JP3162125B2 - 免疫測定用磁性固相担体 - Google Patents
免疫測定用磁性固相担体Info
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- JP3162125B2 JP3162125B2 JP25379291A JP25379291A JP3162125B2 JP 3162125 B2 JP3162125 B2 JP 3162125B2 JP 25379291 A JP25379291 A JP 25379291A JP 25379291 A JP25379291 A JP 25379291A JP 3162125 B2 JP3162125 B2 JP 3162125B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用す
る各種の検出法、測定法などに使用される固相担体に関
する。
る各種の検出法、測定法などに使用される固相担体に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、抗原抗体反応を利用した各種
の検出法や測定法が、研究や診断の分野で利用されてい
るが、これらの検出法や測定法を簡略化するために、抗
原または抗体をあらかじめ固相担体に結合したもの（以
下、固相化抗原または固相化抗体という）を使用し、こ
の固相化抗原または固相化抗体と、抗原抗体反応媒体中
の抗体または抗原を反応させている。
の検出法や測定法が、研究や診断の分野で利用されてい
るが、これらの検出法や測定法を簡略化するために、抗
原または抗体をあらかじめ固相担体に結合したもの（以
下、固相化抗原または固相化抗体という）を使用し、こ
の固相化抗原または固相化抗体と、抗原抗体反応媒体中
の抗体または抗原を反応させている。
【０００３】そして、抗原や抗体の固相担体への結合
は、一般に、疎水性相互作用を利用した物理的な吸着に
よって行われている。上記疎水性相互作用を利用する固
相担体としては疎水性表面を有する合成高分子の成形体
（例えば、ビ−ズ状、プレ−ト状、メンブレン状等の成
形体）があげられ、一般に、粒径が２〜１０ｍｍの合成
高分子からなるビ−ズ（例えば、ポリスチレンビ−ズ）
が好適に使用されている。しかしながら、上記ビ−ズ状
固相担体は、その粒径が大きいために、抗原抗体反応媒
体中に浮遊させることが難しく、仮に媒体の比重を調整
して浮遊させたとしても微粒子と違いブラウン運動をす
ることもないので、外部からの振動を与えないかぎり媒
体中を移動させることは困難である。その結果、固相化
抗原または固相化抗体と、媒体中の抗体または抗原との
衝突機会が少なく、抗原抗体反応に時間がかかり、早く
て１時間、遅い場合は１〜２日間、通常は３時間程度反
応させないと測定ができないという問題点を生じてい
た。
は、一般に、疎水性相互作用を利用した物理的な吸着に
よって行われている。上記疎水性相互作用を利用する固
相担体としては疎水性表面を有する合成高分子の成形体
（例えば、ビ−ズ状、プレ−ト状、メンブレン状等の成
形体）があげられ、一般に、粒径が２〜１０ｍｍの合成
高分子からなるビ−ズ（例えば、ポリスチレンビ−ズ）
が好適に使用されている。しかしながら、上記ビ−ズ状
固相担体は、その粒径が大きいために、抗原抗体反応媒
体中に浮遊させることが難しく、仮に媒体の比重を調整
して浮遊させたとしても微粒子と違いブラウン運動をす
ることもないので、外部からの振動を与えないかぎり媒
体中を移動させることは困難である。その結果、固相化
抗原または固相化抗体と、媒体中の抗体または抗原との
衝突機会が少なく、抗原抗体反応に時間がかかり、早く
て１時間、遅い場合は１〜２日間、通常は３時間程度反
応させないと測定ができないという問題点を生じてい
た。
【０００４】一方、合成高分子の微小粒子からなる固相
担体は、抗原抗体反応の時間は短縮できるが、媒体と固
相担体を分離するとき、遠心分離等の操作を加える必要
があり実用的でない。
担体は、抗原抗体反応の時間は短縮できるが、媒体と固
相担体を分離するとき、遠心分離等の操作を加える必要
があり実用的でない。
【０００５】上記欠点を解決するために、種々の提案が
なされており、例えば、合成高分子の微小粒子の表面に
磁性微粒子を結合させたものが提案されているが、この
ものは、抗原抗体反応の時間も早く、磁石で固定するこ
とにより媒体との分離も簡単に行えるが、測定操作中に
磁性微粒子が合成高分子の微小粒子表面から分離してし
まうという欠点がある。また、特開昭６０−７９２６６
号公報には、磁性体核をポリスチレン等の樹脂で覆った
磁性粒子が開示されているが、このものは、その大きさ
および表面積を均一に揃えることが困難であることか
ら、抗原抗体反応を一定条件下で絶えず均一に行わせる
ことが難しいという欠点があった。
なされており、例えば、合成高分子の微小粒子の表面に
磁性微粒子を結合させたものが提案されているが、この
ものは、抗原抗体反応の時間も早く、磁石で固定するこ
とにより媒体との分離も簡単に行えるが、測定操作中に
磁性微粒子が合成高分子の微小粒子表面から分離してし
まうという欠点がある。また、特開昭６０−７９２６６
号公報には、磁性体核をポリスチレン等の樹脂で覆った
磁性粒子が開示されているが、このものは、その大きさ
および表面積を均一に揃えることが困難であることか
ら、抗原抗体反応を一定条件下で絶えず均一に行わせる
ことが難しいという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記欠点に
鑑みてなされたものであり、その目的は、疎水性相互作
用によって抗原や抗体を容易に結合させることができ、
大きさおよび表面積を均一に制御することが可能であ
り、抗原抗体反応の遅れがなく、磁性を利用して抗原抗
体反応媒体との分離を容易に行うことができる磁性固相
担体を提供することにある。
鑑みてなされたものであり、その目的は、疎水性相互作
用によって抗原や抗体を容易に結合させることができ、
大きさおよび表面積を均一に制御することが可能であ
り、抗原抗体反応の遅れがなく、磁性を利用して抗原抗
体反応媒体との分離を容易に行うことができる磁性固相
担体を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の磁性固相担体
は、樹脂粒子表面に磁性層が形成された固相担体であっ
て、該磁性層がプラズマ重合法によって形成された高分
子物質と、スパッタリング法によって形成された磁性金
属の混合物からなる複合膜であり、該磁性層中の磁性金
属の含有量が原子数で１０〜５０％であることを特徴と
し、そのことにより上記目的が達成される。
は、樹脂粒子表面に磁性層が形成された固相担体であっ
て、該磁性層がプラズマ重合法によって形成された高分
子物質と、スパッタリング法によって形成された磁性金
属の混合物からなる複合膜であり、該磁性層中の磁性金
属の含有量が原子数で１０〜５０％であることを特徴と
し、そのことにより上記目的が達成される。
【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。本発明で
使用される樹脂粒子は、抗原または抗体と結合するもの
であれば、特に限定されるものでなく、例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、酢酸セルロー
ス、ニトロセルロース、フッ素系樹脂等の単独重合体、
スチレンと他のモノマーとの共重合体などからなる粒子
があげられる。
使用される樹脂粒子は、抗原または抗体と結合するもの
であれば、特に限定されるものでなく、例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、酢酸セルロー
ス、ニトロセルロース、フッ素系樹脂等の単独重合体、
スチレンと他のモノマーとの共重合体などからなる粒子
があげられる。
【０００９】また、樹脂粒子の形状は、特に限定される
ものではないが、乳化重合、懸濁重合などにより容易に
製造可能であって、粒径を揃えるための分級技術を考慮
すると、球状や楕円状のものが好ましい。
ものではないが、乳化重合、懸濁重合などにより容易に
製造可能であって、粒径を揃えるための分級技術を考慮
すると、球状や楕円状のものが好ましい。
【００１０】上記樹脂粒子の粒径は、小さくなると得ら
れる磁性固相担体の疎水性部分の表面積が小さくなっ
て、抗原または抗体との結合量が少なくなり、大きくな
ると表面に形成された磁性層が樹脂粒子に比べて相対的
に小さくなって、測定の際に、磁力による抗原抗体反応
媒体との分離が困難になるので、０．１μｍ〜１ｍｍの
範囲に制限され、好ましくは０．５〜１００μｍであ
る。
れる磁性固相担体の疎水性部分の表面積が小さくなっ
て、抗原または抗体との結合量が少なくなり、大きくな
ると表面に形成された磁性層が樹脂粒子に比べて相対的
に小さくなって、測定の際に、磁力による抗原抗体反応
媒体との分離が困難になるので、０．１μｍ〜１ｍｍの
範囲に制限され、好ましくは０．５〜１００μｍであ
る。
【００１１】本発明の磁性固相担体は、上記樹脂粒子の
表面に、磁性層として、高分子物質と磁性金属との混合
物からなる複合膜が形成されたものであって、該複合膜
は、プラズマ重合による高分子物質の形成とスパッタリ
ングによる磁性金属の形成を同一容器内で行うことによ
り得ることができる。
表面に、磁性層として、高分子物質と磁性金属との混合
物からなる複合膜が形成されたものであって、該複合膜
は、プラズマ重合による高分子物質の形成とスパッタリ
ングによる磁性金属の形成を同一容器内で行うことによ
り得ることができる。
【００１２】上記高分子物質は、有機モノマーを出発原
料としてプラズマ重合して形成され、該有機モノマーと
しては、特に制限されることはなく、例えば、エチレ
ン、スチレン、ホルムアルデヒド、ナフタレン、ピレ
ン、ペリレン、ビフェニル、ターフェニル、クォーター
フェニルなどが好適に使用される。
料としてプラズマ重合して形成され、該有機モノマーと
しては、特に制限されることはなく、例えば、エチレ
ン、スチレン、ホルムアルデヒド、ナフタレン、ピレ
ン、ペリレン、ビフェニル、ターフェニル、クォーター
フェニルなどが好適に使用される。
【００１３】また、使用する抗原や抗体の種類によっ
て、有機モノマー中の含有元素を変えて使用することが
できる。例えば、ニトロ基が必要な場合は、ニトロメタ
ン、ニトロベンゼンなどの窒素含有モノマーを出発原料
とし、アミノ基が必要な場合は、アニリンおよびその誘
導体などの窒素含有モノマーを出発原料として、プラズ
マ重合を行う。
て、有機モノマー中の含有元素を変えて使用することが
できる。例えば、ニトロ基が必要な場合は、ニトロメタ
ン、ニトロベンゼンなどの窒素含有モノマーを出発原料
とし、アミノ基が必要な場合は、アニリンおよびその誘
導体などの窒素含有モノマーを出発原料として、プラズ
マ重合を行う。
【００１４】上記有機モノマーのプラズマ重合は、キャ
リアガスで一定圧力に調整された容器内で、有機モノマ
ーが気体ならばそのままで、液体であれば気化させて、
また固体の場合は加熱により昇華させて、電極間に電力
を供給することにより行われる。
リアガスで一定圧力に調整された容器内で、有機モノマ
ーが気体ならばそのままで、液体であれば気化させて、
また固体の場合は加熱により昇華させて、電極間に電力
を供給することにより行われる。
【００１５】上記キャリアガスとしては、例えば、
Ｎ2 、Ａｒなどの不活性ガスが好適に使用され、そのと
きの圧力は、１０-1〜１０-4Ｔｏｒｒが好ましく、より
好ましくは１０-2〜１０-3Ｔｏｒｒである。
Ｎ2 、Ａｒなどの不活性ガスが好適に使用され、そのと
きの圧力は、１０-1〜１０-4Ｔｏｒｒが好ましく、より
好ましくは１０-2〜１０-3Ｔｏｒｒである。
【００１６】上記供給される電力の種類としては、特に
限定されるものではなく、例えば、周波数が１０〜３５
ＫＨｚまたは１０〜５０ＭＨｚのもの、または直流など
が好適に使用でき、出力は５０Ｗ〜１ＫＷが好ましい。
限定されるものではなく、例えば、周波数が１０〜３５
ＫＨｚまたは１０〜５０ＭＨｚのもの、または直流など
が好適に使用でき、出力は５０Ｗ〜１ＫＷが好ましい。
【００１７】上記スパッタリングされる磁性金属として
は、外部磁場に感応するものであれば利用可能であり、
例えば、鉄、コバルト、ニッケルなどの強磁性金属；ま
たは強磁性金属の合金；ガーネットやフェライトなどの
金属酸化物；Ｇｄなどの希土類金属などが挙げられる。
は、外部磁場に感応するものであれば利用可能であり、
例えば、鉄、コバルト、ニッケルなどの強磁性金属；ま
たは強磁性金属の合金；ガーネットやフェライトなどの
金属酸化物；Ｇｄなどの希土類金属などが挙げられる。
【００１８】上記金属のスパッタリングは、金属を陽極
電極材料として使用し、キャリアガスを一定圧力に調整
された容器内で、電極間に電力を供給して上記キャリア
ガスをイオン化し、加速することにより上記金属をスパ
ッタして行われる。
電極材料として使用し、キャリアガスを一定圧力に調整
された容器内で、電極間に電力を供給して上記キャリア
ガスをイオン化し、加速することにより上記金属をスパ
ッタして行われる。
【００１９】上記スパッタリングは、同一容器内で有機
モノマーのプラズマ重合と同時に行われるので、その条
件は、上記プラズマ重合条件と同一である。本発明にお
ける磁性層は、前記樹脂粒子表面を均一に覆っているの
が好ましいが、必ずしも連続膜になっていなくてもよ
く、その厚さは、薄くなると十分な磁性を示さず、厚く
なると磁性層の剥離や粒径が不均一なものとなるので、
０．０５〜１μｍが好ましく、より好ましくは０．１〜
０．５μｍである。
モノマーのプラズマ重合と同時に行われるので、その条
件は、上記プラズマ重合条件と同一である。本発明にお
ける磁性層は、前記樹脂粒子表面を均一に覆っているの
が好ましいが、必ずしも連続膜になっていなくてもよ
く、その厚さは、薄くなると十分な磁性を示さず、厚く
なると磁性層の剥離や粒径が不均一なものとなるので、
０．０５〜１μｍが好ましく、より好ましくは０．１〜
０．５μｍである。
【００２０】また、磁性層中の磁性金属の含有量は、キ
ャリアガスの種類、圧力、高周波出力、モノマー種類を
制御することによって調整が可能で、任意に変化させる
ことができるが、磁性金属の含有量が少なくなると十分
な磁性を示さず、多くなると磁性金属の粒子同士の凝縮
が起こるので、原子数で１０〜５０％の範囲が好まし
い。
ャリアガスの種類、圧力、高周波出力、モノマー種類を
制御することによって調整が可能で、任意に変化させる
ことができるが、磁性金属の含有量が少なくなると十分
な磁性を示さず、多くなると磁性金属の粒子同士の凝縮
が起こるので、原子数で１０〜５０％の範囲が好まし
い。
【００２１】本発明で使用される磁性層は、上記の材料
および方法を用いて行われるが、樹脂粒子表面に均一な
膜厚で磁性層を形成するために、樹脂が保持される容器
に振動装置や攪拌装置を設けて、樹脂粒子を攪拌しなが
ら磁性層を形成するのが望ましい。
および方法を用いて行われるが、樹脂粒子表面に均一な
膜厚で磁性層を形成するために、樹脂が保持される容器
に振動装置や攪拌装置を設けて、樹脂粒子を攪拌しなが
ら磁性層を形成するのが望ましい。
【００２２】本発明の磁性固相担体において、樹脂粒子
の表面が磁性層によって完全に覆われている場合は、プ
ラズマ重合によって形成された高分子物質が疎水性表面
となり、樹脂粒子の表面が磁性層によって完全に覆われ
ていない場合は、樹脂粒子の表面が疎水性表面となっ
て、いずれの場合でも、疎水性相互作用を利用して、抗
原や抗体を固相担体に結合させることができる。
の表面が磁性層によって完全に覆われている場合は、プ
ラズマ重合によって形成された高分子物質が疎水性表面
となり、樹脂粒子の表面が磁性層によって完全に覆われ
ていない場合は、樹脂粒子の表面が疎水性表面となっ
て、いずれの場合でも、疎水性相互作用を利用して、抗
原や抗体を固相担体に結合させることができる。
【００２３】実際に、抗原または抗体を磁性固相担体に
結合させて、固相化抗原または固相化抗体とする操作
は、抗原または抗体と固相担体を、緩衝液などの水性媒
体中で接触させることにより、容易に行うことができ
る。この際、余分な抗原や抗体は、容器の外部から磁石
を近づけて、固相担体を容器内に保持したまま、デカン
テーションすることにより、容易に除去することが可能
である。
結合させて、固相化抗原または固相化抗体とする操作
は、抗原または抗体と固相担体を、緩衝液などの水性媒
体中で接触させることにより、容易に行うことができ
る。この際、余分な抗原や抗体は、容器の外部から磁石
を近づけて、固相担体を容器内に保持したまま、デカン
テーションすることにより、容易に除去することが可能
である。
【００２４】次に、本発明の磁性固相担体を使用して行
う測定の例示として、磁性固相化抗体を用い、１ステッ
プサンドイッチ法による酵素免疫測定法で抗原を測定す
る方法を説明する。
う測定の例示として、磁性固相化抗体を用い、１ステッ
プサンドイッチ法による酵素免疫測定法で抗原を測定す
る方法を説明する。
【００２５】まず、測定対象物質（抗原）に対する抗体
を結合させた磁性固相化抗体と、測定対象物質を含む検
体と、測定対象物質に対する抗体を酵素で標識した酵素
標識抗体とを、同一容器内で混合して抗原抗体反応を行
わせた後、容器の外部から磁石を近づけて、磁性固相化
抗体を容器内に保持し、未反応の抗原および酵素標識抗
体を、デカンテーション法によって除去する。
を結合させた磁性固相化抗体と、測定対象物質を含む検
体と、測定対象物質に対する抗体を酵素で標識した酵素
標識抗体とを、同一容器内で混合して抗原抗体反応を行
わせた後、容器の外部から磁石を近づけて、磁性固相化
抗体を容器内に保持し、未反応の抗原および酵素標識抗
体を、デカンテーション法によって除去する。
【００２６】次いで、上記反応後の固相化抗体を適当な
緩衝液により洗浄し、残存する未反応の酵素標識抗体を
除去した後、酵素基質を加えて、酵素反応を行わせる。
上記酵素反応が終了した後、固相化抗体に結合した酵素
活性を測定することにより、測定対象物質の量を測定す
る。
緩衝液により洗浄し、残存する未反応の酵素標識抗体を
除去した後、酵素基質を加えて、酵素反応を行わせる。
上記酵素反応が終了した後、固相化抗体に結合した酵素
活性を測定することにより、測定対象物質の量を測定す
る。
【００２７】以上の測定の過程で、本発明の磁性固相担
体を使用することにより、抗原抗体反応および酵素反応
において、固相化抗体を懸濁状態で反応させることが可
能であり、従来の固相担体に比べて反応速度が速くなる
ので、測定時間を短縮することができる。また、外部か
ら磁石を近づけることにより、固相化抗体を容器内に保
持できるため、反応媒体と固相化抗体との分離を容易に
行うことができる。
体を使用することにより、抗原抗体反応および酵素反応
において、固相化抗体を懸濁状態で反応させることが可
能であり、従来の固相担体に比べて反応速度が速くなる
ので、測定時間を短縮することができる。また、外部か
ら磁石を近づけることにより、固相化抗体を容器内に保
持できるため、反応媒体と固相化抗体との分離を容易に
行うことができる。
【００２８】
【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。 （実施例） １）固相担体の製造。
【００２９】ステンレス鋼板（ＳＵＳ−３０４）からな
る並行平板電極を設置した反応容器内の下部電極（陰
極）に直径４０ｍｍのペトリ皿を置き、この中に樹脂粒
子としてポリスチレン系粒子（積水フアインケミカル製
「ミクロパールＳＰ」、平均粒径１０μｍ）を供給し
た。
る並行平板電極を設置した反応容器内の下部電極（陰
極）に直径４０ｍｍのペトリ皿を置き、この中に樹脂粒
子としてポリスチレン系粒子（積水フアインケミカル製
「ミクロパールＳＰ」、平均粒径１０μｍ）を供給し
た。
【００３０】次いで、反応容器内に別途設置されたタン
グステンボードに、有機モノマーとして、４，４’−ジ
ヒドロキシ−ｐ−クオ −ターフェニルを供給し、容器内
を１×１０-5Ｔｏｒｒに減圧した後、Ａｒガスを容器内
の全圧が５×１０-3Ｔｏｒｒとなるように供給した。次
いで、タングステンボードに電流を流して、４，４’−
ジドロキシ−ｐ−クオ −ターフェニルを３００℃に加熱
するとともに、電極間に１３ＫＨｚの低周波を１００Ｗ
の出力で印加し、上記樹脂粒子を攪拌しながら１５０分
間成膜して、樹脂粒子の表面に磁性層を有する固相担体
を得た。
グステンボードに、有機モノマーとして、４，４’−ジ
ヒドロキシ−ｐ−クオ −ターフェニルを供給し、容器内
を１×１０-5Ｔｏｒｒに減圧した後、Ａｒガスを容器内
の全圧が５×１０-3Ｔｏｒｒとなるように供給した。次
いで、タングステンボードに電流を流して、４，４’−
ジドロキシ−ｐ−クオ −ターフェニルを３００℃に加熱
するとともに、電極間に１３ＫＨｚの低周波を１００Ｗ
の出力で印加し、上記樹脂粒子を攪拌しながら１５０分
間成膜して、樹脂粒子の表面に磁性層を有する固相担体
を得た。
【００３１】この固相担体の表面の組成を、Ｘ線光電子
分光法によって元素分析したところ、主な元素の原子数
の割合は、Ｃ：４１％、Ｏ：３５％、Ｆｅ：１１％、Ｃ
ｒ：４％であり、高分子物質とステンレスとの複合膜で
あることが示された。 ２）試薬の調製 以下の試薬を調製した。
分光法によって元素分析したところ、主な元素の原子数
の割合は、Ｃ：４１％、Ｏ：３５％、Ｆｅ：１１％、Ｃ
ｒ：４％であり、高分子物質とステンレスとの複合膜で
あることが示された。 ２）試薬の調製 以下の試薬を調製した。
【００３２】リン酸緩衝液（ＰＢＳ）：リン酸１ナトリ
ウム、リン酸２ナトリウムおよび塩化ナトリウムを、リ
ン酸および塩化ナトリウムの終濃度が、それぞれ、０．
０２Ｍ、０．１５Ｍ、そしてｐＨが６．９０となるよう
に混合して調製した。
ウム、リン酸２ナトリウムおよび塩化ナトリウムを、リ
ン酸および塩化ナトリウムの終濃度が、それぞれ、０．
０２Ｍ、０．１５Ｍ、そしてｐＨが６．９０となるよう
に混合して調製した。
【００３３】牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ：Ｂ
ＳＡをＰＢＳに１％（ｗ／ｖ）になるように溶解して調
製した。 抗インスリン抗体：モルモットに、半合成ヒトインスリ
ン〔アクトラピッド・ヒューマンＭＣ、１．４ｍｇ／ｍ
ｌ、（４００Ｕ／ｍｌ）、ノボ社製〕とフロイントのコ
ンプリ−トアジュバンドを１：１に混合、乳化したもの
を０．５ｍｌずつ、２週間おきに６回免疫して抗血清を
得た。抗血清を３８％飽和硫安で、硫安分画し、硫安を
一部含有したγ−グロブリン分画を得た。得られたγ−
グロブリン分画をＰＢＳに溶解し、このＰＢＳ溶液を、
ＰＢＳで平衡化されたセファデックスＧ２５カラムを用
いてゲル濾過して、硫安を含まない抗インスリン抗体の
ＰＢＳ溶液を得た。これをＰＢＳにより希釈し、γ−グ
ロブリン濃度を２０μｇ／ｍｌに調整して用いた。
ＳＡをＰＢＳに１％（ｗ／ｖ）になるように溶解して調
製した。 抗インスリン抗体：モルモットに、半合成ヒトインスリ
ン〔アクトラピッド・ヒューマンＭＣ、１．４ｍｇ／ｍ
ｌ、（４００Ｕ／ｍｌ）、ノボ社製〕とフロイントのコ
ンプリ−トアジュバンドを１：１に混合、乳化したもの
を０．５ｍｌずつ、２週間おきに６回免疫して抗血清を
得た。抗血清を３８％飽和硫安で、硫安分画し、硫安を
一部含有したγ−グロブリン分画を得た。得られたγ−
グロブリン分画をＰＢＳに溶解し、このＰＢＳ溶液を、
ＰＢＳで平衡化されたセファデックスＧ２５カラムを用
いてゲル濾過して、硫安を含まない抗インスリン抗体の
ＰＢＳ溶液を得た。これをＰＢＳにより希釈し、γ−グ
ロブリン濃度を２０μｇ／ｍｌに調整して用いた。
【００３４】酵素標識抗体：抗インスリン・モノクロナ
ール抗体（コスモバイオ社製）を、Ｎ−（γ−Ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｍｉｄｅを用
いて、常法〔「蛋白質核酸酵素」、別冊Ｎｏ．３１．３
３５−３４３（１９８７）〕に従い、β−Ｄ−ガラクシ
トーゼにより標識した。１ｍＭ塩化マグネシウムを含む
ＢＳＡ／ＰＢＳにより、希釈して測定に用いた。
ール抗体（コスモバイオ社製）を、Ｎ−（γ−Ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｍｉｄｅを用
いて、常法〔「蛋白質核酸酵素」、別冊Ｎｏ．３１．３
３５−３４３（１９８７）〕に従い、β−Ｄ−ガラクシ
トーゼにより標識した。１ｍＭ塩化マグネシウムを含む
ＢＳＡ／ＰＢＳにより、希釈して測定に用いた。
【００３５】標準インスリン：上記半合成ヒトインスリ
ンをＢＳＡ／ＰＢＳにより希釈し、インスリン濃度がそ
れぞれ、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０μＵ
／ｍｌの標準インスリンを調製した。濃度０の標準とし
てＢＳＡ／ＰＢＳをそのまま用いた。
ンをＢＳＡ／ＰＢＳにより希釈し、インスリン濃度がそ
れぞれ、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０μＵ
／ｍｌの標準インスリンを調製した。濃度０の標準とし
てＢＳＡ／ＰＢＳをそのまま用いた。
【００３６】酵素基質：ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む
ＢＳＡ／ＰＢＳに濃度０．１％（ｗ／ｖ）になるように
溶解して用いた。
ガラクトピラノシドを、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む
ＢＳＡ／ＰＢＳに濃度０．１％（ｗ／ｖ）になるように
溶解して用いた。
【００３７】生理食塩水：０．９％の塩化ナトリウム水
溶液を用いた。 酵素反応停止液：１％の炭酸ナトリウム水溶液を用い
た。 ３）固相化抗体の調製 １）で調製した固相担体１ｇに、抗インスリン抗体５０
ｍｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。容器
の外から磁石を近づけ、固相担体を容器内に保持したま
ま、デカンテーションにより未反応の抗インスリン抗体
を除去した後、５０ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳを加え、再度
３７℃で１時間インキュベートした。
溶液を用いた。 酵素反応停止液：１％の炭酸ナトリウム水溶液を用い
た。 ３）固相化抗体の調製 １）で調製した固相担体１ｇに、抗インスリン抗体５０
ｍｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。容器
の外から磁石を近づけ、固相担体を容器内に保持したま
ま、デカンテーションにより未反応の抗インスリン抗体
を除去した後、５０ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳを加え、再度
３７℃で１時間インキュベートした。
【００３８】上記と同様のデカンテーションを行ってＢ
ＳＡ／ＰＢＳを除去した後、さらに、２０ｍｌのＢＳＡ
／ＰＢＳを加えて固相担体を洗浄し、デカンテーション
により上清を除去した。この操作を３回繰り返して、固
相化抗体を調製した。
ＳＡ／ＰＢＳを除去した後、さらに、２０ｍｌのＢＳＡ
／ＰＢＳを加えて固相担体を洗浄し、デカンテーション
により上清を除去した。この操作を３回繰り返して、固
相化抗体を調製した。
【００３９】次いで、上記固相化抗体を１０ｍｌのＢＳ
Ａ／ＰＢＳに懸濁し、新しい容器に移し測定に使用し
た。 ４）インスリンの酵素免疫測定法による測定 上記固相化抗体の懸濁液を５０μｌずつ７本の試験管に
とり、各試験管に、２）で調製した濃度が、０、１０、
２０、４０、８０、１６０、３２０μＵ／ｍｌの標準イ
ンスリン１００μｌを、それぞれ、加えた後、さらに酵
素標識抗体を３００μｌ加えて、３７℃で１時間インキ
ュベートした。
Ａ／ＰＢＳに懸濁し、新しい容器に移し測定に使用し
た。 ４）インスリンの酵素免疫測定法による測定 上記固相化抗体の懸濁液を５０μｌずつ７本の試験管に
とり、各試験管に、２）で調製した濃度が、０、１０、
２０、４０、８０、１６０、３２０μＵ／ｍｌの標準イ
ンスリン１００μｌを、それぞれ、加えた後、さらに酵
素標識抗体を３００μｌ加えて、３７℃で１時間インキ
ュベートした。
【００４０】次いで、試験管の外から磁石を近づけて、
デカンテーションにより反応液を除去し、生理食塩水２
ｍｌを加え懸濁させた後、磁石を近づけてデカンテーシ
ョンする操作を２回繰返した。
デカンテーションにより反応液を除去し、生理食塩水２
ｍｌを加え懸濁させた後、磁石を近づけてデカンテーシ
ョンする操作を２回繰返した。
【００４１】次に、各試験管に酵素基質を０．５ｍｌず
つを加え、３７℃で１時間インキュベートし、酵素反応
を行った後、酵素反応停止液を２ｍｌずつ加え酵素反応
を停止させた。
つを加え、３７℃で１時間インキュベートし、酵素反応
を行った後、酵素反応停止液を２ｍｌずつ加え酵素反応
を停止させた。
【００４２】また、空の試験管に酵素基質をを０．５ｍ
ｌ入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、酵素反
応停止液を２ｍｌ加え、これを基質ブランクとした。試
験管の外から磁石を近づけて、固相化抗体が浮遊しない
ようにしながら上清をとり、４２０ｎｍで基質ブランク
を対象として、各濃度の標準インスリンに対する吸光度
を測定し、その結果を図１に示した。 （比較例）表面を研磨したポリスチレン製のプラスチッ
ク・ビーズ（積水化学製ポリスチレンビーズ＃８０、直
径６．４ｍｍ）１００個を用意し、表面に磁性層を形成
しなかったこと以外は、実施例と同様にして、固相化抗
体を調製した。
ｌ入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、酵素反
応停止液を２ｍｌ加え、これを基質ブランクとした。試
験管の外から磁石を近づけて、固相化抗体が浮遊しない
ようにしながら上清をとり、４２０ｎｍで基質ブランク
を対象として、各濃度の標準インスリンに対する吸光度
を測定し、その結果を図１に示した。 （比較例）表面を研磨したポリスチレン製のプラスチッ
ク・ビーズ（積水化学製ポリスチレンビーズ＃８０、直
径６．４ｍｍ）１００個を用意し、表面に磁性層を形成
しなかったこと以外は、実施例と同様にして、固相化抗
体を調製した。
【００４３】但し、抗インスリン抗体、洗浄時のＢＳＡ
／ＰＢＳなどの除去は、デカンテーションでなく、吸引
除去により行った。上記固相化抗体を１個使用し、実施
例と同様な操作によって、酵素免疫測定法を実施した
後、各濃度の標準インスリンに対する吸光度を測定し、
その結果を図１に示した。
／ＰＢＳなどの除去は、デカンテーションでなく、吸引
除去により行った。上記固相化抗体を１個使用し、実施
例と同様な操作によって、酵素免疫測定法を実施した
後、各濃度の標準インスリンに対する吸光度を測定し、
その結果を図１に示した。
【００４４】実施例では、比較例に比べて、大きな吸光
度が得られ、より微量のインスリンを測定することが可
能である。
度が得られ、より微量のインスリンを測定することが可
能である。
【００４５】
【発明の効果】本発明の免疫測定用磁性固相担体は、疎
水相互作用によって抗原や抗体を容易に結合させること
ができ、大きさおよび表面積が均一に制御されているの
で、抗原抗体反応の遅れがなく、測定時間を短縮するこ
とができる。
水相互作用によって抗原や抗体を容易に結合させること
ができ、大きさおよび表面積が均一に制御されているの
で、抗原抗体反応の遅れがなく、測定時間を短縮するこ
とができる。
【００４６】また、簡便な操作で高感度の測定ができ、
磁性を利用して抗原抗体反応媒体との分離を容易に行う
ことができる。
磁性を利用して抗原抗体反応媒体との分離を容易に行う
ことができる。
【図１】図１は、酵素免疫測定法に用いた標準インスリ
ンに対する吸光度を示すグラフである。
ンに対する吸光度を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98
Claims (2)
- 【請求項１】 粒径０．１μｍ〜１ｍｍの樹脂粒子表面
に磁性層が形成され、該磁性層がプラズマ重合法によっ
て形成された高分子物質と、スパッタリング法によって
形成された磁性金属の混合物からなる複合膜であり、該
磁性層中の磁性金属の含有量が原子数で１０〜５０％で
あることを特徴とする免疫測定用磁性固相担体。 - 【請求項２】 請求項１記載の免疫測定用磁性固相担体
の製造方法であって、上記磁性層の形成が０．００１〜
０．０１Ｔｏｒｒの圧力下、５０Ｗ〜１ｋＷの電極間出
力で行われることを特徴とする、免疫測定用磁性固相担
体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25379291A JP3162125B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 免疫測定用磁性固相担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25379291A JP3162125B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 免疫測定用磁性固相担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0593727A JPH0593727A (ja) | 1993-04-16 |
| JP3162125B2 true JP3162125B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=17256215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25379291A Expired - Fee Related JP3162125B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 免疫測定用磁性固相担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3162125B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6636070B2 (ja) * | 2017-02-27 | 2020-01-29 | 三洋化成工業株式会社 | 免疫測定方法及び免疫測定用キット |
-
1991
- 1991-10-01 JP JP25379291A patent/JP3162125B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0593727A (ja) | 1993-04-16 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |