトープはＤＨＦＲ−ＴＳタンパク
質と融合する。例えば、親水性マーカーペプチドであ
る、ＦＬＡＧＴＭエピトープタグ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．）をコードするヌクレオチド配列は、標準的技術に
よって、例えばＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のカルボキシ
末端に相当する部位で、発現ベクター内に挿入すること
ができる。次いで、発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質
−ＦＬＡＧＴＭエピトープ融合生成物は、商品として入
手できる抗−ＦＬＡＧＴＭ抗体を用いて、検出しアフィ
ニティー精製することができる。

【００４８】また、発現ベクターを加工して、特定のプ
ロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含
ませることができ、その結果、発現したＤＨＦＲ−ＴＳ
タンパク質を、特定のプロテアーゼで処置することによ
ってキャリヤー領域または融合パートナーから遊離させ
ることができる。例えば、融合タンパク質ベクターに
は、その他にもいろいろあるが、トロンビンまたはファ
クターＸａ切断部位をコードするＤＨＡ配列を含ませる
ことができる。

【００４９】ＤＨＦＲ−ＴＳコード領域から上流、およ
びＤＨＦＲ−ＴＳコード領域と共にリーディングフレー
ム内にある、シグナル配列を、既知の方法によって発現
ベクター内に加工すると、発現したタンパク質の転送(t
rafficking) および分泌に関わることができる。シグナ
ル配列の非制限の例には、その他にもいろいろあるが、
α−ファクター、イムノグロブリン、外膜タンパク質、
ペニシリナーゼおよびＴ−細胞レセプターからのそれら
が含まれる。

【００５０】本発明の発現ベクターと共にトランスフォ
ームまたはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助
けるために、発現ベクターは、さらにレセプター遺伝子
生成物またはその他の選択可能マーカー用コード配列を
含むように、加工することができる。好ましくは、その
ようなコード配列は、上記のように、調節エレメントコ
ード配列と共に、機能的に作用するアソシエーション内
に存在することができる。本発明に有用なレポーター遺
伝子は、この技術分野では周知であり、その他にもいろ
いろあるが、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質、ホタルのル
シフェラーゼ、およびヒトの成長ホルモンをコードする
それらが含まれる。選択可能マーカーをコードするヌク
レオチド配列は、この技術分野では良く知られており、
抗生物質または抗−代謝物に耐性を授ける遺伝子生成物
をコードする、または栄養素要求性を満たすそれらを含
む。そのような配列の例としては、その他にもいろいろ
あるが、チミジンキナーゼ活性、または、メトトレキセ
ート、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコ
ール、ゼオシン、ピリメタミン、アミノグリコシド、あ
るいはヒグロマイシン、に対する耐性をコードする配列
が含まれる。

【００５１】２．２．宿主細胞の形質転換本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子または組換え
発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞およびそれ
から誘導された細胞系を提供する。本発明の実施に有効
な宿主細胞は、真核生物であるが、原核生物細胞も好ま
しい。そのような形質転換された宿主細胞には、限定す
るわけではないが、その他にもいろいろあるが、組換え
バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコ
スミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；ある
いは、組換え発現ベクターで形質転換された酵母のよう
な微生物：または、バキュロウイルスのような組換えウ
イルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞、あるいは、
例えばアデノウイルスあるいはワクシニアウイルスのよ
うな組換えウイルス発現ベクターに感染させた哺乳動物
細胞のような動物細胞、が含まれる。

【００５２】細菌細胞は、宿主細胞として用いることが
できる。例えば、ＤＨ５α株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｗｉ
ｌｌｅ，ＭＤ．ＵＳＡ、寄託番号３１３４３またはＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡより入手可
能）の様な大腸菌の株を、用いることができる。真核生
物宿主細胞には酵母細胞が含まれるが、マウス、ハムス
ター、ウシ、サル、またはヒトの細胞系からのような、
哺乳動物細胞もまた、有効に用いることができる。本発
明の組換えタンパク質の発現に用いることのできる真核
生物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ
−６１）、ＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３
（例えばＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５８）が含まれ
る。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞
（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２２）ならびにチミジンキ
ナーゼ−欠乏細胞、例えば、Ｌ−Ｍ（ＴＫ）（ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＣＬ−１．３）およびｔｋ'−ｔｓ１３（Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６３２）が含まれる。

【００５３】本発明の組換え発現ベクターは、好ましく
は、細胞の実質的に均一な培地の一つまたはそれより多
くの宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトされ
る。発現ベクターは、一般的には、その他にもいろいろ
あるが、例えばリン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム
処理、ミクロインジェクション、エレクトロポレーショ
ン、組換えウイルスとの接触によるトランスフェクショ
ン、リポソーム−仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラントランスフェクション、形質導入、接
合、または微小発射射撃、の様な、既知の技術に従って
宿主細胞内に導入される。形質転換株の選択は、組換え
発現ベクターと関連する、選択可能マーカー（例えば抗
生物質耐性）を発現する細胞を選択することによるよう
な、標準的方法によって行うことができる。

【００５４】ひとたび、発現ベクターが宿細胞内に導入
されると、本発明のポリヌクレオチド分子の組込みおよ
び維持は、宿主細胞のゲノムまたはエピソームのいずれ
かの内で、例えばサザンハイブリダイゼーション分析、
制限酵素分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含
むＰＣＲ分析、または期待されたタンパク質の生成を検
出する免疫学的アッセイによる、標準的技術によって、
確認することができる。

【００５５】本発明のポリヌクレオチド分子を含むおよ
び／または発現する宿主細胞は、（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡ
ハイブリダイゼーション；（ii）「マーカー」遺伝子機
能の存在の検出；（iii）例えば、宿細胞内でのＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ特異的ｍＲＮＡ転写物の、発現によって測定さ
れる転写レベルの評価；または（iv）例えば、イムノア
ッセイによる、または、例えば、この技術分野で周知の
ＮＡＤＰＨ酸化によって触媒されるジヒドロフォレート
のテトラヒドロフォレートへの転化のようなＤＨＦＲ酵
素活性、あるいは、例えばデオキシウリジンモノホスフ
ェートのデオキシチミジンモノホスフェートへの転化の
ようなＴＳ酵素活性、の検出による、成熟ポリペプチド
生成物の存在の検出：を含む、この技術分野で周知の少
なくとの４つの任意の一般的研究方法によって、同定す
ることができる。

【００５６】２．３，組換えポリペプチドの発現および
精製ひとたび、本発明のポリヌクレオチド分子が適当な宿主
細胞内に安定に導入されると、形質転換された宿主細胞
をクローンで繁殖させ、その結果得られた細胞を、コー
ドされたＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の最大生成を導く条
件下で増殖させる。そのような条件には、典型的には、
形質転換された細胞の高密度増殖が含まれる。発現ベク
ターが誘導プロモーターを含む場合、例えば、温度シフ
ト、栄養素の涸渇、無償性誘導物質の付加（例えばイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）のような炭水化物類似体）、過剰な代謝副産物の蓄
積、またはその類似条件等のような、適当な誘導条件
が、発現の誘導に必要な条件として用いられる。

【００５７】発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質が宿主
細胞の内側に残留する場合には、細胞を集菌し、溶解
し、そして、生成物は、例えば、４゜Ｃで、またはプロ
テアーゼ阻害剤存在下で、またはその両方で、のような
タンパク質分解を最少にするこの技術分野で既知の抽出
条件下で溶解物から精製した。発現したＤＨＦＲ−ＴＳ
タンパク質が宿主細胞から分泌される場合には、栄養素
の涸渇した培地を単純に収集し、タンパク質をそこから
単離することができる。

【００５８】発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質は、制
限するわけではないが、一つまたはそれより多くの以下
の方法；硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分画、イオン交
換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、およ
びアフィニティークロマトグラフィー：を含む適当な標
準的方法を用いて、細胞溶解物または培養液より精製す
ることができる。発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質
が、酵素活性（例えば、ＮＡＤＰＨ酸化によって触媒さ
れるようなジヒドロフォレートをテトラヒドロフォレー
トに転化する能力（ＤＨＦＲ）、またはデオキシウリジ
ンモノフォスフェートをデオキシチミジンモノホスフェ
ートに転化する能力（ＴＳ）のいずれか）を示す場合に
は、この技術分野で知られているような適当なアッセイ
を用いることによって、調製物の純度の増加を精製方法
のそれぞれの段階でモニターすることができる。発現し
たタンパク質が生理活性を持たない場合、例えば、サイ
ズ、またはＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質に特異的な抗体と
の反応性、または融合タグの存在、を基にして、検出す
ることができる。本発明を実施するに当たって使用する
ためには、組換え発現したＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質
は、培地内に生成されても、あるいは細胞溶解物内に存
在しても、非精製状態であっても、または、それから部
分的にあるいは実質的に精製されていても良い。

【００５９】従って、本発明は、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質の調製方法であって、組み換え発現ベクターで形質
転換された宿主細胞を培養し、そして細胞培養液からＤ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質を回収することを含み、前記組
み換え発現ベクターがＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の発現
を誘導する条件下で一つあるいはそれより多くの調節エ
レメントと共に機能的に作用するアソシエーション内に
本発明のポリヌクレオチド分子を含む、前記のＤＨＦＲ
−ＴＳタンパク質の調製方法を提供する。

【００６０】さらに、本発明は、配列番号３に示したア
ミノ酸配列を含む単離されたネオスポラのＤＨＦＲ−Ｔ
Ｓタンパク質、またはファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ
（ＡＴＣＣ２０９５１２）に存在するＤＨＦＲ−ＴＳ遺
伝子によってコードされるＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の
アミノ酸配列を含むタンパク質、それと実質的に相同な
ポリペプチド、ならびに前述のタンパク質およびポリペ
プチドのペプチドフラグメントを提供する。例えば、本
発明のペプチドフラグメントは、ネオスポラのＤＨＦＲ
−ＴＳタンパク質のＤＨＦＲドメインまたはＴＳドメイ
ンからなることができる。ネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳタ
ンパク質の予想されるＤＨＦＲドメインのアミノ酸配列
を、配列番号３のアミノ酸残基約１からアミノ酸残基約
３２３までに示され；予想されるＴＳドメインのアミノ
酸配列は、アミノ酸残基約３２４からアミノ酸残基約６
１２迄である。

【００６１】３．ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の用途ひとたび、充分な純度のＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質が得
られたならば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマト
グラフィー、アミノ酸配列分析、生理活性等を含む標準
的方法によって、その特徴を調べることができる。さら
に、ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質を、親水性分析（例え
ば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７８，３８２
４を参照のこと）または類似のソフトウェアアルゴリズ
ムを用いて特徴を調べると、親油性領域および親水性領
域を同定することができる。構造分析を行うと、特定の
二次構造をとるＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質の領域を同定
することもできる。Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１
９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１，
７−１３）、コンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅ
ｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ編、１９８６、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）、および核磁気共鳴（Ｎ
ＭＲ）のような生物物理学的方法を用ると、ＤＨＦＲ−
ＴＳタンパク質と任意のその基質との間の相互作用の部
位をマッピングし研究することができる。これらの研究
から得られた情報を用いると、より効果的な欠失変異体
およびワクチン組成物を設計する、またはインビボでネ
オスポラのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質のＤＨＦＲドメイ
ンあるいはＴＳドメインのいずれかの酵素活性を特異的
にブロックすることのできる治療化合物あるいは薬理化
合物を設計あるいは選択することができる。

【００６２】本発明の単離されたＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質、組換え体またはその他の点で、様々な目的に有用
である。例えば、タンパク質は、ＤＨＦＲドメインまた
はＴＳドメインのいずれかの酵素活性を特異的にブロッ
クする阻害剤をスクリーニングするために用いることが
できる。そのようなスクリーニング方法は、この技術分
野では周知である。また、本発明のＤＨＦＲ−ＴＳタン
パク質を抗原として用いると、下記の方法に従って、タ
ンパク質と特異的に反応する、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体のいずれかを作り出すことができ
る。そのような抗体は、例えば、天然または組換えのＤ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質を精製するためのアフィニティ
ー試薬として、または動物からの細胞、組織あるいは体
液サンプル内のネオスポラ特異的ＤＨＦＲ−ＴＳタンパ
ク質の存在を例えばＥＬＩＳＡあるいはウエスタンブロ
ットアッセイによって検出するための診断用試薬とし
て、有用である。

【００６３】抗体は、既知の方法を用いてＤＨＦＲ−Ｔ
Ｓタンパク質に対して作り出すことができる。ブタ、ウ
シ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスを含む様
々な宿主動物を、部分的または実質的に精製した抗原で
免疫化することができる。下記のようなアジュバントを
用いると、抗体の生成を強化することができる。ポリク
ローナル抗体は、免疫化された動物の血清から得られ、
標準的技術を用いて抗−ＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質特異
性について試験することができる。別の方法として、Ｄ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質に対するモノクローナル抗体
は、抗体分子の生成のために提供される任意の技術を用
いて、培養液内の連続細胞系によって、調製することが
できる。これらには、限定するつもりはないが、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ、１９７
５、２５６、４９５ー４９７に最初に記載されたハイブ
リドーマ技術；ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏ
ｓｂｏｒら、１９８３、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄ
ａｙ，４，７２；Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２０２６−
２０３０）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏ
ｌｅら、１９８５、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，
ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６）が含
まれる。別の方法として、一本鎖抗体の生成に関して記
載された技術（合衆国特許第４，９４６，７７８号を参
照のこと）を適用して、ＤＨＦＲ−ＴＳ抗原−特異的一
本鎖抗体を作り出すことができる。これらの文献は、参
照としてここに採用される。

【００６４】ＤＨＦＲ−ＴＳ抗原に関する特異的結合部
位を含む抗体フラグメントもまた、本発明内に包含さ
れ、既知の技術によって作成することができる。そのよ
うなフラグメントには、限定するわけではないが、完全
な抗体分子のペプシン消化によって生み出すことのでき
るＦ（ａｂ'）２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）２
フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによ
って生み出すことのできるＦａｂフラグメントが含まれ
る。別の方法としては、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築
する（Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
６，１２７５−１２８１）と、ＤＨＦＲ−ＴＳ抗原に対
して所望の特異性を持つＦａｂフラグメントの急速な同
定を可能にすることができる。

【００６５】モノクローナル抗体および抗体フラグメン
トを生成する技術は、この技術分野では周知であり、さ
らに、その他にもいろいろあるが、Ｈａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ，１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；ならび
に、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（ここに参照として採用される）に記
載されている。

【００６６】４．ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の
標的化変異４．１．遺伝子構築物本発明のポリヌクレオチド分子の開示に基づいて、ネオ
スポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を無力化にする用途に、
遺伝子構築物を調製することができる。ネオスポラのＤ
ＨＦＲ−ＴＳ遺伝子は、現在知られているまたは今後開
発されるであろう遺伝子技術と組み合わせて、適当に設
計した遺伝子構築物を用いて無力化することができる。
例えば、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子は、（ａ）
ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の全部または一部分を欠失する；
または（ｂ）ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の一部分を異なるヌ
クレオチド配列と置き換える；または（ｃ）ネオスポラ
またはその他の起源からのヌクレオチド配列を含むこと
のできる一つまたはそれより多くのヌクレオチド、ある
いはオリゴヌクレオチド分子、あるいはポリヌクレオチ
ド分子をＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子内に挿入する：ように機
能する、本発明の遺伝子構築物を用いて無力化すること
ができる。

【００６７】ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を無力化したネオス
ポラ細胞は、ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の無力化が、ＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ遺伝子がそのように無力化されなかったネオス
ポラの同一株の細胞と比較して、無力化されたＤＨＦＲ
−ＴＳ遺伝子を持つネオスポラ細胞の病原性を減少させ
る、および、無力化されたＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を持つ
そのようなネオスポラ細胞をワクチン組成物、特に修飾
された生ワクチンに用いて、ネオスポラ症に対する防御
応答を哺乳動物に誘導することができる、本発明の実施
に有用である。

【００６８】非制限の実施態様では、野生型ＤＨＦＲ−
ＴＳ遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列を突然
変異したネオスポラＤＨＦＲーＴＳ遺伝子またはその部
分と置き換えることによって、野生型ネオスポラＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ遺伝子を無力化するために、本発明の遺伝子構
築物を用いることができる。そのような遺伝子構築物に
用いるための突然変異したネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ
遺伝子配列は、誤りがちなＰＣＲの使用、またはカセッ
ト突然変異、を含む任意の様々な既知の方法によって、
作り出すことができる。例えば、オリゴヌクレオチド−
関連突然変異は、例えば、配列の特定領域内にフレーム
シフトまたは終止コドンを誘導する、明確な方法で野生
型のネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のＯＲＦ配列を変
えるために用いることができる。別の方法として、また
はさらなる方法として、本発明の遺伝子構築物に用いる
突然変異したヌクレオチド配列は、一つあるいはそれよ
り多くのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子または
ポリヌクレオチド分子内に挿入することによって、また
は、一つあるいはそれより多くのヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド分子またはポリヌクレオチド分子でネオス
ポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の一部分を置換することに
よって、調製することができる。そのようなオリゴヌク
レオチド分子またはポリヌクレオチド分子は、任意の天
然発生の起源から得ることができる、または合成するこ
とができる。挿入された配列は、単純にネオスポラのＤ
ＨＦＲーＴＳ遺伝子のリーディングフレームを崩壊する
ために提供することができるか、または選択可能マーカ
ーのような外因性遺伝子生成物もまたコードすることが
できる。また、ランダム突然変異は、本発明の遺伝子構
築物に用いるための突然変異したネオスポラのＤＨＦＲ
−ＴＳ遺伝子配列を作り出すために用いることができ
る。ランダム突然変異は、例えば、ネオスポラのＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ遺伝子を持つ細胞を蛍光照射あるいはＸ線に、
またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロソグアニジン、メタン
スルホン酸エチル、亜硝酸あるいはナイトロジェンマス
タードに晒して、次にＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子内に突然変
異を持つ細胞を選択することによるような、現在知られ
ている、または今後開発される任意の技術によって、起
こすことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８
９、上記の突然変異技術のレビューを参照のこと。

【００６９】上に定義したように、本発明の実施に有用
である修飾されたネオスポラ細胞を生成するための突然
変異は、ＯＲＦ内あるいはプロモーター領域内、または
遺伝子あるいはＯＲＦに隣接するその他の任意の配列内
に含まれるネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子内のいず
れかに起こすことができる。そのようなネオスポラ細胞
は、ネオスポラＤＨＦＲーＴＳ遺伝子によってコードさ
れるタンパク質の修飾型を生成する、またはそのような
タンパク質を全く生成しない、変異株であることができ
る。好ましい実施態様では、そのようなネオスポラ細胞
は、ｄｈｆｒ−、またはｔｓ− 、またはＤＨＦＲ−−
ＴＳ−変異体表現型を示す（以後、まとめてｄｈｆｒ−
−ｔｓ−表現型を呼ぶ）。さらに、そのようなネオスポ
ラ細胞は、ヌル、条件変異体または漏出変異体であるこ
とができる。

【００７０】別の方法として、本発明の遺伝子構築物
は、それ自身遺伝子のコード領域からのヌクレオチド配
列がほとんどまたは全く存在しない、配列番号１に示す
隣接配列から選択されたような、ネオスポラＤＨＦＲ−
ＴＳ遺伝子またはＯＲＦと原位置で生来隣接するヌクレ
オチド配列を含むことができる。そのような遺伝子構築
物は、例えば、全遺伝子またはＯＲＦを欠失するため
に、有用であろう。

【００７１】好ましい実施態様では、本発明の遺伝子構
築物は、ネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を無力化する
ために用いることのできるポリヌクレオチド分子であっ
て、（ａ）Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍからのＤＨＦＲ−ＴＳタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列のようにその他
の点で同一であるヌクレオチド配列を持つが、そのヌク
レオチド配列がさらに一つまたはそれより多くの無力化
変異を含む、ポリヌクレオチド分子；または（ｂ）原位
置でネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のＯＲＦと生来
隣接するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分
子：を含む、前記のポリヌクレオチド配列を含む。ひと
たび、ネオスポラの一つの株の細胞内に形質転換された
場合、遺伝子構築物のポリヌクレオチド分子は、例えば
相同組換えによって、ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝
子を特異的に標的化し、それによって、遺伝子あるいは
その部分を置換するか、または遺伝子内へ挿入されるか
のいずれかである。この組換えの結果として、ネオスポ
ラの特定の株に対してその他の点で未変性のネオスポラ
のＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を無力化にする。

【００７２】寄生原生動物内で相同遺伝子の置換を実行
する方法は、この技術分野で知られており、その他にも
いろいろあるが、ＣｒｕｚおよびＢｅｖｅｒｌｅｙ、１
９９０、Ｎａｔｕｒｅ，３４８，１７１−１７３；Ｃｒ
ｕｚら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８８，７１７０−７１７４；Ｄｏｎａｌ
ｄおよびＲｏｏｓ、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６３，２４３−２５３；お
よび、Ｔｉｔｕｓら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１０２６７−１０２
７１、に記載されており、ここにその全体を参照として
採用する。

【００７３】相同組換えを通して標的化遺伝子を突然変
異させるため、遺伝子構築物は、好ましくは、上記のよ
うな変異したヌクレオチド配列を含む、環状または線状
のいずれかのプラスミドである。非制限の実施態様で
は、変異した配列の少なくとも約２００ヌクレオチドを
用いると、本発明の遺伝子構築物は相同組換えでネオス
ポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子を特異的に標的化するが、
より短い長さのヌクレオチドもまた有効であることがで
きる。さらに、好ましくは、プラスミドは、構築され、
その結果、天然のネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の
配列をコードする調節エレメントと機能的に作用するア
ソシエーション内でネオスポラのゲノム内に挿入される
であろう、レポーター遺伝子生成物またはその他の選択
可能マーカーをコードするさらなるヌクレオチド配列を
含む。本発明の実施に用いることのできるレポーター遺
伝子は、この技術分野では周知であり、さらに、その他
にもいろいろあるが、ＣＡＴ、緑色蛍光タンパク質、お
よびβ−ガラクトシダーゼをコードするそれらを含む。
選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列もま
た、この技術分野では周知であり、抗生物質または抗代
謝生成物に耐性を授ける遺伝子生成物をコードするそれ
ら、または栄養要求性を与えるそれら、を含む。そのよ
うな配列の例としては、ピリメタミン耐性、または（ア
ミノグリコシドに対して耐性を授ける）ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ、または（ヒグロマイシンに対
して耐性を授ける）ヒグロマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ、をコードするそれらが含まれる。

【００７４】本発明の遺伝子構築物を創造するために用
いることのできる方法は、この技術分野では周知であ
り、その他にもいろいろあるが、Ｍａｎｉａｔｉｓら、
１９８９、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記；
およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記：に記載さ
れたような、インビトロでの組換え技術、合成技術、お
よびインビボでの遺伝子組換えが、含まれる。

【００７５】ネオスポラ細胞は、例えば、エレクトロポ
レーションのような、既知の技術に従って、本発明の遺
伝子構築物で形質転換またはトランスフェクトすること
ができる。形質転換株の選択は、構築物と関連する選択
可能なマーカーを発現する細胞を選択する様に、標準的
技術を用いて実行することができる。成功裡に組換えら
れ、そして特定の標的遺伝子を無力化された、形質転換
株の同定は、サザンブロット分析、あるいはＤＨＦＲ−
ＴＳタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物の欠如を検
出するためのノーザン分析のような遺伝子分析によっ
て、または、例えば免疫学的分析によって決定されるよ
うな、減少した病原性ような新規の表現型あるいはＤＨ
ＦＲ−ＴＳタンパク質を欠損した細胞の出現によって、
またはそのいくつかの組み合わせによって、遂行するこ
とができる。

【００７６】本発明に従って修飾することのできるネオ
スポラの細胞は、好ましくは、タキゾイトであるが、代
わりにブラディゾイトまたは卵母細胞であることもでき
る。ネオスポラのライフサイクルのある段階における細
胞は二倍体であるが、タキゾイトは一倍体である。この
ように、タキゾイトでは、特定のネオスポラ遺伝子を崩
壊するために、ただ一回の組換えが成功裡に行われるこ
とを要求するのみであるため、適当な変異体表現型を発
現する修飾されたネオスポラ細胞の生産にタキゾイトを
用いることが好ましい。一方、ネオスポラの二倍体細胞
では、２つのアレレをそれぞれの遺伝子について崩壊し
なければならない。このことは、２つの異なる選択可能
マーカーを持つ遺伝子構築物で、第一のアレレ、次いで
第二のアレレを順番に標的化することによって、成し遂
げることができる。

【００７７】さらなる非制限の実施態様では、本発明の
遺伝子構築物は、さらに、動物に感染することのできる
ネオスポラあるいは異なる病原体からの異なる遺伝子ま
たはコード領域を含むことができ、その遺伝子またはコ
ード領域は、本発明の修飾された生きたネオスポラ細胞
を持つワクチンの接種時に、動物内の別々の異なった防
御免疫応答を誘導するに有用な抗原をコードする。この
さらなる遺伝子またはコード領域は、さらに、修飾され
た生きたネオスポラ細胞からコードされた抗原の分泌を
誘導する単一配列を含むように加工することができ、そ
れによって抗原がワクチン接種された動物の免疫システ
ムに提示される事を可能にする。

【００７８】このように、本発明は、ＤＨＦＲーＴＳ遺
伝子が崩壊された、修飾された生きたネオスポラ細胞を
提供する。さらに、本発明は、修飾されたネオスポラの
生細胞を調製する方法であって；（ａ）本発明の遺伝子
構築物でネオスポラの細胞を形質転換し；（ｂ）ＤＨＦ
Ｒ−ＴＳ遺伝子が遺伝子構築物によって崩壊された、形
質転換細胞を選択し；そして（ｃ）ネオスポラ症から哺
乳動物を防御するワクチン内で用いることのできる段階
（ｂ）のそれらの細胞の細胞間から選択する：ことを含
む、前記の修飾されたネオスポラの生細胞を調製する方
法を提供する。

【００７９】４．２．ネオスポラ細胞の培養本発明に用いられるネオスポラ細胞は、この技術分野で
記載されている既知技術に従って、インビトロで、タキ
ゾイトの任意の受容細胞系、好ましくは哺乳動物細胞
系、に感染させることによって、培養し、そして保持す
ることができる。ネオスポラのタキゾイトを培養するこ
とのできる哺乳動物細胞には、その他にもいろいろある
が、例えばヒトの包皮繊維芽細胞（Ｌｉｎｄａｙら、１
９９３、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，５４，１０３−
１０６）、ウシの心筋大動脈内皮細胞（Ｍａｒｓｈら、
１９９５、上記）、ウシの単球（Ｌｉｎｄｓａｙおよび
Ｄｕｂｅｙ、１９８９、上記）およびサルの腎臓細胞が
含まれる。例えば、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍのタキゾイト
は、単層のＨｓ６８ヒト包皮繊維芽細胞（ＡＴＣＣ寄託
番号ＣＲＬ−１６３５）（Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９
３、上記）内で培養することができ；および、本発明に
用いられる、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍＮＣ−１株のタキゾ
イトを感染させた、ＭＡＲＣ１４５サル腎臓細胞は、Ａ
ＴＣＣに寄託する（寄託番号１２２３１）。ブラディゾ
イトも同様に培養し操作することができる。

【００８０】哺乳動物細胞培養物を増殖させ、ネオスポ
ラに感染させた細胞培養物は、この技術分野で記載され
ている任意の様々な型の培地内に、維持することができ
る。例えば、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍのタキゾイトに感染さ
せたウシの心筋大動脈内皮細胞の静置単層培養物は、１
０％（ｖ／ｖ）の熱で不活性化したウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）または成熟したウマの血清（ＥＳ）、２ｍＭＬ−
グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ
／ｍｌストレプトマイシンを追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ
の最少必須培地（ＤＭＥＭ，ＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｎ．Ｙ．）内で増殖させることができる
（Ｃｏｎｒａｄら、１９９３、上記）。Ｈｓ６８のヒト
の内皮繊維芽細胞の単層は、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、
１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｘ１０４Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１ｘ１０４μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ン、５ｘ１０−２ｍＭの２−メルカプトエタノールおよ
び０．３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ
１６４０（維持培地）内で、維持することができる。ネ
オスポラに感染したＨｓ６８ヒト包皮繊維芽細胞の単層
培養物は、同一培地内に維持することができるが、ＦＢ
Ｓは１０％に増加させる（増殖培地）。

【００８１】ヒトの細胞のネオスポラに感染した単層の
培養物は、典型的には、例えば、３７゜Ｃおよび５％Ｃ
Ｏ２のような、標準組織培養条件下で、維持される。
タキゾイトは、典型的には、培地内の哺乳動物細胞の７
０−９０％が感染された場合、感染していない単層培地
に継代される。７０−９０％の感染は、標準技術を用い
て顕微鏡で定量することができる。タキゾイトは、感染
した哺乳動物細胞培養物から、任意の標準技術を用いて
宿主細胞を溶解し、そして、例えばろ過または遠心分離
によって、タキゾイトを収集することによって、収集す
ることができる。

【００８２】本発明に従って修飾され、そしてｄｈｆｒ
−−ｔｓ−表現型を示す、ネオスポラ細胞は、上記のよ
うに、チミジンを含む培地内で、哺乳動物細胞内で、培
養することができる。

【００８３】５．抗−ネオスポラワクチン本発明は、例えば前述のｄｈｆｒ−−ｔｓ−ヌル変異体
の様な、免疫学的に有効な量の修飾された生きたネオス
ポラ細胞および獣医学的に許容しうるキャリヤーを含
む、ネオスポラ症に対するワクチンを提供する。

【００８４】さらに、本発明は、例えば、上記の方法に
従って調製されたｄｈｆｒ−−ｔｓ−表現型を示すそれ
らのような、修飾された生きた細胞を含み、そして免疫
学的に有効な量の修飾された生きた細胞を、獣医学的に
許容しうるキャリヤーと共に、哺乳動物への投与に適当
な形で結合させる、ネオスポラ症から哺乳動物を防御す
るワクチンの製造方法を提供する。

【００８５】ここに用いられるように、用語「免疫学的
に有効な量」とは、哺乳動物の種の一員に投与した場
合、一回の投与後または複数回の投与後のいずれかに、
ネオスポラ症に対する予防応答を誘導する能力を持つ本
発明の修飾ネオスポラ生細胞のその量をさす。

【００８６】用語「予防応答を誘導する能力を持つ」
は、ここではワクチン接種された動物にネオスポラ症か
らの防御を提供する、抗体または細胞仲介免疫応答のい
ずれかを含む、ワクチン接種に応答する動物内の任意の
免疫に基づく応答の誘導または強化を含むように、広く
用いられている。ここに用いられているような、用語
「予防応答」および「防御」は、ネオスポラ症の絶対的
防御またはネオスポラ症原因病原体による感染の絶対的
防御だけではなく、例えば、ワクチン接種した動物をワ
クチン接種していない同種の感染動物と比較した場合、
形成速度あるいは一つまたはそれより多くの組織内に形
成される障害の絶対数の任意の検出可能な減少、また
は、流産の発生、または妊娠した哺乳動物からその胎児
への、あるいは哺乳動物の親からその子孫への感染の伝
達の任意の検出可能な減少を含む、そのような病原体に
よる感染程度または速度の任意の検出可能な減少、また
は、病気の激しさあるいは病原体による感染の結果起こ
る任意の症状または病状の任意の検出可能な減少をもさ
す。

【００８７】ワクチンは、単に、培地中に放出されるか
あるいは哺乳動物宿主細胞内に残留しているかのいずれ
かで、またはその両方の組み合わせで、哺乳動物内に直
接投与される、修飾された生きたネオスポラ細胞を含む
培養液のアリコートを含むことができるか、または、代
わりに、投与経路に適当なような、この技術分野で既知
のそれらから選択された獣医学的に許容しうるキャリヤ
ーと組み合わせた修飾された生きたネオスポラ細胞も含
むことができる。修飾された生きたネオスポラ細胞の少
なくともある程度の生命力がワクチン組成物中に保持さ
れていることが好ましい。例えば、本発明のワクチン組
成物を、標準バッファー、キャリヤー、安定剤、希釈
剤、保存剤、および／または溶解剤を用いる認められた
慣習に従って、調合することができ、そして、持続した
放出を容易にするように調合することもできる。希釈剤
は、水、塩類溶液、デキストロース、エタノール、グリ
セロールおよびその類似物等を含むことができる。等張
にするための添加物は、その他にもいろいろあるが、塩
化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビ
トール、およびラクトースを含むことができる。安定化
剤は、その他にもいろいろあるが、アルブミンを含むこ
とができる。修飾された生きたワクチンに特に有用であ
る、適当なその他のワクチンベヒクルおよび添加剤は、
当業者らに知られているか、または、明らかになるであ
ろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃ
ｅｕｉｔｉｃａｌＳｃｉｎｃｅ、第１８版、１９９
０、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（ここに参照とし
て採用される）を参照のこと。

【００８８】本発明のワクチンに用いることのできる修
飾された生きたネオスポラ細胞は、好ましくは、タキゾ
イトであるが、代わりに、ブラディゾイトあるいは卵母
細胞、またはその組み合わせであることもできる。

【００８９】さらに、ワクチン組成物中の修飾された生
きたネオスポラ細胞の少なくともある程度の生命力が維
持される限りにおいて、本発明のワクチンは、例えば、
その他にもいろいろあるが、アジュバントまたはサイト
カイン、の様な一つまたはそれより多くのさらなる免疫
活性調節成分を含むことができる。本発明のワクチン内
で用いることのできるアジュバントの非制限例は、ＲＩ
ＢＩアジュバントシステム（ＲｉｂｉＩｎｃ．，Ｈａ
ｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウ
ムゲルのような鉱物ゲル、例えば、フロイントの完全ア
ジュバントおよび不完全アジュバント、ブロックコポリ
マー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、ＱＳ−２
１（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，
ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）およびＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉ
ｒｏｎ，ＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥ
Ｎ（登録商標）アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ
またはその他のサポニンフラクション、モノホスホリル
リッピッドＡ、およびＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質アミンアジ
ュバントのような、水中油エマルジョン、油中水エマル
ジョンを含む。本発明のワクチンに有用な水中油エマル
ジョンの具体的な非制限例は、修飾されたＳＥＡＭ６２
およびＳＥＡＭ１／２調合物を含む。修飾されたＳＥＡ
Ｍ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、
１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤
（ＩＣＩＳｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／
ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０界面活性剤（ＩＣＩ
Ｓｕｆｒａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノ
ール、２００μｇ／ｍｌＱｕｉｌＡ、１００μｇ／
ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチ
ンを含む水中油エマルジョンである。修飾ＳＥＡＭ１／
２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰ
ＡＮ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタ
ノール、１００μｇ/ｍｌＱｕｉｌＡ、および５０
μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油エマルジョンで
ある。ワクチン内に含ませることのできるその他の免疫
活性調節因子薬剤には、例えば、一つまたはそれより多
くのインターロイキン、インターフェロン、またはその
他の既知のサイトカインが含まれる。ワクチンは、凍結
して保存され、投与前に解凍されることができる。

【００９０】ワクチン組成物中に、少なくともある程度
の修飾された生きたネオスポラ細胞の生命力が維持され
ている限りにおいて、本発明のワクチンは、所望によ
り、修飾された生きたネオスポラ細胞を持続的に放出す
るように、調合することができる。そのような持続的放
出調合物の例としては、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ
（乳酸−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロ
ン酸、コラーゲンおよびその類似物等のような、生物適
合性ポリマーの複合物と組み合わされた、修飾ネオスポ
ラ生細胞が含まれる。構造、選択、および薬剤配達ベヒ
クル内での崩壊されるポリマーの使用は、Ａ．Ｄｏｍｂ
ら、１９９２、ＰｏｌｙｍｅｒｓｆｏｒＡｄｖａｎｃ
ｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３，２７９−２９２
（ここに参照として採用される）を含む、様々な文献内
で考察されている。医薬調合物内でのポリマーの選択お
よび使用についてのさらなるガイダンスは、Ｍ．Ｃｈａ
ｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ編、１９９０、"Ｂｉｏ
ｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒｓａｓＤｒ
ｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ"，Ｄｒｕｇ
ａｎｄｔｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｉｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４５巻、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ
（これもまたここに参照として採用される）のテキスト
内に見出すことができる。代わりに、またはさらに、ワ
クチン組成物中に少なくともある程度の修飾ネオスポラ
生細胞の生命力が維持されている限りにおいて、修飾ネ
オスポラ生細胞を、ミクロカプセル化して、投与および
効率を改善することができる。抗原をミクロカプセル化
する方法は、この技術分野では周知であり、例えば、合
衆国特許第３，１３７，６３１号；合衆国特許第３，９
５９，４５７号；合衆国特許第４，２０５，０６０号；
合衆国特許第４，６０６，９４０号；合衆国特許第４，
７４４，９３３号；合衆国特許第５，１３２，１１７
号；国際特許ＷＯ９５／２８２２７（そのすべてをここ
に参照として採用する）：に記載の技術が含まれる。

【００９１】また、リポソームを用いると、ワクチン組
成物中に少なくともある程度の修飾ネオスポラ生細胞の
生命力が維持されている限りにおいて、本発明の修飾ネ
オスポラ生細胞の持続的放出を提供することができる。
リポソーム組成物の作成および使用に関する詳細は、そ
の他にもいろいろあるが、合衆国特許第４，０１６，１
００号；合衆国特許第４，４５２，７４７号；合衆国特
許第４，９２１，７０６号；合衆国特許第４，９２７，
６３７号；合衆国特許第４，９４４，９４８号；合衆国
特許第５．００８．０５０号；および、合衆国特許第
５．００９，９５６号（そのすべてをここに参照として
採用する）：内に、認めることができる。

【００９２】さらに、本発明は、ネオスポラ症、さら
に、所望するならば、哺乳動物を苦しめうる一つまたは
それより多くのその他の疾病または病状、から哺乳動物
を防御する組み合わせワクチンであって、修飾ネオスポ
ラ生細胞を含む免疫学的に有効な量の第一の成分；哺乳
動物を苦しめる疾病または病状に対する予防応答を誘導
する能力を持つ免疫学的に有効な量の第二の成分；およ
び獣医学的に許容しうるキャリヤーを含む、上記の組み
合わせワクチンを提供する。

【００９３】組み合わせワクチンの第二の成分は、この
技術分野で知られているように、ネオスポラ症あるいは
哺乳動物の種の構成員を苦しめるその他の疾病あるいは
病状のいずれかに対して予防応答を誘導する能力に基づ
いて、選択される。得られたワクチン組成物内で少なく
ともある程度の修飾ネオスポラ生細胞の生命力が維持さ
れる限りにおいて、特定の哺乳動物種内でワクチン組成
物として有用であることが知られている任意の免疫原性
組成物を、組み合わせワクチンの第二の成分に用いるこ
とができる。そのような免疫原性組成物には、限定する
つもりはなく、その他にもいろいろあるが、ウシのヘル
ペスウイルス（ウシの感染性鼻気管炎と同義）、ウシの
呼吸合包体ウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルス、
パラインフルエンザウイルスＩ、II、または III型、レ
プトスピラ種、カンピロバクター種、黄色ブドウ状球
菌、ストレプトコッカスアガラクチアエ(Streptococc
us agalactiae)、マイコプラズマ種、クレプシェラ種、
サルモネラ種、ロタウイルス、コロナウイルス、狂犬
病、パスツレラヘモリティカ(Pasteurella hemolytic
a)、パスツレラムルトシダ(+asteurella multosida)
、クロストリジウム種、テタナス毒素、大腸菌、クリ
プトスポリディウム(Cryptosporidium) 種、珠虫種、ト
リコモナス種、およびその他の真核生物寄生虫、からな
る群より選択される病原体に対す津防御を提供するそれ
らが含まれる。

【００９４】本発明の組み合わせワクチンは、ワクチン
組成物内の細胞の生命力が維持される限りにおいて、さ
らに、例えば、上記のような、アジュバントまたはサイ
トカインを含む、一つまたはそれより多くのさらなる免
疫化性調節成分を含むことができる。組み合わせワクチ
ンの抗原を、凍結型で保存することができ、また投与す
る前に解凍することもできる。

【００９５】本発明は、さらに、ネオスポラ症から哺乳
動物を防御する方法であって、免疫学的に有効な量の本
発明の修飾ネオスポラ生細胞、および獣医学的に許容し
うるキャリヤーを含むワクチンを哺乳動物に投与するこ
とを含む、前記の防御方法を提供する。ワクチンは、好
ましくは、非経口で、例えば、皮下または筋肉内注射の
いずれかによって、投与される。しかしながら、代わり
に、腹腔内あるいは静脈内注射によって、または、例え
ば、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、眼内を含む、その他
の経路によって、またはそのような経路の組み合わせに
よって、さらにまたこの技術分野で既知の遅滞性放出装
置によって、ワクチンを投与することもできる。当業者
らは、選択された経路に従って、ワクチン組成物を調合
する方法を知っているであろう。

【００９６】有効投与量は、影響をモニターしながら、
低投与量の修飾ネオスポラ生細胞で始め、次いで、投与
量を増加させる、慣用的手段で決定することができる。
動物当たりの最適投与量を決定する場合には、多数のフ
ァクターを考慮に入れることができる。これらの中で主
要なものは、種、大きさ、年齢および動物の一般的状
態、動物内のその他の薬剤の存在、動物にワクチン接種
するネオスポラの特定の種または株の毒性、およびその
類似因子である。好ましくは、正確な投与量は、その他
の動物研究から得られた結果を考慮した後に、選択され
る。

【００９７】ワクチンレジメンもまた、上記の因子に基
づいて選択することができる。本発明のワクチンは、例
えば、その他の動物の間のネオスポラ症の発症のタイミ
ングを含む、様々な要素に依存して、特定の動物の生存
中の任意の時間に投与することができる。ワクチンは、
例えば、ネオスポラに関連する先天性疾病または流産か
ら防御するための生前ワクチンのように、離乳期あるい
はより若い動物に、またはより成熟した動物にも、投与
することができる。有効な防御には、最初のワクチン接
種のみを必要とすることができるか、または、一回また
はそれより多くの追加ワクチン接種もまた必要であるか
も知れない。適当な免疫防御に到達しているか否かを検
出する一つの方法は、ワクチン接種後の動物内のセロコ
ンバージョンおよび抗体力価を定量することである。好
ましくは、ワクチン接種のタイミングおよび追加接種の
数は、もしあれば、すべての関連要素の分析に基づい
て、獣医によって決定される。

【００９８】ワクチン内の修飾ネオスポラ生細胞の量
は、好ましくは、約１ｘ１０３から約１ｘ１０８／
ｍｌ、より好ましくは、約１ｘ１０５から約１ｘ１０７
／ｍｌ、の範囲である。適当な投与量の大きさは、約
０．５ｍｌから約１０ｍｌ、より好ましくは、約１ｍｌ
から約５ｍｌ、の範囲である。

【００９９】本発明のワクチンは、ネオスポラ症から哺
乳動物を防御するのに有用である。本明細書中で用いら
れるように、用語「哺乳動物」は、その他にもいろいろ
あるが、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマを含む、
本発明のワクチンを用いるとネオスポラ症から防御され
うる任意の哺乳動物の種をさす。ワクチンは、妊娠した
哺乳動物および妊娠前哺乳動物の両方を防御するのに有
用である。

【０１００】さらに、本発明は、ネオスポラ症に対する
ワクチンを哺乳動物に接種するためのキットであって、
免疫学的に有効な量の本発明の修飾ネオスポラ生細胞を
含む第一の容器、および獣医学的に許容しうるキャリヤ
ーまたは希釈剤を含む第二の容器を含む、前記のワクチ
ン接種用キットを提供する。キットの修飾生細胞は、凍
結型で保存し、投与前に解凍することができる。

【０１０１】生物学的物質の寄託以下の生物学的物質を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｕｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）
（１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡ）に１９９７
年１２月３日に寄託し、以下の寄託番号を割り当てられ
た。

【０１０２】ファージλＮｃｌＤＨＦＲＴＳ寄託番号２０９５１２すべての特許、特許明細書、および上記の文献は、その
全体をここに参照として採用する。

【０１０３】本発明は、本発明の個々の態様の単なる説
明として意図されたものであり、記載された具体的実施
態様によって、範囲を制限されるものではない。機能的
に等価な組成物および方法は本発明の範囲内にある。実
際、ここに示され記載された本発明の修飾に加えて、本
発明の様々な修飾は、前述の記載から当業者らに明らか
になるであろう。そのような修飾は、添付クレイムの範
囲内に入るつもりである。

【０１０４】

【実施例】以下の実施例は、実例となるのみであって、
本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

【０１０５】ネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の分離実施例１．Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍのＤＨＦＲドメインのエ
キソン１の増幅Ｔ．ｇｏｎｄｉｉのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のエキソン１
のＤＮＡ配列の５'および３'末端に特異的な２０−塩基
長のオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｔ．ｇｏｎｄｉ
ｉのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の公表された配列（Ｒｏｏ
ｓ、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，６
２６９−６２８０）に基づいて、設計し合成した。Ｎ．
ｃａｎｉｎｕｍＮＣ−１株のゲノムＤＮＡは、製造者
らによって提供された試薬およびプロトコールを用い
て、ＧＮＯＭＥＴＭキット（Ｂｉｏ１０１，ＬａＪｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を用いて、調製された。ＰＣＲは、０．
５μｇのゲノムＤＮＡ；１２０ｐｍｏｌのそれぞれのプ
ライマー、Ｔｇｄｈｆｒｅｘｏｎ１−５'（５'−ＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴＧＴＣＴ）（配列番号４）
およびＴｇｄｈｆｒｅｘｏｎ１−３'（５'−ＡＧＧＧＡ
ＡＧＡＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴ）（配列番号５）；
２．５ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗ
ａｌｋ，ＣＴ）；ＰＣＲバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）；ならびに１．５ＵのＡＭＰＬＩＴＡＱＴＭ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
で、遂行した。ＰＣＲサイクルは、９４゜Ｃで１分間を
１サイクル、および９４゜Ｃで１分間、５５゜Ｃで１分
間、７２゜Ｃで１分間を２９サイクル、行った。

【０１０６】約０．３ｋｂのＰＣＲ生成物を得、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてさらに処理することなく、
ｐＣＲIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｉｓ
ｂａｄ，ＣＡ）内にクローン化した。クローン化された
−０．３ｋｂフラグメントは、ジデオキシ鎖終止配列決
定法によって配列決定され、配列は、関連するＴ．ｇｏ
ｎｄｉｉのＤＨＦＲ−ＴＳエキソン１配列と＞８５％相
同であると決定された。

【０１０７】実施例２．ネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝
子のクローニングおよび配列決定Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍＮＣ−１株のライブラリーを、バ
クテリオファージベクターλＤＡＳＨＩＩ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）で作成した。上
からの〜０．３ｋｂフラグメントを、α−３２Ｐ−ｄＣ
ＴＰで放射能標識し、そして、プラークハイブリダイゼ
ーションによって、おおよそ５ｘ１０５ファージクロー
ンを、標識したフラグメントとの反応性について、スク
リーニングした。反応性クローンに富むスクリーニング
を３回繰り返した後、〜０．３ｋｂ配列と反応する１２
のファージクローンを同定した。

【０１０８】λ ＤＮＡ単離システム（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を製造者らのプロトコー
ルに従って用い、バクテリオファージλクローンＤＮＡ
を、１２の陽性クローンの内の３つから作成した。λＮ
ｃｌＤＨＦＲＴＳ（ＡＴＣＣ寄託番号２０９５１２）
（また、４Ｃ１３またはλＣＹ５０と名付けられる）と
名付けられた、λファージクローンの内の一つからのＤ
ＮＡを、Ｎｏｔｌで消化し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９、上記に記載の方法に従って、サブクローン化した
１１ｋｂのＤＮＡフラグメントを遊離させた。以下のオ
リゴヌクレオチド；ＤＨＦＲ−ＴＳ配列；５'−ＣＣＣ
ＣＴＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＡ（配列番号
６）；５'−ＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣ
ＴＧ（配列番号７）；５'−ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧ
ＡＴＧＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号８）；および５'−Ａ
ＧＴＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴ（配列番
号９）：と名付けられた：を用いて、１１ｋｂのＤＮＡ
フラグメントを含むプラスミドサブクローンのＤＮＡ上
で、ＰＣＲを行った。オリゴヌクレオチドは、以下の組
み合わせ：配列番号６および８；配列番号６および９；
配列番号７および８；ならびに配列番号７および９：で
ＰＣＲに用いられた。ＰＣＲにより、１１ｋｂフラグメ
ント内にネオスポラＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子の存在を示唆
する生成物が得られた。１１ｋｂフラグメントを含むプ
ラスミドサブクローンのさらなる制限分析から、−１．
５ｋｂの一つのＮｏｔｌ部位内に非対称のＨｉｎｄ III
部位の存在が示された。次いで、ジデオキシ鎖終止配列
決定法を応用したプライマーウオーキングによって、一
方の末端のＮｏｔｌ部位から他方末端のＨｉｎｄ III部
位まで（〜９．６ｋｂ）、ＤＮＡ配列を決定した。この
ようにして得られたＤＮＡ配列を、コンピューターソフ
トウェアプログラムＤＮＡＳＴＡＲＴＭ（ＤＮＡＳＴＡ
ＲＩｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、分析し
た。

【０１０９】上の配列決定したフラグメントの長さは、
９６０３ｂｐ（配列番号１）であり、Ｎ．ｃａｎｉｎｕ
ｍＮＣ−１株からのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子全体の配列
を含む。ネオスポラＤＨＦＲーＴＳ遺伝子のヌクレオチ
ド配列は、エキソンおよびイントロンの所在を予想する
ためにＴ．ｇｏｎｄｉｉのＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子ならび
にＤＨＦＲおよびＴＳドメインの境界の公表された配列
のそれと、比較された。ネオスポラのＤＨＦＲ−ＴＳ遺
伝子は、以下のように１０のエキソンおよび９のイント
ロンを含む；エキソン１、＜２４０５−２７２４；エキ
ソン２、３２１２−３３４８；エキソン３、３９２５−
４２６２；エキソン４、４４９１−４７３７；エキソン
５、５２１４−５３０７；エキソン６、５６７８−５７
５０；エキソン７、６１２９−６２７０；エキソン８、
６８５−６７７７；エキソン９、７２６４−７５７４；
およびエキソン１０、８１１６−＞８１９９：と予想さ
れる。共通スプライスシグナルは、イントロン−エキソ
ン結合部に存在する。予想されたＤＨＦＲドメインは、
公表されたＴ．ｇｏｎｄｉｉのＤＨＦＲ−ＴＳ配列との
構造類似性に基づいて、約ｎｔ２４０５から約ｎｔ４６
６４迄であり；予想されたＴＳドメインは、約ｎｔ４６
６５から約ｎｔ８１９９迄である。

【０１１０】Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍＮＣ−１株からのＤ
ＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコードする予想されたオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、長さ１，８３９
ｂｐ（配列番号２）である。予想されたＤＨＦＲドメイ
ンをコードするＯＲＦは、約ｎｔ１から約ｎｔ９６９迄
である。予想されたＴＳドメインをコードするＯＲＦ
は、約ｎｔ９７０から約ｎｔ１８３６迄である。Ｎ．ｃ
ａｎｉｎｕｍＮＣ−１株のＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質
の推定されるアミノ酸配列は、長さが６１２のアミノ酸
（配列番号３）である。予想されたＤＨＦＲドメインを
含むと推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基が約１
からアミノ酸残基が約３２３迄であり；予想されるＴＳ
ドメインを含むと推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸
残基約３２４からアミノ酸残基約６１２迄である。配列
分析は、Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍの推定アミノ酸配列および
推定のＴ．ｇｏｎｄｉｉＤＨＦＲ−ＴＳ配列の間で
は、ＤＨＦＲドメインで７３アミノ酸の差を、ＴＳドメ
インで１５アミノ酸の差を示す。

【０１１１】

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Krishnan, B. Rajendra Yoder, S. Christine Durtschi, Becky A. <120> DNA ENCODING NEOSPORA DIHYDROFOLATE REDUCTAS
E THYMIDYLATE SYNTHASE. <130> DHFRTS <140> <141> <150> 60/067,507 <151> 19971204 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 beta <210> 1 <211> 9603 <212> DNA <213> Neospora caninum <220> <221> gene <222> (2405)..(8199) <400> 1 gcggccgccg gcacaatgcc gagggcagcg cagggaaaaa ccggtcgaag ctgcttcacg 60 tgtctgaaaa tagagccagc gctactgtcg cttcaaagaa cgagacttcc gcgccacaaa 120 tcggtagtga cggtggccgg aagcgaaaat tttacgacga gcagctgcca gtcggtgtgt 180 accgtcacca gcagaagtat gtcgcgaact gggtagatcc gaaaacccgg agacaaatca 240 aggtctgttt ccccatcgac gtgtggggag actctcaagc tcgcaacatg gctgccgttg 300 cgaggcgtga gcgctgcgtg gatgttgacg aggtggctgc tattttcaat cgtgaagagc 360 gcaccaagac atcaggacgt catccgagtc cttcgaggga tgacagcaaa cagacagcgt 420 ctttcaatag tgctgttagg atgccagcag tccagggtgt ggattcaaaa acggagacgc 480 actcggctcc ggcgctcgaa agcgcgtaga gcctgaggcc acaccacttc tggttttcag 540 agagggcgtc gcactcacaa tttttttcga cttctttccg cacactgggg ccgtgtgctc 600 gaacactttt tatccgtgtg accatgtgcc cgaacacttt ttatccgtgt gaccatgtgc 660 ccacgaacgc ggcgaggctt ccctgtgctc gtggatttta ttgagtgatt ttcttgtata 720 cagaaaacct gtttcgtttt gctgccagtc ttcacatacg cttgcaagca gagcgtgagt 780 agggggggtt ccttgggaga gagcgcgaaa ggcgactttt tttatgacca gcgagagcgc 840 cgcagcagca caacgatcag aaaacacttg ggacaaattg gctctcgcca gggagaagtt 900 gataactaaa ctgcagtgga gaatccaaga tgcgaacgca gcctgcaaaa acatggcttc 960 agagctgcat gttcctttga tttaacgtgc acaccttgtc gtgcaaggtg ggcatcactg 1020 agggacttcg ccatcccgcg tactcgtcgc agcagtgcca cgcttctccg ggcgtccact 1080 gggccgaagt ttaatcgggc ggatcccaag ttaccgtcaa gtcccaaatc ttcagctgtt 1140 tgcaggaagg ttgctccgca cttgggtact gccgtgagaa gcagcggttc actgtgctgc 1200 gtcacctcgt ccacaggaac agacacactg gagctatgtc ggtggaccgg ctgcgtattc 1260 gatgaggttc agctgcggtc gttgcagagc tgcttttccc tcttgccaag acgatacgaa 1320 tagagtgtag cggaaggcac tgtacccaga agcattcagt tgcgctgttt cggatttcag 1380 tcgacacaga tctgttcgcg aacgacggcc ccgcagatct tgtgcccctg actcgggact 1440 cgtacagaag gcggttcgac gacgtttaga tgcgggcgac aagaattcgt gtcttaactt 1500 gctttcagcc tggtgtctac gtgccaaagt tcgctgaccg aaaagtcacc acggaagtgg 1560 attgctacgc agtcatatgc ccgatgccca ctccactgtg ctctttccgc agtgcttcgc 1620 cgccgaaaaa acgaggcgac tccggtttgc tccgtcctgc tccacaaaac tgaaggttcc 1680 tcagaccctt tagagactca aaacgcagcc tccaggacga ccgacgcgca gaagaaacca 1740 gcacgccact gctctctccg cctccagcgt gtctttgtgt ctcgtggcac ggcggtcggt 1800 ggttccgcct gcgtctcgcc ttttcgcgtt ccctgtctca gcgtgaacac catcactaca 1860 cccaccgcca gtgctagaac tggtccgaca ctctttcttc ctccaacgag cgcttcatta 1920 ggtcctttgt ttttcgacac tgcaaacttg cgtggttttt cacttcgcac gcggaagacc 1980 cgaacctgga ctgccgccgc ttgcacacta tagcggcctc gtctgccgtc tccgtcggag 2040 cctcccccct cgtcaacttt acggtccggt gccgcgaaag cgcatttggc gaatatatct 2100 ccggaaactc cacgcttttt aaagccgtca ggctctcttc gttcttctcg tcgagctcgt 2160 tttctctgct tccttgactt gcttcgatct gcgcatcttc ctactcctcc ctggcccgtt 2220 aaacttcgag acaagggacg aggtgtgcac atctttcgct tgatacccaa ctctccccgg 2280 cttcgtgctg accgttttcc acttttacct cacggcaatg ccgagcgcgc ctctgagtgc 2340 ggctgggacg ggtgaagttg gaccgtctgt tgccgttcca actcgtggag ttgtgcagcg 2400 aaacatgcag aaaccagtgt ctcttattgc cgcgatgacc cccaggaggg gcatcggcgt 2460 caacaacggc ctgccatggc cccacttggc cacagatttc aaacactttt ctcgcgtgac 2520 gaaaacgacg gccgacgaag tctctcgcct gaacgcatgg cttccgaaaa aaattgccaa 2580 gacgggcgat tcgggacttc cctctcccgc cttcggtgtc aacagattca acgctgttgt 2640 catgggacga aaaacctggg agagcttgcc gctaaaattt cgtcccctcg tggaccggct 2700 gaatatcgtg gtttcctcct ccctgtaagc acacggcgca ggcgatgtgt ctgtgcgctc 2760 gcgacgtctc cgtgcgtgcc aagagactgg acgattccct ctgaaaagcc ttcgccggct 2820 ccattcctcg tagacgaacc acaaaccgcg agtgcgcttt cctcggagag aaaggccgca 2880 cgtctggatg caacacactg gggggactgc gatcgtatgt cctgataacc gaaatccgga 2940 aggctgactg aagacgcact ggcgttcgca aacatttctc catcgcttcg cgtggaccgg 3000 tgaacctgct ctctgcacaa ccagactcgt ggttcctacg ttgctgagca cggctgcata 3060 tatatatata tatatatata tacatacgca tatgcgtata gaggttcccg cccgaagcgt 3120 gcttctgtcc gtcttccgtc cctgctgtcc tcccatcgcc atctccattt cctacgtgtc 3180 tttcgtcctt cccttgttca acggttgtca gcaaagaaga agacatcgcg gcggagaagc 3240 ctctagtcga aggccagcaa cgcgtgcgag tctgcgattc actccccgca gccctgcgcc 3300 ttgtggacga agagtacaga gagtctgttg accagattta tgttgtgggt aggtgtgcca 3360 agagcggcac agattcctct ctcgctcaga agtgcctggc aactgatctg cggcacgcgc 3420 cgcggatccc gatgcacatt gaggcttcgt gtacatactc cctgcgagct accagagggg 3480 ctgagaatct ccagataagc gtatatttct atgtgtttat gcatagatat ttagaacagg 3540 ctgaggagat gcggggaagg ctgacactga cggaatgcct tgccgcccac cagcagagga 3600 aggcggatgg ggacaacggc atgcagcctg ggacagcggc tgattcacgc cgacagcgca 3660 gcccccgacg tcggtgaagc gtctcgaccg ccttttttgg cgcgcctctc cgttccttct 3720 ttcgcccacg gcttcgtttc tctccattcc cactgcgtgt tggagcccgt ccgtccagtc 3780 tctctcagtt ctcttctttc ccttcagttg ctgtactctt ttcgccgtgc tccagttcct 3840 tgcgttgtgg ccttttccgc tcttcctatt ggcgtctcgc atccattgcg ttttctcggg 3900 tggtatccct ccgcctgcct tcaggaggag cggggctcta tgaggaagcc ctgtctctgg 3960 gcgtggtgtc tcacctctac atcacccgcg tggcgcgtga ctttccatgc gacgttttct 4020 ttcccgcttt ccccggagac tccattcttt caaacaagca ggcggcctcc gcgagtcagc 4080 cttcggctgc tgcggaaccg gtgtttgttc cgttttgccc ccagctcggg agagagaaga 4140 gcaatgaagc gtcgtaccga cccatcttta tttcaaagac ctactcggac aacggagtgc 4200 cctacgactt tgtggttctt gaaaaaggga ggaaggctga cgcttgcagc gccacggaat 4260 cggtaagtgg ctacggaggg gaaaagacga gagaaagagc gggcatccgg aacgagtgtc 4320 gcgaggcgac gttccatgcg tatccaagag agagggaaga gggaacacgc agcttgaggg 4380 gtaagctacg cgctcttttc ttttctccgt ggccgcggga gacgccgtaa agatggtgca 4440 aggacgcgca cgggcgtttc gccgttttcg gtttctgtcc actcttccag tgcgagcttc 4500 gcggcccttg gacctccacc ggagagacgt cgccagagac gaggcttccg tcttcctccg 4560 cctcagccgt tgcccaggtg ttggcttgga tggccgacga agaccggaaa aaatgcgaga 4620 agaaagaaat cattcgggca gtgcctcacg tccactttcg gggccacgaa gaattccagt 4680 acctcgacct cattgccgat attatcaaca acggagcgac aatggacgac cgaacgggta 4740 aacgcgacca cgggaaggca tcccgttcat gcggggctgt ctgctgagcc tcggttcctt 4800 cttccgcgct gtgcggcttt cccctggggt ctttgcttct ctctgttcgc cgccttgcct 4860 gccacatttt cccttcattt tttttctctg tctcccttgc tcttttgtcc taacgttcgt 4920 actcgccttc gtctcgcagt ccacgcttca aaacagacgg gctaccgaaa cgtgttttcc 4980 ctctgcacgg cctttttcac acgccgttgt cgcttgactc tcgctgacgc ggggtttgcc 5040 gcttcctgga agaaagaagg cctttcctca tctgttcgcc cttttcgctg tttcacagaa 5100 agacgagaga gattccgtct ccattttctc aattcgcgtt tcgtgcccca agcagatgtg 5160 ccctgatctg gaggctcttc gccgctcccc ttctcccctg tcgctgcttt caggcgttgg 5220 agtcatctcc aagttcggct gtaccatgcg gttctcgctg gataaggcct tccctctcct 5280 caccacaaag cgtgtgttct ggaaagggta cggcgcccta cagaaatctg tatatattta 5340 acaggcacat gtgtgcgtgt ctgacctgca cacgtgttca taaacgtgca cgcaattgta 5400 tgtggctgcc gtggagtcgt ccacgaacag gaaatattca catgcatgca ctctacagac 5460 gtgcctggac tgcttctcta ccttcgtttg tctgtttatt tgctttaatt tcgcccggtg 5520 accgtcgcgc ctctgtctga ccgtgcattt gcttgcgtct catcgtagtg tgcgtatcga 5580 agacgagaga gcatgtgacg ctgttgtcta tgccgagtac gagaagtccg cacgacggtc 5640 gctgaacgat gttcttttcc gtgtgggttg ctctcagagt cctcgaggag ctgttgtggt 5700 tcatccgcgg tgacacgaac gcgaatcacc tctctgaaaa gggcgtaaag gcaagtcttc 5760 aagcaccgct gctctcgttc aggctcctcc gcagacttgg cgctttcctt cgcggcgtca 5820 cccctccgag gcttcacgct tacattgagt gtacccgttt gtcttctaga ccgtctgctg 5880 cgtttgcagg cccccgcgtg agtgtaggcc cttcatcgtt gagtgtggcc gtagctttgc 5940 gcgacgaaga cagtcgatag gcctttcaga gcacgttcct tctgtctccc gttttccccg 6000 tttttttccg tgtcttcctc tgacagcctc gcacggctca catcccctct gagccgggac 6060 agggctcgcc taaggcagag taccacgctc cgtaacttcc ggcatgcgtt tctgggtttt 6120 cgttttagat ctgggacaag aatgtgacaa gagagttcct tgattcacgc aatctttccc 6180 accgagaggt cggagacatc ggcccgggtt acggcttcca gtggagacac ttcggcgcga 6240 cctacaagga catgcacacg gactacactg gtatgtcccg gcgttctttg aggggggaag 6300 ggaaagcagc cgaacccgcg aaacggcgct gatgcctgtt ctcgcttcgt gtgctggacc 6360 gaccgttcca gccatatcgc aggtttcaat agccgccaca aacggagatg aaaatgcaag 6420 gcgacgactc tgcgctcgcg cacaactggt gacagacgcc actccgtgtg gacgaattcg 6480 gttgcaaact gccaagcgat gaaagggccg tcgggtggta actccgtgcc cgggcgcttg 6540 cacacaaata cccgtgtgtg tgtgtgtgtg cgtatgttga tgcaaagata cccctacgtg 6600 tgcatgtgta catacacgtg agaaattggt gcccgtcgtt gaaaaatgct cactcccatc 6660 cctcctggcg ttgcccattt gcaggtcagg gcgtagacca actgaagaag gtgatcaaca 6720 tgctgagaac gaatccaaca gaccggcgca tgctcatgac cgcttggaac cctgcgggtg 6780 agatctctgt cttcaatctc tcctttccag ataatacgtg catttcaact ggaagctctt 6840 acacagccgt gtgcacaacg ggaagacgct gacacatacg tgttggtccc cccaacgtta 6900 tcttccgtgc cgtatctgtg tggctgctcc tctaaggtta ttgcgccgtg gtgatgtctc 6960 tcgtatctcg tctgtgcttt tcgctggatg cctctgtgcc tagacatctc aaagtgtccc 7020 tcccgtgtgg ggtcccgcga aacacttgcc actggccttt tcgcctcttg ccgctgtcgt 7080 ctgttcctcg ggattcccta ctcggggacc tgccggtttc agtgcctttc ctccgcgggt 7140 gcttcttccc ccgtcctcgc gccttgtgtt tctttgccgt ggcgactgcg ccgccgtgca 7200 tgctgctcac ttccccccgt gcgcgtgtgt tttgtcctcg ccgtctctct ctttcccgtt 7260 cagcgctgga cgaaatggcg ttgccgcctt gccacttgct gtgtcagttc tacgtggaga 7320 acgacagaga cttgtcttgc gtcatgtatc agcggtcctg cgacgttggc ctcggggtgc 7380 cgttcaacat tgcgtcctat tcccttctga cgctcatggt tgcgcacgtc tgcaacctga 7440 agccgaagga gttcattcac ttcatgggca acacgcacgt ctactcgaac cacgtcgagg 7500 ccctgaagga gcagctgcgc agagaaccga gacctttccc catcgtgaac atcctgaaca 7560 aggaacgcat ccaggtgcga agcaactggg aaggaaacgg cacaacggac acgcaaacaa 7620 gcagaagagg cgaaacggac gacggcagcc gaggccccgg ccactgcgag ccgagcgcag 7680 acacgctgct tccagccggc ctatattcgg aaagaaaggg acagtgtcga agggagcaca 7740 cgagacgcaa caacgaaaag gaaacgcgat gcgtcgcaga tcggctcacc tatgtggtgc 7800 gcggtgcggc gcccagatgg cgcggctgca gcgctcgaag gaagactgtc tttgggtgcg 7860 tgtgaacgtt tgtccctgac gcgcggctga cagaacatga gagggctttt ttctgtgttg 7920 cacgctctcc ggatgcatct ctttctgtgc cacgggaagc aaagacgtgt gtgttccccg 7980 ggaattcgga aaagacccga gcatccgctg ccggcgatgg ggggggaggg gccgggcatt 8040 ggatgcctcc cgcctcgtct tgtcgacggc cccaaaaccc gtcagtgcca cgttgtttgt 8100 gagtgtgttc gccaggaaat cgacgacttc accgccgagg atttcgaggt cgtgggctac 8160 gtgccgcatg gacgaatcca gatggagatg gctgtttagt ggaaaaatct gaaatatata 8220 tatatatata tatatatata tatatatagg ttcctggttt tgcaccgttt tttcttctcc 8280 ctccgaaggc attggtgaga gagcggtgga tgcgagggcg ctgaggccaa ttcagcggct 8340 gtttggtccc tcggggaagc aagaaacggg tttcgcttcg cctcgttgct ttccgaaaca 8400 accttaccgc gtttcaaagt cttttctctt tgtcaatgag cgccactact ttgtgggagt 8460 cacgaatgtg cgcgtatccg gccttgtatg gaggtgcggc tgccgcgctc gtcgccggaa 8520 cgctggactg tctgttgctt tcggggcctc tggcgtgctg cggcgtgggc gggggagtgg 8580 caggcgctac ccccccgtcg gtcctcggtg tgcttttgac tcttggcgag tgcgtgaaac 8640 ctaaatctcg acttgtttcg ctcgataagc tgcacactga gcactgaaga gttccccgca 8700 cattatgagg ccgcgcgctc tttcgcgcct ggcacacacg cctaacacag ggtagctgcc 8760 tgataaactg cctatcgcca ccaagggagc tgcctagcca agttgtcggt ggacaaaagt 8820 cctcacacgc cccgcagacc cggaagcaca cgtttcagag accaccggaa atgcatagtt 8880 cttcgtgccc tcgtcgttaa atacgtttcc tgtctcgtct gctggttttt gcttcgtgcg 8940 ttcgctcgcg ctaagatgtc tagaaacggt ggacgccgtt tgcggctctc tctgccgccc 9000 ttccgctgtg acttttccga cctgacctca cgcgcgtgtt ccacgtgaga caaccggtcg 9060 gcggccgagg caggagactt gcgagaaagg aaacaagtcg gatgcacgaa cgtacgtaac 9120 cccgcctcca aagttccccg ctccaaagag gaacgcggcg aggcgactcc tccggcgttg 9180 cctacctcgc ctccacgcct aaagaggact gcagtgggtc gacgctcccg tccgcattgt 9240 aaaaaagggg aaacaagacg agattcacgt ggaagaacca gaaacaacac cgaagcgacg 9300 ctgtcaatcc ccacgggcgc gcagccttct cccgaccgca ctccgccgca tgcaagagcc 9360 ctcgagtgct cccccgcagc tggcctttcc ctgtcgcctt ggaagcagag tgaacacaaa 9420 gagcagagac tagccagggc gaggaagcct cagaaaaact gacggcgagg aacggcagtc 9480 cgccggaaac aggggaaggc agacggcgaa tccgccgccg aagagaggac aaaaagagaa 9540 gaaaaaaggc aaccgcgtgc cgaaaactgg gtaacgggac gacaggcagg aggcataaag 9600 ctt 9603 <210> 2 <211> 1839 <212> DNA <213> Neospora caninum <220> <221> CDS <222> (1)..(1839) <400> 2 atg cag aaa cca gtg tct ctt att gcc gcg atg acc ccc agg agg ggc 48 Met Gln Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala Met Thr Pro Arg Arg Gly 1 5 10 15 atc ggc gtc aac aac ggc ctg cca tgg ccc cac ttg gcc aca gat ttc 96 Ile Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe 20 25 30 aaa cac ttt tct cgc gtg acg aaa acg acg gcc gac gaa gtc tct cgc 144 Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg 35 40 45 ctg aac gca tgg ctt ccg aaa aaa att gcc aag acg ggc gat tcg gga 192 Leu Asn Ala Trp Leu Pro Lys Lys Ile Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly 50 55 60 ctt ccc tct ccc gcc ttc ggt gtc aac aga ttc aac gct gtt gtc atg 240 Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly Val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Met 65 70 75 80 gga cga aaa acc tgg gag agc ttg ccg cta aaa ttt cgt ccc ctc gtg 288 Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val 85 90 95 gac cgg ctg aat atc gtg gtt tcc tcc tcc ctc aaa gaa gaa gac atc 336 Asp Arg Leu Asn Ile Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp Ile 100 105 110 gcg gcg gag aag cct cta gtc gaa ggc cag caa cgc gtg cga gtc tgc 384 Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln Arg Val Arg Val Cys 115 120 125 gat tca ctc ccc gca gcc ctg cgc ctt gtg gac gaa gag tac aga gag 432 Asp Ser Leu Pro Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu 130 135 140 tct gtt gac cag att tat gtt gtg gga gga gcg ggg ctc tat gag gaa 480 Ser Val Asp Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Gly Leu Tyr Glu Glu 145 150 155 160 gcc ctg tct ctg ggc gtg gtg tct cac ctc tac atc acc cgc gtg gcg 528 Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr Ile Thr Arg Val Ala 165 170 175 cgt gac ttt cca tgc gac gtt ttc ttt ccc gct ttc ccc gga gac tcc 576 Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser 180 185 190 att ctt tca aac aag cag gcg gcc tcc gcg agt cag cct tcg gct gct 624 Ile Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala 195 200 205 gcg gaa ccg gtg ttt gtt ccg ttt tgc ccc cag ctc ggg aga gag aag 672 Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys 210 215 220 agc aat gaa gcg tcg tac cga ccc atc ttt att tca aag acc tac tcg 720 Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Ile Ser Lys Thr Tyr Ser 225 230 235 240 gac aac gga gtg ccc tac gac ttt gtg gtt ctt gaa aaa ggg agg aag 768 Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys 245 250 255 gct gac gct tgc agc gcc acg gaa tcg tgc gag ctt cgc ggc cct tgg 816 Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp 260 265 270 acc tcc acc gga gag acg tcg cca gag acg agg ctt ccg tct tcc tcc 864 Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 275 280 285 gcc tca gcc gtt gcc cag gtg ttg gct tgg atg gcc gac gaa gac cgg 912 Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala Asp Glu Asp Arg 290 295 300 aaa aaa tgc gag aag aaa gaa atc att cgg gca gtg cct cac gtc cac 960 Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu Ile Ile Arg Ala Val Pro His Val His 305 310 315 320 ttt cgg ggc cac gaa gaa ttc cag tac ctc gac ctc att gcc gat att 1008 Phe Arg Gly His Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu Ile Ala Asp Ile 325 330 335 atc aac aac gga gcg aca atg gac gac cga acg ggc gtt gga gtc atc 1056 Ile Asn Asn Gly Ala Thr Met Asp Asp Arg Thr Gly Val Gly Val Ile 340 345 350 tcc aag ttc ggc tgt acc atg cgg ttc tcg ctg gat aag gcc ttc cct 1104 Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phe Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro 355 360 365 ctc ctc acc aca aag cgt gtg ttc tgg aaa gga gtc ctc gag gag ctg 1152 Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu 370 375 380 ttg tgg ttc atc cgc ggt gac acg aac gcg aat cac ctc tct gaa aag 1200 Leu Trp Phe Ile Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys 385 390 395 400 ggc gta aag atc tgg gac aag aat gtg aca aga gag ttc ctt gat tca 1248 Gly Val Lys Ile Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser 405 410 415 cgc aat ctt tcc cac cga gag gtc gga gac atc ggc ccg ggt tac ggc 1296 Arg Asn Leu Ser His Arg Glu Val Gly Asp Ile Gly Pro Gly Tyr Gly 420 425 430 ttc cag tgg aga cac ttc ggc gcg acc tac aag gac atg cac acg gac 1344 Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp 435 440 445 tac act ggt cag ggc gta gac caa ctg aag aag gtg atc aac atg ctg 1392 Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val Ile Asn Met Leu 450 455 460 aga acg aat cca aca gac cgg cgc atg ctc atg acc gct tgg aac cct 1440 Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Arg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro 465 470 475 480 gcg gcg ctg gac gaa atg gcg ttg ccg cct tgc cac ttg ctg tgt cag 1488 Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln 485 490 495 ttc tac gtg gag aac gac aga gac ttg tct tgc gtc atg tat cag cgg 1536 Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Ser Cys Val Met Tyr Gln Arg 500 505 510 tcc tgc gac gtt ggc ctc ggg gtg ccg ttc aac att gcg tcc tat tcc 1584 Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser 515 520 525 ctt ctg acg ctc atg gtt gcg cac gtc tgc aac ctg aag ccg aag gag 1632 Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu 530 535 540 ttc att cac ttc atg ggc aac acg cac gtc tac tcg aac cac gtc gag 1680 Phe Ile His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val Glu 545 550 555 560 gcc ctg aag gag cag ctg cgc aga gaa ccg aga cct ttc ccc atc gtg 1728 Ala Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro Ile Val 565 570 575 aac atc ctg aac aag gaa cgc atc cag gaa atc gac gac ttc acc gcc 1776 Asn Ile Leu Asn Lys Glu Arg Ile Gln Glu Ile Asp Asp Phe Thr Ala 580 585 590 gag gat ttc gag gtc gtg ggc tac gtg ccg cat gga cga atc cag atg 1824 Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ile Gln Met 595 600 605 gag atg gct gtt tag 1839 Glu Met Ala Val 610 <210> 3 <211> 612 <212> PRT <213> Neospora caninum <400> 3 Met Gln Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala Met Thr Pro Arg Arg Gly 1 5 10 15 Ile Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe 20 25 30 Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg 35 40 45 Leu Asn Ala Trp Leu Pro Lys Lys Ile Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly 50 55 60 Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly Val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Met 65 70 75 80 Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val 85 90 95 Asp Arg Leu Asn Ile Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp Ile 100 105 110 Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln Arg Val Arg Val Cys 115 120 125 Asp Ser Leu Pro Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu 130 135 140 Ser Val Asp Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Gly Leu Tyr Glu Glu 145 150 155 160 Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr Ile Thr Arg Val Ala 165 170 175 Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser 180 185 190 Ile Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala 195 200 205 Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys 210 215 220 Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Ile Ser Lys Thr Tyr Ser 225 230 235 240 Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys 245 250 255 Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp 260 265 270 Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 275 280 285 Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala Asp Glu Asp Arg 290 295 300 Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu Ile Ile Arg Ala Val Pro His Val His 305 310 315 320 Phe Arg Gly His Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu Ile Ala Asp Ile 325 330 335 Ile Asn Asn Gly Ala Thr Met Asp Asp Arg Thr Gly Val Gly Val Ile 340 345 350 Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phe Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro 355 360 365 Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu 370 375 380 Leu Trp Phe Ile Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys 385 390 395 400 Gly Val Lys Ile Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser 405 410 415 Arg Asn Leu Ser His Arg Glu Val Gly Asp Ile Gly Pro Gly Tyr Gly 420 425 430 Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp 435 440 445 Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val Ile Asn Met Leu 450 455 460 Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Arg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro 465 470 475 480 Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln 485 490 495 Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Ser Cys Val Met Tyr Gln Arg 500 505 510 Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser 515 520 525 Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu 530 535 540 Phe Ile His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val Glu 545 550 555 560 Ala Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro Ile Val 565 570 575 Asn Ile Leu Asn Lys Glu Arg Ile Gln Glu Ile Asp Asp Phe Thr Ala 580 585 590 Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ile Gln Met 595 600 605 Glu Met Ala Val 610 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 4 atgcagaaac cggtgtgtct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 5 agggaagagg aaacgacgat 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 6 cccctcgtgg accggctgaa ta 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 7 tccgtgcgtg ccaagagact g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 8 atggagatgg cgatgggagg ac 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 9 agtatgtaca cgaagcctca at 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者スーザン・クリスチーン・ヨーダーアメリカ合衆国コネチカット州06420, セーラム，ミュージック・ヴェール・ロード 163 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 35/66 A61K 39/002 C07K 14/44 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪＭＥＤＬＩＮＥ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号３のアミノ酸配列を含む、ネオ
スポラＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】配列番号１のｎｔ２４０５からｎｔ８１
９９までのヌクレオチド配列、または配列番号２のヌク
レオチド配列を含む、請求項１の単離ポリヌクレオチド
分子。
【請求項３】単離ポリヌクレオチド分子がトキソプラ
ズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉ
ｉ）からのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を持たない場合、適度に厳しい条件下で配
列番号１のｎｔ２４０５からｎｔ８１９９までのヌクレ
オチド配列、または配列番号２のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、
単離ポリヌクレオチド分子がネオスポラ感染動物の液体
または組織試料中のネオスポラ特異性ポリヌクレオチド
の存在を検出することができる単離ポリヌクレオチド分
子。
【請求項４】非常に厳しい条件下で配列番号１のｎｔ
２４０５からｎｔ８１９９までのヌクレオチド配列、ま
たは配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレ
オチド分子の補体にハイブリダイズする請求項３の単離
ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】単離ポリヌクレオチド分子がトキソプラ
ズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉ
ｉ）からのＤＨＦＲ−ＴＳタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を持たない場合、少なくとも３０％の (a) 配列番号３のアミノ酸配列を含むネオスポラＤＨＦ
Ｒ−ＴＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド分子； (b) ｎｔ２４０５からｎｔ８１９９までの配列番号１の
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子； (c) 配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チド分子； (d) ｎｔ２４０５からｎｔ４６６４まで、またはｎｔ４
６６５からｎｔ８１９９までの配列番号１のヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド分子； (e) ｎｔ１からｎｔ９６９まで、またはｎｔ９７０から
ｎｔ１８３６までの配列番号２のヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド分子；または (f) ｎｔ１からｎｔ２４０４まで、またはｎｔ８２００
からｎｔ９６０３までの配列番号１のヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子；である、ヌクレオチド配列から成る単離ポリヌクレオチ
ド分子。
【請求項６】配列番号３のアミノ酸残基１ないし３２
３または配列番号３のアミノ酸残基３２４ないし６１２
をコードするヌクレオチド配列から成る、請求項５のポ
リヌクレオチド分子。
【請求項７】配列番号１のｎｔ１からｎｔ２４０４ま
で、またはｎｔ８２００からｎｔ９６０３までを含む、
単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項８】請求項１ないし７のいずれかのポリヌク
レオチド分子を含む、組み換えベクター。
【請求項９】ポリヌクレオチド分子が配列番号１のｎ
ｔ２４０５からｎｔ８１９９までのヌクレオチド配列を
含む、請求項８の組み換えベクター。
【請求項１０】ファージλＮｃＩＤＨＦＲＴＳ（ＡＴ
ＣＣ寄託番号２０９５１２）である、請求項９の組換え
ベクター。
【請求項１１】請求項８の組換えベクターを含む形質
転換宿主細胞。
【請求項１２】配列番号３のアミノ酸配列を含む実質
的に精製されたタンパク質。
【請求項１３】配列番号３のアミノ酸残基１ないし３
２３または３２４ないし６１２を含む実質的に精製され
たタンパク質。
【請求項１４】請求項５のポリヌクレオチド分子を含
む遺伝子構築物であって、該ポリヌクレオチド分子はネ
オスポラ（Neospora）細胞に導入された場合、相同組み
換えによりＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子またはこの遺伝子の１
部分を無力化する能力をもつ上記構築物。
【請求項１５】適度に厳しい条件下で配列番号１のｎ
ｔ２４０５からｎｔ８１９９までのヌクレオチド配列、
または配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌク
レオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分
子を含み、該ポリヌクレオチド分子はネオスポラ（Neos
pora）細胞に導入された場合、相同組み換えによりＤＨ
ＦＲ−ＴＳ遺伝子またはこの遺伝子の１部分を無力化す
る能力を持ち、ただし、上記単離されたポリヌクレオチ
ド分子はトキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓ
ｍａｇｏｎｄｉｉ）からのＤＨＦＲ−ＴＳ蛋白質をコ
ードするヌクレオチド配列を持たない、遺伝子構築物。
【請求項１６】さらに、選択可能なマーカーを含む、
請求項１４または１５の遺伝子構築物。
【請求項１７】ＤＨＦＲ−ＴＳ遺伝子のＤＨＦＲドメ
インまたはＴＳドメインを破壊するのに有用である、請
求項１４または１５の遺伝子構築物。
【請求項１８】請求項１４または１５の遺伝子構築物
によって形質転換されたまたはトランスフェクトされた
ネオスポラ細胞。
【請求項１９】ｄｈｆｒ^-、ｆｓ^-およびｄｈｆｒ^-−
ｔｓ^-から成る群より選択された表現型を示す、請求項
１８のネオスポラ細胞。
【請求項２０】ネオスポラ修飾生細胞の調製法であっ
て、 (a)ネオスポラ細胞株の細胞を得； (b)上記工程(a)の細胞に適度に厳しい条件下で配列番号
配列番号１のｎｔ２４０５からｎｔ８１９９までのヌク
レオチド配列、または配列番号２のヌクレオチド配列か
らなるポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド分子を導入し；そして (c)前記ポリヌクレオチド分子の導入の結果として、ｄ
ｈｆｒ^-、ｔｓ^-およびｄｈｆｒ−ｔｓ^-から成る群より
選択した変異体表現型を示す、上記工程(b) からのネ
オスポラ細胞を選択することを含む前記調製法。