JP3164497B2 - Ｅｂｖゲノムのｄｎａ配列 - Google Patents

Ｅｂｖゲノムのｄｎａ配列

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JP3164497B2 JP26609995A JP26609995A JP3164497B2 JP 3164497 B2 JP3164497 B2 JP 3164497B2 JP 26609995 A JP26609995 A JP 26609995A JP 26609995 A JP26609995 A JP 26609995A JP 3164497 B2 JP3164497 B2 JP 3164497B2
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Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】発明の技術分野 本発明は、以下に述べる方法ならびに診断用および製剤
組成物に用いられるべきＥＢＶ関連抗原の少なくとも部
分のためにコードするＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列ならび
にそれぞれのＤＮＡ配列の少なくとも部分の位置決定お
よび単離方法に関する。さらに、本発明は、細菌、酵
母、哺乳動物細胞のような適当な宿主中へ導入された
後、該ＥＢＶ関連抗原の抗原決定基の産生のために有用
である組換えＤＮＡ分子すなわちクローニングおよび発
現ベクターに関する。さらに、本発明は、ＥＢＶ関連抗
原に対する抗体の迅速、簡単、高感度、高度特異的な決
定のためのそれぞれの方法および組成物またはキットに
も関する。これらの試験に於て、ＥＢＶの異なる抗原を
用いて、これらの抗原に対する患者の血清中の特異抗体
群を検出する。この検出は、前感染、新感染、慢性感
染、回復および腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）状態のよ
うな血清供与者の感染の状態に関するかなり信頼できる
結論を可能にする。さらに、本発明は、ＥＢＶ関連疾患
の予防および治療に有用な該抗原を含有する製剤組成物
例えばワクチンに関する。 【０００２】背景技術 ヘルペスウイルス〔ヘルペトビリジアエ（Ｈｅｒｐｅｔ
ｏｖｉｒｉｄｉａｅ）〕は、全直径１５０ｎｍの包囲２
０面体カプシドである。ウイルスゲノムは、分子量約１
０Ｄの２本鎖ＤＮＡからなっている。ヒトのヘルペスウ
イルスは、ヘルペスシンプレックスＩ（“単純疱
疹”）、ヘルペスシンプレックスＩＩ（陰部疱疹）、バ
リセラーゾスター（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅ
ｒ）（水痘、帯状疱疹）、チトメガロウイルス（ｃｙｔ
ｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（先天性奇形、例えば小頭
症）、およびエプスタイン−バル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）〔伝染性単核症（ＩＭ），
バーキットの（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫（Ｂ
Ｌ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）〕である。ヘルペスウイルス
は、宿主の一生の間持続する可能性のある潜在的感染を
つくり上げる顕著な性質を示す。１次感染後、ヘルペス
ウイルスは、照射や免疫抑圧のような、幾つかの公知の
型の刺激の１つによって活性化されるまでは、休止して
いるか、あるいは散在的にだけ見られるかあるいは全く
見られない。かかる内因性疾患の再発は、ヘルペスシン
プレックスまたはゾスター（ｚｏｓｔｅｒ）の場合には
皮膚上の小庖疹の集まりの形をとり、あるいはチトメガ
ロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）または
ＥＢＶの場合にはより一般化された結果を示す可能性が
ある。潜在的感染として無期限に存続するこの能力のた
めに、これらのウイルスは事実上長期間生存することが
できる。ここ数年間、ヒトの癌とＥＢＶとの相関に注意
が向けられている。 【０００３】エプスタイン−バルウイルス（ＥＢＶ）、
感染とその結果 ＥＢＶは第１次疾患として伝染性単核症を生ずる。主と
して子供または若年成人に起こる。平均成人人口の９０
％以上が、抹消Ｂ−リンパ球内に一生存続するＥＢＶで
感染されている。このウイルスは耳下腺中で産生され、
経口ルートによって広がる。血清学は、２種のヒトの腫
瘍性（ｎｅｏｌａｓｔｉｃ）疾患、アフリカン バーキ
ット リンパ腫（Ａｆｒｉｃａｎ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ
ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＢＬ）および鼻咽頭癌（ＮＰ
Ｃ）の惹起にＥＢＶが関与する可能性があることを示唆
している。伝染性単核症はＥＢＶによる１次感染の１つ
の結果である。伝染性単核症は、付加的な危険因子が無
ければ生命を脅かす疾患ではない。しかし、しばしば長
期間（数週間程度）の自覚的病気感情と脾臓破裂の危険
が劇的に増すための物理的ストレスを避ける必要性と
が、確かにこの疾患の抑制を示唆するであろう。 【０００４】伝染性単核症の臨床的診断は、通常、下記
のパラメーターの組み合わせから誘導される。 １． １０，０００〜２０，０００、そして５０，００
０にまで達する高い白血球数。 ２． １０％の異型細胞 ３． リンパ節炎 ４． 熱があること 伝染性単核症の患者は唾液中にＥＢＶを放散する。この
ウイルス放散では、流行および近接者の感染は稀である
ので、この病気の蔓延に対して特別な予防を必要としな
い〔Ａ．Ｓ．エバンス（Ａ．Ｓ．Ｅｖａｎｓ）、“ＥＢ
ウイルス感染の伝達、経口薬物に於けるウイルス感染
（Ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＢ ｖ
ｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）”、Ｊ．フックス、Ｇ．ジョーダン（Ｊ．Ｈｏｏｋ
ｓ，Ｇ．Ｊｏｒｄａｎ）編著、エルスビアノースホラン
ドアムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈ
ｏｌｌａｎｄ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ），ｐ．２１１（１
９８２）〕。ウイルス放散は病気の回復によっては止ま
らず、成人人口の少なくとも６０％（おそらくは１００
％まで）が、耳下腺の唾液腺管の上皮細胞中で生涯産出
される少なくとも低いレベルのＥＢＶを放散する［Ｈ．
ウォルフ、Ｍ．ハウス、Ｅ．ウイルメス（Ｈ．Ｗｏｌ
ｆ，Ｍ．Ｈａｕｓ，Ｅ．Ｗｉｌｍｅｓ）、“耳下腺中に
於けるエプスタイン・バルウイルスの存続（Ｐｅｒｓｉ
ｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒ
ｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｏｔｉｄ ｇｌａｎ
ｄ）”、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５１（１９８４）］。 【０００５】伝染性単核症例の約１％は、該疾患の初期
に於て既に、あるいはその後の帰結として合併症を示
す。ほとんどの合併症は自己免疫機構によるものであ
り、ある症例では身体がＥＢＶ転化、増殖性Ｂ細胞の過
剰を除去することができる機構による対宿主移植片症と
区別することができない。例えばコルチコステロイドと
の併用に於ける高い投与量のシクロポリンＡによる治療
のような環境あるいはプルティロ（Ｐｕｒｔｉｌｏ）記
載のようなＡ．Ｉ．Ｄ．Ｓまたはある種の遺伝的疾病素
質〔ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ）症候群、Ｘ染色体連
鎖リンパ増殖症（ＸＬＰ）；Ｄ．Ｔ．プルティロ、Ｋ．
サカモト、Ｖ．バルナベイ、Ｊ．シーリー、Ｔ．ベクト
ルグ、Ｇ．ロジャーズ、Ｊ．イエッツ、Ｓ．ハラダ
（Ｄ．Ｔ．Ｐｕｒｔｉｌｏ，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，
Ｖ．Ｂａｒｎａｂｅｉ，Ｊ．Ｓｅｅｌｅｙ，Ｔ．Ｂｅｃ
ｈｔｏｌｇ，Ｇ．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｙｅｔｓ，Ｓ．Ｈ
ａｒａｄａ）、およびＸＬＰ共同研究者：“Ｘ連鎖リン
パ増殖症候群（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｌｙｍｐｈｏ−ｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｙｎｄｒｏｎｅ）（ＸＬ
Ｐ）をもつ少年に於けるエプスタイン−バルウイルス誘
発疾患、最近までの登録研究（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ
ｂｏｙｓ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｌ
ｙｍｐｈｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｙｎｄｒ
ｏｎｅ（ＸＬＰ），Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｓｔｕｄｉｅ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）”，Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．，７３，ｐ４９（１９８２）〕のためにＴ細胞
応答が不十分な場合には、感染したＢ細胞は、宿主の制
御から逃れて、試験管内で培養されるときになすであろ
うように制限無く増殖する機会をもつ可能性がある。こ
の結果は、ＡＩＤＳ患者の場合にはＢＬ様疾患として
〔Ｊ．Ｌ．ジーグラー、Ｒ．Ｃ．マイナー、Ｅ．ローゼ
ンバウム、Ｅ．Ｔ．レンネッテ、Ｅ．シリトエ、Ｃ．カ
サバント、Ｗ．Ｌ．ドリュー、Ｌ．ミンツ、Ｊ．ゲルシ
ョア、Ｊ．グリーンスパン、Ｊ．ベックステッド、Ｋ．
ヤマモト（Ｊ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｍｉｎｅ
ｒ，Ｅ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ，Ｅ．Ｔ．Ｌｅｎｎｅｔｔ
ｅ，Ｅ．Ｓｈｉｌｌｉｔｏｅ，Ｃ．Ｃａｓａｖａｎｔ，
Ｗ．Ｌ．Ｄｒｅｗ，Ｌ．Ｍｉｎｔｚ，Ｊ．Ｇｅｒｓｈｏ
ｒ，Ｊ．Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｊ．Ｂｅｃｋｓｔｅａ
ｄ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ），“同性愛男子に於けるバ
ーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）様リンパ腫の発現（Ｏ
ｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ−ｌｉｋｅ
ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎ ｈｏｍｏｓｅｘｕａｌ ｍ
ｅｎ）”、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２，ｐ．６３１
（１９８２）〕、あるいはＸＬＰ患者〔Ｄ．Ｔ．プロテ
ィロ（Ｄ．Ｔ．Ｐｕｒｔｉｌｏ）ら、上掲〕または腎臓
移植受納者〔Ｄ．Ｗ．ハント、Ｇ．フリッツェラ、Ｄ．
Ｔ．プロティロ、Ｋ．サカモト、Ｊ．Ｌ．サリバン、
Ａ．Ｋ．サエムンドセン、Ｇ．クライン、Ｒ．Ｌ．シモ
ンズ、Ｊ．Ｓ．ナジャリアン（Ｄ．Ｗ．Ｈａｎｔｏ，
Ｇ．Ｆｒｉｚｚｅｒａ，Ｇ．Ｔ．Ｐｕｒｔｉｌｏ，Ｋ．
Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｊ．Ｌ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ａ．
Ｋ．Ｓａｅｍｕｎｄｓｅｎ，Ｇ．Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．Ｌ．
Ｓｉｍｏｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｎａｊａｒｉａｎ）、“腎臓移
植受納者に於けるリンパ増殖性障害の臨床スペクトルお
よびエプスタイン・バル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）
ウイルスの役割の証拠（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｔ
ｒｕｍ ｏｆ ｌｙｍｐｎｏ−ｐｒｏ−ｌｉｆｅｒａｔ
ｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｅ
ｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌ ｏｆ Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）”，Ｃａｎｓｅｒ
Ｒｅｓ．，４１，ｐ．４２５３（１９８１）〕では多
クローン性リンパ増殖性疾患として記載された。 【０００６】伝染性単核症または急性ＥＢＶ感染の確実
かつ迅速な同定は、白血病に対する鑑別診断、あるいは
移植受納者の場合に於ける移植拒絶発症に対する鑑別診
断が必要な場合には特に重要である。これらの場合に、
誤った診断は正しくない治療に導き、重大な、生命を脅
かす結果をもたらす可能性がある。ＥＢＶで起こされる１次疾患の予防 伝染性単核症は、一生の極めて早い時期にＥＢＶによる
感染が起こるフィリッピンやマレーシアのような地域で
は知られていないように思われる〔Ｄ．Ｓ．Ｋ．タン
（Ｄ．Ｓ．Ｋ．Ｔａｎ）、“マラヤに於けるアジア人の
間には伝染性単核症は無い（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ ａ
ｍｏｎｇ Ａｓｉａｎｓ ｉｎ Ｍａｌａｙａ）”，Ｍ
ｅｄ．Ｊ．Ｍａｌａｙａ ２１ ｐ．３５８（１９６
７）〕。ほとんど全人口が遅くとも２〜１０才には抗体
を持っている。臨床的徴候は若年感染または成年感染の
結果であるように患われる。ワクチンで感作された生体
は、顕著な臨床的症状なしに感染され、上に挙げた危険
群に於けるしばしばの致死の結果がワクチンによって除
かれると仮定することができる。 【０００７】バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ
腫とＥＢＶ バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫の発生は、
染色体再配列と関連している。すべての症例がリンパ腫
細胞中にＥＢＶゲノムを含有しているわけではないが、
少なくとも高い出現率をもつ地域では、これらの腫瘍の
９７％がＥＢＶ関連であり、ＥＢＶ感染の抑制がバーキ
ット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫の危険を少なくす
るらしい。ＥＢＶ関連の可能な“２次疾患”としての鼻咽頭癌 ＥＢＶが１００％の関連を示す他の疾患は鼻咽頭癌（Ｎ
ＰＣ）である〔Ｍ．Ｊ．シモンズとＫ．シャンムガラト
ナム（Ｍ．Ｊ．Ｓｉｍｏｎｓ ａｎｄ Ｋ．Ｓｈａｎｍ
ｕｇａｒａｔｎａｍ）編著、“鼻咽頭癌の生物学（Ｔｈ
ｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇａ
ｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）”ＵＩＣＣテクニカルレポー
トシリーズ（ＵＩＣＣ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｏ
ｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ）、インターナショナルユニオンア
ゲインストカンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕ
ｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）、ジュネー
ブ、ｐ．１、（１９８２）〕。ＮＰＣは、ほとんどしば
しば、後鼻腔のローゼンミュレル癌（咽頭癌）から始ま
る。しばしば、患者は、頸部リンパ節に最初の典型的な
転移が生じた後にしか入院させられない。 【０００８】中国南部のある地域で、またシンガポール
やマレーシアの中国人の中では、ＮＰＣは、１年につき
１００，０００人あたり４０人までの出現率をもち、最
も頻度の高い腫瘍である。ボルネオやチュニジア（Ｔｕ
ｎｅｓｉａ）のような世界の他の地域でも出現率が高
い。ほとんどのその他の地域では、出現率は、１年につ
き１００，０００人当り約０．２人であり、耳、鼻、咽
頭（ＥＮＴ）の腫瘍の約４％を示す。ほとんどすべての
高危険地域に於て、年令分布は、約４０〜５０才の明ら
かな単一ピークを示す。しかし、ボルネオに於て、およ
びチュニジア（Ｔｕｎｅｓｉａ）ではある程度、５〜１
５才の若年層に顕著な第２ピークが見られる〔Ｍ．Ｊ．
シモンズ（Ｍ．Ｊ．Ｓｉｍｏｎｓ）ら、上掲〕。伝統的
な中国医療を含む環境因子が、南アジアのある人口、主
として中国人人口中の鼻咽頭癌の危険を増した原因であ
る可能性がある（“免疫欠失と癌：エプスタイン−バル
ウイルスとリンパ増殖性悪性度（Ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ：Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅ
ｓ）”、Ｄ．フルティロ（Ｄ．Ｐｕｒｔｉｌｏ）編集、
プレナムプレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）ｐ．２３３
（１９８４）中のＨウルフ（Ｈ．Ｗｏｌｆ）著“エプス
タイン−バルウイルスの生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）”〕 【０００９】ＥＢＶ関連腫瘍形成の抑制 腫瘍形成の抑制には、３つの可能な基本的戦略がある。 １． 早期発見とそれに続く治療 ２． 理想的には寿命を越えて発病を遅らせること ３． 予防 これらの目的は、多くの腫瘍形成のような多因性疾患に
於ても達成され得る。それ自体では罹病させるのに必ず
しも十分でない本質的な１つ以上の因子を除くことによ
って、あるいは腫瘍症状の発現を促進する因子を減らす
ことによって、疾患出現率を減少させることができる。
本発明の特異的ウイルス関連抗原、あるいは抗体または
遺伝物質を、ウイルス関連腫瘍の早期診断の道具として
使用することにより、本質的な因子の除去を容易にする
ことができる。 【００１０】ＥＢＶ関連ＮＰＣの診断のためのＥＢＶ関
連遺伝子産物の選択 Ａ．ＥＢＶによる１次感染 ：ＶＣＡ（ウイルスカプシド
抗原）、ＥＡ（初期抗原（ｅａｒｌｙ・ａｎｔｉｇｅ
ｎ）〕，ＥＢＮＡ〔エプスタイン−バル核抗原（Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ）〕に対する抗体の発生 ＥＢＶは、急性または１次感染中にＢリンパ球を感染す
る（単核症）。免疫応答が無いため、多数の細胞が溶解
サイクル（ｌｙｔｉｃ ｃｙｃｌｅ）中に入り、完全な
１組のウイルス抗原を産生し、抗原は、細胞溶解中に血
流中へ放出される。これらの抗原に対して、宿主の免疫
系によって特異抗体が合成される（表Ａ）。恐らく、Ｅ
ＢＶの発現を抑制する細胞因子のために、すべてのＢリ
ンパ球が十分に溶解性の感染を支持する能力があるわけ
ではない。これらの細胞は、宿主の一生の残りの期間Ｅ
ＢＶゲノムを潜在的に担持している。 【００１１】Ｂ．回復期：ＥＡに対する抗体の消失なら
びにＶＣＡおよびＥＢＮＡに対する抗体の保持 身体の免疫防禦機構が、溶解的に感染させられた細胞を
循環から取り除くので、抗体レベルは回復期中に低下し
始める。しかし、上述したように、ＥＢＶは耳下腺中で
産生される。ウイルス粒子とＥＡを含む細胞内ウイルス
関連抗原とは唾液中へ放出され、中咽頭に達する。ここ
でウイルス粒子はＢリンパ球に結合し、抗原として身体
へ提示され、かくしてＶＣＡに対する抗体力価が保たれ
る。ＥＡは、リンパ球に結合できないので、プロテアー
ゼによって分解され、従って免疫系に対して抗体産生性
抗原として有効ではない。ＥＢＶによって潜在的に感染
された循環リンパ球はＥＢＮＡを含有する。その生活環
の終わりに、これらの細胞は破壊して、ＥＢＮＡを血液
中へ放出する。従って、この抗原に対する抗体は存続す
る。かくして、耳下腺中に於けるＥＢＶ産生と潜在的感
染Ｂ細胞からのＥＢＮＡの放出とのために、回復患者の
血清は、抗ＶＣＡおよび抗ＥＢＮＡ ＩｇＧ抗体レベル
が低い（上記表Ａ参照）。加えて、溶解サイクル（ｌｙ
ｔｉｃ ｃｙｃｌｅ）に入り得る稀なＢリンパ球から放
出されるＥＡは、低劣な抗原である可能性があり、使用
する試験系で検出できる抗体レベルを生じないかもしれ
ない。抗体群の出現の公知の順序、特に１ｇＭ抗体の初
期の存在およびそれに続くＩｇＧ抗体の存在の順序と組
合わせて、ＥＢＶで惹起される１次疾患の種々の抗原群
を、改良診断法に利用することができる。しかし、主と
して細胞抗原または細胞誘導抗原に基づく使用可能な試
験系には、重大な制限がある。これは、感度、特にＩｇ
Ｍ抗体の検出に対する感度に関し、非特異的反応にも関
する。 【００１２】Ｃ．ＮＰＣに罹患した個体中のＥＢＶ関連
抗体： エプスタイン−バル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイ
ルスが鼻咽頭癌およびアフリカバーキットリンパ腫（Ａ
ｆｒｉｃａｎ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍ
ａ）に原因として関連する可能性があるという第１の示
唆的な証拠が血清学的データから誘導された（総説とし
て、Ｍ．Ａ．エプスタイン、Ｂ．Ｇ．アコング（Ｍ．
Ａ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｇ．Ａｃｈｏｎｇ）、“ザエ
プスタイン−バルウイルス（Ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）”、シュプリンゲルフェルラー
クベルリン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒ
ｌｉｎ）、ハイデルベルク、ニューヨーク（１９７９）
参照〕。ウイルスまたは少なくとも初期ウイルス抗原を
産出する細胞について主として間接的な免疫螢光法を用
いて、患者の血清中に、これらの抗原に対する明らかに
より高い抗体力価が見いだされた。初期抗原（Ｅａｒｌ
ｙ Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＥＡ）と名付けられる１群の蛋
白質とウイルスカプシド抗原と呼ばれる他の群の蛋白質
とに対する非特異免疫グロブリンを検出したこれらの第
１の試験は、ＥＢＶとこれらの疾患との間の関係の確立
に役立った。しかし、これらの試験は、単一の血清から
悪性疾患を明確に診断するためには価値が制限され、か
つ治療の監視に用いることができない。 【００１３】抗原および抗体群特異性試験の導入、特に
２種の抗原族ＥＡとＶＣＡに対する末梢ＩｇＡ抗体の決
定は、また少なくともＥＡ族を細分しようとする最初の
意図〔ＥＡ、ＤまたはＲ：Ｇ．ヘンル、Ｗ．ヘンル、
Ｇ．クライン（Ｇ．Ｈｅｎｌｅ，Ｗ．Ｈｅｎｌｅ ａｎ
ｄ Ｇ．Ｋｌｅｉｎ）、“エプスタイン−バルウイルス
感染細胞の初期抗原複合体（ｅａｒｌｙ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）中の２種の明瞭な成分の立証（Ｄ
ｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｄｉｓｔｉｎｃ
ｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ
ａｎｔｉｇｅｎｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌ
ｌｓ）”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８，ｐ．２７２
（１９７１）〕も、試験の診断および予後の価値を著し
く改良した。ＮＰＣに対する危険度の高い地域では、成
人人口の１％がＥＢＶカプシド抗原（ＶＣＡ）に対する
ＩｇＡ抗体をもっている。この群の３％が、臨床検査で
ＮＰＣを有しており、但し末端症例は例外で、抗ＶＣＡ
ＩｇＡ陰性症例は発見されなかった。３年間の追跡調査
で、ＩｇＡ抗ＶＣＡ陽性症例から、毎年約１％がＮＰＣ
を発生した。この性能の試験は、高度特異的自動読取り
可能ＥＬＩＳＡ試験（ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｕｔｏｍａｔｏ−ｒｅａｄａｂｌｅ ＥＬＩＳＡ
ｔｅｓｔ）として有効ならば、極度に危険な人口のため
の優れた“第１段階”スクリーニングを与えるであろ
う。 【００１４】ＥＢウイルスＩｇＡ／ＶＣＡ抗体の検出
は、ＮＰＣの診断にとって有用であり（１６頁の表参
照）、初期段階の検出のために特に価値がある。例え
ば、ウズホウ市（Ｗｕｚｈｏｗ Ｃｉｔｙ）、（中国、
ＮＰＣの高度危険地域）では、血清学的大規模調査によ
って発見されたＮＰＣの頻度は、Ｉ期（４２％）とＩＩ
期（４８％）の患者の％が、そうでない場合の外来患者
診療所で発見される頻度（Ｉ期１．７％、ＩＩ期３０
％）よりも遥かに高かった。生き残りの機会は、明らか
に治療を始めた時期に関係する。Ｉ期の生存率は（上海
腫瘍病院（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｕｍｏｒ Ｈｏｓｐｉ
ｔａｌ）によれば９３％、ＩＩ期では７５％であり、よ
り進んだ期では非常に低い。従って、早期発見および早
期治療によってＮＰＣの死亡率を減少させることが可能
である。ＥＢＶの早期抗原複合体（ｅａｒｌｙ ａｎｔ
ｉｇｅｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）に対するＩｇＡ抗体は、用
いられる方法によるが、ＮＰＣ患者の４０〜７０％で検
出される。これらの抗体は、腫瘍をもっていない人口に
はほとんど存在していない。腫瘍をもっている個体のか
かる試験は、治療開始の決定に非常に重要であり、腫瘍
患者の１００％近くに於て疾患の発見が可能になるよう
に感度が増強されるならば、その価値はさらに高くなる
であろう。 【００１５】ＩｇＡ／ＶＣＡ抗体陽性個体間のＮＰＣの
検出率は１．９％であり、ＩｇＡ／ＥＡ抗体陽性個体の
検出率は３０〜４０％である。これらのデータは、Ｉｇ
Ａ／ＥＡ抗体試験の方がＮＰＣの検出にはより特異的で
あるが、ＩｇＡ／ＶＣＡ抗体ほど敏感でないことを示し
ている。数多くの研究所がＥＡおよびＶＣＡに対するＩ
ｇＡ抗体の連続的測定を用いて治療の成功を監視してお
りかつ極めて良好な成功さをもって再発の早期発見を行
っている。ｇｐ２５０／３５０の膜蛋白質およびその使用 いわゆる膜抗原複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡ）を構成するウイルスエ
ンベロープの４種の蛋白質は記載されている（Ｌ．Ｆ．
クァルティーレ、Ｇ．Ｒ．ピアソン（Ｌ．Ｆ．Ｑｕａｌ
ｔｉｅｒｅ，Ｇ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、ら、上掲；
Ｊ．ノース、Ａ．Ｊ．モーガン、Ｍ．Ａ．エプスタイン
（Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ａ．Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ）、“ＥＢウイルスエンベロープおよびウ
イルス決定膜抗原（Ｍ．Ａ．）ポリペプチドに関する観
察（Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥＢ
ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎ（ＭＡ）ｐｏｌｙ ｐｅｐｔｉｄｅ），”Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６，ｐ．２３１（１９８０）〕。
これら蛋白質の２種、すなわちｇｐ２５０とｇｐ３５０
とは、抗原的に密接に関連している〔Ｄ．Ａ．ソーリー
・ローソンとＫ．ゲイリンガー（Ｄ．Ａ．Ｔｈｏｒｌｅ
ｙ−Ｌａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｋ．Ｇｅｉｌｉｎｇｅ
ｒ）、“エプスタイン−バルウイルスの主要糖蛋白質
（ｇｐ２５０／３５０）に対する単クローン性抗体は感
染性を中和する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅｍａｊｏｒ ｇｌｙ
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｇｐ２５０／３５０）ｏｆ Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｎｅｗｔｒａｌｉ
ｚｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７７，ｐ５３０７
（１９８０）〕。１つの成分の分子量は、ウイルスが誘
導される細胞系によるが、２００，０００〜２５０，０
００Ｄの範囲であり、第２の抗原的に関連する糖蛋白質
は、３００，０００〜３５０，０００Ｄの分子量を有す
るが、ある細胞系では存在しない。 【００１６】これらの糖蛋白質は、すべて、抗原性、蛋
白質、コードするＤＮＡ配列が関連しているので、それ
らは、通常、ｇｐ２２０／３５０またはｇｐ２５０／３
５０あるいは単にｇｐ２５０またはｇｐ３５０と呼ばれ
るが、関連糖蛋白質の全群を意味する。糖蛋白質２５０
／３５０は、ヒトおよびある種の霊長類のＢ−リンパ球
のＥＢＶリセプターに結合することができ、かくしてこ
れらの細胞の感染を開始することができる（Ａ．ウエル
ズ、Ｎ．コイデ、Ｇ．クライン（Ａ．Ｗｅｌｌｓ，Ｎ．
Ｋｏｉｄｅ，Ｇ．Ｋｌｅｉｎ），“２種の大ウイルスエ
ンベロープ糖蛋白質はレセプター陽性細胞に結合するエ
プスタイン・バルウイルスを媒介する（Ｔｗｏｌａｒｇ
ｅ ｖｉｒｏｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ ｖｉｒｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）”、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４１．ｐ２８６（１９８２）〕。これらの蛋白質に
対する抗体はウイルスの感染性を中和する。このこと
は、ヒトならびにウサギ抗血清およびマウス単クローン
性抗体で示された（Ｄ．Ａ．ソーリー−ローソン（Ｄ．
Ａ，Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌｏｗｓｏｎ）ら、上掲〕。単ク
ローン性抗体の使用により、ｇｐ３５０およびｇｐ２５
０の両方に存在する唯一の抗原決定基の封鎖は、ウイル
ス中和のために十分であることを示した。固定化された
ｇｐ３５０およびｇｐ２５０へのヒト血清の吸着は中和
用抗体を除去した（Ｄ．Ａ．ソーリー−ローソン（Ｄ．
Ａ．Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌｏｗｓｏｎ）ら、上掲〕。かく
して、 ａ）ｇｐ３５０およびｇｐ２５０は中和用抗体の産生を
誘発し、かつ ｂ）ｇｐ３５０およびｇｐ２５０に対する抗体は中和能
を有するという有力な証拠がある。 【００１７】従って、この蛋白質ならびにその関連ウイ
ルス遺伝子産物ｇｐ３５０（３５０，０００の分子量を
有する）は、可能なＥＢＶワクチンの候補である〔Ａ．
Ｊ．モーガン、Ｍ．Ａ．エプスタイン、Ｊ．Ｒ．ノース
（Ａ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ａ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，
Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｔｈ）、“マウス、ウサギ、コットン・
トップタマリン（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ ｔａｍａｒｉ
ｎｓ）に於ける新規アジェバントを伴うエプスタイン−
バルウイルス膜抗原（ＭＡ）ｇｐ３４０に関する比較免
疫原性の研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｉｃｉｔｙｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔ
ｉｇｅｎ（ＭＡ）ｇｐ３４０ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ
ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎｍｉｃｅ，ｒａｂｂｉｔｓ
ａｎｄ ｃｏｔｔｏｔｏｎ−ｔｏｐ ｔａｍａｒｉｎ
ｓ）”、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１３，ｐ．２８１
（１９８４）〕。これらの糖蛋白質は、誘導されたＥＢ
Ｖ産生性細胞系で示されるか細胞表面蛋白質の放射性ヨ
ウ素化後に容易に示すことができる〔Ｌ．Ｆ．クアルテ
ィーレ、Ｇ．Ｒ．ピアソン（Ｌ．Ｆ．Ｑｕａｌｔｉｅｒ
ｅ，Ｇ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、“エプスタイン−バル
ウイルス誘発膜抗原：ＥＢＶ重感染ラジ細胞からのトラ
イトンＸ−１００可溶化ウイルス膜抗原の免疫化学的キ
ャラクタリゼーション（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖ
ｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉ
ｇｅｎｓ：ｉｍｍｕｎｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄｖｉｒａｌ ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ＥＢＶ ｓｕ
ｐｅｒｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｒａｊｉ ｃｅｌｌｓ）”、
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２３，ｐ．８０８（１９７
９）〕。 【００１８】ＥＢＶ関連疾患の診断のためのｇｐ２５０
／３５０の応用 ＩｇＧ抗体は、１次ＥＢＶ感染の急性期中には存在しな
いが、回復期後の一生の間存在する。ＩｇＧ抗体は、こ
の疾患の早期に存在するが、回復期中には存在しない。
ＥＢＶ抗原に対するＩｇＡ抗体は、ほとんどもっぱらＮ
ＰＣ患者に存在し、あまり感度の高くない試験でもこれ
らの患者の少なくとも５８％の血清中に検出される（ゼ
ングイとハンスウルフ（Ｚｅｎｇ Ｙｉ ａｎｄ Ｈａ
ｎｓ Ｗｏｌｆ），作製中の原稿および下記実施例１
６〕。【００１９】全ｇｐ２５０分子量またはそのバックボー
ンポリペプチド鎖の部分は、受身血球凝集反応、交差ゲ
ル電気泳動法、ラジオイムノアッセイ法あるいは酵素免
疫測定法のような優先的クラス特異性抗体検出試験の試
薬として利用することができる。高度に特異的な試験抗
原は、より良い信号を与えかつそうでなければわからな
い臨床的に重要な低い抗体レベルを検出する。ある場合
には、全遺伝子産物ではなくてｇｐ２５０の特異な抗原
部位を用いることによって、疾患のより正確な診断が可
能になる。ＥＢＶ関連疾患の予防および治療のためのｇｐ２５０／
３５０の応用 Ａ．生涯の早期に於けるＥＢＶによる感染は無症状の血
清変換を起こすだけであるので、母性抗体またはワクチ
ンによって誘発された抗体の存在は、１次ＥＢＶ感染の
臨床的発現に影響するであろうことが予想される。好ま
しくはＥＢＶ感染を受ける危険のピークの前の、子供ま
たは若年成人の予防接種は、人口中の伝染性単核症の臨
床的発現を有効に減少させることが期待される。 【００２０】Ｂ．ＮＰＣまたはＢＬの高出現率をもつす
べての地域に於て、人口は、一生の最初の１〜２年以内
にＥＢＶへのほとんど１００％の血清変換を示す。予防
接種は、誕生後間もなく行われねばならないであろう。
この予防接種を規則正しく繰り返せば、多分、ＥＢＶ感
染を予防し、あるいはそれを遅らせ、あるいは初期１次
感染の生物学的影響を減少させるであろう。これらの結
果のおのおのは、その後の腫瘍の発生を予防し、あるい
はその開始を相当に遅らせ、あるいはその相対的危険を
減少させることが期待される。 Ｃ．ＮＰＣに於て、腫瘍部位に於けるウイルス抗原の時
々の産生は、主としてＩｇＡ分泌性Ｂリンパ球を刺激す
るであろう。ＩｇＡ抗体は、抗体媒介細胞傷害を阻害す
る能力がある。ｇｐ２５０のようなウイルス膜抗原に対
するＩｇＡ抗体は、ＮＰＣおよびＢＬ患者中に存在し、
疾患の指示剤であるだけでなく、そのマスキングポテン
シャルによって免疫系の不全に貢献して腫瘍細胞を除去
することすらあり得る。腫瘍患者に投与された多量の精
製抗原は、ＩｇＡと結合し、同抗原に対する過剰のＩｇ
Ｇ抗体の産生を開始する可能性がある。これらの特異的
ＩｇＧ抗体は、次に残留ＩｇＡ抗体と競争して、抗体依
存性機構による腫瘍細胞の除去を可能にする。 【００２１】Ｄ．ｇｐ２５０または関連産物の適当な投
与は、細胞免疫機構をも増強し、かくして腫瘍の増殖を
制限することができる。本発明のＥＢＶ特異抗原の生産 １． すべての発見の結果として、本発明の目的は、抗
体クラスおよび抗原特異性抗体の検出のための試験の感
度を改良することおよび大量試験と、より良い標準化と
を可能にする方式とを開発することである。 ２． ＥＢＶは、有効に感染できる細胞が現在知られて
おらずかつＥＢＶまたは関連抗原の調製のための源とし
て用いられるすべての細胞が固定細胞かまたは腫瘍誘導
細胞でさえあるので、溶解細胞サイクル中で有効に産生
され得ない。ほとんどの細胞系に於てレトロウイルスが
示されている。従って、かかる培養から単離される産物
は、非常に高価であるばかりでなく、その使用も潜在的
に危険である。 【００２２】３． 組換えＤＮＡ技術の適用は、組換え
ＤＮＡ分子により形質転換されかつ適当な培養系で増殖
された適当な宿主細胞による有用なポリペプチドの生産
を可能にした。 ４． 本発明によれば、細菌〔例えばエシエリヒア（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属〕、酵母
〔例えばカンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、またはサッカ
ロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属〕、哺乳類
細胞〔例えば、ベロ（Ｖｅｒｏ）−細胞、ＣＨＯ−細胞
またはリンパ芽球皮疹細胞系〕のような適当な宿主に於
けるＥＢＶ蛋白質ｐ１３８、ｐ１５０、ｇｐ２５０／３
５０をコードする遺伝子または遺伝子の少なくとも部分
の遺伝情報を発現させるために組換えＤＮＡ法を用い
る。 ５． さらに、ＥＢＶ蛋白質ｐ１５０、ｐ１４３、ｐ１
３８、ｐ１１０、ｐ１０５、ｐ９０、ｐ８０、ｐ５４を
コードするゲノム領域を同定し、かつその診断目的のた
めの関連を確認した。従って、蛋白質ｐ１３８、ｐ１５
０、ｇｐ２５０／３５０のために示した方法によるこれ
らの蛋白質またはその抗原決定基の生産のための主要情
報をも本発明では記載する。 【００２３】組換えＤＮＡ技術 Ａ．発現制御系 原核生物は、最もしばしば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の
種々の株によって代表される。しかし、細菌、例えばバ
チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、種々のプセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）種または他の細菌株のような他の微生物株も用いら
れる。かかる原核生物系では、宿主と相容性の種から誘
導される複製部位および制御配列を含むプラスミドベク
ターが用いられる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
は、典型的には、ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、ジー
ン（Ｇｅｎｅ）２、ｐ．９５（１９７７）によって大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種から誘導されるプラスミドｐＢＲ
３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２
は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための
遺伝子を含み、これらのマーカーは、所望のベクターの
構築に於て保持される場合も破壊される場合もあり得
る。本明細書で、随意にオペレーターと共に、リボソー
ム結合部位配列と共に、形質転換開始のためのプロモー
ターを含むと定義される、通常用いられる原核生物制御
配列は、かかる通常用いられるプロモーターを、ベータ
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖（ｌａｃ）
プロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）らネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８、ｐ１０５６（１９７７）〕
としておよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系
（ゴエデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，ｐ．４０５７（１９８０）〕と
して含む。携帯用制御カセットとして有用となったラム
ダ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結
合部位〔シマタケ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ）ら、ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）２９２、ｐ．１２８（１９８１）〕
も例である。しかし、原核生物と相容性のどんな入手可
能なプロモーターも使用することができる。 【００２４】細菌に加えて、酵母のような真核微生物も
宿主として使用することができる。サッカロミセス・セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）の実験室株、パン酵母が最も多く用いられ
るが、多数の他の株が市販されている。２μの複製起源
を用いるベクターが示されている（Ｊ．Ｒ．ブローチ
（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０
１，ｐ．３０７（１９８３）〕が、酵母の発現のために
適した他のプラスミドが知られている〔例えばスティン
チコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、２８２、ｐ．３９（１９７９）；チェンペ
（Ｔｓｃｈｅｍｐｅ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）１０、
ｐ．１５７（１９８０）；Ｌ．クラーケ（Ｌ．Ｃｌａｒ
ｋｅ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１，ｐ．３００（１
９８３）参照〕。酵母ベクター用の制御配列には、解糖
酵素の合成のためのプロモーターが含まれる〔ヘス（Ｈ
ｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７，
ｐ．１４９（１９６８）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）
ら、バイオケミストリー 【００２５】（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７，ｐ．
４９００（１９７８）〕。技術上既知のその他のプロモ
ーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのための
プロモーター（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，ｐ．２０７３（１９
８０）〕、およびグリセリンアルド−３−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコース−６−燐酸
イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、三炭糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、グルコキナーゼのような他の解糖
酵素のためのプロモーターが含まれる。増殖条件によっ
て制御される転写の付加的利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解（ｄ
ｅｇｒａｄａｔｉｖｅ）酵素、マルトースおよびガラク
トース利用の原因となる酵素（ホランド（Ｈｏｌｌａｎ
ｄ），上掲〕のためのプロモーター領域である。 【００２６】種々の証拠は、コード配列の３′末端に於
てターミネーター配列が望ましいことを示唆している。
かかるターミネーターは、酵母誘導遺伝子中のコード配
列に続く３′未翻訳領域内に見いだされる。示される多
くのベクターは、プラスミドｐｅｎｏ４６（Ｍ．Ｊ．ホ
ランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）２５６、ｐ．１３８５（１９８１）〕を含むエノ
ラーゼＩ遺伝子またはＹＥｐ１３（Ｊ．ブローチ（Ｊ．
Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８、ｐ．１２１
（１９７９）〕から得られるＬＥＵ２遺伝子から誘導さ
れる制御配列を含むが、酵母と相容性のプロモーター、
複製源および他の制御配列を含む任意のベクターが適当
である。 【００２７】勿論、多細胞生物から誘導される真核生物
宿主細胞培養中でポリペプチドをコードする遺伝子を発
現することも可能である。例えば、グルーズとパターソ
ン（Ｇｒｕｚ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編著“組
織培養（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）”、アカデミ
ックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９７
３）を参照されたい。有用な宿主細胞系には、ベロ（Ｖ
ＥＲＯ）およびへら（ＨｅＬａ）細胞、ならびにチャイ
ニーズハムスターオバリー（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔ
ｅｒ ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞が含まれる。かかる
細胞のための発現ベクターは、通常、例えばシミアン
（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）〔フィアー
ズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７
３、ｐ．１１３（１９７８）〕からの通常用いられる初
期および後期プロモーター、あるいはポリオーマアデノ
ウイルス、牛乳頭腫ウイルスまたはニワトリ肉腫ウイル
スから誘導されるプロモーターのような他のウイルスプ
ロモーターのような、哺乳類細胞と相容性のプロモータ
ーおよび制御配列を含む。 【００２８】哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な面
は、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９
９，２１６号中で、アクセル（Ａｘｅｌ）が記載してい
る。今や、最適発現には“エンハンサー（ｅｎｈａｎｃ
ｅｒ）”領域が重要であるようにも思われる。これらの
領域は、一般に、プロモーター領域の上流にしばしば見
られる配列である。複製源は、必要ならばウイルス源か
ら得ることができる。しかし、染色体中への遺伝子組込
みは、真核生物に於けるＤＮＡ複製の通常の機構であ
り、それ故、独立に複製するベクターは所要でない。植
物細胞も、現在、宿主として有効であり、ノパリンシン
ターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナル配列（Ａ．デピッ
カー（Ａ．Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎ．１，ｐ．５６１（１９８１）〕のような、
植物細胞と相容性の制御配列も有効である。 【００２９】Ｂ．適当な宿主の形質転換 使用される宿主細胞によって、かかる細胞にとって適当
な標準的方法を用いて形質転換を行う。Ｓ．Ｎ．コーエ
ン（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）６９，ｐ．２１１０（１９７
２）によって記載されたような、塩化カルシウムを用い
るカルシウム処理は、原核生物または実質的な細胞壁バ
リヤーを含む他の細胞に用いられる。ある種の植物細胞
に対しては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）による感染（Ｃ．Ｈ．シャウ（Ｃ．Ｈ．Ｓｈｏｗ）
ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２３、ｐ．３１５（１９８
３）〕が用いられる。かかる細胞壁のない哺乳類細胞に
対しては、グラハムとファンデルエブ（Ｇｒａｈａｍ
ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）の燐酸カルシウム沈殿
法〔バイオロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，ｐ．５４
６（１９７８）〕が好ましい。酵母中に於ける形質転換
は、Ｐ．バンゾリンゲン（Ｐ．Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅ
ｎ）ら、［Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０，ｐ．９４６（１９７
７）とＣ．Ｌ．フシャオ（Ｃ．Ｌ．Ｈｓｉａｏ）ら（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７
６，ｐ．３８２９（１９７９）〕の方法に従って行われ
る。別法では、クレベ（Ｋｌｅｂｅ）らの方法〔ジーン
（Ｇｅｎｅ）２５，ｐ．３３３（１９８３）〕を用いる
ことができる。 【００３０】Ｃ．組換えクローニングおよび発現ベクタ
ーの構築 所望のコード（ｃｏｄｉｎｇ）および制御配列を含む適
当なベクターの構築は、技術上よく理解されている標準
連結および制限方法を用いる。単離したプラスミド、Ｄ
ＮＡ配列または合成されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを開裂し、テーラーし（ｔａｉｌｏｒｅｄ）かつ所
望の形に再連結する。部位特異性ＤＮＡ開裂は、技術上
一般に理解されている条件下で適当な１種または２種以
上の制限酵素による処理によって行われ、その特別なも
のは、これら市販の制限酵素のメーカーによって明示さ
れている。例えば、ニューイングランドバイオラブズ、
プロダクト カタログ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｇｌｏｇ）を参
照されたい。 【００３１】所望ならば、標準方法を用い、ポリアクリ
ルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって、
開裂断片のサイズ分離を行うことができる。サイズ分離
の一般的な記載は、“酵素学に於ける方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”６５、ｐ．４９９
−５６０（１９８０）に見られる。制限開裂断片は、４
種のデオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ）の存在
下に於て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）〕の大断片による処理に
よって平滑末端にすることができる。クレナウ（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）断片は５′付着末端に於て満たすが、突き出し
ている３′一本鎖を、仮令４種のｄＮＴＰｓが存在して
もチューバック（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）する。所望なら
ば、付着末端の性質によって指令される制限内で、選ば
れた１種または２種以上のｄＮＴＰｓだけを供給するこ
とによって、選択的に修復を行うことができる。適当な
条件下に於けるＳ１ヌクレアーゼによる処理は、一本鎖
蛋白質の加水分解をもたらす。 【００３２】合成オリゴヌクレオチドは、マッテウム
（Ｍａｔｌｅｕｃｃｉ）らのトリエステル法（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，ｐ．３１８５（１９８
１）〕または１９８３年１１月１５日発行の米国特許第
４，４１５，７３２号記載のカルーザーズ（Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ）のジエチルホスルアミダイト（ｄｉｅｔｈｙ
ｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によって製造す
ることができる。連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用い、標準の条件および温度の下で行わ
れる。“ベクター断片”を用いるベクター構築に於て
は、５′燐酸を除去しかつベクターの再連結を防ぐため
に、通常、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）でベ
クター断片を処理する。ＢＡＰの消化は、標準条件下
（下記説明のように）で行われる。 Ｄ．形質転換体の選択 構築に於て、プラスミド構築のための正しい連結は、大
腸菌（Ｅ・ｃｏｌｉ）または他の適当な宿主を連結混合
物で形質転換させることによって確認される。上首尾の
形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンまたは
他の抗生物質耐性によって、あるいは技術上知られてい
るような、プラスミド構築方式に依存する他のマーカー
を用いて選ばれる。 【００３３】発明の簡単な要約 本発明は、組換えＤＮＡ技術によるＥＢＶ特異的抗原の
製造ならびにＥＢＶ関連疾患の診断、予防、治療に於け
るその使用に関する。従って、本発明の目的は、鼻咽頭
癌（ＮＰＣ）、伝染性単核症、バーキット（Ｂｕｒｋｉ
ｔｔ’ｓ）リンパ腫（図１および図４０〜図６１の凡例
参照）のようなエプスタイン−バルウイルス関連疾患と
免疫学的方法によって相関されるｐ１５０、ｐ１４３、
ｐ１３８、ｐ１１０、ｐ１０５、ｐ９０、ｐ８０、ｐ５
４（Ｇ．Ｊ．ベイリス、Ｈ．ウルフ（Ｇ．Ｊ．Ｂａｙｌ
ｉｓｓ，Ｈ．Ｗｏｌｆ）、下掲）のような新規エプスタ
イン・バルウイルス抗原を同定することである。本発明
のもう１つの目的は、例えばＥＢＶが診断上重要でかつ
医療目的のために適切な該抗原をコードするＢ９５−８
細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡ（Ａ
ＴＣＣ）ＣＲＬ１６１２）〔Ｊ．スケア、Ｊ．Ｌ．スト
ロミンガー（Ｊ．Ｓｋａｒｅ，Ｊ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎ
ｇｅｒ）、“エプスタイン−バルウイルスの形質転換性
Ｂ９５−８株からのＤＮＡのＢａｍＨＩエンドヌクレア
ーゼ断片のクローニングおよびマッピング（Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＢａｍＨＩ ｅ
ｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ
ｔｈｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｓｆｏｒｍ
ｉｎｇ Ｂ９５−８ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅ
ｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７７，ｐ３８６０（１
９８０）〕からクローニングされているように、ＥＢＶ
のゲノム領域の位直決定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）
および同定である。 【００３４】本発明のもう１つの目的は、ｐ１３８およ
びｐ１５０のような医療用に有用な抗原の少なくとも一
部分をコードするＢ９５−８細胞からクローニングされ
る、ＥＢＶ、例えば現存のＥＢＶライブラリーからのＥ
ＢＶのゲノム領域のサブクローニングである。このこと
は、ＥＢＶ Ｂ９５−８サブクローンｐＢＲ３２２Ｂａ
ｍＡ［Ｊ．スケア（Ｊ．Ｓｋａｒｅ）ら、上掲］から誘
導されるサプゲノム断片、例えＸｈｏＩ断片をプラスミ
ドｐＵＣ８（Ｊ．メッシング（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ）下
掲〕（ｐＵＣ６３５、図８参照）に接合させることによ
って達成される。 【００３５】本発明のもう１つの目的は、細菌（例えば
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネ
ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属の細菌〕、酵母〔例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ）属またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属の酵母〕、動物細胞およびヒト細胞〔例えば
ベロ（Ｖｅｒｏ）−細胞；ＣＨＯ−細胞；適当な選択系
と随意に官能性ｇｈｆｒ遺伝子担持プラスミドならびに
調節配列の制御下のＥＢＶ遺伝子の遺伝情報と組合わせ
たＣＨＯｄｈｆｒ細胞；あるいはリンパ芽球皮疹細胞
系〕のような適当な宿主細胞中に於けるそれぞれの遺伝
情報の発現による蛋白質の製造である。これらの宿主細
胞によって生産される蛋白質は、例えばｐ１３８、ｐ１
５０またはｇｐ２５０／３５０関連抗原決定基を含み、
発現方式によって、融合蛋白質として、あるいは非融合
蛋白質として合成される。 【００３６】細菌による融合蛋白質の生産のために、ゲ
ノムサブ断片例えばＥＢＶ Ｂ９５−８のｐ１３８の一
部分をコードしかつ既知のプラスミドｐＵＣ８中へ導入
されるゲノムサブ断片の発現を、例えばイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって
誘発させた。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で固
定された。もう１つの融合蛋白質は、サブクローンｐＵ
Ｃ６３５をＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩによって開裂し
かつこの断片をベクタープラスミドｐＵＣ９（Ｕ．リュ
ーター（Ｕ．Ｒｔｈｅｒ）、下掲〕中へ導入すること
によって得られる。得られた組換えプラスミドはｐＵＣ
９２４（図１０）である。発現産物は約９６ｋｄのサイ
ズであった。 【００３７】もう１つの融合蛋白質は、ｐＢＲ３２２Ｂ
ａｍＡの該Ｘｈｏｌ−ｐ１３８コードフラグメントの遺
伝情報をプラスミドｐＥＡ３０５〔Ｅ．アマン、Ｊ．ブ
ロシウス、Ｐ．プタシュネ（Ｅ．Ａｍａｎｎ，Ｊ．Ｂｒ
ｏｓｉｕｓ，Ｍ．Ｐａｓｈｎｅ），大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）中に於けるクローン化遺伝子の調節された発現のた
めに有用なハイ−ブリッドｔｒｐ−ｌａｃ−プロモータ
ー担持ベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｅａｒｉｎｇ ａ
ｈｙｂｒｉｄ ｔｒｐ−ｌａｃ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ
Ｅ．ｃｏｌｉ）”、ジーン（Ｇｅｎｅ）２５、ｐ．１６
７（１９８３）〕中に於て発現させることによって産生
される。ＰＥＡ３０５に関する適正な読取り枠中へｐ１
３８関連情報を入れた後、クローンｐＭＦ９２４がλ−
リプレッサー蛋白質Ｃ１（図１１）の一部分を含む融合
蛋白質を合成する。さらにもう１つの融合蛋白質は、ｐ
１３８関連遺伝情報３′を含む３．０ｋｂゲノムＸｈｏ
ｌ断片をｔｒｐ−ｌａｃプロモーターへクローニングす
る（上掲のＦ．アマン（Ｆ．Ａｍａｎｎ）ら記載のよう
に〕ことによって得られる。この目的には、既知のプラ
スミドｐＫＫ２４０−１１を用いた。得られたｐＫＫ３
７８は、ｐ１３８関連ＤＮＡ配列がその後に続くアミノ
末端メチオニン残基からなる融合蛋白質を合成する（図
１２）。 【００３８】本発明のさらにもう１つの目的は、ｐ１３
８のようなウイルス蛋白質の抗原決定基蛋白質サブ領域
のみを含有する融合蛋白質または非融合蛋白質またはオ
リゴペプチドを提供することである。この目的のため、
ディジタルエキップメントＶＡＸ１１／７５０（Ｄｉｇ
ｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ＶＡＸ １１／７５
０）コンピューターのために本発明者らが開発したコン
ピュータープログラムを用い、コンピユーター指示分析
によって、蛋白質の決定基の位置を決定する。他の問題
およびＧ．Ｈ．コーエン、Ｂ．ディーツショルド、Ｍ．
ポンフドレオン、Ｄ．ロング、Ｅ．ゴルブ、Ａ．バリチ
オ、Ｌ．ペレイラ、Ｒ．Ｊ．アイゼンベルグ（Ｇ．Ｈ．
Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ，Ｍ．Ｐｏｎ
ｃｅ ｄｅＬｅｏｎ，Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｅ．Ｇｏｌｕｂ，
Ａ．Ｖａｒｒｉｃｈｉｏ，Ｌ．Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．
Ｊ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、中和用抗原の生産を刺激す
るヘルペスシンプレックスウイルス糖蛋白質Ｄの抗原決
定基の位置決定および合成（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｎ ａｎｔｉ
ｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｉｍｉｎａｎｔ ｏｆ Ｈｅｒ
ｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｄ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔ
ｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗｔｒａｌｉ
ｚｉｎｇ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）”、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４
９ｐ．１０２（１９８４）によるもう１つのコンピュー
ターのために同様なプログラムを用いた。それぞれの断
片をｐＵＣ８またはｐＵＲ２８８（Ｕ．リューター
（Ｕ．Ｒｔｈｅｒ）ら、下掲）のようなベクター中へ
クローニングすることにより、ｐＵＲ６００およびｐＵ
Ｒ５４０のようなプラスミドが得られた。産生された大
および小融合蛋白質は、ゲル電気泳動およびイムノブロ
ッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験で研
究される。ｐｕＲ２８８におけるクローニング実験が、
小ｐ１３８関連ポリぺプチドを安定化させるために行わ
れた。 【００３９】本発明のもう１つの目的は、数種の異なる
ＥＢＶ血清型の抗原決定基を含む多抗原（ｐｏｌｙａｎ
ｔｉｇｅｎｓ）の発現である。この目的のため、対応す
るＤＮＡ断片を連鎖し、適当なベクター中へ導入する。
発現産物は融合および非融合ＥＢＶ−特異的多抗原であ
る。ｐ１５０関連抗原決定基を含む別の融合蛋白質が、
ｐＵＲプラスミドおよびｐＵＣプラスミド中の対応する
ＤＮＡ配列のクローニングおよび発現によって得られ
た。得られた構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）は、組換
えプラスミドｐＵＲ２９０ＣＸＨ５８０，ｐＵＲ２９０
ＤＢＸ３２０，ｐＵＲ２９２ＤＢＢ１８０，ｐＵＲ２９
０ＤＴＴ７００， ｐＵＲＤＴＴ７４０， ｐＵＲ２９
０ＤＴＰ６８０，ｐＵＲ２８８ＤＰＰ３２０であった。
本発明のもう１つの目的は、ウイルス蛋白質ｐ１３８の
コード（ｃｏｄｉｎｇ）領域の一部分を含むｐＵＣ６０
０およびｐＵＣ６０１のような新規の発現ベクトルの構
築である。ＤＮＡ配列を、この配列に対して３′で、ベ
クター中へ導入すると、発現蛋白質は、ｐ１３３特異的
アミノ酸配列によって安定化されかつプロテアーゼ分解
に対して保護される。 【００４０】本発明のさらにもう１つの目的は、３〜１
４個のアルギニン残基のためのＤＮＡコードと誘発現ベ
クターのクローニング部位の少なくとも１個の停止コド
ンを導入しかつさらに適当な読取り枠内に置くことによ
る該発現ベクターの修飾である。得られたベクターはｐ
ＵＣＡＲＧ６０１である。もし蛋白質物質のためのＤＮ
Ａ配列コードをこの発現べクター中へ挿入すると、発現
産物は、プラスミドｐＵＣＡＲＧ１１４０（図１６
（ａ）参照）およびｐＵＣＡＲＧ６８０によってコード
された融合蛋白質のようなカルボキシ末端に該アルギニ
ン残基を担持する融合蛋白質である。かくして、本発明
の１つの目的は、Ｈ．Ｍ．サッセンフェルド、Ｓ．Ｊ．
ブリューワー（Ｈ．Ｍ．Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，Ｓ．
Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ）〔“組換え蛋白質の精製のために設
計されたポリペプチド融合（Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ
ｅ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｔ ｐｒｏｔｅｉｕｓ）”、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２，ｐ．７６（１９８４）〕に従って宿主細胞
溶解産物からＥＢＶｐ１３８または関連するポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドのような診断、予防、治療に有
用な蛋白質を単離するための簡単な方法を提供すること
である。 【００４１】該アルギニン残基の導入により、発現され
た蛋白質の正味の電荷はより正となり、宿主細胞の溶解
後、オリゴ−アルギニン連鎖蛋白質は、ＰＳセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−２５カラムクロマトグラ
フィーによって単離される。オリゴアルギニン基のた
め、このＥＢＶ特異的蛋白質は、高ＮａＣｌ濃度に於て
溶出される。この溶出液を、次に、カルボキシ末端リジ
ンおよびアルギニン残基を分解するカルボキシペプチダ
ーゼＢで処理する。最後にもう１つのＳＰセファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−２５カラムクロマトグラフ
ィーを行い、ＥＢＶ関連蛋白質を低食塩濃度で溶出する
（図２０参照）。しかし、この方法が媒質中へ分泌され
る蛋白質の精製にも使用できることは明らかである。イ
オン交換カラムまたは発現された蛋白質に対する特異抗
体で負荷されたカラム上でのモレキュラーシーブ処理ま
たは親和性クロマトグラフィーのような他の確立された
蛋白質精製法が付加的なまたは別個の精製法として使用
できるものも明らかである。本質的に天然産蛋白質また
はその部分のアミノ酸配列を含む非融合蛋白質の生産の
ためには、本発明の組換えプラスミドを修飾することが
できる。発現ベクターの細菌蛋白質をコードする領域と
ＥＢＶ関連蛋白質をコードする領域との間にオリゴヌク
レオチドリンカーを挿入する場合、オリゴヌクレオチド
に対応するアミノ酸配列が発現された融合蛋白質の一部
分となる。この融合蛋白質は、それを発現する形質転換
体から単離した後、導入されたアミノ酸リンカー中のア
ミノ酸配列特異的プロテアーゼにより、あるいはアミノ
酸リンカーが酸開裂に対して敏感なペプチド結合を含む
場合には、酸例えば蟻酸による処理によって開裂され
る。 【００４２】本発明のもう１つの目的は、特異的ウイル
ス抗原ｇｐ２５０およびｇｐ３５０の少なくとも一部分
をコードするＥＢＶのゲノム領域のクローニングであ
る。これは、ｐＢＲ３２２ＢａｍＬ〔Ｊ．スケア（Ｊ．
Ｓｋａｒｅ）ら、上掲〕中に含まれる細胞株Ｂ９５−８
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１２）（Ｒ．バエル（Ｒ．Ｂ
ａｅｒ）ら、下掲〕からのＥＢＶゲノムをプラスミドｐ
ＵＣ８〔Ｊ．メッシング（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、下
掲〕へ接合することによって達成される。得られた組換
えプラスミドをｐＵＣＬＰ１．９（図２６参照）と称
す。細菌による融合蛋白質の生産のために、ＥＢＶＢ９
５−８のｇｐ２５０およびｇｐ３５０の一部分をコード
するゲノムサブ断片を、酵素β−ガラクトシダーゼをコ
ードするｌａｃＺ遺伝子の領域を担持するベクターｐｕ
Ｒ２９０（Ｕ．リュター（Ｕ．Ｒｔｈｅｒ）ら、下
掲〕中へクローニングした（ｐＵＲＬＰ１．９、図２７
参照）。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で精製さ
れかつ同定された。 【００４３】本発明のさらにもう１つの目的は、ｇｐ２
５０およびｇｐ３５０の抗原決定基蛋白質サブ領域のみ
を含有する融合蛋白質または非融合蛋白質を提供するこ
とである。この目的のため、蛋白質の抗原決定基を、デ
ィジタルエキップメントＶＡＸ １１／７５０（Ｄｉｇ
ｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ＶＡＸ １１／７５
０）コンピューター用に本発明者らが開発したコンピュ
ータープログラムを用いるコンピューター指示分析によ
って位置決定した。それぞれのＤＮＡ断片を、次に、ｐ
ＵＲ（ｐ−ガラクトシダーゼ）のような通常の発現ベク
ター中にクローニングする（Ｕ．リュター（Ｕ．Ｒｕｔ
ｈｅｒ）ら、下掲〕。得られたプラスミドは、例えばｐ
ＵＲＬＥＰ６００およびｐＵＲＬＸ Ｐ３９０である（図
３９参照）。さらに、ｇｐ２５０／３５０のＮ末端抗原
決定基を、ｐＵＣベクター（ｐＵＲＬＥＰ６００、図３
９参照）中に融合蛋白質として発現させた。ｇｐ２５０
およびｇｐ３５０Ｎ末端抗原決定基をコードするＤＮＡ
断片を上記発現ベクターｐＵＣＡＲＧ６０１中へクロー
ニングすることによって、もう１つの融合蛋白質が提供
される。 【００４４】本発明のもう１つの目的は、該コンピュー
ター分析で位置決定されたｇｐ２５０およびｇｐ３５０
の数個の抗原決定基を含む多抗原の発現である。この目
的のため、対応するＤＮＡ断片を連鎖させかつ適当なベ
クター中に導入する。発現産物は、融合または非融合Ｅ
ＢＶ特異性多抗原である。本発明の最終の目的は、臨床
診断または科学的研究に有用な診断用組成物（キット）
の製造のための、該ＥＢＶ関連蛋白質またはそのサブ領
域または適当ならばＥＢＶ関連ＤＮＡ断片またはクロー
ンの利用である。これらの試験は、ＥＬＩＳＡ〔酵素免
疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）〕またはＲＩＡ〔ラジオ
イムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａ
ｙ）〕または間接的赤血球凝集試験のような原理に基づ
いている。さらに、ＥＢＶ関連蛋白質は、例えばワクチ
ン接種プログラムの監視、疫学的問題の分析、患者の治
療、ならびに単核症、バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’
ｓ）リンパ腫、鼻咽頭癌のようなＥＢＶ関連疾患の予防
および治療のためのワクチンの製造のために用いること
ができる。ワクチンは、通常の方法に従って製造され
る。随意に水酸化アルミニウムのような通常のアジュバ
ントと共に、単位投与量をバイアルに入れる。別法で
は、産物をリポゾームとの凝集体の形で投与することが
できる。患者は、抗体産生を刺激するのに十分な用量で
ワクチンを接種されかつ１か月後および６か月後に再接
種される。 【００４５】最後に、本発明の蛋白質は、ＮＰＣまたは
慢性伝染性単核症またはＥＢＶ関連バーキット（Ｂｕｒ
ｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫のような疾患にかかっている患
者の免疫応答を変調することができるので、ＥＢＶ関連
疾患の予防および治療に有用である。 【００４６】発明を実施するための最良の方式 実施例１ ＮＰＣの診断に適した抗原の同定 診断上重要なＥＢＶ関連抗原のための所望なＤＮＡ配号
コード（ｃｏｄｉｎｇ）を得るため、下記の戦略を開発
した。正常な成人、新しい伝染性単核症または鼻咽頭癌
患者の種々の血清によるエプスタイン−バル（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス蛋白質の免疫沈降を用い
て、特別な疾患の免疫状態および特徴の診断に適切な抗
原を同定した（図１）。これらの抗原は、ハイブリッド
選択翻訳によるエプスタイン−バル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ）ウイルスゲノム上に位置決定された。配列デ
ータを用いて、これらの遺伝子をＥＢＶ−ＤＮＡからサ
ブクローニングし、真核生物および原核生物細胞中で発
現させた。 【００４７】免疫沈降により、ＥＡおよびＶＣＡが単一
の抗原ではなく、数種のポリペプチドからなる抗原の群
であることがわかった〔Ｇ．Ｊ．ベイリス、Ｈ．ウルフ
（Ｇ．Ｊ．Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｈ．Ｗｏｌｆ）、“エプス
タイン・バルウイルスの調節された発現。ＩＩＩ、溶解
サイクル中ＥＢＶによって特定される蛋白質（Ｔｈｅｒ
ｅｇｎｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＩＩＩ．Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｂｙ ＥＢＶ ｄｕｒ
ｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｙｔｉｃ ｃｙｃｌｅ）”，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５６，ｐ．１０５（１９８１）〕。
免疫沈降のために、ＥＢＶ産生性、ＭＡ陽性細胞系Ｐ３
ＨＲ１、ＥＢＶ陽性、非産生性ラジ（Ｒａｊｉ）細胞
系、ＥＢＶ陰性細胞系ＢＪＡＢを用いた。細胞が、約１
０６／ｍｌの密度に達したとき、等容量の新鮮な媒質で
希釈した。ＥＢＶ抗原の誘発のため、Ｐ３ＨＲ１培養細
胞を、継代培養後直ちに、４０ｎｇ／ｍｌのホルボル−
１２−ミストレート−１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏ
ｌ−１２−ｍｙｓｔｒａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）
〔ツルハウゼン（ｚｕｒ Ｈａｕｚｅｎ）ら、｛Ｈ．ツ
ルハウゼン、Ｆ．Ｊ．オネイル、Ｕ．Ｋ．フリーズ、Ｅ
ヘッカー（Ｈ．Ｚｕｒ Ｈａｕｚｅｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏ’Ｎ
ｅｉｌｌ，Ｕ．Ｋ．Ｆｒｅｅｓｅ，Ｅ．Ｈｅｃｋｅｒ）
“腫瘍プロモーターＴＰＡによって誘発される永続性腫
瘍原性ヘルペスウイルス（Ｐｅｒｓｉｓｔｉｎｇ ｏｎ
ｃｏｇｅｎｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｏｒ
ＴＰＡ）”ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７２、ｐ３
７３（１９７８）｝〕と３ｍＭの酪酸とで処理した。蛋
白質を標識するため、細胞を、低速遠心分離機で集め、
５０〜１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む
無メチオニンＭＥＭ培地中に２×１０６細胞／ｍｌの密
度に再懸濁した。この細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で４
時間インキュベートし、次に、冷ハンクス燐酸塩緩衝食
塩水（ＰＢＳ）で洗い、冷ＩＰ緩衝液（１％トライトン
−Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ；０．１３７Ｍ ＮａＣ
ｌ；１ｍＭ ＣａＣｌ２；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０％
グリセリン；２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０；０．
０１％ＮａＮ３；１μｇ／ｍｌ弗化フェニルメチルスル
ホニル）中に、５×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁さ
せた。次に、細胞を、ソニケーションで破壊し、氷上で
６０分間インキュベートした。抽出物を、１００，００
０ｘｇで、４℃に於て３０分間遠心分離して清澄にし
た。３５Ｓ−メチオニン標識抽出物は、記載〔Ｇ．Ｊ．
ベイリス（Ｇ．Ｊ．Ｂａｙｌｉｓｓ）ら、上掲〕のよう
に正確に免疫沈降した。結果は図１に示してある。 【００４８】ｐ１３８、ｐ１０５、ｐ９０、ｐ８０に対
する抗体は、ＮＰＣ血清のおのおのの中に、また他のＥ
ＢＶ感染特異的血清の一部の中にのみ存在する。同様に
して、ｐ５４〔上掲のＧ．Ｊ，ベイリス（Ｇ．Ｊ，Ｂａ
ｙｌｉｓｓ）らのｐ５８と同じ〕に対する抗体は、新し
いＥＢＶ感染（伝染性単核症）に対して、回復期状態に
比べて有意である。ｐ１５０、ｐ１４３、ｐ１１０に対
する抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免
疫のための、または新しいＥＢＶ感染に対するＩｇＭ特
異性試験に関連して、あるいはＥＢＶ感染腫瘍（ＮＰＣ
とＢＬ）に対するＩｇＡ特異性試験と関連して、マーカ
ーとして役立つことができる。 【００４９】次の工程は、ＥＢＶゲノム上に抗原を位置
決定することであった。従って、上記ＥＢＶ産生性細胞
を、誘発の２日後、４Ｍイソチオシアン酸グアニジンと
０．５Ｍ２−メルカプトエタノールとで溶解することに
よってＲＮＡを調製した（Ｊ．Ｍ．チャーグイン、Ａ．
Ｅ．プルジビラ、Ｒ．Ｊ．マクドナルド、Ｗ．Ｊ．ラッ
ター（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｙｂ
ｙｌａ，Ｒ．Ｊ．ＮａｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔ
ｔｅｒ）、“リポヌクレアーゼに富む源からの生物学的
活性リポ核酸の単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｓｏｕｒｃｅｓ ｅｎｒｉ
ｃｈｅｄ ｉｎ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）”、バイ
オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１８，
ｐ．５２９４（１９７９）〕。溶解産物を、２０，００
０ｒｐｍで１時間遠心分離し（ＳＷ４１、ベックマ
ン）、２ｍｌのＣｓＣｌ、密度１．８ｇ／ｃｍ３の上に
上澄液を重層した。 【００５０】１５０，０００ｇで１７時間遠心分離後、
ＲＮＡペレットをクロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた。１００μｇの全細胞ＲＮＡを、６５％のホ
ルムアルデヒドと０．４Ｍ ＮａＣｌとの中で、５２℃
に於て２．５時間、１６μｇのクローン化ＥＢＶ−ＤＮ
Ａにハイブリッドさせ、ソニケーションし、変性し、小
さいニトロセルロースフィルター上にスポットした。結
合したｍＲＮＡを、フィルターを９０秒間水中で沸騰さ
せることによって溶出した。このＲＮＡを、試験管内
で、ｍＲＮＡ依存性ウサギ網状赤血球溶解産物で翻訳し
た。翻訳産物を、前述したように〔Ｇ．Ｊ．ベイリス、
Ｇ．デビー、Ｈ．ウルフ（Ｇ．Ｊ．Ｂａｙｌｉｓｓ，
Ｇ．Ｄｅｂｙ，Ｈ．Ｗｏｌｆ）、“ＥＢＶ誘発抗原の分
析のための免疫沈降阻止検定（Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒ
ｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓｅ
ｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＥＢＶ
ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ）”、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ７，ｐ．２２２（１９８３）〕
未標識ＥＢＶ−陰性ＢＪＡ−Ｂ細胞からの蛋白質抽出物
でプレインキュベーションした後、１検定につきヒトＮ
ＰＣ血清プール５μｌを用いて免疫沈降させた。免疫複
合体を、蛋白質Ａ−セファロース上に結合させ、洗浄
し、ビードを電気泳動試料緩衝液中で沸騰させることに
よって溶出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負
荷した。 【００５１】この方法で、ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムに
対して、多数のウイルス蛋白質をマッピングすることが
できた（図２）。ｐ１３８の位置決定は、図２に示して
ある。配列デーク〔Ｒ．バエル、Ａ．Ｔ．バンキアー、
Ｍ．Ｄ．ビギン、Ｐ．Ｌ．デイニンガー、Ｐ．Ｊ．ファ
ウエル、Ｔ．Ｊ．ギブソン、Ｇ．ハトフル、Ｇ．Ｓ．ハ
ドソン、Ｓ．Ｃ．サッチウエル、Ｃ．セギン、Ｐ．Ｓ．
トゥフェル、Ｂ．バレル（Ｒ．Ｂａｅｒ，Ａ．Ｔ．Ｂａ
ｎｋｉｅｒ，Ｍ．Ｄ．Ｂｉｇｇｉｎ，Ｐ．Ｌ．Ｄｅｉｎ
ｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｆａｗｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．Ｇｉｂｓ
ｏｎ，Ｇ．Ｈａｔｆｕｌ，Ｇ．Ｓ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｓ．
Ｃ．Ｓａｔｃｈｗｅｌｌ，Ｃ．Ｓｅｇｕｉｎ，Ｐ．Ｓ．
Ｔａｆｆｕｅｌ，Ｂ．Ｂａｒｒｅｌｌ，“Ｂ９５−８エ
プスタイン−バルウイルスゲノムのＤＮＡ配列および発
現（ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ９５−８ Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ）”、ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）３１０．，ｐ．２０７（１９８
４）〕を用いて、ｐ１３８およびｐ５４のための適当な
オープン読取り枠を確認した（図２）。これらのオープ
ン読取り枠は、ウイルスゲノムの右端のＢａｍＡ断片の
右部に完全に含まれる。 【００５２】実施例２ ｐ１３８コード領域のクローニング Ｒ．バエル（Ｒ．Ｂａｅｒ）ら（上掲）の配列データに
よると、ｐ１３８をコードするために適した大きいオー
プン読取り枠がＥＢＶ Ｂ９５−８のＢａｍＡフラグメ
ントに含まれている。ｐ１３８の遺伝子のヌクレオチド
配列、対応するアミノ酸配列とそれぞれの調節素子は、
図３〜図７に示してある。プラスミドｐＢＲ３２２−Ｂ
ａｍＡ〔Ｊ．スケア（Ｊ．Ｓｋａｒｅ）ら、上掲〕のＤ
ＮＡ５０μｇを、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ、６ｍＭメルカ
プトエタノール、６ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９を
含む全容１５０μｌ中で、３７℃に於て２時間、５０Ｕ
Ｘｈｏｌ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕
で消化した。停止緩衝液１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０
ｍＭ ＥＤＴＡ、６０％蔗糖、１％プロムフェノールブ
ルー、ｐＨ７．５）３０μｌを添加し、混合物を、酢酸
塩緩衝液（０．０４Ｍトリス−酢酸塩、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．６）中で分取用１％アガロースゲル上に置
き、４℃に於て、４０Ｖで１６時間電気泳動を行った。
サイズマーカーとして、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化λ−ファ
ージＤＮＡ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕
を用いた。トリス−酢酸緩衝液中のゲルをエチジウムプ
ロミド（０．５μｇ／ｍｌ）で、室温（ＲＴ）に於て１
時間染色後、ＵＶ照明によってＤＮＡを可視化し、３．
０ｋｂおよび３．３ｋｂに対応するバンドを切り取った
〔３．０ｋｂのＸｈｏｌで生成された断片は所望の断片
であり、３．３ｋｂのＸｈｏＩで生成された断片は部分
消化産物である 【００５３】１つのＸｈｏＩ制限部位が切断されていな
い）〕。アガロース片を透析袋内に入れ、３容のトリス
−酢酸緩衝液を添加して各バンドのＤＮＡを溶出し、４
時間（１００Ｖ、４℃）電気泳動を行った。エルティッ
プＤ（Ｅｌｕｔｉｐ Ｄ）カラム〔シュライヒェルアン
ドシェル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌ
ｌ）〕で、メーカーが推奨する方法に従ってクロマトグ
ラフィーを行い、含まれているエチジウムプロミドをイ
ソアミルアルコールで抽出し、２．５容のエタノールを
加え、１晩中−２０℃でインキュベートして沈澱させる
ことによってさらに精製した。このＤＮＡを、ソーバル
ＳＳ３４（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ ３４）ローター中で
遠心分離（１７，０００ｒｐｍ、２０分）することによ
って集め、７０％エタノールで洗浄し、凍結乾燥後、Ｄ
ＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）１５μｌに溶解した。 【００５４】単離された２つの断片のＤＮＡ濃度を、お
のおの１μｌを１００ｎｇおよび１μｇのｐＵＣ８ＤＮ
Ａと並列で電気泳動することによって概算した。ベクタ
ーｐＵＣ８（ドイッチェサムルングフュールミクロオル
ガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆ
ｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）（ＤＳＭ）、
ゲッチンゲン、西独に寄託、受入れ番号ＤＳＭ３４２
０〕〔Ｊ．メッシング、Ｊ．ビエイラ、“２重消化制限
断片の（ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｇｅｓｔ ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）”ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）１９、ｐ．２６９（１９８２）〕のＳａｌＩＩで
消化したＤＮＡを前述のようにして調製した。但し、次
のリガーゼ反応中、ベクターの再連結を抑制するため、
ＤＮＡをアルカリホスファターゼ（０．５単位（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）、３７℃で３０分〕で処理した。 【００５５】以下に於て、２種の精製断片のおのおのを
開裂ベクター中へ挿入した（ＳａｌＩおよびＸｈｏＩは
同じ付着末端すなわち−ＴＧＣＡ−を生ずる）。この目
的のため、各断片に対して、１Ｕ Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼ〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕を含むリ
ガーゼ緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、６ｍＭメルカプトエタノール、０．６ｍＭ ＡＴ
Ｐ、ｐＨ７．５）全容２０μｌ中、３００ｎｇのＤＮＡ
断片と１００ｎｇのｐＵＣ８ＤＮＡとで連結反応を行っ
た。１４℃に於て２０時間後、８０μｌのＴＥ緩衝液と
２００μｌのコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ
８３細胞（ＡＴＣＣ３５６０７）〔Ｊ．ビエイラ、Ｊ．
メッシング（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ、
“合成万能プライマーによる挿入突然変異および配列化
のためのｐＵＣプラスミド、Ｍ１３ｍｐ７ 誘導系（Ｔ
ｈｅ ｐＵＣ Ｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｎ Ｍ １３ｍｐ
７−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎｓ
ｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｕ
ｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｓ）”、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）１９，ｐ．２５９（１９８２）〕とを添加した。 【００５６】塩化カルシウム法〔Ｍ．マンデル、Ａ．ヒ
ガ（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ，Ａ．Ｈｉｇａ）、“カルシウム
依存性バクテリオファージＤＮＡ感染（Ｃｄｌｃｉｕｍ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｏｐｈａｇｅ Ｄ
ＮＡ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５３，ｐ１５４（１９７０）〕に従って形質転換を
行った。次に、この細胞を、１．５ｍｌのＬ−ブロス
（５ｇ酵母エキス、１０ｇトリプトン、５ｇ ＮａＣ
ｌ）と混合し、３７℃に於て１．５時間インキュベート
し、最後に、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン〔シグマ
（Ｓｉｇｍａ）〕と４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ〔ベー
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕とを補足したＬ−
ブロス寒天平板上で平板培養した。この培養中、再連結
ｐＵＣ８分子を担持する細菌は青色コロニーを生じ、組
換えプラスミドを担持する細菌は白色コロニーを生じ
た。 【００５７】所望の組換えプラスミドを担持するコロニ
ーの同定のため、１２個の白色コロニーを取り、Ｌ−ブ
ロス中で３７℃に於て１晩中増殖させた。Ｈ．Ｃ．バー
ンボイムとＪ．ドーリー（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｌｙ）〔“組換えプラスミドＤＮＡの
スクリーニングのための迅速なアルカリ抽出法（Ａｒａ
ｐｉｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）”，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，ｐ．１５１３（１９７
９）〕によるＤＮＡ製剤の試料をＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化し、前述のようにアガロースゲル上で
電気泳動を行った。さらに組入れられた断片の配向を示
すために、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化を行い、
最後に、３．３ｋｂをＸｈｏＩ消化によって試験した。
プラスミドｐＵＣ６３５は、ＢａｍＡ断片（ｐＢＲ３２
２ＢａｍＡ）の３．０ｋｂＸｈｏＩサブ断片を、適正な
配向および１ａｃＵＶ５プロモーターに対する適正な読
取り枠内で担持しかつほとんど全１３８（図８）の発現
のために用いられる。ｐＵＣ６３５でコードされた融合
蛋白質は、β−ガラクトシダーゼアミノ末端の１２個の
アミノ酸とｐ１３８の約１０２０個のアミノ酸とβ−ガ
ラクトシダーゼのカルボキシ末端部分の６０個のアミノ
酸とｐＢＲ３２２でコードされた領域のもう２９個のア
ミノ酸とからなる。 【００５８】プラスミドｐＵＣ６１３０は、反対の配向
の３．３ｋｂの断片を担持する（図８）。大腸菌（Ｅ．
ｃｏ１ｉ）Ｋ１２ＪＭ８３株は、β−ガラクトシダーゼ
リプレッサー過剰生産株でないので、融合蛋白質は構成
的に発現される。従って、プラスミドｐＵＣ６３５を、
β−ガラクトシダーゼリプレッサー過剰生産株大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＢＭＨ７１−１８（ＤＳＭ３４
１３）〔Ｕ．リュター、Ｂ．ミュラー・ヒル（Ｕ．Ｒ
ｔｈｅｒ，Ｂ．Ｍｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ），“ｃＤＮＡ
クローンの容易な同定（Ｅａｓｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ）”、ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０，ｐ．１７９１（１９８
３）〕中へ導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｍ
ＢＨ７１−１８株の代わりに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｋ１２ＪＭ１０９（ＤＳＭ３４２３）も使用することが
できる（実験方法の本質的変化なしに）。ｐＵＣ６３５
以外に、他の３種のプラスミド、ｐＵＣ９２４、ｐＭＦ
９２４、ｐＫＫ３７８（図１０−図１２）が構築され
た。 【００５９】ｐＫＫ３７８の挿入物は同じＸｈｏＩ部位
から始まり、停止コドンの第３ＸｈｏＩ部位がある２５
０ｂｐ３′まで続く。この３．３ｋｂの断片は、不完全
な消化によって生成され、ｔａｃ−プロモーターとｐＫ
Ｋ２４０−１１〔Ｆ．アマン（Ｆ．Ａｍａｎｎ）ら、上
掲〕の開始コドンとの背後に挿入された。発現産物は僅
か２種の細菌アミノ酸を含み、そのサイズは、細菌ｌａ
ｃＺ部分が無くなっているのでｐＵＣ６３５の発現産物
のサイズより小さい。ｐＵＣ９２４は、ＢｇｌＩＩ部位
から第３ＸｈｏＩ部位までの断片を含む。ｐＵＣ９（Ｄ
ＳＭ３４２１）はベクターとして用いられた。この挿入
物（ｉｎｓｅｒｔ）のサイズはｐＵＣ６３５中のものよ
りも小さいので、またｐ１３８からの停止コドンを用い
るので、発現産物の分子量はｐＵＣ６３５およびｐＫＫ
３７８に於けるよりも小さいと期待される。 【００６０】プラスミドｐＭＦ９２４は、ｐＥＡ３０５
〔Ｅ．アマン（Ｅ．Ａｍａｎｎ）ら、上掲〕と、ｐＵＣ
９２４と同じＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片とから構築され
た。ｐＭＦ１は、後にＣ１リプレッサーのＮ末端部分が
続くｔａｃ−プロモーターを有し、得られる融合蛋白質
はｐＵＣ９２４に於けるよりも１７ｋｄ大きいと期待さ
れる。これらの構築物は、ｔａｃ−およびｌａｃ−プロ
モーターをＩＰＴＧで誘導しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
蛋白質を分離することによって、ＥＢＶ関連抗原の産生
について試験された。領域内のクーマッシー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ）ブルー染色ゲル上に、新しいバンドは全く
見られないか、または弱いバンドしか見られなかった。
しかし蛋白質をニトロセルロース上へ移行し、高力価Ｎ
ＰＣ−プール血清とペルオキシダーゼ接合第２抗ＩｇＧ
抗体とで免疫染色した後、すべての構築物に於て新しい
ＥＢＶ特異的バンドが明らかに検出された（図８）。 【００６１】発現された蛋白は、すべて、ほとんど初期
のサイズを示すが、収量は広範囲にわたっていた。ｐＵ
Ｃ６３５およびｐＭＦ９２４でコードされる蛋白質は、
ｐｕＣ９２４およびｐＫＫ３７８からの非融合蛋白質よ
りも安定に発現できるように思われる。しかし、ｐＵＣ
６３５からの最高の発現蛋白質でも、その収量は、真核
生物蛋白質の大きいサイズのためであるかも知れないが
クーマッシー染色ゲル（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｓｔａｉ
ｎｅｄ ｇｅｌ）に於て極めて弱いバンドしか見られな
かったので大規模生産にとっては低過ぎる。 【００６２】実施例３ ｐＵＣ６３５、ｐＵＣ９２４、ｐＭＦ９２４、ｐＫＫ３
７８でコードされる蛋白質の免疫学的検定 プラスミドｐＵＣ６３５、ｐＵＣ９２４、ｐＭＦ９２
４、ｐＫＫ３７８で形質転換された宿主細胞を、５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンで補足されたＬ−ブロス中で、
細胞密度ＯＤ６００＝０．８に培養した。次に、β−ガ
ラクトシダーゼの誘導のため、乳糖アナロゴン（ａｎａ
ｌｏｇｏｎ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ：シグマ（Ｓｉｇｍａ）〕を添加した
（最終濃度：１ｍＭ）。３７℃に於て１．５時間、さら
にインキュベーション後、培養細胞を遠心分離した。こ
の細胞を、２００μｌの沸騰混合物（２％ＳＤＳ．５％
メルカプトエタノール、３％蔗糖、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．０）中に再懸濁し、１００℃で１０分間
加熱した。得られた蛋白質抽出物２０μｌを１２．５％
ポリアクリルアミドゲル上で分離し、最後に、クーマッ
シーブルー染色で可視化したが、発現産物の収量が非常
に低いので、免疫染色が必要であった。そこで、電気泳
動で分離した蛋白質をニトロセルロースフィルターへ移
行した。すなわち、“ウエスタン・ブロット（Ｗｅｓｔ
ｅｒｎ−ｂｌｏｔ）”を調製した（Ｊ．レナート、Ｊ．
ライサー、Ｇ．Ｒ．シャーク（Ｊ．Ｒｅｎａｒｔ，Ｊ．
Ｒｅｉｓｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｓｈａｒｋ，“ゲルからジアゾ
ベンジル−メチル−ペーパーへの蛋白質の移行および抗
血清による検出（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｅｌｓ ｔｏ ｄｉａｚｏｂｅｎ
ｚｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐａｐｅｒ ａｎｄ ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｒａ）”、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７６、ｐ．
３１１６（１９７９）：獣医学に於ける潜在的ヘルペス
感染（Ｌａｔｅｎｔ Ｈｅｒｐｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）、マーチヌスニジノフ（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊ
ｉｎｏｆｆ）Ｐｕｂｌ，ｐ１０５（１９８４）中のＳ．
モドロー、Ｈ．ウルフ（Ｓ．Ｍｏｄｒｏｗ，Ｈ．Ｗｏｌ
ｆ）、“ヘルペスウイルスサイミリおよびヘルペスウイ
ルスアテレスで誘発された蛋白質のキャラクタリゼーシ
ョン（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ ａｎｄ ｈｅｒ
ｐｅｓｖｉｒｕｓ ａｔｅｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）”〕。 【００６３】ウエスタン−ブロット緩衝液（７２％グリ
シン、１５ｇトリス、１リットルメタノール、蒸留水で
５リットルにする）中、電流強度０．８Ａで３時間、ウ
エスタン・ブロットを調製した。次に、ニトロセルロー
スを、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）緩衝液〔０．１％フィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌ）４００、１％ポリビニルピロリド
ン、１．６％ＢＳＡ、０．１％ＮＰ４０，０．０５％ゼ
ラチン、０．１７ＭＨ３ＢＯ３、２８ｍＭ ＮａＯＨ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ８．
２）で３時間飽和し、ＮＰＣ患者からの１：５０希釈高
力価ＥＢＶ特異的血清と共に１晩中インキュベートし
た。血清は、細菌蛋白質から生ずるバックグラウンドを
少なくするため、細菌蛋白質抽出液（１ｍｌ／１０９大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞〕に予め吸収させておいた。
次に、ニトロセルロースフィルターをゼラチン緩衝液
（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０
ｍＭＮａＣｌ、０．２５％ゼラチン、０．５％トライト
ン、０．２％ＳＤＳ、ｐＨ７．５）中で５時間洗浄する
ことによって未結合ＩｇＧを除去した。吸収されたＥＢ
Ｖ−特異性蛋白質を可視化するために、ペルオキシダー
ゼにカップリングさせかつＴＮ緩衝液（１５４ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）で１：２００に
希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を添加した。室温で２
時間後、未結合のウサギ抗体を、前述のようにゼラチン
緩衝液で洗浄することによって除去した。最後に、１０
０ｍｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５中で、５０
ｍｇのジアミノベンジジン（シグマＳｉｇｍａ）と４０
μｌのＨ２Ｏ２とを加え、室温で１０分間インキュベー
トすることによって、ペルオキシダーゼ反応を行った。
この実験の結果は図９に示してある。 【００６４】実施例４ プラスミドｐＵＣ６３５でコードされるβ−ｇａｌ：ｐ
１３８融合蛋白質の精製 クローン大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９ｐＵ
Ｃ６３５を、上述のアンピシリンで補足したＬ−ブロス
５００ｍｌ中で、３７℃に於て、ＯＤ５６０が０．８に
なるまで増殖させた。融合蛋白質合成を、ＩＰＴＧ（１
ｍＭ）で誘導し、さらに２時間インキュベーションを続
行した後、ＧＳＡローター（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌ
ｌ）〕中で、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細
胞を集め、この細胞を、５０ｍｌの２０ｍＭトリスーＨ
Ｃｌ、ｐＨ７．５に再懸濁した。細胞を溶解するため、
ＥＤＴＡ（最終濃度５０ｍＭ）とリゾチーム（最終濃度
２ｍｇ／ｍｌ）とを添加し、この混合物を、３７℃に於
て３０分間インキュベートした。次に、細胞を、８分
間、２回ソニケーション〔ラブソニック１５０（Ｌａｂ
ｓｏｎｉｃ１５０）、プラウン（Ｂｒａｕｎ）〕し、ト
ライトンＸ−１００を最終濃度３％になるように添加
し、３７℃に於てさらに３０分間インキュベートした
後、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離〔ＳＳ３４
ローター｛ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）｝〕することに
よって、懸濁液中の不溶粒子をペレット化した。得られ
たペレットを、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリスーＨＣｌ、
０．５％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５の溶液
２０ｍｌに溶解し、前のように再度遠心分離した。最後
に、８０ｍｇの蛋白質を、緩衝液（８Ｍ尿素、１０ｍＭ
トリス、０．１％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．
５）でカラムクロマトグラフィー〔セファロース２β−
Ｃｌ｛ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝、長さ８
０ｃｍ、直径３ｃｍ〕にかけた。捕集した４ｍｌずつの
試料のおのおのの３０μｌを、１５％ＰＡＧＥで分析
し、融合蛋白質含有分画をプールした。 【００６５】実施例５ コンピューター解析で確認される抗原決定基をコードす
るｐ１３８サブ領域のクローニング 原理的に、診断用試験に於ては、抗原蛋白質の抗原決定
基サブ領域だけが必要である。従って、ｐ１３８アミノ
酸配列をコンピュータープログラムで解折し、同定され
たこの遺伝子のサブ領域を適当なベクター中に導入し
た。かかる小蛋白質の産生は、これら小蛋白質が産物の
長さが減少するにつれて抗原性の急速な変化を受けにく
くなるという利点がある。さらに特別には、クラス特異
的抗体の検定に関して、診断上の価値がある。Ｐ．チョ
ウとＧ．ファスマン（Ｐ．ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｇ．Ｆａ
ｓｍａｎ）の方法〔“蛋白質から計算されるα−ヘリカ
ル−β−シートおよびランダムコイル領域に於けるアミ
ノ酸の配座パラメーター（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａ
ｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｉｎｏａｃｉ
ｄｓ ｉｎ α−ｈｅｒｉｃａｌ β−ｓｈｅｅｔ ａ
ｎｄ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｃａ
ｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）”、
バイオケミトリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１３，
ｐ．２１１（１９７４）〕によれば、そのアミノ酸配列
（１次構造）によってひき起こされる蛋白質のおよその
２次構造の計算が可能である。示唆された構造に重ね
て、プログラムが相対的親水性、疎水性を決定する。両
方のデータセットを組合わせて、２次構造のα−ヘリカ
ル、β−シート、β−ターニングおよびランダムコイル
領域を示すコンピューターグラフィックが描かれる。そ
れによって親水性領域および疎水性領域が、それぞれ白
丸および黒丸で示される。 【００６６】かかるコンピューターグラフィックの１例
は、図１３にｐ１３８アミノ酸配列について示してあ
る。抗原性部位が、蛋白質の表面にある親水性β−ター
ンに主として位置するとの仮定に基づくと、ｐ１３８の
ほぼアミノ酸５２０とカルボキシ末端との間の領域が抗
原性であるべきである。対応するＤＮＡ配列はｐＵＣ６
３５のＰｓｔＩ断片によって示される。かくして、ｐＵ
Ｃ６３５をＰｓｔＩで開裂し、すべてのＰｓｔＩ断片を
単離し、ＰＳｔＩ開裂ｐＵＣ８中へ導入し、付加的な４
００ｂｐを有する残りのベクター断片（ｐ１３８をコー
ドする配列の第１ＰｓｔＩ部位まで）を再連結させた
（方法はすべて実施例２記載の通り）。得られた組換え
プラスミドを、それぞれｐＵＣＰ４００、ｐＵＣＰ３８
０、ｐＵＣＰ６００、ｐＵＣＰ２１０、ｐＵＣＰ７５
０、ｐＵＣＰ５４０と称した。ｐ１３８をコードする配
列のアミノ末端領域は、プラスミドｐＢＲ３２２−Ｂａ
ｍＡをＰｓｔＩおよびＨｇｉＡＩで消化しかつ該断片を
ＰｓｔＩ開裂ｐＵＣ９中へ挿入することによってクロー
ニングされた〔Ｊ．メッシング（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ）
ら、上掲〕（実施例２記載の方法）。得られた組換えプ
ラスミドをｐＵＣＨＰと称す。翻訳が挿入の３′末端で
停止するｐＵｃＨＰは例外であるが、ｐＵＣ８に対する
すべてのサブクローン配向および読取り枠は正しい。最
後に、この組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｋ１２ＪＭ１０９細胞中へ導入した。 【００６７】実施例６ ｐＵＲ２８８ｐ１３８サブクローンを用いるコンピュー
ター解析によって同定された抗原決定基の発現 ｐＵＣサブクローン（実施例５）は、短いために適当な
３次構造を構築できず、従って完全な蛋白質よりもプロ
テアーゼによって大きな程度に分解される可能性がある
ため細菌中で安定に発現できないので、本発明者らは、
該ＰｓｔＩ断片サブクローンをＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで開裂しかつそれぞれの断片を単離してそれら
をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂したｐＵＲ２
８８中へ連結させること（方法はすべて実施例２記載の
通り）によって、ｐＵＲ２８８（ＤＳＭ３４１５）
（Ｕ．リュター（Ｕ．Ｒｕｔｈｅｒ）ら、上掲〕によっ
てコードされるβ−ガラクトシダーゼの少なくとも一部
分を用いて大融合蛋白質をコードする組換えプラスミド
を構築した。 【００６８】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９
中で発現を行った。産物は、実施例３記載のようにして
分析した。ゲルのクーマッシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）
ブルー染色後、サイズの異なる数種の大融合蛋白質を検
出したが、ウエスタン・ブロットの調製後、ｐＵＲ６０
０およびｐＵＲ５４０によって発現される産物だけが上
記ＩｇＧ抗体と特異的反応を示した（図１４）。これら
の結果は、コンピューター解析とよく一致している。ま
た、実施例５によって得られるクローンの発現を実施例
３記載に従って行った。産物も、実施例３記載のように
して分析した。クーマッシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染
色ゲルから、プラスミドｐＵＣＰ６００とｐＵＣＰ３８
０だけが安定な融合蛋白質をコードすると考えることが
できる。ウエスタン・ブロットは、ｐＵＣＰ６００誘導
融合蛋白質だけが抗原性であることを示す（図１５）。
この融合蛋白質は、アミノ末端クローニング部位でコー
ドされる１１種のアミノ酸とｐ１３８の約６００ｂｐに
よってコードされる領域と１ａｃＺ遣伝子のカルボキシ
末端アミノ酸とを含む。かくして、組換え発現プラスミ
ドｐＵＲ６００およびｐＵＲ５４０ならびにｐＵＣＰ６
００は、それぞれがＥＢＶ蛋白質ｐ１３８の抗原決定基
を含む、大融合蛋白質および小融合蛋白質の生産に使用
することができる。 【００６９】実施例７ 真核生物蛋白質のそれ自体不安定な部分の安定化のため
のプラスミドｐＵＣＰ６００でコードされる蛋白質の応
用 実施例６の実験によって、ｐ１３８で誘導される蛋白質
部分が、プラスミドｐＵＣＰ６００でコードされる蛋白
質以外は不安定であることがわかった。ｐ１３８のＣ末
端からの第２抗原領域（ｐ５４０、図１３参照）は、組
換えｐＵＣベクターｐＵｃＰ５４０を用いて安定に発現
することができない。かかるそれ自体不安定な発現産物
を安定化させるｐ１３８のｐ６００領域の能力を本実施
例で示す。このためには、該プラスミドをＳｓｔＩおよ
ＨｉｎｄＩＩＩで消化（ＳｓｔＩ部位は第１ＰｓｔＩ部
位から約２０ ｂｐ ３′のところにある）することに
よって、ｐＵｃＰ６００の５′−ＰｓｔＩ部位を除去し
なければならなかった。このｐ１３８関連ＳｓｔＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片をＳｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ開裂ｐＵ
Ｃ１２（ＤＳＭ３４２２）中へ挿入したＲ．ウー、Ｌ．
グロスマン、Ｋ．モルドアブ（Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏ
Ｂｍａｎｎ ａｎｄ Ｋ．Ｍｏｌｄｏａｖｅ）編著、酵
素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）Ｖｏｌ１０１，Ｐａｒｔ Ｃ中のＪ．メッシング
（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ）、“クローニング用の新Ｍ１３
ベクター（Ｎｅｗ Ｍ １３ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８３，２０−７８）。 【００７０】次に、得られた組換えプラスミドをＥｃｏ
Ｒ ｉおよびＰｓｔＩで消化した。得られた６００ｂｐ
断片をプラスミドｐＵＣ８中へ挿入した。今や、５′−
ＰＳｔＩ部位は ＳｓｔＩ部位で置換されており、かく
して、読取り枠は、挿入物の３′−および５ ′−末端
の所で再構成される（図１６（ａ））。得られた組換え
プラスミドｐＵＣ ６０１は、依然として安定な産物を
発現する（図１７）。ＥＢＶをコードする配列の３′末
端に於けるＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部の間に、５
アルギニンと２個の停止コドンを枠内にコードする公知
の方法で得られた合成オリゴペプチドを図１６（ｂ）の
ように挿入した。得られたプラスミドｐＵＣＡＲＣ６０
１は、そのＣ末端で５個のアルギニン残基に融合するｐ
１３８のＰ６００を領域をコードする。最終工程に於
て、ｐ１３８のＰ５４０領域をコードするＰｓｔＩ断片
を、ＰｓｔＩによる消化後のｐ１３８のＰ６００領域を
コードするＰｓｔＩ断片へ連結した。得られた組換えプ
ラスミドｐＵＣＡＲＧ１１４０は、枠内に融合されたｐ
１３８の２個の抗原部位を含む約４３ｋｄの安定な蛋白
質をコードする。この融合蛋白質に於て、蛋白質領域Ｐ
６００は蛋白質領域Ｐ５４０を安定化する（図１７）。
発現産物のカルボキシ末端に於けるアルギニン残基は、
サッセンフェルドとブリューワー（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌ
ｄ ａｎｄ Ｂｒｅｗｅｒ）（上掲）が記載しているよ
うに、得られた融合蛋白質の精製のために用いることが
できる（図２０）。 【００７１】実施例８ 組換えプラスミドｐＵＣＡＲＧ６８０の構築 プラスミドｐＵＣＡＲＧ１１４０から、ｐ１３８をコー
ドする領域の４３５ｂｐとｐ６００断片のＣ末端部分と
ｐ５４０断片のＮ末端部分とが欠けている修飾プラスミ
ド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）を構築した。
コンピュータープログラムで予想された主な抗原性部位
は依然として存在する。このプラスミドをｐＵＣＡＲＧ
６８０と称した。このプラスミドの構築は、ｐＵＣＡＲ
Ｇ１１４０をＮｃｏＩで消化することによって達成され
た（開裂部位は図３〜図７中のｂｐ １８４１およびｂ
ｐ ３２４３に相当する）ｐ６００ＮｃｏＩ部位中およ
びｐ５４０ＮｃｏＩ部位中の読取り枠は合わないので、
付着末端をＳ１ヌクレアーゼで除去した。３０μｇのｐ
ＵＣＡＲＧ１１４０をＮｃｏＩで消化し、３．３ｋｂベ
クター−ｐ１３８断片をゲル電気泳動で分離し、精製し
た。このＤＮＡ断片５μｇを、３３ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ ＮａＣ１、０．０３ｍＭ ＺｎＳＯ４、
ｐＨ４．５の１００μｌで、室温に於て１５分間、１０
０単位Ｓ１ヌクレアーゼで消化した。フェノール抽出に
より消化を停止させ、エタノールで沈殿させた後、この
ＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼで再連結させ、コンピテ
ント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９細胞の形
質転換に用いた。得られたクローンを、サイズ３０ｋｂ
の新しい蛋白質（ｐＵＣＡＲＧ６８０）の出現のために
スクリーニングした。ｐＵＣＡＲＧ６８０でコードされ
る短縮されたｐ６００／ｐ５４０融蛋白質は、依然とし
て抗原として反応する。新たに構築された組換えプラス
ミドｐＵＣＡＲＧ６８０（ＤＳＭ３４０８）は、ＤＳＭ
３４０８の寄託番号でＤＳＭに寄託された。 【００７２】実施例９ プラスミドｐＵＣＡＲＧ１１４０でコードされる融合蛋
白質の抗原性の検定 個々のＮＰＣ血清を用いる、組換えプラスミドｐＵＣＡ
ＲＧ１１４０、ｐＵＣ５４０、ｐＵＲ６００（実施例６
および７）でコードされる融合蛋白質とのイムノブロッ
ト（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｓ）は、種々の患者で免疫反
応が異なることを示す（図１８）。これに関して、該プ
ラスミドはｐ１３８領域Ｐ５４０＋Ｐ６００、Ｐ５４
０、Ｐ６００をそれぞれ含む融合蛋白質をコードするこ
とを理解せねばならない。ＮＰＣ血清Ｎｏ．３５２に於
てＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の主分画はＰ５４０領域に向
けられるが、ＮＰＣ血清Ｎｏ．３５４中の主分画はｐ１
３８のＰ６００領域に向けられる。ＮＰＣ患者からの多
くの血清から調製された代表的プールは付加的な抗原性
部位を検出しなかった。この発見からの結論は、本発明
の組換えプラスミドによってコードされる抗原決定基Ｐ
５４０、Ｐ６００が、診断目的に有用なＥＬＩＳＡ試験
のために所望な特異性を得るのに必要かつ十分であると
いうことである。 【００７３】実施例１０ ＥＬＩＳＡ試験に於けるＮＰＣの検出のための、ｐＵＣ
ＡＲＧ１１４０でコードされる融合蛋白質の応用 ｐＵＣＡＲＧ１１４０でコードされる精製融合蛋白質を
ミクロ力価平板に塗抹した。個々のＮＰＣ血清を、その
ＩｇＧについて、また特にそのＩｇＡ反応性について試
験した。これらの血清のＩｇＡ−抗ＥＡ力価は、通常の
免疫蛍光法試験で前もって測定した。最高力価は１：８
０であった。図１９に示すＥＬＩＳＡ試験では、２種の
ＥＢＶ陰性血清、１種のＮＰＣ血清プール、１０種の個
々のＮＰＣ血清を、１：１０６４０希釈まで試験した。
試験は、通常のＥＬＩＳＡ試験法に従って行った。結合
した抗体は、ペルオキシダーゼで接合したマウス抗ヒト
ＩｇＧすなわちＩｇＡとペルオキシダーゼとの反応で検
出した。すべてのＮＰＣ血清が塗抹抗原との反応（Ｉｇ
Ａで１：２５６０まで）を示し、陰性対照ではバックグ
ラウンド反応は見られなかった。この結果は、ｐＵＣＡ
ＲＧ１１４０でコードされる発現産物がＮＰＣの診断お
よび早期発見に適していることを示している。 【００７４】実施例１１ ベクターｐＵＣ８中のｇｐ３５０をコードする遺伝子の
サブ領域のクローニング ｇｐ２５０およびｇｐ３５０をコードする領域をＥＢＶ
Ｂ９５−８ゲノムのＢａｍＬ断片〔Ｊ．スケア（Ｊ．
Ｓｋｅｒｅ）ら、上掲〕にマッピングした。両方のポリ
ペプチドが同一領域を共有するので、両蛋白質は読取り
枠を重ねることによってコードされると想像された（Ｍ
・ハンメル、Ｄ．ソーリー・ローソン、Ｅ．キーフ
（Ｍ．Ｈｕｍｍｅｌ，Ｄ．Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｋｉｅｆｆ），“エプスタイン・バルウイルス
ＤＮＡ断片は２種の主なエンベロープ糖蛋白質（ｇｐ３
５０／３００とｇｐ２２０／２００）のためのメッセー
ジをコードする（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕ
ｓ ＤＮＡ ｆｎｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ｍｅ
ｓｓａｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍａｊｏｒ
ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ （ｇ
ｐ３５０／３００ ａｎｄ ｇｐ２２０／２０
０））”、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ４９，Ｐ．４１３
（１９８４）〕。バエル（Ｂａｅｒ）ら（上掲）の配列
データは、ウイルスゲノムの該ＢａｍＬ断片中のドナー
スプライス部位とアクセプタースプライス部位とを含む
大きいオープン読取り枠を示した（図２１〜図２４およ
び図２５）。 【００７５】ｇｐ３５０はこの領域から転写されたスプ
ライシングされないｍＲＮＡの翻訳産物でありかつｇｐ
２５０は対応するスプライシングされたｍＲＮＡの産物
であると仮定される（図２１〜図２４）。両産物共にウ
イルスカプシド中に見いだされるので、免疫グロブリン
Ｈ鎖遺伝子と匹敵できる方法〔Ｔ，ホンジョウ（Ｔ．Ｈ
ｏｎｊｏ，“免疫グロブリン遺伝子（ｉｍｍｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ）”、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，ｐ．４９９（１９８３）〕で該
ｍＲＮＡの示差スプラシングが起こると仮定される。こ
のスプライシング中で、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮ
Ａの６３０ ｂｐ が除去されて、ｇｐ２５０をコード
するｍＲＮＡが得られる（図２１〜図２４および図３９
（点線）〕〔Ｒ．バエル（Ｒ．Ｂａｅｒ）ら、上掲〕。
従って、ｇｐ３５０の読取り枠の全部または一部分をク
ローニングして、最終的にｇｐ３５０関連産物を単離し
かつ産生させる。ｇｐ２５０だけでなくｇｐ３５０も高
度にグリコシル化された蛋白質であることに留意せねば
ならない。対照的に、本発明による組換えＤＮＡ分子の
発現によって産生される蛋白質は、天然に通常存在する
それぞれのウイルス蛋白質と異なる。原核生物中で発現
が行われる場合には、未修飾蛋白質が得られるが、真核
生物中で発現が行われる場合には、異なるグリコシル化
パターンあるいは天然産物に比べて別の修飾を有する蛋
白質が得られる。 【００７６】ＢａｒｎＬ断片をｐＢＲ３２２に導入し、
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ
１２ＨＢ１０１を形質転換させた〔Ｊ．スケア（Ｊ．Ｓ
ｋａｒｅ）、上掲〕。宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１
２ＨＢ１０１の代わりに、本発明に用いた宿主細菌を用
いてもよい。Ｍ．ハンメル（Ｍ．Ｈｕｎｒｍｅｌ）ら、
（上掲）、Ｊ．Ｒ．ノース（Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｔｈ）ら、
〔Ｊ．Ｒ．ノース、Ａ．Ｊ．モーガン、Ｊ．Ｌ．トンプ
ソン、Ｍ．Ａ．エプスタイン（Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｔｈ，
Ａ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，
Ｍ．Ａ．Ｅｐｓｔｄｎ），“精製エプスタイン・バルウ
イルスＭｒ３４０，０００糖蛋白質は、リポソーム中に
取込まれるとき、強力なウイルス中和性抗体を誘導する
（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｕｖｉ
ｒｕｓ Ｍｒ ３４０，０００ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ−ｎ
ｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｈ
ｅｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎ ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅｓ）”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ７９，ｐ．７５０４（１９８２）〕およびＤ．
Ａ．ソーリー・ローソンとＣ．Ａ．プードリー（Ｄ．
Ａ．Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｃ．Ａ．
Ｐｏｏｄｒｙ）〔“試験管内で中和用抗体の生成の原因
となるエプスタイン−バルウイルスの主成分（ｇｐ３５
０−ｇｐ２２０）の同定と単離（Ｉｄｅｎｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ
ａｉｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ｇｐ３５０−ｇｐ２２
０）ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｒ
ｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ
Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉ
ｎ Ｖｉｖｏ）”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４３，ｐ．７３０
（１９８４）〕の刊行物の内容は、ｇｐ２５０／３５０
をコードする配列の領域が十分に抗原性でかつ（あるい
は）免疫原性の蛋白質をコードすることおよびこれらの
サブ領域の導入後のこれらの産物が原核生物細胞中およ
び真核生物細胞中で安定に発現され得ることを予想する
ことはできない。従って、本発明の完全に未修飾のまた
は異なる方法で修飾されたｇｐ２５０／３５０関連蛋白
質が十分に活性な抗原および（または）免疫原であるこ
とは驚くべきことである。特に、先行刊行物中では、蛋
白質の小さい炭水化物残基がこの蛋白質の抗原または免
疫原ポテンシャルに明らかに寄与することは除外されな
かった。 【００７７】図２１〜図２４に示すように、ＢａｍＬ断
片（ハンメル（Ｈｕｍｍｅｌ）ら、上掲〕の１．９ Ｋ
ｂ ＰｓｔＩ ＰｓｔＩ断片は、アミノ酸位置２３２か
ら始まりアミノ酸位置８２５で終わるｇｐ３５０をコー
ドする領域の部分を含んでいる。Ｈ．Ｃ．バーンボイム
とＪ．ドーリィ（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｊ．Ｄｏｌｙ）〔“組換えプラスミドＤＮＡをスクリー
ニングするための迅速アルカリ抽出法（Ａ ｒａｐｉｄ
ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）”、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，ｐ．１５１３（１９７
９）〕が発表した方法に従って、ｐＢＲ３２２−Ｂａｍ
ＬプラスミドＤＮＡの大規模調製を行った。このＤＮＡ
５０μｇを、５０ｍＭ ＮａＣ１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭトリスーＨＣ１、ｐＨ
７．５中で、３７℃に於て２時間、１００単位のＰｓｔ
Ｉ〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕で消化し
た。１／５容の、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、６０％蔗糖、２
％ブロムフェノールブルーを添加して消化を停止した。
得られた溶液を、トリス−酢酸緩衝液（０．０４Ｍトリ
スー酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中の１％ア
ガロースゲル（シーケム（Ｓｅａｋｅｍ）、ＦＭＣ〕上
で電気泳動によって分離した。サイズマーカーとして、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化λ−ファージＤＮＡ（ベーリンガ
ー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）〕を用いた。室温（ＲＴ）
に於て１４時間、４０Ｖで電気泳動した後、ゲルを、
０．５μｇ／ｍｌエチジウムプロミド含有トリスー酢酸
緩衝液で染色した。 【００７８】ＵＶ照射によってゲル中のＤＮＡバンドを
可視化し、実施例２記載のようにして１．９ｋｂ Ｐｓ
ｔＩ−ＰｓｔＩ断片を単離した。ベクターｐＵＣ８のＰ
ｓｔＩ消化ＤＮＡを前述のようにして調製した。但し、
次のリガーゼ反応中、ベクターの再連結を抑制するため
ＤＮＡをアルカリホスファターゼ（０．５単位（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）、３７℃、３０分）で処理した。精製
した断片のおのおの１μｌを、１００ｎｇおよび５００
ｎｇのｐＵＣ８−ＤＮＡと共に並列で電気泳動（上述の
条件下で）することによって、精製断片の濃度を概算し
た。１．９ｋｂＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片４００ｎｇとＰ
ｓｔＩ消化ベクターＤＮＡ１００ｎｇとを連結させ、連
結したプラスミドＤＮＡで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１
２ＪＭ１０９を形質転換させ、実施例２記載のようにし
て陽性クローンを同定した。得られたクローンを大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９ｐＵＣＬＰ １．９
と呼び、得られた組換えプラスミドを組換えプラスミド
ｐＵＣＬＰ１．９と呼んだ。 【００７９】実施例１２ ベクターｐＵＲ２９０中に於けるｇｐ３５０をコードす
るサブ領域のクローニング ｇｐ３５０サブ領域の安定産物の発現のため、該１．９
ｋｂＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をベクターｐＵＲ２９０
（ＤＳＭ３４１７）（図２７）（Ｕ．リュター（Ｕ．Ｒ
ｕｔｈｅｒ）ら、下掲〕中にリクローニング（ｒｅｃｌ
ｏｎ）した。得られた組換えプラスミドは、ｇｐ３５０
のアミノ酸２３２〜８２５とｐＵＲ２９０およびｐＢＲ
３２２ヌクレオチド残基のクローニング部位によってコ
ードされるアミノ酸とがその後に続く、β−ガラクトシ
ダーゼのアミノ末端領域の融合蛋白質をコードする。そ
れぞれのアミノ酸配列を図２８〜図３３に示す。プラス
ミドｐＵＣＬＰ１．９のＤＮＡ５０μｇを１００単位の
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、上述のよ
うにして１％アガロースゲル上で分離した。初めにｐＵ
Ｃ８中に導入したＰｓｔ１−ＰｓｔＩ断片により僅かに
数個多くのヌクレオチドを含む、ここに得られた１．９
ｋｂＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を、その他の得
られた断片から１％アガロースゲル上で（上述したよう
にして）分離し、最後に、上述のようにしてゲルから単
離し、ベクターｐＵＲ２９０のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ消化ＤＮＡ（Ｕ．リューター、Ｂ．ミューラー・
ヒル（Ｕ．Ｒｕｔｈｅｒ，Ｂ．Ｍｌｌｅｒ−Ｈｉｌ
ｌ），“ｃＤＮＡクローンの容易な同定（Ｅａｓｙ ｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｌｏ
ｎｅｓ）”、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０，ｐ．１
７９１（１９８３）〕中へ、上述の方法に従って連結さ
せた。次の工程は、これらの組換えＤＮＡ分子によるβ
−ガラクトシダーゼリプレッサー・蛋白質過剰産生株の
形質転換であった。形質転換体を平板培養し、上述のよ
うに分析した。但し、ＤＮＡ調製物の試料をＢａｍＨＩ
／Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得ら
れたクローン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０
９ｐＵＲＬＰ１．９は、プラスミドｐＵＣＬＰ１．９お
よびベクターｐＵＲ２９０の該ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ １．９ｋｂ断片の組換え体である。プラスミド
ｐＵＲＬＰ １．９を担持している（図 ２７参照）。 【００８０】実施例１３ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９ｐＵＲＬＰ
１．９によって合成されるｇｐ３５０関連ポリペプチド ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補足した５ｍｌのＬ−
プロス中で、３７℃に於て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ
１２ＪＭ１０９ｐＵＲＬＰ １．９を１晩中培養して増
殖させた。この培養細胞を、次に、５６０ｎｍに於ける
光学密度（ＯＤ５６０）０．４に希釈し、この細菌懸濁
液４ｍｌを、ＯＤ５６０が０．８になるまで３７℃に於
てインキュベートした。次に、プラスミドｐＵＲＬＰ
１．９が担持している遣伝情報の発現を、実施例３のよ
うにして誘導し、最後に、実施例３記載のようにクーマ
ッシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー染色することによ
って蛋白質を可視化した。対照実験と比較して、プラス
ミドｐＵＲＬＰ １．９でコードされかつサイズが１１
６ｋＤ〜２００ｋＤの範囲の幾つかの新規蛋白質が検出
された（図３４）。異なるサイズの発現産物は、不完全
なｍＲＮＡ合成または翻訳によるものかも知れない。新
規産物がＥＢＶ関連蛋白質であることを立証するため、
電気泳動で分離されたすべての蛋白質をニトロセルロー
スフィルターに移行した。すなわち実施例３記載の方法
によって“ウエスタン・ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂ
ｌｏｔ）”を調製した。この実験の結果は図３４に示し
てある。 【００８１】実施例１４ プラスミドｐＵＲＬＰ１．９でコードされるβ−ｇａ
ｌ：ｃｐ３５０融合蛋白質の精製 β−ガラクトシダーゼの天然のカルボキシ末端アミノ酸
配列のｇｐ３５０関連アミノ酸配列による置換はβ−ガ
ラクトシダーゼ四量体の生成を阻害する。さらに、この
新たに発現された融合蛋白質は、細菌の細胞中に高濃度
で存在し、従って宿主細胞の細胞質内に沈殿する。実施
例４記載の方法に従って、クローン大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９ｐＵＲＬＰ１．９を用いて対応す
る融合蛋白質を産生させた。この精製法の数段階の結果
を図３５に示す。 【００８２】実施例１５ β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質としてのｇｐ２５０／
３５０の抗原エピトープの発現 図３６は、親水性（黒丸）および疎水性（灰色丸）領域
の相対的価値と共に、ｇｐ３５０のコンピューターで予
測された２次構造を示す。β−ターンまたはループ構造
は、１８０℃のラインターンとして示される（α−らせ
ん、α−シート、コイル構造は、用いた尺度ではやっと
識別できる。）抗原部位は、蛋白質の表面に暴露する可
能性がある親水性環境内のβ−ターン中にあるという仮
定に基づくと、約アミノ酸５０およびアミノ酸７０なら
びに８００−８３０の領域がそれぞれ抗原エピトープを
示すと期待される。 【００８３】ｇｐ２５０／３５０のＮ末端のサブクロー
ニングおよび発現 ｐＢＲ３２２（Ｊ．スケア（Ｊ．Ｓｋｅｒｅ）ら、上
掲〕中にクローニングされたＥＢＶ ＢａｍＨＩ−Ｌ断
片をＥｃｏＲＩ（図２１〜図２４に示した配列中の位置
６５０および１２８４に於ける制限部位）で消化し、得
られた６３４ ｂＰ断片を、電気泳動後アガロースゲル
から溶出し、ＥｃｏＲＩ線状化ｐＵＣ１９（ＤＳＭ３４
２５）（ヤニッシューペロン（ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｏｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）３３、１０３−１１９
（１９８５）〕に連結させた。次に、この連結産物で大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９を形質転換させ
た（すべての工程は、実施例２記載のように行った）。
実施例２に従って、得られた組換えプラスミドを、適当
な制限酵素を用いて、その挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）の配
向について試験した。ｐＵＣ１９プラスミドのｌａｃＺ
遺伝子の読取り枠に対して読取り枠の反対の配向で挿入
物を担持する組換えプラスミドをｐＵＣｌ９ＬＥＰ６０
０と称し、さらにクローニングのために使用した。 【００８４】 【化１】【００８５】ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００をＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔＩ（ＢａｍＨＩ部位はｐＵＣ１９から誘導さ
れ、ＰｓｔＩ部位は図２１〜図２４の位置１２４８に相
当する）で消化し、得られた６００ ｂｐ 断片を、前
以てＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化してあるｐＵＲ２
９１（ＤＳＭ３４１８）（リュター（Ｒｕｔｈｅｒ）、
上掲〕中へ挿入した。得られた組換えプラスミドｐＵＲ
ＬＥＰ６００は、β−ガラクトシダーゼのＣ末端に於け
るリンカー領域中に於て下記の配列を示した。 ＩＰＴＧ−誘導後のこの組換えプラスミドから、実施例
３記載のように融合蛋白質の発現を行った。この実験の
結果は、図３７に示す。図３７（下部）から、得られた
発現産物は、ＮＰＣ血清のプールによって中程度に抗原
性の蛋白質として認識されると見なすことができる。 【００８６】ｇｐ２５０／３５０のＣ末端のサブクロー
ニングおよび発現 プラスミドｐＵＣＬＰ１．９（実施例１１参照）をＸｍ
ｎＩ（図２１〜図２４の位置２７６０に於ける制限部
位）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（ｐＵＣ−プラスミドから
誘導される領域内の制限部位）で消化することによっ
て、コンピューター指示分析によっても抗原性であると
期待されるＣ末端付近の抗原エピトープを含む領域を単
離した。この精製３８６ ｂｐ 断片を、予めＨｉｎｃ
ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化してあるｐＵＣ１
９中へ挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＭ１
０９中へ導入された、ここに得たプラスミドはｐＵＣ１
９ＬＸＰ３９０ 【００８７】 【化２】 【００８８】ｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０の挿入物（ｉｎｓ
ｅｒｔ）をＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで切り
出し、同じ酵素で消化したｐＵＲ２８８中へ結合させ
た。得られた組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２ＪＭ１０９中へ導入し、ｐＵＲＬＸＰ３９０
と称した。そのリンカー領域の配列は下記の通りであ
る。ＩＰＴＧ誘導後、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が、
該形質転換宿主によって合成された。ウエスタン・ブロ
ットに於て、発現産物は、ＮＰＣ血清プールと高い反応
性を示す（図３７下部参照）。 【００８９】実施例１６ 新たに構築された組換えプラスミドによってコードされ
るβ−gal:: gp２５０／３５０融合蛋白質の診断試験に
於ける使用 ジルグ（Jilg) ら、(W. ジルグとH.ウルフ(E.Jilg and
H.Wolf) ”、エプスタイン・バルウイルス特異性膜抗原
gp２５０に対する抗体の診断的意義、(Diagnostic Sign
ificance of Antibodies to the Epstein-Barr Virus-S
pecific Membrane Antigen gp250) ”、ザジャーナル
オブ インフェクシアス ディジージス(The Journal o
f Infections Diseases), 152 , 222-225 (1985)〕は、
gp２５０およびgp３５０の、ＥＢＶに対する免疫状態の
決定および特に慢性ＥＢＶ感染の診断のための抗原とし
ての正当性を示した。ＥＢＶ感染後正常な免疫応答を示
すヒトはgp２５０およびgp３５０に対する抗体をもって
いるが、慢性ＥＢＶ感染にかかっている患者は未だ付加
的な介在配列（図３９参照）を含む 【００９０】ｇｐ３５０にのみ免疫応答を示す。これら
のヒト血清学的状態は、実施例４記載の方法によって精
製された３種の融合蛋白質を用いるＥＬＩＳＡ試験で検
査することができる。３種の融合蛋白質全部に対する抗
体反応は正常な免疫状態を示す。もしｐＵＲＬＥＰ６０
０およびｐＵＲＬＸＰ３９０でコードされる蛋白質と反
応しないかまたは弱く反応するが、ｐＵＲＬＰ１．９
（介在配列を含む、図３９参照）に対して反応性である
ならば、慢性ＥＢＶ感染の可能性が極めて大きい。膜蛋
白質ｇｐ２５０／３５０およびそのサブ断片に対するＩ
ｇＡ抗体は、正常な人口中には存在しないが、比較的敏
感でない免疫蛍光法で測定するとき鼻咽頭癌患者の５８
％に存在する。これらの結果は、同等の試験系に於ける
ＥＢＶ特異的初期抗原（ｅａｒｌｙ ａｎｔｉｇｅｎ）
に対するＩｇＡ抗体の検出率に似ている。同様に、より
高感度のＥＬＩＳＡ試験は１００％に近い検出率を持
ち、偽陽性結果のほんの僅かの増加がある。従って、新
たに構築された組換えプラスミドｐＵＲＬＥＰ６００、
ｐＵＲＬＸＰ３９０、ｐＵＲＬＰ１．９でそれぞれコー
ドされる抗原は、鼻咽頭癌の初期診断および治療の管理
に有用な物質である。 【００９１】実施例１７ プラスミドpUC ８に於けるgp２５０／３５０断片の発現 gp２５０／３５０のＮ末端領域を含む組換えプラスミド
pUC19LEP600 （実施例１５参照）をＢamＨＩおよびＰst
Ｉで消化した。このＥＢＶ誘導断片を、予め同じ酵素で
消化してあるpUC ８中へ連結させた。得られたクローン
pUCLEP６００のリンカー領域の配列は下記の通りであ
る。 ＩＰＴＣによる誘導後、pUCLEP６００でコードされた融
合蛋白質は、細菌細胞内で全く安定でありかつＮＰＣ血
清プールによって抗原として認識される（図３８参
照）。細菌融合部分は、Ｎ−末端に於ける１４個のアミ
ノ酸とＣ末端に於ける９個のアミノ酸とからなる。この
蛋白質の価値は、ワクチンに応用できることであり、特
にそれがβ−gal 融合蛋白質で決定されたように（図３
８参照）、Ｃ末端からのそれ自体不安定な第２抗原領域
と融合されるときワクチンに応用できることである。実
施例１１、１５〜１７によって構築された組換え発現プ
ラスミドおよびクローニングプラスミドの挿入物 (inse
rt) は図３９に示してある。 【００９２】実施例１８ ｐ１３８：：gp２５０／３５０融合蛋白質としてのgp２
５０／３５０のＮ末端部分の発現 プラスミドpUC19LEP600（実施例１５参照）をＰstＩで
消化し、得られた６００bp断片を、ＰstＩで線状化され
たプラスミドpUCARG６０１（実施例７参照）に連結させ
た。gp３５０挿入物がpUCARG６０１−読取り枠と同じ配
向であることがチェックされ、得られた組換えプラスミ
ドをpUCARG１２３０と称した。得られたプラスミドのリ
ンカー領域中および接合(Junction)部位に於ける配列は
下記の通りである。ＩＰＴＧによる誘導後、pUCARG１２３０を担持する大腸
菌（Ｅ．coli) Ｋ１2ＪＭ１０９は、2 種の異なる蛋白
質すなわちｐ１３８とgp２５０／３５０からの抗原性領
域からなる安定でかつ抗原性の蛋白質を発現する。さら
に、この発現産物は、ＥＬＩＳＡ試験に於ける抗原とし
て、またワクチン接種用の抗原としても使用することが
できる。 【００９３】実施例１９ ｇｐ２５０／３５０抗原で免疫されたウサギに由来する
血清による中和試験 Ｂ９５−８からの上清を用いてヒト臍帯血球〔フィコー
ル／ハイパーク（Ｆｉｃｏｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配か
らのリンパ球分画〕を不死化した。０．５×１０６リン
パ球を、０．５ｍｌのミクロ力価平板につき十分に接種
し、５０μｌのＢ９５−８の無細胞上清を添加し、３７
℃に於て２時間、吸着させた。インキュベーション後、
ウイルスを含んでいる培地をとり出し、１０％の子牛胎
児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で洗浄し、同培地２
００μｌ中で、３７℃に於て５％ＣＯ２雰囲気中でイン
キュベートした。発育しつつあるリンパ芽球皮疹細胞
を、実験開始から３週間以後に評価し、陽性形質転換と
して計数した。 【００９４】血清の中和性は、Ｂ９５−８細胞上清を含
むエプスタイン−バルウイルスの一定量を、複試験に於
ける対照としてのそれぞれの予備免疫化血清を含む試験
血清２０μｌと共に僅かに攪拌しながら１時間インキュ
ベートした後、上清を臍帯血液リンパ球に吸着させるこ
とによって試験した。２時間後にセルから接種物を除去
した後、保持培地（１０％ＦＣＳで補足したＲＰＭ１１
６４０）を、中和活性試験下にあるそれぞれの血清５％
で補足した。下記の結果が得られた。 【００９５】実施例２０ ウイルスカプシド蛋白質ｐ１５０の抗原性断片のクロー
ニングおよび発現 診断に適した蛋白質ｐ１５０（ウイルスカプシド抗原Ｖ
ＣＡ（実施例１、図４０〜図６１参照）〕を抗原部位に
ついて試験し、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として
発現させるためにサブクローニングした。抗原部位をコ
ードすると期待されるＮ末端領域は、キヤロン４Ａ（Ｃ
ｈａｒｏｎ４Ａ）ファージＥＢ６９−７９（Ｇ．Ｎ．ブ
エル、Ｄ．ライスマン、Ｃ、キントナー、Ｇ．クラウ
ス、Ｂ．サグデン（Ｇ．Ｎ．Ｂｕｅｌｌ，Ｄ．Ｒｅｉｓ
ｍａｎ，Ｃ．Ｋｉｎｔｎｅｒ，Ｇ．Ｃｒｏｕｓｅ，ａｎ
ｄ Ｓ．Ｓｕｇｄｅｎ），”エプスタイン−バルウイル
スのＢ９５−８株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２）からの
重複ＤＮＡ断片のクローニングは内部反復に対する相同
の部位を示す（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎ
ｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
Ｂ９５−８ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｓｐｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒｖｉｒｕｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２）ｒｉｖ
ｅａｌｓ ａ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｏｍｏｇｙ ｔｏ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏ
ｎ），”ジャーナル オブ ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４０，９７７−９８２
（１９８１）〕をＢａｍＨＩで消化することによって得
られ、得られた１１７６ ｂｐ 断片をｐＵＣ１２のＢ
ａｍＨＩ部位中へクローニングした。適当な配向での挿
入を有する得られたプラスミドから、ＸｈｏＩ／Ｓａｌ
Ｉで５８０ ｂｐ 断片を切除した。ＳａｌＩ部位はｐ
ＵＣ１２リンカーから由来し、ＸｈｏＩ部位はｐ１５０
の開始から上流へ３３ｂｐの所にある。この断片を、Ｓ
ａｌＩで消化されたｐＵＣ８（ＳａｌＩとＸｈｏＩとは
同じ付着末端配列を共有する）中へ挿入した。得られた
クローンを、ＢａｍＨ部位の次にｐ１５０開始コドンを
もつようにスクリーニングした。適当なクローンから、
ｐ１５０コード領域をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切り出し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消
化されたｐＵＲ２９０（ｐＵＲ２９０ＣＸＨ５８０）中
にクローニングした。このクローンからのβ−Ｇａ
ｌ：：ｐ１５０融合蛋白質の発現は、図６２に示してあ
る。それがＮＰＣ血清プールと極めてよく反応する能力
は図６３からわかる。 【００９６】さらに、従って、ｐ１５０：β−ｇａｌ融
合構築体が得られた。例えば図６４に示しているサブク
ローンＰＵＲ２９０ＤＢＸ３２０，ｐＵＲ２９２ＤＢＢ
１８０，ｐＵＲ２９０ＤＴＴ７００，ｐＵＲＤＴＴ７４
０ ｐＵＲ２９０ＤＴＰ６８０，ｐＵＲ２８８ＤＰＰ３
２０が得られた。このサブクローンの名称から用いれた
ベターがわかり、例えばサブクローンｐＵＲ２９０ＤＢ
Ｘ３２０の構築のためには、ベクターｐＵＲ２９０を用
いた。図６３から、サブクローニングのために用いた制
限酵素部位もわかる。ｐＵＲＤＢＢ１８０を除いてすべ
てのクローンは、所望の断片をｐＵＣ８またはｐｕＣ１
２（上掲参照）中へサブクローニングして、ｐＵＲベク
ター（上掲参照）ヘクローニングするために適したＢａ
ｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を得ることによって
構築された。ｐＵＲ２９２ＤＢＢ１８０は、ＢａｍＨＩ
で線状化されたｐＵＲ２９２中への１８０ ｂｐ のＢ
ｇｌ ＩＩ−Ｂｇｌ ＩＩ断片の挿入によって誘導され
た。図６２および図６３はそれらの発現および抗原性を
示す。 【００９７】ｐＵＲ２９０ＣＸＨ５８０でコードされか
つ実施例４によって精製されたβ−ｇａｌ：：ｐ１５０
融合蛋白質は、ＥＬＩＳＡ試験ではＥＢＶ特異性抗原と
して反応し、診断に応用できることを示す。５８０ ｂ
ｐ 断片（ｐＵＲ２９０ＣＳＨ５８０の構築のために用
いられる）を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用
いてｐＵＣ１８（ＤＳＭ３４２４）中へ挿入することに
よってｐ１５０のＮ末端断片をもつ安定な発現も得られ
た。得られたクローンｐＵＣ１８ＣＸＨ５８０は、サイ
ズが約２５ｋＤの安定な抗原性蛋白質を発現する。 【００９８】本発明の目的のために、下記の寄託プラス
ミド、宿主細菌、細胞系を用いた。寄託は、プタペスト
条約に従って行われた。 【００９９】以上、本発明の多数の実施態様を示した
が、ＥＢＶ関連抗原をコードしかつ組換えＤＮＡ分子の
産生をコードするＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列を利用する
他の実施態様を与えるために本明細書の構成を変え得る
ことは明らかである。該ＤＮＡ配列に関連しかつ他のＥ
ＢＶ血清型から誘導され得る他のＤＮＡ配列も用い得る
ことは当業者には明らかである。ＥＢＶは、公知の天然
ＥＢＶ源、例えば感染した患者の唾液から容易に得るこ
とができる。 【０１００】生物学的に同等な結果を得るため、他の適
当なベクター／宿主系を用い得ることは明らかである。
本発明は、現在入手できる宿主／ベクター系に限定され
るものではない。
【図面の簡単な説明】図１は、単核症およびＮＰＣに罹患している患者に由来
するＥＢＶ特異性血清の免疫沈降のオートラジオグラフ
ィーである。 免疫沈降した３５Ｓ−標識一蛋白質をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルに
Ｘ線フィルムを露出した。免疫沈降に用いた種々の血清
源は、オートラジオグラフィーのそれぞれの領域の下に
示してある。“プール”と称する対照は、免疫沈降性の
ＥＢＶ特異的蛋白質のすべてを含んでいる。このオート
ラジオグラフィーから、ＮＰＣ血清のおのおのに、かつ
ＥＢＶ感染特異的血清のあるものにのみ、少くともｐ１
３８、ｐ１５０、ｐ８０に対する抗体が存在することが
わかる。同様に、回復期状態に比べて、新しいＥＢＶ感
染（伝染性単核症）には、ｐ５４に対する抗体が重要で
ある。ｐ１５０、ｐ１４３、ｐ１１０、ｐ９０に対する
抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免疫の
ため、あるいは新しいＥＢＶ感染についてＩｇＭ特異性
試験に関連して、あるいはＥＢＶ関連腫瘍（ｎｅｏｐｌ
ａｓｉａ）（ＮＰＣおよびＢＬ）についてはＩｇＡに関
連してマーカーとして作用することができる。図２は、
ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムに対するｍＲＮＡ’ｓのマッ
ピングを示す。ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムのＢａｍＨＩ
制限部位は、図の下に示してあり、それぞれの制限断片
は、大文字および小文字で示してある。個々のＢａｍＨ
Ｉ制限断片に対するハイブリッド選択によって位置決定
されている蛋白質のｍＲＮＡ’ｓは数および線で示して
ある。この図から、ｐ１３８の遺伝子がＢａｍＡ断片に
相関していることがわかる。図３〜図７は、ｐ１３８を
コードするＢａｍＡの左側読取り枠のＤＮＡ配列を示
す。ここに示した配列は、それぞれの陰性鎖である。ｐ
１３８コード領域は、ヌクレオチド位置１８２から始ま
り、ヌクレオチド位置３５６３で終わる。このコード領
域の断片のクローニングに用いられる制限部位が示して
ある。図８は、プラスミドｐＵＣ６３５およびｐＵＣ１
３０の制限地図を示す。ベクターｐＵＣ８のサイズは
２．７ｋｂである。１ａｃＵＶ５β−ガラクトシダーゼ
プロモーターおよびオペレーター（ＰＯ）のクローニン
グ部位３′は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ），ＢａｍＨＩ（Ｂ）、
ＳａｌＩ（Ｓ），ＰｓｔＩ（Ｐ），Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
（Ｈ）部位を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子はＡＭＰで
示される。ｐ１３８コード領域の３，０ｋｂおよび３．
３ｋｂＸｈｏＩ断片をｐＵＣ８のＳａｌＩ部位中へ挿入
する。挿入は中抜きバーで示してある。ｐＵＣ６３５
は、３．０ｋｂＸｈｏＩ断片を、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子に対して正しい読取り枠内に含んでいるが、ｐＵ
Ｃ６１３０は、３．３ｋｂＸｈｏＩ断片を反対の配向で
含んでいる図９は、プラスミドｐＵＣ６３５、ｐＵＣ９
２４、ｐＭＦ９２４、ｐＫＫ３７８によってコードされ
る蛋白質の発現を示す。第１列は免疫染色したウエスタ
ン・ブロットで、ｐＵＣ８で形質転換され、ＩＰＴＧで
誘導された細菌から単離されている第２列はｐＵＣ９２
４で形質転換された細菌の蛋白質であり、第３列はｐＫ
Ｋ３７８で形質転換された細菌の蛋白質であり、第４列
はｐＭＦ９２４で形質転換された細菌の蛋白質であり、
第５列はｐＵＣ６３５で形質転換された細菌の蛋白質で
ある。融合蛋白質のサイズは、７５ｋＤ（第２列）、１
１０ｋＤ（第３列）、９０ｋＤ（第４列）、１３５ｋＤ
（第５列）と概算された。図１０は、プラスミドｐＵＣ
９２４の制限地図である。ベクターｐＵＣ９のサイズは
２．７ｋｂである、１ａｃＵＶ５β−ガラクトシダーゼ
プロモーターおよびオペレーター（ＰＯ）のクローニン
グ部位３′は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ），ＢａｍＨＩ（Ｂ）、
ＳａｌＩ（Ｓ）、ＰｓｔＩ（Ｐ），Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
（Ｈ）を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子はＡＭＰで示さ
れる。ｐＵＣ６３５の２．６ｋｂＢｇｌ ＩＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−断片を、ＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間
に挿入する、Ｂｇｌ ＩＩの略号は“Ｂｇ”である。図
１１は、プラスミドｐＭＦ９２４の制限地図である。ｐ
ＵＣ９２４の２．０ｋｂ ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ断片がハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（ｔ
ａｃ）とＣ１（λ＝プレッサー）のアミノ末端コード領
域との３′に位置する、ｐＥＡ３０５のＢａｍＨおよび
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位中へ挿入された。図１２は、
プラスミドｐＫＫ３７８の制限地図であるリンカーとし
てｐＢＲ３２２の３４５ ｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片（黒い太線で示す）を用い、ベクターｐＫ
Ｋ２４０−１１のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位中へｐＵＣ６１
３０の３．３ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
挿入した。かくして、ｐ１３８コード断片は、ハイブリ
ッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（ｔａｃ）およびＡＴ
Ｃ開始コドンの３′に位置する。図１３は、ｐ１３８の
２次構造である。ｐ１３８の２次構造のチョウーファス
マン（Ｃｈｏｕ．Ｆａｓｍａｎ）計算のコンピューター
プロットを示す。また、疎水性領域（黒丸）および親水
性領域（白丸）も示す。抗原部位は、β−ターンをもつ
親水性領域にあると期待される。この環境は、ｐ６００
領域中および蛋白質のカルボキシ末端に与えられる。ベ
クターｐＵＣ８およびｐＵＲ２８８中へサブクローニン
グされた領域が示されている。図１４は、ｐ１３８のＰ
ｓｔＩ断片を担持するプラスミドｐＵＲで形質転換され
た細菌の発現産物を示す。（Ａ）種々のプラスミドを担
持するＩＰＴＣ誘導細菌の溶解産物のクーマッシーブリ
リアントブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲ
ル分析を示す。分子量１２０〜１５０ｋｄの融合蛋白質
を黒丸で示す。トラックＭ（ＴｒａｃｋＭ）分子量マー
カーが図３〜図７に示すようなｐ１３８の領域を含むプ
ラスミドを担持する細菌のｐＵＲ４００−ｐＵＲ５４０
の溶解産物を標識する。（Ｂ）ゲル（パネルＡで示した
ものと同様な）からニトロセルロースペーパー（ウエス
タンブロット）上へ移行させた蛋白質の酵素免疫測定を
示す。この測定では、高力価血清のプールを用い、洗浄
後、結合した免疫グロブリンを、ヒトＩｇＧに対する抗
体にカップリングさせたペルオキシダーゼとジアミノベ
ンジジンとによる逐次反応によって可視化した。ｐＵＲ
６００およびｐＵＲ５４０を含む細菌からの融合蛋白質
だけが特異的反応を示す。プラスミドｐＵＣ６３５（陽
性対照としての）はｐ１３８コード領域のほとんど全部
を含むが、蛋白質は不安定で、急速に分解する。ｐＵＣ
８は、ＥＢＶ誘導配列を含まないベクタープラスミドを
含む陰性対照である。図１５は、ｐ１３８のＰｓｔＩ断
片を担持するｐＵＣサブクローンで形質転換された菌の
発現産物を示す。ゲルからニトロセルロースペーパー
（ウエスタン・ブロット）へ電気泳動によって移行させ
た蛋白質の酵素免疫測定を行った。この測定では、高力
価抗血清のプールを用い、洗浄後、結合した免疫グロブ
リンを、ヒトＩｇＧに対する抗体にカップリングさせた
ペルオキシダーゼとジアミノベンジジンとによる逐次反
応によって可視化した。ｐＵＣＰ６００を含む菌からの
融合蛋白質は安定に産生され、特異的抗原反応を示す。
図１６は、β−ｇａｌ融合蛋白質としての発現によって
見いだされる両方の抗原部位をコードするプラスミドｐ
ＵＣＡＲＧ１１４０の構築スキームである。（ａ）ｐＵ
Ｃ６００の５′−ＰｓｔＩ部位を、ＳａｌＩ（２０ｂｐ
上流）およびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化することによって
除去し、次いでｐＵＣ１２−ＳａｌＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉと連結させた。このプラスミドから、ＥｃｏＲＩおよ
びＰｓｔＩで挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）を除去し、ｐＵＣ
８−ＥｃｏＲＩ中へ連結させた。得られたプラスミドｐ
ＵＣ６０１中へ、５個のアルギニンと２個の停止コドン
とをコードするオリゴヌクレオチドを、３′−ＰｓｔＩ
部位とＨｉｎｄ ＩＩＩ（ｐＵＣＡＲＧ６０１）との間
の１本鎖ＤＮＡとして挿入した。最後の工程に於て、ｐ
１３８のＣ末端からの第２抗原決定基をコードする５４
０ ｂｐ ＰｓｔＩ断片を、ＰｓｔＩによる消化および
連結によって挿入した。得られたプラスミドは、５個の
アルギニン残基がその後に続く両方の抗原決定基を枠内
に含んでいた。このプラスミドをｐＵＣＡＲ１１４０と
称した。（ｂ）オリゴアルギニンリンカーのヌクレオチ
ド配列。下方鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）を合成
し、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩの付着末端間の架
橋形成によって１本鎖ＤＮＡとして挿入した。図１７
は、ｐＵＣ８を対照とする、プラスミドｐＵＣ６００，
ｐＵＣ６０１，ｐＵＣＡＲＧ６０１，ｐＵＣＡＲＧ１１
４０のＩＰＴＧ誘導発現を示す。上部は、クーマッシー
（Ｃｏｏｍａｓｓｉ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。新
たに検出された蛋白質は、黒色点で標識し、下部は、Ｎ
ＰＣ患者からの血清による免疫染色後に得られた対応す
るウエスタンブロトト（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を
示す。ｐＵＣＰ６００と比べて、ｐＵＣ６０１によって
コードされるＥＢＶ関連蛋白質は、１４個のアミノ酸が
欠けている（ｐＵＣ−ポリリンカーによってコードされ
る６個のアミノ酸とＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片からの８個
のアミノ酸）ので、約１．５ｋＤ小さい。ｐＵＣＡＲＧ
６０１によってコードされる蛋白質のサイズは、挿入さ
れたオリゴヌクレオチド中に存在する停止コドンによっ
てｐＵＣのＩａｃＺ領域中を通しての読取りが阻害され
るので、さらに約１１ｋＤ減少される。ｐＵＣＬＡＲＧ
１１４０では、５４０ ｂｐ 断片の挿入によって約４
２ｋＤにサイズが増加する。この蛋白質は細菌細胞中で
安定である。図１８は、ｐ１３８中で検出される２個の
エピトープに対する個々のＮＰＣ血清のＩｇＧおよびＩ
ｇＡ抗体の分布および反応性を示す。図に示したプラス
ミドを担持するＩＰＴＧ誘導大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細
胞の溶解産物を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、４回、
独立に分離し、ウエスタン・ブロッティングによってニ
トロセルロースへ移行させた。第１列：陰性参照として
のｐＵＲ２８８；第２列：陽性対照としてのｐＵＣＡＲ
Ｇ１１４；第３列：ｐＵＲ５４０；第４列：ｐＵＲ６０
０。２種の個々のＮＰＣ血清（Ｎｏ．３５２とＮｏ．３
５４）をフィルターと共にインキュベートし、結合した
ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を、ペルオキシダーゼ接合抗ヒ
トＩｇＧおよび抗ヒトＩｇＡウサギ抗体を用いて可視化
した。ウエスタン・プロツト中の蛋白質の異なる位置、
特にｐＵＣＡＲＧ１１４０の異なる位置はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの異なる電気泳動時間から得られる。ＮＰＣ血清Ｎ
ｏ．３５２に於ては、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の主な反
応はｐ１３８のＣ末端からのｐ５４０エピトープ（図１
３参照）に対して向けられるが、血清Ｎｏ．３５４では
抗−ｐ１３８抗体の主要部分はＤ６００エピトープ（図
１３参照）。このことは、血清中の抗ｐ１３８抗体の検
出には両方の抗原部位が必要であることを示す。図１９
は、プラスミドｐＵＣＡＲＧ１１４０によってコードさ
れる蛋白質を抗原として用いるＥＬＩＳＡ試験を示す。
第１列および第３列：ＥＢＶ陰性血清、第２列：ＮＰＣ
プール血清、第４−１３列：個々のＮＰＣ血清。希釈試
験は下部に示す。左側：ＩｇＧ、右側：ＩｇＡ。図２０
は、カルボキシ末端にオリゴアルギニン基を担持する蛋
白質の精製を示す。（Ａ）５個のアルギニン残基と２個
の停止コドンとをコードするオリゴヌクレオチドの配
列。５′末端に於けるＨｉｎｄ ＩＩＩと３′末端に於
けるＰｓｔＩ部位とは、このオリゴヌクレオチドをｐＵ
Ｃ８中へ挿入することによって生成された。（Ｂ）カル
ボキシ末端に該Ａｒｇ−リンカーを担持する不溶性の発
現真核生物蛋白質の精製スキーム。図２１〜図２４は、
ｇｐ２５０／３５０をコードするＢａｍＩ−断片の左側
読取り枠のＤＮＡ配列を示す。この糖蛋白質のためのコ
ード領域は、ゲノム位置９２１５３から始まり、位置８
９４３３で終わる。図に示した配列は、代表的な陰性鎖
であり、位置９２７０３のＢａｍＨＩ部位から始まる。
この図の配列番号によれば、ｇｐ３５０コード領域は、
位置５５６と３２７６の間にある。塩基対５２０の領域
内のＴＡＴＡＡ−ボックスは・・・で標識され、位置３
２９０の多分ポリアデニル化位置は＋＋＋で標識され
る。スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部
位は、ドナー部位は）（………で、アクセプター部位は
………）（で示される。コード領域のカルボキシ末端付
近の疎水性領域は＊＊＊で標識される。恐らく、このア
ミノ酸配列は、この蛋白質を膜に固着させるためのアン
カー配列として働く。図２５は、ＢａｍＬ−断片の制限
地図とオープン読取り枠とを示す。（Ａ）制限地図：制
限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｐ
ｓｔＩの位置がＢａｍＬ−断片のヌクレオチド位置に対
して示される。（Ｂ）オープン読取り枠：ＢａｍＨＩＬ
−断片のオープン読取り枠が箱として示され、それぞれ
のＤＮＡ配列の両方の極性で与えられる。図２６は、プ
ラスミドｐＵＣＬＰ１．９の制限地図を示す。ｐＵＣ８
のサイズは２．７ｋｂである。１ａｃＵＶ５β−ガラク
トシダーゼプロモーターおよびオペレーター（ＰＯ）の
クローニング領域３′は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ），ＢａｍＨ
Ｉ（Ｂ）、ＳａｌＩ（Ｓ），ＰｓｔＩ（Ｐ），Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（Ｈ）部位を含む。中抜きバーで示されるＢａ
ｍＬ−断片の１．９ｋｂサブ断片をＰｓｔＩ部中へ挿入
した。この読取り枠は、ｐＵＣ８の１ａｃＺコード部分
と同じ配向を有する（太い黒線で示す）。図２７は、プ
ラスミドｐＵＲＬＰ１．９の制限地図を示す。ベクター
ｐＵＲ２９０は、５．２ｋｂの長さを有し、β−ラクタ
マーゼ遺伝子（ＭＡＰ２）からなり、ｐＢＲ３２２の複
製源である。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は太い黒線で
示され、それぞれのプロモーター・オペレーター領域は
ＰＯで示される。制限酵素の略号は下記の通りである。
ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＣｌａＩ（Ｃ）、ＥｃｏＲＩ
（Ｅ）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）、Ｓ
ａｌＩ（Ｓ）。ｐＵＣＬＰ１．９の１．９ｋｂ挿入物は
ＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄ ＩＩＩ部位との間に導入さ
れた。図２８〜図３３は、プラスミドｐＵＲＬＰ１．９
によってコードされる融合蛋白質のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列である。 ｂｐ ４−３０６９：β−ガラクトシダーゼ ｂｐ ３０７０−３０７２：ｐＵＲ２９０リンカー（小
文字で示す） ｂｐ ３０７３−３０８８：多重クローニング部位（Ｂ
ａｍＨＩ−ＰｓｔＩ：小文字で示す） ｂｐ ３０８９〜４９８５：ｇｐ３５０のＰｓｔＩ断片 ｂｐ ４９８６〜４９９４：ｐＵＣ８多重クローニング
部位（ＰｓｔＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ：小文字で示す） ｂｐ ４９９５〜末端：ＰＢＲ３２２配列。図３４は、プラスミドｐＵＲＬＰ１．９によってコード
されるβ−ｇａｌ：ｇｐ３５０蛋白質の発現を示す 。第
１列および第２列は、未誘導の（第１列）およびＩＰＴ
Ｇ誘導の（第２列）ｐＵＲＬＰ１．９含有クローンのク
ーマッシーブルー染色ＰＡＧＥを示す。分子量の異なる
数多くのバンドがあるので、蛋白質の主成分は不完全に
合成されたように思われる。第３列は、ＮＰＣ血清によ
るペルオキシダーゼＤＡＢ染色ウエスタンブロットを示
す。β−ガラクトシダーゼに相当するサイズ１１６ｋＤ
のバンド以外は、新たに発現されたすべての蛋白質は抗
原性である。細菌のバックグラウンドバンドは、使用し
た血清中の高含量の抗菌性抗体によるものである。図３
５は、プラスミドｐＵＲＬＰ１．９によってコードされ
るβ−ｇａｌ：ｇ ｐ３５０融合蛋白質の精製を示す。
（Ａ）クーマッシー染色ゲル；（Ｂ）ＮＰＣ血清で処理
したウエスタンブロット。 第１列：未誘導培養 第２列：ＩＰＴＧ誘導培養 第３列：８Ｍ尿素中に溶解した溶解菌の不溶性蛋白質 第４列：セファローズ２Ｂ−Ｃ１クロマトグラフィー後
プールされたβ−ｇａｌ：ｇｐ３５０蛋白質含有分画図３６は、親水性（黒丸）および疎水性（灰色丸）の相
対的価値物を含むｇｐ３５０のコン−ピューター予測２
次構造を示す 。図に示した尺度では、ループ構造だけが
１８０°のラインターン（ｌｉｎｅｔｕｒｎｓ）として
明瞭に見られる。図３７は、β−ｇａｌ融合蛋白質とし
てのｇｐ３５０断片の発現を示す。プラスミドｐＵＲＬ
ＥＰ６００およびｐＵＲＬＸＰ３９０によってコードさ
れるクーマッシーブルー染色発現産物を上部に示す（ｐ
ＵＲ２８８は対照）。下部には、ＥＢＶ陽性血清との反
応性を示すための免疫染色後の同じプローグを示す。図
３８は、ｐＵＣＬＥＰ６００およびｐＵＣＡＲＧ１２３
４によってコードされる蛋白質の発現とそれらのＥＢＶ
陽性血清に対する反応性とを、ｐＵＲ８を対照として示
す。 上部：クーマッシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 下部：免疫染色ウエスタンブロット。図３９は、ｇｐ２５０／３５０をコードする領域の制限
地図を示す 。黒いバーはｇｐ２５０／３５０をコードす
る領域を示す。さらに、サブクローニングのために用い
られた制限酵素、スプライス部位、実施例１３および１
５−１７で構築された組換え発現プラスミドの挿入物
（ｉｎｓｅｒｔ）が示してある。図４０〜図６１は、Ｅ
ＢＶ関連蛋白質のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配
列を示す。 Ａ．蛋白質 ｐ５４ 試験管内翻訳でｐ４７と同定されたモノクローン性抗体
による免疫沈降と相関がある蛋白質５４のヌクレオチド
配列および誘導されるアミノ酸配列。 Ｂ．蛋白質ｐ９０ Ｃ．蛋白質ｐ１４３ Ｄ．蛋白質ｐ１５０。図６２は、β−ｇａｌ：：ｐ１５０融合蛋白質の発現を
示す 頂部に示したＩＰＴＧ誘導クローンを、溶解後、１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、蛋白質をクーマッシ
ーブルーで染色した。対照としてｐＵＲ２８８をβ−ガ
ラクトシダーゼのサイズを示すために用いた。すべての
クローンが対照クローンよりも大きくかつ挿入物（ｉｎ
ｓｅｒｔ）サイズに相当する新しい蛋白質を産生する。
図６３は、β−ｇａｌ：：ｐ１５０融合蛋白質の抗原性
を示す。図６２に示したクローンからの同じ溶解産物を
ニトロセルロースへ移行し、免疫染色（上掲）によって
ＥＢＶ関連抗原を可視化した。Ｎ末端部分をコードする
クローンは強く反応する。図６４は、ｐ１５０コード領
域の地図である。ｐ１５０コード領域を黒いバーで示
す。サブクローニングのために用いられた制限部位およ
び得られたｐＵＲ−クローンも示してある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:93） (56)参考文献 Ｎａｔｕｖｅ，ｖｏｌ．310，（19 Ｊｕｌｙ 1984）ｐ．207−211 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．43，ｎｏ．２，ｐ．730 −736 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．77，ｎｏ．９ ｐ．5307−5311

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．少なくとも一種のＥＢＶ−関連抗原決定基を有す
    る、蛋白質ｐ２５０／３５０の少なくとも一部分である
    蛋白質であって、下記（ａ）〜（ｈ）のいずれかのプラ
    スミドに含まれるＤＮＡによってコードされる蛋白質： （ａ）図２１〜２２の位置６５０及び１２８４の間の６
    ４３ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片を、ベクタープラスミドｐＵ
    Ｃ１９（ＤＳＭ ３４２５）に挿入することにより得ら
    れ、少なくとも一種のＥＢＶ関連抗原決定基を有する蛋
    白質をコードする該ＤＮＡ配列は融合タンパクをコード
    するＤＮＡ配列である、ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００に含ま
    れる、５′→３′の方向に下記の位置９２０６０から９
    １４２１のＤＮＡ； 【表１】（ｂ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＰｓｔＲ
    Ｉ 断片をＰｓｔＩ−線状化プラスミドｐＵＣＡＲＧ６
    ０１に同じ配向で挿入することにより得られ、該プラス
    ミドｐＵＣＡＲＧ６０１は、ＥＢＶ−ＢａｍＡ断片を含
    むｐＢＲ３２２をＸｈｏＩにより開裂し、得られた３．
    ０ｋｂ ＸｈｏＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ３４２０）の
    ＳａｌＩ開裂部位に正しい配向で、かつｌａｃＵＶ５プ
    ロモーターに対して正しい読取り枠に挿入し、プラスミ
    ドｐＵＣ６３５を得、ｐＵＣ６３５の６００ｂｐ Ｐｓ
    ｔＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）のＰｓｔＩ開
    裂部位に挿入し、プラスミドｐＵＣＰ６００を得、ｐＵ
    Ｃ６００のｐ１３８−関連ＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
    片をｐＵＣ１２（ＤＳＭ ３４２２）のＳｓｔＩ／Ｈｉ
    ｎｄＩＩＩ開裂部位に挿入し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ
    により得られた断片を開裂し、及び得られた６００ｂｐ
    断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に挿入することに
    より得られ、並びに得られたプラスミドの５’−Ｐｓｔ
    Ｉ部位をＳｓｔＩ部位で置換することにより得られる、
    ｐＵＣＡＲＧ１２３０に含まれる、５′→３′の方向に
    下記の位置９２０６０から９１４６０のＤＮＡ； 【表２】 （ｃ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＢａｍＨ
    Ｉ／ＰｓｔＩ断片をベクタープラスミドｐＵＣ８（ＤＳ
    Ｍ ３４２０）に挿入することにより得られるｐＵＣＬ
    ＥＰ６００に含まれる、５′→３′の方向に上記の位置
    ９２０６０から９１４６０のDNA； （ｄ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＢａｍＨ
    Ｉ／ＰｓｔＩ断片をベクタープラスミドｐｕＲ２９１
    （ＤＳＭ ３４１８）に挿入することにより得られるｐ
    ＵＲＬＥＰ６００に含まれる、５′→３′の方向に上記
    の位置９２０６０から９１４６０のＤＮＡ； （ｅ）ＥＢＶ−ＢａｍＬ断片含有ｐＢＲ３２２の１．９
    ｋｂ ＰｓｔＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に
    挿入し、プラスミドｐＵＣＬＰ１．９を得、ｐＵＣＬＰ
    １．９の３８６ｂｐ ＸｍｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
    ベクタープラスミドｐＵＣ１９（ＤＳＭ ３４２５）の
    ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによ
    り得られるｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０に含まれる、５′→
    ３′の方向に下記の位置８９９４８から８９５６３のＤ
    ＮＡ； 【表３】 （ｆ）上記のプラスミドｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０の小Ｂ
    ａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をベクタープラスミドｐ
    ＵＲ２８８（ＤＳＭ ３４１５）に挿入することにより
    得られるｐＵＲＬＸＰ３９０に含まれる、５′→３′の
    方向に上記の位置８９９４８から８９５６３のDNA； （ｇ）図２６に示される制限地図を有し、ＥＢＶ−Ｂａ
    ｍＬ断片含有ｐＢＲ３２２の１．９ｋｂ ＰｓｔＩ断片
    をベクタープラスミドｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に
    挿入することにより得られ、少なくとも一種のＥＢＶ関
    連抗原決定基を有する蛋白質をコードする該ＤＮＡ配列
    は融合タンパクをコードするＤＮＡ配列である、ｐＵＣ
    ＬＰ１．９に含まれる、５′→３′の方向に下記の位置
    ９１４６０から８９５６３のDNA； 【表４】【表５】【表６】（ｈ）図２７に示される制限地図を有し、ｐＵＣＬＰ
    １．９の１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片
    をべクタープラスミドｐＵＲ２９０（ＤＳＭ ３４１
    ７）に挿入することにより得られ、少なくとも一種のＥ
    ＢＶ関連抗原決定基を有する蛋白質をコードする該ＤＮ
    Ａ配列は融合タンパクをコードするＤＮＡ配列である、
    ｐＵＲＬＰ１．９に含まれる、５′→３′の方向に上記
    の位置９１４６０から８９５６３のDNA。 ２．該ＤＮＡが５′及び３′フランクに各調節配列をさ
    らに含む請求項１記載の蛋白質。 ３．該ＤＮＡが、３′末端に３〜１５の、正しい読取り
    枠中に位置したアルギニンコドンと、それに続く少なく
    とも一個の停止コドンを含む、請求項１又は２のいずれ
    か一項に記載の蛋白質。 ４．該ＤＮＡが、５′末端に、得られたポリペプチド中
    で配列特異的なプロテアーゼの開裂部位として機能する
    か又は酸による酸処理により開裂可能なオリゴペプチド
    をコードするオリゴヌクレオチドを有する、請求項１、
    ２又は３のいずれか一項に記載の蛋白質。 ５．抗ＥＢＶ抗体の検出を行うための診断用組成物であ
    って、蛋白質ｐ２５０／３５０の少なくとも一部分であ
    る蛋白質を、試料中の該抗ＥＢＶ抗体と結合するのに十
    分な量含み、該蛋白質が下記（ａ）〜（ｈ）のいずれか
    のプラスミドに含まれるＤＮＡによってコードされる組
    成物： （ａ）図２１〜２２の位置６５０及び１２８４の間の６
    ４３ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片を、ベクタープラスミドｐＵ
    Ｃ１９（ＤＳＭ ３４２５）に挿入することにより得ら
    れ、少なくとも一種のＥＢＶ関連抗原決定基を有する蛋
    白質をコードする該ＤＮＡ配列は融合タンパクをコード
    するＤＮＡ配列である、ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００に含ま
    れる、５′→３′の方向に下記の位置９２０６０から９
    １４２１のＤＮＡ； 【表１】（ｂ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＰｓｔＲ
    Ｉ 断片をＰｓｔＩ−線状化プラスミドｐＵＣＡＲＧ６
    ０１に同じ配向で挿入することにより得られ、該プラス
    ミドｐＵＣＡＲＧ６０１は、ＥＢＶ−ＢａｍＡ断片を含
    むｐＢＲ３２２をＸｈｏＩにより開裂し、得られた３．
    ０ｋｂ ＸｈｏＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ３４２０）の
    ＳａｌＩ開裂部位に正しい配向で、かつｌａｃＵＶ５プ
    ロモーターに対して正しい読取り枠に挿入し、プラスミ
    ドｐＵＣ６３５を得、ｐＵＣ６３５の６００ｂｐ Ｐｓ
    ｔＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）のＰｓｔＩ開
    裂部位に挿入し、プラスミドｐＵＣＰ６００を得、ｐＵ
    Ｃ６００のｐ１３８−関連ＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
    片をｐＵＣ１２（ＤＳＭ ３４２２）のＳｓｔＩ／Ｈｉ
    ｎｄＩＩＩ開裂部位に挿入し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ
    により得られた断片を開裂し、及び得られた６００ｂｐ
    断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に挿入することに
    より得られ、並びに得られたプラスミドの５’−Ｐｓｔ
    Ｉ部位をＳｓｔＩ部位で置換することにより得られる、
    ｐＵＣＡＲＧ１２３０に含まれる、５′→３′の方向に
    下記の位置９２０６０から９１４６０のＤＮＡ； 【表２】 （ｃ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＢａｍＨ
    Ｉ／ＰｓｔＩ断片をベクタープラスミドｐＵＣ８（ＤＳ
    Ｍ ３４２０）に挿入することにより得られるｐＵＣＬ
    ＥＰ６００に含まれる、５′→３′の方向に上記の位置
    ９２０６０から９１４６０のDNA； （ｄ）ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００の６００ｂｐ ＢａｍＨ
    Ｉ／ＰｓｔＩ断片をベクタープラスミドｐｕＲ２９１
    （ＤＳＭ ３４１８）に挿入することにより得られるｐ
    ＵＲＬＥＰ６００に含まれる、５′→３′の方向に上記
    の位置９２０６０から９１４６０のＤＮＡ； （ｅ）ＥＢＶ−ＢａｍＬ断片含有ｐＢＲ３２２の１．９
    ｋｂ ＰｓｔＩ断片をｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に
    挿入し、プラスミドｐＵＣＬＰ１．９を得、ｐＵＣＬＰ
    １．９の３８６ｂｐ ＸｍｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
    ベクタープラスミドｐＵＣ１９（ＤＳＭ ３４２５）の
    ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによ
    り得られるｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０に含まれる、５′→
    ３′の方向に下記の位置８９９４８から８９５６３のＤ
    ＮＡ； 【表３】 （ｆ）上記のプラスミドｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０の小Ｂ
    ａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をベクタープラスミドｐ
    ＵＲ２８８（ＤＳＭ ３４１５）に挿入することにより
    得られるｐＵＲＬＸＰ３９０に含まれる、５′→３′の
    方向に上記の位置８９９４８から８９５６３のDNA； （ｇ）図２６に示される制限地図を有し、ＥＢＶ−Ｂａ
    ｍＬ断片含有ｐＢＲ３２２の１．９ｋｂ ＰｓｔＩ断片
    をベクタープラスミドｐＵＣ８（ＤＳＭ ３４２０）に
    挿入することにより得られ、少なくとも一種のＥＢＶ関
    連抗原決定基を有する蛋白質をコードする該ＤＮＡ配列
    は融合タンパクをコードするＤＮＡ配列である、ｐＵＣ
    ＬＰ１．９に含まれる、５′→３′の方向に下記の位置
    ９１４６０から８９５６３のDNA； 【表４】【表５】【表６】（ｈ）図２７に示される制限地図を有し、ｐＵＣＬＰ
    １．９の１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片
    をべクタープラスミドｐＵＲ２９０（ＤＳＭ ３４１
    ７）に挿入することにより得られ、少なくとも一種のＥ
    ＢＶ関連抗原決定基を有する蛋白質をコードする該ＤＮ
    Ａ配列は融合タンパクをコードするＤＮＡ配列である、
    ｐＵＲＬＰ１．９に含まれる、５′→３′の方向に上記
    の位置９１４６０から８９５６３のDNA。
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