JP3238396B2 - 担体結合組換えタンパク質、その製造方法並びに免疫原及びワクチンとしての使用 - Google Patents

担体結合組換えタンパク質、その製造方法並びに免疫原及びワクチンとしての使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担体結合組換えタンパク質、その製造方法、
並びにその使用、特に免疫原及びワクチンとしての使用
に関する。
ヒト及び動物における免疫系の主な目的は、感染性ウ
ィルス、バクテリア、真菌、又は原生動物の変性細胞の
結果として生じる病原性損傷に抵抗し、かつこれを避け
ることである。免疫系の特別の性質として、病原体で繰
り返し感染した後に、より強い耐性が生じることが挙げ
られる。免疫感作の目的は、これに対応する疾病を引き
起こすことなく、特定の病原体に対する免疫系の力を構
築することにある。
抗体及び細胞性Ｔ及びＢリンパ球が病原体への特定の
耐性に関与する。このために本質的に必要なことは、バ
クテリア細胞上に存在するような外来の構造を認識する
ことである。免疫系の刺激に依存して、免疫感作後にこ
のような過程で病原体に対する一時的又は生涯の免疫が
構築される。
抗原に対する免疫応答が十分に起きることが、モノク
ローナル及びポリクローナル抗体の特性、及びワクチン
の有効性にとって重要である。しかしながら、ウィルス
抗原や組換えヒトタンパク質では、これらをさらに修飾
して用いない場合には乏しい免疫応答しか示さなかった
り、或いは全く示さないことがよくある。このために、
これらの病原は免疫応答を増幅する目的で担体（好まし
くはタンパク質）に結合することがよくある。しかし、
抗原を担体に結合することによって、抗原決定基の部位
やその近辺で抗原が変化することがある。その結果免疫
応答が実質的に弱められる。
免疫応答を改良するためには、このような抗原をバク
テリアの外膜に導入して、この複合体を免疫として使用
することが有利である（J.Immunol.139（1987）1658−1
664,バクテリアワクチン及び局部的免疫−Ann.Sclavor
1986,n.1−2,pp.19−22,Proceedings of Sclavo I
nternational Conference,Siena,Italy,17−19 Novem
ber 1986）。弱毒化又は死亡病原体（バクテリア又は
ウィルス）、病原体の処理した部分成分（バクテリアの
膜タンパク質、ウィルスの構造タンパク質）、又は組換
え生ワクチン（ウィルス又はバクテリア）もまた使用で
きる。
免疫感作のための免疫原として生存性バクテリア又は
ウィルスを用いる欠点は、好ましくない病原菌が広がる
ことを排除できないことである。
しかしながら、免疫原又はワクチンとして使用する前
に、バクテリア及びウィルスを殺したり、断片化するこ
とにより抗原決定基が変えられ、免疫応答を実質的に減
じる。従って本発明の目的は、これらの欠点を有しない
免疫原及びワクチンを提供することである。
この目的は、組換えタンパク質とともに、膜組込みの
できる少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタンパ
ク質ドメインをコードする融合タンパク質遺伝子と、バ
クテリオファージからの溶菌活性な膜タンパク質、溶菌
活性な毒素放出性タンパク質、又はそれらの溶菌性部分
配列をコードする遺伝子（以後、溶菌性遺伝子という）
とを、グラム陰性菌中で発現させ、次いで培養液から担
体結合組換えタンパク質を単離することによって得られ
る、担体結合組換えタンパク質によって達成される。
融合タンパク質遺伝子と溶菌性遺伝子の発現は、好ま
しくは２つの異なるプロモーターによってコントロール
される（図１）。溶菌性遺伝子の発現は、融合タンパク
質遺伝子の発現と比較して遅れるのが好ましい。
融合タンパク質遺伝子と溶菌性遺伝子とをこのように
発現させることによって、まず宿主生物として用いられ
るグラム陰性菌の膜中に多数の融合タンパク質が組込ま
れ、次いでバクテリアの溶菌が起こる。通常は不透過性
であるバクテリアの細胞壁複合体がこれによって極めて
透過性となり、バクテリアの細胞質成分が放出される
（Eur.J.Biochem.180（1989）,393−398）。細胞の形
態、例えば大腸菌細胞の桿菌形態は保持される。膜の局
在した領域にトンネル構造が形成されるだけである。ト
ンネル形成は、トンネルの端部における内膜と外膜の融
合を伴う。このようにして形成されるバクテリアコート
（外被）が組換えタンパク質の担体となり、これ以後バ
クテリアゴーストと呼ぶ（図２）。
バクテリアゴーストは細胞質（内）膜、ペリプラズム
空間及び外膜からなり、これによって細胞壁複合体の完
全性がおおむね保持されている。さらにＳ−層コート
（外膜の外側にある準結晶性タンパク層）を有するバク
テリア株の場合には、このタンパク層もまたバクテリア
ゴーストの成分である（Ann.Rev.Microbiol.37（198
3）,311−339）。従ってバクテリアゴーストは組換えタ
ンパク質（免疫原）の担体であり、その成分（ペプチド
グリカン、リポポリサッカライド）の故に、これらは同
時に免疫応答を増幅するためのアジュバントを構成す
る。
すべてのグラム陰性菌、好ましくは大腸菌、Bordetel
la pertussis,Campylobacter nijuni,Cornebacterium
diphteriae,Legionella pneumophilia,Listeria mo
nocytogenes,Pseudomonas,aeruginosa,Shigella dysen
teriae,Vibrio cholerae,Yersinia enteroliticaなど
のグラム陰性病原菌は宿主として適している（Schaecht
er,M,H.Medoff,D.Schlesinger,微生物病のメカニズム.W
illiams and Wilkins,Baltimore（1989））。
本発明の担体結合組換えタンパク質は、顕著な免疫応
答と高い抗体力価をもたらす免疫原として極めて適して
いる。
本発明の特に有利な点は、発現後に組換えタンパク質
がバクテリアの膜に直接組み込まれ、担体結合が形成さ
れることから得られる。その結果、このような組換えタ
ンパク質を免疫原の生産前に単離する必要がない。さら
に、数百から最大限可能な数（約50000）までの組換え
抗原がバクテリアゴーストの膜に組み込まれると、免疫
原を含むバクテリアゴーストの生産には十分であるの
で、組換えタンパク質の過発現は必要でなくなる。
本発明による方法のさらなる利点は、バクテリアゴー
ストの細胞壁複合体中には非常に多くの抗原エピトープ
が存在することである。組換えタンパク質のためのター
ゲット配列は、組込みのためにバクテリア細胞壁複合体
の中のある一定の領域を好むことが明らかとなった。こ
れらの領域は主として内膜及び外膜の固着部位を構成
し、バクテリアの細胞分裂と関連する。その結果、組換
えタンパク質は均一に分布していないが、細胞壁複合体
中でむしろ島のようになって蓄積する（図2d参照）。比
較的小さな領域に組換えタンパク質が集合する（房）
は、免疫グロブリンを担持しているＢ細胞の増殖が刺激
されるという利点を有している。他方、バクテリアゴー
スト中に存在するリポポリサッカライドはマイトジェン
として作用し、また細胞分裂のシグナルの引き金とな
る。その結果、Ｂ細胞特異的な免疫グロブリン生産の有
効な刺激を得ることができる。
さらに、本発明の担体結合組換えタンパク質は、その
天然のタンパク質構造で、つまり活性形でバクテリア膜
に組み込まれることが明らかとなった。
組換えタンパク質は原核生物で発現させた後、通常封
入体として不活性形で得られ（EP−Ａ−0219 874,WO
89/03711参照）、続いて変性及び再生により活性形に変
換されるので、このことは特に驚くべきことである。
組換えタンパク質としては当業者にとってなじみのあ
るすべてのタンパク質が適している。ヒトタンパク質及
び抗原、特にウィルス抗原を用いるのがとりわけ好まし
い。その大きさは限定されない。しかしながら、抗原の
分子量は好ましくは2000から200000ダルトンである。
組換え抗原は、ヒトウィルス及びレトロウィルス、例
えばHIV,HBV及びEBVなどの抗原構造が特に好ましい。
膜組み込みのできる疎水性で非−溶菌活性なタンパク
質ドメインはこれ以後ターゲット配列と呼ぶ。しかしな
がら、アミノ酸置換によって変更される膜タンパク質の
完全配列、又は部分配列もまたターゲット配列として好
ましい。しかし、このような変更は対応するタンパク質
の構造を変えるものであってはならない。
好ましく用いられるターゲット配列は、その他の膜タ
ンパク質のシグナル配列とは対照的に、膜中に存在する
プロテアーゼ（例えば、ペリプラズム空間のシグナルペ
プチダーゼ及びプロテアーゼ）によって切断されない。
ターゲット配列は、例えばPhiX174ファージグループの
溶菌遺伝子の天然の配列（Ｎ−末端ターゲットの場合）
および、MS2ファージグループの溶菌遺伝子の天然の配
列（Ｃ−末端ターゲットの場合）からタンパク質工学に
よって得ることができる。
Ｎ−及びＣ−末端側を各々２から30個の任意のアミノ
酸と隣り合わせ得る、14から20アミノ酸からなる疎水性
のアルファー螺旋タンパク質ドメインがターゲット配列
としてとりわけ適している。少なくともさらに１個のタ
ンパク質ドメインをこのタンパク質ドメインに結合する
ことが好ましい。この結合は融通のきくリンカー配列を
介して起こることが好ましい。融通のきくリンカー配列
とは、２から100アミノ酸、好ましくは２から30アミノ
酸を有し、かつ無秩序な２次構造（ターン及びランダム
コイル配列）を有する親水性のアミノ酸配列と理解され
る。
第１のタンパク質ドメインに結合する付加的タンパク
質ドメインは、第１のタンパク質ドメインと類似の構成
である。しかしながら、付加的ドメインのうちの少なく
とも１つがβ−プリーツシート構造を有しており、10か
ら16アミノ酸、好ましくは11から13アミノ酸からなるこ
とが好ましい。このようなβ−プリーツシート構造の構
築及び２次構造は、外膜のポーリンにある両親媒性タン
パク質配列と同様のものであることが好ましい。Ｎ−末
端ターゲットのためには、ファージPhiX174からのタン
パク質Ｅのアミノ酸１から54を含み、かつ溶菌的に作用
しないターゲット配列（以後Ｅ′配列と呼ぶ）を用いる
のが好ましい。Ｃ−末端ターゲットのためには、ファー
ジMS2からのタンパク質Ｌのアミノ酸21から75を含み、
かつ溶菌的に作用しないターゲット配列（以後Ｌ′配列
と呼ぶ）を用いるのが好ましい（配列についてはEP−Ａ
０ 292 021と比較されたい）。タンパク質の２次構
造の変更を引き起こさない、相同アミノ酸の置換によっ
て得られる、Ｅ及びＬターゲット配列の上記配列に由来
する配列もまた適している。
バクテリオファージの膜タンパク質とは、好ましくは
Microviridaeクラスのバクテリオファージからの膜タン
パク質、好ましくはイコサヘドラル（icosahedral）フ
ァージ、溶菌性ファージ、及び腸内細菌科（Enterobact
eriaceae）に感染することのできるssDNAを含むファー
ジからの膜タンパク質であると理解される。このような
ものの例としては、大腸菌Ｃ株に感染することのできる
ファージPhiX174,S13,G4,G6,G14,PhiA,PhiB,PhiC,PhiR
がある。大腸菌Ｃ株及び大腸菌Ｂ株に感染できるアルフ
ァ３もまた適している。大腸菌K12株に感染できるファ
ージK9,St−1,PhiK,PhiXtB及びU3もまた適している（Si
nsheimer R.L.（1968）:Prog.Nucl.Acad.Res.Mol.Bio
l.（Davidson J.N.＆ Cohn W.W.編集）Vol.8,Academ
ic Press,New York ＆ London,pp.115−169;Tessma
n E.S.＆ Tessmann I.（1978）:1本鎖DNAファージ
（Denhardt D.T.,Dressler D.＆ Ray D.S.編集）Co
ld Spring Harbor Press,Cold Sping Harbor,pp.9
−29;Hayashi M.,Aoyama A.,Richardson D.L.＆ Ha
yashi M.N.（1987）：バクテリオファージ,pp.1−7
1）。
溶菌的に活性な膜タンパク質としては、好ましくはコ
リシン溶菌タンパク質（Microbiol.Sciences １（198
4）168−175及び203−205）のようなその他の毒素放出
性蛋白質と同様に、上記のバクテリオファージからの溶
菌タンパク質が適している。
さらに好ましい態様においては、このタンパク質（所
望する場合には、これにさらにその他の物質を共有結合
的又は非共有結合的に結合する）のための非共有結合的
な結合パートナーが組換えタンパク質に結合される。そ
のパートナーが結合パートナーとして適しているような
結合ペアの例としては、ビオチンーストレプトアビジン
又はアビジン、ハプテンー抗体、抗原−抗体、コンカナ
バリンー抗体、糖−レクチン、ハプテンー結合性タンパ
ク質（例えば、チロキシン結合グロブリン及びチロキシ
ン）又はオリゴペプチドー抗体がある。
結合ペアとして用いるには、ストレプトアビジン又は
アビジンとビオチンが好ましい。ストレプトアビジン又
はアビジンが固定化組換えタンパク質として特に好まし
く用いられ、ビオチン化抗原がこれに結合される。
さらに、タンパク質は化学リガンドを認識する組換え
タンパク質として用いるのが好ましい。この例として
は、β−ガラクトシダーゼ/p−アミノフェニル−β−Ｄ
−チオガラクトシド（ラクトースの構造類似体）（Gene
29（1984） 27−31）が挙げられる。このような置換
産物が、基質を切断することなく、β−ガラクトシダー
ゼの活性中心の認識によって、バクテリアゴーストに結
合される。
本発明はまた、膜組込みのできる少なくとも１つの疎
水性で非−溶菌活性なタンパク質ドメインをコードする
第１のDNA配列（DNAターゲット配列）、組換えタンパク
質をコードする第２のDNA配列（DNAタンパク質配列）、
これとは別のコントロール下にあり、かつバクテリオフ
ァージからの溶菌活性な膜タンパク質又は溶菌活性な毒
素放出性タンパク質又はそれらの溶菌活性な部分をコー
ドするDNA配列（DNA溶菌遺伝子）を含む組換えDNAに関
する。
Ｌ′タンパク質又はＥ′タンパク質をコードするDNA
配列がターゲット配列として好ましい。同じ２次構造を
有するこれらのタンパク質に由来するアミノ酸をコード
するDNA配列もまた適している。これらの配列は好まし
くは、２から30アミノ酸を有し、かつ無秩序な２次構造
を有する親水性タンパク質ドメインをコードするDNA配
列により連結されている。
好ましい態様においては、DNA溶菌配列はＥタンパク
質のDNA配列、Ｌタンパク質のDNA配列、又はELハイブリ
ッドタンパク質のDNA配列を含む（配列についてはEP−
Ａ ０ 291 021を参照）。溶菌的に作用するそれらの
部分的配列もまた適している。
DNAタンパク質配列は、ウィルス抗原（例えば、HIV,H
BV,EBV）又は組換えヒトタンパク質のDNA配列が好まし
い。
本発明はまた、組換えタンパク質とともに、膜組込み
のできる少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタン
パク質ドメインをコードする融合タンパク質と、バクテ
リオファージからの溶菌活性な膜タンパク質又は溶菌活
性な毒素放出性タンパク質又はそれらの溶菌活性な部分
配列とを、グラム陰性菌中で発現させ、次いで培養液か
ら担体結合組換えタンパク質を単離することを特徴とす
る、担体結合組換えタンパク質の製造方法に関する。形
質転換及び発現は当業者に公知の方法によって実施でき
る。形質転換は好ましくはエレクトロポレーション又は
接合（conjugation）によって実施される。
発酵の間、溶菌タンパク質の活性は初めのうち阻害さ
れるか、或いは溶菌遺伝子の発現が抑制されるのが好ま
しく、阻害又は抑制は好ましくは後期対数期の所望の時
期に解除する。
さらに好ましい態様においては、このようにして得ら
れる担体結合組換えタンパク質を、所望する場合には誘
導体の形にした該タンパク質のための結合パートナーと
ともにインキュベートし、形成する複合体を単離する。
結合ペアのための上記したパートナーが結合パートナー
として適している。
さらに好ましい態様においては、少なくとも２つの異
なる組換えタンパク質の遺伝子が本発明によって発現さ
れる。このようにして複数の抗原構造を有する免疫原又
はワクチンが得られる。この関連では、組換えタンパク
質として異なるウィルス又はレトロウィルス（例えば、
HIV1,HIV2,HBV及びEBV）の抗原決定基を用いることが特
に好ましい。発現のためには、これらの遺伝子を発現ベ
クター中に、ターゲット配列のための遺伝子の後に３′
方向のオープンリディングフレームとして配置するか、
或いは発現すべきそれぞれの組換えタンパク質のための
特別のベクターを用いることができる。しかしながら、
この場合にはベクターはそれぞれ別の複製起点と別の耐
性遺伝子とを備えている必要がある。
本発明はまた、組換えタンパク質とともに、膜組込み
のできる少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタン
パク質ドメインを含む融合タンパク質を、所望する場合
にはバクテリオファージからの溶菌活性な膜タンパク質
又は溶菌活性な毒素放出性タンパク質又はそれらの溶菌
活性な部分配列の遅れた発現とともに、グラム陰性菌中
で発現させることによって得られる担体結合組換えタン
パク質で哺乳動物を免疫感作し、公知の方法で血清又は
脾臓から抗体を得ることを特徴とする抗体の生産方法に
関する。
好ましい態様においては、免疫された動物のＢリンパ
球を形質転換剤の存在下に適当な細胞系と融合し、所望
の抗体を生産する細胞系をクローン化して培養し、細胞
又は培養上澄からモノクローナル抗体を単離する。
本発明の方法はHIV免疫原、HBV免疫原のようなウィル
ス免疫原の生産には特に適していることが明らかとなっ
た。
さらに、原核生物で発現させた場合には、普通光屈折
小体のような不活性形で得られる（例えば、tPAやＧ−C
SFのようなヒトタンパク質）が、本発明の方法で発現さ
せると、驚くべきことに組換え抗原の活性、従って抗原
構造が保持されることが明らかとなった。従って、本発
明の方法は免疫原性組換えヒトタンパク質の生産には特
に有利である。
本発明はまた、本発明による担体結合組換えタンパク
質をワクチンとして、またＴリンパ球の刺激に使用する
ことに関する。
本発明によるワクチンは通常の方法で生産し、かつ使
用することができる。
本発明はまた、本発明による担体結合組換えタンパク
質を用いるワクチンの製造方法に関する。これらのワク
チンの製造は公知の方法で実施することができる。しか
し、好ましくは担体結合組換えタンパク質はまず凍結乾
燥し、次いで所望する場合には補助物質を添加して懸濁
する。
さらに、ワクチンは多価ワクチンとして製剤化するこ
とが好ましい。このため、本発明の担体結合組換えタン
パク質は、バクテリアゴーストの膜上に固定化した複数
の組換え抗原を含むことができる。
本発明によるワクチンを用いる予防接種は当業界で慣
用の方法、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮
下、経口、及び鼻腔内などの方法で実施することができ
る。
筋肉内又は皮下投与のためには、ワクチンは例えば生
理食塩水に懸濁することができる。鼻腔内又は眼内投与
のためには、ワクチンは例えばスプレー又は水溶液の形
で適用することができる。経口などの局所投与のために
は、例えば口腔内の糖分解酵素や胃の中のタンパク質分
解酵素などによる不活性化に対して免疫原を一時適に保
護する必要がしばしばある。かかる一時的な保護は、例
えば免疫原をカプセル化することで達成される。このカ
プセル化は例えば保護剤でコーティングする（マイクロ
カプセル化）又は本発明の複数の免疫原を保護的担体内
に入れる（マクロカプセル化）ことによって達成でき
る。
カプセル化物質は半透過性、又はヒトや動物体内に導
入されたときに半透過性になるものでありうる。カプセ
ル化のための担体としては生物的に分解可能な物質が通
常用いられる。
以下に記載する実施例、図面及び配列表によって本発
明をさらに説明する。
図１は、プラスミドpkSELS,pML1及びpMTV1の略図を示
す。
図２は、組換えタンパク質の担体としてのバクテリア
ゴーストを示す図である。
ａ）グラム陰性菌の縦に沿った断面図（om:外膜;pp:ペ
リプラズム空間;im:内（細胞質）膜;cp:細胞質） ｂ）膜透過性溶菌トンネルの形成 ｃ）溶菌トンネルを通っての細胞質の流出 ｄ）ターゲット配列を介して細胞壁複合体中に留まった
融合タンパク質を有するバクテリアゴースト 実施例1:HIV １ gp41のためのＮ−末端膜ターゲッテ
ィング Hinc II/Pvu IIで部分消化することによって、プラス
ミドpHF14からHIV １特異的DNA断片を1445bpのDNA断片
として単離する。この断片はgp41の完全な配列、（gp41
の345コドンの）リンカー配列、gp120の最後の45コドン
を含む。これはSEQ ID NO:1のヌクレオチド４から144
8に対応する。
プラスミドpKSEL5（SEQ ID NO:6）をAcc Iで線状に
して、クレノウポリメラーゼでプロトルーディングDNA
末端（５′末端が１本鎖になっている付着末端）をフィ
リングした後、HIV1特異的DNA断片をその線状化プラス
ミドと連結する。得られるプラスミドをpHIE1と命名
し、これはPhiX174のＥ遺伝子の部分配列（Ｅ′ターゲ
ット配列）と上記のHIV1断片との融合をフレーム内に含
み、ここでHIV1 env−遺伝子の天然の停止コドンは保
持されている。
実施例2:HIV1 pg41のＮ−及びＣ−末端膜ターゲッティ
ング Hic IIで消化することによってプラスミドpHF14から1
059bpのHIV1特異的DNA断片を単離する。この断片は５′
側にリンカー配列、続いてgp120からの45コドンとgp41
からの301コドンを含む。これはSEQ ID NO:1からのヌ
クレオチド４から1062に対応する。プラスミドpKSEL5を
Acc Iで線状にし、クレノウポリメラーゼでプロトルー
ディングDNA末端をフィリングした後、HIV1特異的DNA断
片をこのベクターとライゲートする。かくして得られる
プラスミドpHIE3は、Ｅ遺伝子の部分配列（Ｅ′ターゲ
ット配列）と、HIVの部分配列及びＬ遺伝子の部分配列
（Ｌ′ターゲット配列）との融合をフレーム内に含む。
実施例3:HIV1 gp41のＣ−末端膜ターゲッティング Sal I及びHinc IIによって、プラスミドpHF14から106
1bpのDNA断片を単離する。この断片は５′側にリンカー
配列、続いてgp120の45コドンとgp41の301コドンを含
む。これはSEQ ID NO:1からのヌクレオチド２から106
2に対応する。Xho I/Acc Iで消化することによって、プ
ラスミドpKSEL5からＥ′配列を除去した後、このベクタ
ー及び単離したHIV1断片のプロトルーディングDNA末端
をクレノウポリメラーゼによってフィリングし、連結す
る。かくして得られるプラスミドpHIE5は、lacZ遺伝子
の最初の５コドン、ポリリンカーコドン、gp120/gp41コ
ドン、及びポリリンカーコドンとそれに続くＬ′ターゲ
ット配列の融合をフレーム内に含む。
実施例4:ストレプトアビジンのＣ−末端膜ターゲッティ
ング pFN6からの498bpのXba I断片（FXaStrpA、SEQ ID N
O:2のヌクレオチド２から499）を、クレノウポリメラー
ゼでフィリングし、Hinc II/Xho Iによる切断でＥ′遺
伝子断片を削除したプラスミドpKSEL5のフィリングした
切断部位と連結する。得られるプラスミドをpAV5と命名
する。これは、プラスミドpAV5中に、lacZ遺伝子の最初
の５コドン、残っているポリリンカー配列からの26アミ
ノ酸コドンとともに、FXaStrpAのアミノ酸配列及びこれ
に続くＬ′ターゲット配列の融合をフレーム内に生じ
る。
実施例5:ストレプトアビジンのＮ−末端膜ターゲッティ
ング BamH Iで消化した後、因子X aプロテアーゼ切断によ
って５′側に伸びたストレプトアビジン遺伝子を、プラ
スミドpFN6から511bpの断片として単離する。これはSEQ
ID NO:2からのヌクレオチド14から524を含む。末端
をクレノウポリメラーゼでフィリングした後、このDNA
断片をＥ′及びＬ′ターゲット配列の間にある、ベクタ
ーpKSEL5のフィリングしたXba I切断部位に組み込む。
これによるフレーム内の遺伝子融合は、Ｅ′ターゲット
配列及びFXaStrpA配列からなるプラスミドpAV1を得る。
ストレプトアビジンの３′側にある停止コドンは、クロ
ーニングを実施しても完全なままである。
実施例6:ストレプトアビジンのＮ−及びＣ−末端膜ター
ゲッティング Hinc IIによる部分消化とそれに続くXba Iによる消化
によって作られた33bpの長さのDNA断片を削除すること
によって、プラスミドpAV1中のストレプトアビジン遺伝
子の後ろに位置する停止コドン５′−TAATAA−３′を除
去する。ストレプトアビジン特異的DNA配列は、SEQ ID
NO:2からのヌクレオチド14から499を含む。プラスミ
ドの末端をクレノウポリメラーゼでフィリングし、再連
結した後、ベクター中に含まれるＬ′ターゲット配列
を、Ｅ′ターゲット配列及びFXaStrpA配列とフレーム内
で融合する（プラスミドpAV3）。このようにして、対応
する遺伝子産物はＣ−末端ターゲット配列とともにＮ−
末端ターゲット配列を有することとなる。
実施例7:β−ガラクトシダーゼのＮ−末端膜ターゲッテ
ィング Pst I及びDra Iを用いてプラスミドpMC1403（J.Bacte
riol.143（1980） 971−980）から3124bpのDra I断片
（SEQ ID NO:3）を単離し、プラスミドpKSEL5のPst I
及びNru I制限部位と正しい方向性で連結する。かくし
て形成されるプラスミドpLZ1は、Ｅ′ターゲット配列の
最初の54コドン、13リンカーコドン及びLacZ遺伝子の10
15コドンを含む。プラスミドpLZ1に用いたPst I/Dra I
断片は、配列表SEQ ID NO:3のヌクレオチド26から314
9までを含み、3124bpからなる。
実施例8:β−ガラクトシダーゼのＮ−及びＣ−末端膜タ
ーゲッティング プラスミドpMC1403から、3010bpのLacZ DNA断片（Ps
t I−EcoR I、SEQ ID NO:3からのヌクレオチド26から
3035）を単離し、EcoR I及びHind III末端をフィリング
した後、これをpKSEL5のPst I/Hind III制限部位に正し
い方向性で組み込む。かくして得られるプラスミドpLZ3
中では、Ｅ′ターゲット配列と、LacZ遺伝子及びＬ′タ
ーゲット配列との融合をもたらす。
実施例9:β−ガラクトシダーゼのＣ−末端膜ターゲッテ
ィング プラスミドpLZ3をEcoR Iで消化し、Acc Iで部分消化
する。これによってＥ′ターゲット配列が除去される。
この断片はSEQ ID NO:3からのヌクレオチド29−3035
を含み、3007bpの長さである（EcoR I切断部位をフィリ
ングした後）。ベクターのプロトルーディングDNA末端
をフィリングし、再連結した後に、LacZ−Ｌ′融合遺伝
子が存在し、かつその遺伝子産物がＣ−末端膜ターゲッ
ト配列を有するベクターpLZ5が得られる。
実施例10:プラスミドpMTV1（SEQ ID NO:4）、pkSEL及
びpML1（SEQ ID NO:5）を介する担体結合組換えタン
パク質の製造 プラスミドpMTV1及びpML1上には、PhiX174溶菌遺伝子
Ｅとともに、ラムダcI857リプレッサー遺伝子、ラムダ
プロモーター／オペレーター系pRを右側に含む溶菌カセ
ットが存在する。
外来遺伝子の組込みはpMTV1又はpkSEL5のための複数
のクローニング部位mcs2（図１）において実施できる。
これは実施例１−９に記載したのと類似の方法で実施で
きる。
実施例11:発酵及び溶菌 プラスミドは大腸菌K12（DSM 2093）中に組み込み、
震盪フラスコ中、600nmでOD0.8−1.2まで、培養生育さ
せ、ここで溶菌遺伝子Ｅの発現はcI857リプレッサー分
子（Eur.J.Biochem.180（1989） 393−398）で抑制さ
れる。cI857リプレッサー分子の熱不活性化による遺伝
子Ｅの発現は、バクテリアの対数増殖期に42℃に温度を
上げることによって行う。タンパク質Ｅによって引き起
こされる大腸菌の溶菌は、バクテリアの培地（全培地又
は最少培地、震盪水浴中で通気）によるが、温度上昇後
10から30分で始まる。さらに10から30分後に溶菌は完了
する。
実施例12:改変されるタンパク質Ｅ溶菌 実施例11と同様に培養するが、温度を28℃から42℃に
上昇させる30分前に硫酸マグネシウムを加えることによ
って、培地を0.2モル／リットルの硫酸マグネシウム濃
度にする。これによって、遺伝子Ｅが発現してもバクテ
リアの溶菌が妨げられる。
温度上昇後30分で細胞を遠心で回収する。細胞の即時
的溶菌は、細胞ペレットを低モルのバッファー（PBS,1m
mol/l リン酸バッファー、１から10mmol/l トリスー
塩酸、pH6−８）又は水に再懸濁することによって行
う。この方法で得られる細胞コートをバクテリアゴース
トと呼ぶ。タンパク質Ｅの溶菌と浸透圧ショックの組み
合わせによるこの条件により、バクテリアの溶菌構造の
大部分が得られる。バクテリアゴーストの形態もまたこ
の条件下で大部分保持される。
バクテリアゴーストをPBS又は0.9％NaClで２回洗浄し
て精製（再懸濁及び遠心）し、凍結乾燥する。
実施例13:免疫感作 免疫感作のためには、マウス１匹当たり109個のバク
テリア（バクテリアゴーストの乾燥重量1mgに対応）
を、0.9％NaCl中、１カ月毎の間隔をおいて４回腹腔内
投与する。最後の免疫感作後８日目に、血清を得て抗体
を単離する。
実施例14:ビオチン化HBc抗原の結合 ターゲット配列を介してストレプトアビジンを組み込
んだ実施例４によって作成したバクテリアゴーストを凍
結乾燥する。40mmol/l リン酸バッファー、pH7.4中
の、Ｂ型肝炎コア抗原の及びビチオン複合体20Ig/ml（H
BcAgとＮ−ヒドロキシスクシンイミドー活性化ビオチン
との反応によって製造）の溶液10mlをこの凍結乾燥物1m
gに加えて、30分間インキュベートして次いで40mmol/l
リン酸バッファー、pH7.4で数回洗浄する。このよう
にして担体結合HBcAg免疫原を得て、これを免疫感作及
び抗体の単離に用いることができる。
HIV1のgp160のＣ−末端（BH8クローンと元々同等のも
の:7199から8372（Ratner et al.（1985））は大文字
で示してある。gp120のＣ−末端の最後の45コドン
（５′−ATCTTCAGA.....GAAAAAAGA−３′）の後にはgp4
1の345コドンが続く。以下のクローニングに用いたポリ
リンカーはHIV1配列の５′側に伸びる。
文献:Ratner,L.,Haseltine,W.,Patarca,R.,Livak,K.J.,
Starich,B.,Josephs,S.F.,Doran,E.R.,Rafalski,J.A.,W
hitehorn,E.A.,Baumeister,K.,Ivanoff,L.,Petteway,J
r.S.R.,Pearson,M.L.,Lautenberger,J.A.Papas,T.S.,Gh
rayeb,J.,Chang,N.T.,Gallo,R.C.,Wong−Staal,F.1985,
AIDSウィルスHTLV−IIIの完全ヌクレオチド配列、Natur
e 313:277−284。
SEQ ID NO:2 配列の型：ヌクレオチド配列（FXa−Stripa） 配列の長さ:525塩基対 鎖の型:1本鎖 DNA配列 FXa−Strpa 525bp 完全配列 ストレプトアビジン配列（Argarana et al.,1986）は
大文字で示してある。因子X a切断部位Ile−Glu−Gly−
ArgをコードするDNA配列５′−atcgagggtagg−３′は、
ここに示す配列のヌクレオチド19から30まで伸びる。
文献:Argarana、C.E.,Kuntz,I.D.,Birken,S.,Axel,R.,C
antor,Ch.R.1986.ストレプトアビジン遺伝子のモレキュ
ラークローニング及びヌクレオチド配列、Nucl.Acids
Res.14（４）:1871−1882。
SEQ ID NO:3 配列の型：ヌクレオチド配列（LacZ） 配列の長さ:3152塩基対 鎖の型:1本鎖 プラスミドpMC1403からのLacZ遺伝子のためのDNA配列は
大文字で示してある。文献:Casadaban,M.J.,Chou,J.,Co
hen,M.S.1980.酵素的に活性なβ−ガラクトシダーゼセ
グメントを外因性タンパク質のアミノー末端断片に結合
するin vitroの遺伝子融合：翻訳開始シグナルの検出
及びクローニングのための大腸菌プラスミドベクター、
J.Bacteriol.143:971−980。
SEQ ID NO:4 配列の型：ヌクレオチド配列（pMTV1） 配列の長さ:5314塩基対 鎖の型:1本鎖 SEQ ID NO:5 配列の型：ヌクレオチド配列（pML1） 配列の長さ:7641塩基対 鎖の型:1本鎖 SEQ ID NO:6 配列の型：ヌクレオチド配列（pKSEL5） 配列の長さ:3681塩基対 鎖の型:1本鎖
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 スツォスタック，ミカエル ピー. ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン ― 40 カール―テオドア―シュトラー セ 31 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 C07K 1/00 - 19/00 A61K 39/00 - 39/44 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１に、αらせん構造を有し、14から20ア
    ミノ酸からなっており、かつＮ−及びＣ−末端側で各々
    ２から30個の任意のアミノ酸と隣り合い得る、膜組込み
    のできる少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタン
    パク質ドメインをコードし、第２に、組換えタンパク質
    をコードする、前記疎水性で非−溶菌活性なタンパク質
    と前記組換えタンパク質とが融合された融合タンパク質
    の遺伝子の発現と、バクテリオファージからの溶菌活性
    な膜タンパク質、溶菌活性な毒素放出性タンパク質、又
    はそれらの溶菌活性な部分配列をコードする遺伝子の発
    現とをグラム陰性菌中で行い、次いで培養液から担体結
    合組換えタンパク質を単離することによって得られる、
    グラム陰性菌の膜に結合した組換えタンパク質。
  2. 【請求項２】前記融合タンパク質がさらに、10から16ア
    ミノ酸からなりかつβ−プリーツシート２次構造を有す
    る少なくとも１つのタンパク質ドメインを含む、請求の
    範囲第１項に記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】タンパク質ドメインがファージPhiX174の
    タンパク質Ｅのアミノ酸１から54、ファージMS2のタン
    パク質Ｌのアミノ酸21から75、及び／又はこれらの配列
    からアミノ酸置換によって得られ、かつ類似のタンパク
    質２次構造を有するアミノ酸配列を含む、請求の範囲第
    １項又は２項に記載のタンパク質。
  4. 【請求項４】タンパク質ドメインと組換えタンパク質と
    が、２から100アミノ酸からなりかつ無秩序な２次構造
    を有する親水性アミノ酸配列によって連結されている、
    請求の範囲第１項から３項のいずれかに記載のタンパク
    質。
  5. 【請求項５】組換えタンパク質が抗原構造を有する、請
    求の範囲第１項から４項のいずれかに記載のタンパク
    質。
  6. 【請求項６】組換えタンパク質に、このタンパク質（所
    望する場合には、これにさらにその他の物質を共有結合
    的又は非共有結合的に結合する）のための非共有結合的
    な結合パートナーが結合されている、請求の範囲第１項
    から５項のいずれかに記載のタンパク質。
  7. 【請求項７】組換えタンパク質がストレプトアビジン又
    はアビジンである、請求の範囲第６項に記載のタンパク
    質。
  8. 【請求項８】非共有結合パートナーがビオチン化抗原で
    ある、請求の範囲第６項又は７項に記載のタンパク質。
  9. 【請求項９】αらせん構造を有し、14から20アミノ酸か
    らなっており、かつＮ−及びＣ−末端側で各々２から30
    個の任意のアミノ酸と隣り合い得る、膜組込みのできる
    少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタンパク質ド
    メインをコードする第１のDNA配列（DNAターゲット配
    列）、組換えタンパク質をコードする第２のDNA配列（D
    NAタンパク質配列）とともに、これとは別のコントロー
    ル下にあり、かつバクテリオファージからの溶菌活性な
    膜タンパク質又は溶菌活性な毒素放出性タンパク質又は
    それらの溶菌活性な部分をコードする第３のDNA配列（D
    NA溶菌遺伝子）を含む組換えDNA。
  10. 【請求項１０】第１に、αらせん構造を有し、14から20
    アミノ酸からなっており、かつＮ−及びＣ−末端側で各
    々２から30個の任意のアミノ酸と隣り合い得る、膜組込
    みのできる少なくとも１つの疎水性で非−溶菌活性なタ
    ンパク質ドメインを含むとともに、第２に、組換えタン
    パク質を含む融合タンパク質と、バクテリオファージか
    らの溶菌活性な膜タンパク質又は溶菌活性な毒素放出性
    タンパク質又はそれらの溶菌活性な部分配列とをグラム
    陰性菌中で発現させ、次いで培養液から担体結合組換え
    タンパク質を単離することからなる、グラム陰性菌の膜
    に結合した組換えタンパク質の製造方法。
  11. 【請求項１１】少なくとも１つの別の組換えタンパク質
    の遺伝子が発現される、請求の範囲第10項に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】培養の間、溶菌膜タンパク質の活性が阻
    害されるか、或いは溶菌活性な膜タンパク質又は毒素放
    出性タンパク質の発現が抑制され、そして阻害又は抑制
    を所望の時期に解除する、請求の範囲第10項又は11項に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】組換えタンパク質を、所望する場合には
    誘導体化される該タンパク質のための結合パートナーと
    ともにインキュベートし、かくして形成されかつグラム
    陰性菌の膜に結合した複合体を単離する、請求の範囲第
    10項から12項のいずれかに記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4023721A1 (de) * 1990-07-26 1992-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung
GB9226065D0 (en) * 1992-12-14 1993-02-10 Ici Plc Peptides
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
DE19603649A1 (de) * 1996-02-01 1997-08-07 Werner Lubitz Rekombinante Expression von S-Layer-Proteinen
DE19633698A1 (de) * 1996-08-21 1998-02-26 Lubitz Werner Prof Dr Neue Systeme zur Regulation der Genexpression
US6803231B1 (en) * 1998-01-30 2004-10-12 Vanderbilt University Method of delivering antigens for vaccination with a live vector
DE19903345A1 (de) * 1999-01-28 2000-08-03 Werner Lubitz Kompartimentierung von rekombinanten Polypeptiden in Wirtszellen
DE19909770A1 (de) * 1999-03-05 2000-09-07 Werner Lubitz Bakterienghosts als Träger- und Targetingvehikel
CA2390371A1 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Texas A & M University System Antibiotics based upon bacteriophage lysis proteins
DE60232071D1 (de) 2001-06-11 2009-06-04 Applied Nanosystems Bv Verfahren zur bindung von acma-typ protein anker fusionen an mikroorganismen zellwandmaterialien
ATE355069T1 (de) * 2001-07-18 2006-03-15 Inst Immunologii I Terapii Dos Verfahren zur herstellung polyvalenter bakteriophagenpräparationen zur behandlung bakterieller infektionen
PL374884A1 (en) * 2002-07-23 2005-11-14 Teva Gyogyszergyar Zartköruen Mukodo Reszvenytarsasag Preparation of 1h-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amines via 1h-imidazo[4,5-c]quinolin-4-phthalimide intermediates
CA2710814C (en) 2008-01-18 2014-10-14 Werner Lubitz Bacterial ghost (bg) production process using betapropiolactone (blp) for final inactivation
PL215522B1 (pl) 2008-09-29 2013-12-31 Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan Nowe szczepy bakteriofagów do leczenia zakazen bakteryjnych, zwlaszcza szczepami bakterii lekoopornych rodzaju Enterococcus
PL212258B1 (pl) 2010-06-20 2012-09-28 Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan Nowe szczepy bakteriofagów do leczenia zakazen bakteryjnych, zwlaszcza szczepami bakterii lekoopornych rodzaju Stenotrophomonas
EP3636661A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-15 Bioc3 Phosphate translocator

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839293A (en) * 1986-02-24 1989-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA encoding streptavidin, streptavidin produced therefrom, fused polypeptides which include amino acid sequences present in streptavidin and uses thereof
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation
DE3715840A1 (de) * 1987-05-12 1988-12-01 Boehringer Mannheim Gmbh Fuer ein lytisch wirksames, chimaeres protein kodierende rekombinante dna und ihre verwendung

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