JP3217112B2 - 硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法 - Google Patents
硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法Info
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- JP3217112B2 JP3217112B2 JP07320192A JP7320192A JP3217112B2 JP 3217112 B2 JP3217112 B2 JP 3217112B2 JP 07320192 A JP07320192 A JP 07320192A JP 7320192 A JP7320192 A JP 7320192A JP 3217112 B2 JP3217112 B2 JP 3217112B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化糖の選択的脱硫
化方法に関し、更に詳しくは硫酸化糖の硫酸エステルの
うち、第１級水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類
からなる場合は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表
す）に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法
に関する。
化方法に関し、更に詳しくは硫酸化糖の硫酸エステルの
うち、第１級水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類
からなる場合は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表
す）に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物活性を有する硫酸化糖を提供するた
めに、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されている。
硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素メタノ−ル中
で酸触媒により脱硫酸する方法が知られている（Kantor
T.G. and Schubert M., J. Amer. Chem. Soc. 79, 152
(1957) ）。しかし、この方法では特定の硫酸基のみを
脱硫酸することはできず、またグリコシド結合のメタノ
リシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子化し、もと
の鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。
めに、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されている。
硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素メタノ−ル中
で酸触媒により脱硫酸する方法が知られている（Kantor
T.G. and Schubert M., J. Amer. Chem. Soc. 79, 152
(1957) ）。しかし、この方法では特定の硫酸基のみを
脱硫酸することはできず、またグリコシド結合のメタノ
リシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子化し、もと
の鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。
【０００３】収量よく脱硫酸を行う方法として、ジメチ
ルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピ
リジン等の非プロトン性溶媒中（Usov A. I., Adamyant
s K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and
Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)）又
は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド
中（Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohyd
r. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and
Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)）で行う
ソルボリシスがある。ソルボリシスの反応機構は、非プ
ロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用い
て行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。
この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによりＮ
−硫酸基の選択的脱硫酸方法として用いることができ
る。しかし、Ｏ−硫酸基の場合には、第１級又は第２級
水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱離させること
はできなかった。また、現在までのところ位置特異性を
持った脱硫酸化酵素も知られていない。
ルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピ
リジン等の非プロトン性溶媒中（Usov A. I., Adamyant
s K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and
Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)）又
は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド
中（Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohyd
r. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and
Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)）で行う
ソルボリシスがある。ソルボリシスの反応機構は、非プ
ロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用い
て行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。
この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによりＮ
−硫酸基の選択的脱硫酸方法として用いることができ
る。しかし、Ｏ−硫酸基の場合には、第１級又は第２級
水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱離させること
はできなかった。また、現在までのところ位置特異性を
持った脱硫酸化酵素も知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】第１級水酸基に結合し
ている硫酸基の特異的脱離法の開発は、ヒトに対し好ま
しい生物活性を有する医薬品の創造を目的とした硫酸化
糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化
多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロ
イチン硫酸、ヘパリン類は、脂質代謝改善剤、抗血栓剤
として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したも
のは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸
基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用
が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化
糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異
なり、各硫酸化糖の生理活性も微妙に異なる。本発明者
は、硫酸化糖の特定位置の硫酸エステルを脱硫酸化する
ことにより、出血作用が少なく、かつ元の硫酸化糖に対
して異なる生物活性を発現させるための位置選択的硫酸
エステルの脱硫酸を目的として鋭意検討し、本発明に到
達した。
ている硫酸基の特異的脱離法の開発は、ヒトに対し好ま
しい生物活性を有する医薬品の創造を目的とした硫酸化
糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化
多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロ
イチン硫酸、ヘパリン類は、脂質代謝改善剤、抗血栓剤
として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したも
のは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸
基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用
が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化
糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異
なり、各硫酸化糖の生理活性も微妙に異なる。本発明者
は、硫酸化糖の特定位置の硫酸エステルを脱硫酸化する
ことにより、出血作用が少なく、かつ元の硫酸化糖に対
して異なる生物活性を発現させるための位置選択的硫酸
エステルの脱硫酸を目的として鋭意検討し、本発明に到
達した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、硫酸化
糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）
アセトアミド類と反応させることにより、硫酸化糖の第
１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸する
ことを特徴とする脱硫酸化糖の製造方法である。
糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）
アセトアミド類と反応させることにより、硫酸化糖の第
１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸する
ことを特徴とする脱硫酸化糖の製造方法である。
【０００６】本発明の方法によれば、硫酸化糖の第１級
水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類からなる場合
は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表す）に結合して
いる全部の硫酸基の脱硫酸化、又は部分的脱硫酸化を選
択的に行うことができる。
水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類からなる場合
は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表す）に結合して
いる全部の硫酸基の脱硫酸化、又は部分的脱硫酸化を選
択的に行うことができる。
【０００７】本発明の方法が適用される硫酸化糖は、単
糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖の類を問わず、該糖の硫
酸エステルである。本方法に用いられる硫酸化糖の有機
塩基塩としては、ピリジン等の芳香族アミン；トリメチ
ルアミン、トリエチルアミン等の脂肪族３級アミン；Ｎ
−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチ
ルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル
複素環アミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖の類を問わず、該糖の硫
酸エステルである。本方法に用いられる硫酸化糖の有機
塩基塩としては、ピリジン等の芳香族アミン；トリメチ
ルアミン、トリエチルアミン等の脂肪族３級アミン；Ｎ
−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチ
ルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル
複素環アミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
【０００８】有機塩基を溶媒として硫酸化糖を溶解し、
該有機塩基との塩を形成させる。続いて無水の有機塩基
の存在下、トリメチルシリル化試薬であるＮ，Ｏ−ビス
（トリメチルシリル）アセトアミド（以下ＢＴＳＡと略
記）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフロロア
セトアミド（ＢＴＳＦＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチル
シリル）ジフロロアセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメ
チルシリル）モノフロロアセトアミドを加え、反応温度
を室温〜１００℃で反応させることにより、本発明の選
択的脱硫酸化を達成することができる。
該有機塩基との塩を形成させる。続いて無水の有機塩基
の存在下、トリメチルシリル化試薬であるＮ，Ｏ−ビス
（トリメチルシリル）アセトアミド（以下ＢＴＳＡと略
記）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフロロア
セトアミド（ＢＴＳＦＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチル
シリル）ジフロロアセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメ
チルシリル）モノフロロアセトアミドを加え、反応温度
を室温〜１００℃で反応させることにより、本発明の選
択的脱硫酸化を達成することができる。
【０００９】第１級水酸基に結合している硫酸基の全部
を脱硫酸化する場合は、硫酸化糖中の遊離水酸基及び硫
酸エステル化水酸基を含む全水酸基のモル量に対し１６
倍モル量以上、第１級水酸基に結合している硫酸基を部
分的に脱硫酸化し、該硫酸基量の一部を残存させる場合
には、３倍〜１６倍モル量のトリメチエルシリル化試薬
を用いればよい。
を脱硫酸化する場合は、硫酸化糖中の遊離水酸基及び硫
酸エステル化水酸基を含む全水酸基のモル量に対し１６
倍モル量以上、第１級水酸基に結合している硫酸基を部
分的に脱硫酸化し、該硫酸基量の一部を残存させる場合
には、３倍〜１６倍モル量のトリメチエルシリル化試薬
を用いればよい。
【００１０】具体的には、例えば、第１級水酸基に結合
している硫酸基の全部を脱硫酸化する場合、前記の条件
を満足するトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は４０℃〜８０℃で３時間以内反応させることにより、
目的の全部を脱硫酸化することができる。また、第１級
水酸基に結合している硫酸基を部分的に脱硫酸化する場
合、所定のトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は３０℃〜８０℃で２時間以上、適宜条件を組み合わせ
て反応させることにより目的を達成できる。
している硫酸基の全部を脱硫酸化する場合、前記の条件
を満足するトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は４０℃〜８０℃で３時間以内反応させることにより、
目的の全部を脱硫酸化することができる。また、第１級
水酸基に結合している硫酸基を部分的に脱硫酸化する場
合、所定のトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は３０℃〜８０℃で２時間以上、適宜条件を組み合わせ
て反応させることにより目的を達成できる。
【００１１】続いて反応液中に水を加え、余分のトリメ
チルシリル化剤を加水非反応性とすることにより反応を
停止させ、次いで溶媒及び非反応性のトリメチルシリル
化剤を透析により可能な限り除去する。次に、透析内液
を１００℃で３０分〜１時間沸騰させ、透析内液中に残
存するＯ−トリメチルシリル化糖誘導体のＯ−トリメチ
ルシリル基を加水分解除去する。
チルシリル化剤を加水非反応性とすることにより反応を
停止させ、次いで溶媒及び非反応性のトリメチルシリル
化剤を透析により可能な限り除去する。次に、透析内液
を１００℃で３０分〜１時間沸騰させ、透析内液中に残
存するＯ−トリメチルシリル化糖誘導体のＯ−トリメチ
ルシリル基を加水分解除去する。
【００１２】用いた硫酸化糖に、第１級水酸基との硫酸
エステルに加えて第２級水酸基との硫酸エステルが存在
する場合、又は、第１級水酸基に結合している硫酸基の
全部を脱硫酸化しない反応条件を選択した場合には、こ
れら残存する硫酸基をＮａ塩とするために、水酸化ナト
リウムを加えてpH９前後に調整し、透析した後、凍結乾
燥して硫酸化糖のナトリウム塩を得ることができる。
エステルに加えて第２級水酸基との硫酸エステルが存在
する場合、又は、第１級水酸基に結合している硫酸基の
全部を脱硫酸化しない反応条件を選択した場合には、こ
れら残存する硫酸基をＮａ塩とするために、水酸化ナト
リウムを加えてpH９前後に調整し、透析した後、凍結乾
燥して硫酸化糖のナトリウム塩を得ることができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明するが、硫酸化糖の同定は以下の試験例に基
づき行った。実施例は本発明の範囲をなんら制限するも
のではない。
詳細に説明するが、硫酸化糖の同定は以下の試験例に基
づき行った。実施例は本発明の範囲をなんら制限するも
のではない。
【００１４】試験例 １）硫酸イオンの定量 硫酸化糖及び脱硫酸化糖の硫酸基の定量は、新生化学実
験講座３，糖質II，p37,p 81 （東京化学同人刊）に記
載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫酸イ
オンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着させ
た後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを電気
電導度計を用いて検出、定量した。
験講座３，糖質II，p37,p 81 （東京化学同人刊）に記
載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫酸イ
オンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着させ
た後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを電気
電導度計を用いて検出、定量した。
【００１５】すなわち、３００μｇの硫酸化糖に３Ｎ−
塩酸1 mlを加え、１００℃で１８時間加水分解した。そ
の溶液を乾燥した後、１ｍｌの水に溶解した。ミリポア
限外ろ過膜（0.45 μm ）でろ過した後、硫酸イオン含
量をＨＰＬＣ（Waters ILC-1）によるイオン交換クロマ
ロトグラフィーで分析した。カラムに IC Pak Anion（W
aters, 4.6 mm × 5 cm ）を用い、1.3 mM四ホウ酸ナ
トリウム、 1.5 mM グルコン酸ナトリウム、 6 mM ホウ
酸、0.25％グリセリン及び 12 ％アセトニトリルの組成
の移動相を使用して、0.8 ml／分の流速で展開した。硫
酸イオンの検出には電気電導度計（Waters 430）を用い
た。
塩酸1 mlを加え、１００℃で１８時間加水分解した。そ
の溶液を乾燥した後、１ｍｌの水に溶解した。ミリポア
限外ろ過膜（0.45 μm ）でろ過した後、硫酸イオン含
量をＨＰＬＣ（Waters ILC-1）によるイオン交換クロマ
ロトグラフィーで分析した。カラムに IC Pak Anion（W
aters, 4.6 mm × 5 cm ）を用い、1.3 mM四ホウ酸ナ
トリウム、 1.5 mM グルコン酸ナトリウム、 6 mM ホウ
酸、0.25％グリセリン及び 12 ％アセトニトリルの組成
の移動相を使用して、0.8 ml／分の流速で展開した。硫
酸イオンの検出には電気電導度計（Waters 430）を用い
た。
【００１６】２）13Ｃ−ＮＭＲ 硫酸化糖の水酸基の性質を判定する目的で、骨格炭素の
核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液
でのスペクトルは、80℃、 75.4 MHz(GeneralElectoric
Company, QE-300 ）で測定した。
核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液
でのスペクトルは、80℃、 75.4 MHz(GeneralElectoric
Company, QE-300 ）で測定した。
【００１７】３）酵素消化による構造解析 新生化学実験講座３，糖質II p49〜62に記載の「２・８
グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構
造解析」を参照して次のようにして行った。
グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構
造解析」を参照して次のようにして行った。
【００１８】ａ）コンドロイチナ−ゼＡＢＣによる消化 吉田らの方法（生化学，57,1189 (1985)）により、デル
マタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（10 mg/m
l）２０μl に、0.4 M トリス−塩酸(pH 8.0)２０μl
、0.4 M 酢酸ナトリウム２０μl 、0.1 ％ウシ血清ア
ルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コンドロイ
チナ−ゼＡＢＣ（5U/ml ）を２０μl 加えて、３７℃で
２時間反応させた。
マタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（10 mg/m
l）２０μl に、0.4 M トリス−塩酸(pH 8.0)２０μl
、0.4 M 酢酸ナトリウム２０μl 、0.1 ％ウシ血清ア
ルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コンドロイ
チナ−ゼＡＢＣ（5U/ml ）を２０μl 加えて、３７℃で
２時間反応させた。
【００１９】ｂ）ヘパリン分解酵素による消化 M,W,Mcleanの方法（M.W.Mclean, “ Proc. 9th Int. Sy
mp. Glycoconjugates”,p.B41(1987)）により、ヘパリ
ン０．１ mg を 2 mM 酢酸カルシウムを含む 20 mM 酢
酸ナトリウム (pH 7.0) ２２０μl に溶解して、20 mU
のヘパリナ−ゼ、20 mU のヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加
えて、３７℃で２時間反応させた。
mp. Glycoconjugates”,p.B41(1987)）により、ヘパリ
ン０．１ mg を 2 mM 酢酸カルシウムを含む 20 mM 酢
酸ナトリウム (pH 7.0) ２２０μl に溶解して、20 mU
のヘパリナ−ゼ、20 mU のヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加
えて、３７℃で２時間反応させた。
【００２０】ｃ）ＨＰＬＣによる分析 コンドロイチナ−ゼＡＢＣ又はヘパリン分解酵素消化を
行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル
852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津 P
NH2 カラム,4.0 mm × 250 mm ）を使用し、232 nmでの
吸光度を測定した。流速１ml／分で、16mMリン酸水素ナ
トリウムを６０分間に０％から５０％まで上昇させて溶
出した。
行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル
852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津 P
NH2 カラム,4.0 mm × 250 mm ）を使用し、232 nmでの
吸光度を測定した。流速１ml／分で、16mMリン酸水素ナ
トリウムを６０分間に０％から５０％まで上昇させて溶
出した。
【００２１】４）ゲルろ過 硫酸化糖の３％溶液１０μl をＨＰＬＣによるゲルろ過
で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、
7.8 mm × 30 cm）を用い、溶離液に 0.2 M硫酸カリウ
ムを使用して、1.0 ml／分の流速で展開した。硫酸化糖
の検出には示差屈折計（島津,AID-2A ）を用いた。
で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、
7.8 mm × 30 cm）を用い、溶離液に 0.2 M硫酸カリウ
ムを使用して、1.0 ml／分の流速で展開した。硫酸化糖
の検出には示差屈折計（島津,AID-2A ）を用いた。
【００２１】実施例１ メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸アンモニウム
塩約２mg／３mlの水溶液に、アンバ−ライトＩＲ−１２
０Ｈ型樹脂５mlを加えて、遊離の硫酸エステル型に変換
させた。樹脂を除去した後、ピリジン２mlを加え、ピリ
ジニウム塩を形成させた。残余のピリジンを減圧下で留
去し、残渣を凍結乾燥することにより、乾燥メチル−α
−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩を調製し
た。この試料を各０．２ mg づつ小分けし、乾燥ピリジ
ン約０．０５mlを加えて、メチル−α−ガラクトピラノ
シド−６硫酸ピリジニウム塩の全水酸基モル量（[-OH]
＋[-O-SO3 -]）に対するＢＴＳＡのモル量が０〜２０倍
量までの異なる反応系を用意した。各系にＢＴＳＡを加
えた後、８０℃で約１時間加熱反応させた。各系の反応
混合物中のトリメチルシリル化メチルガラクトピラノシ
ドを直接ガスクロマトグラフィ−で測定することによ
り、脱硫酸量を算出して図１に示した。
塩約２mg／３mlの水溶液に、アンバ−ライトＩＲ−１２
０Ｈ型樹脂５mlを加えて、遊離の硫酸エステル型に変換
させた。樹脂を除去した後、ピリジン２mlを加え、ピリ
ジニウム塩を形成させた。残余のピリジンを減圧下で留
去し、残渣を凍結乾燥することにより、乾燥メチル−α
−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩を調製し
た。この試料を各０．２ mg づつ小分けし、乾燥ピリジ
ン約０．０５mlを加えて、メチル−α−ガラクトピラノ
シド−６硫酸ピリジニウム塩の全水酸基モル量（[-OH]
＋[-O-SO3 -]）に対するＢＴＳＡのモル量が０〜２０倍
量までの異なる反応系を用意した。各系にＢＴＳＡを加
えた後、８０℃で約１時間加熱反応させた。各系の反応
混合物中のトリメチルシリル化メチルガラクトピラノシ
ドを直接ガスクロマトグラフィ−で測定することによ
り、脱硫酸量を算出して図１に示した。
【００２２】実施例２ 実施例１のＢＴＳＡモル量を１６倍量及び８倍量に設定
し、反応温度を４０℃、６０℃、８０℃に変えて、経時
的に脱硫酸化率を検討した。その結果を図２に示した。
し、反応温度を４０℃、６０℃、８０℃に変えて、経時
的に脱硫酸化率を検討した。その結果を図２に示した。
【００２３】実施例１及び２から明らかなように、ＢＴ
ＳＡが硫酸化糖の遊離水酸基及び硫酸化水酸基を含む全
水酸基のモル量に対して１６倍モル量以上で、反応温度
４０℃〜８０℃、３時間以内反応させることにより第１
級水酸基に結合している硫酸基の全部を脱硫酸化するこ
とができる。また第１級水酸基に結合している硫酸基を
部分的に脱硫酸化する場合には、ＢＴＳＡを３〜１６倍
迄のモル量で、反応温度を３０℃〜８０℃、反応時間を
適宜選択することにより目的を達成することができる。
ＳＡが硫酸化糖の遊離水酸基及び硫酸化水酸基を含む全
水酸基のモル量に対して１６倍モル量以上で、反応温度
４０℃〜８０℃、３時間以内反応させることにより第１
級水酸基に結合している硫酸基の全部を脱硫酸化するこ
とができる。また第１級水酸基に結合している硫酸基を
部分的に脱硫酸化する場合には、ＢＴＳＡを３〜１６倍
迄のモル量で、反応温度を３０℃〜８０℃、反応時間を
適宜選択することにより目的を達成することができる。
【００２４】実施例３〜９ α−Ｄ−ガラクトピラノシド−６硫酸（実施例３）、α
−Ｄ−ガラクトピラノシド−２硫酸（実施例４）、フノ
ラン（実施例５）、ポルフィラン（実施例６）、コンド
ロイチン硫酸（実施例７）、デルマタン硫酸（実施例
８）、ヘパリン（実施例９）の７種の硫酸化糖の脱硫酸
化を、それぞれＢＳＴＡにより以下のようにして行っ
た。
−Ｄ−ガラクトピラノシド−２硫酸（実施例４）、フノ
ラン（実施例５）、ポルフィラン（実施例６）、コンド
ロイチン硫酸（実施例７）、デルマタン硫酸（実施例
８）、ヘパリン（実施例９）の７種の硫酸化糖の脱硫酸
化を、それぞれＢＳＴＡにより以下のようにして行っ
た。
【００２５】各硫酸化糖のナトリウム塩２００mgをそれ
ぞれＩＲ−１２０（Ｈ+ 型）カラム（1 ×10 cm ）にか
け、溶出液に過剰のピリジンを加えてpH８に中和し、凍
結乾燥して各硫酸化糖のピリジン塩を調製した。各硫酸
化糖のピリジン塩をそれぞれ脱水したピリジン２０mlに
溶解して反応試料とした。各試料の糖骨格の全水酸基の
計算当量に対して２０倍モル量（約４ml）のＢＴＳＡを
加え、６０℃で２時間攪拌した。反応終了後、２０ｍｌ
の水を加えて未反応のＢＴＳＡを加水非反応性とするこ
とにより反応を停止させ、ミリポア限外ろ過膜を用いて
透析した。
ぞれＩＲ−１２０（Ｈ+ 型）カラム（1 ×10 cm ）にか
け、溶出液に過剰のピリジンを加えてpH８に中和し、凍
結乾燥して各硫酸化糖のピリジン塩を調製した。各硫酸
化糖のピリジン塩をそれぞれ脱水したピリジン２０mlに
溶解して反応試料とした。各試料の糖骨格の全水酸基の
計算当量に対して２０倍モル量（約４ml）のＢＴＳＡを
加え、６０℃で２時間攪拌した。反応終了後、２０ｍｌ
の水を加えて未反応のＢＴＳＡを加水非反応性とするこ
とにより反応を停止させ、ミリポア限外ろ過膜を用いて
透析した。
【００２６】次にＯ−トリメチルシリル基を加水分解除
去するため、透析内液を１００℃で３０分から１時間
（溶液が透明になるまで）加熱沸騰させた。水酸化ナト
リウムを加えてpH９〜９．５に調整した後、透析した。
透析内液を凍結乾燥して、各硫酸化糖の脱硫酸化処理物
各１４０ mg 相当のナトリウム塩を得た。各糖の処理前
後の硫酸イオンの定量値を表１に示す。
去するため、透析内液を１００℃で３０分から１時間
（溶液が透明になるまで）加熱沸騰させた。水酸化ナト
リウムを加えてpH９〜９．５に調整した後、透析した。
透析内液を凍結乾燥して、各硫酸化糖の脱硫酸化処理物
各１４０ mg 相当のナトリウム塩を得た。各糖の処理前
後の硫酸イオンの定量値を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例１０，比較例１〜３ 実施例３及び４に準じ、トリメチルシリル化剤としてＢ
ＴＳＦＡ、トリメチルシリルイミダゾ−ル（ＴＳＩ）、
ヨウ化トリメチルシラン（ＩＴＳ）、Ｎ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）カーバメ−ト（ＢＳＣ）を用いて反応
させた結果を表２に示す。
ＴＳＦＡ、トリメチルシリルイミダゾ−ル（ＴＳＩ）、
ヨウ化トリメチルシラン（ＩＴＳ）、Ｎ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）カーバメ−ト（ＢＳＣ）を用いて反応
させた結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】実施例３、４から判るように、本発明の方
法は、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱
硫酸化する方法であり、第２級水酸基の脱硫酸化は起こ
らないことが判る。
法は、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱
硫酸化する方法であり、第２級水酸基の脱硫酸化は起こ
らないことが判る。
【００３１】実施例５のフノランは - 3 D Gal(6-SO4)
β1-4(3,6-anhydro)L-Gal α1-の２糖が繰り返した構造
であり、ＢＴＳＡ処理により硫酸基が殆んど無くなっ
た。実施例６のポルフィランは -3 D Gal β1-4 LGal(6
-SO4) α1- の２糖が繰り返した構造であり、ＢＴＳＡ
処理により硫酸基が殆んど無くなった。これら実施例５
及び６におけるＮＭＲの解析では、Ｃ−６位の13Ｃシグ
ナルの高磁場シフト並びにＣ−５位の低磁場シフトが確
認され、他の部位に変化がなく、Perlin A.S. and Casu
B. の報告（The Polysaccharides Vol.1,p133〜193 (
Academic Press )）と一致した。
β1-4(3,6-anhydro)L-Gal α1-の２糖が繰り返した構造
であり、ＢＴＳＡ処理により硫酸基が殆んど無くなっ
た。実施例６のポルフィランは -3 D Gal β1-4 LGal(6
-SO4) α1- の２糖が繰り返した構造であり、ＢＴＳＡ
処理により硫酸基が殆んど無くなった。これら実施例５
及び６におけるＮＭＲの解析では、Ｃ−６位の13Ｃシグ
ナルの高磁場シフト並びにＣ−５位の低磁場シフトが確
認され、他の部位に変化がなく、Perlin A.S. and Casu
B. の報告（The Polysaccharides Vol.1,p133〜193 (
Academic Press )）と一致した。
【００３２】実施例８のコンドロイチン硫酸は鮫由来の
もので、コンドロイチナ−ゼ類を用いる組成２糖分析に
より、６硫酸：４硫酸の量比が９０：１０であった。実
施例８、９のコンドロイチン硫酸とヘパリンは、６硫酸
だけでなく４硫酸やジ硫酸エステル等を含んでおり、Ｂ
ＴＳＡ処理後の硫酸イオン含量はそれぞれ６．６％、２
４．９％の値を示した。実施例７のデルマタン硫酸は殆
んどが４硫酸であったため、ＢＴＳＡ処理前後での硫酸
イオン含量の変化は少なかった。
もので、コンドロイチナ−ゼ類を用いる組成２糖分析に
より、６硫酸：４硫酸の量比が９０：１０であった。実
施例８、９のコンドロイチン硫酸とヘパリンは、６硫酸
だけでなく４硫酸やジ硫酸エステル等を含んでおり、Ｂ
ＴＳＡ処理後の硫酸イオン含量はそれぞれ６．６％、２
４．９％の値を示した。実施例７のデルマタン硫酸は殆
んどが４硫酸であったため、ＢＴＳＡ処理前後での硫酸
イオン含量の変化は少なかった。
【００３３】デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリンについては、更に詳しい構造変化を調べるため
に、２糖単位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。
実施例７、８、９の対応する硫酸化糖並びに脱硫酸化処
理後の糖に対し、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫
酸に対してはコンドロイチナ−ゼＡＢＣ、ヘパリンに対
してはヘパリン分解酵素を用い、新実験生化学講座３，
糖質II p54〜59（東京化学同人刊）の方法に従って処理
した。生じた不飽和２糖異性体のＨＰＬＣ分画クロマト
グラムを図３に示す。
パリンについては、更に詳しい構造変化を調べるため
に、２糖単位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。
実施例７、８、９の対応する硫酸化糖並びに脱硫酸化処
理後の糖に対し、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫
酸に対してはコンドロイチナ−ゼＡＢＣ、ヘパリンに対
してはヘパリン分解酵素を用い、新実験生化学講座３，
糖質II p54〜59（東京化学同人刊）の方法に従って処理
した。生じた不飽和２糖異性体のＨＰＬＣ分画クロマト
グラムを図３に示す。
【００３４】実施例７で用いたデルマタン硫酸は殆んど
が４硫酸であり、６硫酸が少量混ざっているものであっ
が、ＢＴＳＡ処理により６硫酸のみに脱硫酸が起こり、
硫酸基が結合していない２糖残基になった以外は全く変
化が認められなかった。また、実施例８で用いたコンド
イチン硫酸は６硫酸、４硫酸、ジ硫酸エステル等の混合
物であったが、ＢＴＳＡ処理をすると、６硫酸のみが脱
離したために起きた変化しか見られなかった。次に実施
例９で用いたヘパリンについては、消化されて遊離した
２糖残基を比較すると６硫酸のみが脱離され、その他の
位置の硫酸基は一切変化を受けていなかった。
が４硫酸であり、６硫酸が少量混ざっているものであっ
が、ＢＴＳＡ処理により６硫酸のみに脱硫酸が起こり、
硫酸基が結合していない２糖残基になった以外は全く変
化が認められなかった。また、実施例８で用いたコンド
イチン硫酸は６硫酸、４硫酸、ジ硫酸エステル等の混合
物であったが、ＢＴＳＡ処理をすると、６硫酸のみが脱
離したために起きた変化しか見られなかった。次に実施
例９で用いたヘパリンについては、消化されて遊離した
２糖残基を比較すると６硫酸のみが脱離され、その他の
位置の硫酸基は一切変化を受けていなかった。
【００３５】更に、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫
酸、ヘパリンについて、ゲルろ過によりＢＴＳＡ処理前
後の分子量変化を調べた。図４に示したように分子量分
布の変化は殆んど認められなかった。
酸、ヘパリンについて、ゲルろ過によりＢＴＳＡ処理前
後の分子量変化を調べた。図４に示したように分子量分
布の変化は殆んど認められなかった。
【００３６】以上のことから、ＢＴＳＡによる脱硫酸化
反応は、第１級水酸基に結合している硫酸基に特異的に
働き、他の位置の硫酸基及びグリコシド結合には影響を
与えないことが明らかである。
反応は、第１級水酸基に結合している硫酸基に特異的に
働き、他の位置の硫酸基及びグリコシド結合には影響を
与えないことが明らかである。
【００３７】実施例１、１０及び比較例１、２、３から
わかるように、本発明の方法で適用可能なシリル化剤と
しては、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミ
ド類のような有機カルボン酸アミドのＮ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）化合物に特定できる。
わかるように、本発明の方法で適用可能なシリル化剤と
しては、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミ
ド類のような有機カルボン酸アミドのＮ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）化合物に特定できる。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、糖骨格の水酸基に結合
している性質の異なる硫酸基を、第１級水酸基及び第２
級水酸基の違いを認識して脱硫酸化することにより、従
来知られていない位置特定硫酸エステルを有する硫酸化
糖を製造することができる。
している性質の異なる硫酸基を、第１級水酸基及び第２
級水酸基の違いを認識して脱硫酸化することにより、従
来知られていない位置特定硫酸エステルを有する硫酸化
糖を製造することができる。
【図１】ＢＴＳＡ量変化に伴うメチル−α−ガラクトピ
ラノシド−６硫酸の脱硫酸化率を示したグラフである。
ラノシド−６硫酸の脱硫酸化率を示したグラフである。
【図２】メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸の各
温度における経時的脱硫酸化率を示したグラフである。
実線はＢＴＳＡ１６倍モル量、破線はＢＴＳＡ８倍モル
量での結果を示す。
温度における経時的脱硫酸化率を示したグラフである。
実線はＢＴＳＡ１６倍モル量、破線はＢＴＳＡ８倍モル
量での結果を示す。
【図３】ＢＴＳＡ処理による糖組成の変化を示した分画
クロマトグラムである。
クロマトグラムである。
【図４】ＢＴＳＡ処理による分子量分布の変化を示した
ＨＰＬＣ（ゲルろ過）のクロマトグラムである。実線は
ＢＴＳＡ処理前、破線はＢＴＳＡ処理後を示す。
ＨＰＬＣ（ゲルろ過）のクロマトグラムである。実線は
ＢＴＳＡ処理前、破線はＢＴＳＡ処理後を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 硫酸化糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス
（トリメチルシリル）アセトアミド類と反応させること
により、硫酸化糖の第１級水酸基に結合している硫酸基
を選択的に脱硫酸することを特徴とする脱硫酸化糖の製
造方法。 - 【請求項２】 フノラン、ポルフィラン、及びヘパリン
からなる群より選択される第１級水酸基に硫酸基が結合
している硫酸化多糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）アセトアミド類と反応させることによ
り得られる、第１級水酸基に結合している硫酸基が選択
的に脱硫酸された硫酸化多糖。 - 【請求項３】 硫酸イオン含量が２５％以下である、請
求項３に記載の硫酸化多糖。 - 【請求項４】 コンドロイチン硫酸の第１級水酸基に硫
酸基が結合している硫酸化多糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ
−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド類と反応させ
ることにより得られる第１級水酸基に結合している硫酸
基が選択的に脱硫酸されたコンドロイチン硫酸であっ
て、前記コンドロイチン硫酸は、グリコサミノグリカン
分解酵素とＨＰＬＣとを組み合わせた構造解析におい
て、ΔＤｉ−６Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉＳDで表される不飽
和二糖異性体が実質的に検出されず、少なくともΔＤｉ
−０Ｓ及びΔＤｉ−ＵＡ２Ｓで表される不飽和二糖異性
体が検出されるものである、第１級水酸基に結合してい
る硫酸基が選択的に脱硫酸されたコンドロイチン硫酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07320192A JP3217112B2 (ja) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | 硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07320192A JP3217112B2 (ja) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | 硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05230090A JPH05230090A (ja) | 1993-09-07 |
| JP3217112B2 true JP3217112B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=13511301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07320192A Expired - Lifetime JP3217112B2 (ja) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | 硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3217112B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69739750D1 (de) | 1996-07-23 | 2010-03-18 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Neue laktosamin-oligosaccharide und verfahren zu ihrer herstellung |
| JP4675048B2 (ja) * | 2004-02-18 | 2011-04-20 | 公益財団法人野口研究所 | 硫酸糖ライブラリー |
| MX2020002011A (es) | 2017-08-23 | 2020-07-13 | Ecolab Usa Inc | Dispersante de azufre elemental para controlar las incrustaciones en sistemas de agua. |
-
1992
- 1992-02-25 JP JP07320192A patent/JP3217112B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05230090A (ja) | 1993-09-07 |
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