JP3205226B2 - トリプシン様酵素をコードする核酸塩基配列および該酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トリプシン様酵
素、さらに詳しくは慢性気道疾患患者の喀痰中などに見
い出されるプロテアーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮ
Ａ核酸塩基配列、並びに該核酸塩基配列を用いる上記プ
ロテアーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト肺および気道内には様々なプロテア
ーゼが存在することが知られており、例えば慢性呼吸器
疾患患者の肺および気道内に見出せる好中球由来プロテ
アーゼとしては、エラスターゼ、カテプシンＧ、コラゲ
ナーゼ、ゼラチナーゼ、プロテアーゼ３がある。好中球
は細菌、ウイルスなどの外来異物に対する防御機構とし
て働くが、炎症が亢進したり慢性化した場合、異物を処
理しきれず、好中球自身の破壊により好中球プロテアー
ゼの放出が起こるとされている。

【０００３】また、肥満細胞由来のトリプシン様酵素と
して、分子量約１４万のトリプターゼが肺および気道内
に存在することも知られているが、その生理的な役割は
完全には解明されていない（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２５９，１
１０４６〜１１０５１，１９８４）。このトリプターゼ
とは異なるトリプシン様酵素として、慢性気道疾患患者
喀痰より粗精製された分子量２０，０００のプロテアー
ゼが知られている（１９９２年４月胸部疾患学会要旨
集、ｐ２８０，Ｇ−７７、ｐ３１９，Ｉ−３６）。この
プロテアーゼはトロンビン合成基質およびトリプシン用
合成基質を分解し、生体基質としてフィブリノーゲンを
分解することが示されているが、その生理的な役割は不
明である。

【０００４】生体基質であるフィブリノーゲンの分解作
用を有する酵素は、様々な疾患の治療薬への応用が考え
られる。気管支喘息など呼吸器疾患の痰、特に粘性痰に
はフィブリンが含まれており、その粘性に関与している
ことが示唆されている（１９９３年３月胸部疾患学会要
旨集、ｐ３１１，Ｋ１−５８）。したがって、フィブリ
ンの前駆物質であるフィブリノーゲンを選択的に分解す
るトリプシン様酵素は去痰剤への応用が期待される。ま
た、腫瘍細胞の転移形成過程における血管床着床にはフ
ィブリン網形成が関与しており（Irish. J. Med. Sci.
３９４，４７４〜４７９，１９５８）、さらにフィブリ
ン網は腫瘍細胞を免疫細胞から保護する役割があること
が知られている（Thromb. Diath. Haem. Sappl. ５９，
１３９〜１５６，１９７４）。したがって、フィブリノ
ーゲンを分解し、フィブリン網形成を減少させるトリプ
シン様酵素は、腫瘍細胞転移抑制剤として期待される。
さらに、血液中のフィブリノーゲンを分解し、血液凝固
時間を延長するトリプシン様酵素は広義の血液凝固阻止
剤として、循環器疾患、例えば慢性動脈閉塞症、末梢循
環障害などへの適用が期待される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】トリプシン様酵素はヒ
ト喀痰から精製することができるが、出発材料の入手可
能性が限定されていることおよび喀痰中のトリプシン様
酵素の濃度が低いために、この方法は複雑で、得られた
物は高価となる。本願発明はトリプシン様酵素の臨床的
適用の可能性を容易とするためトリプシン様酵素の有用
な量を製造を可能ならしめる手段を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、慢性呼吸
器疾患患者の喀痰からトリプシン活性をもつ酵素（プロ
テアーゼ）を単離し、そのＮ末端の２０個のアミノ酸配
列を決定し、このアミノ酸配列をベースに該アミノ酸配
列をコードするＤＮＡを合成し、さらにこのＤＮＡを用
いてrapid amplification of cDNA ends（以下、ＲＡＣ
Ｅと称す。）法により上記酵素をコードする核酸塩基配
列のクローニングに成功し、該酵素の全アミノ酸配列を
決定した。

【０００７】かくして、本発明は、下記アミノ酸配列
［Ｉ］：

【０００８】

【化３】 Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asn Asn Ala His His Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn 20 25 30 Asn Met Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Arg Ser Asn Ser Asn 35 40 45 Pro Arg Asp Trp Ile Ala Thr Ser Gly Ile Ser Thr Thr Phe Pro Lys 50 55 60 Leu Arg Met Arg Val Arg Asn Ile Leu Ile His Asn Asn Tyr Lys Ser 65 70 75 80 Ala Thr His Glu Asn Asp Ile Ala Leu Val Arg Leu Glu Asn Ser Val 85 90 95 Thr Phe Thr Lys Asp Ile His Ser Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr Gln 100 105 110 Asn Ile Pro Pro Gly Ser Thr Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly Ala Gln 115 120 125 Glu Tyr Ala Gly His Thr Val Pro Glu Leu Arg Gln Gly Gln Val Arg 130 135 140 Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Ala Pro His Ser Tyr Asn Gly Ala 145 150 155 160 Ile Leu Ser Gly Met Leu Cys Ala Gly Val Pro Gln Gly Gly Val Asp 165 170 175 Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Gln Glu Asp Ser Arg 180 185 190 Arg Leu Trp Phe Ile Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Asp Gln Cys Gly 195 200 205 Leu Pro Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Thr Ala Tyr Leu Asp 210 215 220 Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly Ile 225 230 を有するトリプシン様酵素またはその生化学的同等物を
コードする核酸塩基配列を提供するものである。

【０００９】本発明の核酸塩基配列がコードするトリプ
シン様酵素は、ヒト下気道、殊に慢性気道疾患患者の喀
痰、気道粘液、気道洗浄液などの中に存在するプロテア
ーゼであり、以下に述べる如き理化学的特性を有する。 作用：トリプシン様のプロテアーゼ（蛋白分解酵素）
活性。 基質特異性：トリプシン用合成基質およびトロンビン
用合成基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基質、
エラスターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質およ
びロイシンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解しな
い。 至適ｐＨ：トリプシン用合成基質による活性測定にお
いて、８．２〜９．２（Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッファ
ー）、殊に８．６付近。 力価の測定法：トリプシン用合成基質を用いたプロテ
アーゼ活性の測定 作用適温：約３７℃ ｐＨによる失活；ｐＨ６．０ではｐＨ７．６の約２割
になる。 阻害：ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド）（以上、セリンプロテアーゼ阻害剤）、ロイペプ
チン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）およびアンチパイン（Ａｎ
ｔｉｐａｉｎ）（以上トリプシン阻害剤）で阻害され
る。 精製方法：慢性呼吸器疾患患者の喀痰からカラムクロ
マトグラフィーで精製。 分子量：２８０００Ｄａ［ＳＤＳ―ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法（以下、ＳＤＳ―ＰＡＧＥという）に
よる］。

【００１０】さらに詳しくは、上記トリプシン様酵素は トリプシン用合成基質：Boc-Phe-Ser-Arg-MCA およびBo
c-Gln-Ala-Arg-MCA 、 トロンビン用合成基質：Boc-Val-Pro-Arg-MCA をよく分解し ファクターＸａ用合成基質：Boc-Ile-Gln-Gly-Arg-MCA
、 ウロキナーゼ用合成基質：Boc-Gln-Gly-Arg-MCA プラスミン用合成基質：Boc-Val-Leu-Lys-MCA をわずかに分解し、 キモトリプシン用合成基質：Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA
、 エラスターゼ用合成基質：Suc-Ala-Pro-Ala-MCA 、 コラゲネース用合成基質：Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MC
A を分解しない。（ここでＭＣＡはメチルクマリンアミド
（Methylcoumarin amide）を意味する）。

【００１１】また、上記トリプシン様酵素は、生体基質
としてはフィブリノーゲン、ＶＩＰ（vasoactive intes
tinal peptide ）を分解するが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、アル
ブミン、α1 ―アンチトリプシン及びサブスタンスＰは
分解しない。

【００１２】さらに、上記トリプシン様酵素は、トリプ
シンとは対照的に、インフルエンザウイルス、ＮＤＶ宮
寺株及びＶＳＶ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株を不活化する
作用も有している（日本ウイルス学会、第４２回総会
演説抄録、p201, No.4022 ）。 以上に述べた如き理化
学的特性をもつトリプシン様酵素は、後述する実施例１
に具体的に記述されている方法に従い、例えば、疎水性
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の１種又はそれ
以上の組合わせを用いるクロマトグラフィーにより、例
えば、慢性気道疾患患者の喀痰、気道粘液、気道洗浄液
などから単離・精製することによって得ることができ
る。

【００１３】本明細書において、トリプシン様酵素の
「生化学的同等物」とは、上記トリプシン様酵素のアミ
ノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、該
アミノ酸配列の末端もしくは鎖中への１個もしくは複数
個のアミノ酸の付加、及び／又は該アミノ酸配列中の１
個もしくは複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置換
されているポリペプチドであって、上記トリプシン様酵
素と実質的に同等の酵素活性を保持しているものを意味
する。

【００１４】上記のトリプシン様酵素又はその生化学的
同等物をコードする本発明の核酸塩基配列は、後述する
実施例８〜１１で詳細に述べるように、ＲＡＣＥ法（Fr
ohman, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
５，８９９８−９００２（１９８８））によって合成す
ることができるが、その概要を述べれば次のとおりであ
る。

【００１５】一般的に、ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの一
部の配列が既知である場合、これをもとに完全長ｃＤＮ
Ａを効率よく取得する方法である。すなわち、ＰＣＲを
用いてｍＲＮＡの３′末端または５′末端と中ほどの既
知配列領域との間のフラグメントを増幅させｃＤＮＡを
得る方法である。この既知の配列領域から３′末端ある
いは５′末端それぞれの方向に伸長できるようにプライ
マーを作製し、ｃＤＮＡを合成する。従ってＰＣＲの際
は、既知領域に特異的にアニールするプライマーと、
３′末端ではｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列、５′末端では
テイリング反応あるいはライゲーション反応等により付
加した配列にアニールするプライマーを用いる。次に重
複した３′末端側と５′末端側の合成ｃＤＮＡ配列を結
合させて完全長ｃＤＮＡとする。

【００１６】より具体的には、ヒト慢性気道疾患患者の
喀痰中から単離されたトリプシン様酵素のＮ末端アミノ
酸配列２０残基を決定し、この配列に基づいて対応する
コドンの縮重を考慮の上、１〜７番目のアミノ酸をコー
ドし得るオリゴヌクレオチド混合物、ならびに１５〜２
０番目のアミノ酸をコードし得る配列の相補鎖のオリゴ
ヌクレオチド混合物を作製する。そしてこれらをプライ
マー（ｄｅｇｅｎｅｒｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ）に用いて、
ヒト気道ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うと、５９ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントが優先的に増幅される。常法に
よりこの５９ｂｐフラグメントの配列を決定すると、こ
の配列はトリプシン様酵素のＮ末端アミノ酸配列１９残
基をコードしていることから、この５９ｂｐフラグメン
トはトリプシン様酵素のｃＤＮＡの一部であることがわ
かる。このｃＤＮＡの一部の配列をもとにＲＡＣＥ法に
よって以下に述べるようにしてｃＤＮＡ全長の配列を取
得することができる。

【００１７】まず、３′末端側のｃＤＮＡ取得について
説明する。ヒト気道ｍＲＮＡから、その５′末端側に付
加配列を持ったオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵
素で一本鎖ｃＤＮＡを合成する。この一本鎖ｃＤＮＡを
鋳型として先に述べた５９ｂｐフラグメントの配列の一
部に特異的にアニールするプライマーと該付加配列に対
するプライマーでＰＣＲを行う。増幅の度合いに応じ
て、同じプライマーあるいは内側に位置するプライマー
でＰＣＲを繰り返すことによって増幅産物を得ることが
でき、この増幅産物を用いて３′末端側のｃＤＮＡをク
ローニングし、続いて配列を決定することができる。

【００１８】次に５′末端側は、決定されたｃＤＮＡ配
列に特異的にアニールするプライマーでヒト気道ｍＲＮ
Ａから一本鎖ｃＤＮＡを合成する。続いてこの一本鎖ｃ
ＤＮＡを精製後、３′末端に新たに付加配列をライゲー
ション反応によって連結する。そしてこれを鋳型とし
て、逆転写に用いたプライマーよりも内側の配列に特異
的にアニールするプライマーとこの付加配列に対するプ
ライマーでＰＣＲを行う。以後の操作は３′末端側の場
合と同様にして配列を決定することができる。

【００１９】このようにして決定された３′末端側と
５′末端側のｃＤＮＡの重複する部分を結合させること
によりトリプシン様酵素の完全長ｃＤＮＡを取得するこ
とができる。

【００２０】このようにして合成され且つクローン化さ
れるトリプシン様酵素遺伝子ｃＤＮＡ配列は、配列番号
１５に示す塩基配列を有しており、これはそのままベク
タープラスミドに組み込み適当な宿主を形質転換して発
現させることができ、或いは該ｃＤＮＡを鋳型として対
応するｍＲＮＡ配列を合成することも可能である。

【００２１】従って、本発明の核酸塩基配列は、具体的
には、下記の配列［II］を有することができる。

【００２２】

【化４】 AXC CXX GGA GGC ACX GAG GCX GAG GAG GGA AGC XGG CCG XGG CAA GXC AGX CXG CGG CXC AAX AAX GCC CAC CAC XGX GGA GGC AGC CXG AXC AAX AAC AXG XGG AXC CXG ACA GCA GCX CAC XGC XXC AGA AGC AAC XCX AAX CCX CGX GAC XGG AXX GCC ACG XCX GGX AXX XCC ACA ACA XXX CCX AAA CXA AGA AXG AGA GXA AGA AAX AXX XXA AXX CAX AAC AAX XAX AAA XCX GCA ACX CAX GAA AAX GAC AXX GCA CXX GXG AGA CXX GAG AAC AGX GXC ACC XXX ACC AAA GAX AXC CAX AGX GXG XGX CXC CCA GCX GCX ACC CAG AAX AXX CCA CCX GGC XCX ACX GCX XAX GXA ACA GGA XGG GGC GCX CAA GAA XAX GCX GGC CAC ACA GXX CCA GAG CXA AGG CAA GGA CAG GXC AGA AXA AXA AGX AAX GAX GXA XGX AAX GCA CCA CAX AGX XAX AAX GGA GCC AXC XXG XCX GGA AXG CXG XGX GCX GGA GXA CCX CAA GGX GGA GXG GAC GCA XGX CAG GGX GAC XCX GGX GGC CCA CXA GXA CAA GAA GAC XCA CGG CGG CXX XGG XXX AXX GXG GGG AXA GXA AGC XGG GGA GAX CAG XGX GGC CXG CCG GAX AAG CCA GGA GXG XAX ACX CGA GXG ACA GCC XAC CXX GAC XGG AXX AGG CAA CAA ACX GGG AXC （式中、ＸはＴまたはＵを表す。） さらに、トリプシン様酵素をコードする暗号鎖は、上記
の連続した塩基配列（ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ）の形態で
存在することができるのみならず、該ｃＤＮＡ及びｍＲ
ＮＡの前駆体であるｅｘｏｎ―ｉｎｔｒｏｎ構造の遺伝
子として、該暗号鎖がイントロンの介在によって中断さ
れた断続した形態で存在することも可能である。

【００２３】本発明の核酸塩基配列は、その配列そのも
のを発現可能な態様で細胞内に導入することにより直接
利用できることはもちろんであるが、例えばｍＲＮＡの
場合、細胞中に当該ｍＲＮＡを形成させることが出来る
ＤＮＡ配列を導入し、それから本願発明のｍＲＮＡを形
成させるという間接的利用も可能である。

【００２４】本発明の核酸塩基配列を使用すれば、遺伝
子工学的手法により、前記のアミノ酸配列を有するトリ
プシン様酵素又はその生化学的同等物を製造することが
可能である。

【００２５】以下にトリプシン様酵素又はその生化学的
同等物を遺伝子工学的に製造する方法を説明する。

【００２６】本発明に従うトリプシン様酵素又はその生
化学的同等物（以下、便宜上トリプシン様酵素と総称す
ることがある）は、例えば、（ａ）プロモーター；
（ｂ）随意、前記プロモーターを刺激するエンハンサ
ー；および（ｃ）前記プロモーターにより転写開始され
うる下記ＤＮＡ配列［III ］ （Ａ）ｍ―（Ｂ）ｎ―Ｃ …［III ］ （式中、Ａはシグナルペプチド（プレペプチド）及び／
又はプレプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を示し、
Ｂは開裂配列または翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ
配列を示し、ｍは０または１、ｎは０または１を示し、
Ｃは前記式［Ｉ］のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を示す、）を含有し、且つこれらはトリプシン様酵素
が発現されるように配置された配列を含有するベクター
あるいはウイルスにより形質転換または感染された宿主
細胞を生育し、分泌または蓄積したトリプシン様酵素を
単離することによって製造することができる。

【００２７】上記配列［III ］において、Ａ配列は、シ
グナルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプ
ロペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、このシグナ
ルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプロペ
プチドは目的タンパク質を発現させる宿主細胞中でシグ
ナルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプロ
ペプチドとして機能するペプチドであればよい。

【００２８】また、前記式［III ］のＤＮＡ配列におい
て、Ｂ配列は開裂配列または翻訳開始コドンをコードす
るＤＮＡ配列であり、かかる目的で使用し得る配列とし
ては宿主細胞のシグナルペプチダーゼあるいはプロセシ
ングプロテアーゼにより切断される配列、酵素的に切断
される配列またはＭｅｔが望ましい。この開裂配列のア
ミノ酸は前記した様にシグナルペプチド（プレペプチ
ド）および／またはプレプロペプチドの種類によってそ
れに対応したアミノ酸である。例えば開裂配列のアミノ
酸としてはＧｌｎ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，Ａｒｇ，
Ｌｙｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｙなどを挙げることができ、その
配列をコードするＤＮＡ配列としては、Ｇｌｎに対応す
るＣＡＧを挙げることができる。また翻訳開始コドンの
アミノ酸であるＭｅｔの配列をコードするＤＮＡ配列と
してはＡＴＧを挙げることができる。

【００２９】Ｃ配列は、トリプシン様酵素またはそれと
生化学的に同等のタンパク質のＤＮＡ配列を示す。例え
ば該ＤＮＡ配列と実質的に同一の機能を有する範囲にお
いて、そのＤＮＡの一部が前述したように置換、挿入、
欠失したものであってもよい。ここでトリプシン様酵素
と生化学的に同等のタンパク質には、最終的にトリプシ
ン様酵素の免疫学的測定法によって検出しうるものが包
含される。更に好適には酵素学的測定法により検出しう
るものをいう。かかるＣ配列としては成熟トリプシン様
酵素の前記アミノ酸配列［Ｉ］をコードするＤＮＡ配列
が考えられるが、簡便にはＸがＴを表わす場合の前記塩
基配列［II］で示されるヒトｃＤＮＡを用いることがで
きる。

【００３０】本発明に係るトリプシン様酵素をコードし
ているＤＮＡ化合物は、昆虫細胞およびその他の真核性
宿主細胞を形質転換または感染させ、さらに、それら細
胞内でトリプシン様酵素活性を発現させるのに、特に好
適である。多くの昆虫および哺乳類宿主細胞は、トリプ
シン様酵素のＮ末端に存在しているシグナルペプチド
（プレペプチド）および／またはプレプロペプチドを認
識し、適切にプロセシングするために必要な細胞機構を
有している。広範囲に及ぶ様々な真核性宿主細胞の形質
転換あるいは感染のためのベクターあるいはウイルスが
あり、以下に例示する特定のベクターあるいはウイルス
は決して、本発明の範囲を制限することを意図したもの
ではない。

【００３１】真核性細胞中で目的タンパク質を発現させ
る手段は、それ自体当該分野では多くの系が周知であ
る。

【００３２】例えば酵母中で発現させる系としては特開
昭５７―１５９４８９号公報に記載された「酵母中での
ポリペプチドの発現」が挙げられ、昆虫細胞中で発現さ
せる系としては特開昭６０―３７９８８号公報に記載さ
れた「組換えバキュロウイルス発現ベクターの製法」が
挙げられ、哺乳類動物細胞中で発現させる系としては特
開平２―１７１１９８号公報に記載された「真核性発現
の改良」が挙げられるが、もちろんこれら以外にも多数
存在する。

【００３３】以下、真核性宿主細胞におけるトリプシン
様酵素の製造法について上に例示したバキュロウイルス
発現系を用いる場合を代表例として説明する。この場合
においては、真核性プロモーターとしてはバキュロウイ
ルスが有するプロモーターが使用される。真核性細胞に
感染するウイルスが有するプロモーターは真核性細胞中
でプロモーター機能を発現するので「真核性プロモータ
ー」である。

【００３４】また、これを刺激するように配置されたエ
ンハンサーもバキュロウイルスのエンハンサーを利用す
ることにより、随意に、容易に配置することができる。
これらの構成の一番簡便な手段は、バキュロウイルスが
保有するタンパク質発現系、例えばポリヘドリン遺伝子
を利用し、そのポリヘドリン遺伝子領域に前記アミノ酸
配列［Ｉ］をコードするＤＮＡ配列、より好ましくは、
前記式［III ］で表わされるＤＮＡ配列を置換・挿入す
ることにより達成される。

【００３５】より具体的に説明すれば、例えばオートグ
ラファ・カリフォルニカ・マルチプル・ニュークリア・
ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica m
ultiple nuclear polyhedrosis virus:AcMNPV ）の完全
ＥｃｏＲＩ―Ｉ断片［R. D.Posse et al., Virology,
１８５（１９９１）２２９−２４１］部分を用い、その
ポリヘドリン遺伝子部分に、上記ＤＮＡ配列を置換・挿
入した変異ウイルスを調製し、当該ウイルスを昆虫細
胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera f
rugiperda ）系の樹立株ＳＦ―９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
７１１）に感染させ、その感染細胞を培養することによ
り目的とするタンパク質を産生させる。

【００３６】上記変異ウイルスの調製は簡便には相同組
換えにより行うことができ、この具体的手段については
特開昭６０―３７９８８号公報にも詳細に記載されてい
る。上記発現系の調製には、バキュロウイルスＡｃＭＮ
ＰＶ、相同組換え用ベクターおよびＳＦ―９株が出発材
料として必要である。かかる発現系は、フナコシ（株）
でキットとして販売されており（MaxBac^R Baculovirus
Expression system；ＩＮＶ ＩＶ−０８２２−０
４）、誰でも入手可能である。また、バキュロウイルス
自身については、Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｍ．Ｄ．Ｓ
ｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８９（１９７８）５
１７−５２７に記載された方法により自然界から取得す
ることもできる。

【００３７】また相同組換え用ベクターは、例えばｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ部位に、前記ＡｃＭＮＰＶのＥｃ
ｏＲＩ―Ｉ断片を挿入し、そのポリヘドリン構造遺伝子
部分を前記式［III ］で表わされるＤＮＡ配列で置換す
ることにより得ることもできる。

【００３８】かくして得られた相同組換え用ベクターを
バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶと混合し、ＳＦ―９培養
細胞にコトランスフェクションさせればよい。かかる操
作により、組換えバキュロウイルスと非組換えバキュロ
ウイルスからなるウイルス集団が得られる。通常トラン
スフェクションして３日目の上清には１０⁵ 〜１０⁶ｐ
ｆｕ／ｍｌのウイルスが存在する。３５ｍｌディッシュ
に１００個のプラークを形成するように希釈してアッセ
イを行うと、そのうち２分の１から３分の１が無色透
明、あるいは相同組換え用ベクターがｌａｃＺマーカー
遺伝子を有し、且つ培地中にＸ―Ｇａｌを添加する場
合、青く染色されたプラークになる。これを組換えバキ
ュロウイルスの候補株として選択し、ウイルスを採取す
る。これらの候補株の中から、トリプシン様酵素をコー
ドするＤＮＡをＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法に
よって検出し、組換えバキュロウイルスを得る。この組
換えバキュロウイルスを再び新鮮なＳＦ―９細胞に感染
させるという手法をとることによって、組換えバキユロ
ウイルスを多量に調製することができる。

【００３９】上記方法において未感染ＳＦ―９細胞は１
０％ウシ血清を含む培地中、２８℃で培養することがで
きる。

【００４０】かかる培地中で培養維持されているＳＦ―
９培養細胞に上記組換えバキュロウイルスを感染させ、
タンパク質を発現させる。これは上記培地中あるいは無
血清培地中で２８℃、７２〜９６時間位培養を続けるこ
とによって達成できる。

【００４１】かくして得られた培養物は目的タンパク
質、ＡｃＭＮＰＶ、ＳＦ―９細胞、ＳＦ―９死細胞およ
びＳＦ―９またはＡｃＭＮＰＶ由来のＤＮＡやタンパク
質を含有している。従ってトリプシン様酵素を得るため
には、上記培養物から以下の操作によりトリプシン様酵
素を精製し、分離する。

【００４２】培養上清からの精製プロセス （１）細胞を遠心分離する。 （２）限外濾過によりウイルスを除去する。 （３）５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析あるいは希釈を行
う。 （４）５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したベンザミジンアフィ
ニティーカラムにサンプルをロードし、同緩衝液で洗浄
後、１０ｍＭ塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ２．０）で溶出し、トリプシン様酵素活性で検出し、
メインピークを集める。 かくして得られるトリプシン様酵素はＳＤＳ―ＰＡＧＥ
で１バンドである。

【００４３】培養細胞からの精製プロセス （１）細胞を遠心分離し、集める。 （２）細胞を５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁する。 （３）終濃度が１％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ―１０
０を加え、０℃に６０分間置き、細胞を溶解する。 （４）細胞残渣を遠心分離する。 （５）５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析あるいは希釈を行
う。 （６）５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したベンザミジンアフィ
ニティーカラムにサンプルをロードし、同緩衝液で洗浄
後、１０ｍＭ塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ２．０）で溶出し、トリプシン様酵素活性で検出し、
メインピークを集める。 かくして得られるトリプシン様酵素はＳＤＳ―ＰＡＧＥ
で１バンドである。

【００４４】本発明におけるＤＮＡ化合物は、例えば、
大腸菌、枯草菌およびストレプトマイセス等の原核性宿
主細胞内でも発現し得る。原核性宿主細胞内で、トリプ
シン様酵素活性をコードしているＤＮＡを発現させるこ
とにより、トリプシン様酵素を生産することができる。

【００４５】トリプシン様酵素は、トリプシン様酵素特
異抗体の産生を刺激するための抗原として用いることが
でき、あるいは、トリプシン様酵素の測定にも用いるこ
とができる。多くの測定法においては、試料中のタンパ
ク質レベルを測定するのに競合的な抗体結合を利用す
る。即ち、放射活性（またはそれ以外の方法で）標識し
た原核生物産生トリプシン様酵素は、気道液中のトリプ
シン様酵素の測定などにおける「競合的分子（competin
g molecule）」として用いることができる。

【００４６】一般則として、原核生物は有効に真核性シ
グナルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプ
ロペプチドをプロセシングしない：従って、トリプシン
様酵素構造遺伝子のシグナルペプチド（プレペプチド）
および／またはプレプロペプチドをコードしている部分
を原核生物内で発現させることは、幾分、非能率的であ
ろう。従って、本発明に係るトリプシン様酵素活性をコ
ードしているＤＮＡ化合物を原核性宿主細胞内で発現さ
せる前に、プレプロペプチドをコードしているＤＮＡを
除去してもよい。また、本明細書中で特に例示していな
いが、本発明は、原核生物内でトリプシン様酵素を発現
させ、分泌させることも目的とする、原核性シグナルペ
プチド（プレペプチド）の暗号ＤＮＡとトリプシン様酵
素活性の暗号ＤＮＡとの融合物をも包含するものであ
る。

【００４７】トリプシン様酵素の新生ポリペプチドの−
１８６〜−１アミノ酸残基（配列番号１５参照）は、細
胞外分泌のためのシグナル（プレ）およびプロペプチド
をコードしていると思われ、活性な成熟トリプシン様酵
素中には存在していない。トリプシン様酵素のこれらの
領域は原核性発現ベクター中にはコードされていなくて
もよいが、本発明では、トリプシン様酵素のプレプロペ
プチドをコードしている原核性発現ベクターをも使用す
ることができる。

【００４８】プロモーターの選択は、本発明の実施可能
性にとって臨界的な事でないので、トリプシン様酵素の
大腸菌内での発現は、決して、特定のプロモーターの使
用に限定されない。例として大腸菌ラクトース（ｌａ
ｃ）、大腸菌ｔｒｐ、バクテリオファージλＰ_L Ｏ_L 、
およびバクテリオファージλＰ_R Ｏ_R 等のプロモーター
が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ｔｒ
ｐプロモーターとｌａｃプロモーターの如く、１または
それ以上のプロモーターを直列に配したり、ｔａｃプロ
モーターの如く、ハイブリッドプロモーターを用いて、
トリプシン様酵素構造遺伝子の発現を行わせることもで
きる。上記のプロモーターは、いずれも、既に特性化さ
れており、当業者が熟知しているものであって、合成的
に、あるいは既知のプラスミドから組み立てることがで
きるものである。

【００４９】本発明に係るトリプシン様酵素遺伝子の如
き外来性遺伝子をｌａｃプロモーターの下流にクローニ
ングすると、ラクトースによる誘導の結果、タンパク質
の合成速度が著しく大きくなると共に、細胞内にタンパ
ク質性顆粒が形成される。この顆粒のタンパク質組成の
均質性は高く、この顆粒の少くとも５０％、多くは８０
％（いずれも乾重量％）以上が所望のタンパク質生産物
からなる。この顆粒は、容易に細胞溶解液から単離さ
れ、また、低濃度の尿素、あるいは洗浄剤溶液で洗浄し
ても安定である。洗浄することにより、顆粒に対して非
特異的に結合しているタンパク質が除かれる。

【００５０】原核性発現ベクターは、広範囲の宿主生
物、とりわけ、大腸菌、大腸菌Ｋ１２、大腸菌Ｋ１２
Ｃ６００、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１、大腸菌Ｋ１２
ＪＭ１０９等のグラム陰性菌に適用し得る。

【００５１】本発明は、本明細書中に例示した組換えプ
ラスミド或いはウイルスに含まれている実際の選択マー
カーの使用に限定されるものではない。本発明のＤＮＡ
化合物（または配列）を含んでいる組換えＤＮＡベクタ
ーあるいはウイルスに用いるのに適当な、真核性ならび
に原核性宿主細胞の、広範囲に及ぶ種々の選択マーカー
が存在している。

【００５２】本発明の例示ＤＮＡ配列、プラスミドおよ
びウイルスには多くの修飾や変更が可能である。例え
ば、遺伝暗号の同義性により、ポリペプチドの暗号領域
全体を通して、ヌクレオチドの置換を行うことができ
る。そのような配列はトリプシン様酵素のアミノ酸配列
またはＤＮＡ配列から推定することができ、下記の従来
からの合成法により、組み立てることができる。そのよ
うな合成法は、実質上、イタクラらの方法（Itakura et
al., １９７７，サイエンス (Science)１９８：１０５
９）ならびにクレアらの方法（Crea et at.,１９７８，
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスィーズＵＳＡ ７５：５７６５）
に従って行うことができる。従って、本発明は特に例示
したＤＮＡ配列、プラスミドおよびウイルスに限定され
るものではない。

【００５３】当業者には理解されるであろうが、本発明
における発現ベクターあるいはウイルスは真核性または
原核性いずれの宿主細胞にも用いることができ、そのよ
うにして、トリプシン様酵素活性を有するポリペプチド
を宿主に発現させることができる。宿主細胞内で機能
し、トリプシン様酵素構造遺伝子の転写を駆動するよう
なプロモーターを含有しているベクターでは該宿主細胞
を形質転換または感染すると共に、該宿主細胞がシグナ
ルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプロペ
プチドのプロセシングを行うための細胞機構を有してい
るならば、培地から、新規トリプシン様酵素活性を単離
することができる。他の発現状況下、該宿主細胞がシグ
ナルペプチド（プレペプチド）および／またはプレプロ
ペプチドのプロセシングを行うための細胞機構を有して
いないならば、トリプシン様酵素活性を宿主細胞から単
離しなければならない。

【００５４】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定す
るためのものでないことを理解すべきである。

【００５５】試薬および実験操作に関する説明 （１）他に断らない限りは、タカラ（Ｔａｋａｒａ）、
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ベーリンガー・
マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）およびクローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から得
たＤＮＡ修飾酵素（例えば、ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ）およびキット類を製造業者による指示
の通りに使用する。

【００５６】（２）オリゴヌクレオチドは、アプライド
・バイオシステムズ・モデル３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成
機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅ
ｌ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）
で合成し、同社製ＯＰＣ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇ
ｅ）カラムによって精製することができる。

【００５７】（３）ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）
は、前述のａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを
用いてパーキンエルマー・シータス・インストゥルメン
ツ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ）社製ＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮ
Ａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）で実施し、ＤＮＡ
を特異的に増幅することができる。

【００５８】（４）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、マ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら［モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２年］によって記載
されている如くに形質転換することができる。

【００５９】（５）プラスミドは、アンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを含有しているＬブロス寒天培地（１％ペプト
ン、１％ＮａＣｌ、０．５％酵母エキス、および１．５
％寒天）上の約２５ｃｍ² においてプラスミドを保持す
る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を３７℃で一夜培養し、キア
ゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製キアゲン・プラスミド・キッ
ト（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）で調製す
ることができる。

【００６０】

【実施例】

［実施例１］トリプシン様酵素の単離精製 慢性呼吸器疾患患者喀痰の原液１０００ｍｌを、同量の
０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．
５）、０．３Ｍ ＮａＣｌと混合し、ホモジナイザーに
より氷冷下１分間ホモジナイズした後、遠心分離（１９
０００ｒｐｍ）した上清に対し硫安を終濃度４０％にな
るように加える。沈殿物を遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ）で除去し、上清中のプロテアーゼをブチル・トヨパ
ール・ゲル（Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅｒｌ Ｇｅｌ）
に吸着させた後、５％（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ；１０％グリ
セロール、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）でプロテアーゼ画分を溶出させた。

【００６１】この溶出液に硫安を終濃度６５％になるよ
うに加え、遠心分離（１００００ｒｐｍ）して得られた
沈殿を０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０
％グリセロールに溶かし全容量１００ｍｌとし、同じバ
ッファー中で透析した。透析液中のプロテアーゼをＳＰ
―トヨパール（ＳＰ―Ｔｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍゲル
（Ｇｅｌ）に吸着させ、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ４．０）で３回、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ
４．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、０．０５
Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロー
ル、０．３Ｍ ＮａＣｌでプロテアーゼ画分を溶出させ
た。これに硫安を終濃度８０％になるように加え、遠心
分離（８０００ｒｐｍ）により得られた沈殿を０．０５
Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール
４０ｍｌに溶かし、同じバッファーで透析した。

【００６２】透析液を再びＳＰ―トヨパール（ＳＰ―Ｔ
ｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍカラム（１．２×２ｃｍ）に
かけ０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％
グリセロールから０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．
５）、１０％グリセロール、０．２Ｍ ＮａＣｌまでの
グラジエント溶出によりプロテアーゼ画分を得た。この
溶出液を限外濾過（ＹＭ１０膜）により約３０ｍｌまで
濃縮した後、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．
２）、１０％グリセロール、０．５Ｍ ＮａＣｌで透析
した。

【００６３】透析液をアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製した。すなわち、ベンザミジン―セファロース
（Benzamidine-Sepharose ）６Ｂカラムにかけ０．０５
ＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１０％グリセロー
ル、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．０５Ｍ酢酸
バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール、０．
５Ｍ ＮａＣｌで溶出させることにより、精製されたプ
ロテアーゼ溶液を得た。このトリプシン様酵素をＳＤＳ
―ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果分子
量２８０００に単一バンドとして検出された（図１参
照）。

【００６４】分子量マーカーとしては、バイオ・ラッド
・ラボラトリーズ社の下記のものを用いた。 ９７．４ｋＤａ：フォスフォリラーゼｂ ６６．２ｋＤａ：アルブミン ４２．７ｋＤａ：オボアルブミン ３１．０ｋＤａ：カルボニックアンハイドラーゼ ２１．５ｋＤａ：ダイズトリプシンインヒビター １４．４ｋＤａ：リゾチーム

【００６５】［実施例２］トリプシン活性の測定方法 トリプシン用合成基質Ｂｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ
―ＭＣＡ（ＭＣＡ：Methylcoumarin amide）を１００μ
Ｍ含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッファー（ｐ
Ｈ８．６）１．５ｍｌに対し、実施例１で得られたトリ
プシン様プロテアーゼの溶液を５０μｌ加え、３７℃で
１時間インキュベートした。次いで１ｍｌの３０％酢酸
を加え生成した７―アミノ―４―メチルクマリン（７―
amino ―４―methylcoumarin：ＡＭＣ）量を蛍光測定に
より定量し（蛍光４４０ｎｍ、励起光３８０ｎｍ）、酵
素の活性を算出した。 １分間に１ｐＭのＡＭＣを生成
させる活性を１単位と定義する。（１単位＝１ｐＭ Ａ
ＭＣ／ｍｉｎ）

【００６６】［実施例３］トリプシン様酵素の至適ｐＨの測定 各ｐＨでのトリプシン活性を確認するために以下のバッ
ファーを作成した。 ＭＥＳバッファー；ｐＨ６．０，６．２，６．４，６．
６，６．８ ＨＥＰＥＳバッファー；ｐＨ６．８，７．０，７．２，
７．４，７．６ Ｔｒｉｓバッファー；ｐＨ７．４，７．６，７．８，
８．０，８．２，８．４，８．６，８．７，８．８，
９．０，９．２，９．４ 夫々のバッファー中で実施例１で得られたトリプシン様
酵素の活性を実施例２記載の方法でトリプシン活性を測
定し、その結果を図２に示す。

【００６７】ｐＨ８．２〜９．２の範囲で強い活性を示
し、中でもｐＨ８．４，８．６，８．７，８．８の場合
が最も高い活性を示した。

【００６８】［実施例４］トリプシン様酵素の基質特異性 （１）合成基質 反応バッファーとして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ８．６）を用い、合成基質として、トリプ
シン用基質（Ｂｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ、Ｂｏｃ―Ｇｌｎ―Ａｌａ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、トロ
ンビン用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ）、ファクターＸａ用基質（Ｂｏｃ―Ｉｌｅ―Ｇｌｎ
―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、ウロキナーゼ用基質（Ｂ
ｏｃ―Ｇｌｎ―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、プラスミン
用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｌｅｕ―Ｌｙｓ―ＭＣＡ）、
キモトリプシン用基質（Ｂｏｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒ
ｏ―Ｐｈｅ―ＭＣＡ）、エラスターゼ用基質（Ｓｕｃ―
Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ａｌａ―ＭＣＡ）、コラゲネース用基
質（Ｓｕｃ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ
―ＭＣＡ）およびロイシンアミノペプチダーゼ用基質
（Ｌｅｕ―ＭＣＡ）を用い、実施例１で得られたトリプ
シン様酵素の活性を実施例２記載の方法により測定し
た。トリプシン様酵素のＢｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒ
ｇ―ＭＣＡ（トリプシン用基質）に対する活性を１００
％とした時の各基質に対する反応性を表１に示した。ま
た、ヒト好中球エラスターゼとラット肥満細胞由来トリ
プターゼについてもそれぞれＳｕｃ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―
Ａｌａ―ＭＣＡとＳｕｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―Ｍ
ＣＡに対する活性を１００％とした時の各基質に対する
反応性を表１に示した。

【００６９】その結果、実施例１で得られたトリプシン
様酵素はトリプシン用基質とトロンビン用基質をよく分
解し、キモトリプシン活性、エラスターゼ活性、コラゲ
ネース活性およびロイシンアミノペプチターゼ活性を示
さなかった。また、基質特異性の点で好中球エラスター
ゼとラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なってい
た。

【００７０】（２）生体基質 生体基質としてＩｇＡ、ＩｇＧ、アルブミン、α1 ―ア
ンチトリプシンフィブリーゲン、ＶＩＰ（vasoactive i
ntestinal peptide ）およびサブスタンスＰを用い、こ
れらに実施例１で得られたトリプシン様酵素を反応させ
た後、基質の分解をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で検出した結果、フィブリノーゲンとＶＩＰだけ
が特異的に分解され、その他の生体基質は分解されなか
った。

【００７１】

【表１】

【００７２】［実施例５］トリプシン様酵素に対するプロテアーゼ阻害剤の効果 プロテアーゼ阻害剤としてセリンプロテアーゼ阻害剤で
あるＤＦＰ（Diisopropyl Fluorophosphate ）とＰＭＳ
Ｆ（Phenylmethyl sulfonyl Fluoride）、トリプシン阻
害剤であるロイペプチン（Leupeptin ）とアンチパイン
（Antipain）、エラスチン阻害剤であるエラスチノール
（Elastinol ）、ロイシンアミノペプチダーゼ阻害剤で
あるベスタチン（Bestatin）、キモトリプシン阻害剤で
あるアマスタチン（Amastatin ）、血中プロテアーゼイ
ンヒビターであるα1 ―アンチトリプシンを用い、実施
例１で得られたトリプシン様酵素、ヒト由来好中球エラ
スターゼ、ラット肥満細胞（Mast cell ）由来トリプタ
ーゼに対する阻害効果を測定した。阻害剤の濃度はＰＭ
ＳＦのみ１ｍＭとしその他の阻害剤は１０μＭとした。
阻害剤と酵素を反応させた後実施例２に記載の方法に従
って酵素活性を測定し阻害剤による酵素活性の阻害率
（％）を求め表２に示した。

【００７３】

【表２】

【００７４】その結果、トリプシン様酵素はＤＦＰ、Ｐ
ＭＳＦ、ロイペプチン（Leupeptin）、アンチパイン（A
ntipain）、α1 ―アンチトリプシンによって阻害され
エラスチノール（Elastinol ）、ベスタチン（Bestati
n）、アマスタチン（Amastatin ）では阻害されなかっ
た。基質特異性および各阻害剤の阻害効果から判断し
て、トリプシン様酵素はヒト好中球エラスターゼおよび
ラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なる性質を示し
た。

【００７５】［実施例６］トリプシン様酵素のフィブリノーゲン凝固に対する影響 フィブリノーゲンを０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ７．４）、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂ 、０．
１５Ｍ ＮａＣｌに２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、
これに実施例１で得られたトリプシン様酵素を活性単位
を変化させて加え、３７℃で加温した後、この反応液
０．１ｍｌとスロンビン溶液（２．５単位／ｍｌ）０．
１ｍｌとを混合し、凝固時間を測定した。その結果を図
３に示す。トリプシン様酵素の加えた活性単位が増加す
るほど、凝固時間は延長された。

【００７６】［実施例７］トリプシン様酵素のＮ末端アミノ酸配列 実施例１で得られたトリプシン様酵素を、逆相ＨＰＬＣ
（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４）にかけ、アセトニトリル
濃度５０．４％で酵素を溶出させた。次いで、溶媒留去
により濃縮し、そのままプロテインシーケンサー（Appl
ied BiosystemsModel４７７Ａ）によりＮ末端アミノ酸
配列を解析した。

【００７７】その結果トリプシン様酵素のＮ末端から２
０残基までの配列はＩｌｅ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｇｌｙ―
Ｔｈｒ―Ｇｌｕ―Ａｌａ―Ｇｌｕ―Ｇｌｕ―Ｇｌｙ―Ｓ
ｅｒ―Ｔｒｐ―Ｐｒｏ―Ｔｒｐ―Ｇｌｎ―Ｖａｌ―Ｓｅ
ｒ―Ｌｅｕ―Ａｒｇ―Ｌｅｕであった。

【００７８】［実施例８］喀痰中から単離されたトリプシン様酵素のＮ末アミノ酸
配列２０残基をコードするｃＤＮＡ５９ｂｐのクローニ
ング Ａ．オリゴヌクレオチド混合物ＴＲＹ−０およびＴＲＹ
−００の調製 実施例７で決定されたアミノ酸配列に基づいて、対応す
るコドンの縮重を考慮の上、１〜７番目のアミノ酸をコ
ードしうる配列番号２で示したオリゴヌクレオチド混合
物を設計し、ＴＲＹ−０と名付けた。また１５〜２０番
目のアミノ酸をコードしうる配列の相補鎖、すなわち配
列番号３で示したオリゴヌクレオチド混合物を設計し、
ＴＲＹ−００と名付けた。これらをアプライド・バイオ
システムズ・モデル３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９
４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成
し、同社製ＯＰＣ（Oligonucleotide Purification Car
tridge）カラムを用いて精製した。

【００７９】Ｂ．ヒト気道ｃＤＮＡに対するＰＣＲ 実施例８Ａで調製したオリゴヌクレオチド混合物ＴＲＹ
−０およびＴＲＹ−００をプライマーとしてそれぞれ
０．１μｇとａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを
用いて、クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製ヒト
気道 ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（ＬＯＴ＃２
３０２２）１ｎｇに対して反応容量２０μｌでＰＣＲを
行った。ＰＣＲは、パーキンエルマー・シータス・イン
ストルメンツ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ) 社製、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を用
い、反応サイクルは９４℃ １分、５７℃ １分３０
秒、７２℃ ２分を３５回繰り返すこととし、最後に７
２℃で７分間インキュベートし、ＰＣＲ反応混合物を得
た。

【００８０】Ｃ．５９ｂｐＰＣＲ増幅産物フラグメント
の調製 実施例８Ｂで得たＰＣＲ反応混合物２０μｌに等容量の
クロロホルムを加えて激しく攪拌した。次いで遠心して
上層の水相を新しいチューブに移した。この溶液に終濃
度が０．３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量のエタ
ノールを加えて混合した。得られた溶液を−８０℃に２
０分間置き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化した。
ペレットを７０％エタノールでリンスした後、１０μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０およ
び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５．６％ポリアクリル
アミドゲル（２９：１、アクリルアミド：ビス−アクリ
ルアミド）電気泳動にかけ、５９ｂｐＤＮＡフラグメン
トが他のＰＣＲ産物から分離されるまで泳動させた。ゲ
ルをまずエチジウムブロマイドの希薄溶液で染色し、次
いでこのゲルを紫外線下で観察することにより、ＤＮＡ
バンドを調べた。

【００８１】５９ｂｐフラグメントを含む領域をゲルか
ら切り取り、マイクロ遠心チューブ内に入れて小片にく
ずした。このゲル小片の入ったマイクロ遠心チューブ内
に抽出緩衝液（５００ｍＭ ＮＨ₄ ＯＡｃ：０．１％Ｓ
ＤＳ：および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）４００μ
ｌを加え、３７℃で一夜置いた。遠心して残渣をペレッ
ト化し、上清を新しいチューブに移した。この上清に終
濃度が０．３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量のエ
タノールを加えて混合した。得られた溶液を−８０℃に
２０分間置き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化し
た。ペレットを７０％エタノールでリンスした後、この
精製（純化）フラグメントを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。

【００８２】Ｄ．プラスミドｐ５９−１４の組み立て 実施例８Ｃで得たフラグメントをファルマシア社製シュ
アクローンライゲーションキット（ＳｕｒｅＣｌｏｎｅ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてプラスミドベク
ターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に平滑末端で連結し
た。さらにこのプラスミドでタカラ社製コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞を、マニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら〔モレキュラー・クローニング：ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、１９８２年〕による記載に従い、形質転
換した。

【００８３】得られた形質転換体からそのアンピシリン
耐性表現型、ならびにプラスミドベクターｐＵＣ１８の
ＳｍａＩ切断部位近傍の配列を持つプライマーを用いた
挿入部分を増幅させるＰＣＲの産物の長さによってｐ５
９−１４クローンを選択し、ポジティブクローンからプ
ラスミドを調製することによりｐ５９−１４を得た。プ
ラスミドの調製は、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有
しているＬブロス寒天培地（１％ペプトン、１％ＮａＣ
ｌ、０．５％酵母エキス、および１．５％寒天）上の約
２５ｃｍ² においてプラスミドを保持する大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）を３７℃で一夜培養し、キアゲン（ＱＩＡＧ
ＥＮ）社製キアゲン・プラスミド・キット（ＱＩＡＧＥ
Ｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）で行った。

【００８４】Ｅ．プラスミドｐ５９−１４挿入部のＤＮ
Ａ配列決定 実施例８Ｄで得たプラスミドｐ５９−１４の挿入部につ
いてジデオキシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロ
ク・ナトル・アカド・サイ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４：５４６３〜５４
６７頁、１９７７年〕によって配列決定した。プラスミ
ドｐ５９−１４挿入部のＤＮＡ配列を配列番号４に示
す。この５９ｂｐの挿入部は、喀痰中から単離されたト
リプシン様酵素のＮ末アミノ酸配列１９残基をコードし
ており、所望するトリプシン様酵素ｃＤＮＡの一部であ
ると同定した。

【００８５】［実施例９］喀痰中から単離されたトリプシン様酵素をコードするｃ
ＤＮＡ領域のクローニング Ａ．オリゴヌクレオチドＴＲＹ−１、ＴＲＹ−８、ＴＲ
Ｙ−１０およびＴＲＹ−１１の調製 実施例８で決定されたトリプシン様酵素をコードするｃ
ＤＮＡの一部の配列に基づいて、配列番号４の１番目の
Ａから２３番目のＡに相当する配列番号５で示したオリ
ゴヌクレオチドを設計し、ＴＲＹ−１と名付けた。同様
に配列番号４の１６番目のＧから４０番目のＴに相当す
る配列番号６で示したオリゴヌクレオチドを設計し、Ｔ
ＲＹ−８と名付けた。またｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡの
３’末端にアニールすることができる配列番号７で示し
たオリゴヌクレオチドを設計し、ＴＲＹ−１０と名付け
た。さらにＴＲＹ−１０の５’末端側１９残基に同一の
配列番号８で示したオリゴヌクレオチドを設計し、ＴＲ
Ｙ−１１と名付けた。

【００８６】これらをアプライド・バイオシステムズ・
モデル３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で合成し、同社製Ｏ
ＰＣカラムを用いて精製した。

【００８７】Ｂ．ＴＲＹ−１０によるヒト気道ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ ＲＮＡに対する一本鎖ｃＤＮＡの調製 クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から得たヒト気道
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡ（ＬＯＴ＃２６１０５）１０
ｎｇを９μｌの水溶液とした。この溶液を６５℃、３分
間インキュベートした後、直ちに氷浴中に５分間置い
た。この溶液に対してベーリンガー・マンハイム社製ｃ
ＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋ
ｉｔ）を用いて、実施例９Ａで調製したオリゴヌクレオ
チドＴＲＹ−１０の１０ｎｇをプライマーとして反応容
量２０μｌで一本鎖ｃＤＮＡを調製した。

【００８８】Ｃ．喀痰中から単離されたトリプシン様酵
素をコードするｃＤＮＡ領域のＰＣＲによる増幅 実施例９Ａで調製したオリゴヌクレオチドＴＲＹ−１お
よびＴＲＹ−１１をプライマーとしてそれぞれ０．１μ
ｇとａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、
実施例９Ｂで得たヒト気道ｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡを
鋳型とした一本鎖ｃＤＮＡの１／１０量に対して反応容
量２０μｌでＰＣＲを行った。反応サイクルは９４℃、
１分；５７℃、１分３０秒；７２℃、２分を３５回繰り
返すこととし、最後に７２℃で７分間インキュベート
し、第一次ＰＣＲ反応混合物を得た。

【００８９】さらにこのＰＣＲ反応混合物の１／４０量
に対して、実施例９Ａで調製したオリゴヌクレオチドＴ
ＲＹ−８およびＴＲＹ−１０をプライマーとしてそれぞ
れ０．１μｇおよび０．１７５μｇとａｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、反応容量２０μｌでＰ
ＣＲを行った。反応サイクルは９４℃、１分；５７℃、
１分３０秒；７２℃、２分を３５回繰り返すこととし、
最後に７２℃で７分間インキュベートし、第二次ＰＣＲ
反応混合物を得た。この第二次ＰＣＲ反応混合物中に
は、約９００ｂｐのＤＮＡが選択的に増幅されているこ
とを５．６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確
認した。

【００９０】Ｄ．第二次ＰＣＲ増幅産物フラグメントの
調製 実施例９Ｃで得た第二次ＰＣＲ反応混合物２０μｌに等
容量のクロロホルムを加えて激しく攪拌した。次いで遠
心して上層の水相を新しいチューブに移した。この溶液
に終濃度が０．３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量
のエタノールを加えて混合した。得られた溶液を−８０
℃に２０分間置き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化
した。ペレットを７０％エタノールでリンスした後、１
０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、２％低融点アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約９００ｂｐＤＮＡフラグメントが
他のＰＣＲ産物から分離されるまで泳動させた。ゲルを
まずエチジウムブロマイドの希薄溶液で染色し、次いで
このゲルを紫外線下で観察することにより、ＤＮＡバン
ドを調べた。

【００９１】約９００ｂｐフラグメントを含む領域をゲ
ルから切り取り、マイクロ遠心チューブ内に入れた。こ
のゲル断片５０ｍｇの入ったマイクロ遠心チューブ内に
ＴＥ緩衝液を総容量が４００μｌとなるように加え、６
５℃でアガロースゲルが溶解するまでインキュベートし
た。この溶液に、あらかじめ６５℃にしたＴＥ緩衝液飽
和フェノールを等容量加えて激しく攪拌した。次いで遠
心して上層の水相を新しいチューブに移した。この操作
を再度繰り返した。さらにこの溶液に等容量のクロロホ
ルムを加えて激しく攪拌した。次いで遠心して上層の水
相を新しいチューブに移した。この溶液に終濃度が０．
３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量のエタノールを
加えて混合した。得られた溶液を−８０℃に２０分間置
き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化した。ペレット
を７０％エタノールでリンスした後、この精製（純化）
フラグメントを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

【００９２】Ｅ．プラスミドｐ１９−３３の組み立て 実施例９Ｄで得たフラグメントをファルマシア社製シュ
アクローンライゲーションキット（ＳｕｒｅＣｌｏｎｅ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてプラスミドベク
ターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に平滑末端で連結し
た。さらにこのプラスミドでタカラ社製コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞を形質転換した。得られ
た形質転換体からそのアンピシリン耐性表現型、ならび
にプラスミドベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位近
傍の配列を持つプライマーを用いた挿入部分を増幅させ
るＰＣＲの産物の長さによってｐ１９−３３クローンを
選択し、ポジティブクローンからプラスミドを調製する
ことによりｐ１９−３３を得た。

【００９３】Ｆ．プラスミドｐ１９−３３挿入部のＤＮ
Ａ配列決定 実施例９Ｅで得たプラスミドｐ１９−３３の挿入部につ
いてジデオキシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４
６３〜５４６７頁、１９７７年］によって配列決定し
た。プラスミドｐ１９−３３挿入部のＤＮＡ配列を配列
番号９に示す。この９０１ｂｐの挿入部は、喀痰中から
単離されたトリプシン様酵素のＮ末アミノ酸配列２０残
基の一部をコードしており、所望するトリプシン様酵素
ｃＤＮＡの一部であると同定した。

【００９４】［実施例１０］トリプシン様酵素ｃＤＮＡ上流域のクローニング Ａ．オリゴヌクレオチドＴＲＹ−２５、およびＴＲＹ−
２６の調製 実施例９で決定されたトリプシン様酵素をコードするｃ
ＤＮＡの一部の配列に基づいて、配列番号９の１２７番
目のＡから１５１番目のＴまでの配列に相補的な配列番
号１０で示したオリゴヌクレオチドを設計し、ＴＲＹ−
２５と名付けた。同様に配列番号９の８３番目のＡから
１０７番目のＡまでの配列に相補的な配列番号１１で示
したオリゴヌクレオチドを設計し、ＴＲＹ−２６と名付
けた。

【００９５】これらをアプライド・バイオシステムズ・
モデル３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で合成し、アプライ
ド・バイオシステムズ社製ＯＰＣカラムを用いて精製し
た。

【００９６】Ｂ．ＴＲＹ−２５によるヒト気道ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ ＲＮＡのアンカー連結一本鎖ｃＤＮＡの調製 クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から得たヒト気道
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡ（ＬＯＴ＃２９０９９）２μ
ｇに対してクローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製
５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ キットを用
いて、実施例１０Ａで調製したオリゴヌクレオチドＴＲ
Ｙ−２５の８３ｎｇをプライマーとして逆転写反応を行
い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて反応混液中のＲ
ＮＡをアルカリ水解後中和し、キット中に含まれるガラ
スパウダーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを精製した。この一
本鎖ｃＤＮＡの３’末端にキット中の配列番号１２に示
したアンプリファインダーアンカー（ＡｍｐｌｉＦＩＮ
ＤＥＲ ａｎｃｈｏｒ）をＴ４ ＲＮＡ リガーゼによ
って連結した。

【００９７】Ｃ．トリプシン様酵素ｃＤＮＡ上流域のＰ
ＣＲによる増幅 実施例１０Ａで調製したオリゴヌクレオチドＴＲＹ−２
６および配列番号１３に示したクローンテック（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）社製５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ＲＡ
ＣＥ キット中に含まれるアンプリファインダーアンカ
ープライマー（ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ａｎｃｈｏｒ
ｐｒｉｍｅｒ）をそれぞれ終濃度０．２μＭのプライ
マーとしてａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用
いて、実施例１０Ｂで得たヒト気道ｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＮＡのアンカー連結一本鎖ｃＤＮＡの１／１００量に
対して反応容量５０μｌでＰＣＲを行った。反応サイク
ルは９４℃、４５秒；６０℃、４５秒；７２℃、２分を
３５回繰り返すこととし、最後に７２℃で７分間インキ
ュベートし、ＰＣＲ反応混合物を得た。このＰＣＲ反応
混合物中には、約７９０ｂｐのＤＮＡが選択的に増幅さ
れていることを５．６％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により確認した。

【００９８】Ｄ．ＰＣＲ増幅産物フラグメントの調製 実施例１０Ｃで得たＰＣＲ反応混合物４０μｌに等容量
のクロロホルムを加えて激しく攪拌した。次いで遠心し
て上層の水相を新しいチューブに移した。この溶液に終
濃度が０．３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量のエ
タノールを加えて混合した。得られた溶液を−８０℃に
２０分間置き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化し
た。ペレットを７０％エタノールでリンスした後、１０
μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、５．６％ポリアクリルアミ
ドゲル（２９：１、アクリルアミド：ビス−アクリルア
ミド）電気泳動にかけ、約７９０ｂｐＤＮＡフラグメン
トが他のＰＣＲ産物から分離されるまで泳動させた。ゲ
ルをまずエチジウムブロマイドの希薄溶液で染色し、次
いでこのゲルを紫外線下で観察することにより、ＤＮＡ
バンドを調べた。

【００９９】約７９０ｂｐフラグメントを含む領域をゲ
ルから切り取り、マイクロ遠心チューブ内に入れて小片
にくずした。このゲル小片の入ったマイクロ遠心チュー
ブ内に抽出緩衝液（５００ｍＭ ＮＨ₄ ＯＡｃ：０．１
％ＳＤＳ：および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）４０
０μｌを加え、３７℃で一夜置いた。遠心して残渣をペ
レット化し、上清を新しいチューブに移した。この上清
に終濃度が０．３Ｍになる量のＮａＯＡｃと２．５容量
のエタノールを加えて混合した。得られた溶液を−８０
℃に２０分間置き、次いで遠心してＤＮＡをペレット化
した。ペレットを７０％エタノールでリンスした後、こ
の精製（純化）フラグメントを１０μｌのＴＥ緩衝液に
溶解した。

【０１００】Ｅ．プラスミドｐ５−１１９の組み立て 実施例１０Ｄで得たフラグメントをファルマシア社製シ
ュアクローンライゲーションキット（ＳｕｒｅＣｌｏｎ
ｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてプラスミドベ
クターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に平滑末端で連結
した。さらにこのプラスミドでタカラ社製コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞を形質転換した。得られ
た形質転換体からそのアンピシリン耐性表現型、ならび
にプラスミドベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位近
傍の配列を持つプライマーを用いた挿入部分を増幅させ
るＰＣＲの産物の長さによってｐ５−１１９クローンを
選択し、ポジティブクローンからプラスミドを調製する
ことによりｐ５−１１９を得た。

【０１０１】Ｆ．プラスミドｐ５−１１９挿入部のＤＮ
Ａ配列決定 実施例１０Ｅで得たプラスミドｐ５−１１９の挿入部に
ついてジデオキシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プ
ロク・ナトル・アカド・サイ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４：５４６３〜５
４６７頁、１９７７年］によって配列決定した。プラス
ミドｐ５−１１９挿入部のＤＮＡ配列を配列番号１４に
示す。この７８９ｂｐの挿入部は、喀痰中から単離され
たトリプシン様酵素のＮ末アミノ酸配列２０残基をコー
ドする領域を含んでおり、所望するトリプシン様酵素ｃ
ＤＮＡの一部であると同定した。

【０１０２】［実施例１１］トリプシン様酵素遺伝子ｃＤＮＡ配列の決定 実施例９および１０で決定された配列の重複する部分１
０７ｂｐを同定し、その同一性を確認した。配列分析に
より、これらを重ね合わせた配列は喀痰中より単離され
たトリプシン様酵素のＮ末２０残基のアミノ酸をコード
する領域を含んでいることを確認した。以上より配列を
連結し、所望するトリプシン様酵素遺伝子ｃＤＮＡ配列
を決定した。このＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号１
５に示す。

【０１０３】［実施例１２］プラスミドｐＰＨＡＴ１の組み立て 実施例９で得たプラスミドｐ１９―３３および実施例１
０で得たプラスミドｐ５―１１９を別々にＳｐｈＩおよ
びＢｓｔＸＩで切断した。ｐ１９―３３由来約３．６Ｋ
ｂのＳｐｈＩ―ＢｓｔＸＩ断片ならびにｐ５―１１９由
来約０．７ＫｂのＳｐｈＩ―ＢｓｔＸＩ断片をアガロー
ス電気泳動により分離回収した。これら２種のＳｐｈＩ
―ＢｓｔＸＩ断片についてライゲーション反応を行い、
これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。数個
の形質転換体よりプラスミドを調製することにより、プ
ラスミドｐＰＨＡＴ１を得た。（図４参照）。

【０１０４】［実施例１３］トリプシン様酵素をコードするｃＤＮＡを挿入した組換
えベクターの組み立て 発現用ベクターｐＢｌｕｅＢａｃIII （Invitrogen）を
使用した。このベクターとしてｐＢｌｕｅＢａｃIII の
配列を配列番号１６に示し、制限サイトおよび機能地図
を添付の図５に示す。図５に示されるように、ｐＢｌｕ
ｅＢａｃIII は相同組換え用のＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ断
片をrecombination Sequenceとして有している。このＡ
ｃＭＮＰＶ遺伝子（Autographa californica multiple
nuclearpolyhedrosis virus遺伝子）は下記文献に紹介
されている。 R. D. Posse et al., Virology, １８５（１９９１）p
p. ２２９−２４１ このｐＢｌｕｅＢａｃIII をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ
III で切断し、これに配列番号１７および１８に示した
２種の一本鎖ＤＮＡをアニーリングすることにより得た
ＢａｍＨＩ―ＮｄｅＩ断片、ならびにｐＰＨＡＴ１をＮ
ｄｅＩおよびＨｉｎｄIII で切断、アガロース電気泳動
により分離回収したＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片をライ
ゲーションした。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した。数個の形質転換体よりプラスミドを調製す
ることにより相同組換え用ベクターｐＢａｃＰＨＡＴ１
を得た（図６参照）。

【０１０５】［実施例１４］組換えバキュロウイルスの調製 ＡｃＭＮＰＶをＥｃｏ８１Ｉにて一ケ所切断して直鎖に
したもの１４ｎｇとｐＢａｃＰＨＡＴ１ １μｇを混合
し滅菌水にて８μｌにした。これに滅菌水で２倍に希釈
したリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ社）を等量加えて室温
で１５分間静置し、次いでこれを３５ｍｌディッシュ中
に昆虫細胞ＳＦ−９ １×１０⁶ 個を含有する無血清培
地ＥＸ−ＣＥＬＬ４００（JRH Bio Science ）１．５ｍ
ｌに添加した。３日間培養した後、培地を回収し、それ
を１０倍、１００倍など適当に希釈し、単層培養したＳ
Ｆ―９に感染させプラークを形成させた。３日間培養し
た後、培地中にＸ―ｇａｌを添加し、翌日、青く染色さ
れた組換えバキュロウイルスと無色透明な非組換えバキ
ュロウイルスを選別した。青く染色されたプラークをパ
スツールビペットで吸い取り培地中に懸濁、その後この
ウイルス液を再び適当に希釈し、昆虫細胞に感染させ培
養を行った。このようにして出現するプラークがすべて
青く染色されるまで純化を繰り返した。こうして得られ
た組換えバキュロウイルスを＃１Ｂ３と命名した。

【０１０６】［実施例１５］組換えバキュロウイルスによるトリプシン様酵素の製造 ＳＦ―９細胞を単層で５×１０⁶ 個／ｍｌの密度まで生
育させ、培地を除去した後、細胞あたり２〜５ｐｆｕの
＃１Ｂ３を含む無血清培地を加えて感染させ、４日間培
養し、トリプシン様酵素を発現させた。発現したタンパ
ク質の確認は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥおよび抗トリプシン様
酵素ペプチド抗体を用いたウエスタンブロット法（Ana
l. Biochem., １１２，１９５−２０３，１９８１）に
よって行った。

【０１０７】遠心分離（約５００ｘｇ）で上清と細胞を
分離し、上清は限外ろ過（フジフィルター フィルトロ
ン ミニセット 分画分子量３００ｋＤａ）によりウイ
ルスを除去した後、５０ｍＭトリス塩酸−５００ｍＭ塩
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩透析あるいは
希釈した。細胞は５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、終濃度が１
％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ―１００を加え、０℃に
６０分間置き、細胞を溶解した。細胞残渣を遠心分離し
た後、５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩透析あるいは希釈した。こ
れらの溶液を５０ｍＭトリス塩酸―５００ｍＭ塩化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したベンザミジン
アフィニティーカラム（Pharmacia ）にロードし、同緩
衝液で洗浄後、１０ｍＭ塩酸―５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム溶液（ｐＨ２．０）で溶出させた。各フラクションに
ついて実施例２に示した方法によりトリプシン様酵素活
性を測定検出し（図７参照）、メインピークを集め、Ｓ
ＤＳ―ＰＡＧＥを行い分子量約２８ｋＤａタンパク質を
検出し、抗トリプシン様酵素ペプチド抗体を用いたウエ
スタンブロット法によって、この２８ｋＤａタンパク質
がトリプシン様酵素であることを確認した。

【０１０８】かくして得られた精製トリプシン様酵素は
ＳＤＳ―ＰＡＧＥで１バンドある。感染細胞から精製し
たトリプシン様酵素のＳＤＳ―ＰＡＧＥ及びウエスタン
ブロットの結果を図８に示す。

【０１０９】この精製サンプルのＮ末端アミノ酸配列を
プロテインシーケンサー（AppliedBiosystems Model
４７７Ａ）により決定したところ、天然のトリプシン様
酵素の配列と一致した。

【０１１０】［参考例］抗トリプシン様酵素ペプチドポリクローナル抗体の作成 成熟トリプシン様酵素１から１９残基までの配列のＮ末
端にシステインを有する２０残基のペプチドをペプチド
シンセサイザー（Applide Biosystems Model４３１Ａ）
にて化学合成した。この合成ペプチドを１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、１
０ｍｇのマレイミド活性化ヘモシアニン（Boehringer M
annheim Biochemica）と２５℃で２時間インキュベート
した後、反応溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して透析した。ヘモシアニンに結合させたペプ
チドを家兎の皮下に投与（０．５ｍｇ／１回）した。投
与は２週間おきに６回繰り返した。全血を採取、血清を
調製した後、プロテインＡ―セファロース―４Ｂ（Phar
macia ）カラムで精製して抗トリプシン様酵素ペプチド
ポリクローナル抗体を得た。

【配列表】

【０１１１】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 配列 Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20

【０１１２】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 ６、１２、１５ Ｅ ／ＮはＣ又はＩ（イノシン）を意
味する。 配列 ATCYTNGGRG GNACNGAGGC 20

【０１１３】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ARKCKMAGGC TSACYTG 17

【０１１４】配列番号：４ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 組織の種類：気道 配列 ATCTTGGGGG GCACGGAGGC TGAGGAGGGA AGCTGGCCGT GGCAAGTCAG CCTGCGATT 59

【０１１５】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCTTGGGGG GCACGGAGGC TGA 23

【０１１６】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGGCTGAGG AGGGAAGCTG GCCGT 25

【０１１７】配列番号：７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35

【０１１８】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTCGAGTC GACATCGAT 19

【０１１９】配列番号：９ 配列の長さ：９０１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 組織の種類：気道 配列 GAGGCTGAGG AGGGAAGCTG GCCGTGGCAA GTCAGTCTGC GGCTCAATAA TGCCCACCAC 60 TGTGGAGGCA GCCTGATCAA TAACATGTGG ATCCTGACAG CAGCTCACTG CTTCAGAAGC 120 AACTCTAATC CTCGTGACTG GATTGCCACG TCTGGTATTT CCACAACATT TCCTAAACTA 180 AGAATGAGAG TAAGAAATAT TTTAATTCAT AACAATTATA AATCTGCAAC TCATGAAAAT 240 GACATTGCAC TTGTGAGACT TGAGAACAGT GTCACCTTTA CCAAAGATAT CCATAGTGTG 300 TGTCTCCCAG CTGCTACCCA GAATATTCCA CCTGGCTCTA CTGCTTATGT AACAGGATGG 360 GGCGCTCAAG AATATGCTGG CCACACAGTT CCAGAGCTAA GGCAAGGACA GGTCAGAATA 420 ATAAGTAATG ATGTATGTAA TGCACCACAT AGTTATAATG GAGCCATCTT GTCTGGAATG 480 CTGTGTGCTG GAGTACCTCA AGGTGGAGTG GACGCATGTC AGGGTGACTC TGGTGGCCCA 540 CTAGTACAAG AAGACTCACG GCGGCTTTGG TTTATTGTGG GGATAGTAAG CTGGGGAGAT 600 CAGTGTGGCC TGCCGGATAA GCCAGGAGTG TATACTCGAG TGACAGCCTA CCTTGACTGG 660 ATTAGGCAAC AAACTGGGAT CTAGTGCAAC AAGTGCATCC CTGTTGCAAA GTCTGTATGC 720 AGGTGTGCCT GTCTTAAATT CCAAAGCTTT ACATTTCAAC TGAAAAAGAA ACTAGAAATG 780 TCCTAATTTA ACATCTTGTT ACATAAATAT GGTTTAACAA ACACTGTTTA ACCTTTCTTT 840 ATTATTAAAG GTTTTCTATT TTCTCCAAAA AAAAAAAAAA AAATCGATGT CGACTCGAGT 900 C 901

【０１２０】配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGTGGCAAT CCAGTCACGA GGATT 25

【０１２１】配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAGCTGCTG TCAGGATCCA CATGT 25

【０１２２】配列番号：１２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 ３５ Ｓ ／ＮはＧをアミノ基で修飾したもの 配列 CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGN 35

【０１２３】配列番号：１３ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38

【０１２４】配列番号：１４ 配列の長さ：７８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 組織の種類：気道 配列 CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAGTG AATTCGTGGA GTGGGAATCT 60 CAAAGCAGTT GAGTAGGCAG AAAAAAGAAC CTCTTCATTA AGGATTAAAA TGTATAGGCC 120 AGCACGTGTA ACTTCGACTT CAAGATTTCT GAATCCATAT GTAGTATGTT TCATTGTCGT 180 CGCAGGGGTA GTGATCCTGG CAGTCACCAT AGCTCTACTT GTTTACTTTT TAGCTTTTGA 240 TCAAAAATCT TACTTTTATA GGAGCAGTTT TCAACTCCTA AATGTTGAAT ATAATAGTCA 300 GTTAAATTCA CCAGCTACAC AGGAATACAG GACTTTGAGT GGAAGAATTG AATCTCTGAT 360 TACTAAAACA TTCAAAGAAT CAAATTTAAG AAATCAGTTC ATCAGAGCTC ATGTTGCCAA 420 ACTGAGGCAA GATGGTAGTG GTGTGAGAGC GGATGTTGTC ATGAAATTTC AATTCACTAG 480 AAATAACAAT GGAGCATCAA TGAAAAGCAG AATTGAGTCT GTTTTACGAC AAATGCTGAA 540 TAACTCTGGA AACCTGGAAA TAAACCCTTC AACTGAGATA ACATCACTTA CTGACCAGGC 600 TGCAGCAAAT TGGCTTATTA ATGAATGTGG GGCCGGTCCA GACCTAATAA CATTGTCTGA 660 GCAGAGAATC CTTGGAGGCA CTGAGGCTGA GGAGGGAAGC TGGCCGTGGC AAGTCAGTCT 720 GCGGCTCAAT AATGCCCACC ACTGTGGAGG CAGCCTGATC AATAACATGT GGATCCTGAC 780 AGCAGCTCA 789

【０１２５】配列番号：１５ 配列の長さ：１５１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 組織の種類：気道 配列の特徴 ６２．．１３１５ Ｐ ＣＤＳ ６２．．６１９ Ｐ ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ６２０．．１３１５ Ｅ ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 配列 GA GTGGGAATCT 12 CAAAGCAGTT GAGTAGGCAG AAAAAAGAAC CTCTTCATTA AGGATTAAA ATG TAT AGG 70 Met Tyr Arg -185 CCA GCA CGT GTA ACT TCG ACT TCA AGA TTT CTG AAT CCA TAT GTA GTA 118 Pro Ala Arg Val Thr Ser Thr Ser Arg Phe Leu Asn Pro Tyr Val Val -180 -175 -170 TGT TTC ATT GTC GTC GCA GGG GTA GTG ATC CTG GCA GTC ACC ATA GCT 166 Cys Phe Ile Val Val Ala Gly Val Val Ile Leu Ala Val Thr Ile Ala -165 -160 -155 CTA CTT GTT TAC TTT TTA GCT TTT GAT CAA AAA TCT TAC TTT TAT AGG 214 Leu Leu Val Tyr Phe Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Tyr Phe Tyr Arg -150 -145 -140 AGC AGT TTT CAA CTC CTA AAT GTT GAA TAT AAT AGT CAG TTA AAT TCA 262 Ser Ser Phe Gln Leu Leu Asn Val Glu Tyr Asn Ser Gln Leu Asn Ser -135 -130 -125 -120 CCA GCT ACA CAG GAA TAC AGG ACT TTG AGT GGA AGA ATT GAA TCT CTG 310 Pro Ala Thr Gln Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Gly Arg Ile Glu Ser Leu -115 -110 -105 ATT ACT AAA ACA TTC AAA GAA TCA AAT TTA AGA AAT CAG TTC ATC AGA 358 Ile Thr Lys Thr Phe Lys Glu Ser Asn Leu Arg Asn Gln Phe Ile Arg -100 -95 -90 GCT CAT GTT GCC AAA CTG AGG CAA GAT GGT AGT GGT GTG AGA GCG GAT 406 Ala His Val Ala Lys Leu Arg Gln Asp Gly Ser Gly Val Arg Ala Asp -85 -80 -75 GTT GTC ATG AAA TTT CAA TTC ACT AGA AAT AAC AAT GGA GCA TCA ATG 454 Val Val Met Lys Phe Gln Phe Thr Arg Asn Asn Asn Gly Ala Ser Met -70 -65 -60 AAA AGC AGA ATT GAG TCT GTT TTA CGA CAA ATG CTG AAT AAC TCT GGA 502 Lys Ser Arg Ile Glu Ser Val Leu Arg Gln Met Leu Asn Asn Ser Gly -55 -50 -45 -40 AAC CTG GAA ATA AAC CCT TCA ACT GAG ATA ACA TCA CTT ACT GAC CAG 550 Asn Leu Glu Ile Asn Pro Ser Thr Glu Ile Thr Ser Leu Thr Asp Gln -35 -30 -25 GCT GCA GCA AAT TGG CTT ATT AAT GAA TGT GGG GCC GGT CCA GAC CTA 598 Ala Ala Ala Asn Trp Leu Ile Asn Glu Cys Gly Ala Gly Pro Asp Leu -20 -15 -10 ATA ACA TTG TCT GAG CAG AGA ATC CTT GGA GGC ACT GAG GCT GAG GAG 646 Ile Thr Leu Ser Glu Gln Arg Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu -5 1 5 GGA AGC TGG CCG TGG CAA GTC AGT CTG CGG CTC AAT AAT GCC CAC CAC 694 Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Leu Asn Asn Ala His His 10 15 20 25 TGT GGA GGC AGC CTG ATC AAT AAC ATG TGG ATC CTG ACA GCA GCT CAC 742 Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Asn Met Trp Ile Leu Thr Ala Ala His 30 35 40 TGC TTC AGA AGC AAC TCT AAT CCT CGT GAC TGG ATT GCC ACG TCT GGT 790 Cys Phe Arg Ser Asn Ser Asn Pro Arg Asp Trp Ile Ala Thr Ser Gly 45 50 55 ATT TCC ACA ACA TTT CCT AAA CTA AGA ATG AGA GTA AGA AAT ATT TTA 838 Ile Ser Thr Thr Phe Pro Lys Leu Arg Met Arg Val Arg Asn Ile Leu 60 65 70 ATT CAT AAC AAT TAT AAA TCT GCA ACT CAT GAA AAT GAC ATT GCA CTT 886 Ile His Asn Asn Tyr Lys Ser Ala Thr His Glu Asn Asp Ile Ala Leu 75 80 85 GTG AGA CTT GAG AAC AGT GTC ACC TTT ACC AAA GAT ATC CAT AGT GTG 934 Val Arg Leu Glu Asn Ser Val Thr Phe Thr Lys Asp Ile His Ser Val 90 95 100 105 TGT CTC CCA GCT GCT ACC CAG AAT ATT CCA CCT GGC TCT ACT GCT TAT 982 Cys Leu Pro Ala Ala Thr Gln Asn Ile Pro Pro Gly Ser Thr Ala Tyr 110 115 120 GTA ACA GGA TGG GGC GCT CAA GAA TAT GCT GGC CAC ACA GTT CCA GAG 1030 Val Thr Gly Trp Gly Ala Gln Glu Tyr Ala Gly His Thr Val Pro Glu 125 130 135 CTA AGG CAA GGA CAG GTC AGA ATA ATA AGT AAT GAT GTA TGT AAT GCA 1078 Leu Arg Gln Gly Gln Val Arg Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Ala 140 145 150 CCA CAT AGT TAT AAT GGA GCC ATC TTG TCT GGA ATG CTG TGT GCT GGA 1126 Pro His Ser Tyr Asn Gly Ala Ile Leu Ser Gly Met Leu Cys Ala Gly 155 160 165 GTA CCT CAA GGT GGA GTG GAC GCA TGT CAG GGT GAC TCT GGT GGC CCA 1174 Val Pro Gln Gly Gly Val Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 170 175 180 185 CTA GTA CAA GAA GAC TCA CGG CGG CTT TGG TTT ATT GTG GGG ATA GTA 1222 Leu Val Gln Glu Asp Ser Arg Arg Leu Trp Phe Ile Val Gly Ile Val 190 195 200 AGC TGG GGA GAT CAG TGT GGC CTG CCG GAT AAG CCA GGA GTG TAT ACT 1270 Ser Trp Gly Asp Gln Cys Gly Leu Pro Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr 205 210 215 CGA GTG ACA GCC TAC CTT GAC TGG ATT AGG CAA CAA ACT GGG ATC 1315 Arg Val Thr Ala Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly Ile 220 225 230 TAGTGCAACA AGTGCATCCC TGTTGCAAAG TCTGTATGCA GGTGTGCCTG TCTTAAATTC 1375 CAAAGCTTTA CATTTCAACT GAAAAAGAAA CTAGAAATGT CCTAATTTAA CATCTTGTTA 1435 CATAAATATG GTTTAACAAA CACTGTTTAA CCTTTCTTTA TTATTAAAGG TTTTCTATTT 1495 TCTCCAAAAA AAAAAAAAAA AA 1517

【０１２６】配列番号：16 配列の長さ：10241 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 ベクターＤＮＡ 配列 GCAGTTCGTT GACGCCTTCC TCCGTGTGGC CGAACACGTC GAGCGGGTGG TCGATGACCA 60 GCGGCGTGCC GCACGCGACG CACAAGTATC TGTACACCGA ATGATCGTCG GGCGAAGGCA 120 CGTCGGCCTC CAAGTGGCAA TATTGGCAAA TTCGAAAATA TATACAGTTG GGTTGTTTGC 180 GCATATCTAT CGTGGCGTTG GGCATGTACG TCCGAACGTT GATTTGCATG CAAGCCGAAA 240 TTAAATCATT GCGATTAGTG CGATTAAAAC GTTGTACATC CTCGCTTTTA ATCATGCCGT 300 CGATTAAATC GCGCAATCGA GTCAAGTGAT CAAAGTGTGG AATAATGTTT TCTTTGTATT 360 CCCGAGTCAA GCGCAGCGCG TATTTTAACA AACTAGCCAT CTTGTAAGTT AGTTTCATTT 420 AATGCAACTT TATCCAATAA TATATTATGT ATCGCACGTC AAGAATTAAC AATGCGCCCG 480 TTGTCGCATC TCAACACGAC TATGATAGAG ATCAAATAAA GCGCGAATTA AATAGCTTGC 540 GACGCAACGT GCACGATCTG TGCACGCGTT CCGGCACGAG CTTTGATTGT AATAAGTTTT 600 TACGAAGCGA TGACATGACC CCCGTAGTGA CAACGATCAC GCCCAAAAGA ACTGCCGACT 660 ACAAAATTAC CGAGTATGTC GGTGACGTTA AAACTATTAA GCCATCCAAT CGACCGTTAG 720 TCGAATCAGG ACCGCTGGTG CGAGAAGCCG CGAAGTATGG CGAATGCATC GTATAACGTG 780 TGGAGTCCGC TCATTAGAGC GTCATGTTTA GACAAGAAAG CTACATATTT AATTGATCCC 840 GATGATTTTA TTGATAAATT GACCCTAACT CCATACACGG TATTCTACAA TGGCGGGGTT 900 TTGGTCAAAA TTTCCGGACT GCGATTGTAC ATGCTGTTAA CGGCTCCGCC CACTATTAAT 960 GAAATTAAAA ATTCCAATTT TAAAAAACGC AGCAAGAGAA ACATTTGTAT GAAAGAATGC 1020 GTAGAAGGAA AGAAAAATGT CGTCGACATG CTGAACAACA AGATTAATAT GCCTCCGTGT 1080 ATAAAAAAAA TATTGAACGA TTTGAAAGAA AACAATGTAC CGCGCGGCGG TATGTACAGG 1140 AAGAGGTTTA TACTAAACTG TTACATTGCA AACGTGGTTT CGTGTGCCAA GTGTGAAAAC 1200 CGATGTTTAA TCAAGGCTCT GACGCATTTC TACAACCACG ACTCCAAGTG TGTGGGTGAA 1260 GTCATGCATC TTTTAATCAA ATCCCAAGAT GTGTATAAAC CACCAAACTG CCAAAAAATG 1320 AAAACTGTCG ACAAGCTCTG TCCGTTTGCT GGCAACTGCA AGGGTCTCAA TCCTATTTGT 1380 AATTATTGAA TAATAAAACA ATTATAAATG CTAAATTTGT TTTTTATTAA CGATACAAAC 1440 CAAACGCAAC AAGAACATTT GTAGTATTAT CTATAATTGA AAACGCGTAG TTATAATCGC 1500 TGAGGTAATA TTTAAAATCA TTTTCAAATG ATTCACAGTT AATTTGCGAC AATATAATTT 1560 TATTTTCACA TAAACTAGAC GCCTTGTCGT CTTCTTCTTC GTATTCCTTC TCTTTTTCAT 1620 TTTTCTCCTC ATAAAAATTA ACATAGTTAT TATCGTATCC ATATATGTAT CTATCGTATA 1680 GAGTAAATTT TTTGTTGTCA TAAATATATA TGTCTTTTTT AATGGGGTGT ATAGTACCGC 1740 TGCGCATAGT TTTTCTGTAA TTTACAACAG TGCTATTTTC TGGTAGTTCT TCGGAGTGTG 1800 TTGCTTTAAT TATTAAATTT ATATAATCAA TGAATTTGGG ATCGTCGGTT TTGTACAATA 1860 TGTTGCCGGC ATAGTACGCA GCTTCTTCTA GTTCAATTAC ACCATTTTTT AGCAGCACCG 1920 GATTAACATA ACTTTCCAAA ATGTTGTACG AACCGTTAAA CAAAAACAGT TCACCTCCCT 1980 TTTCTATACT ATTGTCTGCG AGCAGTTGTT TGTTGTTAAA AATAACAGCC ATTGTAATGA 2040 GACGCACAAA CTAATATCAC AAACTGGAAA TGTCTATCAA TATATAGTTG CTGATATCAG 2100 ATCCAGACAT GATAAGATAC ATTGATGAGT TTGGACAAAC CACAACTAGA ATGCAGTGAA 2160 AAAAATGCTT TATTTGTGAA ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC ATTATAAGCT 2220 GCAATAAACA AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG 2280 TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC AAGTAAAACC TCTACAAATG TGGTATGGCT GATTATGATC 2340 CTCTAGAGTC GAGATCCCCC TCGCCCGGTT ATTATTATTT TTGACACCAG ACCAACTGGT 2400 AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CCGCCGATAC TGACGGGCTC CAGGAGTCGT 2460 CGCCACCAAT CCCCATATGG AAACCGTCGA TATTCAGCCA TGTGCCTTCT TCCGCGTGCA 2520 GCAGATGGCG ATGGCTGGTT TCCATCAGTT GCTGTTGACT GTAGCGGCTG ATGTTGAACT 2580 GGAAGTCGCC GCGCCACTGG TGTGGGCCAT AATTCAATTC GCGCGTCCCG CAGCGCAGAC 2640 CGTTTTCGCT CGGGAAGACG TACGGGGTAT ACATGTCTGA CAATGGCAGA TCCCAGCGGT 2700 CAAAACAGGC GGCAGTAAGG CGGTCGGGAT AGTTTTCTTG CGGCCCTAAT CCGAGCCAGT 2760 TTACCCGCTC TGCTACCTGC GCCAGCTGGC AGTTCAGGCC AATCCGCGCC GGATGCGGTG 2820 TATCGCTCGC CACTTCAACA TCAACGGTAA TCGCCATTTG ACCACTACCA TCAATCCGGT 2880 AGGTTTTCCG GCTGATAAAT AAGGTTTTCC CCTGATGCTG CCACGCGTGA GCGGTCGTAA 2940 TCAGCACCGC ATCAGCAAGT GTATCTGCCG TGCACTGCAA CAACGCTGCT TCGGCCTGGT 3000 AATGGCCCGC CGCCTTCCAG CGTTCGACCC AGGCGTTAGG GTCAATGCGG GTCGCTTCAC 3060 TTACGCCAAT GTCGTTATCC AGCGGTGCAC GGGTGAACTG ATCGCGCAGC GGCGTCAGCA 3120 GTTGTTTTTT ATCGCCAATC CACATCTGTG AAAGAAAGCC TGACTGGCGG TTAAATTGCC 3180 AACGCTTATT ACCCAGCTCG ATGCAAAAAT CCATTTCGCT GGTGGTCAGA TGCGGGATGG 3240 CGTGGGACGC GGCGGGGAGC GTCACACTGA GGTTTTCCGC CAGACGCCAC TGCTGCCAGG 3300 CGCTGATGTG CCCGGCTTCT GACCATGCGG TCGCGTTCGG TTGCACTACG CGTACTGTGA 3360 GCCAGAGTTG CCCGGCGCTC TCCGGCTGCG GTAGTTCAGG CAGTTCAATC AACTGTTTAC 3420 CTTGTGGAGC GACATCCAGA GGCACTTCAC CGCTTGCCAG CGGCTTACCA TCCAGCGCCA 3480 CCATCCAGTG CAGGAGCTCG TTATCGCTAT GACGGAACAG GTATTCGCTG GTCACTTCGA 3540 TGGTTTGCCC GGATAAACGG AACTGGAAAA ACTGCTGCTG GTGTTTTGCT TCCGTCAGCG 3600 CTGGATGCGG CGTGCGGTCG GCAAAGACCA GACCGTTCAT ACAGAACTGG CGATCGTTCG 3660 GCGTATCGCC AAAATCACCG CCGTAAGCCG ACCACGGGTT GCCGTTTTCA TCATATTTAA 3720 TCAGCGACTG ATCCACCCAG TCCCAGACGA AGCCGCCCTG TAAACGGGGA TACTGACGAA 3780 ACGCCTGCCA GTATTTAGCG AAACCGCCAA GACTGTTACC CATCGCGTGG GCGTATTCGC 3840 AAAGGATCAG CGGGCGCGTC TCTCCAGGTA GCGAAAGCCA TTTTTTGATG GACCATTTCG 3900 GCACAGCCGG GAAGGGCTGG TCTTCATCCA CGCGCGCGTA CATCGGGCAA ATAATATCGG 3960 TGGCCGTGGT GTCGGCTCCG CCGCCTTCAT ACTGCACCGG GCGGGAAGGA TCGACAGATT 4020 TGATCCAGCG ATACAGCGCG TCGTGATTAG CGCCGTGGCC TGATTCATTC CCCAGCGACC 4080 AGATGATCAC ACTCGGGTGA TTACGATCGC GCTGCACCAT TCGCGTTACG CGTTCGCTCA 4140 TCGCCGGTAG CCAGCGCGGA TCATCGGTCA GACGATTCAT TGGCACCATG CCGTGGGTTT 4200 CAATATTGGC TTCATCCACC ACATACAGGC CGTAGCGGTC GCACAGCGTG TACCACAGCG 4260 GATGGTTCGG ATAATGCGAA CAGCGCACGG CGTTAAAGTT GTTCTGCTTC ATCAGCAGGA 4320 TATCCTGCAC CATCGTCTGC TCATCCATGA CCTGACCATG CAGAGGATGA TGCTCGTGAC 4380 GGTTAACGCC TCGAATCAGC AACGGCTTGC CGTTCAGCAG CAGCAGACCA TTTTCAATCC 4440 GCACCTCGCG GAAACCGACA TCGCAGGCTT CTGCTTCAAT CAGCGTGCCG TCGGCGGTGT 4500 GCAGTTCAAC CACCGCACGA TAGAGATTCG GGATTTCGGC GCTCCACAGT TTCGGGTTTT 4560 CGACGTTCAG ACGTAGTGTG ACGCGATCGG CATAACCACC ACGCTCATCG ATAATTTCAC 4620 CGCCGAAAGG CGCGGTGCCG CTGGCGACCT GCGTTTCACC CTGCCATAAA GAAACTGTTA 4680 CCCGTAGGTA GTCACGCAAC TCGCCGCACA TCTGAACTTC AGCCTCCAGT ACAGCGCGGC 4740 TGAAATCATC ATTAAAGCGA GTGGCAACAT GGAAATCGCT GATTTGTGTA GTCGGTTTAT 4800 GCAGCAACGA GACGTCACGG AAAATGCCGC TCATCCGCCA CATATCCTGA TCTTCCAGAT 4860 AACTGCCGTC ACTCCAACGC AGCACCATCA CCGCGAGGCG GTTTTCTCCG GCGCGTAAAA 4920 ATGCGCTCAG GTCAAATTCA GACGGCAAAC GACTGTCCTG GCCGTAACCG ACCCAGCGCC 4980 CGTTGCACCA CAGATGAAAC GCCGAGTTAA CGCCATCAAA AATAATTCGC GTCTGGCCTT 5040 CCTGTAGCCA GCTTTCATCA ACATTAAATG TGAGCGAGTA ACAACCCGTC GGATTCTCCG 5100 TGGGAACAAA CGGCGGATTG ACCGTAATGG GATAGGTTAC GTTGGTGTAG ATGGGCGCAT 5160 CGTAACCGTG CATCTGCCAG TTTGAGGGGA CGACGACAGT ATCGGCCTCA GGAAGATCGC 5220 ACTCCAGCCA GCTTTCCGGC ACCGCTTCTG GTGCCGGAAA CCAGGCAAAG CGCCATTCGC 5280 CATTCAGGCT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCG CTATTACGCC 5340 AGCTGGCGAA AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA GGGTTTTCCC 5400 AGTCACGACG TTGTAAAACG ACGGGATCTA TCATTTTTAG CAGTGATTCT AATTGCAGCT 5460 GCTCTTTGAT ACAACTAATT TTACGACGAC GATGCGAGCT TTTATTCAAC CGAGCGTGCA 5520 TGTTTGCAAT CGTGCAAGCG TTATCAATTT TTCATTATCG TATTGTTGCA CATCAACAGG 5580 CTGGACACCA CGTTGAACTC GCCGCAGTTT TGCGGCAAGT TGGACCCGCC GCGCATCCAA 5640 TGCAAACTTT CCGACATTCT GTTGCCTACG AACGATTGAT TCTTTGTCCA TTGATCGAAG 5700 CGAGTGCCTT CGACTTTTTC GTGTCCAGTG TGGCTTGATA TCATGGAGAT AATTAAAATG 5760 ATAACCATCT CGCAAATAAA TAAGTATTTT ACTGTTTTCG TAACAGTTTT GTAATAAAAA 5820 AACCTATAAA TATTCCGGAT TATTCATACC GTCCCACCAT CGGGCGTGCT AGCGGATCCG 5880 AGCTCGAGAT CTGCAGCTGG TACCATGGAA TTCGAAGCTT GTCGTTGGAT GGAAAGGAAA 5940 AGAGTTCTAC AGGGAAACTT GGACCCGCTT CATGGAAGAC AGCTTCCCCA TTGTTAACGA 6000 CCAAGAAGTG ATGGATGTTT TCCTTGTTGT CAACATGCGT CCCACTAGAC CCAACCGTTG 6060 TTACAAATTC CTGGCCCAAC ACGCTCTGCG TTGCGACCCC GACTATGTAC CTCATGACGT 6120 GATTAGGATC GTCGAGCCTT CATGGGTGGG CAGCAACAAC GAGTACCGCA TCAGCCTGGC 6180 TAAGAAGGGC GGCGGCTGCC CAATAATGAA CCTTCACTCT GAGTACACCA ACTCGTTCGA 6240 ACAGTTCATC GATCGTGTCA TCTGGGAGAA CTTCTACAAG CCCATCGTTT ACATCGGTAC 6300 CGACTCTGCT GAAGAGGAGG AAATTCTCCT TGAAGTTTCC CTGGTGTTCA AAGTAAAGGA 6360 GTTTGCACCA GACGCACCTC TGTTCACTGG TCCGGCGTAT TAAAACACGA TACATTGTTA 6420 TTAGTACATT TATTAAGCGC TAGATTCTGT GCGTTGTTGA TTTACAGACA ATTGTTGTAC 6480 GTATTTTAAT AATTCATTAA ATTTATAATC TTTAGGGTGG TATGTTAGAG CGAAAATCAA 6540 ATGATTTTCA GCGTCTTTAT ATCTGAATTT AAATATTAAA TCCTCAATAG ATTTGTAAAA 6600 TAGGTTTCGA TTAGTTTCAA ACAAGGGTTG TTTTTCCGAA CCGATGGCTG GACTATCTAA 6660 TGGATTTTCG CTCAACGCCA CAAAACTTGC CAAATCTTGT AGCAGCAATC TAGCTTTGTC 6720 GATATTCGTT TGTGTTTTGT TTTGTAATAA AGGTTCGACG TCGTTCAAAA TATTATGCGC 6780 TTTTGTATTT CTTTCATCAC TGTCGTTAGT GTACAATTGA CTCGACGTAA ACACGTTAAA 6840 TAAAGCTAGC TTGGACATAT TTAACATCGG GCGTGTTAGC TTTATTAGGC CGATTATCGT 6900 CGTCGTCCCA ACCCTCGTCG TTAGAAGTTG CTTCCGAAGA CGATTTTGCC ATAGCCACAC 6960 GACGCCTATT AATTGTGTCG GCTAACACGT CCGCGATCAA ATTTGTAGTT GAGCTTTTTG 7020 GAATTATTTC TGATTGCGGG CGTTTTTGGG CGGGTTTCAA TCTAACTGTG CCCGATTTTA 7080 ATTCAGACAA CACGTTAGAA AGCGATGGTG CAGGCGGTGG TAACATTTCA GACGGCAAAT 7140 CTACTAATGG CGGCGGTGGT GGAGCTGATG ATAAATCTAC CATCGGTGGA GGCGCAGGCG 7200 GGGCTGGCGG CGGAGGCGGA GGCGGAGGTG GTGGCGGTGA TGCAGACGGC GGTTTAGGCT 7260 CAAATGTCTC TTTAGGCAAC ACAGTCGGCA CCTCAACTAT TGTACTGGTT TCGGGCGCCG 7320 TTTTTGGTTT GACCGGTCTG AGACGAGTGC GATTTTTTTC GTTTCTAATA GCTTCCAACA 7380 ATTGTTGTCT GTCGTCTAAA GGTGCAGCGG GTTGAGGTTC CGTCGGCATT GGTGGAGCGG 7440 GCGGCAATTC AGACATCGAT GGTGGTGGTG GTGGTGGAGG CGCTGGAATG TTAGGCACGG 7500 GAGAAGGTGG TGGCGGCGGT GCCGCCGGTA TAATTTGTTC TGGTTTAGTT TGTTCGCGCA 7560 CGATTGTGGG CACCGGCGCA GGCGCCGCTG GCTGCACAAC GGAAGGTCGT CTGCTTCGAG 7620 GCAGCGCTTG GGGTGGTGGC AATTCAATAT TATAATTGGA ATACAAATCG TAAAAATCTG 7680 CTATAAGCAT TGTAATTTCG CTATCGTTTA CCGTGCCGAT ATTTAACAAC CGCTCAATGT 7740 AAGCAATTGT ATTGTAAAGA GATTGTCTCA AGCTCCGCAC GCCGATAACA AGCCTTTTCA 7800 TTTTTACTAC AGCATTGTAG TGGCGAGACA CTTCGCTGTC GTCGACTCGA GTTCTATAGT 7860 GTCACCTAAA TCGTATGTGT ATGATACATA AGGTTATGTA TTAATTGTAG CCGCGTTCTA 7920 ACGACAATAT GTCCATATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 7980 GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT CTGCTCCCGG 8040 CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG CATGTGTCAG AGGTTTTCAC 8100 CGTCATCACC GAAACGCGCG AGAGGAAAGG GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA 8160 ATGTCATGAT AATAATGGTT TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG 8220 GAACCCCTAT TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT 8280 AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC 8340 GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA 8400 CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC 8460 TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA 8520 TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG 8580 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA 8640 CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA 8700 TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA 8760 CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC 8820 TGAATGAAGC CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA 8880 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG 8940 ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT 9000 GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC 9060 TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA 9120 CTATGGATGA ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT 9180 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT 9240 TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 9300 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 9360 CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 9420 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 9480 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 9540 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 9600 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 9660 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 9720 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCATTGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 9780 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 9840 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC 9900 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 9960 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 10020 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 10080 GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCCA ATACGCAAAC 10140 CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT AATGCAGGTT AACCTGGCTT ATCGAAATTA 10200 ATACGACTCA CTATAGGGAG ACCGGCAGAT CGATCTGTCG A 10241

【０１２７】配列番号：17 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCATGTA TAGGCCAGCA CGTGTAACTT CGACTTCAAG ATTTCTGAAT CCA 53

【０１２８】配列番号：18 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGATTCA GAAATCTTGA AGTCGAAGTT ACACGTGCTG GCCTATACAT G 51

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のトリプシン様酵素の分子量を測定した
ＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。

【図２】本発明のトリプシン様酵素の活性に対するｐＨ
の影響を示す。

【図３】本発明のトリプシン様酵素のフィブリノーゲン
凝固に対する影響を示す。

【図４】本発明のプラスミドｐＰＨＡＴ１を示す。

【図５】発現用ベクターｐＢｌｕｅＢａｃIII の制限サ
イトおよび機能地図を示す。

【図６】本発明のトリプシン様酵素をコードするｃＤＮ
Ａを挿入した組換えベクターｐＢａｃＰＨＡＴ１を示
す。

【図７】本発明のトリプシン様酵素活性の結果を示す。

【図８】本発明のトリプシン様酵素のＳＤＳ―ＰＡＧＥ
及びウエスタンブロットの結果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/54 //(Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 須賀 哲也 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝 人株式会社 東京研究センター内 (72)発明者 杉本 圭則 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝 人株式会社 東京研究センター内 (72)発明者 高木 健一郎 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝 人株式会社 東京研究センター内 (72)発明者 安岡 劭 徳島県徳島市蔵本町３丁目18−15 徳島 大学医療技術短期大学部内 (56)参考文献 特許2839825（ＪＰ，Ｂ２) 日本胸部疾患雑誌（日本胸部疾患学 会）第31巻増刊号 Ｐ．233 Ｈ−８ （1993年３月10日発行) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/48 - 9/76 C12N 15/00 - 15/57 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢ／Ｇｅ ｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列： 【化１】 Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asn Asn Ala His His Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn 20 25 30 Asn Met Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Arg Ser Asn Ser Asn 35 40 45 Pro Arg Asp Trp Ile Ala Thr Ser Gly Ile Ser Thr Thr Phe Pro Lys 50 55 60 Leu Arg Met Arg Val Arg Asn Ile Leu Ile His Asn Asn Tyr Lys Ser 65 70 75 80 Ala Thr His Glu Asn Asp Ile Ala Leu Val Arg Leu Glu Asn Ser Val 85 90 95 Thr Phe Thr Lys Asp Ile His Ser Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr Gln 100 105 110 Asn Ile Pro Pro Gly Ser Thr Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly Ala Gln 115 120 125 Glu Tyr Ala Gly His Thr Val Pro Glu Leu Arg Gln Gly Gln Val Arg 130 135 140 Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Ala Pro His Ser Tyr Asn Gly Ala 145 150 155 160 Ile Leu Ser Gly Met Leu Cys Ala Gly Val Pro Gln Gly Gly Val Asp 165 170 175 Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Gln Glu Asp Ser Arg 180 185 190 Arg Leu Trp Phe Ile Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Asp Gln Cys Gly 195 200 205 Leu Pro Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Thr Ala Tyr Leu Asp 210 215 220 Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly Ile 225 230 を有するトリプシン様酵素またはその生化学的同等物を
   コードする核酸塩基配列。
2. 【請求項２】 塩基配列中に下記式： 【化２】 AXC CXX GGA GGC ACX GAG GCX GAG GAG GGA AGC XGG CCG XGG CAA GXC AGX CXG CGG CXC AAX AAX GCC CAC CAC XGX GGA GGC AGC CXG AXC AAX AAC AXG XGG AXC CXG ACA GCA GCX CAC XGC XXC AGA AGC AAC XCX AAX CCX CGX GAC XGG AXX GCC ACG XCX GGX AXX XCC ACA ACA XXX CCX AAA CXA AGA AXG AGA GXA AGA AAX AXX XXA AXX CAX AAC AAX XAX AAA XCX GCA ACX CAX GAA AAX GAC AXX GCA CXX GXG AGA CXX GAG AAC AGX GXC ACC XXX ACC AAA GAX AXC CAX AGX GXG XGX CXC CCA GCX GCX ACC CAG AAX AXX CCA CCX GGC XCX ACX GCX XAX GXA ACA GGA XGG GGC GCX CAA AXA AXA AGX AAX GAX GXA XGX AAX GCA CCA CAX AGX XAX AAX GGA GCC GAA XAX GCX GGC CAC ACA GXX CCA GAG CXA AGG CAA GGA CAG GXC AGA AXC XXG XCX GGA AXG CXG XGX GCX GGA GXA CCX CAA GGX GGA GXG GAC GCA XGX CAG GGX GAC XCX GGX GGC CCA CXA GXA CAA GAA GAC XCA CGG CGG CXX XGG XXX AXX GXG GGG AXA GXA AGC XGG GGA GAX CAG XGX GGC CXG CCG GAX AAG CCA GGA GXG XAX ACX CGA GXG ACA GCC XAC CXX GAC XGG AXX AGG CAA CAA ACX GGG AXC （式中、ＸはＴまたはＵを表す）で示される暗号鎖を連
   続的または断続的に含有する請求項１記載の核酸塩基配
   列。
3. 【請求項３】 請求項１記載の核酸塩基配列を用い、遺
   伝子工学的手法により請求項１記載のアミノ酸配列を有
   するトリプシン様酵素またはその生化学的同等物を製造
   する方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のアミノ酸配列を有するト
   リプシン様酵素の生化学的同等物。