JP3234897B2 - 低温発現型キチナーゼ遺伝子およびその単離方法 - Google Patents
低温発現型キチナーゼ遺伝子およびその単離方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キチナーゼ（chit
inase）遺伝子およびその単離方法に関し、詳しくは、
低温環境下において植物を加害する雪腐病菌などの好冷
性植物病原菌に対して、その抵抗性を植物に付与する機
能を持つキチーゼ遺伝子およびその単離方法に関する。
inase）遺伝子およびその単離方法に関し、詳しくは、
低温環境下において植物を加害する雪腐病菌などの好冷
性植物病原菌に対して、その抵抗性を植物に付与する機
能を持つキチーゼ遺伝子およびその単離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】長期にわたる厳寒積雪地帯では、ムギ類
・牧草類などの越冬作物は低温環境下（０℃以下）また
は積雪下（０℃、暗黒下）で長期間の生存を余儀なくさ
れる。この環境下において越冬作物は、好冷性糸状菌で
ある雪腐病菌に犯され、抵抗性の低い作物は枯死してし
まう。
・牧草類などの越冬作物は低温環境下（０℃以下）また
は積雪下（０℃、暗黒下）で長期間の生存を余儀なくさ
れる。この環境下において越冬作物は、好冷性糸状菌で
ある雪腐病菌に犯され、抵抗性の低い作物は枯死してし
まう。
【０００３】現在の秋播小麦栽培では、根雪前の農薬散
布が雪腐病の防除に必須となっているが、根雪開始時期
が不確実なため、十分な散布が不可能となる事例か多
い。そこで、根雪前の農薬散布を行わなくても済むよう
に、雪腐病に対する十分な抵抗性を持つ品種の育成が望
まれている。
布が雪腐病の防除に必須となっているが、根雪開始時期
が不確実なため、十分な散布が不可能となる事例か多
い。そこで、根雪前の農薬散布を行わなくても済むよう
に、雪腐病に対する十分な抵抗性を持つ品種の育成が望
まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
交雑に基づいた育種技術では十分な抵抗性をもつ優良品
種の育成がなされておらず、また、優良品種の育成には
長い年月を要することから、より有効な手段例えば遺伝
子工学的な手段による品種の改良が強く求められてい
る。
交雑に基づいた育種技術では十分な抵抗性をもつ優良品
種の育成がなされておらず、また、優良品種の育成には
長い年月を要することから、より有効な手段例えば遺伝
子工学的な手段による品種の改良が強く求められてい
る。
【０００５】本発明者らは、上記した課題を解決するた
め長期にわたる研究を重ね、その結果、次のような結論
をまとめた。すなわち、雪腐病菌に対する植物体の抵抗
性は、秋期から冬期にかけての気温低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称す）により誘導されるが、後
述する本発明の３種類のキチナーゼ遺伝子はこのハード
ニング中に発現が見られ、その翻訳産物が雪腐病菌の細
胞壁に含まれるキチンを分解することで病害抵抗性を植
物体に付与するということが判った。
め長期にわたる研究を重ね、その結果、次のような結論
をまとめた。すなわち、雪腐病菌に対する植物体の抵抗
性は、秋期から冬期にかけての気温低下に伴う低温順化
（以下、ハードニングと称す）により誘導されるが、後
述する本発明の３種類のキチナーゼ遺伝子はこのハード
ニング中に発現が見られ、その翻訳産物が雪腐病菌の細
胞壁に含まれるキチンを分解することで病害抵抗性を植
物体に付与するということが判った。
【０００６】従って本発明の目的は、低温環境下で酵素
機能を有し植物体に導入されることで植物に対し病害抵
抗性を付与するキチナーゼ遺伝子を提供することにあ
る。
機能を有し植物体に導入されることで植物に対し病害抵
抗性を付与するキチナーゼ遺伝子を提供することにあ
る。
【０００７】本発明における他の目的は、低温環境下で
酵素機能を有し植物体に導入されることで植物に対し病
害抵抗性を付与するキチナーゼ遺伝子の単離方法を提供
することにある。
酵素機能を有し植物体に導入されることで植物に対し病
害抵抗性を付与するキチナーゼ遺伝子の単離方法を提供
することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列を含む小麦キチナーゼ遺伝子である。
ために本発明は、図１に示す配列番号１記載のアミノ酸
配列を含む小麦キチナーゼ遺伝子である。
【０００９】図１に示す配列番号１記載のアミノ酸配列
を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、７７１塩基・２
５６アミノ酸からなり、大麦キチナーゼ遺伝子と９８％
（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つものである。
を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、７７１塩基・２
５６アミノ酸からなり、大麦キチナーゼ遺伝子と９８％
（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つものである。
【００１０】また、図１に示す配列番号１記載のアミノ
酸配列を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
るものである。
酸配列を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
るものである。
【００１１】そして、上記した目的を達成するために本
発明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を含
む小麦キチナーゼ遺伝子である。
発明は、図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列を含
む小麦キチナーゼ遺伝子である。
【００１２】図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配列
を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、９７２塩基・３
２３アミノ酸からなり、ライ麦キチナーゼ遺伝子と６８
％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つものである。
を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、９７２塩基・３
２３アミノ酸からなり、ライ麦キチナーゼ遺伝子と６８
％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つものである。
【００１３】また、図２に示す配列番号２記載のアミノ
酸配列を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
るものである。
酸配列を有する上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
るものである。
【００１４】さらに、上記した目的を達成するために本
発明は、図３に示す配列番号３記載のアミノ酸配列を含
む秋播小麦キチナーゼ遺伝子である。
発明は、図３に示す配列番号３記載のアミノ酸配列を含
む秋播小麦キチナーゼ遺伝子である。
【００１５】図３に示す配列番号３記載のアミノ酸配列
を有する上記秋播小麦キチナーゼ遺伝子は、９６０塩基
・３１９アミノ酸からなり、春播小麦キチナーゼ遺伝子
と９５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つもので
ある。
を有する上記秋播小麦キチナーゼ遺伝子は、９６０塩基
・３１９アミノ酸からなり、春播小麦キチナーゼ遺伝子
と９５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持つもので
ある。
【００１６】また、図３に示す配列番号３記載のアミノ
酸配列を有する上記秋播小麦キチナーゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含
まれるキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付
与するものである。
酸配列を有する上記秋播小麦キチナーゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含
まれるキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付
与するものである。
【００１７】さらに、上記した目的を達成するために本
発明は、低温発現型キチナーゼ遺伝子の単離方法であっ
て、ハードニング（低温順化）による病害抵抗性の向上
に関与する低温発現型キチナーゼ遺伝子を単離すること
を目的として、充分にハードニングを施した秋播小麦Ｐ
Ｉ１７３４３８（高度雪腐病抵抗性を有する）からｍＲ
ＮＡを抽出することと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡ
およびｃＤＮＡライブラリーを作製することと、ＥＭＢ
Ｌ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクに
よって公開されている数種の植物由来のキチナーゼ遺伝
子において高度に保存されている塩基配列部分を参考に
して、２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プライマーを
設計することと、設計された２種類のキチナーゼ遺伝子
の特異的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型に
ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応
を行うことによって、キチナーゼ遺伝子の断片を増幅し
増幅断片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとし
て、上記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーシ
ョンアッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子
の全長を含むクローンを単離することと、を特徴とす
る。
発明は、低温発現型キチナーゼ遺伝子の単離方法であっ
て、ハードニング（低温順化）による病害抵抗性の向上
に関与する低温発現型キチナーゼ遺伝子を単離すること
を目的として、充分にハードニングを施した秋播小麦Ｐ
Ｉ１７３４３８（高度雪腐病抵抗性を有する）からｍＲ
ＮＡを抽出することと、上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡ
およびｃＤＮＡライブラリーを作製することと、ＥＭＢ
Ｌ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバンクに
よって公開されている数種の植物由来のキチナーゼ遺伝
子において高度に保存されている塩基配列部分を参考に
して、２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プライマーを
設計することと、設計された２種類のキチナーゼ遺伝子
の特異的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型に
ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応
を行うことによって、キチナーゼ遺伝子の断片を増幅し
増幅断片を得ることと、上記の増幅断片をプローブとし
て、上記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーシ
ョンアッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝子
の全長を含むクローンを単離することと、を特徴とす
る。
【００１８】上記２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プ
ライマーのうち、 一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ （配列番号４） を有し、 他方は、以下の塩基配列 （Reverse）：５‘Ａ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ− Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ （配列番号５） を有する。
ライマーのうち、 一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ （配列番号４） を有し、 他方は、以下の塩基配列 （Reverse）：５‘Ａ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ− Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ （配列番号５） を有する。
【００１９】すなわち、本発明のキチナーゼ遺伝子は、
低温発現型キチナーゼ遺伝子である。この低温発現型キ
チナーゼ遺伝子を作製する方法としては、具体的には下
記のようなプロセスによって行われている。
低温発現型キチナーゼ遺伝子である。この低温発現型キ
チナーゼ遺伝子を作製する方法としては、具体的には下
記のようなプロセスによって行われている。
【００２０】詳しくは、札幌市の自然条件下で１１月２
２日までハードニング（低温順化）させた高度雪腐病抵
抗性を有する秋播小麦ＰＩ１７３４３８からｍＲＮＡを
抽出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよび
ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
２日までハードニング（低温順化）させた高度雪腐病抵
抗性を有する秋播小麦ＰＩ１７３４３８からｍＲＮＡを
抽出する。そして、該ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよび
ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２１】次いで、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｄ
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来のキチナーゼ遺伝子の塩基配列を詳細に解析
し、すべての遺伝子において高度に保存されている塩基
配列部分を参考に２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プ
ライマーを設計する。
ＤＢＪＤＮＡデータバンクにおいて公開されている数種
の植物由来のキチナーゼ遺伝子の塩基配列を詳細に解析
し、すべての遺伝子において高度に保存されている塩基
配列部分を参考に２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プ
ライマーを設計する。
【００２２】設計された２種類のキチナーゼ遺伝子の特
異的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行
って、キチナーゼ遺伝子の予想された断片（４００塩基
前後）を増幅し、増幅部分の断片を単離する。
異的プライマーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応を行
って、キチナーゼ遺伝子の予想された断片（４００塩基
前後）を増幅し、増幅部分の断片を単離する。
【００２３】そして、それぞれの増幅断片をプローブと
して、上記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼー
ションアッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝
子の全長を含むクローンを単離する。単離したクローン
の塩基配列を解析し、小麦では新規なキチナーゼ遺伝子
が３種類単離されたことが明かとなる。
して、上記のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼー
ションアッセイによりスクリ−ニングすることで、遺伝
子の全長を含むクローンを単離する。単離したクローン
の塩基配列を解析し、小麦では新規なキチナーゼ遺伝子
が３種類単離されたことが明かとなる。
【００２４】
１）耐雪性秋播小麦系統ＰＩ１７３４３８からのｃＤＮ
Ａ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Triticum astivum
L.）ＰＩ１７３４３８（高度雪腐病抵抗性を有する）の
クラウン部分よりｍＲＮＡを常法により抽出した。得ら
れたｍＲＮＡ５μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（STRA
TAGENE社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ
の両端末にアダプターを接続後、λ ZAP Expression
vector（STRATAGENE社製）に組み込み、約6x106pfuの
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
Ａ及びｃＤＮＡライブラリーの調製 ９月下旬にバットに播種し、自然条件下で１１月２２日
までハードニングさせた秋播小麦（Triticum astivum
L.）ＰＩ１７３４３８（高度雪腐病抵抗性を有する）の
クラウン部分よりｍＲＮＡを常法により抽出した。得ら
れたｍＲＮＡ５μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（STRA
TAGENE社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ
の両端末にアダプターを接続後、λ ZAP Expression
vector（STRATAGENE社製）に組み込み、約6x106pfuの
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２５】 ２） キチナーゼ遺伝子プライマーを用いて、上記のｃ
ＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のキチナーゼ遺伝
子の塩基配列が高度に保存された領域に基づいて合成さ
れた、 （Forward）：５‘Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ （配列番号４） という塩基配列を有するキチナーゼ遺伝子の特異的プラ
イマーと （Reverse）：５‘Ａ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ− Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ （配列番号５） という塩基配列を有するキチナーゼ遺伝子の特異的プラ
イマーと、を用いて、上記により合成されたｃＤＮＡを
鋳型にＰＣＲ反応を行った。
ＤＮＡを鋳型に行われるＰＣＲ反応 既知（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデ
ータバンクにおいて公開されている）のキチナーゼ遺伝
子の塩基配列が高度に保存された領域に基づいて合成さ
れた、 （Forward）：５‘Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ （配列番号４） という塩基配列を有するキチナーゼ遺伝子の特異的プラ
イマーと （Reverse）：５‘Ａ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ− Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ （配列番号５） という塩基配列を有するキチナーゼ遺伝子の特異的プラ
イマーと、を用いて、上記により合成されたｃＤＮＡを
鋳型にＰＣＲ反応を行った。
【００２６】上記ＰＣＲ反応は、５０μl の反応系で
行われた。日本ジーン社製TaqＤＮＡポリメラーゼ（５
units/μl）を１μl、１０×ポリメラーゼバッファー
（MgCl2を含む）を５μl、ｄＮＴＰ液（１０ｍＭ）を５
μl、上記の各プライマー（１２μＭ）を２μl、および
上記で合成したｃＤＮＡを約１０ｎｇ加えて、反応液全
量を蒸留水で５０μlとした。ＰＣＲの反応条件および
反応回数は、以下の表１に示す。
行われた。日本ジーン社製TaqＤＮＡポリメラーゼ（５
units/μl）を１μl、１０×ポリメラーゼバッファー
（MgCl2を含む）を５μl、ｄＮＴＰ液（１０ｍＭ）を５
μl、上記の各プライマー（１２μＭ）を２μl、および
上記で合成したｃＤＮＡを約１０ｎｇ加えて、反応液全
量を蒸留水で５０μlとした。ＰＣＲの反応条件および
反応回数は、以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】 ＰＣＲの反応条件および反応回数 （表１において、「変性」は、ＤＮＡの二本鎖をそれぞ
れの一本鎖に変える反応を意味し、「伸張反応」は、Ｄ
ＮＡ断片の増幅反応を意味し、「３０回」は、変性とニ
ーリングと伸張反応とを含むサイクルを３０回にわたり
繰り返すことを意味している）
れの一本鎖に変える反応を意味し、「伸張反応」は、Ｄ
ＮＡ断片の増幅反応を意味し、「３０回」は、変性とニ
ーリングと伸張反応とを含むサイクルを３０回にわたり
繰り返すことを意味している）
【００２８】上記ＰＣＲ反応の結果、配列番号４の塩基
配列を有するプライマーおよび配列番号５の塩基配列を
有するプライマーから、予測された長さの断片（４００
塩基前後）が増幅された。そして、常法に基づき市販の
自動シーケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利
用し、得られた増幅断片の塩基配列を決定することで、
既知のキチナーゼ遺伝子と高い相同性をもつ新規なキチ
ナーゼ遺伝子の断片であることが確認された。
配列を有するプライマーおよび配列番号５の塩基配列を
有するプライマーから、予測された長さの断片（４００
塩基前後）が増幅された。そして、常法に基づき市販の
自動シーケンサー（ＡＢＩ社製、モデル３７３Ｓ）を利
用し、得られた増幅断片の塩基配列を決定することで、
既知のキチナーゼ遺伝子と高い相同性をもつ新規なキチ
ナーゼ遺伝子の断片であることが確認された。
【００２９】 ３）本発明のキチナーゼ遺伝子を有するｃＤＮＡクロー
ンの単離・塩基配列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規キチナーゼ遺伝子の断片をラジオ
アイソトープで標識したプローブを利用してハイブリダ
イゼーシヨンアッセイを行った。
ンの単離・塩基配列の決定 上記により得られたｃＤＮＡライブラリーのうちおよそ
１０万クローンをプロットしたフィルターを利用し、上
記により得られた新規キチナーゼ遺伝子の断片をラジオ
アイソトープで標識したプローブを利用してハイブリダ
イゼーシヨンアッセイを行った。
【００３０】ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ液、５×デンハルト液、０・
５％ＳＤＳ液、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを加
え、４２℃の条件下で１６時間にわたって行われた。
【００３１】その後、上記フィルターに対して、２×Ｓ
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて５５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２回にわたり実施した。
洗浄されたフィルターとＸ線フィルムを利用し、アイソ
トーブでラベルされたプローブと結合した陽性クローン
をスクリーニングした。
ＳＣ液および０．１％ＳＤＳ液を用いて５５℃の条件下
で１０分間を必要とする洗浄を２回にわたり実施した。
洗浄されたフィルターとＸ線フィルムを利用し、アイソ
トーブでラベルされたプローブと結合した陽性クローン
をスクリーニングした。
【００３２】このように得られた約４５個の陽性クロー
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１〜３に示す配列番号１〜３記載
のアミノ酸配列を含む３種類の新規キチナーゼ遺伝子が
それぞれ秋播小麦から単離されたことが判った。
ンについてそれぞれ、ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを
用いて塩基配列を決定した。得られた候補クローンの塩
基配列の解析から、図１〜３に示す配列番号１〜３記載
のアミノ酸配列を含む３種類の新規キチナーゼ遺伝子が
それぞれ秋播小麦から単離されたことが判った。
【００３３】具体的には、単離されたのは、ａ）７７１
塩基・２５６アミノ酸からり、大麦キチナーゼ遺伝子と
９８％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持ち、図１に
示す配列番号１記載のアミノ酸配列を含む小麦キチナー
ゼ遺伝子、ｂ）９７２塩基・３２３アミノ酸からなり、
ライムギキチナーゼ遺伝子と６８％（アミノ酸配列レベ
ル）の相同性を持ち、図２に示す配列番号２記載のアミ
ノ酸配列を含む小麦キチナーゼ遺伝子、ｃ）９６０塩基
・３１９アミノ酸からなり、春播コムギキチナーゼと９
５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持ち、図３に示
す配列番号３記載のアミノ酸配列を含む秋播小麦キチナ
ーゼ遺伝子である。
塩基・２５６アミノ酸からり、大麦キチナーゼ遺伝子と
９８％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持ち、図１に
示す配列番号１記載のアミノ酸配列を含む小麦キチナー
ゼ遺伝子、ｂ）９７２塩基・３２３アミノ酸からなり、
ライムギキチナーゼ遺伝子と６８％（アミノ酸配列レベ
ル）の相同性を持ち、図２に示す配列番号２記載のアミ
ノ酸配列を含む小麦キチナーゼ遺伝子、ｃ）９６０塩基
・３１９アミノ酸からなり、春播コムギキチナーゼと９
５％（アミノ酸配列レベル）の相同性を持ち、図３に示
す配列番号３記載のアミノ酸配列を含む秋播小麦キチナ
ーゼ遺伝子である。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、既知のキチナーゼ遺伝
子とアミノ酸配列が異なり、腐雪病に対する高度の抵抗
性を有し、小麦では新規なキチナーゼ遺伝子が提供され
る。本発明における３種類のキチナーゼ遺伝子は、低温
でのキチン分解能を有することから、上記３種類のキチ
ナーゼ遺伝子のうち何れかを植物体に導入することによ
って、低温環境下で植物を加害する病原菌に対しても抵
抗性を付与することになり、雪腐病菌など好冷性植物病
原菌に対して高度の抵抗性を有する植物品種を提供する
ことができる。
子とアミノ酸配列が異なり、腐雪病に対する高度の抵抗
性を有し、小麦では新規なキチナーゼ遺伝子が提供され
る。本発明における３種類のキチナーゼ遺伝子は、低温
でのキチン分解能を有することから、上記３種類のキチ
ナーゼ遺伝子のうち何れかを植物体に導入することによ
って、低温環境下で植物を加害する病原菌に対しても抵
抗性を付与することになり、雪腐病菌など好冷性植物病
原菌に対して高度の抵抗性を有する植物品種を提供する
ことができる。
【００３５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜110＞ Tadaoki Inaba, General Manager of Hokkaido National Agricultural Experiment Station ＜120＞ Low Temperature Expression Chitinase cDNA and Method for Their Isolation ＜130＞ 11P97 ＜140＞ JP 1999/081694 ＜141＞ 1999-3-25 ＜150＞ JP 1999/081694 ＜151＞ 1999-3-25 ＜160＞ 5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 256 ＜212＞ PRT ＜213＞ Wheat ＜400＞ 1 MARFAALAVC AAALLLAVAA GGAAAQGVGS VITRSVYASM LPNRDNSLCP ARGFYTYDAF 60 IAAANTFPGF GTTGSADDIK RDLAAFFGQT SHETTGGTRG AADQFQWGYC FKEEISKATS 120 PPYYGRGPIQ LTGRSNYDLA GRAIGKDLVS NPDLVSTDAV VSFRTAMWFW MTAQGNKPSC 180 HNVALRRWTP TAADTAAGRV PGYGVITNII NGGLECGMGR NDANVDRIGY YTRYCGMLGT 240 ATGGNLDCYT QRNFAS * 256 ＜210＞ 2 ＜211＞ 323 ＜212＞ PRT ＜213＞ Wheat ＜400＞ 2 MSTLRARCAT AVLAVVLAAA AVTPATAEQC GSQAGGAKCA DCLCCSQFGF CGTTSDYCGP 60 RCQSQCTGCG GGGGGVASIV SRDLFERFLL HRNDAACLAR GFYTYDAFLA AAGAFPAFGT 120 TGDLDTRKRE VAAFFGQTSH ETTGGWPTAP DGPFSWGYCF KQEQGSPPSY CDQSADWPCA 180 PGKQYYGRGP IQLTHNYNYG PAGRAIGVDL LNNPDLVATD PTVAFKTAIW FWMTTQSNKP 240 SCHDVITGLW TPTARDSAAG RVPGYGVITN VINGGIECGM GQNDKVADRI GFYKRYCDIF 300 GIGYGNNLDC YNQLSFNVGL AAQ * 323 ＜210＞ 3 ＜211＞ 320 ＜212＞ PRT ＜213＞ Wheat ＜400＞ 3 MRGVVVVAML AAAFAVSAHA EQCGSQAGGA TCPNCLCCSK FGFCGTTSDY CGTGCQSQCN 60 GCSGGTPVPV PTPSGGGVSS IISQSLFDQM LLHRNDAACL AKGFYNYGAF VAAANSFSGF 120 ATTGSTDVKK REVAAFLAQT SHETTGGWPT APDGPYSWGY CFNQERGATS DYCTPSSQWP 180 CAPGKKYFGR GPIQISHNYN YGPAGQAIGT DLLNNPDLVA SDATVSFKTA LWFWMTPQSP 240 KPSSHDVITG RWSPSGADQA AGRVPGYGVI TNIINGGLEC GRGQDGRVAD RIGFYKRYCD 300 LLGVSYGDNL DCYNQRPFA * 320 ＜210＞ 4 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ Wheat ＜400＞ 4 5‘C-A-C-G-A-G-A-C-C-A-C-N-G-G-C-G-G-N-T-G-G-G-C 23 ＜210＞ 5 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Wheat ＜400＞ 5 5‘A-C-N-A-A-T-A-T-C-A-T-C-A-A-C-G-G-C-G-G 20
【図１】配列番号１記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
【図２】配列番号２記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
【図３】配列番号３記載のアミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，266［３］（1991）ｐ．1564−1573 Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．，58［２］（1994）ｐ. 322−329 Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．，57［11］（1993）ｐ. 1854−1861 Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，103 ［２］（1994）ｐ．177−187 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ
Claims (7)
- 【請求項１】 図１に示す配列番号１記載のアミノ酸配
列を含むことと、７７１塩基・２５６アミノ酸からな
り、オオムギキチナーゼ遺伝子と９８％（アミノ酸配列
レベル）の相同性を持つこととを特徴とする小麦キチナ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
ることを特徴とする請求項１記載の小麦キチナーゼ遺伝
子。 - 【請求項３】 図２に示す配列番号２記載のアミノ酸配
列を含むことと、９７２塩基・３２３アミノ酸からな
り、ライムギキチナーゼ遺伝子と６８％（アミノ酸配列
レベル）の相同性を持つこととを特徴とする小麦キチナ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 上記小麦キチナーゼ遺伝子は、低温環境
下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含まれ
るキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付与す
ることを特徴とする請求項３記載の小麦キチナーゼ遺伝
子。 - 【請求項５】 図３に示す配列番号３記載のアミノ酸配
列を含むことと、９６０塩基・３１９アミノ酸からな
り、春播小麦キチナーゼ遺伝子と９５％（アミノ酸配列
レベル）の相同性を持つこととを特徴とする秋播小麦キ
チナーゼ遺伝子。 - 【請求項６】 上記秋播小麦キチナーゼ遺伝子は、低温
環境下で酵素機能を有し、かつ植物病原菌の細胞壁に含
まれるキチンを分解することで病害抵抗性を植物体に付
与することを特徴とする請求項５記載の秋播小麦キチナ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項７】 低温発現型キチナーゼ遺伝子の単離方法
であって、 ハードニング（低温順化）による病害抵抗性の向上に関
与する低温発現型キチナーゼ遺伝子を単離することを目
的として、充分にハードニングを施した秋播小麦系統Ｐ
Ｉ１７３４３８（高度雪腐病抵抗性を有する）からｍＲ
ＮＡを抽出することと、 上記ｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラ
リーを作製することと、 ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＤＤＢＪＤＮＡデータバ
ンクによって公開されている数種の植物由来のキチナー
ゼ遺伝子において高度に保存されている塩基配列部分を
参考にして、２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プライ
マーを設計することと、 設計された２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プライマ
ーを用いて、上記のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（ポリメラ
ーゼ・チェーン・リアクション）反応を行うことによっ
て、キチナーゼ遺伝子の断片を増幅し増幅断片を得るこ
とと、 上記の増幅断片をプローブとして、上記のｃＤＮＡライ
ブラリーをハイブリダイゼーションアッセイによりスク
リ−ニングすることで、遺伝子の全長を含むクローンを
単離することと、 を含み、 上記２種類のキチナーゼ遺伝子の特異的プライマーのう
ち、 一方は、以下の塩基配列 （Forward）：５‘Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｇ− Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ （配列番号４） を有し、 他方は、以下の塩基配列 （Reverse）：５‘Ａ−Ｃ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ− Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ （配列番号５） を有することを特徴とする低温発現型キチナーゼ遺伝子
の単離方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08169499A JP3234897B2 (ja) | 1999-03-25 | 1999-03-25 | 低温発現型キチナーゼ遺伝子およびその単離方法 |
| CA002301335A CA2301335A1 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-23 | Low temperature expression chitinase cdnas and method for isolating the same |
| GB0007240A GB2350114B (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression chitinase cDNAs and method for isolating the same |
| AU22585/00A AU739464B2 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression chitinase cDNAs and method for isolating the same |
| DE10014638A DE10014638B4 (de) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | cDNA's, kodierend für Proteine mit Chitinaseaktivität, für eine Niedertemperatur-Expression sowie Verfahren zu deren Isolierung |
| US09/534,229 US6838271B1 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Low temperature expression chitinase cDNAs and method for isolating the same |
| HK01101097A HK1030239A1 (en) | 1999-03-25 | 2001-02-15 | Low temperature expression chitinase cdnas and method for isolating the same |
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000270866A JP2000270866A (ja) | 2000-10-03 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP3234897B2 (ja) |
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| GB (1) | GB2350114B (ja) |
| HK (1) | HK1030239A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| WO1999006565A2 (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-11 | Ice Biotech Inc. | Antifreeze proteins, dna and expression systems |
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-
2000
- 2000-03-23 CA CA002301335A patent/CA2301335A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 AU AU22585/00A patent/AU739464B2/en not_active Ceased
- 2000-03-24 US US09/534,229 patent/US6838271B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 DE DE10014638A patent/DE10014638B4/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-24 GB GB0007240A patent/GB2350114B/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-15 HK HK01101097A patent/HK1030239A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７［１１］（１９９３）ｐ．１８５４−１８６１ |
| Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８［２］（１９９４）ｐ．３２２−３２９ |
| Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０３［２］（１９９４）ｐ．１７７−１８７ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６［３］（１９９１）ｐ．１５６４−１５７３ |
Also Published As
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|---|---|
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| CA2301335A1 (en) | 2000-09-25 |
| JP2000270866A (ja) | 2000-10-03 |
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