JPH08191695A - Ebvゲノムのdna配列 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エプスタインバルウイルス(EBV)関連抗
原蛋白質をコードするDNAを提供すること。 【解決手段】 EBV関連抗原蛋白質p150、p14
3、p138、p110、p105、p90、p80、
p54またはgp250/350の少なくとも一部分に
対応するDNA。
原蛋白質をコードするDNAを提供すること。 【解決手段】 EBV関連抗原蛋白質p150、p14
3、p138、p110、p105、p90、p80、
p54またはgp250/350の少なくとも一部分に
対応するDNA。
Description
【0001】発明の技術分野 本発明は、以下に述べる方法ならびに診断用および製剤
組成物に用いられるべきEBV関連抗原の少なくとも部
分のためにコードするEBVゲノムのDNA配列ならび
にそれぞれのDNA配列の少なくとも部分の位置決定お
よび単離方法に関する。さらに、本発明は、細菌、酵
母、哺乳動物細胞のような適当な宿主中へ導入された
後、該EBV関連抗原の抗原決定基の産生のために有用
である組換えDNA分子すなわちクローニングおよび発
現ベクターに関する。さらに、本発明は、EBV関連抗
原に対する抗体の迅速、簡単、高感度、高度特異的な決
定のためのそれぞれの方法および組成物またはキットに
も関する。これらの試験に於て、EBVの異なる抗原を
用いて、これらの抗原に対する患者の血清中の特異抗体
群を検出する。この検出は、前感染、新感染、慢性感
染、回復および腫瘍(neoplastic)状態のよ
うな血清供与者の感染の状態に関するかなり信頼できる
結論を可能にする。さらに、本発明は、EBV関連疾患
の予防および治療に有用な該抗原を含有する製剤組成物
例えばワクチンに関する。
組成物に用いられるべきEBV関連抗原の少なくとも部
分のためにコードするEBVゲノムのDNA配列ならび
にそれぞれのDNA配列の少なくとも部分の位置決定お
よび単離方法に関する。さらに、本発明は、細菌、酵
母、哺乳動物細胞のような適当な宿主中へ導入された
後、該EBV関連抗原の抗原決定基の産生のために有用
である組換えDNA分子すなわちクローニングおよび発
現ベクターに関する。さらに、本発明は、EBV関連抗
原に対する抗体の迅速、簡単、高感度、高度特異的な決
定のためのそれぞれの方法および組成物またはキットに
も関する。これらの試験に於て、EBVの異なる抗原を
用いて、これらの抗原に対する患者の血清中の特異抗体
群を検出する。この検出は、前感染、新感染、慢性感
染、回復および腫瘍(neoplastic)状態のよ
うな血清供与者の感染の状態に関するかなり信頼できる
結論を可能にする。さらに、本発明は、EBV関連疾患
の予防および治療に有用な該抗原を含有する製剤組成物
例えばワクチンに関する。
【0002】背景技術 ヘルペスウイルス〔ヘルペトビリジアエ(Herpet
oviridiae)〕は、全直径150nmの包囲2
0面体カプシドである。ウイルスゲノムは、分子量約1
0Dの2本鎖DNAからなっている。ヒトのヘルペスウ
イルスは、ヘルペスシンプレックスI(“単純疱
疹”)、ヘルペスシンプレックスII(陰部疱疹)、バ
リセラーゾスター(Varicella−Zoste
r)(水痘、帯状疱疹)、チトメガロウイルス(cyt
omegalovirus)(先天性奇形、例えば小頭
症)、およびエプスタイン−バル(Epstein−B
arr)ウイルス(EBV)〔伝染性単核症(IM),
バーキットの(Burkitt’s)リンパ腫(B
L)、鼻咽頭癌(NPC)〕である。ヘルペスウイルス
は、宿主の一生の間持続する可能性のある潜在的感染を
つくり上げる顕著な性質を示す。1次感染後、ヘルペス
ウイルスは、照射や免疫抑圧のような、幾つかの公知の
型の刺激の1つによって活性化されるまでは、休止して
いるか、あるいは散在的にだけ見られるかあるいは全く
見られない。かかる内因性疾患の再発は、ヘルペスシン
プレックスまたはゾスター(zoster)の場合には
皮膚上の小庖疹の集まりの形をとり、あるいはチトメガ
ロウイルス(Cytomegalovirus)または
EBVの場合にはより一般化された結果を示す可能性が
ある。潜在的感染として無期限に存続するこの能力のた
めに、これらのウイルスは事実上長期間生存することが
できる。ここ数年間、ヒトの癌とEBVとの相関に注意
が向けられている。
oviridiae)〕は、全直径150nmの包囲2
0面体カプシドである。ウイルスゲノムは、分子量約1
0Dの2本鎖DNAからなっている。ヒトのヘルペスウ
イルスは、ヘルペスシンプレックスI(“単純疱
疹”)、ヘルペスシンプレックスII(陰部疱疹)、バ
リセラーゾスター(Varicella−Zoste
r)(水痘、帯状疱疹)、チトメガロウイルス(cyt
omegalovirus)(先天性奇形、例えば小頭
症)、およびエプスタイン−バル(Epstein−B
arr)ウイルス(EBV)〔伝染性単核症(IM),
バーキットの(Burkitt’s)リンパ腫(B
L)、鼻咽頭癌(NPC)〕である。ヘルペスウイルス
は、宿主の一生の間持続する可能性のある潜在的感染を
つくり上げる顕著な性質を示す。1次感染後、ヘルペス
ウイルスは、照射や免疫抑圧のような、幾つかの公知の
型の刺激の1つによって活性化されるまでは、休止して
いるか、あるいは散在的にだけ見られるかあるいは全く
見られない。かかる内因性疾患の再発は、ヘルペスシン
プレックスまたはゾスター(zoster)の場合には
皮膚上の小庖疹の集まりの形をとり、あるいはチトメガ
ロウイルス(Cytomegalovirus)または
EBVの場合にはより一般化された結果を示す可能性が
ある。潜在的感染として無期限に存続するこの能力のた
めに、これらのウイルスは事実上長期間生存することが
できる。ここ数年間、ヒトの癌とEBVとの相関に注意
が向けられている。
【0003】エプスタイン−バルウイルス(EBV)、
感染とその結果 EBVは第1次疾患として伝染性単核症を生ずる。主と
して子供または若年成人に起こる。平均成人人口の90
%以上が、抹消B−リンパ球内に一生存続するEBVで
感染されている。このウイルスは耳下腺中で産生され、
経口ルートによって広がる。血清学は、2種のヒトの腫
瘍性(neolastic)疾患、アフリカン バーキ
ット リンパ腫(African Burkitt’s
lymphoma)(BL)および鼻咽頭癌(NP
C)の惹起にEBVが関与する可能性があることを示唆
している。伝染性単核症はEBVによる1次感染の1つ
の結果である。伝染性単核症は、付加的な危険因子が無
ければ生命を脅かす疾患ではない。しかし、しばしば長
期間(数週間程度)の自覚的病気感情と脾臓破裂の危険
が劇的に増すための物理的ストレスを避ける必要性と
が、確かにこの疾患の抑制を示唆するであろう。
感染とその結果 EBVは第1次疾患として伝染性単核症を生ずる。主と
して子供または若年成人に起こる。平均成人人口の90
%以上が、抹消B−リンパ球内に一生存続するEBVで
感染されている。このウイルスは耳下腺中で産生され、
経口ルートによって広がる。血清学は、2種のヒトの腫
瘍性(neolastic)疾患、アフリカン バーキ
ット リンパ腫(African Burkitt’s
lymphoma)(BL)および鼻咽頭癌(NP
C)の惹起にEBVが関与する可能性があることを示唆
している。伝染性単核症はEBVによる1次感染の1つ
の結果である。伝染性単核症は、付加的な危険因子が無
ければ生命を脅かす疾患ではない。しかし、しばしば長
期間(数週間程度)の自覚的病気感情と脾臓破裂の危険
が劇的に増すための物理的ストレスを避ける必要性と
が、確かにこの疾患の抑制を示唆するであろう。
【0004】伝染性単核症の臨床的診断は、通常、下記
のパラメーターの組み合わせから誘導される。 1. 10,000〜20,000、そして50,00
0にまで達する高い白血球数。 2. 10%の異型細胞 3. リンパ節炎 4. 熱があること 伝染性単核症の患者は唾液中にEBVを放散する。この
ウイルス放散では、流行および近接者の感染は稀である
ので、この病気の蔓延に対して特別な予防を必要としな
い〔A.S.エバンス(A.S.Evans)、“EB
ウイルス感染の伝達、経口薬物に於けるウイルス感染
(The Transmission of EB v
iral infections,Viral Inf
ections in Oral Medicin
e)”、J.フックス、G.ジョーダン(J.Hook
s,G.Jordan)編著、エルスビアノースホラン
ドアムステルダム(Elsevier North H
olland Amsterdam),p.211(1
982)〕。ウイルス放散は病気の回復によっては止ま
らず、成人人口の少なくとも60%(おそらくは100
%まで)が、耳下腺の唾液腺管の上皮細胞中で生涯産出
される少なくとも低いレベルのEBVを放散する[H.
ウォルフ、M.ハウス、E.ウイルメス(H.Wol
f,M.Haus,E.Wilmes)、“耳下腺中に
於けるエプスタイン・バルウイルスの存続(Persi
stence of Epstein−Barrvir
us in the parotid glan
d)”、J.Virol.,51(1984)]。
のパラメーターの組み合わせから誘導される。 1. 10,000〜20,000、そして50,00
0にまで達する高い白血球数。 2. 10%の異型細胞 3. リンパ節炎 4. 熱があること 伝染性単核症の患者は唾液中にEBVを放散する。この
ウイルス放散では、流行および近接者の感染は稀である
ので、この病気の蔓延に対して特別な予防を必要としな
い〔A.S.エバンス(A.S.Evans)、“EB
ウイルス感染の伝達、経口薬物に於けるウイルス感染
(The Transmission of EB v
iral infections,Viral Inf
ections in Oral Medicin
e)”、J.フックス、G.ジョーダン(J.Hook
s,G.Jordan)編著、エルスビアノースホラン
ドアムステルダム(Elsevier North H
olland Amsterdam),p.211(1
982)〕。ウイルス放散は病気の回復によっては止ま
らず、成人人口の少なくとも60%(おそらくは100
%まで)が、耳下腺の唾液腺管の上皮細胞中で生涯産出
される少なくとも低いレベルのEBVを放散する[H.
ウォルフ、M.ハウス、E.ウイルメス(H.Wol
f,M.Haus,E.Wilmes)、“耳下腺中に
於けるエプスタイン・バルウイルスの存続(Persi
stence of Epstein−Barrvir
us in the parotid glan
d)”、J.Virol.,51(1984)]。
【0005】伝染性単核症例の約1%は、該疾患の初期
に於て既に、あるいはその後の帰結として合併症を示
す。ほとんどの合併症は自己免疫機構によるものであ
り、ある症例では身体がEBV転化、増殖性B細胞の過
剰を除去することができる機構による対宿主移植片症と
区別することができない。例えばコルチコステロイドと
の併用に於ける高い投与量のシクロポリンAによる治療
のような環境あるいはプルティロ(Purtilo)記
載のようなA.I.D.Sまたはある種の遺伝的疾病素
質〔ダンカン(Duncan’s)症候群、X染色体連
鎖リンパ増殖症(XLP);D.T.プルティロ、K.
サカモト、V.バルナベイ、J.シーリー、T.ベクト
ルグ、G.ロジャーズ、J.イエッツ、S.ハラダ
(D.T.Purtilo,K.Sakamoto,
V.Barnabei,J.Seeley,T.Bec
htolg,G.Rogers,J.Yets,S.H
arada)、およびXLP共同研究者:“X連鎖リン
パ増殖症候群(X−linked lympho−pr
oliferative syndrone)(XL
P)をもつ少年に於けるエプスタイン−バルウイルス誘
発疾患、最近までの登録研究(Epstein−Bar
rvirus−induceddiseases in
boys With the X−linked l
ympho−proliferative syndr
one(XLP),Update on studie
s of the registry)”,Am.J.
Med.,73,p49(1982)〕のためにT細胞
応答が不十分な場合には、感染したB細胞は、宿主の制
御から逃れて、試験管内で培養されるときになすであろ
うように制限無く増殖する機会をもつ可能性がある。こ
の結果は、AIDS患者の場合にはBL様疾患として
〔J.L.ジーグラー、R.C.マイナー、E.ローゼ
ンバウム、E.T.レンネッテ、E.シリトエ、C.カ
サバント、W.L.ドリュー、L.ミンツ、J.ゲルシ
ョア、J.グリーンスパン、J.ベックステッド、K.
ヤマモト(J.L.Ziegler,R.C.Mine
r,E.Rosenbaum,E.T.Lennett
e,E.Shillitoe,C.Casavant,
W.L.Drew,L.Mintz,J.Gersho
r,J.Greenspan,J.Beckstea
d,K.Yamamoto),“同性愛男子に於けるバ
ーキット(Burkitt’s)様リンパ腫の発現(O
utbreak of Burkitt’s−like
lymphoma in homosexual m
en)”、ランセット(Lancet)2,p.631
(1982)〕、あるいはXLP患者〔D.T.プロテ
ィロ(D.T.Purtilo)ら、上掲〕または腎臓
移植受納者〔D.W.ハント、G.フリッツェラ、D.
T.プロティロ、K.サカモト、J.L.サリバン、
A.K.サエムンドセン、G.クライン、R.L.シモ
ンズ、J.S.ナジャリアン(D.W.Hanto,
G.Frizzera,G.T.Purtilo,K.
Sakamoto,J.L.Sullivan,A.
K.Saemundsen,G.Klein,R.L.
Simons,J.S.Najarian)、“腎臓移
植受納者に於けるリンパ増殖性障害の臨床スペクトルお
よびエプスタイン・バル(Epstein−Barr)
ウイルスの役割の証拠(Clinical Spect
rum of lympno−pro−liferat
ive disorders in renal tr
ansplant recipients and e
vidence for the rol of Ep
stein−Barr virus)”,Canser
Res.,41,p.4253(1981)〕では多
クローン性リンパ増殖性疾患として記載された。
に於て既に、あるいはその後の帰結として合併症を示
す。ほとんどの合併症は自己免疫機構によるものであ
り、ある症例では身体がEBV転化、増殖性B細胞の過
剰を除去することができる機構による対宿主移植片症と
区別することができない。例えばコルチコステロイドと
の併用に於ける高い投与量のシクロポリンAによる治療
のような環境あるいはプルティロ(Purtilo)記
載のようなA.I.D.Sまたはある種の遺伝的疾病素
質〔ダンカン(Duncan’s)症候群、X染色体連
鎖リンパ増殖症(XLP);D.T.プルティロ、K.
サカモト、V.バルナベイ、J.シーリー、T.ベクト
ルグ、G.ロジャーズ、J.イエッツ、S.ハラダ
(D.T.Purtilo,K.Sakamoto,
V.Barnabei,J.Seeley,T.Bec
htolg,G.Rogers,J.Yets,S.H
arada)、およびXLP共同研究者:“X連鎖リン
パ増殖症候群(X−linked lympho−pr
oliferative syndrone)(XL
P)をもつ少年に於けるエプスタイン−バルウイルス誘
発疾患、最近までの登録研究(Epstein−Bar
rvirus−induceddiseases in
boys With the X−linked l
ympho−proliferative syndr
one(XLP),Update on studie
s of the registry)”,Am.J.
Med.,73,p49(1982)〕のためにT細胞
応答が不十分な場合には、感染したB細胞は、宿主の制
御から逃れて、試験管内で培養されるときになすであろ
うように制限無く増殖する機会をもつ可能性がある。こ
の結果は、AIDS患者の場合にはBL様疾患として
〔J.L.ジーグラー、R.C.マイナー、E.ローゼ
ンバウム、E.T.レンネッテ、E.シリトエ、C.カ
サバント、W.L.ドリュー、L.ミンツ、J.ゲルシ
ョア、J.グリーンスパン、J.ベックステッド、K.
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e,E.Shillitoe,C.Casavant,
W.L.Drew,L.Mintz,J.Gersho
r,J.Greenspan,J.Beckstea
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ーキット(Burkitt’s)様リンパ腫の発現(O
utbreak of Burkitt’s−like
lymphoma in homosexual m
en)”、ランセット(Lancet)2,p.631
(1982)〕、あるいはXLP患者〔D.T.プロテ
ィロ(D.T.Purtilo)ら、上掲〕または腎臓
移植受納者〔D.W.ハント、G.フリッツェラ、D.
T.プロティロ、K.サカモト、J.L.サリバン、
A.K.サエムンドセン、G.クライン、R.L.シモ
ンズ、J.S.ナジャリアン(D.W.Hanto,
G.Frizzera,G.T.Purtilo,K.
Sakamoto,J.L.Sullivan,A.
K.Saemundsen,G.Klein,R.L.
Simons,J.S.Najarian)、“腎臓移
植受納者に於けるリンパ増殖性障害の臨床スペクトルお
よびエプスタイン・バル(Epstein−Barr)
ウイルスの役割の証拠(Clinical Spect
rum of lympno−pro−liferat
ive disorders in renal tr
ansplant recipients and e
vidence for the rol of Ep
stein−Barr virus)”,Canser
Res.,41,p.4253(1981)〕では多
クローン性リンパ増殖性疾患として記載された。
【0006】伝染性単核症または急性EBV感染の確実
かつ迅速な同定は、白血病に対する鑑別診断、あるいは
移植受納者の場合に於ける移植拒絶発症に対する鑑別診
断が必要な場合には特に重要である。これらの場合に、
誤った診断は正しくない治療に導き、重大な、生命を脅
かす結果をもたらす可能性がある。EBVで起こされる1次疾患の予防 伝染性単核症は、一生の極めて早い時期にEBVによる
感染が起こるフィリッピンやマレーシアのような地域で
は知られていないように思われる〔D.S.K.タン
(D.S.K.Tan)、“マラヤに於けるアジア人の
間には伝染性単核症は無い(Absence of i
nfectious mononucleosis a
mong Asians in Malaya)”,M
ed.J.Malaya 21 p.358(196
7)〕。ほとんど全人口が遅くとも2〜10才には抗体
を持っている。臨床的徴候は若年感染または成年感染の
結果であるように患われる。ワクチンで感作された生体
は、顕著な臨床的症状なしに感染され、上に挙げた危険
群に於けるしばしばの致死の結果がワクチンによって除
かれると仮定することができる。
かつ迅速な同定は、白血病に対する鑑別診断、あるいは
移植受納者の場合に於ける移植拒絶発症に対する鑑別診
断が必要な場合には特に重要である。これらの場合に、
誤った診断は正しくない治療に導き、重大な、生命を脅
かす結果をもたらす可能性がある。EBVで起こされる1次疾患の予防 伝染性単核症は、一生の極めて早い時期にEBVによる
感染が起こるフィリッピンやマレーシアのような地域で
は知られていないように思われる〔D.S.K.タン
(D.S.K.Tan)、“マラヤに於けるアジア人の
間には伝染性単核症は無い(Absence of i
nfectious mononucleosis a
mong Asians in Malaya)”,M
ed.J.Malaya 21 p.358(196
7)〕。ほとんど全人口が遅くとも2〜10才には抗体
を持っている。臨床的徴候は若年感染または成年感染の
結果であるように患われる。ワクチンで感作された生体
は、顕著な臨床的症状なしに感染され、上に挙げた危険
群に於けるしばしばの致死の結果がワクチンによって除
かれると仮定することができる。
【0007】バーキット(Burkitt’s)リンパ
腫とEBV バーキット(Burkitt’s)リンパ腫の発生は、
染色体再配列と関連している。すべての症例がリンパ腫
細胞中にEBVゲノムを含有しているわけではないが、
少なくとも高い出現率をもつ地域では、これらの腫瘍の
97%がEBV関連であり、EBV感染の抑制がバーキ
ット(Burkitt’s)リンパ腫の危険を少なくす
るらしい。EBV関連の可能な“2次疾患”としての鼻咽頭癌 EBVが100%の関連を示す他の疾患は鼻咽頭癌(N
PC)である〔M.J.シモンズとK.シャンムガラト
ナム(M.J.Simons and K.Shanm
ugaratnam)編著、“鼻咽頭癌の生物学(Th
e Biology of Nasopharynga
l Carcinoma)”UICCテクニカルレポー
トシリーズ(UICC technical repo
rt Series)、インターナショナルユニオンア
ゲインストカンサー(International U
nion Against Cancer)、ジュネー
ブ、p.1、(1982)〕。NPCは、ほとんどしば
しば、後鼻腔のローゼンミュレル癌(咽頭癌)から始ま
る。しばしば、患者は、頸部リンパ節に最初の典型的な
転移が生じた後にしか入院させられない。
腫とEBV バーキット(Burkitt’s)リンパ腫の発生は、
染色体再配列と関連している。すべての症例がリンパ腫
細胞中にEBVゲノムを含有しているわけではないが、
少なくとも高い出現率をもつ地域では、これらの腫瘍の
97%がEBV関連であり、EBV感染の抑制がバーキ
ット(Burkitt’s)リンパ腫の危険を少なくす
るらしい。EBV関連の可能な“2次疾患”としての鼻咽頭癌 EBVが100%の関連を示す他の疾患は鼻咽頭癌(N
PC)である〔M.J.シモンズとK.シャンムガラト
ナム(M.J.Simons and K.Shanm
ugaratnam)編著、“鼻咽頭癌の生物学(Th
e Biology of Nasopharynga
l Carcinoma)”UICCテクニカルレポー
トシリーズ(UICC technical repo
rt Series)、インターナショナルユニオンア
ゲインストカンサー(International U
nion Against Cancer)、ジュネー
ブ、p.1、(1982)〕。NPCは、ほとんどしば
しば、後鼻腔のローゼンミュレル癌(咽頭癌)から始ま
る。しばしば、患者は、頸部リンパ節に最初の典型的な
転移が生じた後にしか入院させられない。
【0008】中国南部のある地域で、またシンガポール
やマレーシアの中国人の中では、NPCは、1年につき
100,000人あたり40人までの出現率をもち、最
も頻度の高い腫瘍である。ボルネオやチュニジア(Tu
nesia)のような世界の他の地域でも出現率が高
い。ほとんどのその他の地域では、出現率は、1年につ
き100,000人当り約0.2人であり、耳、鼻、咽
頭(ENT)の腫瘍の約4%を示す。ほとんどすべての
高危険地域に於て、年令分布は、約40〜50才の明ら
かな単一ピークを示す。しかし、ボルネオに於て、およ
びチュニジア(Tunesia)ではある程度、5〜1
5才の若年層に顕著な第2ピークが見られる〔M.J.
シモンズ(M.J.Simons)ら、上掲〕。伝統的
な中国医療を含む環境因子が、南アジアのある人口、主
として中国人人口中の鼻咽頭癌の危険を増した原因であ
る可能性がある(“免疫欠失と癌:エプスタイン−バル
ウイルスとリンパ増殖性悪性度(Immune def
iciency and cancer:Epstei
n−Barr virus and lymphopr
oliferative malignancie
s)”、D.フルティロ(D.Purtilo)編集、
プレナムプレス(PlenumPress)p.233
(1984)中のHウルフ(H.Wolf)著“エプス
タイン−バルウイルスの生物学(Biology of
Epstein−Barr virus)”〕
やマレーシアの中国人の中では、NPCは、1年につき
100,000人あたり40人までの出現率をもち、最
も頻度の高い腫瘍である。ボルネオやチュニジア(Tu
nesia)のような世界の他の地域でも出現率が高
い。ほとんどのその他の地域では、出現率は、1年につ
き100,000人当り約0.2人であり、耳、鼻、咽
頭(ENT)の腫瘍の約4%を示す。ほとんどすべての
高危険地域に於て、年令分布は、約40〜50才の明ら
かな単一ピークを示す。しかし、ボルネオに於て、およ
びチュニジア(Tunesia)ではある程度、5〜1
5才の若年層に顕著な第2ピークが見られる〔M.J.
シモンズ(M.J.Simons)ら、上掲〕。伝統的
な中国医療を含む環境因子が、南アジアのある人口、主
として中国人人口中の鼻咽頭癌の危険を増した原因であ
る可能性がある(“免疫欠失と癌:エプスタイン−バル
ウイルスとリンパ増殖性悪性度(Immune def
iciency and cancer:Epstei
n−Barr virus and lymphopr
oliferative malignancie
s)”、D.フルティロ(D.Purtilo)編集、
プレナムプレス(PlenumPress)p.233
(1984)中のHウルフ(H.Wolf)著“エプス
タイン−バルウイルスの生物学(Biology of
Epstein−Barr virus)”〕
【0009】EBV関連腫瘍形成の抑制 腫瘍形成の抑制には、3つの可能な基本的戦略がある。 1. 早期発見とそれに続く治療 2. 理想的には寿命を越えて発病を遅らせること 3. 予防 これらの目的は、多くの腫瘍形成のような多因性疾患に
於ても達成され得る。それ自体では罹病させるのに必ず
しも十分でない本質的な1つ以上の因子を除くことによ
って、あるいは腫瘍症状の発現を促進する因子を減らす
ことによって、疾患出現率を減少させることができる。
本発明の特異的ウイルス関連抗原、あるいは抗体または
遺伝物質を、ウイルス関連腫瘍の早期診断の道具として
使用することにより、本質的な因子の除去を容易にする
ことができる。
於ても達成され得る。それ自体では罹病させるのに必ず
しも十分でない本質的な1つ以上の因子を除くことによ
って、あるいは腫瘍症状の発現を促進する因子を減らす
ことによって、疾患出現率を減少させることができる。
本発明の特異的ウイルス関連抗原、あるいは抗体または
遺伝物質を、ウイルス関連腫瘍の早期診断の道具として
使用することにより、本質的な因子の除去を容易にする
ことができる。
【0010】EBV関連NPCの診断のためのEBV関
連遺伝子産物の選択 A.EBVによる1次感染 :VCA(ウイルスカプシド
抗原)、EA(初期抗原(early・antige
n)〕,EBNA〔エプスタイン−バル核抗原(Eps
tein−Barr Nuclear Antige
n)〕に対する抗体の発生 EBVは、急性または1次感染中にBリンパ球を感染す
る(単核症)。免疫応答が無いため、多数の細胞が溶解
サイクル(lytic cycle)中に入り、完全な
1組のウイルス抗原を産生し、抗原は、細胞溶解中に血
流中へ放出される。これらの抗原に対して、宿主の免疫
系によって特異抗体が合成される(表A)。恐らく、E
BVの発現を抑制する細胞因子のために、すべてのBリ
ンパ球が十分に溶解性の感染を支持する能力があるわけ
ではない。これらの細胞は、宿主の一生の残りの期間E
BVゲノムを潜在的に担持している。
連遺伝子産物の選択 A.EBVによる1次感染 :VCA(ウイルスカプシド
抗原)、EA(初期抗原(early・antige
n)〕,EBNA〔エプスタイン−バル核抗原(Eps
tein−Barr Nuclear Antige
n)〕に対する抗体の発生 EBVは、急性または1次感染中にBリンパ球を感染す
る(単核症)。免疫応答が無いため、多数の細胞が溶解
サイクル(lytic cycle)中に入り、完全な
1組のウイルス抗原を産生し、抗原は、細胞溶解中に血
流中へ放出される。これらの抗原に対して、宿主の免疫
系によって特異抗体が合成される(表A)。恐らく、E
BVの発現を抑制する細胞因子のために、すべてのBリ
ンパ球が十分に溶解性の感染を支持する能力があるわけ
ではない。これらの細胞は、宿主の一生の残りの期間E
BVゲノムを潜在的に担持している。
【0011】B.回復期:EAに対する抗体の消失なら
びにVCAおよびEBNAに対する抗体の保持 身体の免疫防禦機構が、溶解的に感染させられた細胞を
循環から取り除くので、抗体レベルは回復期中に低下し
始める。しかし、上述したように、EBVは耳下腺中で
産生される。ウイルス粒子とEAを含む細胞内ウイルス
関連抗原とは唾液中へ放出され、中咽頭に達する。ここ
でウイルス粒子はBリンパ球に結合し、抗原として身体
へ提示され、かくしてVCAに対する抗体力価が保たれ
る。EAは、リンパ球に結合できないので、プロテアー
ゼによって分解され、従って免疫系に対して抗体産生性
抗原として有効ではない。EBVによって潜在的に感染
された循環リンパ球はEBNAを含有する。その生活環
の終わりに、これらの細胞は破壊して、EBNAを血液
中へ放出する。従って、この抗原に対する抗体は存続す
る。かくして、耳下腺中に於けるEBV産生と潜在的感
染B細胞からのEBNAの放出とのために、回復患者の
血清は、抗VCAおよび抗EBNA IgG抗体レベル
が低い(上記表A参照)。加えて、溶解サイクル(ly
tic cycle)に入り得る稀なBリンパ球から放
出されるEAは、低劣な抗原である可能性があり、使用
する試験系で検出できる抗体レベルを生じないかもしれ
ない。抗体群の出現の公知の順序、特に1gM抗体の初
期の存在およびそれに続くIgG抗体の存在の順序と組
合わせて、EBVで惹起される1次疾患の種々の抗原群
を、改良診断法に利用することができる。しかし、主と
して細胞抗原または細胞誘導抗原に基づく使用可能な試
験系には、重大な制限がある。これは、感度、特にIg
M抗体の検出に対する感度に関し、非特異的反応にも関
する。
びにVCAおよびEBNAに対する抗体の保持 身体の免疫防禦機構が、溶解的に感染させられた細胞を
循環から取り除くので、抗体レベルは回復期中に低下し
始める。しかし、上述したように、EBVは耳下腺中で
産生される。ウイルス粒子とEAを含む細胞内ウイルス
関連抗原とは唾液中へ放出され、中咽頭に達する。ここ
でウイルス粒子はBリンパ球に結合し、抗原として身体
へ提示され、かくしてVCAに対する抗体力価が保たれ
る。EAは、リンパ球に結合できないので、プロテアー
ゼによって分解され、従って免疫系に対して抗体産生性
抗原として有効ではない。EBVによって潜在的に感染
された循環リンパ球はEBNAを含有する。その生活環
の終わりに、これらの細胞は破壊して、EBNAを血液
中へ放出する。従って、この抗原に対する抗体は存続す
る。かくして、耳下腺中に於けるEBV産生と潜在的感
染B細胞からのEBNAの放出とのために、回復患者の
血清は、抗VCAおよび抗EBNA IgG抗体レベル
が低い(上記表A参照)。加えて、溶解サイクル(ly
tic cycle)に入り得る稀なBリンパ球から放
出されるEAは、低劣な抗原である可能性があり、使用
する試験系で検出できる抗体レベルを生じないかもしれ
ない。抗体群の出現の公知の順序、特に1gM抗体の初
期の存在およびそれに続くIgG抗体の存在の順序と組
合わせて、EBVで惹起される1次疾患の種々の抗原群
を、改良診断法に利用することができる。しかし、主と
して細胞抗原または細胞誘導抗原に基づく使用可能な試
験系には、重大な制限がある。これは、感度、特にIg
M抗体の検出に対する感度に関し、非特異的反応にも関
する。
【0012】C.NPCに罹患した個体中のEBV関連
抗体:エプスタイン−バル(Epstein−Bar
r)ウイルスが鼻咽頭癌およびアフリカバーキットリン
パ腫(African Burkitt’s Lymp
homa)に原因として関連する可能性があるという第
1の示唆的な証拠が血清学的データから誘導された(総
説として、M.A.エプスタイン、B.G.アコング
(M.A.Epstein,B.G.Achong)、
“ザエプスタイン−バルウイルス(The Epste
in−Barr Virus)”、シュプリンゲルフェ
ルラークベルリン(Springer Verlag
Berlin)、ハイデルベルク、ニューヨーク(19
79)参照〕。ウイルスまたは少なくとも初期ウイルス
抗原を産出する細胞について主として間接的な免疫螢光
法を用いて、患者の血清中に、これらの抗原に対する明
らかにより高い抗体力価が見いだされた。初期抗原(E
arly Antigen)(EA)と名付けられる1
群の蛋白質とウイルスカプシド抗原と呼ばれる他の群の
蛋白質とに対する非特異免疫グロブリンを検出したこれ
らの第1の試験は、EBVとこれらの疾患との間の関係
の確立に役立った。しかし、これらの試験は、単一の血
清から悪性疾患を明確に診断するためには価値が制限さ
れ、かつ治療の監視に用いることができない。
抗体:エプスタイン−バル(Epstein−Bar
r)ウイルスが鼻咽頭癌およびアフリカバーキットリン
パ腫(African Burkitt’s Lymp
homa)に原因として関連する可能性があるという第
1の示唆的な証拠が血清学的データから誘導された(総
説として、M.A.エプスタイン、B.G.アコング
(M.A.Epstein,B.G.Achong)、
“ザエプスタイン−バルウイルス(The Epste
in−Barr Virus)”、シュプリンゲルフェ
ルラークベルリン(Springer Verlag
Berlin)、ハイデルベルク、ニューヨーク(19
79)参照〕。ウイルスまたは少なくとも初期ウイルス
抗原を産出する細胞について主として間接的な免疫螢光
法を用いて、患者の血清中に、これらの抗原に対する明
らかにより高い抗体力価が見いだされた。初期抗原(E
arly Antigen)(EA)と名付けられる1
群の蛋白質とウイルスカプシド抗原と呼ばれる他の群の
蛋白質とに対する非特異免疫グロブリンを検出したこれ
らの第1の試験は、EBVとこれらの疾患との間の関係
の確立に役立った。しかし、これらの試験は、単一の血
清から悪性疾患を明確に診断するためには価値が制限さ
れ、かつ治療の監視に用いることができない。
【0013】抗原および抗体群特異性試験の導入、特に
2種の抗原族EAとVCAに対する末梢IgA抗体の決
定は、また少なくともEA族を細分しようとする最初の
意図〔EA、DまたはR:G.ヘンル、W.ヘンル、
G.クライン(G.Henle,W.Henle an
d G.Klein)、“エプスタイン−バルウイルス
感染細胞の初期抗原複合体(early antige
n complex)中の2種の明瞭な成分の立証(D
emonstration of 2 distinc
t components in the early
antigencomplex of Epstei
n−Barr Virus infected cel
ls)”Int.J.Cancer,8,p.272
(1971)〕も、試験の診断および予後の価値を著し
く改良した。NPCに対する危険度の高い地域では、成
人人口の1%がEBVカプシド抗原(VCA)に対する
IgA抗体をもっている。この群の3%が、臨床検査で
NPCを有しており、但し末端症例は例外で、抗VCA
IgA陰性症例は発見されなかった。3年間の追跡調査
で、IgA抗VCA陽性症例から、毎年約1%がNPC
を発生した。この性能の試験は、高度特異的自動読取り
可能ELISA試験(highly specific
automato−readable ELISA
test)として有効ならば、極度に危険な人口のため
の優れた“第1段階”スクリーニングを与えるであろ
う。
2種の抗原族EAとVCAに対する末梢IgA抗体の決
定は、また少なくともEA族を細分しようとする最初の
意図〔EA、DまたはR:G.ヘンル、W.ヘンル、
G.クライン(G.Henle,W.Henle an
d G.Klein)、“エプスタイン−バルウイルス
感染細胞の初期抗原複合体(early antige
n complex)中の2種の明瞭な成分の立証(D
emonstration of 2 distinc
t components in the early
antigencomplex of Epstei
n−Barr Virus infected cel
ls)”Int.J.Cancer,8,p.272
(1971)〕も、試験の診断および予後の価値を著し
く改良した。NPCに対する危険度の高い地域では、成
人人口の1%がEBVカプシド抗原(VCA)に対する
IgA抗体をもっている。この群の3%が、臨床検査で
NPCを有しており、但し末端症例は例外で、抗VCA
IgA陰性症例は発見されなかった。3年間の追跡調査
で、IgA抗VCA陽性症例から、毎年約1%がNPC
を発生した。この性能の試験は、高度特異的自動読取り
可能ELISA試験(highly specific
automato−readable ELISA
test)として有効ならば、極度に危険な人口のため
の優れた“第1段階”スクリーニングを与えるであろ
う。
【0014】EBウイルスIgA/VCA抗体の検出
は、NPCの診断にとって有用であり(16頁の表参
照)、初期段階の検出のために特に価値がある。例え
ば、ウズホウ市(Wuzhow City)、(中国、
NPCの高度危険地域)では、血清学的大規模調査によ
って発見されたNPCの頻度は、I期(42%)とII
期(48%)の患者の%が、そうでない場合の外来患者
診療所で発見される頻度(I期1.7%、II期30
%)よりも遥かに高かった。生き残りの機会は、明らか
に治療を始めた時期に関係する。I期の生存率は(上海
腫瘍病院(Shanghai Tumor Hospi
tal)によれば93%、II期では75%であり、よ
り進んだ期では非常に低い。従って、早期発見および早
期治療によってNPCの死亡率を減少させることが可能
である。EBVの早期抗原複合体(early ant
igen complex)に対するIgA抗体は、用
いられる方法によるが、NPC患者の40〜70%で検
出される。これらの抗体は、腫瘍をもっていない人口に
はほとんど存在していない。腫瘍をもっている個体のか
かる試験は、治療開始の決定に非常に重要であり、腫瘍
患者の100%近くに於て疾患の発見が可能になるよう
に感度が増強されるならば、その価値はさらに高くなる
であろう。
は、NPCの診断にとって有用であり(16頁の表参
照)、初期段階の検出のために特に価値がある。例え
ば、ウズホウ市(Wuzhow City)、(中国、
NPCの高度危険地域)では、血清学的大規模調査によ
って発見されたNPCの頻度は、I期(42%)とII
期(48%)の患者の%が、そうでない場合の外来患者
診療所で発見される頻度(I期1.7%、II期30
%)よりも遥かに高かった。生き残りの機会は、明らか
に治療を始めた時期に関係する。I期の生存率は(上海
腫瘍病院(Shanghai Tumor Hospi
tal)によれば93%、II期では75%であり、よ
り進んだ期では非常に低い。従って、早期発見および早
期治療によってNPCの死亡率を減少させることが可能
である。EBVの早期抗原複合体(early ant
igen complex)に対するIgA抗体は、用
いられる方法によるが、NPC患者の40〜70%で検
出される。これらの抗体は、腫瘍をもっていない人口に
はほとんど存在していない。腫瘍をもっている個体のか
かる試験は、治療開始の決定に非常に重要であり、腫瘍
患者の100%近くに於て疾患の発見が可能になるよう
に感度が増強されるならば、その価値はさらに高くなる
であろう。
【0015】IgA/VCA抗体陽性個体間のNPCの
検出率は1.9%であり、IgA/EA抗体陽性個体の
検出率は30〜40%である。これらのデータは、Ig
A/EA抗体試験の方がNPCの検出にはより特異的で
あるが、IgA/VCA抗体ほど敏感でないことを示し
ている。数多くの研究所がEAおよびVCAに対するI
gA抗体の連続的測定を用いて治療の成功を監視してお
りかつ極めて良好な成功さをもって再発の早期発見を行
っている。gp250/350の膜蛋白質およびその使用 いわゆる膜抗原複合体(membrane antig
en complex)(MA)を構成するウイルスエ
ンベロープの4種の蛋白質は記載されている(L.F.
クァルティーレ、G.R.ピアソン(L.F.Qual
tiere,G.R.Pearson)、ら、上掲;
J.ノース、A.J.モーガン、M.A.エプスタイン
(J.North,A.J.Morgan,M.A.E
pstein)、“EBウイルスエンベロープおよびウ
イルス決定膜抗原(M.A.)ポリペプチドに関する観
察(Observations on the EB
virus envelope and virus−
determined membrane antig
en(MA)poly peptide),”Int.
J.Cancer 26,p.231(1980)〕。
これら蛋白質の2種、すなわちgp250とgp350
とは、抗原的に密接に関連している〔D.A.ソーリー
・ローソンとK.ゲイリンガー(D.A.Thorle
y−Lawson and K.Geilinge
r)、“エプスタイン−バルウイルスの主要糖蛋白質
(gp250/350)に対する単クローン性抗体は感
染性を中和する(Monoclonal antibo
dies against themajor gly
coprotein(gp250/350)of Ep
stein−Barr virus newtrali
ze infectivity)”、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA 77,p5307
(1980)〕。1つの成分の分子量は、ウイルスが誘
導される細胞系によるが、200,000〜250,0
00Dの範囲であり、第2の抗原的に関連する糖蛋白質
は、300,000〜350,000Dの分子量を有す
るが、ある細胞系では存在しない。
検出率は1.9%であり、IgA/EA抗体陽性個体の
検出率は30〜40%である。これらのデータは、Ig
A/EA抗体試験の方がNPCの検出にはより特異的で
あるが、IgA/VCA抗体ほど敏感でないことを示し
ている。数多くの研究所がEAおよびVCAに対するI
gA抗体の連続的測定を用いて治療の成功を監視してお
りかつ極めて良好な成功さをもって再発の早期発見を行
っている。gp250/350の膜蛋白質およびその使用 いわゆる膜抗原複合体(membrane antig
en complex)(MA)を構成するウイルスエ
ンベロープの4種の蛋白質は記載されている(L.F.
クァルティーレ、G.R.ピアソン(L.F.Qual
tiere,G.R.Pearson)、ら、上掲;
J.ノース、A.J.モーガン、M.A.エプスタイン
(J.North,A.J.Morgan,M.A.E
pstein)、“EBウイルスエンベロープおよびウ
イルス決定膜抗原(M.A.)ポリペプチドに関する観
察(Observations on the EB
virus envelope and virus−
determined membrane antig
en(MA)poly peptide),”Int.
J.Cancer 26,p.231(1980)〕。
これら蛋白質の2種、すなわちgp250とgp350
とは、抗原的に密接に関連している〔D.A.ソーリー
・ローソンとK.ゲイリンガー(D.A.Thorle
y−Lawson and K.Geilinge
r)、“エプスタイン−バルウイルスの主要糖蛋白質
(gp250/350)に対する単クローン性抗体は感
染性を中和する(Monoclonal antibo
dies against themajor gly
coprotein(gp250/350)of Ep
stein−Barr virus newtrali
ze infectivity)”、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA 77,p5307
(1980)〕。1つの成分の分子量は、ウイルスが誘
導される細胞系によるが、200,000〜250,0
00Dの範囲であり、第2の抗原的に関連する糖蛋白質
は、300,000〜350,000Dの分子量を有す
るが、ある細胞系では存在しない。
【0016】これらの糖蛋白質は、すべて、抗原性、蛋
白質、コードするDNA配列が関連しているので、それ
らは、通常、gp220/350またはgp250/3
50あるいは単にgp250またはgp350と呼ばれ
るが、関連糖蛋白質の全群を意味する。糖蛋白質250
/350は、ヒトおよびある種の霊長類のB−リンパ球
のEBVリセプターに結合することができ、かくしてこ
れらの細胞の感染を開始することができる(A.ウエル
ズ、N.コイデ、G.クライン(A.Wells,N.
Koide,G.Klein),“2種の大ウイルスエ
ンベロープ糖蛋白質はレセプター陽性細胞に結合するエ
プスタイン・バルウイルスを媒介する(Twolarg
e viron envelope glycopro
teins mediate Epstein−Bar
r virus binding torecepto
r−positive cells)”、J.Viro
l.41.p286(1982)〕。これらの蛋白質に
対する抗体はウイルスの感染性を中和する。このこと
は、ヒトならびにウサギ抗血清およびマウス単クローン
性抗体で示された(D.A.ソーリー−ローソン(D.
A,Thorley−Lowson)ら、上掲〕。単ク
ローン性抗体の使用により、gp350およびgp25
0の両方に存在する唯一の抗原決定基の封鎖は、ウイル
ス中和のために十分であることを示した。固定化された
gp350およびgp250へのヒト血清の吸着は中和
用抗体を除去した(D.A.ソーリー−ローソン(D.
A.Thorley−Lowson)ら、上掲〕。かく
して、 a)gp350およびgp250は中和用抗体の産生を
誘発し、かつ b)gp350およびgp250に対する抗体は中和能
を有するという有力な証拠がある。
白質、コードするDNA配列が関連しているので、それ
らは、通常、gp220/350またはgp250/3
50あるいは単にgp250またはgp350と呼ばれ
るが、関連糖蛋白質の全群を意味する。糖蛋白質250
/350は、ヒトおよびある種の霊長類のB−リンパ球
のEBVリセプターに結合することができ、かくしてこ
れらの細胞の感染を開始することができる(A.ウエル
ズ、N.コイデ、G.クライン(A.Wells,N.
Koide,G.Klein),“2種の大ウイルスエ
ンベロープ糖蛋白質はレセプター陽性細胞に結合するエ
プスタイン・バルウイルスを媒介する(Twolarg
e viron envelope glycopro
teins mediate Epstein−Bar
r virus binding torecepto
r−positive cells)”、J.Viro
l.41.p286(1982)〕。これらの蛋白質に
対する抗体はウイルスの感染性を中和する。このこと
は、ヒトならびにウサギ抗血清およびマウス単クローン
性抗体で示された(D.A.ソーリー−ローソン(D.
A,Thorley−Lowson)ら、上掲〕。単ク
ローン性抗体の使用により、gp350およびgp25
0の両方に存在する唯一の抗原決定基の封鎖は、ウイル
ス中和のために十分であることを示した。固定化された
gp350およびgp250へのヒト血清の吸着は中和
用抗体を除去した(D.A.ソーリー−ローソン(D.
A.Thorley−Lowson)ら、上掲〕。かく
して、 a)gp350およびgp250は中和用抗体の産生を
誘発し、かつ b)gp350およびgp250に対する抗体は中和能
を有するという有力な証拠がある。
【0017】従って、この蛋白質ならびにその関連ウイ
ルス遺伝子産物gp350(350,000の分子量を
有する)は、可能なEBVワクチンの候補である〔A.
J.モーガン、M.A.エプスタイン、J.R.ノース
(A.J.Morgan,M.A.Epstein,
J.R.North)、“マウス、ウサギ、コットン・
トップタマリン(cotton−top tamari
ns)に於ける新規アジェバントを伴うエプスタイン−
バルウイルス膜抗原(MA)gp340に関する比較免
疫原性の研究(Comparative immuno
genicitystudies on Epstei
n−Barr virus membrane ant
igen(MA)gp340 with novel
adjuvants inmice,rabbits
and cottoton−top tamarin
s)”、J.Med.Virol.13,p.281
(1984)〕。これらの糖蛋白質は、誘導されたEB
V産生性細胞系で示されるか細胞表面蛋白質の放射性ヨ
ウ素化後に容易に示すことができる〔L.F.クアルテ
ィーレ、G.R.ピアソン(L.F.Qualtier
e,G.R.Pearson)、“エプスタイン−バル
ウイルス誘発膜抗原:EBV重感染ラジ細胞からのトラ
イトンX−100可溶化ウイルス膜抗原の免疫化学的キ
ャラクタリゼーション(Epstein−Barr v
irus−inducedmembrane anti
gens:immuno chemical char
acterization of Triton X−
100 solubilizedviral memb
rane antigens from EBV su
perinfected Raji cells)”、
Int.J.Cancer23,p.808(197
9)〕。
ルス遺伝子産物gp350(350,000の分子量を
有する)は、可能なEBVワクチンの候補である〔A.
J.モーガン、M.A.エプスタイン、J.R.ノース
(A.J.Morgan,M.A.Epstein,
J.R.North)、“マウス、ウサギ、コットン・
トップタマリン(cotton−top tamari
ns)に於ける新規アジェバントを伴うエプスタイン−
バルウイルス膜抗原(MA)gp340に関する比較免
疫原性の研究(Comparative immuno
genicitystudies on Epstei
n−Barr virus membrane ant
igen(MA)gp340 with novel
adjuvants inmice,rabbits
and cottoton−top tamarin
s)”、J.Med.Virol.13,p.281
(1984)〕。これらの糖蛋白質は、誘導されたEB
V産生性細胞系で示されるか細胞表面蛋白質の放射性ヨ
ウ素化後に容易に示すことができる〔L.F.クアルテ
ィーレ、G.R.ピアソン(L.F.Qualtier
e,G.R.Pearson)、“エプスタイン−バル
ウイルス誘発膜抗原:EBV重感染ラジ細胞からのトラ
イトンX−100可溶化ウイルス膜抗原の免疫化学的キ
ャラクタリゼーション(Epstein−Barr v
irus−inducedmembrane anti
gens:immuno chemical char
acterization of Triton X−
100 solubilizedviral memb
rane antigens from EBV su
perinfected Raji cells)”、
Int.J.Cancer23,p.808(197
9)〕。
【0018】EBV関連疾患の診断のためのgp250
/350の応用 IgG抗体は、1次EBV感染の急性期中には存在しな
いが、回復期後の一生の間存在する。IgG抗体は、こ
の疾患の早期に存在するが、回復期中には存在しない。
EBV抗原に対するIgA抗体は、ほとんどもっぱらN
PC患者に存在し、あまり感度の高くない試験でもこれ
らの患者の少なくとも58%の血清中に検出される(ゼ
ングイとハンスウルフ(Zeng Yi and Ha
ns Wolf),作製中の原稿および下記実施例1
6〕。
/350の応用 IgG抗体は、1次EBV感染の急性期中には存在しな
いが、回復期後の一生の間存在する。IgG抗体は、こ
の疾患の早期に存在するが、回復期中には存在しない。
EBV抗原に対するIgA抗体は、ほとんどもっぱらN
PC患者に存在し、あまり感度の高くない試験でもこれ
らの患者の少なくとも58%の血清中に検出される(ゼ
ングイとハンスウルフ(Zeng Yi and Ha
ns Wolf),作製中の原稿および下記実施例1
6〕。
【0019】全gp250分子量またはそのバックボー
ンポリペプチド鎖の部分は、受身血球凝集反応、交差ゲ
ル電気泳動法、ラジオイムノアッセイ法あるいは酵素免
疫測定法のような優先的クラス特異性抗体検出試験の試
薬として利用することができる。高度に特異的な試験抗
原は、より良い信号を与えかつそうでなければわからな
い臨床的に重要な低い抗体レベルを検出する。ある場合
には、全遺伝子産物ではなくてgp250の特異な抗原
部位を用いることによって、疾患のより正確な診断が可
能になる。EBV関連疾患の予防および治療のためのgp250/
350の応用 A.生涯の早期に於けるEBVによる感染は無症状の血
清変換を起こすだけであるので、母性抗体またはワクチ
ンによって誘発された抗体の存在は、1次EBV感染の
臨床的発現に影響するであろうことが予想される。好ま
しくはEBV感染を受ける危険のピークの前の、子供ま
たは若年成人の予防接種は、人口中の伝染性単核症の臨
床的発現を有効に減少させることが期待される。
ンポリペプチド鎖の部分は、受身血球凝集反応、交差ゲ
ル電気泳動法、ラジオイムノアッセイ法あるいは酵素免
疫測定法のような優先的クラス特異性抗体検出試験の試
薬として利用することができる。高度に特異的な試験抗
原は、より良い信号を与えかつそうでなければわからな
い臨床的に重要な低い抗体レベルを検出する。ある場合
には、全遺伝子産物ではなくてgp250の特異な抗原
部位を用いることによって、疾患のより正確な診断が可
能になる。EBV関連疾患の予防および治療のためのgp250/
350の応用 A.生涯の早期に於けるEBVによる感染は無症状の血
清変換を起こすだけであるので、母性抗体またはワクチ
ンによって誘発された抗体の存在は、1次EBV感染の
臨床的発現に影響するであろうことが予想される。好ま
しくはEBV感染を受ける危険のピークの前の、子供ま
たは若年成人の予防接種は、人口中の伝染性単核症の臨
床的発現を有効に減少させることが期待される。
【0020】B.NPCまたはBLの高出現率をもつす
べての地域に於て、人口は、一生の最初の1〜2年以内
にEBVへのほとんど100%の血清変換を示す。予防
接種は、誕生後間もなく行われねばならないであろう。
この予防接種を規則正しく繰り返せば、多分、EBV感
染を予防し、あるいはそれを遅らせ、あるいは初期1次
感染の生物学的影響を減少させるであろう。これらの結
果のおのおのは、その後の腫瘍の発生を予防し、あるい
はその開始を相当に遅らせ、あるいはその相対的危険を
減少させることが期待される。 C.NPCに於て、腫瘍部位に於けるウイルス抗原の時
々の産生は、主としてIgA分泌性Bリンパ球を刺激す
るであろう。IgA抗体は、抗体媒介細胞傷害を阻害す
る能力がある。gp250のようなウイルス膜抗原に対
するIgA抗体は、NPCおよびBL患者中に存在し、
疾患の指示剤であるだけでなく、そのマスキングポテン
シャルによって免疫系の不全に貢献して腫瘍細胞を除去
することすらあり得る。腫瘍患者に投与された多量の精
製抗原は、IgAと結合し、同抗原に対する過剰のIg
G抗体の産生を開始する可能性がある。これらの特異的
IgG抗体は、次に残留IgA抗体と競争して、抗体依
存性機構による腫瘍細胞の除去を可能にする。
べての地域に於て、人口は、一生の最初の1〜2年以内
にEBVへのほとんど100%の血清変換を示す。予防
接種は、誕生後間もなく行われねばならないであろう。
この予防接種を規則正しく繰り返せば、多分、EBV感
染を予防し、あるいはそれを遅らせ、あるいは初期1次
感染の生物学的影響を減少させるであろう。これらの結
果のおのおのは、その後の腫瘍の発生を予防し、あるい
はその開始を相当に遅らせ、あるいはその相対的危険を
減少させることが期待される。 C.NPCに於て、腫瘍部位に於けるウイルス抗原の時
々の産生は、主としてIgA分泌性Bリンパ球を刺激す
るであろう。IgA抗体は、抗体媒介細胞傷害を阻害す
る能力がある。gp250のようなウイルス膜抗原に対
するIgA抗体は、NPCおよびBL患者中に存在し、
疾患の指示剤であるだけでなく、そのマスキングポテン
シャルによって免疫系の不全に貢献して腫瘍細胞を除去
することすらあり得る。腫瘍患者に投与された多量の精
製抗原は、IgAと結合し、同抗原に対する過剰のIg
G抗体の産生を開始する可能性がある。これらの特異的
IgG抗体は、次に残留IgA抗体と競争して、抗体依
存性機構による腫瘍細胞の除去を可能にする。
【0021】D.gp250または関連産物の適当な投
与は、細胞免疫機構をも増強し、かくして腫瘍の増殖を
制限することができる。本発明のEBV特異抗原の生産 1. すべての発見の結果として、本発明の目的は、抗
体クラスおよび抗原特異性抗体の検出のための試験の感
度を改良することおよび大量試験と、より良い標準化と
を可能にする方式とを開発することである。 2. EBVは、有効に感染できる細胞が現在知られて
おらずかつEBVまたは関連抗原の調製のための源とし
て用いられるすべての細胞が固定細胞かまたは腫瘍誘導
細胞でさえあるので、溶解細胞サイクル中で有効に産生
され得ない。ほとんどの細胞系に於てレトロウイルスが
示されている。従って、かかる培養から単離される産物
は、非常に高価であるばかりでなく、その使用も潜在的
に危険である。
与は、細胞免疫機構をも増強し、かくして腫瘍の増殖を
制限することができる。本発明のEBV特異抗原の生産 1. すべての発見の結果として、本発明の目的は、抗
体クラスおよび抗原特異性抗体の検出のための試験の感
度を改良することおよび大量試験と、より良い標準化と
を可能にする方式とを開発することである。 2. EBVは、有効に感染できる細胞が現在知られて
おらずかつEBVまたは関連抗原の調製のための源とし
て用いられるすべての細胞が固定細胞かまたは腫瘍誘導
細胞でさえあるので、溶解細胞サイクル中で有効に産生
され得ない。ほとんどの細胞系に於てレトロウイルスが
示されている。従って、かかる培養から単離される産物
は、非常に高価であるばかりでなく、その使用も潜在的
に危険である。
【0022】3. 組換えDNA技術の適用は、組換え
DNA分子により形質転換されかつ適当な培養系で増殖
された適当な宿主細胞による有用なポリペプチドの生産
を可能にした。 4. 本発明によれば、細菌〔例えばエシエリヒア(E
scherichia)属、サルモネラ(Salmon
ella)属、プセウドモナス(Pseudomona
s)属またはバチルス(Bacillus)属〕、酵母
〔例えばカンジタ(Candida)属、またはサッカ
ロミセス(Saccharomyces)属〕、哺乳類
細胞〔例えば、ベロ(Vero)−細胞、CHO−細胞
またはリンパ芽球皮疹細胞系〕のような適当な宿主に於
けるEBV蛋白質p138、p150、gp250/3
50をコードする遺伝子または遺伝子の少なくとも部分
の遺伝情報を発現させるために組換えDNA法を用い
る。 5. さらに、EBV蛋白質p150、p143、p1
38、p110、p105、p90、p80、p54を
コードするゲノム領域を同定し、かつその診断目的のた
めの関連を確認した。従って、蛋白質p138、p15
0、gp250/350のために示した方法によるこれ
らの蛋白質またはその抗原決定基の生産のための主要情
報をも本発明では記載する。
DNA分子により形質転換されかつ適当な培養系で増殖
された適当な宿主細胞による有用なポリペプチドの生産
を可能にした。 4. 本発明によれば、細菌〔例えばエシエリヒア(E
scherichia)属、サルモネラ(Salmon
ella)属、プセウドモナス(Pseudomona
s)属またはバチルス(Bacillus)属〕、酵母
〔例えばカンジタ(Candida)属、またはサッカ
ロミセス(Saccharomyces)属〕、哺乳類
細胞〔例えば、ベロ(Vero)−細胞、CHO−細胞
またはリンパ芽球皮疹細胞系〕のような適当な宿主に於
けるEBV蛋白質p138、p150、gp250/3
50をコードする遺伝子または遺伝子の少なくとも部分
の遺伝情報を発現させるために組換えDNA法を用い
る。 5. さらに、EBV蛋白質p150、p143、p1
38、p110、p105、p90、p80、p54を
コードするゲノム領域を同定し、かつその診断目的のた
めの関連を確認した。従って、蛋白質p138、p15
0、gp250/350のために示した方法によるこれ
らの蛋白質またはその抗原決定基の生産のための主要情
報をも本発明では記載する。
【0023】組換えDNA技術 A.発現制御系 原核生物は、最もしばしば、大腸菌(E.coli)の
種々の株によって代表される。しかし、細菌、例えばバ
チルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)、種々のプセウドモナス(Pseudomona
s)種または他の細菌株のような他の微生物株も用いら
れる。かかる原核生物系では、宿主と相容性の種から誘
導される複製部位および制御配列を含むプラスミドベク
ターが用いられる。例えば、大腸菌(E.coli)
は、典型的には、ボリバー(Bolivar)ら、ジー
ン(Gene)2、p.95(1977)によって大腸
菌(E.coli)種から誘導されるプラスミドpBR
322の誘導体を用いて形質転換される。pBR322
は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための
遺伝子を含み、これらのマーカーは、所望のベクターの
構築に於て保持される場合も破壊される場合もあり得
る。本明細書で、随意にオペレーターと共に、リボソー
ム結合部位配列と共に、形質転換開始のためのプロモー
ターを含むと定義される、通常用いられる原核生物制御
配列は、かかる通常用いられるプロモーターを、ベータ
ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)および乳糖(lac)
プロモーター系(チャン(Chang)らネーチャー
(Nature)、198、p1056(1977)〕
としておよびトリプトファン(trp)プロモーター系
(ゴエデル(Goeddel)ら、Nucleic A
cids Res.8,p.4057(1980)〕と
して含む。携帯用制御カセットとして有用となったラム
ダ誘導PLプロモーターおよびN−遺伝子リボソーム結
合部位〔シマタケ(Shimatake)ら、ネーチャ
ー(Nature)292、p.128(1981)〕
も例である。しかし、原核生物と相容性のどんな入手可
能なプロモーターも使用することができる。
種々の株によって代表される。しかし、細菌、例えばバ
チルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)、種々のプセウドモナス(Pseudomona
s)種または他の細菌株のような他の微生物株も用いら
れる。かかる原核生物系では、宿主と相容性の種から誘
導される複製部位および制御配列を含むプラスミドベク
ターが用いられる。例えば、大腸菌(E.coli)
は、典型的には、ボリバー(Bolivar)ら、ジー
ン(Gene)2、p.95(1977)によって大腸
菌(E.coli)種から誘導されるプラスミドpBR
322の誘導体を用いて形質転換される。pBR322
は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための
遺伝子を含み、これらのマーカーは、所望のベクターの
構築に於て保持される場合も破壊される場合もあり得
る。本明細書で、随意にオペレーターと共に、リボソー
ム結合部位配列と共に、形質転換開始のためのプロモー
ターを含むと定義される、通常用いられる原核生物制御
配列は、かかる通常用いられるプロモーターを、ベータ
ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)および乳糖(lac)
プロモーター系(チャン(Chang)らネーチャー
(Nature)、198、p1056(1977)〕
としておよびトリプトファン(trp)プロモーター系
(ゴエデル(Goeddel)ら、Nucleic A
cids Res.8,p.4057(1980)〕と
して含む。携帯用制御カセットとして有用となったラム
ダ誘導PLプロモーターおよびN−遺伝子リボソーム結
合部位〔シマタケ(Shimatake)ら、ネーチャ
ー(Nature)292、p.128(1981)〕
も例である。しかし、原核生物と相容性のどんな入手可
能なプロモーターも使用することができる。
【0024】細菌に加えて、酵母のような真核微生物も
宿主として使用することができる。サッカロミセス・セ
レビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae)の実験室株、パン酵母が最も多く用いられ
るが、多数の他の株が市販されている。2μの複製起源
を用いるベクターが示されている(J.R.ブローチ
(J.R.Broach),Meth.Enz.10
1,p.307(1983)〕が、酵母の発現のために
適した他のプラスミドが知られている〔例えばスティン
チコム(Stinchcomb)ら、ネーチャー(Na
ture)、282、p.39(1979);チェンペ
(Tschempe)ら、ジーン(Gene)10、
p.157(1980);L.クラーケ(L.Clar
ke)ら、Meth.Enz.101,p.300(1
983)参照〕。酵母ベクター用の制御配列には、解糖
酵素の合成のためのプロモーターが含まれる〔ヘス(H
ess)ら、J.Adv.Enzyme Reg.7,
p.149(1968);ホランド(Holland)
ら、バイオケミストリー
宿主として使用することができる。サッカロミセス・セ
レビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae)の実験室株、パン酵母が最も多く用いられ
るが、多数の他の株が市販されている。2μの複製起源
を用いるベクターが示されている(J.R.ブローチ
(J.R.Broach),Meth.Enz.10
1,p.307(1983)〕が、酵母の発現のために
適した他のプラスミドが知られている〔例えばスティン
チコム(Stinchcomb)ら、ネーチャー(Na
ture)、282、p.39(1979);チェンペ
(Tschempe)ら、ジーン(Gene)10、
p.157(1980);L.クラーケ(L.Clar
ke)ら、Meth.Enz.101,p.300(1
983)参照〕。酵母ベクター用の制御配列には、解糖
酵素の合成のためのプロモーターが含まれる〔ヘス(H
ess)ら、J.Adv.Enzyme Reg.7,
p.149(1968);ホランド(Holland)
ら、バイオケミストリー
【0025】(Biochemistry)17,p.
4900(1978)〕。技術上既知のその他のプロモ
ーターには、3−ホスホグリセリン酸キナーゼのための
プロモーター(ヒッツェマン(Hitzeman)ら、
J.Biol.Chem.255,p.2073(19
80)〕、およびグリセリンアルド−3−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコース−6−燐酸
イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、三炭糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、グルコキナーゼのような他の解糖
酵素のためのプロモーターが含まれる。増殖条件によっ
て制御される転写の付加的利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロー
ムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解(d
egradative)酵素、マルトースおよびガラク
トース利用の原因となる酵素(ホランド(Hollan
d),上掲〕のためのプロモーター領域である。
4900(1978)〕。技術上既知のその他のプロモ
ーターには、3−ホスホグリセリン酸キナーゼのための
プロモーター(ヒッツェマン(Hitzeman)ら、
J.Biol.Chem.255,p.2073(19
80)〕、およびグリセリンアルド−3−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコース−6−燐酸
イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、三炭糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、グルコキナーゼのような他の解糖
酵素のためのプロモーターが含まれる。増殖条件によっ
て制御される転写の付加的利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロー
ムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解(d
egradative)酵素、マルトースおよびガラク
トース利用の原因となる酵素(ホランド(Hollan
d),上掲〕のためのプロモーター領域である。
【0026】種々の証拠は、コード配列の3′末端に於
てターミネーター配列が望ましいことを示唆している。
かかるターミネーターは、酵母誘導遺伝子中のコード配
列に続く3′未翻訳領域内に見いだされる。示される多
くのベクターは、プラスミドpeno46(M.J.ホ
ランド(Holland)ら、J.Biol.Che
m.)256、p.1385(1981)〕を含むエノ
ラーゼI遺伝子またはYEp13(J.ブローチ(J.
Broach)ら、ジーン(Gene)8、p.121
(1979)〕から得られるLEU2遺伝子から誘導さ
れる制御配列を含むが、酵母と相容性のプロモーター、
複製源および他の制御配列を含む任意のベクターが適当
である。
てターミネーター配列が望ましいことを示唆している。
かかるターミネーターは、酵母誘導遺伝子中のコード配
列に続く3′未翻訳領域内に見いだされる。示される多
くのベクターは、プラスミドpeno46(M.J.ホ
ランド(Holland)ら、J.Biol.Che
m.)256、p.1385(1981)〕を含むエノ
ラーゼI遺伝子またはYEp13(J.ブローチ(J.
Broach)ら、ジーン(Gene)8、p.121
(1979)〕から得られるLEU2遺伝子から誘導さ
れる制御配列を含むが、酵母と相容性のプロモーター、
複製源および他の制御配列を含む任意のベクターが適当
である。
【0027】勿論、多細胞生物から誘導される真核生物
宿主細胞培養中でポリペプチドをコードする遺伝子を発
現することも可能である。例えば、グルーズとパターソ
ン(Gruz and Patterson)編著“組
織培養(Tissue Culture)”、アカデミ
ックプレス(Academic Press)(197
3)を参照されたい。有用な宿主細胞系には、ベロ(V
ERO)およびへら(HeLa)細胞、ならびにチャイ
ニーズハムスターオバリー(ChineseHamst
er ovary)(CHO)細胞が含まれる。かかる
細胞のための発現ベクターは、通常、例えばシミアン
(Simian)ウイルス40(SV40)〔フィアー
ズ(Fiers)ら、ネーチャー(Nature)27
3、p.113(1978)〕からの通常用いられる初
期および後期プロモーター、あるいはポリオーマアデノ
ウイルス、牛乳頭腫ウイルスまたはニワトリ肉腫ウイル
スから誘導されるプロモーターのような他のウイルスプ
ロモーターのような、哺乳類細胞と相容性のプロモータ
ーおよび制御配列を含む。
宿主細胞培養中でポリペプチドをコードする遺伝子を発
現することも可能である。例えば、グルーズとパターソ
ン(Gruz and Patterson)編著“組
織培養(Tissue Culture)”、アカデミ
ックプレス(Academic Press)(197
3)を参照されたい。有用な宿主細胞系には、ベロ(V
ERO)およびへら(HeLa)細胞、ならびにチャイ
ニーズハムスターオバリー(ChineseHamst
er ovary)(CHO)細胞が含まれる。かかる
細胞のための発現ベクターは、通常、例えばシミアン
(Simian)ウイルス40(SV40)〔フィアー
ズ(Fiers)ら、ネーチャー(Nature)27
3、p.113(1978)〕からの通常用いられる初
期および後期プロモーター、あるいはポリオーマアデノ
ウイルス、牛乳頭腫ウイルスまたはニワトリ肉腫ウイル
スから誘導されるプロモーターのような他のウイルスプ
ロモーターのような、哺乳類細胞と相容性のプロモータ
ーおよび制御配列を含む。
【0028】哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な面
は、1983年8月16日発行の米国特許第4,39
9,216号中で、アクセル(Axel)が記載してい
る。今や、最適発現には“エンハンサー(enhanc
er)”領域が重要であるようにも思われる。これらの
領域は、一般に、プロモーター領域の上流にしばしば見
られる配列である。複製源は、必要ならばウイルス源か
ら得ることができる。しかし、染色体中への遺伝子組込
みは、真核生物に於けるDNA複製の通常の機構であ
り、それ故、独立に複製するベクターは所要でない。植
物細胞も、現在、宿主として有効であり、ノパリンシン
ターゼ(nopaline synthase)プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナル配列(A.デピッ
カー(A.Depicker)ら、J.Mol.App
l.Gen.1,p.561(1981)〕のような、
植物細胞と相容性の制御配列も有効である。
は、1983年8月16日発行の米国特許第4,39
9,216号中で、アクセル(Axel)が記載してい
る。今や、最適発現には“エンハンサー(enhanc
er)”領域が重要であるようにも思われる。これらの
領域は、一般に、プロモーター領域の上流にしばしば見
られる配列である。複製源は、必要ならばウイルス源か
ら得ることができる。しかし、染色体中への遺伝子組込
みは、真核生物に於けるDNA複製の通常の機構であ
り、それ故、独立に複製するベクターは所要でない。植
物細胞も、現在、宿主として有効であり、ノパリンシン
ターゼ(nopaline synthase)プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナル配列(A.デピッ
カー(A.Depicker)ら、J.Mol.App
l.Gen.1,p.561(1981)〕のような、
植物細胞と相容性の制御配列も有効である。
【0029】B.適当な宿主の形質転換 使用される宿主細胞によって、かかる細胞にとって適当
な標準的方法を用いて形質転換を行う。S.N.コーエ
ン(S.N.Cohen),Proc.Natl.Ac
ad.Sci.(USA)69,p.2110(197
2)によって記載されたような、塩化カルシウムを用い
るカルシウム処理は、原核生物または実質的な細胞壁バ
リヤーを含む他の細胞に用いられる。ある種の植物細胞
に対しては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefacien
s)による感染(C.H.シャウ(C.H.Show)
ら、ジーン(Gene)23、p.315(198
3)〕が用いられる。かかる細胞壁のない哺乳類細胞に
対しては、グラハムとファンデルエブ(Graham
and Van der Eb)の燐酸カルシウム沈殿
法〔バイオロジー(Virology)52,p.54
6(1978)〕が好ましい。酵母中に於ける形質転換
は、P.バンゾリンゲン(P.Van Solinge
n)ら、[J.Bact.130,p.946(197
7)とC.L.フシャオ(C.L.Hsiao)ら(P
roc.Natl.Acad.Sci.(USA)7
6,p.3829(1979)〕の方法に従って行われ
る。別法では、クレベ(Klebe)らの方法〔ジーン
(Gene)25,p.333(1983)〕を用いる
ことができる。
な標準的方法を用いて形質転換を行う。S.N.コーエ
ン(S.N.Cohen),Proc.Natl.Ac
ad.Sci.(USA)69,p.2110(197
2)によって記載されたような、塩化カルシウムを用い
るカルシウム処理は、原核生物または実質的な細胞壁バ
リヤーを含む他の細胞に用いられる。ある種の植物細胞
に対しては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefacien
s)による感染(C.H.シャウ(C.H.Show)
ら、ジーン(Gene)23、p.315(198
3)〕が用いられる。かかる細胞壁のない哺乳類細胞に
対しては、グラハムとファンデルエブ(Graham
and Van der Eb)の燐酸カルシウム沈殿
法〔バイオロジー(Virology)52,p.54
6(1978)〕が好ましい。酵母中に於ける形質転換
は、P.バンゾリンゲン(P.Van Solinge
n)ら、[J.Bact.130,p.946(197
7)とC.L.フシャオ(C.L.Hsiao)ら(P
roc.Natl.Acad.Sci.(USA)7
6,p.3829(1979)〕の方法に従って行われ
る。別法では、クレベ(Klebe)らの方法〔ジーン
(Gene)25,p.333(1983)〕を用いる
ことができる。
【0030】C.組換えクローニングおよび発現ベクタ
ーの構築 所望のコード(coding)および制御配列を含む適
当なベクターの構築は、技術上よく理解されている標準
連結および制限方法を用いる。単離したプラスミド、D
NA配列または合成されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを開裂し、テーラーし(tailored)かつ所
望の形に再連結する。部位特異性DNA開裂は、技術上
一般に理解されている条件下で適当な1種または2種以
上の制限酵素による処理によって行われ、その特別なも
のは、これら市販の制限酵素のメーカーによって明示さ
れている。例えば、ニューイングランドバイオラブズ、
プロダクト カタログ(New England Bi
olabs,Product Cataglog)を参
照されたい。
ーの構築 所望のコード(coding)および制御配列を含む適
当なベクターの構築は、技術上よく理解されている標準
連結および制限方法を用いる。単離したプラスミド、D
NA配列または合成されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを開裂し、テーラーし(tailored)かつ所
望の形に再連結する。部位特異性DNA開裂は、技術上
一般に理解されている条件下で適当な1種または2種以
上の制限酵素による処理によって行われ、その特別なも
のは、これら市販の制限酵素のメーカーによって明示さ
れている。例えば、ニューイングランドバイオラブズ、
プロダクト カタログ(New England Bi
olabs,Product Cataglog)を参
照されたい。
【0031】所望ならば、標準方法を用い、ポリアクリ
ルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって、
開裂断片のサイズ分離を行うことができる。サイズ分離
の一般的な記載は、“酵素学に於ける方法(Metho
d in Enzymology)”65、p.499
−560(1980)に見られる。制限開裂断片は、4
種のデオキシヌクレオチド三燐酸(dNTPs)の存在
下に於て、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼ
I(クレナウ(Klenow)〕の大断片による処理に
よって平滑末端にすることができる。クレナウ(Kle
now)断片は5′付着末端に於て満たすが、突き出し
ている3′一本鎖を、仮令4種のdNTPsが存在して
もチューバック(chew back)する。所望なら
ば、付着末端の性質によって指令される制限内で、選ば
れた1種または2種以上のdNTPsだけを供給するこ
とによって、選択的に修復を行うことができる。適当な
条件下に於けるS1ヌクレアーゼによる処理は、一本鎖
蛋白質の加水分解をもたらす。
ルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって、
開裂断片のサイズ分離を行うことができる。サイズ分離
の一般的な記載は、“酵素学に於ける方法(Metho
d in Enzymology)”65、p.499
−560(1980)に見られる。制限開裂断片は、4
種のデオキシヌクレオチド三燐酸(dNTPs)の存在
下に於て、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼ
I(クレナウ(Klenow)〕の大断片による処理に
よって平滑末端にすることができる。クレナウ(Kle
now)断片は5′付着末端に於て満たすが、突き出し
ている3′一本鎖を、仮令4種のdNTPsが存在して
もチューバック(chew back)する。所望なら
ば、付着末端の性質によって指令される制限内で、選ば
れた1種または2種以上のdNTPsだけを供給するこ
とによって、選択的に修復を行うことができる。適当な
条件下に於けるS1ヌクレアーゼによる処理は、一本鎖
蛋白質の加水分解をもたらす。
【0032】合成オリゴヌクレオチドは、マッテウム
(Matleucci)らのトリエステル法(J.A
m.Chem.Soc.103,p.3185(198
1)〕または1983年11月15日発行の米国特許第
4,415,732号記載のカルーザーズ(Carut
hers)のジエチルホスルアミダイト(diethy
lphosphoramidite)法によって製造す
ることができる。連結(ligation)は、T4D
NAリガーゼを用い、標準の条件および温度の下で行わ
れる。“ベクター断片”を用いるベクター構築に於て
は、5′燐酸を除去しかつベクターの再連結を防ぐため
に、通常、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)でベ
クター断片を処理する。BAPの消化は、標準条件下
(下記説明のように)で行われる。 D.形質転換体の選択 構築に於て、プラスミド構築のための正しい連結は、大
腸菌(E・coli)または他の適当な宿主を連結混合
物で形質転換させることによって確認される。上首尾の
形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンまたは
他の抗生物質耐性によって、あるいは技術上知られてい
るような、プラスミド構築方式に依存する他のマーカー
を用いて選ばれる。
(Matleucci)らのトリエステル法(J.A
m.Chem.Soc.103,p.3185(198
1)〕または1983年11月15日発行の米国特許第
4,415,732号記載のカルーザーズ(Carut
hers)のジエチルホスルアミダイト(diethy
lphosphoramidite)法によって製造す
ることができる。連結(ligation)は、T4D
NAリガーゼを用い、標準の条件および温度の下で行わ
れる。“ベクター断片”を用いるベクター構築に於て
は、5′燐酸を除去しかつベクターの再連結を防ぐため
に、通常、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)でベ
クター断片を処理する。BAPの消化は、標準条件下
(下記説明のように)で行われる。 D.形質転換体の選択 構築に於て、プラスミド構築のための正しい連結は、大
腸菌(E・coli)または他の適当な宿主を連結混合
物で形質転換させることによって確認される。上首尾の
形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンまたは
他の抗生物質耐性によって、あるいは技術上知られてい
るような、プラスミド構築方式に依存する他のマーカー
を用いて選ばれる。
【0033】発明の簡単な要約 本発明は、組換えDNA技術によるEBV特異的抗原の
製造ならびにEBV関連疾患の診断、予防、治療に於け
るその使用に関する。従って、本発明の目的は、鼻咽頭
癌(NPC)、伝染性単核症、バーキット(Burki
tt’s)リンパ腫(図1および図40〜図61の凡例
参照)のようなエプスタイン−バルウイルス関連疾患と
免疫学的方法によって相関されるp150、p143、
p138、p110、p105、p90、p80、p5
4(G.J.ベイリス、H.ウルフ(G.J.Bayl
iss,H.Wolf)、下掲)のような新規エプスタ
イン・バルウイルス抗原を同定することである。本発明
のもう1つの目的は、例えばEBVが診断上重要でかつ
医療目的のために適切な該抗原をコードするB95−8
細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション(Am
erican Type Culture Colle
ction)、ロックビル、メリーランド、USA(A
TCC)CRL1612)〔J.スケア、J.L.スト
ロミンガー(J.Skare,J.L.Stromin
ger)、“エプスタイン−バルウイルスの形質転換性
B95−8株からのDNAのBamHIエンドヌクレア
ーゼ断片のクローニングおよびマッピング(Cloni
ng and Mapping of BamHI e
ndonuclease fragments of
the DNA from the trasform
ing B95−8 strain of Epste
in−Barr Virus)”、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA77,p3860(1
980)〕からクローニングされているように、EBV
のゲノム領域の位直決定(localization)
および同定である。
製造ならびにEBV関連疾患の診断、予防、治療に於け
るその使用に関する。従って、本発明の目的は、鼻咽頭
癌(NPC)、伝染性単核症、バーキット(Burki
tt’s)リンパ腫(図1および図40〜図61の凡例
参照)のようなエプスタイン−バルウイルス関連疾患と
免疫学的方法によって相関されるp150、p143、
p138、p110、p105、p90、p80、p5
4(G.J.ベイリス、H.ウルフ(G.J.Bayl
iss,H.Wolf)、下掲)のような新規エプスタ
イン・バルウイルス抗原を同定することである。本発明
のもう1つの目的は、例えばEBVが診断上重要でかつ
医療目的のために適切な該抗原をコードするB95−8
細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション(Am
erican Type Culture Colle
ction)、ロックビル、メリーランド、USA(A
TCC)CRL1612)〔J.スケア、J.L.スト
ロミンガー(J.Skare,J.L.Stromin
ger)、“エプスタイン−バルウイルスの形質転換性
B95−8株からのDNAのBamHIエンドヌクレア
ーゼ断片のクローニングおよびマッピング(Cloni
ng and Mapping of BamHI e
ndonuclease fragments of
the DNA from the trasform
ing B95−8 strain of Epste
in−Barr Virus)”、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA77,p3860(1
980)〕からクローニングされているように、EBV
のゲノム領域の位直決定(localization)
および同定である。
【0034】本発明のもう1つの目的は、p138およ
びp150のような医療用に有用な抗原の少なくとも一
部分をコードするB95−8細胞からクローニングされ
る、EBV、例えば現存のEBVライブラリーからのE
BVのゲノム領域のサブクローニングである。このこと
は、EBV B95−8サブクローンpBR322Ba
mA[J.スケア(J.Skare)ら、上掲]から誘
導されるサプゲノム断片、例えXhoI断片をプラスミ
ドpUC8(J.メッシング(J.Messing)下
掲〕(pUC635、図8参照)に接合させることによ
って達成される。
びp150のような医療用に有用な抗原の少なくとも一
部分をコードするB95−8細胞からクローニングされ
る、EBV、例えば現存のEBVライブラリーからのE
BVのゲノム領域のサブクローニングである。このこと
は、EBV B95−8サブクローンpBR322Ba
mA[J.スケア(J.Skare)ら、上掲]から誘
導されるサプゲノム断片、例えXhoI断片をプラスミ
ドpUC8(J.メッシング(J.Messing)下
掲〕(pUC635、図8参照)に接合させることによ
って達成される。
【0035】本発明のもう1つの目的は、細菌(例えば
エシェリヒア(Escherichia)属、サルモネ
ラ(Salmonella)属、プセウドモナス(Ps
eudomonas)属またはバチルス(Bacill
us)属の細菌〕、酵母〔例えばカンジダ(Candi
da)属またはサッカロミセス(Saccharomy
ces)属の酵母〕、動物細胞およびヒト細胞〔例えば
ベロ(Vero)−細胞;CHO−細胞;適当な選択系
と随意に官能性ghfr遺伝子担持プラスミドならびに
調節配列の制御下のEBV遺伝子の遺伝情報と組合わせ
たCHOdhfr細胞;あるいはリンパ芽球皮疹細胞
系〕のような適当な宿主細胞中に於けるそれぞれの遺伝
情報の発現による蛋白質の製造である。これらの宿主細
胞によって生産される蛋白質は、例えばp138、p1
50またはgp250/350関連抗原決定基を含み、
発現方式によって、融合蛋白質として、あるいは非融合
蛋白質として合成される。
エシェリヒア(Escherichia)属、サルモネ
ラ(Salmonella)属、プセウドモナス(Ps
eudomonas)属またはバチルス(Bacill
us)属の細菌〕、酵母〔例えばカンジダ(Candi
da)属またはサッカロミセス(Saccharomy
ces)属の酵母〕、動物細胞およびヒト細胞〔例えば
ベロ(Vero)−細胞;CHO−細胞;適当な選択系
と随意に官能性ghfr遺伝子担持プラスミドならびに
調節配列の制御下のEBV遺伝子の遺伝情報と組合わせ
たCHOdhfr細胞;あるいはリンパ芽球皮疹細胞
系〕のような適当な宿主細胞中に於けるそれぞれの遺伝
情報の発現による蛋白質の製造である。これらの宿主細
胞によって生産される蛋白質は、例えばp138、p1
50またはgp250/350関連抗原決定基を含み、
発現方式によって、融合蛋白質として、あるいは非融合
蛋白質として合成される。
【0036】細菌による融合蛋白質の生産のために、ゲ
ノムサブ断片例えばEBV B95−8のp138の一
部分をコードしかつ既知のプラスミドpUC8中へ導入
されるゲノムサブ断片の発現を、例えばイソプロピル−
β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって
誘発させた。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で固
定された。もう1つの融合蛋白質は、サブクローンpU
C635をEcoRIおよびBgIIIによって開裂し
かつこの断片をベクタープラスミドpUC9(U.リュ
ーター(U. ドはpUC924(図10)である。発現産物は約96
kdのサイズであった。
ノムサブ断片例えばEBV B95−8のp138の一
部分をコードしかつ既知のプラスミドpUC8中へ導入
されるゲノムサブ断片の発現を、例えばイソプロピル−
β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって
誘発させた。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で固
定された。もう1つの融合蛋白質は、サブクローンpU
C635をEcoRIおよびBgIIIによって開裂し
かつこの断片をベクタープラスミドpUC9(U.リュ
ーター(U. ドはpUC924(図10)である。発現産物は約96
kdのサイズであった。
【0037】もう1つの融合蛋白質は、pBR322B
amAの該Xhol−p138コードフラグメントの遺
伝情報をプラスミドpEA305〔E.アマン、J.ブ
ロシウス、P.プタシュネ(E.Amann,J.Br
osius,M.Pashne),大腸菌(E.col
i)中に於けるクローン化遺伝子の調節された発現のた
めに有用なハイ−ブリッドtrp−lac−プロモータ
ー担持ベクター(Vectors bearing a
hybrid trp−lac−promoter
useful for regulated expr
essionof cloned gene in
E.coli)”、ジーン(Gene)25、p.16
7(1983)〕中に於て発現させることによって産生
される。PEA305に関する適正な読取り枠中へp1
38関連情報を入れた後、クローンpMF924がλ−
リプレッサー蛋白質C1(図11)の一部分を含む融合
蛋白質を合成する。さらにもう1つの融合蛋白質は、p
138関連遺伝情報3′を含む3.0kbゲノムXho
l断片をtrp−lacプロモーターへクローニングす
る(上掲のF.アマン(F.Amann)ら記載のよう
に〕ことによって得られる。この目的には、既知のプラ
スミドpKK240−11を用いた。得られたpKK3
78は、p138関連DNA配列がその後に続くアミノ
末端メチオニン残基からなる融合蛋白質を合成する(図
12)。
amAの該Xhol−p138コードフラグメントの遺
伝情報をプラスミドpEA305〔E.アマン、J.ブ
ロシウス、P.プタシュネ(E.Amann,J.Br
osius,M.Pashne),大腸菌(E.col
i)中に於けるクローン化遺伝子の調節された発現のた
めに有用なハイ−ブリッドtrp−lac−プロモータ
ー担持ベクター(Vectors bearing a
hybrid trp−lac−promoter
useful for regulated expr
essionof cloned gene in
E.coli)”、ジーン(Gene)25、p.16
7(1983)〕中に於て発現させることによって産生
される。PEA305に関する適正な読取り枠中へp1
38関連情報を入れた後、クローンpMF924がλ−
リプレッサー蛋白質C1(図11)の一部分を含む融合
蛋白質を合成する。さらにもう1つの融合蛋白質は、p
138関連遺伝情報3′を含む3.0kbゲノムXho
l断片をtrp−lacプロモーターへクローニングす
る(上掲のF.アマン(F.Amann)ら記載のよう
に〕ことによって得られる。この目的には、既知のプラ
スミドpKK240−11を用いた。得られたpKK3
78は、p138関連DNA配列がその後に続くアミノ
末端メチオニン残基からなる融合蛋白質を合成する(図
12)。
【0038】本発明のさらにもう1つの目的は、p13
8のようなウイルス蛋白質の抗原決定基蛋白質サブ領域
のみを含有する融合蛋白質または非融合蛋白質またはオ
リゴペプチドを提供することである。この目的のため、
ディジタルエキップメントVAX11/750(Dig
ital Equipment VAX 11/75
0)コンピューターのために本発明者らが開発したコン
ピュータープログラムを用い、コンピユーター指示分析
によって、蛋白質の決定基の位置を決定する。他の問題
およびG.H.コーエン、B.ディーツショルド、M.
ポンフドレオン、D.ロング、E.ゴルブ、A.バリチ
オ、L.ペレイラ、R.J.アイゼンベルグ(G.H.
Cohen,B.Dietzschold,M.Pon
ce deLeon,D.Long,E.Golub,
A.Varrichio,L.Pereira,R.
J.Eisenberg)、中和用抗原の生産を刺激す
るヘルペスシンプレックスウイルス糖蛋白質Dの抗原決
定基の位置決定および合成(Localization
and synthesis of on anti
genic deteriminant of Her
pes simplex virus glycopr
otein D that stimulates t
he production of newtrali
zing−antibody)”、J.Virol.4
9p.102(1984)によるもう1つのコンピュー
ターのために同様なプログラムを用いた。それぞれの断 ベクター中へクローニングすることにより、pUR60
0およびpUR540のようなプラスミドが得られた。
産生された大および小融合蛋白質は、ゲル電気泳動およ
びイムノブロッティング(immunoblottin
g)実験で研究される。puR288におけるクローニ
ング実験が、小p138関連ポリぺプチドを安定化させ
るために行われた。
8のようなウイルス蛋白質の抗原決定基蛋白質サブ領域
のみを含有する融合蛋白質または非融合蛋白質またはオ
リゴペプチドを提供することである。この目的のため、
ディジタルエキップメントVAX11/750(Dig
ital Equipment VAX 11/75
0)コンピューターのために本発明者らが開発したコン
ピュータープログラムを用い、コンピユーター指示分析
によって、蛋白質の決定基の位置を決定する。他の問題
およびG.H.コーエン、B.ディーツショルド、M.
ポンフドレオン、D.ロング、E.ゴルブ、A.バリチ
オ、L.ペレイラ、R.J.アイゼンベルグ(G.H.
Cohen,B.Dietzschold,M.Pon
ce deLeon,D.Long,E.Golub,
A.Varrichio,L.Pereira,R.
J.Eisenberg)、中和用抗原の生産を刺激す
るヘルペスシンプレックスウイルス糖蛋白質Dの抗原決
定基の位置決定および合成(Localization
and synthesis of on anti
genic deteriminant of Her
pes simplex virus glycopr
otein D that stimulates t
he production of newtrali
zing−antibody)”、J.Virol.4
9p.102(1984)によるもう1つのコンピュー
ターのために同様なプログラムを用いた。それぞれの断 ベクター中へクローニングすることにより、pUR60
0およびpUR540のようなプラスミドが得られた。
産生された大および小融合蛋白質は、ゲル電気泳動およ
びイムノブロッティング(immunoblottin
g)実験で研究される。puR288におけるクローニ
ング実験が、小p138関連ポリぺプチドを安定化させ
るために行われた。
【0039】本発明のもう1つの目的は、数種の異なる
EBV血清型の抗原決定基を含む多抗原(polyan
tigens)の発現である。この目的のため、対応す
るDNA断片を連鎖し、適当なベクター中へ導入する。
発現産物は融合および非融合EBV−特異的多抗原であ
る。p150関連抗原決定基を含む別の融合蛋白質が、
pURプラスミドおよびpUCプラスミド中の対応する
DNA配列のクローニングおよび発現によって得られ
た。得られた構築物(constructs)は、組換
えプラスミドpUR290CXH580,pUR290
DBX320,pUR292DBB180,pUR29
0DTT700, pURDTT740, pUR29
0DTP680,pUR288DPP320であった。
本発明のもう1つの目的は、ウイルス蛋白質p138の
コード(coding)領域の一部分を含むpUC60
0およびpUC601のような新規の発現ベクトルの構
築である。DNA配列を、この配列に対して3′で、ベ
クター中へ導入すると、発現蛋白質は、p133特異的
アミノ酸配列によって安定化されかつプロテアーゼ分解
に対して保護される。
EBV血清型の抗原決定基を含む多抗原(polyan
tigens)の発現である。この目的のため、対応す
るDNA断片を連鎖し、適当なベクター中へ導入する。
発現産物は融合および非融合EBV−特異的多抗原であ
る。p150関連抗原決定基を含む別の融合蛋白質が、
pURプラスミドおよびpUCプラスミド中の対応する
DNA配列のクローニングおよび発現によって得られ
た。得られた構築物(constructs)は、組換
えプラスミドpUR290CXH580,pUR290
DBX320,pUR292DBB180,pUR29
0DTT700, pURDTT740, pUR29
0DTP680,pUR288DPP320であった。
本発明のもう1つの目的は、ウイルス蛋白質p138の
コード(coding)領域の一部分を含むpUC60
0およびpUC601のような新規の発現ベクトルの構
築である。DNA配列を、この配列に対して3′で、ベ
クター中へ導入すると、発現蛋白質は、p133特異的
アミノ酸配列によって安定化されかつプロテアーゼ分解
に対して保護される。
【0040】本発明のさらにもう1つの目的は、3〜1
4個のアルギニン残基のためのDNAコードと誘発現ベ
クターのクローニング部位の少なくとも1個の停止コド
ンを導入しかつさらに適当な読取り枠内に置くことによ
る該発現ベクターの修飾である。得られたベクターはp
UCARG601である。もし蛋白質物質のためのDN
A配列コードをこの発現べクター中へ挿入すると、発現
産物は、プラスミドpUCARG1140(図16
(a)参照)およびpUCARG680によってコード
された融合蛋白質のようなカルボキシ末端に該アルギニ
ン残基を担持する融合蛋白質である。かくして、本発明
の1つの目的は、H.M.サッセンフェルド、S.J.
ブリューワー(H.M.Sassenfeld,S.
J.Brewer)〔“組換え蛋白質の精製のために設
計されたポリペプチド融合(A polypeptid
e fusion designed for the
purification of recombin
at proteius)”、Bio/Technol
ogy 2,p.76(1984)〕に従って宿主細胞
溶解産物からEBVp138または関連するポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドのような診断、予防、治療に有
用な蛋白質を単離するための簡単な方法を提供すること
である。
4個のアルギニン残基のためのDNAコードと誘発現ベ
クターのクローニング部位の少なくとも1個の停止コド
ンを導入しかつさらに適当な読取り枠内に置くことによ
る該発現ベクターの修飾である。得られたベクターはp
UCARG601である。もし蛋白質物質のためのDN
A配列コードをこの発現べクター中へ挿入すると、発現
産物は、プラスミドpUCARG1140(図16
(a)参照)およびpUCARG680によってコード
された融合蛋白質のようなカルボキシ末端に該アルギニ
ン残基を担持する融合蛋白質である。かくして、本発明
の1つの目的は、H.M.サッセンフェルド、S.J.
ブリューワー(H.M.Sassenfeld,S.
J.Brewer)〔“組換え蛋白質の精製のために設
計されたポリペプチド融合(A polypeptid
e fusion designed for the
purification of recombin
at proteius)”、Bio/Technol
ogy 2,p.76(1984)〕に従って宿主細胞
溶解産物からEBVp138または関連するポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドのような診断、予防、治療に有
用な蛋白質を単離するための簡単な方法を提供すること
である。
【0041】該アルギニン残基の導入により、発現され
た蛋白質の正味の電荷はより正となり、宿主細胞の溶解
後、オリゴ−アルギニン連鎖蛋白質は、PSセファデッ
クス(Sephadex)C−25カラムクロマトグラ
フィーによって単離される。オリゴアルギニン基のた
め、このEBV特異的蛋白質は、高NaCl濃度に於て
溶出される。この溶出液を、次に、カルボキシ末端リジ
ンおよびアルギニン残基を分解するカルボキシペプチダ
ーゼBで処理する。最後にもう1つのSPセファデック
ス(Sephadex)C−25カラムクロマトグラフ
ィーを行い、EBV関連蛋白質を低食塩濃度で溶出する
(図20参照)。しかし、この方法が媒質中へ分泌され
る蛋白質の精製にも使用できることは明らかである。イ
オン交換カラムまたは発現された蛋白質に対する特異抗
体で負荷されたカラム上でのモレキュラーシーブ処理ま
たは親和性クロマトグラフィーのような他の確立された
蛋白質精製法が付加的なまたは別個の精製法として使用
できるものも明らかである。本質的に天然産蛋白質また
はその部分のアミノ酸配列を含む非融合蛋白質の生産の
ためには、本発明の組換えプラスミドを修飾することが
できる。発現ベクターの細菌蛋白質をコードする領域と
EBV関連蛋白質をコードする領域との間にオリゴヌク
レオチドリンカーを挿入する場合、オリゴヌクレオチド
に対応するアミノ酸配列が発現された融合蛋白質の一部
分となる。この融合蛋白質は、それを発現する形質転換
体から単離した後、導入されたアミノ酸リンカー中のア
ミノ酸配列特異的プロテアーゼにより、あるいはアミノ
酸リンカーが酸開裂に対して敏感なペプチド結合を含む
場合には、酸例えば蟻酸による処理によって開裂され
る。
た蛋白質の正味の電荷はより正となり、宿主細胞の溶解
後、オリゴ−アルギニン連鎖蛋白質は、PSセファデッ
クス(Sephadex)C−25カラムクロマトグラ
フィーによって単離される。オリゴアルギニン基のた
め、このEBV特異的蛋白質は、高NaCl濃度に於て
溶出される。この溶出液を、次に、カルボキシ末端リジ
ンおよびアルギニン残基を分解するカルボキシペプチダ
ーゼBで処理する。最後にもう1つのSPセファデック
ス(Sephadex)C−25カラムクロマトグラフ
ィーを行い、EBV関連蛋白質を低食塩濃度で溶出する
(図20参照)。しかし、この方法が媒質中へ分泌され
る蛋白質の精製にも使用できることは明らかである。イ
オン交換カラムまたは発現された蛋白質に対する特異抗
体で負荷されたカラム上でのモレキュラーシーブ処理ま
たは親和性クロマトグラフィーのような他の確立された
蛋白質精製法が付加的なまたは別個の精製法として使用
できるものも明らかである。本質的に天然産蛋白質また
はその部分のアミノ酸配列を含む非融合蛋白質の生産の
ためには、本発明の組換えプラスミドを修飾することが
できる。発現ベクターの細菌蛋白質をコードする領域と
EBV関連蛋白質をコードする領域との間にオリゴヌク
レオチドリンカーを挿入する場合、オリゴヌクレオチド
に対応するアミノ酸配列が発現された融合蛋白質の一部
分となる。この融合蛋白質は、それを発現する形質転換
体から単離した後、導入されたアミノ酸リンカー中のア
ミノ酸配列特異的プロテアーゼにより、あるいはアミノ
酸リンカーが酸開裂に対して敏感なペプチド結合を含む
場合には、酸例えば蟻酸による処理によって開裂され
る。
【0042】本発明のもう1つの目的は、特異的ウイル
ス抗原gp250およびgp350の少なくとも一部分
をコードするEBVのゲノム領域のクローニングであ
る。これは、pBR322BamL〔J.スケア(J.
Skare)ら、上掲〕中に含まれる細胞株B95−8
(ATCC CRL 1612)(R.バエル(R.B
aer)ら、下掲〕からのEBVゲノムをプラスミドp
UC8〔J.メッシング(J.Messing)ら、下
掲〕へ接合することによって達成される。得られた組換
えプラスミドをpUCLP1.9(図26参照)と称
す。細菌による融合蛋白質の生産のために、EBVB9
5−8のgp250およびgp350の一部分をコード
するゲノムサブ断片を、酵素β−ガラクトシダーゼをコ
ードするlacZ遺伝子の領域を担持するベクターpu
R290(U.リュター(U. の発現産物は、免疫学的方法で精製されかつ同定され
た。
ス抗原gp250およびgp350の少なくとも一部分
をコードするEBVのゲノム領域のクローニングであ
る。これは、pBR322BamL〔J.スケア(J.
Skare)ら、上掲〕中に含まれる細胞株B95−8
(ATCC CRL 1612)(R.バエル(R.B
aer)ら、下掲〕からのEBVゲノムをプラスミドp
UC8〔J.メッシング(J.Messing)ら、下
掲〕へ接合することによって達成される。得られた組換
えプラスミドをpUCLP1.9(図26参照)と称
す。細菌による融合蛋白質の生産のために、EBVB9
5−8のgp250およびgp350の一部分をコード
するゲノムサブ断片を、酵素β−ガラクトシダーゼをコ
ードするlacZ遺伝子の領域を担持するベクターpu
R290(U.リュター(U. の発現産物は、免疫学的方法で精製されかつ同定され
た。
【0043】本発明のさらにもう1つの目的は、gp2
50およびgp350の抗原決定基蛋白質サブ領域のみ
を含有する融合蛋白質または非融合蛋白質を提供するこ
とである。この目的のため、蛋白質の抗原決定基を、デ
ィジタルエキップメントVAX 11/750(Dig
ital Equipment VAX 11/75
0)コンピューター用に本発明者らが開発したコンピュ
ータープログラムを用いるコンピューター指示分析によ
って位置決定した。それぞれのDNA断片を、次に、p
UR(p−ガラクトシダーゼ)のような通常の発現ベク
ター中にクローニングする(U.リュター(U.Rut
her)ら、下掲〕。得られたプラスミドは、例えばp
URLEP600およびpURLXP390である(図
39参照)。さらに、gp250/350のN末端抗原
決定基を、pUCベクター(pURLEP600、図3
9参照)中に融合蛋白質として発現させた。gp250
およびgp350N末端抗原決定基をコードするDNA
断片を上記発現ベクターpUCARG601中へクロー
ニングすることによって、もう1つの融合蛋白質が提供
される。
50およびgp350の抗原決定基蛋白質サブ領域のみ
を含有する融合蛋白質または非融合蛋白質を提供するこ
とである。この目的のため、蛋白質の抗原決定基を、デ
ィジタルエキップメントVAX 11/750(Dig
ital Equipment VAX 11/75
0)コンピューター用に本発明者らが開発したコンピュ
ータープログラムを用いるコンピューター指示分析によ
って位置決定した。それぞれのDNA断片を、次に、p
UR(p−ガラクトシダーゼ)のような通常の発現ベク
ター中にクローニングする(U.リュター(U.Rut
her)ら、下掲〕。得られたプラスミドは、例えばp
URLEP600およびpURLXP390である(図
39参照)。さらに、gp250/350のN末端抗原
決定基を、pUCベクター(pURLEP600、図3
9参照)中に融合蛋白質として発現させた。gp250
およびgp350N末端抗原決定基をコードするDNA
断片を上記発現ベクターpUCARG601中へクロー
ニングすることによって、もう1つの融合蛋白質が提供
される。
【0044】本発明のもう1つの目的は、該コンピュー
ター分析で位置決定されたgp250およびgp350
の数個の抗原決定基を含む多抗原の発現である。この目
的のため、対応するDNA断片を連鎖させかつ適当なベ
クター中に導入する。発現産物は、融合または非融合E
BV特異性多抗原である。本発明の最終の目的は、臨床
診断または科学的研究に有用な診断用組成物(キット)
の製造のための、該EBV関連蛋白質またはそのサブ領
域または適当ならばEBV関連DNA断片またはクロー
ンの利用である。これらの試験は、ELISA〔酵素免
疫測定法(Enzyme−linked immuno
sorbent assay)〕またはRIA〔ラジオ
イムノアッセイ(Radio immuno assa
y)〕または間接的赤血球凝集試験のような原理に基づ
いている。さらに、EBV関連蛋白質は、例えばワクチ
ン接種プログラムの監視、疫学的問題の分析、患者の治
療、ならびに単核症、バーキット(Burkitt’
s)リンパ腫、鼻咽頭癌のようなEBV関連疾患の予防
および治療のためのワクチンの製造のために用いること
ができる。ワクチンは、通常の方法に従って製造され
る。随意に水酸化アルミニウムのような通常のアジュバ
ントと共に、単位投与量をバイアルに入れる。別法で
は、産物をリポゾームとの凝集体の形で投与することが
できる。患者は、抗体産生を刺激するのに十分な用量で
ワクチンを接種されかつ1か月後および6か月後に再接
種される。
ター分析で位置決定されたgp250およびgp350
の数個の抗原決定基を含む多抗原の発現である。この目
的のため、対応するDNA断片を連鎖させかつ適当なベ
クター中に導入する。発現産物は、融合または非融合E
BV特異性多抗原である。本発明の最終の目的は、臨床
診断または科学的研究に有用な診断用組成物(キット)
の製造のための、該EBV関連蛋白質またはそのサブ領
域または適当ならばEBV関連DNA断片またはクロー
ンの利用である。これらの試験は、ELISA〔酵素免
疫測定法(Enzyme−linked immuno
sorbent assay)〕またはRIA〔ラジオ
イムノアッセイ(Radio immuno assa
y)〕または間接的赤血球凝集試験のような原理に基づ
いている。さらに、EBV関連蛋白質は、例えばワクチ
ン接種プログラムの監視、疫学的問題の分析、患者の治
療、ならびに単核症、バーキット(Burkitt’
s)リンパ腫、鼻咽頭癌のようなEBV関連疾患の予防
および治療のためのワクチンの製造のために用いること
ができる。ワクチンは、通常の方法に従って製造され
る。随意に水酸化アルミニウムのような通常のアジュバ
ントと共に、単位投与量をバイアルに入れる。別法で
は、産物をリポゾームとの凝集体の形で投与することが
できる。患者は、抗体産生を刺激するのに十分な用量で
ワクチンを接種されかつ1か月後および6か月後に再接
種される。
【0045】最後に、本発明の蛋白質は、NPCまたは
慢性伝染性単核症またはEBV関連バーキット(Bur
kitt’s)リンパ腫のような疾患にかかっている患
者の免疫応答を変調することができるので、EBV関連
疾患の予防および治療に有用である。
慢性伝染性単核症またはEBV関連バーキット(Bur
kitt’s)リンパ腫のような疾患にかかっている患
者の免疫応答を変調することができるので、EBV関連
疾患の予防および治療に有用である。
【0046】発明を実施するための最良の方式 実施例1 NPCの診断に適した抗原の同定 診断上重要なEBV関連抗原のための所望なDNA配号
コード(coding)を得るため、下記の戦略を開発
した。正常な成人、新しい伝染性単核症または鼻咽頭癌
患者の種々の血清によるエプスタイン−バル(Epst
ein−Barr)ウイルス蛋白質の免疫沈降を用い
て、特別な疾患の免疫状態および特徴の診断に適切な抗
原を同定した(図1)。これらの抗原は、ハイブリッド
選択翻訳によるエプスタイン−バル(Epstein−
Barr)ウイルスゲノム上に位置決定された。配列デ
ータを用いて、これらの遺伝子をEBV−DNAからサ
ブクローニングし、真核生物および原核生物細胞中で発
現させた。
コード(coding)を得るため、下記の戦略を開発
した。正常な成人、新しい伝染性単核症または鼻咽頭癌
患者の種々の血清によるエプスタイン−バル(Epst
ein−Barr)ウイルス蛋白質の免疫沈降を用い
て、特別な疾患の免疫状態および特徴の診断に適切な抗
原を同定した(図1)。これらの抗原は、ハイブリッド
選択翻訳によるエプスタイン−バル(Epstein−
Barr)ウイルスゲノム上に位置決定された。配列デ
ータを用いて、これらの遺伝子をEBV−DNAからサ
ブクローニングし、真核生物および原核生物細胞中で発
現させた。
【0047】免疫沈降により、EAおよびVCAが単一
の抗原ではなく、数種のポリペプチドからなる抗原の群
であることがわかった〔G.J.ベイリス、H.ウルフ
(G.J.Bayliss,H.Wolf)、“エプス
タイン・バルウイルスの調節された発現。III、溶解
サイクル中EBVによって特定される蛋白質(Ther
egnlated expression of Ep
stein−Barr virus,III.Prot
eins specified by EBV dur
ing the Iytic cycle)”,J.G
en.Virol.56,p.105(1981)〕。
免疫沈降のために、EBV産生性、MA陽性細胞系P3
HR1、EBV陽性、非産生性ラジ(Raji)細胞
系、EBV陰性細胞系BJABを用いた。細胞が、約1
06/mlの密度に達したとき、等容量の新鮮な媒質で
希釈した。EBV抗原の誘発のため、P3HR1培養細
胞を、継代培養後直ちに、40ng/mlのホルボル−
12−ミストレート−13−アセテート(phorbo
l−12−mystrate−13−acetate)
〔ツルハウゼン(zur Hauzen)ら、{H.ツ
ルハウゼン、F.J.オネイル、U.K.フリーズ、E
ヘッカー(H.Zur Hauzen,F.J.O’N
eill,U.K.Freese,E.Hecker)
“腫瘍プロモーターTPAによって誘発される永続性腫
瘍原性ヘルペスウイルス(Persisting on
cogenic herpes virus indu
ced by the tumor promotor
TPA)”ネーチャー(Nature)272、p3
73(1978)}〕と3mMの酪酸とで処理した。蛋
白質を標識するため、細胞を、低速遠心分離機で集め、
50〜100μCi/mlの35S−メチオニンを含む
無メチオニンMEM培地中に2×106細胞/mlの密
度に再懸濁した。この細胞を、37℃/5%CO2で4
時間インキュベートし、次に、冷ハンクス燐酸塩緩衝食
塩水(PBS)で洗い、冷IP緩衝液(1%トライトン
−X−100、0.1%SDS;0.137M NaC
l;1mM CaCl2;1mM MgCl2;10%
グリセリン;20mMトリス−HClpH9.0;0.
01%NaN3;1μg/ml弗化フェニルメチルスル
ホニル)中に、5×106細胞/mlの濃度に再懸濁さ
せた。次に、細胞を、ソニケーションで破壊し、氷上で
60分間インキュベートした。抽出物を、100,00
0xgで、4℃に於て30分間遠心分離して清澄にし
た。35S−メチオニン標識抽出物は、記載〔G.J.
ベイリス(G.J.Bayliss)ら、上掲〕のよう
に正確に免疫沈降した。結果は図1に示してある。
の抗原ではなく、数種のポリペプチドからなる抗原の群
であることがわかった〔G.J.ベイリス、H.ウルフ
(G.J.Bayliss,H.Wolf)、“エプス
タイン・バルウイルスの調節された発現。III、溶解
サイクル中EBVによって特定される蛋白質(Ther
egnlated expression of Ep
stein−Barr virus,III.Prot
eins specified by EBV dur
ing the Iytic cycle)”,J.G
en.Virol.56,p.105(1981)〕。
免疫沈降のために、EBV産生性、MA陽性細胞系P3
HR1、EBV陽性、非産生性ラジ(Raji)細胞
系、EBV陰性細胞系BJABを用いた。細胞が、約1
06/mlの密度に達したとき、等容量の新鮮な媒質で
希釈した。EBV抗原の誘発のため、P3HR1培養細
胞を、継代培養後直ちに、40ng/mlのホルボル−
12−ミストレート−13−アセテート(phorbo
l−12−mystrate−13−acetate)
〔ツルハウゼン(zur Hauzen)ら、{H.ツ
ルハウゼン、F.J.オネイル、U.K.フリーズ、E
ヘッカー(H.Zur Hauzen,F.J.O’N
eill,U.K.Freese,E.Hecker)
“腫瘍プロモーターTPAによって誘発される永続性腫
瘍原性ヘルペスウイルス(Persisting on
cogenic herpes virus indu
ced by the tumor promotor
TPA)”ネーチャー(Nature)272、p3
73(1978)}〕と3mMの酪酸とで処理した。蛋
白質を標識するため、細胞を、低速遠心分離機で集め、
50〜100μCi/mlの35S−メチオニンを含む
無メチオニンMEM培地中に2×106細胞/mlの密
度に再懸濁した。この細胞を、37℃/5%CO2で4
時間インキュベートし、次に、冷ハンクス燐酸塩緩衝食
塩水(PBS)で洗い、冷IP緩衝液(1%トライトン
−X−100、0.1%SDS;0.137M NaC
l;1mM CaCl2;1mM MgCl2;10%
グリセリン;20mMトリス−HClpH9.0;0.
01%NaN3;1μg/ml弗化フェニルメチルスル
ホニル)中に、5×106細胞/mlの濃度に再懸濁さ
せた。次に、細胞を、ソニケーションで破壊し、氷上で
60分間インキュベートした。抽出物を、100,00
0xgで、4℃に於て30分間遠心分離して清澄にし
た。35S−メチオニン標識抽出物は、記載〔G.J.
ベイリス(G.J.Bayliss)ら、上掲〕のよう
に正確に免疫沈降した。結果は図1に示してある。
【0048】p138、p105、p90、p80に対
する抗体は、NPC血清のおのおのの中に、また他のE
BV感染特異的血清の一部の中にのみ存在する。同様に
して、p54〔上掲のG.J,ベイリス(G.J,Ba
yliss)らのp58と同じ〕に対する抗体は、新し
いEBV感染(伝染性単核症)に対して、回復期状態に
比べて有意である。p150、p143、p110に対
する抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免
疫のための、または新しいEBV感染に対するIgM特
異性試験に関連して、あるいはEBV感染腫瘍(NPC
とBL)に対するIgA特異性試験と関連して、マーカ
ーとして役立つことができる。
する抗体は、NPC血清のおのおのの中に、また他のE
BV感染特異的血清の一部の中にのみ存在する。同様に
して、p54〔上掲のG.J,ベイリス(G.J,Ba
yliss)らのp58と同じ〕に対する抗体は、新し
いEBV感染(伝染性単核症)に対して、回復期状態に
比べて有意である。p150、p143、p110に対
する抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免
疫のための、または新しいEBV感染に対するIgM特
異性試験に関連して、あるいはEBV感染腫瘍(NPC
とBL)に対するIgA特異性試験と関連して、マーカ
ーとして役立つことができる。
【0049】次の工程は、EBVゲノム上に抗原を位置
決定することであった。従って、上記EBV産生性細胞
を、誘発の2日後、4Mイソチオシアン酸グアニジンと
0.5M2−メルカプトエタノールとで溶解することに
よってRNAを調製した(J.M.チャーグイン、A.
E.プルジビラ、R.J.マクドナルド、W.J.ラッ
ター(J.M.Chirgwin,A.E.Przyb
yla,R.J.NacDonald,W.J.Rut
ter)、“リポヌクレアーゼに富む源からの生物学的
活性リポ核酸の単離(Isolation of bi
ological active ribonucle
ic acid from sources enri
ched in ribonuclease)”、バイ
オケミストリー(Biochemistry)18,
p.5294(1979)〕。溶解産物を、20,00
0rpmで1時間遠心分離し(SW41、ベックマ
ン)、2mlのCsCl、密度1.8g/cm3の上に
上澄液を重層した。
決定することであった。従って、上記EBV産生性細胞
を、誘発の2日後、4Mイソチオシアン酸グアニジンと
0.5M2−メルカプトエタノールとで溶解することに
よってRNAを調製した(J.M.チャーグイン、A.
E.プルジビラ、R.J.マクドナルド、W.J.ラッ
ター(J.M.Chirgwin,A.E.Przyb
yla,R.J.NacDonald,W.J.Rut
ter)、“リポヌクレアーゼに富む源からの生物学的
活性リポ核酸の単離(Isolation of bi
ological active ribonucle
ic acid from sources enri
ched in ribonuclease)”、バイ
オケミストリー(Biochemistry)18,
p.5294(1979)〕。溶解産物を、20,00
0rpmで1時間遠心分離し(SW41、ベックマ
ン)、2mlのCsCl、密度1.8g/cm3の上に
上澄液を重層した。
【0050】150,000gで17時間遠心分離後、
RNAペレットをクロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた。100μgの全細胞RNAを、65%のホ
ルムアルデヒドと0.4M NaClとの中で、52℃
に於て2.5時間、16μgのクローン化EBV−DN
Aにハイブリッドさせ、ソニケーションし、変性し、小
さいニトロセルロースフィルター上にスポットした。結
合したmRNAを、フィルターを90秒間水中で沸騰さ
せることによって溶出した。このRNAを、試験管内
で、mRNA依存性ウサギ網状赤血球溶解産物で翻訳し
た。翻訳産物を、前述したように〔G.J.ベイリス、
G.デビー、H.ウルフ(G.J.Bayliss,
G.Deby,H.Wolf)、“EBV誘発抗原の分
析のための免疫沈降阻止検定(An immunopr
ecipitation blocking asse
y for the analysis of EBV
induced antigens)”、J.Vir
ol,Methods 7,p.222(1983)〕
未標識EBV−陰性BJA−B細胞からの蛋白質抽出物
でプレインキュベーションした後、1検定につきヒトN
PC血清プール5μlを用いて免疫沈降させた。免疫複
合体を、蛋白質A−セファロース上に結合させ、洗浄
し、ビードを電気泳動試料緩衝液中で沸騰させることに
よって溶出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル上に負
荷した。
RNAペレットをクロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた。100μgの全細胞RNAを、65%のホ
ルムアルデヒドと0.4M NaClとの中で、52℃
に於て2.5時間、16μgのクローン化EBV−DN
Aにハイブリッドさせ、ソニケーションし、変性し、小
さいニトロセルロースフィルター上にスポットした。結
合したmRNAを、フィルターを90秒間水中で沸騰さ
せることによって溶出した。このRNAを、試験管内
で、mRNA依存性ウサギ網状赤血球溶解産物で翻訳し
た。翻訳産物を、前述したように〔G.J.ベイリス、
G.デビー、H.ウルフ(G.J.Bayliss,
G.Deby,H.Wolf)、“EBV誘発抗原の分
析のための免疫沈降阻止検定(An immunopr
ecipitation blocking asse
y for the analysis of EBV
induced antigens)”、J.Vir
ol,Methods 7,p.222(1983)〕
未標識EBV−陰性BJA−B細胞からの蛋白質抽出物
でプレインキュベーションした後、1検定につきヒトN
PC血清プール5μlを用いて免疫沈降させた。免疫複
合体を、蛋白質A−セファロース上に結合させ、洗浄
し、ビードを電気泳動試料緩衝液中で沸騰させることに
よって溶出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル上に負
荷した。
【0051】この方法で、EBV B95−8ゲノムに
対して、多数のウイルス蛋白質をマッピングすることが
できた(図2)。p138の位置決定は、図2に示して
ある。配列デーク〔R.バエル、A.T.バンキアー、
M.D.ビギン、P.L.デイニンガー、P.J.ファ
ウエル、T.J.ギブソン、G.ハトフル、G.S.ハ
ドソン、S.C.サッチウエル、C.セギン、P.S.
トゥフェル、B.バレル(R.Baer,A.T.Ba
nkier,M.D.Biggin,P.L.Dein
inger,P.J.Fawell,T.J.Gibs
on,G.Hatful,G.S.Hudson,S.
C.Satchwell,C.Seguin,P.S.
Taffuel,B.Barrell,“B95−8エ
プスタイン−バルウイルスゲノムのDNA配列および発
現(DNA−sequence and expres
sion of the B95−8 Epstein
−Barr virus genome)”、ネーチャ
ー(Nature)310.,p.207(198
4)〕を用いて、p138およびp54のための適当な
オープン読取り枠を確認した(図2)。これらのオープ
ン読取り枠は、ウイルスゲノムの右端のBamA断片の
右部に完全に含まれる。
対して、多数のウイルス蛋白質をマッピングすることが
できた(図2)。p138の位置決定は、図2に示して
ある。配列デーク〔R.バエル、A.T.バンキアー、
M.D.ビギン、P.L.デイニンガー、P.J.ファ
ウエル、T.J.ギブソン、G.ハトフル、G.S.ハ
ドソン、S.C.サッチウエル、C.セギン、P.S.
トゥフェル、B.バレル(R.Baer,A.T.Ba
nkier,M.D.Biggin,P.L.Dein
inger,P.J.Fawell,T.J.Gibs
on,G.Hatful,G.S.Hudson,S.
C.Satchwell,C.Seguin,P.S.
Taffuel,B.Barrell,“B95−8エ
プスタイン−バルウイルスゲノムのDNA配列および発
現(DNA−sequence and expres
sion of the B95−8 Epstein
−Barr virus genome)”、ネーチャ
ー(Nature)310.,p.207(198
4)〕を用いて、p138およびp54のための適当な
オープン読取り枠を確認した(図2)。これらのオープ
ン読取り枠は、ウイルスゲノムの右端のBamA断片の
右部に完全に含まれる。
【0052】実施例2 p138コード領域のクローニング R.バエル(R.Baer)ら(上掲)の配列データに
よると、p138をコードするために適した大きいオー
プン読取り枠がEBV B95−8のBamAフラグメ
ントに含まれている。p138の遺伝子のヌクレオチド
配列、対応するアミノ酸配列とそれぞれの調節素子は、
図3〜図7に示してある。プラスミドpBR322−B
amA〔J.スケア(J.Skare)ら、上掲〕のD
NA50μgを、150mM MgCl、6mMメルカ
プトエタノール、6mMトリス−HCl、pH7.9を
含む全容150μl中で、37℃に於て2時間、50U
Xhol(ベーリンガー(Boehringer)〕
で消化した。停止緩衝液10mMトリス−HCl、50
mM EDTA、60%蔗糖、1%プロムフェノールブ
ルー、pH7.5)30μlを添加し、混合物を、酢酸
塩緩衝液(0.04Mトリス−酢酸塩、2mM EDT
A、pH7.6)中で分取用1%アガロースゲル上に置
き、4℃に於て、40Vで16時間電気泳動を行った。
サイズマーカーとして、Hind III消化λ−ファ
ージDNA(ベーリンガー(Boehringer)〕
を用いた。トリス−酢酸緩衝液中のゲルをエチジウムプ
ロミド(0.5μg/ml)で、室温(RT)に於て1
時間染色後、UV照明によってDNAを可視化し、3.
0kbおよび3.3kbに対応するバンドを切り取った
〔3.0kbのXholで生成された断片は所望の断片
であり、3.3kbのXhoIで生成された断片は部分
消化産物である
よると、p138をコードするために適した大きいオー
プン読取り枠がEBV B95−8のBamAフラグメ
ントに含まれている。p138の遺伝子のヌクレオチド
配列、対応するアミノ酸配列とそれぞれの調節素子は、
図3〜図7に示してある。プラスミドpBR322−B
amA〔J.スケア(J.Skare)ら、上掲〕のD
NA50μgを、150mM MgCl、6mMメルカ
プトエタノール、6mMトリス−HCl、pH7.9を
含む全容150μl中で、37℃に於て2時間、50U
Xhol(ベーリンガー(Boehringer)〕
で消化した。停止緩衝液10mMトリス−HCl、50
mM EDTA、60%蔗糖、1%プロムフェノールブ
ルー、pH7.5)30μlを添加し、混合物を、酢酸
塩緩衝液(0.04Mトリス−酢酸塩、2mM EDT
A、pH7.6)中で分取用1%アガロースゲル上に置
き、4℃に於て、40Vで16時間電気泳動を行った。
サイズマーカーとして、Hind III消化λ−ファ
ージDNA(ベーリンガー(Boehringer)〕
を用いた。トリス−酢酸緩衝液中のゲルをエチジウムプ
ロミド(0.5μg/ml)で、室温(RT)に於て1
時間染色後、UV照明によってDNAを可視化し、3.
0kbおよび3.3kbに対応するバンドを切り取った
〔3.0kbのXholで生成された断片は所望の断片
であり、3.3kbのXhoIで生成された断片は部分
消化産物である
【0053】1つのXhoI制限部位が切断されていな
い)〕。アガロース片を透析袋内に入れ、3容のトリス
−酢酸緩衝液を添加して各バンドのDNAを溶出し、4
時間(100V、4℃)電気泳動を行った。エルティッ
プD(Elutip D)カラム〔シュライヒェルアン
ドシェル(Schleicher & Schuel
l)〕で、メーカーが推奨する方法に従ってクロマトグ
ラフィーを行い、含まれているエチジウムプロミドをイ
ソアミルアルコールで抽出し、2.5容のエタノールを
加え、1晩中−20℃でインキュベートして沈澱させる
ことによってさらに精製した。このDNAを、ソーバル
SS34(Sorvall SS 34)ローター中で
遠心分離(17,000rpm、20分)することによ
って集め、70%エタノールで洗浄し、凍結乾燥後、D
NAをTE緩衝液(10mMトリス−HCl、1 mM
EDTA,pH7.5)15μlに溶解した。
い)〕。アガロース片を透析袋内に入れ、3容のトリス
−酢酸緩衝液を添加して各バンドのDNAを溶出し、4
時間(100V、4℃)電気泳動を行った。エルティッ
プD(Elutip D)カラム〔シュライヒェルアン
ドシェル(Schleicher & Schuel
l)〕で、メーカーが推奨する方法に従ってクロマトグ
ラフィーを行い、含まれているエチジウムプロミドをイ
ソアミルアルコールで抽出し、2.5容のエタノールを
加え、1晩中−20℃でインキュベートして沈澱させる
ことによってさらに精製した。このDNAを、ソーバル
SS34(Sorvall SS 34)ローター中で
遠心分離(17,000rpm、20分)することによ
って集め、70%エタノールで洗浄し、凍結乾燥後、D
NAをTE緩衝液(10mMトリス−HCl、1 mM
EDTA,pH7.5)15μlに溶解した。
【0054】単離された2つの断片のDNA濃度を、お
のおの1μlを100ngおよび1μgのpUC8DN
Aと並列で電気泳動することによって概算した。ベクタ
ーpUC8(ドイッチェサムルングフュールミクロオル
ガニズメン(Deut れ番号DSM3420〕〔J.メッシング、J.ビエイ
ラ、“2重消化制限断片の(of double−di
gest restriction fragment
s)”ジーン(Gene)19、p.269(198
2)〕のSalIIで消化したDNAを前述のようにし
て調製した。但し、次のリガーゼ反応中、ベクターの再
連結を抑制するため、DNAをアルカリホスファターゼ
(0.5単位(Boehringer)、37℃で30
分〕で処理した。
のおの1μlを100ngおよび1μgのpUC8DN
Aと並列で電気泳動することによって概算した。ベクタ
ーpUC8(ドイッチェサムルングフュールミクロオル
ガニズメン(Deut れ番号DSM3420〕〔J.メッシング、J.ビエイ
ラ、“2重消化制限断片の(of double−di
gest restriction fragment
s)”ジーン(Gene)19、p.269(198
2)〕のSalIIで消化したDNAを前述のようにし
て調製した。但し、次のリガーゼ反応中、ベクターの再
連結を抑制するため、DNAをアルカリホスファターゼ
(0.5単位(Boehringer)、37℃で30
分〕で処理した。
【0055】以下に於て、2種の精製断片のおのおのを
開裂ベクター中へ挿入した(SalIおよびXhoIは
同じ付着末端すなわち−TGCA−を生ずる)。この目
的のため、各断片に対して、1U T4−DNAリガー
ゼ〔ベーリンガー(Boehringer)〕を含むリ
ガーゼ緩衝液(10mMトリス、10mM MgC
l2、6mMメルカプトエタノール、0.6mM AT
P、pH7.5)全容20μl中、300ngのDNA
断片と100ngのpUC8DNAとで連結反応を行っ
た。14℃に於て20時間後、80μlのTE緩衝液と
200μlのコンピテント大腸菌(E.coli)JM
83細胞(ATCC35607)〔J.ビエイラ、J.
メッシング(J.Vieira,J.Messing、
“合成万能プライマーによる挿入突然変異および配列化
のためのpUCプラスミド、M13mp7 誘導系(T
he pUC Plasmids,an M 13mp
7−derived system for ins
ertion mutagenesis and se
quencing with synthetic u
niversalprimers)”、ジーン(Gen
e)19,p.259(1982)〕とを添加した。
開裂ベクター中へ挿入した(SalIおよびXhoIは
同じ付着末端すなわち−TGCA−を生ずる)。この目
的のため、各断片に対して、1U T4−DNAリガー
ゼ〔ベーリンガー(Boehringer)〕を含むリ
ガーゼ緩衝液(10mMトリス、10mM MgC
l2、6mMメルカプトエタノール、0.6mM AT
P、pH7.5)全容20μl中、300ngのDNA
断片と100ngのpUC8DNAとで連結反応を行っ
た。14℃に於て20時間後、80μlのTE緩衝液と
200μlのコンピテント大腸菌(E.coli)JM
83細胞(ATCC35607)〔J.ビエイラ、J.
メッシング(J.Vieira,J.Messing、
“合成万能プライマーによる挿入突然変異および配列化
のためのpUCプラスミド、M13mp7 誘導系(T
he pUC Plasmids,an M 13mp
7−derived system for ins
ertion mutagenesis and se
quencing with synthetic u
niversalprimers)”、ジーン(Gen
e)19,p.259(1982)〕とを添加した。
【0056】塩化カルシウム法〔M.マンデル、A.ヒ
ガ(M.Mandel,A.Higa)、“カルシウム
依存性バクテリオファージDNA感染(Cdlcium
dependent bacterophage D
NA infection)”,J.Mol.Bio
l.53,p154(1970)〕に従って形質転換を
行った。次に、この細胞を、1.5mlのL−ブロス
(5g酵母エキス、10gトリプトン、5g NaC
l)と混合し、37℃に於て1.5時間インキュベート
し、最後に、50μg/mlのアンピシリン〔シグマ
(Sigma)〕と40μg/mlのX−gal〔ベー
リンガー(Boehringer)〕とを補足したL−
ブロス寒天平板上で平板培養した。この培養中、再連結
pUC8分子を担持する細菌は青色コロニーを生じ、組
換えプラスミドを担持する細菌は白色コロニーを生じ
た。
ガ(M.Mandel,A.Higa)、“カルシウム
依存性バクテリオファージDNA感染(Cdlcium
dependent bacterophage D
NA infection)”,J.Mol.Bio
l.53,p154(1970)〕に従って形質転換を
行った。次に、この細胞を、1.5mlのL−ブロス
(5g酵母エキス、10gトリプトン、5g NaC
l)と混合し、37℃に於て1.5時間インキュベート
し、最後に、50μg/mlのアンピシリン〔シグマ
(Sigma)〕と40μg/mlのX−gal〔ベー
リンガー(Boehringer)〕とを補足したL−
ブロス寒天平板上で平板培養した。この培養中、再連結
pUC8分子を担持する細菌は青色コロニーを生じ、組
換えプラスミドを担持する細菌は白色コロニーを生じ
た。
【0057】所望の組換えプラスミドを担持するコロニ
ーの同定のため、12個の白色コロニーを取り、L−ブ
ロス中で37℃に於て1晩中増殖させた。H.C.バー
ンボイムとJ.ドーリー(H.C.Birnboim
and J.Doly)〔“組換えプラスミドDNAの
スクリーニングのための迅速なアルカリ抽出法(Ara
pid alkaline extraction p
rocedurefor screening rec
ombinant plasmid DNA)”,Nu
cl.Acids Res.7,p.1513(197
9)〕によるDNA製剤の試料をBamHIおよびHi
ndIIIで消化し、前述のようにアガロースゲル上で
電気泳動を行った。さらに組入れられた断片の配向を示
すために、BamHIおよびBglIIで消化を行い、
最後に、3.3kbをXhoI消化によって試験した。
プラスミドpUC635は、BamA断片(pBR32
2BamA)の3.0kbXhoIサブ断片を、適正な
配向および1acUV5プロモーターに対する適正な読
取り枠内で担持しかつほとんど全138(図8)の発現
のために用いられる。pUC635でコードされた融合
蛋白質は、β−ガラクトシダーゼアミノ末端の12個の
アミノ酸とp138の約1020個のアミノ酸とβ−ガ
ラクトシダーゼのカルボキシ末端部分の60個のアミノ
酸とpBR322でコードされた領域のもう29個のア
ミノ酸とからなる。
ーの同定のため、12個の白色コロニーを取り、L−ブ
ロス中で37℃に於て1晩中増殖させた。H.C.バー
ンボイムとJ.ドーリー(H.C.Birnboim
and J.Doly)〔“組換えプラスミドDNAの
スクリーニングのための迅速なアルカリ抽出法(Ara
pid alkaline extraction p
rocedurefor screening rec
ombinant plasmid DNA)”,Nu
cl.Acids Res.7,p.1513(197
9)〕によるDNA製剤の試料をBamHIおよびHi
ndIIIで消化し、前述のようにアガロースゲル上で
電気泳動を行った。さらに組入れられた断片の配向を示
すために、BamHIおよびBglIIで消化を行い、
最後に、3.3kbをXhoI消化によって試験した。
プラスミドpUC635は、BamA断片(pBR32
2BamA)の3.0kbXhoIサブ断片を、適正な
配向および1acUV5プロモーターに対する適正な読
取り枠内で担持しかつほとんど全138(図8)の発現
のために用いられる。pUC635でコードされた融合
蛋白質は、β−ガラクトシダーゼアミノ末端の12個の
アミノ酸とp138の約1020個のアミノ酸とβ−ガ
ラクトシダーゼのカルボキシ末端部分の60個のアミノ
酸とpBR322でコードされた領域のもう29個のア
ミノ酸とからなる。
【0058】プラスミドpUC6130は、反対の配向
の3.3kbの断片を担持する(図8)。大腸菌(E.
co1i)K12JM83株は、β−ガラクトシダーゼ
リプレッサー過剰生産株でないので、融合蛋白質は構成
的に発現される。従って、プラスミドpUC635を、
β−ガラクトシダーゼリプレッサー過剰生産株大腸菌
(E.coli)K12BMH71−18(DSM34
13)〔U.リュター、B.ミュラー・ヒル ion of cDNA clones)”、EMBO
Journal 10,p.1791(1983)〕
中へ導入した。大腸菌(E.coli)K12MBH7
1−18株の代わりに、大腸菌(E.coli)K12
JM109(DSM3423)も使用することができる
(実験方法の本質的変化なしに)。pUC635以外
に、他の3種のプラスミド、pUC924、pMF92
4、pKK378(図10−図12)が構築された。
の3.3kbの断片を担持する(図8)。大腸菌(E.
co1i)K12JM83株は、β−ガラクトシダーゼ
リプレッサー過剰生産株でないので、融合蛋白質は構成
的に発現される。従って、プラスミドpUC635を、
β−ガラクトシダーゼリプレッサー過剰生産株大腸菌
(E.coli)K12BMH71−18(DSM34
13)〔U.リュター、B.ミュラー・ヒル ion of cDNA clones)”、EMBO
Journal 10,p.1791(1983)〕
中へ導入した。大腸菌(E.coli)K12MBH7
1−18株の代わりに、大腸菌(E.coli)K12
JM109(DSM3423)も使用することができる
(実験方法の本質的変化なしに)。pUC635以外
に、他の3種のプラスミド、pUC924、pMF92
4、pKK378(図10−図12)が構築された。
【0059】pKK378の挿入物は同じXhoI部位
から始まり、停止コドンの第3XhoI部位がある25
0bp3′まで続く。この3.3kbの断片は、不完全
な消化によって生成され、tac−プロモーターとpK
K240−11〔F.アマン(F.Amann)ら、上
掲〕の開始コドンとの背後に挿入された。発現産物は僅
か2種の細菌アミノ酸を含み、そのサイズは、細菌la
cZ部分が無くなっているのでpUC635の発現産物
のサイズより小さい。pUC924は、BglII部位
から第3XhoI部位までの断片を含む。pUC9(D
SM3421)はベクターとして用いられた。この挿入
物(insert)のサイズはpUC635中のものよ
りも小さいので、またp138からの停止コドンを用い
るので、発現産物の分子量はpUC635およびpKK
378に於けるよりも小さいと期待される。
から始まり、停止コドンの第3XhoI部位がある25
0bp3′まで続く。この3.3kbの断片は、不完全
な消化によって生成され、tac−プロモーターとpK
K240−11〔F.アマン(F.Amann)ら、上
掲〕の開始コドンとの背後に挿入された。発現産物は僅
か2種の細菌アミノ酸を含み、そのサイズは、細菌la
cZ部分が無くなっているのでpUC635の発現産物
のサイズより小さい。pUC924は、BglII部位
から第3XhoI部位までの断片を含む。pUC9(D
SM3421)はベクターとして用いられた。この挿入
物(insert)のサイズはpUC635中のものよ
りも小さいので、またp138からの停止コドンを用い
るので、発現産物の分子量はpUC635およびpKK
378に於けるよりも小さいと期待される。
【0060】プラスミドpMF924は、pEA305
〔E.アマン(E.Amann)ら、上掲〕と、pUC
924と同じBglII−XhoI断片とから構築され
た。pMF1は、後にC1リプレッサーのN末端部分が
続くtac−プロモーターを有し、得られる融合蛋白質
はpUC924に於けるよりも17kd大きいと期待さ
れる。これらの構築物は、tac−およびlac−プロ
モーターをIPTGで誘導しかつSDS−PAGE上で
蛋白質を分離することによって、EBV関連抗原の産生
について試験された。領域内のクーマッシー(Coom
assie)ブルー染色ゲル上に、新しいバンドは全く
見られないか、または弱いバンドしか見られなかった。
しかし蛋白質をニトロセルロース上へ移行し、高力価N
PC−プール血清とペルオキシダーゼ接合第2抗IgG
抗体とで免疫染色した後、すべての構築物に於て新しい
EBV特異的バンドが明らかに検出された(図8)。
〔E.アマン(E.Amann)ら、上掲〕と、pUC
924と同じBglII−XhoI断片とから構築され
た。pMF1は、後にC1リプレッサーのN末端部分が
続くtac−プロモーターを有し、得られる融合蛋白質
はpUC924に於けるよりも17kd大きいと期待さ
れる。これらの構築物は、tac−およびlac−プロ
モーターをIPTGで誘導しかつSDS−PAGE上で
蛋白質を分離することによって、EBV関連抗原の産生
について試験された。領域内のクーマッシー(Coom
assie)ブルー染色ゲル上に、新しいバンドは全く
見られないか、または弱いバンドしか見られなかった。
しかし蛋白質をニトロセルロース上へ移行し、高力価N
PC−プール血清とペルオキシダーゼ接合第2抗IgG
抗体とで免疫染色した後、すべての構築物に於て新しい
EBV特異的バンドが明らかに検出された(図8)。
【0061】発現された蛋白は、すべて、ほとんど初期
のサイズを示すが、収量は広範囲にわたっていた。pU
C635およびpMF924でコードされる蛋白質は、
puC924およびpKK378からの非融合蛋白質よ
りも安定に発現できるように思われる。しかし、pUC
635からの最高の発現蛋白質でも、その収量は、真核
生物蛋白質の大きいサイズのためであるかも知れないが
クーマッシー染色ゲル(Coomassie−stai
ned gel)に於て極めて弱いバンドしか見られな
かったので大規模生産にとっては低過ぎる。
のサイズを示すが、収量は広範囲にわたっていた。pU
C635およびpMF924でコードされる蛋白質は、
puC924およびpKK378からの非融合蛋白質よ
りも安定に発現できるように思われる。しかし、pUC
635からの最高の発現蛋白質でも、その収量は、真核
生物蛋白質の大きいサイズのためであるかも知れないが
クーマッシー染色ゲル(Coomassie−stai
ned gel)に於て極めて弱いバンドしか見られな
かったので大規模生産にとっては低過ぎる。
【0062】実施例3 pUC635、pUC924、pMF924、pKK3
78でコードされる蛋白質の免疫学的検定 プラスミドpUC635、pUC924、pMF92
4、pKK378で形質転換された宿主細胞を、50μ
g/mlのアンピシリンで補足されたL−ブロス中で、
細胞密度OD600=0.8に培養した。次に、β−ガ
ラクトシダーゼの誘導のため、乳糖アナロゴン(ana
logon)イソプロピル−β−D−チオガラクトピラ
ノシド(IPTG:シグマ(Sigma)〕を添加した
(最終濃度:1mM)。37℃に於て1.5時間、さら
にインキュベーション後、培養細胞を遠心分離した。こ
の細胞を、200μlの沸騰混合物(2%SDS.5%
メルカプトエタノール、3%蔗糖、50mMトリス−H
Cl、pH7.0)中に再懸濁し、100℃で10分間
加熱した。得られた蛋白質抽出物20μlを12.5%
ポリアクリルアミドゲル上で分離し、最後に、クーマッ
シーブルー染色で可視化したが、発現産物の収量が非常
に低いので、免疫染色が必要であった。そこで、電気泳
動で分離した蛋白質をニトロセルロースフィルターへ移
行した。すなわち、“ウエスタン・ブロット(West
ern−blot)”を調製した(J.レナート、J.
ライサー、G.R.シャーク(J.Renart,J.
Reiser,G.R.Shark,“ゲルからジアゾ
ベンジル−メチル−ペーパーへの蛋白質の移行および抗
血清による検出(Transfer of prote
ins from gels to diazoben
zyl−methyl−paper and dete
ction with antisera)”、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA76、p.
3116(1979):獣医学に於ける潜在的ヘルペス
感染(Latent Herpes Infectio
ns in Veterinary Medicin
e)、マーチヌスニジノフ(Martinus Nij
inoff)Publ,p105(1984)中のS.
モドロー、H.ウルフ(S.Modrow,H.Wol
f)、“ヘルペスウイルスサイミリおよびヘルペスウイ
ルスアテレスで誘発された蛋白質のキャラクタリゼーシ
ョン(characterization of he
rpesvirus saimiri and her
pesvirus ateles induced p
roteins)”〕。
78でコードされる蛋白質の免疫学的検定 プラスミドpUC635、pUC924、pMF92
4、pKK378で形質転換された宿主細胞を、50μ
g/mlのアンピシリンで補足されたL−ブロス中で、
細胞密度OD600=0.8に培養した。次に、β−ガ
ラクトシダーゼの誘導のため、乳糖アナロゴン(ana
logon)イソプロピル−β−D−チオガラクトピラ
ノシド(IPTG:シグマ(Sigma)〕を添加した
(最終濃度:1mM)。37℃に於て1.5時間、さら
にインキュベーション後、培養細胞を遠心分離した。こ
の細胞を、200μlの沸騰混合物(2%SDS.5%
メルカプトエタノール、3%蔗糖、50mMトリス−H
Cl、pH7.0)中に再懸濁し、100℃で10分間
加熱した。得られた蛋白質抽出物20μlを12.5%
ポリアクリルアミドゲル上で分離し、最後に、クーマッ
シーブルー染色で可視化したが、発現産物の収量が非常
に低いので、免疫染色が必要であった。そこで、電気泳
動で分離した蛋白質をニトロセルロースフィルターへ移
行した。すなわち、“ウエスタン・ブロット(West
ern−blot)”を調製した(J.レナート、J.
ライサー、G.R.シャーク(J.Renart,J.
Reiser,G.R.Shark,“ゲルからジアゾ
ベンジル−メチル−ペーパーへの蛋白質の移行および抗
血清による検出(Transfer of prote
ins from gels to diazoben
zyl−methyl−paper and dete
ction with antisera)”、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA76、p.
3116(1979):獣医学に於ける潜在的ヘルペス
感染(Latent Herpes Infectio
ns in Veterinary Medicin
e)、マーチヌスニジノフ(Martinus Nij
inoff)Publ,p105(1984)中のS.
モドロー、H.ウルフ(S.Modrow,H.Wol
f)、“ヘルペスウイルスサイミリおよびヘルペスウイ
ルスアテレスで誘発された蛋白質のキャラクタリゼーシ
ョン(characterization of he
rpesvirus saimiri and her
pesvirus ateles induced p
roteins)”〕。
【0063】ウエスタン−ブロット緩衝液(72%グリ
シン、15gトリス、1リットルメタノール、蒸留水で
5リットルにする)中、電流強度0.8Aで3時間、ウ
エスタン・ブロットを調製した。次に、ニトロセルロー
スを、コーエン(Cohen)緩衝液〔0.1%フィコ
ール(Ficoll)400、1%ポリビニルピロリド
ン、1.6%BSA、0.1%NP40,0.05%ゼ
ラチン、0.17MH3BO3、28mM NaOH、
150mM NaCl、6mM NaN3、pH8.
2)で3時間飽和し、NPC患者からの1:50希釈高
力価EBV特異的血清と共に1晩中インキュベートし
た。血清は、細菌蛋白質から生ずるバックグラウンドを
少なくするため、細菌蛋白質抽出液(1ml/109大
腸菌(E.coli)細胞〕に予め吸収させておいた。
次に、ニトロセルロースフィルターをゼラチン緩衝液
(50mMトリス−HCl、5mM EDTA、150
mMNaCl、0.25%ゼラチン、0.5%トライト
ン、0.2%SDS、pH7.5)中で5時間洗浄する
ことによって未結合IgGを除去した。吸収されたEB
V−特異性蛋白質を可視化するために、ペルオキシダー
ゼにカップリングさせかつTN緩衝液(154mM N
aCl、10mMトリス、pH7.4)で1:200に
希釈したウサギ抗ヒトIgG抗体を添加した。室温で2
時間後、未結合のウサギ抗体を、前述のようにゼラチン
緩衝液で洗浄することによって除去した。最後に、10
0mlの5mMトリス−HCl、pH7,5中で、50
mgのジアミノベンジジン(シグマSigma)と40
μlのH2O2とを加え、室温で10分間インキュベー
トすることによって、ペルオキシダーゼ反応を行った。
この実験の結果は図9に示してある。
シン、15gトリス、1リットルメタノール、蒸留水で
5リットルにする)中、電流強度0.8Aで3時間、ウ
エスタン・ブロットを調製した。次に、ニトロセルロー
スを、コーエン(Cohen)緩衝液〔0.1%フィコ
ール(Ficoll)400、1%ポリビニルピロリド
ン、1.6%BSA、0.1%NP40,0.05%ゼ
ラチン、0.17MH3BO3、28mM NaOH、
150mM NaCl、6mM NaN3、pH8.
2)で3時間飽和し、NPC患者からの1:50希釈高
力価EBV特異的血清と共に1晩中インキュベートし
た。血清は、細菌蛋白質から生ずるバックグラウンドを
少なくするため、細菌蛋白質抽出液(1ml/109大
腸菌(E.coli)細胞〕に予め吸収させておいた。
次に、ニトロセルロースフィルターをゼラチン緩衝液
(50mMトリス−HCl、5mM EDTA、150
mMNaCl、0.25%ゼラチン、0.5%トライト
ン、0.2%SDS、pH7.5)中で5時間洗浄する
ことによって未結合IgGを除去した。吸収されたEB
V−特異性蛋白質を可視化するために、ペルオキシダー
ゼにカップリングさせかつTN緩衝液(154mM N
aCl、10mMトリス、pH7.4)で1:200に
希釈したウサギ抗ヒトIgG抗体を添加した。室温で2
時間後、未結合のウサギ抗体を、前述のようにゼラチン
緩衝液で洗浄することによって除去した。最後に、10
0mlの5mMトリス−HCl、pH7,5中で、50
mgのジアミノベンジジン(シグマSigma)と40
μlのH2O2とを加え、室温で10分間インキュベー
トすることによって、ペルオキシダーゼ反応を行った。
この実験の結果は図9に示してある。
【0064】実施例4 プラスミドpUC635でコードされるβ−gal:p
138融合蛋白質の精製 クローン大腸菌(E.coli)K12JM109pU
C635を、上述のアンピシリンで補足したL−ブロス
500ml中で、37℃に於て、OD560が0.8に
なるまで増殖させた。融合蛋白質合成を、IPTG(1
mM)で誘導し、さらに2時間インキュベーションを続
行した後、GSAローター(ソーバル(Sorval
l)〕中で、5000rpmで10分間遠心分離して細
胞を集め、この細胞を、50mlの20mMトリスーH
Cl、pH7.5に再懸濁した。細胞を溶解するため、
EDTA(最終濃度50mM)とリゾチーム(最終濃度
2mg/ml)とを添加し、この混合物を、37℃に於
て30分間インキュベートした。次に、細胞を、8分
間、2回ソニケーション〔ラブソニック150(Lab
sonic150)、プラウン(Braun)〕し、ト
ライトンX−100を最終濃度3%になるように添加
し、37℃に於てさらに30分間インキュベートした
後、10,000rpmで20分間遠心分離〔SS34
ローター{ソーバル(Sorvall)}〕することに
よって、懸濁液中の不溶粒子をペレット化した。得られ
たペレットを、8M尿素、10mMトリスーHCl、
0.5%β−メルカプトエタノール、pH7.5の溶液
20mlに溶解し、前のように再度遠心分離した。最後
に、80mgの蛋白質を、緩衝液(8M尿素、10mM
トリス、0.1%β−メルカプトエタノール、pH7.
5)でカラムクロマトグラフィー〔セファロース2β−
Cl{ファーマシア(Pharmacia)}、長さ8
0cm、直径3cm〕にかけた。捕集した4mlずつの
試料のおのおのの30μlを、15%PAGEで分析
し、融合蛋白質含有分画をプールした。
138融合蛋白質の精製 クローン大腸菌(E.coli)K12JM109pU
C635を、上述のアンピシリンで補足したL−ブロス
500ml中で、37℃に於て、OD560が0.8に
なるまで増殖させた。融合蛋白質合成を、IPTG(1
mM)で誘導し、さらに2時間インキュベーションを続
行した後、GSAローター(ソーバル(Sorval
l)〕中で、5000rpmで10分間遠心分離して細
胞を集め、この細胞を、50mlの20mMトリスーH
Cl、pH7.5に再懸濁した。細胞を溶解するため、
EDTA(最終濃度50mM)とリゾチーム(最終濃度
2mg/ml)とを添加し、この混合物を、37℃に於
て30分間インキュベートした。次に、細胞を、8分
間、2回ソニケーション〔ラブソニック150(Lab
sonic150)、プラウン(Braun)〕し、ト
ライトンX−100を最終濃度3%になるように添加
し、37℃に於てさらに30分間インキュベートした
後、10,000rpmで20分間遠心分離〔SS34
ローター{ソーバル(Sorvall)}〕することに
よって、懸濁液中の不溶粒子をペレット化した。得られ
たペレットを、8M尿素、10mMトリスーHCl、
0.5%β−メルカプトエタノール、pH7.5の溶液
20mlに溶解し、前のように再度遠心分離した。最後
に、80mgの蛋白質を、緩衝液(8M尿素、10mM
トリス、0.1%β−メルカプトエタノール、pH7.
5)でカラムクロマトグラフィー〔セファロース2β−
Cl{ファーマシア(Pharmacia)}、長さ8
0cm、直径3cm〕にかけた。捕集した4mlずつの
試料のおのおのの30μlを、15%PAGEで分析
し、融合蛋白質含有分画をプールした。
【0065】実施例5 コンピューター解析で確認される抗原決定基をコードす
るp138サブ領域のクローニング 原理的に、診断用試験に於ては、抗原蛋白質の抗原決定
基サブ領域だけが必要である。従って、p138アミノ
酸配列をコンピュータープログラムで解折し、同定され
たこの遺伝子のサブ領域を適当なベクター中に導入し
た。かかる小蛋白質の産生は、これら小蛋白質が産物の
長さが減少するにつれて抗原性の急速な変化を受けにく
くなるという利点がある。さらに特別には、クラス特異
的抗体の検定に関して、診断上の価値がある。P.チョ
ウとG.ファスマン(P.chou and G.Fa
sman)の方法〔“蛋白質から計算されるα−ヘリカ
ル−β−シートおよびランダムコイル領域に於けるアミ
ノ酸の配座パラメーター(Conformationa
l parameters for aminoaci
ds in α−herical β−sheet a
nd random coil regions ca
lculated from proteins)”、
バイオケミトリー(Biochemistry)13,
p.211(1974)〕によれば、そのアミノ酸配列
(1次構造)によってひき起こされる蛋白質のおよその
2次構造の計算が可能である。示唆された構造に重ね
て、プログラムが相対的親水性、疎水性を決定する。両
方のデータセットを組合わせて、2次構造のα−ヘリカ
ル、β−シート、β−ターニングおよびランダムコイル
領域を示すコンピューターグラフィックが描かれる。そ
れによって親水性領域および疎水性領域が、それぞれ白
丸および黒丸で示される。
るp138サブ領域のクローニング 原理的に、診断用試験に於ては、抗原蛋白質の抗原決定
基サブ領域だけが必要である。従って、p138アミノ
酸配列をコンピュータープログラムで解折し、同定され
たこの遺伝子のサブ領域を適当なベクター中に導入し
た。かかる小蛋白質の産生は、これら小蛋白質が産物の
長さが減少するにつれて抗原性の急速な変化を受けにく
くなるという利点がある。さらに特別には、クラス特異
的抗体の検定に関して、診断上の価値がある。P.チョ
ウとG.ファスマン(P.chou and G.Fa
sman)の方法〔“蛋白質から計算されるα−ヘリカ
ル−β−シートおよびランダムコイル領域に於けるアミ
ノ酸の配座パラメーター(Conformationa
l parameters for aminoaci
ds in α−herical β−sheet a
nd random coil regions ca
lculated from proteins)”、
バイオケミトリー(Biochemistry)13,
p.211(1974)〕によれば、そのアミノ酸配列
(1次構造)によってひき起こされる蛋白質のおよその
2次構造の計算が可能である。示唆された構造に重ね
て、プログラムが相対的親水性、疎水性を決定する。両
方のデータセットを組合わせて、2次構造のα−ヘリカ
ル、β−シート、β−ターニングおよびランダムコイル
領域を示すコンピューターグラフィックが描かれる。そ
れによって親水性領域および疎水性領域が、それぞれ白
丸および黒丸で示される。
【0066】かかるコンピューターグラフィックの1例
は、図13にp138アミノ酸配列について示してあ
る。抗原性部位が、蛋白質の表面にある親水性β−ター
ンに主として位置するとの仮定に基づくと、p138の
ほぼアミノ酸520とカルボキシ末端との間の領域が抗
原性であるべきである。対応するDNA配列はpUC6
35のPstI断片によって示される。かくして、pU
C635をPstIで開裂し、すべてのPstI断片を
単離し、PStI開裂pUC8中へ導入し、付加的な4
00bpを有する残りのベクター断片(p138をコー
ドする配列の第1PstI部位まで)を再連結させた
(方法はすべて実施例2記載の通り)。得られた組換え
プラスミドを、それぞれpUCP400、pUCP38
0、pUCP600、pUCP210、pUCP75
0、pUCP540と称した。p138をコードする配
列のアミノ末端領域は、プラスミドpBR322−Ba
mAをPstIおよびHgiAIで消化しかつ該断片を
PstI開裂pUC9中へ挿入することによってクロー
ニングされた〔J.メッシング(J.Messing)
ら、上掲〕(実施例2記載の方法)。得られた組換えプ
ラスミドをpUCHPと称す。翻訳が挿入の3′末端で
停止するpUcHPは例外であるが、pUC8に対する
すべてのサブクローン配向および読取り枠は正しい。最
後に、この組換えプラスミドを大腸菌(E.coli)
K12JM109細胞中へ導入した。
は、図13にp138アミノ酸配列について示してあ
る。抗原性部位が、蛋白質の表面にある親水性β−ター
ンに主として位置するとの仮定に基づくと、p138の
ほぼアミノ酸520とカルボキシ末端との間の領域が抗
原性であるべきである。対応するDNA配列はpUC6
35のPstI断片によって示される。かくして、pU
C635をPstIで開裂し、すべてのPstI断片を
単離し、PStI開裂pUC8中へ導入し、付加的な4
00bpを有する残りのベクター断片(p138をコー
ドする配列の第1PstI部位まで)を再連結させた
(方法はすべて実施例2記載の通り)。得られた組換え
プラスミドを、それぞれpUCP400、pUCP38
0、pUCP600、pUCP210、pUCP75
0、pUCP540と称した。p138をコードする配
列のアミノ末端領域は、プラスミドpBR322−Ba
mAをPstIおよびHgiAIで消化しかつ該断片を
PstI開裂pUC9中へ挿入することによってクロー
ニングされた〔J.メッシング(J.Messing)
ら、上掲〕(実施例2記載の方法)。得られた組換えプ
ラスミドをpUCHPと称す。翻訳が挿入の3′末端で
停止するpUcHPは例外であるが、pUC8に対する
すべてのサブクローン配向および読取り枠は正しい。最
後に、この組換えプラスミドを大腸菌(E.coli)
K12JM109細胞中へ導入した。
【0067】実施例6 pUR288p138サブクローンを用いるコンピュー
ター解析によって同定された抗原決定基の発現 pUCサブクローン(実施例5)は、短いために適当な
3次構造を構築できず、従って完全な蛋白質よりもプロ
テアーゼによって大きな程度に分解される可能性がある
ため細菌中で安定に発現できないので、本発明者らは、
該PstI断片サブクローンをBamHIおよびHin
dIIIで開裂しかつそれぞれの断片を単離してそれら
をBamHIおよびHindIIIで開裂したpUR2
88中へ連結させること(方法はすべて実施例2記載の
通り)によって、pUR288(DSM3415)
(U.リュター(U.Ruther)ら、上掲〕によっ
てコードされるβ−ガラクトシダーゼの少なくとも一部
分を用いて大融合蛋白質をコードする組換えプラスミド
を構築した。
ター解析によって同定された抗原決定基の発現 pUCサブクローン(実施例5)は、短いために適当な
3次構造を構築できず、従って完全な蛋白質よりもプロ
テアーゼによって大きな程度に分解される可能性がある
ため細菌中で安定に発現できないので、本発明者らは、
該PstI断片サブクローンをBamHIおよびHin
dIIIで開裂しかつそれぞれの断片を単離してそれら
をBamHIおよびHindIIIで開裂したpUR2
88中へ連結させること(方法はすべて実施例2記載の
通り)によって、pUR288(DSM3415)
(U.リュター(U.Ruther)ら、上掲〕によっ
てコードされるβ−ガラクトシダーゼの少なくとも一部
分を用いて大融合蛋白質をコードする組換えプラスミド
を構築した。
【0068】大腸菌(E.coli)K12JM109
中で発現を行った。産物は、実施例3記載のようにして
分析した。ゲルのクーマッシー(Coomassie)
ブルー染色後、サイズの異なる数種の大融合蛋白質を検
出したが、ウエスタン・ブロットの調製後、pUR60
0およびpUR540によって発現される産物だけが上
記IgG抗体と特異的反応を示した(図14)。これら
の結果は、コンピューター解析とよく一致している。ま
た、実施例5によって得られるクローンの発現を実施例
3記載に従って行った。産物も、実施例3記載のように
して分析した。クーマッシー(Coomassie)染
色ゲルから、プラスミドpUCP600とpUCP38
0だけが安定な融合蛋白質をコードすると考えることが
できる。ウエスタン・ブロットは、pUCP600誘導
融合蛋白質だけが抗原性であることを示す(図15)。
この融合蛋白質は、アミノ末端クローニング部位でコー
ドされる11種のアミノ酸とp138の約600bpに
よってコードされる領域と1acZ遣伝子のカルボキシ
末端アミノ酸とを含む。かくして、組換え発現プラスミ
ドpUR600およびpUR540ならびにpUCP6
00は、それぞれがEBV蛋白質p138の抗原決定基
を含む、大融合蛋白質および小融合蛋白質の生産に使用
することができる。
中で発現を行った。産物は、実施例3記載のようにして
分析した。ゲルのクーマッシー(Coomassie)
ブルー染色後、サイズの異なる数種の大融合蛋白質を検
出したが、ウエスタン・ブロットの調製後、pUR60
0およびpUR540によって発現される産物だけが上
記IgG抗体と特異的反応を示した(図14)。これら
の結果は、コンピューター解析とよく一致している。ま
た、実施例5によって得られるクローンの発現を実施例
3記載に従って行った。産物も、実施例3記載のように
して分析した。クーマッシー(Coomassie)染
色ゲルから、プラスミドpUCP600とpUCP38
0だけが安定な融合蛋白質をコードすると考えることが
できる。ウエスタン・ブロットは、pUCP600誘導
融合蛋白質だけが抗原性であることを示す(図15)。
この融合蛋白質は、アミノ末端クローニング部位でコー
ドされる11種のアミノ酸とp138の約600bpに
よってコードされる領域と1acZ遣伝子のカルボキシ
末端アミノ酸とを含む。かくして、組換え発現プラスミ
ドpUR600およびpUR540ならびにpUCP6
00は、それぞれがEBV蛋白質p138の抗原決定基
を含む、大融合蛋白質および小融合蛋白質の生産に使用
することができる。
【0069】実施例7 真核生物蛋白質のそれ自体不安定な部分の安定化のため
のプラスミドpUCP600でコードされる蛋白質の応
用 実施例6の実験によって、p138で誘導される蛋白質
部分が、プラスミドpUCP600でコードされる蛋白
質以外は不安定であることがわかった。p138のC末
端からの第2抗原領域(p540、図13参照)は、組
換えpUCベクターpUcP540を用いて安定に発現
することができない。かかるそれ自体不安定な発現産物
を安定化させるp138のp600領域の能力を本実施
例で示す。このためには、該プラスミドをSstIおよ
HindIIIで消化(SstI部位は第1PstI部
位から約20 bp 3′のところにある)することに
よって、pUcP600の5′−PstI部位を除去し
なければならなかった。このp138関連SstI−H
indIII断片をSstI/HindIII開裂pU
C12(DSM3422)中へ挿入したR.ウー、L.
グロスマン、K.モルドアブ(R.Wu,L.Gro
Bmann and K.Moldoave)編著、酵
素学の方法(Methods of Enzymolo
gy)Vol101,Part C中のJ.メッシング
(J.Messing)、“クローニング用の新M13
ベクター(New M 13 Vectors for
Cloning),Acad.Pres.,New
York,1983,20−78)。
のプラスミドpUCP600でコードされる蛋白質の応
用 実施例6の実験によって、p138で誘導される蛋白質
部分が、プラスミドpUCP600でコードされる蛋白
質以外は不安定であることがわかった。p138のC末
端からの第2抗原領域(p540、図13参照)は、組
換えpUCベクターpUcP540を用いて安定に発現
することができない。かかるそれ自体不安定な発現産物
を安定化させるp138のp600領域の能力を本実施
例で示す。このためには、該プラスミドをSstIおよ
HindIIIで消化(SstI部位は第1PstI部
位から約20 bp 3′のところにある)することに
よって、pUcP600の5′−PstI部位を除去し
なければならなかった。このp138関連SstI−H
indIII断片をSstI/HindIII開裂pU
C12(DSM3422)中へ挿入したR.ウー、L.
グロスマン、K.モルドアブ(R.Wu,L.Gro
Bmann and K.Moldoave)編著、酵
素学の方法(Methods of Enzymolo
gy)Vol101,Part C中のJ.メッシング
(J.Messing)、“クローニング用の新M13
ベクター(New M 13 Vectors for
Cloning),Acad.Pres.,New
York,1983,20−78)。
【0070】次に、得られた組換えプラスミドをEco
R iおよびPstIで消化した。得られた600bp
断片をプラスミドpUC8中へ挿入した。今や、5′−
PStI部位は SstI部位で置換されており、かく
して、読取り枠は、挿入物の3′−および5 ′−末端
の所で再構成される(図16(a))。得られた組換え
プラスミドpUC 601は、依然として安定な産物を
発現する(図17)。EBVをコードする配列の3′末
端に於けるPstIおよびHindIII部の間に、5
アルギニンと2個の停止コドンを枠内にコードする公知
の方法で得られた合成オリゴペプチドを図16(b)の
ように挿入した。得られたプラスミドpUCARC60
1は、そのC末端で5個のアルギニン残基に融合するp
138のP600を領域をコードする。最終工程に於
て、p138のP540領域をコードするPstI断片
を、PstIによる消化後のp138のP600領域を
コードするPstI断片へ連結した。得られた組換えプ
ラスミドpUCARG1140は、枠内に融合されたp
138の2個の抗原部位を含む約43kdの安定な蛋白
質をコードする。この融合蛋白質に於て、蛋白質領域P
600は蛋白質領域P540を安定化する(図17)。
発現産物のカルボキシ末端に於けるアルギニン残基は、
サッセンフェルドとブリューワー(Sassenfel
d and Brewer)(上掲)が記載しているよ
うに、得られた融合蛋白質の精製のために用いることが
できる(図20)。
R iおよびPstIで消化した。得られた600bp
断片をプラスミドpUC8中へ挿入した。今や、5′−
PStI部位は SstI部位で置換されており、かく
して、読取り枠は、挿入物の3′−および5 ′−末端
の所で再構成される(図16(a))。得られた組換え
プラスミドpUC 601は、依然として安定な産物を
発現する(図17)。EBVをコードする配列の3′末
端に於けるPstIおよびHindIII部の間に、5
アルギニンと2個の停止コドンを枠内にコードする公知
の方法で得られた合成オリゴペプチドを図16(b)の
ように挿入した。得られたプラスミドpUCARC60
1は、そのC末端で5個のアルギニン残基に融合するp
138のP600を領域をコードする。最終工程に於
て、p138のP540領域をコードするPstI断片
を、PstIによる消化後のp138のP600領域を
コードするPstI断片へ連結した。得られた組換えプ
ラスミドpUCARG1140は、枠内に融合されたp
138の2個の抗原部位を含む約43kdの安定な蛋白
質をコードする。この融合蛋白質に於て、蛋白質領域P
600は蛋白質領域P540を安定化する(図17)。
発現産物のカルボキシ末端に於けるアルギニン残基は、
サッセンフェルドとブリューワー(Sassenfel
d and Brewer)(上掲)が記載しているよ
うに、得られた融合蛋白質の精製のために用いることが
できる(図20)。
【0071】実施例8 組換えプラスミドpUCARG680の構築 プラスミドpUCARG1140から、p138をコー
ドする領域の435bpとp600断片のC末端部分と
p540断片のN末端部分とが欠けている修飾プラスミ
ド(modified version)を構築した。
コンピュータープログラムで予想された主な抗原性部位
は依然として存在する。このプラスミドをpUCARG
680と称した。このプラスミドの構築は、pUCAR
G1140をNcoIで消化することによって達成され
た(開裂部位は図3〜図7中のbp 1841およびb
p 3243に相当する)p600NcoI部位中およ
びp540NcoI部位中の読取り枠は合わないので、
付着末端をS1ヌクレアーゼで除去した。30μgのp
UCARG1140をNcoIで消化し、3.3kbベ
クター−p138断片をゲル電気泳動で分離し、精製し
た。このDNA断片5μgを、33mM酢酸ナトリウ
ム、50mM NaC1、0.03mM ZnSO4、
pH4.5の100μlで、室温に於て15分間、10
0単位S1ヌクレアーゼで消化した。フェノール抽出に
より消化を停止させ、エタノールで沈殿させた後、この
DNAをT4−DNAリガーゼで再連結させ、コンピテ
ント大腸菌(E.coli)K12JM109細胞の形
質転換に用いた。得られたクローンを、サイズ30kb
の新しい蛋白質(pUCARG680)の出現のために
スクリーニングした。pUCARG680でコードされ
る短縮されたp600/p540融蛋白質は、依然とし
て抗原として反応する。新たに構築された組換えプラス
ミドpUCARG680(DSM3408)は、DSM
3408の寄託番号でDSMに寄託された。
ドする領域の435bpとp600断片のC末端部分と
p540断片のN末端部分とが欠けている修飾プラスミ
ド(modified version)を構築した。
コンピュータープログラムで予想された主な抗原性部位
は依然として存在する。このプラスミドをpUCARG
680と称した。このプラスミドの構築は、pUCAR
G1140をNcoIで消化することによって達成され
た(開裂部位は図3〜図7中のbp 1841およびb
p 3243に相当する)p600NcoI部位中およ
びp540NcoI部位中の読取り枠は合わないので、
付着末端をS1ヌクレアーゼで除去した。30μgのp
UCARG1140をNcoIで消化し、3.3kbベ
クター−p138断片をゲル電気泳動で分離し、精製し
た。このDNA断片5μgを、33mM酢酸ナトリウ
ム、50mM NaC1、0.03mM ZnSO4、
pH4.5の100μlで、室温に於て15分間、10
0単位S1ヌクレアーゼで消化した。フェノール抽出に
より消化を停止させ、エタノールで沈殿させた後、この
DNAをT4−DNAリガーゼで再連結させ、コンピテ
ント大腸菌(E.coli)K12JM109細胞の形
質転換に用いた。得られたクローンを、サイズ30kb
の新しい蛋白質(pUCARG680)の出現のために
スクリーニングした。pUCARG680でコードされ
る短縮されたp600/p540融蛋白質は、依然とし
て抗原として反応する。新たに構築された組換えプラス
ミドpUCARG680(DSM3408)は、DSM
3408の寄託番号でDSMに寄託された。
【0072】実施例9 プラスミドpUCARG1140でコードされる融合蛋
白質の抗原性の検定 個々のNPC血清を用いる、組換えプラスミドpUCA
RG1140、pUC540、pUR600(実施例6
および7)でコードされる融合蛋白質とのイムノブロッ
ト(immunoblots)は、種々の患者で免疫反
応が異なることを示す(図18)。これに関して、該プ
ラスミドはp138領域P540+P600、P54
0、P600をそれぞれ含む融合蛋白質をコードするこ
とを理解せねばならない。NPC血清No.352に於
てIgGおよびIgA抗体の主分画はP540領域に向
けられるが、NPC血清No.354中の主分画はp1
38のP600領域に向けられる。NPC患者からの多
くの血清から調製された代表的プールは付加的な抗原性
部位を検出しなかった。この発見からの結論は、本発明
の組換えプラスミドによってコードされる抗原決定基P
540、P600が、診断目的に有用なELISA試験
のために所望な特異性を得るのに必要かつ十分であると
いうことである。
白質の抗原性の検定 個々のNPC血清を用いる、組換えプラスミドpUCA
RG1140、pUC540、pUR600(実施例6
および7)でコードされる融合蛋白質とのイムノブロッ
ト(immunoblots)は、種々の患者で免疫反
応が異なることを示す(図18)。これに関して、該プ
ラスミドはp138領域P540+P600、P54
0、P600をそれぞれ含む融合蛋白質をコードするこ
とを理解せねばならない。NPC血清No.352に於
てIgGおよびIgA抗体の主分画はP540領域に向
けられるが、NPC血清No.354中の主分画はp1
38のP600領域に向けられる。NPC患者からの多
くの血清から調製された代表的プールは付加的な抗原性
部位を検出しなかった。この発見からの結論は、本発明
の組換えプラスミドによってコードされる抗原決定基P
540、P600が、診断目的に有用なELISA試験
のために所望な特異性を得るのに必要かつ十分であると
いうことである。
【0073】実施例10 ELISA試験に於けるNPCの検出のための、pUC
ARG1140でコードされる融合蛋白質の応用 pUCARG1140でコードされる精製融合蛋白質を
ミクロ力価平板に塗抹した。個々のNPC血清を、その
IgGについて、また特にそのIgA反応性について試
験した。これらの血清のIgA−抗EA力価は、通常の
免疫蛍光法試験で前もって測定した。最高力価は1:8
0であった。図19に示すELISA試験では、2種の
EBV陰性血清、1種のNPC血清プール、10種の個
々のNPC血清を、1:10640希釈まで試験した。
試験は、通常のELISA試験法に従って行った。結合
した抗体は、ペルオキシダーゼで接合したマウス抗ヒト
IgGすなわちIgAとペルオキシダーゼとの反応で検
出した。すべてのNPC血清が塗抹抗原との反応(Ig
Aで1:2560まで)を示し、陰性対照ではバックグ
ラウンド反応は見られなかった。この結果は、pUCA
RG1140でコードされる発現産物がNPCの診断お
よび早期発見に適していることを示している。
ARG1140でコードされる融合蛋白質の応用 pUCARG1140でコードされる精製融合蛋白質を
ミクロ力価平板に塗抹した。個々のNPC血清を、その
IgGについて、また特にそのIgA反応性について試
験した。これらの血清のIgA−抗EA力価は、通常の
免疫蛍光法試験で前もって測定した。最高力価は1:8
0であった。図19に示すELISA試験では、2種の
EBV陰性血清、1種のNPC血清プール、10種の個
々のNPC血清を、1:10640希釈まで試験した。
試験は、通常のELISA試験法に従って行った。結合
した抗体は、ペルオキシダーゼで接合したマウス抗ヒト
IgGすなわちIgAとペルオキシダーゼとの反応で検
出した。すべてのNPC血清が塗抹抗原との反応(Ig
Aで1:2560まで)を示し、陰性対照ではバックグ
ラウンド反応は見られなかった。この結果は、pUCA
RG1140でコードされる発現産物がNPCの診断お
よび早期発見に適していることを示している。
【0074】実施例11 ベクターpUC8中のgp350をコードする遺伝子の
サブ領域のクローニング gp250およびgp350を
コードする領域をEBV B95−8ゲノムのBam L断片〔J.スケア(J.Skere)ら、上掲〕にマ
ッピングした。両方のポリペプチドが同一領域を共有す
るので、両蛋白質は読取り枠を重ねることによってコー
ドされると想像された(M・ハンメル、D.ソーリー・
ローソン、E.キーフ(M.Hummel,D.Tho
rley−Lawson,E.Kieff),“エプス
タイン・バルウイルスDNA断片は2種の主なエンベロ
ープ糖蛋白質(gp350/300とgp220/20
0)のためのメッセージをコードする(Epstein
−Barr virus DNA fngments
encodes messages for the
two major envelope glycop
roteins (gp350/300 and gp
220/200))”、J.of Virol 49,
P.413(1984)〕。バエル(Baer)ら(上
掲)の配列データは、ウイルスゲノムの該BamL断片
中のドナースプライス部位とアクセプタースプライス部
位とを含む大きいオープン読取り枠を示した(図21〜
図24および図25)。
サブ領域のクローニング gp250およびgp350を
コードする領域をEBV B95−8ゲノムのBam L断片〔J.スケア(J.Skere)ら、上掲〕にマ
ッピングした。両方のポリペプチドが同一領域を共有す
るので、両蛋白質は読取り枠を重ねることによってコー
ドされると想像された(M・ハンメル、D.ソーリー・
ローソン、E.キーフ(M.Hummel,D.Tho
rley−Lawson,E.Kieff),“エプス
タイン・バルウイルスDNA断片は2種の主なエンベロ
ープ糖蛋白質(gp350/300とgp220/20
0)のためのメッセージをコードする(Epstein
−Barr virus DNA fngments
encodes messages for the
two major envelope glycop
roteins (gp350/300 and gp
220/200))”、J.of Virol 49,
P.413(1984)〕。バエル(Baer)ら(上
掲)の配列データは、ウイルスゲノムの該BamL断片
中のドナースプライス部位とアクセプタースプライス部
位とを含む大きいオープン読取り枠を示した(図21〜
図24および図25)。
【0075】gp350はこの領域から転写されたスプ
ライシングされないmRNAの翻訳産物でありかつgp
250は対応するスプライシングされたmRNAの産物
であると仮定される(図21〜図24)。両産物共にウ
イルスカプシド中に見いだされるので、免疫グロブリン
H鎖遺伝子と匹敵できる方法〔T,ホンジョウ(T.H
onjo,“免疫グロブリン遺伝子(immunogl
obulin genes)”、Ann.Rev.of
Immunol.1,p.499(1983)〕で該
mRNAの示差スプラシングが起こると仮定される。こ
のスプライシング中で、gp350をコードするmRN
Aの630 bp が除去されて、gp250をコード
するmRNAが得られる(図21〜図24および図39
(点線)〕〔R.バエル(R.Baer)ら、上掲〕。
従って、gp350の読取り枠の全部または一部分をク
ローニングして、最終的にgp350関連産物を単離し
かつ産生させる。gp250だけでなくgp350も高
度にグリコシル化された蛋白質であることに留意せねば
ならない。対照的に、本発明による組換えDNA分子の
発現によって産生される蛋白質は、天然に通常存在する
それぞれのウイルス蛋白質と異なる。原核生物中で発現
が行われる場合には、未修飾蛋白質が得られるが、真核
生物中で発現が行われる場合には、異なるグリコシル化
パターンあるいは天然産物に比べて別の修飾を有する蛋
白質が得られる。
ライシングされないmRNAの翻訳産物でありかつgp
250は対応するスプライシングされたmRNAの産物
であると仮定される(図21〜図24)。両産物共にウ
イルスカプシド中に見いだされるので、免疫グロブリン
H鎖遺伝子と匹敵できる方法〔T,ホンジョウ(T.H
onjo,“免疫グロブリン遺伝子(immunogl
obulin genes)”、Ann.Rev.of
Immunol.1,p.499(1983)〕で該
mRNAの示差スプラシングが起こると仮定される。こ
のスプライシング中で、gp350をコードするmRN
Aの630 bp が除去されて、gp250をコード
するmRNAが得られる(図21〜図24および図39
(点線)〕〔R.バエル(R.Baer)ら、上掲〕。
従って、gp350の読取り枠の全部または一部分をク
ローニングして、最終的にgp350関連産物を単離し
かつ産生させる。gp250だけでなくgp350も高
度にグリコシル化された蛋白質であることに留意せねば
ならない。対照的に、本発明による組換えDNA分子の
発現によって産生される蛋白質は、天然に通常存在する
それぞれのウイルス蛋白質と異なる。原核生物中で発現
が行われる場合には、未修飾蛋白質が得られるが、真核
生物中で発現が行われる場合には、異なるグリコシル化
パターンあるいは天然産物に比べて別の修飾を有する蛋
白質が得られる。
【0076】BarnL断片をpBR322に導入し、
得られた組換えプラスミドで大腸菌(E.coli)K
12HB101を形質転換させた〔J.スケア(J.S
kare)、上掲〕。宿主大腸菌(E.coli)K1
2HB101の代わりに、本発明に用いた宿主細菌を用
いてもよい。M.ハンメル(M.Hunrmel)ら、
(上掲)、J.R.ノース(J.R.North)ら、
〔J.R.ノース、A.J.モーガン、J.L.トンプ
ソン、M.A.エプスタイン(J.R.North,
A.J.Morgan,J.L.Thompson,
M.A.Epstdn),“精製エプスタイン・バルウ
イルスMr340,000糖蛋白質は、リポソーム中に
取込まれるとき、強力なウイルス中和性抗体を誘導する
(Purified Epstein−Barruvi
rus Mr 340,000 glycoprote
in induces potent virus−n
eutralizing antibodies wh
en incorporated in liposo
mes)”Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA79,p.7504(1982)〕およびD.
A.ソーリー・ローソンとC.A.プードリー(D.
A.Thorley−Lawson and C.A.
Poodry)〔“試験管内で中和用抗体の生成の原因
となるエプスタイン−バルウイルスの主成分(gp35
0−gp220)の同定と単離(Idenficati
on and Isolation of the M
ain Component(gp350−gp22
0)of Epstein−Barr Virus R
esponsiblefor Generating
Neutralizing Antibodies I
n Vivo)”,J.Virol 43,p.730
(1984)〕の刊行物の内容は、gp250/350
をコードする配列の領域が十分に抗原性でかつ(あるい
は)免疫原性の蛋白質をコードすることおよびこれらの
サブ領域の導入後のこれらの産物が原核生物細胞中およ
び真核生物細胞中で安定に発現され得ることを予想する
ことはできない。従って、本発明の完全に未修飾のまた
は異なる方法で修飾されたgp250/350関連蛋白
質が十分に活性な抗原および(または)免疫原であるこ
とは驚くべきことである。特に、先行刊行物中では、蛋
白質の小さい炭水化物残基がこの蛋白質の抗原または免
疫原ポテンシャルに明らかに寄与することは除外されな
かった。
得られた組換えプラスミドで大腸菌(E.coli)K
12HB101を形質転換させた〔J.スケア(J.S
kare)、上掲〕。宿主大腸菌(E.coli)K1
2HB101の代わりに、本発明に用いた宿主細菌を用
いてもよい。M.ハンメル(M.Hunrmel)ら、
(上掲)、J.R.ノース(J.R.North)ら、
〔J.R.ノース、A.J.モーガン、J.L.トンプ
ソン、M.A.エプスタイン(J.R.North,
A.J.Morgan,J.L.Thompson,
M.A.Epstdn),“精製エプスタイン・バルウ
イルスMr340,000糖蛋白質は、リポソーム中に
取込まれるとき、強力なウイルス中和性抗体を誘導する
(Purified Epstein−Barruvi
rus Mr 340,000 glycoprote
in induces potent virus−n
eutralizing antibodies wh
en incorporated in liposo
mes)”Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA79,p.7504(1982)〕およびD.
A.ソーリー・ローソンとC.A.プードリー(D.
A.Thorley−Lawson and C.A.
Poodry)〔“試験管内で中和用抗体の生成の原因
となるエプスタイン−バルウイルスの主成分(gp35
0−gp220)の同定と単離(Idenficati
on and Isolation of the M
ain Component(gp350−gp22
0)of Epstein−Barr Virus R
esponsiblefor Generating
Neutralizing Antibodies I
n Vivo)”,J.Virol 43,p.730
(1984)〕の刊行物の内容は、gp250/350
をコードする配列の領域が十分に抗原性でかつ(あるい
は)免疫原性の蛋白質をコードすることおよびこれらの
サブ領域の導入後のこれらの産物が原核生物細胞中およ
び真核生物細胞中で安定に発現され得ることを予想する
ことはできない。従って、本発明の完全に未修飾のまた
は異なる方法で修飾されたgp250/350関連蛋白
質が十分に活性な抗原および(または)免疫原であるこ
とは驚くべきことである。特に、先行刊行物中では、蛋
白質の小さい炭水化物残基がこの蛋白質の抗原または免
疫原ポテンシャルに明らかに寄与することは除外されな
かった。
【0077】図21〜図24に示すように、BamL断
片(ハンメル(Hummel)ら、上掲〕の1.9 K
b PstI PstI断片は、アミノ酸位置232か
ら始まりアミノ酸位置825で終わるgp350をコー
ドする領域の部分を含んでいる。H.C.バーンボイム
とJ.ドーリィ(H.C.Birnboim and
J.Doly)〔“組換えプラスミドDNAをスクリー
ニングするための迅速アルカリ抽出法(A rapid
alkaline extraction proc
edure for screening recom
binant plasmid DNA)”、Nuc
l.Acids Res.7,p.1513(197
9)〕が発表した方法に従って、pBR322−Bam
LプラスミドDNAの大規模調製を行った。このDNA
50μgを、50mM NaC1、10mM MgCl
2、1mM DTT,10mMトリスーHC1、pH
7.5中で、37℃に於て2時間、100単位のPst
I〔ベーリンガー(Boehringer)〕で消化し
た。1/5容の、50mM EDTA、60%蔗糖、2
%ブロムフェノールブルーを添加して消化を停止した。
得られた溶液を、トリス−酢酸緩衝液(0.04Mトリ
スー酢酸、2mM EDTA、pH7.6)中の1%ア
ガロースゲル(シーケム(Seakem)、FMC〕上
で電気泳動によって分離した。サイズマーカーとして、
Hind III消化λ−ファージDNA(ベーリンガ
ー(Boehringer)〕を用いた。室温(RT)
に於て14時間、40Vで電気泳動した後、ゲルを、
0.5μg/mlエチジウムプロミド含有トリスー酢酸
緩衝液で染色した。
片(ハンメル(Hummel)ら、上掲〕の1.9 K
b PstI PstI断片は、アミノ酸位置232か
ら始まりアミノ酸位置825で終わるgp350をコー
ドする領域の部分を含んでいる。H.C.バーンボイム
とJ.ドーリィ(H.C.Birnboim and
J.Doly)〔“組換えプラスミドDNAをスクリー
ニングするための迅速アルカリ抽出法(A rapid
alkaline extraction proc
edure for screening recom
binant plasmid DNA)”、Nuc
l.Acids Res.7,p.1513(197
9)〕が発表した方法に従って、pBR322−Bam
LプラスミドDNAの大規模調製を行った。このDNA
50μgを、50mM NaC1、10mM MgCl
2、1mM DTT,10mMトリスーHC1、pH
7.5中で、37℃に於て2時間、100単位のPst
I〔ベーリンガー(Boehringer)〕で消化し
た。1/5容の、50mM EDTA、60%蔗糖、2
%ブロムフェノールブルーを添加して消化を停止した。
得られた溶液を、トリス−酢酸緩衝液(0.04Mトリ
スー酢酸、2mM EDTA、pH7.6)中の1%ア
ガロースゲル(シーケム(Seakem)、FMC〕上
で電気泳動によって分離した。サイズマーカーとして、
Hind III消化λ−ファージDNA(ベーリンガ
ー(Boehringer)〕を用いた。室温(RT)
に於て14時間、40Vで電気泳動した後、ゲルを、
0.5μg/mlエチジウムプロミド含有トリスー酢酸
緩衝液で染色した。
【0078】UV照射によってゲル中のDNAバンドを
可視化し、実施例2記載のようにして1.9kb Ps
tI−PstI断片を単離した。ベクターpUC8のP
stI消化DNAを前述のようにして調製した。但し、
次のリガーゼ反応中、ベクターの再連結を抑制するため
DNAをアルカリホスファターゼ(0.5単位(Boe
hringer)、37℃、30分)で処理した。精製
した断片のおのおの1μlを、100ngおよび500
ngのpUC8−DNAと共に並列で電気泳動(上述の
条件下で)することによって、精製断片の濃度を概算し
た。1.9kbPstI−PstI断片400ngとP
stI消化ベクターDNA100ngとを連結させ、連
結したプラスミドDNAで大腸菌(E.coli)K1
2JM109を形質転換させ、実施例2記載のようにし
て陽性クローンを同定した。得られたクローンを大腸菌
(E.coli)K12JM109pUCLP 1.9
と呼び、得られた組換えプラスミドを組換えプラスミド
pUCLP1.9と呼んだ。
可視化し、実施例2記載のようにして1.9kb Ps
tI−PstI断片を単離した。ベクターpUC8のP
stI消化DNAを前述のようにして調製した。但し、
次のリガーゼ反応中、ベクターの再連結を抑制するため
DNAをアルカリホスファターゼ(0.5単位(Boe
hringer)、37℃、30分)で処理した。精製
した断片のおのおの1μlを、100ngおよび500
ngのpUC8−DNAと共に並列で電気泳動(上述の
条件下で)することによって、精製断片の濃度を概算し
た。1.9kbPstI−PstI断片400ngとP
stI消化ベクターDNA100ngとを連結させ、連
結したプラスミドDNAで大腸菌(E.coli)K1
2JM109を形質転換させ、実施例2記載のようにし
て陽性クローンを同定した。得られたクローンを大腸菌
(E.coli)K12JM109pUCLP 1.9
と呼び、得られた組換えプラスミドを組換えプラスミド
pUCLP1.9と呼んだ。
【0079】実施例12 ベクターpUR290中に於けるgp350をコードす
るサブ領域のクローニング gp350サブ領域の安定産物の発現のため、該1.9
kbPstI−PstI断片をベクターpUR290
(DSM3417)(図27)(U.リュター(U.R
uther)ら、下掲〕中にリクローニング(recl
on)した。得られた組換えプラスミドは、gp350
のアミノ酸232〜825とpUR290およびpBR
322ヌクレオチド残基のクローニング部位によってコ
ードされるアミノ酸とがその後に続く、β−ガラクトシ
ダーゼのアミノ末端領域の融合蛋白質をコードする。そ
れぞれのアミノ酸配列を図28〜図33に示す。プラス
ミドpUCLP1.9のDNA50μgを100単位の
BamHIおよびHind IIIで消化し、上述のよ
うにして1%アガロースゲル上で分離した。初めにpU
C8中に導入したPst1−PstI断片により僅かに
数個多くのヌクレオチドを含む、ここに得られた1.9
kbBamHI/Hind III断片を、その他の得
られた断片から1%アガロースゲル上で(上述したよう
にして)分離し、最後に、上述のようにしてゲルから単
離し、ベクターpUR290のBamHI/Hind
III消化DNA クローンの容易な同定(Easy identific
ation of cDNA clones)”、EM
BO Journal 10,p.1791(198
3)〕中へ、上述の方法に従って連結させた。次の工程
は、これらの組換えDNA分子によるβ−ガラクトシダ
ーゼリプレッサー・蛋白質過剰産生株の形質転換であっ
た。形質転換体を平板培養し、上述のように分析した。
但し、DNA調製物の試料をBamHI/Hind I
IIおよびEcoRIで消化した。得られたクローン、
大腸菌(E.coli)K12JM109pURLP
1.9は、プラスミドpUCLP1.9およびベクター
pUR290の該BamHI−Hind III 1.
9kb断片の組換え体である。プラスミドpURLP
1.9を担持している(図 27参照)。
るサブ領域のクローニング gp350サブ領域の安定産物の発現のため、該1.9
kbPstI−PstI断片をベクターpUR290
(DSM3417)(図27)(U.リュター(U.R
uther)ら、下掲〕中にリクローニング(recl
on)した。得られた組換えプラスミドは、gp350
のアミノ酸232〜825とpUR290およびpBR
322ヌクレオチド残基のクローニング部位によってコ
ードされるアミノ酸とがその後に続く、β−ガラクトシ
ダーゼのアミノ末端領域の融合蛋白質をコードする。そ
れぞれのアミノ酸配列を図28〜図33に示す。プラス
ミドpUCLP1.9のDNA50μgを100単位の
BamHIおよびHind IIIで消化し、上述のよ
うにして1%アガロースゲル上で分離した。初めにpU
C8中に導入したPst1−PstI断片により僅かに
数個多くのヌクレオチドを含む、ここに得られた1.9
kbBamHI/Hind III断片を、その他の得
られた断片から1%アガロースゲル上で(上述したよう
にして)分離し、最後に、上述のようにしてゲルから単
離し、ベクターpUR290のBamHI/Hind
III消化DNA クローンの容易な同定(Easy identific
ation of cDNA clones)”、EM
BO Journal 10,p.1791(198
3)〕中へ、上述の方法に従って連結させた。次の工程
は、これらの組換えDNA分子によるβ−ガラクトシダ
ーゼリプレッサー・蛋白質過剰産生株の形質転換であっ
た。形質転換体を平板培養し、上述のように分析した。
但し、DNA調製物の試料をBamHI/Hind I
IIおよびEcoRIで消化した。得られたクローン、
大腸菌(E.coli)K12JM109pURLP
1.9は、プラスミドpUCLP1.9およびベクター
pUR290の該BamHI−Hind III 1.
9kb断片の組換え体である。プラスミドpURLP
1.9を担持している(図 27参照)。
【0080】実施例13 大腸菌(E.coli)K12JM109pURLP
1.9によって合成されるgp350関連ポリペプチド 50μg/mlのアンピシリンで補足した5mlのL−
プロス中で、37℃に於て、大腸菌(E.coli)K
12JM109pURLP 1.9を1晩中培養して増
殖させた。この培養細胞を、次に、560nmに於ける
光学密度(OD560)0.4に希釈し、この細菌懸濁
液4mlを、OD560が0.8になるまで37℃に於
てインキュベートした。次に、プラスミドpURLP
1.9が担持している遣伝情報の発現を、実施例3のよ
うにして誘導し、最後に、実施例3記載のようにクーマ
ッシー(Coomassie)ブルー染色することによ
って蛋白質を可視化した。対照実験と比較して、プラス
ミドpURLP 1.9でコードされかつサイズが11
6kD〜200kDの範囲の幾つかの新規蛋白質が検出
された(図34)。異なるサイズの発現産物は、不完全
なmRNA合成または翻訳によるものかも知れない。新
規産物がEBV関連蛋白質であることを立証するため、
電気泳動で分離されたすべての蛋白質をニトロセルロー
スフィルターに移行した。すなわち実施例3記載の方法
によって“ウエスタン・ブロット(Western−b
lot)”を調製した。この実験の結果は図34に示し
てある。
1.9によって合成されるgp350関連ポリペプチド 50μg/mlのアンピシリンで補足した5mlのL−
プロス中で、37℃に於て、大腸菌(E.coli)K
12JM109pURLP 1.9を1晩中培養して増
殖させた。この培養細胞を、次に、560nmに於ける
光学密度(OD560)0.4に希釈し、この細菌懸濁
液4mlを、OD560が0.8になるまで37℃に於
てインキュベートした。次に、プラスミドpURLP
1.9が担持している遣伝情報の発現を、実施例3のよ
うにして誘導し、最後に、実施例3記載のようにクーマ
ッシー(Coomassie)ブルー染色することによ
って蛋白質を可視化した。対照実験と比較して、プラス
ミドpURLP 1.9でコードされかつサイズが11
6kD〜200kDの範囲の幾つかの新規蛋白質が検出
された(図34)。異なるサイズの発現産物は、不完全
なmRNA合成または翻訳によるものかも知れない。新
規産物がEBV関連蛋白質であることを立証するため、
電気泳動で分離されたすべての蛋白質をニトロセルロー
スフィルターに移行した。すなわち実施例3記載の方法
によって“ウエスタン・ブロット(Western−b
lot)”を調製した。この実験の結果は図34に示し
てある。
【0081】実施例14 プラスミドpURLP1.9でコードされるβ−ga
l:cp350融合蛋白質の精製 β−ガラクトシダーゼの天然のカルボキシ末端アミノ酸
配列のgp350関連アミノ酸配列による置換はβ−ガ
ラクトシダーゼ四量体の生成を阻害する。さらに、この
新たに発現された融合蛋白質は、細菌の細胞中に高濃度
で存在し、従って宿主細胞の細胞質内に沈殿する。実施
例4記載の方法に従って、クローン大腸菌(E.col
i)K12JM109pURLP1.9を用いて対応す
る融合蛋白質を産生させた。この精製法の数段階の結果
を図35に示す。
l:cp350融合蛋白質の精製 β−ガラクトシダーゼの天然のカルボキシ末端アミノ酸
配列のgp350関連アミノ酸配列による置換はβ−ガ
ラクトシダーゼ四量体の生成を阻害する。さらに、この
新たに発現された融合蛋白質は、細菌の細胞中に高濃度
で存在し、従って宿主細胞の細胞質内に沈殿する。実施
例4記載の方法に従って、クローン大腸菌(E.col
i)K12JM109pURLP1.9を用いて対応す
る融合蛋白質を産生させた。この精製法の数段階の結果
を図35に示す。
【0082】実施例15 β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質としてのgp250/
350の抗原エピトープの発現 図36は、親水性(黒丸)および疎水性(灰色丸)領域
の相対的価値と共に、gp350のコンピューターで予
測された2次構造を示す。β−ターンまたはループ構造
は、180℃のラインターンとして示される(α−らせ
ん、α−シート、コイル構造は、用いた尺度ではやっと
識別できる。)抗原部位は、蛋白質の表面に暴露する可
能性がある親水性環境内のβ−ターン中にあるという仮
定に基づくと、約アミノ酸50およびアミノ酸70なら
びに800−830の領域がそれぞれ抗原エピトープを
示すと期待される。
350の抗原エピトープの発現 図36は、親水性(黒丸)および疎水性(灰色丸)領域
の相対的価値と共に、gp350のコンピューターで予
測された2次構造を示す。β−ターンまたはループ構造
は、180℃のラインターンとして示される(α−らせ
ん、α−シート、コイル構造は、用いた尺度ではやっと
識別できる。)抗原部位は、蛋白質の表面に暴露する可
能性がある親水性環境内のβ−ターン中にあるという仮
定に基づくと、約アミノ酸50およびアミノ酸70なら
びに800−830の領域がそれぞれ抗原エピトープを
示すと期待される。
【0083】gp250/350のN末端のサブクロー
ニングおよび発現 pBR322(J.スケア(J.Skere)ら、上
掲〕中にクローニングされたEBV BamHI−L断
片をEcoRI(図21〜図24に示した配列中の位置
650および1284に於ける制限部位)で消化し、得
られた634 bP断片を、電気泳動後アガロースゲル
から溶出し、EcoRI線状化pUC19(DSM34
25)(ヤニッシューペロン(yanisch−Per
on)ら、ジーン(Gene)33、103−119
(1985)〕に連結させた。次に、この連結産物で大
腸菌(E.coli)K12JM109を形質転換させ
た(すべての工程は、実施例2記載のように行った)。
実施例2に従って、得られた組換えプラスミドを、適当
な制限酵素を用いて、その挿入物(insert)の配
向について試験した。pUC19プラスミドのlacZ
遺伝子の読取り枠に対して読取り枠の反対の配向で挿入
物を担持する組換えプラスミドをpUCl9LEP60
0と称し、さらにクローニングのために使用した。
ニングおよび発現 pBR322(J.スケア(J.Skere)ら、上
掲〕中にクローニングされたEBV BamHI−L断
片をEcoRI(図21〜図24に示した配列中の位置
650および1284に於ける制限部位)で消化し、得
られた634 bP断片を、電気泳動後アガロースゲル
から溶出し、EcoRI線状化pUC19(DSM34
25)(ヤニッシューペロン(yanisch−Per
on)ら、ジーン(Gene)33、103−119
(1985)〕に連結させた。次に、この連結産物で大
腸菌(E.coli)K12JM109を形質転換させ
た(すべての工程は、実施例2記載のように行った)。
実施例2に従って、得られた組換えプラスミドを、適当
な制限酵素を用いて、その挿入物(insert)の配
向について試験した。pUC19プラスミドのlacZ
遺伝子の読取り枠に対して読取り枠の反対の配向で挿入
物を担持する組換えプラスミドをpUCl9LEP60
0と称し、さらにクローニングのために使用した。
【0084】
【化1】
【0085】pUC19LEP600をBamHIおよ
びPstI(BamHI部位はpUC19から誘導さ
れ、PstI部位は図21〜図24の位置1248に相
当する)で消化し、得られた600 bp 断片を、前
以てBamHIおよびPstIで消化してあるpUR2
91(DSM3418)(リュター(Ruther)、
上掲〕中へ挿入した。得られた組換えプラスミドpUR
LEP600は、β−ガラクトシダーゼのC末端に於け
るリンカー領域中に於て下記の配列を示した。 IPTG−誘導後のこの組換えプラスミドから、実施例
3記載のように融合蛋白質の発現を行った。この実験の
結果は、図37に示す。図37(下部)から、得られた
発現産物は、NPC血清のプールによって中程度に抗原
性の蛋白質として認識されると見なすことができる。
びPstI(BamHI部位はpUC19から誘導さ
れ、PstI部位は図21〜図24の位置1248に相
当する)で消化し、得られた600 bp 断片を、前
以てBamHIおよびPstIで消化してあるpUR2
91(DSM3418)(リュター(Ruther)、
上掲〕中へ挿入した。得られた組換えプラスミドpUR
LEP600は、β−ガラクトシダーゼのC末端に於け
るリンカー領域中に於て下記の配列を示した。 IPTG−誘導後のこの組換えプラスミドから、実施例
3記載のように融合蛋白質の発現を行った。この実験の
結果は、図37に示す。図37(下部)から、得られた
発現産物は、NPC血清のプールによって中程度に抗原
性の蛋白質として認識されると見なすことができる。
【0086】gp250/350のC末端のサブクロー
ニングおよび発現 プラスミドpUCLP1.9(実施例11参照)をXm
nI(図21〜図24の位置2760に於ける制限部
位)およびHind III(pUC−プラスミドから
誘導される領域内の制限部位)で消化することによっ
て、コンピューター指示分析によっても抗原性であると
期待されるC末端付近の抗原エピトープを含む領域を単
離した。この精製386 bp 断片を、予めHinc
IIおよびHind IIIで消化してあるpUC1
9中へ挿入した。大腸菌(E.coli)K12JM1
09中へ導入された、ここに得たプラスミドはpUC1
9LXP390
ニングおよび発現 プラスミドpUCLP1.9(実施例11参照)をXm
nI(図21〜図24の位置2760に於ける制限部
位)およびHind III(pUC−プラスミドから
誘導される領域内の制限部位)で消化することによっ
て、コンピューター指示分析によっても抗原性であると
期待されるC末端付近の抗原エピトープを含む領域を単
離した。この精製386 bp 断片を、予めHinc
IIおよびHind IIIで消化してあるpUC1
9中へ挿入した。大腸菌(E.coli)K12JM1
09中へ導入された、ここに得たプラスミドはpUC1
9LXP390
【0087】
【化2】である。
【0088】pUC19LXP390の挿入物(ins
ert)をBamH IおよびHind IIIで切り
出し、同じ酵素で消化したpUR288中へ結合させ
た。得られた組換えプラスミドを大腸菌(E.col
i)K12JM109中へ導入し、pURLXP390
と称した。そのリンカー領域の配列は下記の通りであ
る。 IPTG誘導後、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が、
該形質転換宿主によって合成された。ウエスタン・ブロ
ットに於て、発現産物は、NPC血清プールと高い反応
性を示す(図37下部参照)。
ert)をBamH IおよびHind IIIで切り
出し、同じ酵素で消化したpUR288中へ結合させ
た。得られた組換えプラスミドを大腸菌(E.col
i)K12JM109中へ導入し、pURLXP390
と称した。そのリンカー領域の配列は下記の通りであ
る。 IPTG誘導後、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が、
該形質転換宿主によって合成された。ウエスタン・ブロ
ットに於て、発現産物は、NPC血清プールと高い反応
性を示す(図37下部参照)。
【0089】実施例16 新たに構築された組換えプラスミドによってコードされ
るβ−gal::gp250/350融合蛋白質の診断
試験に於ける使用 ジルグ(Jilg)ら、(W.ジルグとH.ウルフ
(E.Jilg andH.Wolf)”、エプスタイ
ン・バルウイルス特異性膜抗原gp250に対する抗体
の診断的意義、(Diagnostic Signif
icance of Antibodies to t
he Epstein−Barr Virus−Spe
cific Membrane Antigen gp
250)”、ザジャーナル オブ インフェクシアス
ディジージス (The Jurnal of Inf
ections Diseases),152,222
−225(1985)〕は、gp250およびgp35
0の、EBVに対する免疫状態の決定および特に慢性E
BV感染の診断のための抗原としての正当性を示した。
EBV感染後正常な免疫応答を示すヒトはgp250お
よびgp350に対する抗体をもっているが、慢性EB
V感染にかかっている患者な未だ付加的な介在配列(図
39参照)を含む
るβ−gal::gp250/350融合蛋白質の診断
試験に於ける使用 ジルグ(Jilg)ら、(W.ジルグとH.ウルフ
(E.Jilg andH.Wolf)”、エプスタイ
ン・バルウイルス特異性膜抗原gp250に対する抗体
の診断的意義、(Diagnostic Signif
icance of Antibodies to t
he Epstein−Barr Virus−Spe
cific Membrane Antigen gp
250)”、ザジャーナル オブ インフェクシアス
ディジージス (The Jurnal of Inf
ections Diseases),152,222
−225(1985)〕は、gp250およびgp35
0の、EBVに対する免疫状態の決定および特に慢性E
BV感染の診断のための抗原としての正当性を示した。
EBV感染後正常な免疫応答を示すヒトはgp250お
よびgp350に対する抗体をもっているが、慢性EB
V感染にかかっている患者な未だ付加的な介在配列(図
39参照)を含む
【0090】gp350にのみ免疫応答を示す。これら
のヒト血清学的状態は、実施例4記載の方法によって精
製された3種の融合蛋白質を用いるELISA試験で検
査することができる。3種の融合蛋白質全部に対する抗
体反応は正常な免疫状態を示す。もしpURLEP60
0およびpURLXP390でコードされる蛋白質と反
応しないかまたは弱く反応するが、pURLP1.9
(介在配列を含む、図39参照)に対して反応性である
ならば、慢性EBV感染の可能性が極めて大きい。膜蛋
白質gp250/350およびそのサブ断片に対するI
gA抗体は、正常な人口中には存在しないが、比較的敏
感でない免疫蛍光法で測定するとき鼻咽頭癌患者の58
%に存在する。これらの結果は、同等の試験系に於ける
EBV特異的初期抗原(early antigen)
に対するIgA抗体の検出率に似ている。同様に、より
高感度のELISA試験は100%に近い検出率を持
ち、偽陽性結果のほんの僅かの増加がある。従って、新
たに構築された組換えプラスミドpURLEP600、
pURLXP390、pURLP1.9でそれぞれコー
ドされる抗原は、鼻咽頭癌の初期診断および治療の管理
に有用な物質である。
のヒト血清学的状態は、実施例4記載の方法によって精
製された3種の融合蛋白質を用いるELISA試験で検
査することができる。3種の融合蛋白質全部に対する抗
体反応は正常な免疫状態を示す。もしpURLEP60
0およびpURLXP390でコードされる蛋白質と反
応しないかまたは弱く反応するが、pURLP1.9
(介在配列を含む、図39参照)に対して反応性である
ならば、慢性EBV感染の可能性が極めて大きい。膜蛋
白質gp250/350およびそのサブ断片に対するI
gA抗体は、正常な人口中には存在しないが、比較的敏
感でない免疫蛍光法で測定するとき鼻咽頭癌患者の58
%に存在する。これらの結果は、同等の試験系に於ける
EBV特異的初期抗原(early antigen)
に対するIgA抗体の検出率に似ている。同様に、より
高感度のELISA試験は100%に近い検出率を持
ち、偽陽性結果のほんの僅かの増加がある。従って、新
たに構築された組換えプラスミドpURLEP600、
pURLXP390、pURLP1.9でそれぞれコー
ドされる抗原は、鼻咽頭癌の初期診断および治療の管理
に有用な物質である。
【0091】実施例17 プラスミドpUC8に於けるgp250/350断片の
発現 gp250/350のN末端領域を含む組換えプラスミ
ドpUC19LEP600(実施例15参照)をBam
HIおよびPstIで消化した。このEBV誘導断片
を、予め同じ酵素で消化してあるpUC8中へ連結させ
た。得られたクローンpUCLEP600のリンカー領
域の配列は下記の通りである。 IPTCによる誘導後、pUCLEP600でコードさ
れた融合蛋白質は、細菌細胞内で全く安定でありかつN
PC血清プールによって抗原として認識される(図38
参照)。細菌融合部分は、N−末端に於ける14個のア
ミノ酸とC末端に於ける9個のアミノ酸とからなる。こ
の蛋白質の価値は、ワクチンに応用できることであり、
特にそれがβ−gal融合蛋白質で決定されたように
(図19参照)、C末端からのそれ自体不安定な第2抗
原領域と融合されるときワクチンに応用できることであ
る。実施例11、15〜17によって構築された組換え
発現プラスミドおよびクローニングプラスミドの挿入物
(insert)は図39に示してある。
発現 gp250/350のN末端領域を含む組換えプラスミ
ドpUC19LEP600(実施例15参照)をBam
HIおよびPstIで消化した。このEBV誘導断片
を、予め同じ酵素で消化してあるpUC8中へ連結させ
た。得られたクローンpUCLEP600のリンカー領
域の配列は下記の通りである。 IPTCによる誘導後、pUCLEP600でコードさ
れた融合蛋白質は、細菌細胞内で全く安定でありかつN
PC血清プールによって抗原として認識される(図38
参照)。細菌融合部分は、N−末端に於ける14個のア
ミノ酸とC末端に於ける9個のアミノ酸とからなる。こ
の蛋白質の価値は、ワクチンに応用できることであり、
特にそれがβ−gal融合蛋白質で決定されたように
(図19参照)、C末端からのそれ自体不安定な第2抗
原領域と融合されるときワクチンに応用できることであ
る。実施例11、15〜17によって構築された組換え
発現プラスミドおよびクローニングプラスミドの挿入物
(insert)は図39に示してある。
【0092】実施例18 p138::gp250/350融合蛋白質としてのg
p250/350のN末端部分の発現 プラスミドpUC19LEP600(図19参照)をP
stIで消化し、得られた600bp断片を、PstI
で線状化されたプラスミドpUCARG601(実施例
7参照)に連結させた。gp350挿入物がpUCAR
G601−読取り枠と同じ配向であることがチェックさ
れ、得られた組換えプラスミドをpUCARG1230
と称した。得られたプラスミドのリンカー領域中および
接合(Junction)部位に於ける配列は下記の通
りである。 IPTGによる誘導後、pUCARG1230を担持す
る大腸菌(E.coli)K12JM109は、2種の
異なる蛋白質すなわちp138とgp250/350か
らの抗原性領域からなる安定でかつ抗原性の蛋白質を発
現する。さらに、この発現産物は、ELISA試験に於
ける抗原として、またワクチン接種用の抗原としても使
用することができる。
p250/350のN末端部分の発現 プラスミドpUC19LEP600(図19参照)をP
stIで消化し、得られた600bp断片を、PstI
で線状化されたプラスミドpUCARG601(実施例
7参照)に連結させた。gp350挿入物がpUCAR
G601−読取り枠と同じ配向であることがチェックさ
れ、得られた組換えプラスミドをpUCARG1230
と称した。得られたプラスミドのリンカー領域中および
接合(Junction)部位に於ける配列は下記の通
りである。 IPTGによる誘導後、pUCARG1230を担持す
る大腸菌(E.coli)K12JM109は、2種の
異なる蛋白質すなわちp138とgp250/350か
らの抗原性領域からなる安定でかつ抗原性の蛋白質を発
現する。さらに、この発現産物は、ELISA試験に於
ける抗原として、またワクチン接種用の抗原としても使
用することができる。
【0093】実施例19 gp250/350抗原で免疫されたウサギに由来する
血清による中和試験 B95−8からの上清を用いてヒト臍帯血球〔フィコー
ル/ハイパーク(Ficol/Hypaque)勾配か
らのリンパ球分画〕を不死化した。0.5×106リン
パ球を、0.5mlのミクロ力価平板につき十分に接種
し、50μlのB95−8の無細胞上清を添加し、37
℃に於て2時間、吸着させた。インキュベーション後、
ウイルスを含んでいる培地をとり出し、10%の子牛胎
児血清を含むRPM11640培地で洗浄し、同培地2
00μl中で、37℃に於て5%CO2雰囲気中でイン
キュベートした。発育しつつあるリンパ芽球皮疹細胞
を、実験開始から3週間以後に評価し、陽性形質転換と
して計数した。
血清による中和試験 B95−8からの上清を用いてヒト臍帯血球〔フィコー
ル/ハイパーク(Ficol/Hypaque)勾配か
らのリンパ球分画〕を不死化した。0.5×106リン
パ球を、0.5mlのミクロ力価平板につき十分に接種
し、50μlのB95−8の無細胞上清を添加し、37
℃に於て2時間、吸着させた。インキュベーション後、
ウイルスを含んでいる培地をとり出し、10%の子牛胎
児血清を含むRPM11640培地で洗浄し、同培地2
00μl中で、37℃に於て5%CO2雰囲気中でイン
キュベートした。発育しつつあるリンパ芽球皮疹細胞
を、実験開始から3週間以後に評価し、陽性形質転換と
して計数した。
【0094】血清の中和性は、B95−8細胞上清を含
むエプスタイン−バルウイルスの一定量を、複試験に於
ける対照としてのそれぞれの予備免疫化血清を含む試験
血清20μlと共に僅かに攪拌しながら1時間インキュ
ベートした後、上清を臍帯血液リンパ球に吸着させるこ
とによって試験した。2時間後にセルから接種物を除去
した後、保持培地(10%FCSで補足したRPM11
640)を、中和活性試験下にあるそれぞれの血清5%
で補足した。下記の結果が得られた。
むエプスタイン−バルウイルスの一定量を、複試験に於
ける対照としてのそれぞれの予備免疫化血清を含む試験
血清20μlと共に僅かに攪拌しながら1時間インキュ
ベートした後、上清を臍帯血液リンパ球に吸着させるこ
とによって試験した。2時間後にセルから接種物を除去
した後、保持培地(10%FCSで補足したRPM11
640)を、中和活性試験下にあるそれぞれの血清5%
で補足した。下記の結果が得られた。
【0095】実施例20 ウイルスカプシド蛋白質p150の抗原性断片のクロー
ニングおよび発現 診断に適した蛋白質p150(ウイルスカプシド抗原V
CA(実施例1、図40〜図61参照)〕を抗原部位に
ついて試験し、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として
発現させるためにサブクローニングした。抗原部位をコ
ードすると期待されるN末端領域は、キヤロン4A(C
haron4A)ファージEB69−79(G.N.ブ
エル、D.ライスマン、C、キントナー、G.クラウ
ス、B.サグデン(G.N.Buell,D.Reis
man,C.Kintner,G.Crouse,an
d S.Sugden),”エプスタイン−バルウイル
スのB95−8株(ATCC CRL1612)からの
重複DNA断片のクローニングは内部反復に対する相同
の部位を示す(Cloning overlappin
g DNA fragments from the
B95−8 strain of Esptein−B
arrvirus(ATCC CRL1612)riv
eals a site of homogy to
the internal repetitio
n),”ジャーナル オブ ビロロジー(Journa
l of Virology)40,977−982
(1981)〕をBamHIで消化することによって得
られ、得られた1176 bp 断片をpUC12のB
amHI部位中へクローニングした。適当な配向での挿
入を有する得られたプラスミドから、XhoI/Sal
Iで580 bp 断片を切除した。SalI部位はp
UC12リンカーから由来し、XhoI部位はp150
の開始から上流へ33bpの所にある。この断片を、S
alIで消化されたpUC8(SalIとXhoIとは
同じ付着末端配列を共有する)中へ挿入した。得られた
クローンを、BamH部位の次にp150開始コドンを
もつようにスクリーニングした。適当なクローンから、
p150コード領域をBamHIおよびHind II
Iで切り出し、BamHIおよびHind IIIで消
化されたpUR290(pUR290CXH580)中
にクローニングした。このクローンからのβ−Ga
l::p150融合蛋白質の発現は、図62に示してあ
る。それがNPC血清プールと極めてよく反応する能力
は図63からわかる。
ニングおよび発現 診断に適した蛋白質p150(ウイルスカプシド抗原V
CA(実施例1、図40〜図61参照)〕を抗原部位に
ついて試験し、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として
発現させるためにサブクローニングした。抗原部位をコ
ードすると期待されるN末端領域は、キヤロン4A(C
haron4A)ファージEB69−79(G.N.ブ
エル、D.ライスマン、C、キントナー、G.クラウ
ス、B.サグデン(G.N.Buell,D.Reis
man,C.Kintner,G.Crouse,an
d S.Sugden),”エプスタイン−バルウイル
スのB95−8株(ATCC CRL1612)からの
重複DNA断片のクローニングは内部反復に対する相同
の部位を示す(Cloning overlappin
g DNA fragments from the
B95−8 strain of Esptein−B
arrvirus(ATCC CRL1612)riv
eals a site of homogy to
the internal repetitio
n),”ジャーナル オブ ビロロジー(Journa
l of Virology)40,977−982
(1981)〕をBamHIで消化することによって得
られ、得られた1176 bp 断片をpUC12のB
amHI部位中へクローニングした。適当な配向での挿
入を有する得られたプラスミドから、XhoI/Sal
Iで580 bp 断片を切除した。SalI部位はp
UC12リンカーから由来し、XhoI部位はp150
の開始から上流へ33bpの所にある。この断片を、S
alIで消化されたpUC8(SalIとXhoIとは
同じ付着末端配列を共有する)中へ挿入した。得られた
クローンを、BamH部位の次にp150開始コドンを
もつようにスクリーニングした。適当なクローンから、
p150コード領域をBamHIおよびHind II
Iで切り出し、BamHIおよびHind IIIで消
化されたpUR290(pUR290CXH580)中
にクローニングした。このクローンからのβ−Ga
l::p150融合蛋白質の発現は、図62に示してあ
る。それがNPC血清プールと極めてよく反応する能力
は図63からわかる。
【0096】さらに、従って、p150:β−gal融
合構築体が得られた。例えば図64に示しているサブク
ローンPUR290DBX320,pUR292DBB
180,pUR290DTT700,pURDTT74
0 pUR290DTP680,pUR288DPP3
20が得られた。このサブクローンの名称から用いれた
ベターがわかり、例えばサブクローンpUR290DB
X320の構築のためには、ベクターpUR290を用
いた。図63から、サブクローニングのために用いた制
限酵素部位もわかる。pURDBB180を除いてすべ
てのクローンは、所望の断片をpUC8またはpuC1
2(上掲参照)中へサブクローニングして、pURベク
ター(上掲参照)ヘクローニングするために適したBa
mHIおよびHind III部位を得ることによって
構築された。pUR292DBB180は、BamHI
で線状化されたpUR292中への180 bp のB
gl II−Bgl II断片の挿入によって誘導され
た。図62および図63はそれらの発現および抗原性を
示す。
合構築体が得られた。例えば図64に示しているサブク
ローンPUR290DBX320,pUR292DBB
180,pUR290DTT700,pURDTT74
0 pUR290DTP680,pUR288DPP3
20が得られた。このサブクローンの名称から用いれた
ベターがわかり、例えばサブクローンpUR290DB
X320の構築のためには、ベクターpUR290を用
いた。図63から、サブクローニングのために用いた制
限酵素部位もわかる。pURDBB180を除いてすべ
てのクローンは、所望の断片をpUC8またはpuC1
2(上掲参照)中へサブクローニングして、pURベク
ター(上掲参照)ヘクローニングするために適したBa
mHIおよびHind III部位を得ることによって
構築された。pUR292DBB180は、BamHI
で線状化されたpUR292中への180 bp のB
gl II−Bgl II断片の挿入によって誘導され
た。図62および図63はそれらの発現および抗原性を
示す。
【0097】pUR290CXH580でコードされか
つ実施例4によって精製されたβ−gal::p150
融合蛋白質は、ELISA試験ではEBV特異性抗原と
して反応し、診断に応用できることを示す。580 b
p 断片(pUR290CSH580の構築のために用
いられる)を、BamHIおよびHind IIIを用
いてpUC18(DSM3424)中へ挿入することに
よってp150のN末端断片をもつ安定な発現も得られ
た。得られたクローンpUC18CXH580は、サイ
ズが約25kDの安定な抗原性蛋白質を発現する。
つ実施例4によって精製されたβ−gal::p150
融合蛋白質は、ELISA試験ではEBV特異性抗原と
して反応し、診断に応用できることを示す。580 b
p 断片(pUR290CSH580の構築のために用
いられる)を、BamHIおよびHind IIIを用
いてpUC18(DSM3424)中へ挿入することに
よってp150のN末端断片をもつ安定な発現も得られ
た。得られたクローンpUC18CXH580は、サイ
ズが約25kDの安定な抗原性蛋白質を発現する。
【0098】本発明の目的のために、下記の寄託プラス
ミド、宿主細菌、細胞系を用いた。寄託は、プタペスト
条約に従って行われた。
ミド、宿主細菌、細胞系を用いた。寄託は、プタペスト
条約に従って行われた。
【0099】以上、本発明の多数の実施態様を示した
が、EBV関連抗原をコードしかつ組換えDNA分子の
産生をコードするEBVゲノムのDNA配列を利用する
他の実施態様を与えるために本明細書の構成を変え得る
ことは明らかである。該DNA配列に関連しかつ他のE
BV血清型から誘導され得る他のDNA配列も用い得る
ことは当業者には明らかである。EBVは、公知の天然
EBV源、例えば感染した患者の唾液から容易に得るこ
とができる。
が、EBV関連抗原をコードしかつ組換えDNA分子の
産生をコードするEBVゲノムのDNA配列を利用する
他の実施態様を与えるために本明細書の構成を変え得る
ことは明らかである。該DNA配列に関連しかつ他のE
BV血清型から誘導され得る他のDNA配列も用い得る
ことは当業者には明らかである。EBVは、公知の天然
EBV源、例えば感染した患者の唾液から容易に得るこ
とができる。
【0100】生物学的に同等な結果を得るため、他の適
当なベクター/宿主系を用い得ることは明らかである。
本発明は、現在入手できる宿主/ベクター系に限定され
るものではない。
当なベクター/宿主系を用い得ることは明らかである。
本発明は、現在入手できる宿主/ベクター系に限定され
るものではない。
【図面の簡単な説明】図1は、単核症およびNPCに罹患している患者に由来
するEBV特異性血清の免疫沈降のオートラジオグラフ
ィーである。 免疫沈降した35S−標識一蛋白質をSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルに
X線フィルムを露出した。免疫沈降に用いた種々の血清
源は、オートラジオグラフィーのそれぞれの領域の下に
示してある。“プール”と称する対照は、免疫沈降性の
EBV特異的蛋白質のすべてを含んでいる。このオート
ラジオグラフィーから、NPC血清のおのおのに、かつ
EBV感染特異的血清のあるものにのみ、少くともp1
38、p150、p80に対する抗体が存在することが
わかる。同様に、回復期状態に比べて、新しいEBV感
染(伝染性単核症)には、p54に対する抗体が重要で
ある。p150、p143、p110、p90に対する
抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免疫の
ため、あるいは新しいEBV感染についてIgM特異性
試験に関連して、あるいはEBV関連腫瘍(neopl
asia)(NPCおよびBL)についてはIgAに関
連してマーカーとして作用することができる。図2は、
EBV B95−8ゲノムに対するmRNA’sのマッ
ピングを示す。EBV B95−8ゲノムのBamHI
制限部位は、図の下に示してあり、それぞれの制限断片
は、大文字および小文字で示してある。個々のBamH
I制限断片に対するハイブリッド選択によって位置決定
されている蛋白質のmRNA’sは数および線で示して
ある。この図から、p138の遺伝子がBamA断片に
相関していることがわかる。図3〜図7は、p138を
コードするBamAの左側読取り枠のDNA配列を示
す。ここに示した配列は、それぞれの陰性鎖である。p
138コード領域は、ヌクレオチド位置182から始ま
り、ヌクレオチド位置3563で終わる。このコード領
域の断片のクローニングに用いられる制限部位が示して
ある。図8は、プラスミドpUC635およびpUC1
30の制限地図を示す。ベクターpUC8のサイズは
2.7kbである。1acUV5β−ガラクトシダーゼ
プロモーターおよびオペレーター(PO)のクローニン
グ部位3′は、EcoRI(E),BamHI(B)、
SalI(S),PstI(P),Hind III
(H)部位を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子はAMPで
示される。p138コード領域の3,0kbおよび3.
3kbXhoI断片をpUC8のSalI部位中へ挿入
する。挿入は中抜きバーで示してある。pUC635
は、3.0kbXhoI断片を、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子に対して正しい読取り枠内に含んでいるが、pU
C6130は、3.3kbXhoI断片を反対の配向で
含んでいる図9は、プラスミドpUC635、pUC924、pM
F924、pKK378によってコードされる蛋白質の
発現を示す 。第1列は免疫染色したウエスタン・ブロッ
トで、pUC8で形質転換され、IPTGで誘導された
細菌から単離されている 第2列はpUC924で形質転換された細菌の蛋白質で
あり、第3列はpKK378で形質転換された細菌の蛋
白質であり、第4列はpMF924で形質転換された細
菌の蛋白質であり、第5列はpUC635で形質転換さ
れた細菌の蛋白質である。融合蛋白質のサイズは、75
kD(第2列)、110kD(第3列)、90kD(第
4列)、135kD(第5列)と概算された。図10
は、プラスミドpUC924の制限地図である。ベクタ
ーpUC9のサイズは2.7kbである、1acUV5
β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびオペレーター
(PO)のクローニング部位3′は、EcoRI
(E),BamHI(B)、SalI(S)、PstI
(P),Hind III(H)を含む。β−ラクタマ
ーゼ遺伝子はAMPで示される。pUC635の2.6
kbBgl II/EcoRI−断片を、BamHI部
位とEcoRI部位との間に挿入する、Bgl IIの
略号は“Bg”である。図11は、プラスミドpMF9
24の制限地図である。pUC924の2.0kb B
amHI/Hind III断片がハイブリッドtrp
−lacプロモーター(tac)とC1(λ=プレッサ
ー)のアミノ末端コード領域との3′に位置する、pE
A305のBamHおよびHind III制限部位中
へ挿入された。図12は、プラスミドpKK378の制
限地図であるリンカーとしてpBR322の345 b
p BamHI/Hind III断片(黒い太線で示
す)を用い、ベクターpKK240−11のHind
III部位中へpUC6130の3.3kb BamH
I/HindIII断片を挿入した。かくして、p13
8コード断片は、ハイブリッドtrp−lacプロモー
ター(tac)およびATC開始コドンの3′に位置す
る。図13は、p138の2次構造である。p138の
2次構造のチョウーファスマン(Chou.Fasma
n)計算のコンピュータープロットを示す。また、疎水
性領域(黒丸)および親水性領域(白丸)も示す。抗原
部位は、β−ターンをもつ親水性領域にあると期待され
る。この環境は、p600領域中および蛋白質のカルボ
キシ末端に与えられる。ベクターpUC8およびpUR
288中へサブクローニングされた領域が示されてい
る。図14は、p138のPstI断片を担持するプラ
スミドpURで形質転換された細菌の発現産物を示す。 (A)種々のプラスミドを担持するIPTC誘導細菌の
溶解産物のクーマッシーブリリアントブルー染色SDS
ポリアクリルアミドスラブゲル分析を示す。分子量12
0〜150kdの融合蛋白質を黒丸で示す。トラックM
(TrackM)分子量マーカーが図3〜図7に示すよ
うなp138の領域を含むプラスミドを担持する細菌の
pUR400−pUR540の溶解産物を標識する。 (B)ゲル(パネルAで示したものと同様な)からニト
ロセルロースペーパー(ウエスタンブロット)上へ移行
させた蛋白質の酵素免疫測定を示す。この測定では、高
力価血清のプールを用い、洗浄後、結合した免疫グロブ
リンを、ヒトIgGに対する抗体にカップリングさせた
ペルオキシダーゼとジアミノベンジジンとによる逐次反
応によって可視化した。pUR600およびpUR54
0を含む細菌からの融合蛋白質だけが特異的反応を示
す。プラスミドpUC635(陽性対照としての)はp
138コード領域のほとんど全部を含むが、蛋白質は不
安定で、急速に分解する。pUC8は、EBV誘導配列
を含まないベクタープラスミドを含む陰性対照である。
図15は、p138のPstI断片を担持するpUCサ
ブクローンで形質転換された菌の発現産物を示す。ゲル
からニトロセルロースペーパー(ウエスタン・ブロッ
ト)へ電気泳動によって移行させた蛋白質の酵素免疫測
定を行った。この測定では、高力価抗血清のプールを用
い、洗浄後、結合した免疫グロブリンを、ヒトIgGに
対する抗体にカップリングさせたペルオキシダーゼとジ
アミノベンジジンとによる逐次反応によって可視化し
た。pUCP600を含む菌からの融合蛋白質は安定に
産生され、特異的抗原反応を示す。図16は、β−ga
l融合蛋白質としての発現によって見いだされる両方の
抗原部位をコードするプラスミドpUCARG1140
の構築スキームである。 (a)pUC600の5′−PstI部位を、SalI
(20bp上流)およびHind IIIで消化するこ
とによって除去し、次いでpUC12−SalI/Hi
nd IIIと連結させた。このプラスミドから、Ec
oRIおよびPstIで挿入物(insert)を除去
し、pUC8−EcoRI中へ連結させた。得られたプ
ラスミドpUC601中へ、5個のアルギニンと2個の
停止コドンとをコードするオリゴヌクレオチドを、3′
−PstI部位とHind III(pUCARG60
1)との間の1本鎖DNAとして挿入した。最後の工程
に於て、p138のC末端からの第2抗原決定基をコー
ドする540 bp PstI断片を、PstIによる
消化および連結によって挿入した。得られたプラスミド
は、5個のアルギニン残基がその後に続く両方の抗原決
定基を枠内に含んでいた。このプラスミドをpUCAR
1140と称した。 (b)オリゴアルギニンリンカーのヌクレオチド配列。
下方鎖(lower strand)を合成し、Pst
IおよびHind IIIの付着末端間の架橋形成によ
って1本鎖DNAとして挿入した。図17は、pUC8
を対照とする、プラスミドpUC600,pUC60
1,pUCARG601,pUCARG1140のIP
TG誘導発現を示す。上部は、クーマッシー(Coom
assi)染色SDS−PAGEを示す。新たに検出さ
れた蛋白質は、黒色点で標識し、下部は、NPC患者か
らの血清による免疫染色後に得られた対応するウエスタ
ンブロトト(Western blot)を示す。pU
CP600と比べて、pUC601によってコードされ
るEBV関連蛋白質は、14個のアミノ酸が欠けている
(pUC−ポリリンカーによってコードされる6個のア
ミノ酸とPstI−PstI断片からの8個のアミノ
酸)ので、約1.5kD小さい。pUCARG601に
よってコードされる蛋白質のサイズは、挿入されたオリ
ゴヌクレオチド中に存在する停止コドンによってpUC
のIacZ領域中を通しての読取りが阻害されるので、
さらに約11kD減少される。pUCLARG1140
では、540 bp 断片の挿入によって約42kDに
サイズが増加する。この蛋白質は細菌細胞中で安定であ
る。図18は、p138中で検出される2個のエピトー
プに対する個々のNPC血清のIgGおよびIgA抗体
の分布および反応性を示す。図に示したプラスミドを担
持するIPTG誘導大腸菌(E.coli)細胞の溶解
産物を、12%SDS−PAGE上で、4回、独立に分
離し、ウエスタン・ブロッティングによってニトロセル
ロースへ移行させた。第1列:陰性参照としてのpUR
288;第2列:陽性対照としてのpUCARG11
4;第3列:pUR540;第4列:pUR600。2
種の個々のNPC血清(No.352とNo.354)
をフィルターと共にインキュベートし、結合したIgG
およびIgA抗体を、ペルオキシダーゼ接合抗ヒトIg
Gおよび抗ヒトIgAウサギ抗体を用いて可視化した。
ウエスタン・プロツト中の蛋白質の異なる位置、特にp
UCARG1140の異なる位置はSDS−PAGEの
異なる電気泳動時間から得られる。NPC血清No.3
52に於ては、IgGおよびIgA抗体の主な反応はp
138のC末端からのp540エピトープ(図13参
照)に対して向けられるが、血清No.354では抗−
p138抗体の主要部分はD600エピトープ(図13
参照)。このことは、血清中の抗p138抗体の検出に
は両方の抗原部位が必要であることを示す。図19は、
プラスミドpUCARG1140によってコードされる
蛋白質を抗原として用いるELISA試験を示す。第1
列および第3列:EBV陰性血清、第2列:NPCプー
ル血清、第4−13列:個々のNPC血清。希釈試験は
下部に示す。左側:IgG、右側:IgA。図20は、
カルボキシ末端にオリゴアルギニン基を担持する蛋白質
の精製を示す。 (A)5個のアルギニン残基と2個の停止コドンとをコ
ードするオリゴヌクレオチドの配列。5′末端に於ける
Hind IIIと3′末端に於けるPstI部位と
は、このオリゴヌクレオチドをpUC8中へ挿入するこ
とによって生成された。 (B)カルボキシ末端に該Arg−リンカーを担持する
不溶性の発現真核生物蛋白質の精製スキーム。図21〜
図24は、gp250/350をコードするBamI−
断片の左側読取り枠のDNA配列を示す。この糖蛋白質
のためのコード領域は、ゲノム位置92153から始ま
り、位置89433で終わる。図に示した配列は、代表
的な陰性鎖であり、位置92703のBamHI部位か
ら始まる。この図の配列番号によれば、gp350コー
ド領域は、位置556と3276の間にある。塩基対5
20の領域内のTATAA−ボックスは・・・で標識さ
れ、位置3290の多分ポリアデニル化位置は+++で
標識される。スプライスドナーおよびスプライスアクセ
プター部位は、ドナー部位は)(………で、アクセプタ
ー部位は………)(で示される。コード領域のカルボキ
シ末端付近の疎水性領域は***で標識される。恐ら
く、このアミノ酸配列は、この蛋白質を膜に固着させる
ためのアンカー配列として働く。図25は、BamL−
断片の制限地図とオープン読取り枠とを示す。 (A)制限地図:制限酵素BamHI、EcoRI、H
ind III、PstIの位置がBamL−断片のヌ
クレオチド位置に対して示される。 (B)オープン読取り枠:BamHIL−断片のオープ
ン読取り枠が箱として示され、それぞれのDNA配列の
両方の極性で与えられる。図26は、プラスミドpUC
LP1.9の制限地図を示す。pUC8のサイズは2.
7kbである。1acUV5β−ガラクトシダーゼプロ
モーターおよびオペレーター(PO)のクローニング領
域3′は、EcoRI(E),BamHI(B)、Sa
lI(S),PstI(P),Hind III(H)
部位を含む。中抜きバーで示されるBamL−断片の
1.9kbサブ断片をPstI部中へ挿入した。この読
取り枠は、pUC8の1acZコード部分と同じ配向を
有する(太い黒線で示す)。図27は、プラスミドpU
RLP1.9の制限地図を示す。ベクターpUR290
は、5.2kbの長さを有し、β−ラクタマーゼ遺伝子
(MAP2)からなり、pBR322の複製源である。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子は太い黒線で示され、それ
ぞれのプロモーター・オペレーター領域はPOで示され
る。制限酵素の略号は下記の通りである。BamHI
(B)、ClaI(C)、EcoRI(E)、Hind
III(H)、PstI(P)、SalI(S)。p
UCLP1.9の1.9kb挿入物はBamHI部位と
Hind III部位との間に導入された。図28〜図
33は、プラスミドpURLP1.9によってコードさ
れる融合蛋白質のDNA配列およびアミノ酸配列であ
る。 bp 4−3069:β−ガラクトシダーゼ bp 3070−3072:pUR290リンカー(小
文字で示す) bp 3073−3088:多重クローニング部位(B
amHI−PstI:小文字で示す) bp 3089〜4985:gp350のPstI断片 bp 4986〜4994:pUC8多重クローニング
部位(PstI〜HindIII:小文字で示す) bp 4995〜末端:PBR322配列。図34は、プラスミドpURLP1.9によってコード
されるβ−gal:gp350蛋白質の発現を示す 。第
1列および第2列は、未誘導の(第1列)およびIPT
G誘導の(第2列)pURLP1.9含有クローンのク
ーマッシーブルー染色PAGEを示す。分子量の異なる
数多くのバンドがあるので、蛋白質の主成分は不完全に
合成されたように思われる。第3列は、NPC血清によ
るペルオキシダーゼDAB染色ウエスタンブロットを示
す。β−ガラクトシダーゼに相当するサイズ116kD
のバンド以外は、新たに発現されたすべての蛋白質は抗
原性である。細菌のバックグラウンドバンドは、使用し
た血清中の高含量の抗菌性抗体によるものである。図3
5は、プラスミドpURLP1.9によってコードされ
るβ−gal:gp350融合蛋白質の精製を示す。 (A)クーマッシー染色ゲル;(B)NPC血清で処理
したウエスタンブロット。 第1列:未誘導培養 第2列:IPTG誘導培養 第3列:8M尿素中に溶解した溶解菌の不溶性蛋白質 第4列:セファローズ2B−C1クロマトグラフィー後
プールされたβ−gal:gp350蛋白質含有分画図36は、親水性(黒丸)および疎水性(灰色丸)の相
対的価値物を含むgp350のコン−ピューター予測2
次構造を示す 。図に示した尺度では、ループ構造だけが
180°のラインターン(lineturns)として
明瞭に見られる。図37は、β−gal融合蛋白質とし
てのgp350断片の発現を示す。プラスミドpURL
EP600およびpURLXP390によってコードさ
れるクーマッシーブルー染色発現産物を上部に示す(p
UR288は対照)。下部には、EBV陽性血清との反
応性を示すための免疫染色後の同じプローグを示す。図
38は、pUCLEP600およびpUCARG123
4によってコードされる蛋白質の発現とそれらのEBV
陽性血清に対する反応性とを、pUR8を対照として示
す。 上部:クーマッシー染色SDS−PAGE 下部:免疫染色ウエスタンブロット。図39は、gp250/350をコードする領域の制限
地図を示す 。黒いバーはgp250/350をコードす
る領域を示す。さらに、サブクローニングのために用い
られた制限酵素、スプライス部位、実施例13および1
5−17で構築された組換え発現プラスミドの挿入物
(insert)が示してある。図40〜図61は、E
BV関連蛋白質のDNA配列および対応するアミノ酸配
列を示す。 A.蛋白質 p54 試験管内翻訳でp47と同定されたモノクローン性抗体
による免疫沈降と相関がある蛋白質54のヌクレオチド
配列および誘導されるアミノ酸配列。 B.蛋白質p90 C.蛋白質p143 D.蛋白質p150。図62は、β−gal::p150融合蛋白質の発現を
示す 頂部に示したIPTG誘導クローンを、溶解後、10%
SDS−PAGE中で分離し、蛋白質をクーマッシーブ
ルーで染色した。対照としてpUR288をβ−ガラク
トシダーゼのサイズを示すために用いた。すべてのクロ
ーンが対照クローンよりも大きくかつ挿入物(inse
rt)サイズに相当する新しい蛋白質を産生する。図6
3は、β−gal::p150融合蛋白質の抗原性を示
す。図62に示したクローンからの同じ溶解産物をニト
ロセルロースへ移行し、免疫染色(上掲)によってEB
V関連抗原を可視化した。N末端部分をコードするクロ
ーンは強く反応する。図64は、p150コード領域の
地図である。p150コード領域を黒いバーで示す。サ
ブクローニングのために用いられた制限部位および得ら
れたpUR−クローンも示してある。
するEBV特異性血清の免疫沈降のオートラジオグラフ
ィーである。 免疫沈降した35S−標識一蛋白質をSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルに
X線フィルムを露出した。免疫沈降に用いた種々の血清
源は、オートラジオグラフィーのそれぞれの領域の下に
示してある。“プール”と称する対照は、免疫沈降性の
EBV特異的蛋白質のすべてを含んでいる。このオート
ラジオグラフィーから、NPC血清のおのおのに、かつ
EBV感染特異的血清のあるものにのみ、少くともp1
38、p150、p80に対する抗体が存在することが
わかる。同様に、回復期状態に比べて、新しいEBV感
染(伝染性単核症)には、p54に対する抗体が重要で
ある。p150、p143、p110、p90に対する
抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存在し、免疫の
ため、あるいは新しいEBV感染についてIgM特異性
試験に関連して、あるいはEBV関連腫瘍(neopl
asia)(NPCおよびBL)についてはIgAに関
連してマーカーとして作用することができる。図2は、
EBV B95−8ゲノムに対するmRNA’sのマッ
ピングを示す。EBV B95−8ゲノムのBamHI
制限部位は、図の下に示してあり、それぞれの制限断片
は、大文字および小文字で示してある。個々のBamH
I制限断片に対するハイブリッド選択によって位置決定
されている蛋白質のmRNA’sは数および線で示して
ある。この図から、p138の遺伝子がBamA断片に
相関していることがわかる。図3〜図7は、p138を
コードするBamAの左側読取り枠のDNA配列を示
す。ここに示した配列は、それぞれの陰性鎖である。p
138コード領域は、ヌクレオチド位置182から始ま
り、ヌクレオチド位置3563で終わる。このコード領
域の断片のクローニングに用いられる制限部位が示して
ある。図8は、プラスミドpUC635およびpUC1
30の制限地図を示す。ベクターpUC8のサイズは
2.7kbである。1acUV5β−ガラクトシダーゼ
プロモーターおよびオペレーター(PO)のクローニン
グ部位3′は、EcoRI(E),BamHI(B)、
SalI(S),PstI(P),Hind III
(H)部位を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子はAMPで
示される。p138コード領域の3,0kbおよび3.
3kbXhoI断片をpUC8のSalI部位中へ挿入
する。挿入は中抜きバーで示してある。pUC635
は、3.0kbXhoI断片を、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子に対して正しい読取り枠内に含んでいるが、pU
C6130は、3.3kbXhoI断片を反対の配向で
含んでいる図9は、プラスミドpUC635、pUC924、pM
F924、pKK378によってコードされる蛋白質の
発現を示す 。第1列は免疫染色したウエスタン・ブロッ
トで、pUC8で形質転換され、IPTGで誘導された
細菌から単離されている 第2列はpUC924で形質転換された細菌の蛋白質で
あり、第3列はpKK378で形質転換された細菌の蛋
白質であり、第4列はpMF924で形質転換された細
菌の蛋白質であり、第5列はpUC635で形質転換さ
れた細菌の蛋白質である。融合蛋白質のサイズは、75
kD(第2列)、110kD(第3列)、90kD(第
4列)、135kD(第5列)と概算された。図10
は、プラスミドpUC924の制限地図である。ベクタ
ーpUC9のサイズは2.7kbである、1acUV5
β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびオペレーター
(PO)のクローニング部位3′は、EcoRI
(E),BamHI(B)、SalI(S)、PstI
(P),Hind III(H)を含む。β−ラクタマ
ーゼ遺伝子はAMPで示される。pUC635の2.6
kbBgl II/EcoRI−断片を、BamHI部
位とEcoRI部位との間に挿入する、Bgl IIの
略号は“Bg”である。図11は、プラスミドpMF9
24の制限地図である。pUC924の2.0kb B
amHI/Hind III断片がハイブリッドtrp
−lacプロモーター(tac)とC1(λ=プレッサ
ー)のアミノ末端コード領域との3′に位置する、pE
A305のBamHおよびHind III制限部位中
へ挿入された。図12は、プラスミドpKK378の制
限地図であるリンカーとしてpBR322の345 b
p BamHI/Hind III断片(黒い太線で示
す)を用い、ベクターpKK240−11のHind
III部位中へpUC6130の3.3kb BamH
I/HindIII断片を挿入した。かくして、p13
8コード断片は、ハイブリッドtrp−lacプロモー
ター(tac)およびATC開始コドンの3′に位置す
る。図13は、p138の2次構造である。p138の
2次構造のチョウーファスマン(Chou.Fasma
n)計算のコンピュータープロットを示す。また、疎水
性領域(黒丸)および親水性領域(白丸)も示す。抗原
部位は、β−ターンをもつ親水性領域にあると期待され
る。この環境は、p600領域中および蛋白質のカルボ
キシ末端に与えられる。ベクターpUC8およびpUR
288中へサブクローニングされた領域が示されてい
る。図14は、p138のPstI断片を担持するプラ
スミドpURで形質転換された細菌の発現産物を示す。 (A)種々のプラスミドを担持するIPTC誘導細菌の
溶解産物のクーマッシーブリリアントブルー染色SDS
ポリアクリルアミドスラブゲル分析を示す。分子量12
0〜150kdの融合蛋白質を黒丸で示す。トラックM
(TrackM)分子量マーカーが図3〜図7に示すよ
うなp138の領域を含むプラスミドを担持する細菌の
pUR400−pUR540の溶解産物を標識する。 (B)ゲル(パネルAで示したものと同様な)からニト
ロセルロースペーパー(ウエスタンブロット)上へ移行
させた蛋白質の酵素免疫測定を示す。この測定では、高
力価血清のプールを用い、洗浄後、結合した免疫グロブ
リンを、ヒトIgGに対する抗体にカップリングさせた
ペルオキシダーゼとジアミノベンジジンとによる逐次反
応によって可視化した。pUR600およびpUR54
0を含む細菌からの融合蛋白質だけが特異的反応を示
す。プラスミドpUC635(陽性対照としての)はp
138コード領域のほとんど全部を含むが、蛋白質は不
安定で、急速に分解する。pUC8は、EBV誘導配列
を含まないベクタープラスミドを含む陰性対照である。
図15は、p138のPstI断片を担持するpUCサ
ブクローンで形質転換された菌の発現産物を示す。ゲル
からニトロセルロースペーパー(ウエスタン・ブロッ
ト)へ電気泳動によって移行させた蛋白質の酵素免疫測
定を行った。この測定では、高力価抗血清のプールを用
い、洗浄後、結合した免疫グロブリンを、ヒトIgGに
対する抗体にカップリングさせたペルオキシダーゼとジ
アミノベンジジンとによる逐次反応によって可視化し
た。pUCP600を含む菌からの融合蛋白質は安定に
産生され、特異的抗原反応を示す。図16は、β−ga
l融合蛋白質としての発現によって見いだされる両方の
抗原部位をコードするプラスミドpUCARG1140
の構築スキームである。 (a)pUC600の5′−PstI部位を、SalI
(20bp上流)およびHind IIIで消化するこ
とによって除去し、次いでpUC12−SalI/Hi
nd IIIと連結させた。このプラスミドから、Ec
oRIおよびPstIで挿入物(insert)を除去
し、pUC8−EcoRI中へ連結させた。得られたプ
ラスミドpUC601中へ、5個のアルギニンと2個の
停止コドンとをコードするオリゴヌクレオチドを、3′
−PstI部位とHind III(pUCARG60
1)との間の1本鎖DNAとして挿入した。最後の工程
に於て、p138のC末端からの第2抗原決定基をコー
ドする540 bp PstI断片を、PstIによる
消化および連結によって挿入した。得られたプラスミド
は、5個のアルギニン残基がその後に続く両方の抗原決
定基を枠内に含んでいた。このプラスミドをpUCAR
1140と称した。 (b)オリゴアルギニンリンカーのヌクレオチド配列。
下方鎖(lower strand)を合成し、Pst
IおよびHind IIIの付着末端間の架橋形成によ
って1本鎖DNAとして挿入した。図17は、pUC8
を対照とする、プラスミドpUC600,pUC60
1,pUCARG601,pUCARG1140のIP
TG誘導発現を示す。上部は、クーマッシー(Coom
assi)染色SDS−PAGEを示す。新たに検出さ
れた蛋白質は、黒色点で標識し、下部は、NPC患者か
らの血清による免疫染色後に得られた対応するウエスタ
ンブロトト(Western blot)を示す。pU
CP600と比べて、pUC601によってコードされ
るEBV関連蛋白質は、14個のアミノ酸が欠けている
(pUC−ポリリンカーによってコードされる6個のア
ミノ酸とPstI−PstI断片からの8個のアミノ
酸)ので、約1.5kD小さい。pUCARG601に
よってコードされる蛋白質のサイズは、挿入されたオリ
ゴヌクレオチド中に存在する停止コドンによってpUC
のIacZ領域中を通しての読取りが阻害されるので、
さらに約11kD減少される。pUCLARG1140
では、540 bp 断片の挿入によって約42kDに
サイズが増加する。この蛋白質は細菌細胞中で安定であ
る。図18は、p138中で検出される2個のエピトー
プに対する個々のNPC血清のIgGおよびIgA抗体
の分布および反応性を示す。図に示したプラスミドを担
持するIPTG誘導大腸菌(E.coli)細胞の溶解
産物を、12%SDS−PAGE上で、4回、独立に分
離し、ウエスタン・ブロッティングによってニトロセル
ロースへ移行させた。第1列:陰性参照としてのpUR
288;第2列:陽性対照としてのpUCARG11
4;第3列:pUR540;第4列:pUR600。2
種の個々のNPC血清(No.352とNo.354)
をフィルターと共にインキュベートし、結合したIgG
およびIgA抗体を、ペルオキシダーゼ接合抗ヒトIg
Gおよび抗ヒトIgAウサギ抗体を用いて可視化した。
ウエスタン・プロツト中の蛋白質の異なる位置、特にp
UCARG1140の異なる位置はSDS−PAGEの
異なる電気泳動時間から得られる。NPC血清No.3
52に於ては、IgGおよびIgA抗体の主な反応はp
138のC末端からのp540エピトープ(図13参
照)に対して向けられるが、血清No.354では抗−
p138抗体の主要部分はD600エピトープ(図13
参照)。このことは、血清中の抗p138抗体の検出に
は両方の抗原部位が必要であることを示す。図19は、
プラスミドpUCARG1140によってコードされる
蛋白質を抗原として用いるELISA試験を示す。第1
列および第3列:EBV陰性血清、第2列:NPCプー
ル血清、第4−13列:個々のNPC血清。希釈試験は
下部に示す。左側:IgG、右側:IgA。図20は、
カルボキシ末端にオリゴアルギニン基を担持する蛋白質
の精製を示す。 (A)5個のアルギニン残基と2個の停止コドンとをコ
ードするオリゴヌクレオチドの配列。5′末端に於ける
Hind IIIと3′末端に於けるPstI部位と
は、このオリゴヌクレオチドをpUC8中へ挿入するこ
とによって生成された。 (B)カルボキシ末端に該Arg−リンカーを担持する
不溶性の発現真核生物蛋白質の精製スキーム。図21〜
図24は、gp250/350をコードするBamI−
断片の左側読取り枠のDNA配列を示す。この糖蛋白質
のためのコード領域は、ゲノム位置92153から始ま
り、位置89433で終わる。図に示した配列は、代表
的な陰性鎖であり、位置92703のBamHI部位か
ら始まる。この図の配列番号によれば、gp350コー
ド領域は、位置556と3276の間にある。塩基対5
20の領域内のTATAA−ボックスは・・・で標識さ
れ、位置3290の多分ポリアデニル化位置は+++で
標識される。スプライスドナーおよびスプライスアクセ
プター部位は、ドナー部位は)(………で、アクセプタ
ー部位は………)(で示される。コード領域のカルボキ
シ末端付近の疎水性領域は***で標識される。恐ら
く、このアミノ酸配列は、この蛋白質を膜に固着させる
ためのアンカー配列として働く。図25は、BamL−
断片の制限地図とオープン読取り枠とを示す。 (A)制限地図:制限酵素BamHI、EcoRI、H
ind III、PstIの位置がBamL−断片のヌ
クレオチド位置に対して示される。 (B)オープン読取り枠:BamHIL−断片のオープ
ン読取り枠が箱として示され、それぞれのDNA配列の
両方の極性で与えられる。図26は、プラスミドpUC
LP1.9の制限地図を示す。pUC8のサイズは2.
7kbである。1acUV5β−ガラクトシダーゼプロ
モーターおよびオペレーター(PO)のクローニング領
域3′は、EcoRI(E),BamHI(B)、Sa
lI(S),PstI(P),Hind III(H)
部位を含む。中抜きバーで示されるBamL−断片の
1.9kbサブ断片をPstI部中へ挿入した。この読
取り枠は、pUC8の1acZコード部分と同じ配向を
有する(太い黒線で示す)。図27は、プラスミドpU
RLP1.9の制限地図を示す。ベクターpUR290
は、5.2kbの長さを有し、β−ラクタマーゼ遺伝子
(MAP2)からなり、pBR322の複製源である。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子は太い黒線で示され、それ
ぞれのプロモーター・オペレーター領域はPOで示され
る。制限酵素の略号は下記の通りである。BamHI
(B)、ClaI(C)、EcoRI(E)、Hind
III(H)、PstI(P)、SalI(S)。p
UCLP1.9の1.9kb挿入物はBamHI部位と
Hind III部位との間に導入された。図28〜図
33は、プラスミドpURLP1.9によってコードさ
れる融合蛋白質のDNA配列およびアミノ酸配列であ
る。 bp 4−3069:β−ガラクトシダーゼ bp 3070−3072:pUR290リンカー(小
文字で示す) bp 3073−3088:多重クローニング部位(B
amHI−PstI:小文字で示す) bp 3089〜4985:gp350のPstI断片 bp 4986〜4994:pUC8多重クローニング
部位(PstI〜HindIII:小文字で示す) bp 4995〜末端:PBR322配列。図34は、プラスミドpURLP1.9によってコード
されるβ−gal:gp350蛋白質の発現を示す 。第
1列および第2列は、未誘導の(第1列)およびIPT
G誘導の(第2列)pURLP1.9含有クローンのク
ーマッシーブルー染色PAGEを示す。分子量の異なる
数多くのバンドがあるので、蛋白質の主成分は不完全に
合成されたように思われる。第3列は、NPC血清によ
るペルオキシダーゼDAB染色ウエスタンブロットを示
す。β−ガラクトシダーゼに相当するサイズ116kD
のバンド以外は、新たに発現されたすべての蛋白質は抗
原性である。細菌のバックグラウンドバンドは、使用し
た血清中の高含量の抗菌性抗体によるものである。図3
5は、プラスミドpURLP1.9によってコードされ
るβ−gal:gp350融合蛋白質の精製を示す。 (A)クーマッシー染色ゲル;(B)NPC血清で処理
したウエスタンブロット。 第1列:未誘導培養 第2列:IPTG誘導培養 第3列:8M尿素中に溶解した溶解菌の不溶性蛋白質 第4列:セファローズ2B−C1クロマトグラフィー後
プールされたβ−gal:gp350蛋白質含有分画図36は、親水性(黒丸)および疎水性(灰色丸)の相
対的価値物を含むgp350のコン−ピューター予測2
次構造を示す 。図に示した尺度では、ループ構造だけが
180°のラインターン(lineturns)として
明瞭に見られる。図37は、β−gal融合蛋白質とし
てのgp350断片の発現を示す。プラスミドpURL
EP600およびpURLXP390によってコードさ
れるクーマッシーブルー染色発現産物を上部に示す(p
UR288は対照)。下部には、EBV陽性血清との反
応性を示すための免疫染色後の同じプローグを示す。図
38は、pUCLEP600およびpUCARG123
4によってコードされる蛋白質の発現とそれらのEBV
陽性血清に対する反応性とを、pUR8を対照として示
す。 上部:クーマッシー染色SDS−PAGE 下部:免疫染色ウエスタンブロット。図39は、gp250/350をコードする領域の制限
地図を示す 。黒いバーはgp250/350をコードす
る領域を示す。さらに、サブクローニングのために用い
られた制限酵素、スプライス部位、実施例13および1
5−17で構築された組換え発現プラスミドの挿入物
(insert)が示してある。図40〜図61は、E
BV関連蛋白質のDNA配列および対応するアミノ酸配
列を示す。 A.蛋白質 p54 試験管内翻訳でp47と同定されたモノクローン性抗体
による免疫沈降と相関がある蛋白質54のヌクレオチド
配列および誘導されるアミノ酸配列。 B.蛋白質p90 C.蛋白質p143 D.蛋白質p150。図62は、β−gal::p150融合蛋白質の発現を
示す 頂部に示したIPTG誘導クローンを、溶解後、10%
SDS−PAGE中で分離し、蛋白質をクーマッシーブ
ルーで染色した。対照としてpUR288をβ−ガラク
トシダーゼのサイズを示すために用いた。すべてのクロ
ーンが対照クローンよりも大きくかつ挿入物(inse
rt)サイズに相当する新しい蛋白質を産生する。図6
3は、β−gal::p150融合蛋白質の抗原性を示
す。図62に示したクローンからの同じ溶解産物をニト
ロセルロースへ移行し、免疫染色(上掲)によってEB
V関連抗原を可視化した。N末端部分をコードするクロ
ーンは強く反応する。図64は、p150コード領域の
地図である。p150コード領域を黒いバーで示す。サ
ブクローニングのために用いられた制限部位および得ら
れたpUR−クローンも示してある。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成7年10月9日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【提出日】平成7年12月21日
【手続補正2】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図2】
【図10】
【図11】
【図12】
【図26】
【図27】
【図1】
【図8】
【図3】
【図38】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図9】
【図15】
【図16】
【図13】
【図63】
【図14】
【図17】
【図18】
【図25】
【図39】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図42】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図47】
【図34】
【図35】
【図37】
【図62】
【図36】
【図40】
【図41】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図64】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/569 J 33/577 B // C12P 21/02 C (C12N 1/21 C12R 1:19)
Claims (20)
- 【請求項1】 図3、図17、図28に示すようなアミ
ノ酸配列を有するEBV関連抗原蛋白質の少なくとも一
部分に対応することを特徴とする、EBVゲノムのDN
A配列。 - 【請求項2】 蛋白質p150、p143、p138、
p110、p105、p90、p80、p54またはg
p250/350の少なくとも一部分に対応することを
特徴とする、請求項1記載のDNA配列。 - 【請求項3】 5’フランクおよび3’フランク中のそ
れぞれの調節配列を付加的に含有することを特徴とす
る、請求項1または2記載のDNA配列。 - 【請求項4】 請求項1記載のDNA配列に対してヌク
レオチドの置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの
挿入、ヌクレオチド配列(stretch)の逆位を含
む突然変異によって関連ずけられかつ特許請求の範囲第
(1)項記載の蛋白質の少なくとも一部分をコードす
る、天然源または合成源または半合成源を含むいずれか
らの源からの、請求項1〜3のいずれか1項に記載のD
NA配列にハイブリッドするDNA配列。 - 【請求項5】 組換えプラスミドpUC6130、pU
C635、pUCP400、pUCP380、pUCP
600、pUCP210、pUCP750、pUCP5
40、pUCHP、pUC924、pMF924、pK
K378、pUR600、pUR540、pUCARG
680またはpUCARG1140中に挿入されている
ことを特徴とする、請求項2記載のDNA配列。 - 【請求項6】 組換えプラスミドpUCLP1.9、p
URLP1.9、pUC19LEP600、pUC19
LXP390、pURLXP390、pUCARG12
30、pUCLEP600、pUCLXP390または
pURLEP600中へ挿入されていることを特徴とす
る、請求項2記載のDNA配列。 - 【請求項7】 組換えプラスミドpUR290CXH5
80、pUR290DBX320、pUR292DBB
180、pUR290DTT700、pURDTT74
0、pUR290DTP680またはpUR288DP
P320中へ挿入されているこを特徴とする、請求項2
記載のDNA配列。 - 【請求項8】 単一のEBVゲノムから誘導される請求
項1〜4のいずれか1項のDNAの少なくとも2つの領
域を読取り枠中に含有することを特徴とするDNA配
列。 - 【請求項9】 異なるEBVゲノムから誘導される請求
項1〜4のいずれか1項のDNA配列の少なくとも2つ
の領域を読取り枠中に含有することを特徴とする、請求
項7記載のDNA配列。 - 【請求項10】 正しい読取り枠中に位置し、少なくと
も1個の停止コドンがその後に続く3〜15個のアルギ
ニンコドンをその3’末端に於て含有することを特徴と
する、請求項1〜8のいずれか1項に記載のDNA配
列。 - 【請求項11】 得られたポリペプチド中で配列特異性
プロテアーゼのための開裂部位として働くかあるいは蟻
酸のような酸による酸処理によって開裂可能であるオリ
ゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをその5’
末端に於て含有することを特徴とする、請求項1〜6の
いずれか1項に記載のDNA配列。 - 【請求項12】 請求項1〜10のいずれか1項に記載
のDNA配列を含有することを特徴とする、クローニン
グのための組換えDNA分子。 - 【請求項13】 表現調節配列に作動的に連結合された
請求項1〜10のいずれか1項に記載のDNA配列を含
有することを特徴とする、表現のための組換えDNA分
子。 - 【請求項14】 表現調節配列が大腸菌λプロモーター
系、大腸菌ラック系(lac−system)、大腸菌
β−ラクタマーゼ系、大腸菌trp系、大腸菌リポ蛋白
質プロモーター、酵母および他の真核性表現調節配列の
群から選ばれることを特徴とする、請求項12記載の組
換えDNA分子。 - 【請求項15】 そのコードされた蛋白質が融合蛋白質
中にその3’末端へ連結されたDNA配列によってコー
ドされた蛋白質を安定化するp138コードDNA配列
の一部分を担持し、かつ第2DNA配列の挿入後正しい
読取り枠中のこの第2配列の3’末端に位置される少な
くとも1個の停止コドンが後に続く3〜15個のアルギ
ニン残基をコードするDNA配列を担持するベクター。 - 【請求項16】 pUCARG601である請求項15
記載のベクター。 - 【請求項17】 請求項11〜14のいずれか1項に記
載の少なくとも1個の組換えDNA分子によって形質転
換されていることを特徴とする宿主。 - 【請求項18】 大腸菌、他の細菌、酵母、他の真菌、
動物細胞、ヒト細胞の株からなる群から選ばれる請求項
17記載の宿主。 - 【請求項19】 請求項7または8に記載のDNA配列
によってコードされることを特徴とする、EBV関連疾
患の診断および治療に適した少なくとも2個のEBV関
連抗原決定基を有する多抗原。 - 【請求項20】 請求項1〜10のいずれか1項記載の
少なくとも1つのDNA配列を試料中のEBV関連DN
A配列へのハイブリダイゼーションのために十分な量で
含有する、EBV関連疾患の検出のための診断用組成
物。
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