JP3116087B2 - 神経突起伸長活性を有する蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、神経突起伸長活性
を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白
質を有効成分とする神経突起伸長剤、抗痴呆剤、記憶改
善剤及び脳機能賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及びその課題】神経細胞は、発生過程にお
いて外部環境の影響を受けて神経突起をのばし、神経回
路を形成する。また、情報処理過程においてシナプスの
形態変化、特に発芽と呼ばれる新しい神経終末の伸長と
新たな場所へのシナプス形成が大切であると考えられて
いる。この神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と
密接な関係があると考えられており、痴呆患者に神経突
起の消失がみられることから、神経突起を形成させるこ
とにより記憶の改善ないし痴呆の治療を行うことが可能
である。この神経突起の伸長に、神経突起伸長活性を持
つ蛋白質の役割が重要視されているが、その実体は解明
されていない。

【０００３】本発明者は、神経突起伸長活性を持つ蛋白
質を報告したが（特開平８−１２７５９５号）、さらに
研究を進めることにより、全く新しい配列を有する蛋白
質を新たに見出した。

【０００４】本発明は、神経突起伸長活性を有する蛋白
質及び該蛋白質をコードするＤＮＡを提供することを目
的とする。

【０００５】また、本発明は、神経突起伸長剤、抗痴呆
剤、記憶改善剤及び脳機能賦活剤を提供することを目的
とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み検討を重ねた結果、新規な蛋白質をコードするＤＮ
Ａを単離し、該ＤＮＡ配列から発現された蛋白質が神経
突起の伸長を顕著に促進することを見出した。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の項１〜項１１
の蛋白質、ＤＮＡ、神経突起伸長剤、抗痴呆剤、記憶改
善剤、脳機能賦活剤、ベクター、形質転換体及びタンパ
ク質の製造法を提供するものである。

【０００８】項１． 神経突起伸長活性を有する、配列
番号１の１〜５３９で表される蛋白質、あるいは、１又
は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された該蛋白
質誘導体。

【０００９】項２． 神経突起伸長活性を有する、配列
番号１の１〜５３９で表される蛋白質あるいは、１又は
複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された該蛋白質
誘導体をコードする核酸配列を含むＤＮＡ。

【００１０】項３． 項２に記載のＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下にハイブリダイズし得るＤＮＡ。

【００１１】項４． 配列番号２で表される項３に記載
のＤＮＡ。

【００１２】項５． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する神経突起伸長剤。

【００１３】項６． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する抗痴呆剤。

【００１４】項７． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する記憶改善剤。

【００１５】項８． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する脳機能賦活剤。

【００１６】項９． 項２〜４のいずれかに記載のＤＮ
Ａを組み込んだベクター。

【００１７】項１０． 項９のベクターを宿主細胞に導
入してなる形質転換体。

【００１８】項１１． 項１０に記載の形質転換体を培
養し、培養液から項２又は３のＤＮＡでコードされる蛋
白質を回収することを特徴とする神経突起伸長活性を有
する蛋白質の製造法。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の蛋白質の神経突起伸長活
性に関し、配列番号１に示す１〜５３９の蛋白質は強力
な神経突起伸長活性を有する。

【００２０】

【００２１】特定のアミノ酸を置換、付加又は欠失する
方法としては、ポイントミューテーション法、ＰＣＲを
利用したdeletion/Insertion法などの従来公知の方法が
用いられる。

【００２２】本明細書において、「ストリンジェントな
条件」とは、通常ハイブリダイズ法で用いられる条件を
意味し、このような条件は、当業者であれば容易に理解
できる。

【００２３】本発明の蛋白質は、例えば、ニワトリ胚終
脳神経細胞初代培養系をアッセイ系として用い、ヒヨコ
除神経筋抽出液中から得ることができるが、ヒヨコ由来
の蛋白質に限定されることはない。神経突起を形成させ
る活性を有する該蛋白質の配列は本発明者により初めて
明らかにされたものであり、ニワトリなどの鳥類、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター等の哺乳類な
どのあらゆる動物由来の神経突起伸長活性を有し、該蛋
白質に相同性のある蛋白質が、いずれも本発明に包含さ
れる。

【００２４】本発明の蛋白質は、例えば、神経突起伸長
活性を有する該蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ
ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体とし、該形質
転換体を培地中で培養することにより製造される。

【００２５】本発明者は、ヒヨコ除神経筋抽出液を用い
て、神経突起伸長活性を有する蛋白質に対するモノクロ
ーナル抗体を単離し、該モノクローナル抗体を用いてｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、図２に示すｃ
ＤＮＡを得、該ｃＤＮＡでコードされる１−５３９の配
列を有する蛋白質を単離し、該蛋白質が神経突起伸長活
性を有することを確認した。

【００２６】上記の神経突起伸長活性を有する該蛋白質
をコードするＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換さ
れる宿主細胞としては、特に限定されず、従来公知の形
質転換用の細胞が広く用いられるが、例えば大腸菌等の
細菌類、酵母などの真核微生物、マウス、ラット、ハム
スター、ヒト等の各種哺乳動物の培養細胞が挙げられ
る。

【００２７】大腸菌等へのベクターの導入も、公知の方
法に従い行うことができる。

【００２８】本発明の蛋白質の製造に用いられるベクタ
ーとしては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの翻訳
に必要なプロモーター等を備えている限り特に限定され
ないが、例えば、pBluescript、pGEX等が挙げられる。

【００２９】本発明は、神経突起伸長活性を有する該蛋
白質をコードするＤＮＡを組み込んだベクターが前記細
胞に組み込まれた形質転換体にも関する。

【００３０】該形質転換体が培養される培地は、形質転
換される細胞の種類にもよるが、例えば大腸菌などの微
生物の場合には、炭素源（グルコース等）、窒素源（硫
酸アンモニウムなど）、無機物（リン酸ナトリウム、硫
酸鉄、硫酸マンガンなど）を含む培地が挙げられる。温
度、ｐＨ、時間などの培養条件は、各種細胞の通常の培
養条件がそのまま用いられる。

【００３１】本発明の蛋白質は神経突起を伸長させる活
性があり、該蛋白質は神経突起伸長剤として使用でき
る。また、神経突起の伸長による神経回路の形成は、記
憶及び痴呆とも密接な関係があることが明らかになって
おり、該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、神経繊維の
修復剤、神経細胞賦活剤、学習改善剤、情緒障害改善剤
等としても使用される。

【００３２】本発明の蛋白質は、神経突起伸長剤、抗痴
呆剤、記憶改善剤又は脳機能賦活剤として、注射剤、経
口剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤等）、
軟膏剤、坐剤などの通常用いられる製剤形態で投与でき
る。本発明の蛋白質は、好ましくは注射剤として投与さ
れる。これら製剤形態は、本発明の蛋白質に、製剤化に
通常用いられる薬学的に許容される担体を適宜用いて容
易に調製できる。

【００３３】例えば注射剤を製造する場合には、本発明
の蛋白質にｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、
局所麻酔剤などを添加して、常法により皮下、筋肉内、
静脈内用の注射剤を調製することができる。

【００３４】本発明の蛋白質は、上記の神経突起伸長活
性を示すために１〜１０μｇ／ｍｌ程度の濃度になるよ
うに投与される。また、抗痴呆剤、記憶改善剤又は脳機
能賦活剤として投与される場合には、注射剤として成人
１日当たり０．０００１mg〜10mg程度を投与するのが好
ましい。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、神経突起の伸長活性を
示す新規蛋白質を単離し、その構造を明らかにした。

【００３６】該蛋白質は、遺伝子工学の方法により容易
に大量生産できる。

【００３７】該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、脳機
能賦活剤、神経繊維の修復剤、神経細胞賦活剤、学習改
善剤、情緒障害改善剤等として有用である。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

【００３９】実施例１ （１）モノクローナル抗体の作成 (1ー1)抗原の調製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を切り取りプロテアーゼ阻害剤を含
むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中でミキサーを用い
てホモゲナイズし、次いで遠心分離(100,000g、１時
間、４℃)して、得られた上清を抗原とした。

【００４０】(1ー2)マウス免疫 フロイントアジュバントと等量混合した抗原(2mg/ml)を
マウス(BALB/c)腹腔内へ0.2ml注射することにより、免
疫を行った。エーテル麻酔したマウスの尾から少量の血
液を採取し、これを用いて血清を調製した。抗体価の上
昇は、通常のＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。

【００４１】(1-3)ハイブリドーマの作成 抗体価が１：１０００に上昇したマウスの脾臓（本実験
例においては１：２５００）を切り出し、無菌状態でこ
れを切断し、ステンレスメッシュ（＃１００）上で5ml
シリンジのピストンを用いてつぶすことにより解離脾細
胞を得た。ミエローマ細胞（ＰＡＩ細胞）は、脾細胞調
製の１０日前より増殖を開始した。調製した解離脾細胞
とミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール１５００
（最終濃度9%(v/v)）を用いて融合された。

【００４２】(1-4)スクリーニング 融合後のハイブリドーマは、４細胞／ウエルの密度でＣ
Ｏ₂インキュベーター内で培養され、コロニー形成の確
認されたウエルの培養液の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ法
により抗体の産生を確認した。抗体産生の確認された陽
性ウエルの細胞は、クローニング、２次スクリーニング
へと進めた。最終的に得られたクローンは、３次スクリ
ーニングの後に分離されたものである。

【００４３】(1-5)活性阻害抗体の選択 得られたモノクローナル抗体の中で、神経突起伸長活性
を阻害するものを以下の方法で選択した。培養皿中に抗
原を入れ、神経突起伸長活性を有する蛋白質を底面に接
着させ、さらにモノクローナル抗体を添加し、１時間静
置した。培養皿中の溶液を培養液に交換し、ニワトリ胚
の終脳神経細胞を加えて２４時間培養の後、神経突起伸
長の様子を観察した。伸長活性を最も強く抑制したのが
４Ｄ２ａモノクローナル抗体である。

【００４４】（２）ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮ
Ａの単離 (2-1)ｃＤＮＡライブラリーの作製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を取り出し、ホモゲナイズの後Ｃｓ
Ｃｌを用いた密度勾配遠心(45,000 rpm; 40時間）でＲ
ＮＡを分離した。さらに、オリゴｄＴカラムを用いて常
法に従いｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素（ストラタジー
ン社製）によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを
λＺＡＰベクターに組み込んだ。in vitroパッケージン
グによりλファージ粒子を形成させ、これを大腸菌に感
染させｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００４５】(2-2)スクリーニング プラークスクリーニング法により、目的のクローンを単
離した。この際に、４Ｄ２ａモノクローナル抗体を用い
た。スクリーニングは２回行い、確実にこの抗体で認識
される蛋白質を発現するクローンを選択した。ヘルパー
ファージ（ｆ１）を作用させることによりファージベク
ター中のpBluescript部分を単離した。

【００４６】（３）大腸菌への該ＤＮＡを含むベクター
の導入 (3-1)発現ベクターへのサブクローニング クローニングしたｃＤＮＡの２６５bp−１８８１bpの
５’端にＥｃｏＲＩアダプター、３’端にpoly Aテール
＋Xho Iサイトを付加し、このＤＮＡを発現ベクターpGE
X4T3のEcoRI−Xho Iサイトにサブクローンした。

【００４７】(3-2)発現 上記のプラスミドを各々用いて、コンピテント大腸菌JM
105を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシドでグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと目的
蛋白質の融合蛋白を発現させた。

【００４８】（４）目的蛋白質の単離 融合蛋白質を発現させた大腸菌を超音波により破壊し、
可溶性分画を分離した。この分画をグルタチオン−セフ
ァロース４Ｂカラムに通し、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）とグルタチオンの親和性を利用
して組換え蛋白質を精製した。

【００４９】（５）単離した蛋白質の神経突起伸長活性
の測定法 精製した各組換え蛋白質〔本発明の１〜５３９のタンパ
ク質（Ｍ３１０）、ＰＤ（除神経節抽出液）、ＧＳ
Ｔ）〕をHam's F12培地（但し、10mMグルコース、2.5μ
g/mlインシュリンを追加）で各々希釈し、培養皿（16mm
直径）に加え、３７℃で２時間静置した。一方、ふ卵５
日目のニワトリ胚より大脳（終脳）及び脊髄（運動神経
を含む）を切り出し、0.0125%トリプシンで３７℃、３
０分間処理し、上記F12培地で洗浄後、ピペッティング
で細胞を分散させた。先の培養皿の各ウエルに4×10⁴の
神経細胞を入れ、37℃、5%CO₂、100%湿度の条件下で24
時間培養した。培養後、細胞を位相差顕微鏡で観察し、
細胞体の２倍以上の長さの神経突起を持つ神経細胞の割
合を計測した。結果を図４に示す。

【００５０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General <120> Protein having neurite elongation activity <130> 113MS0183 <160> 3 <210> 1 <211> 539 <212> PRT <213> Chicken <400> 1 Met Ser Ser Phe Gln Glu Val Pro Ser Ser Ala Asn Ala Leu Gln Thr 1 5 10 15 Ser Asn Phe Ala His Val Ile Phe Gln Asn Val Ala Lys Ser Tyr Leu 20 25 30 Pro Asn Thr His Leu Glu Cys His Tyr Thr Leu Thr Gln Phe Ile His 35 40 45 Pro His Gln Lys Asp Trp Val Gly Ile Phe Lys Val Gly Trp Ser Thr 50 55 60 Ala Arg Asp Tyr Tyr Thr Phe Leu Trp Ser Pro Met Pro Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Val Glu Gly Pro Thr Val Asn Cys Val Leu Asn Phe Gln Gly Tyr Tyr 85 90 95 Leu Pro Asn Asp Asp Gly Glu Phe Tyr Gln Phe Cys Tyr Val Thr His 100 105 110 Lys Gly Glu Ile Arg Gly Ala Ser Thr Pro Phe Gln Phe Arg Thr Ser 115 120 125 Ser Pro Val Glu Glu Leu Leu Thr Met Glu Asp Glu Gly Asn Ser Asp 130 135 140 Met Leu Val Val Thr Thr Lys Ala Gly Leu Leu Glu Phe Lys Ile Glu 145 150 155 160 Lys Ile Val Lys Glu Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Thr Ser Val Leu 165 170 175 Glu Lys Glu Thr Ala Gln Leu Arg Asp Gln Val Glu Arg Leu Glu Lys 180 185 190 Glu Leu Asn Leu Glu Lys Gln Arg Cys Asp Gln Leu Gln Thr Glu Gln 195 200 205 Lys Thr Asn Ile Gln Ala Ser Glu Ser Leu Lys Thr Glu Asn Asp Asp 210 215 220 Leu Lys Lys Lys His Asp Glu Val Ala Ser Lys Val Leu Gln Leu Glu 225 230 235 240 Glu Asp Ile Met Thr Val Thr Gln Lys Ala Ile Ala Lys Glu Thr Glu 245 250 255 Leu Asp Ser Met Lys Asp Lys Leu Lys Lys Val Met Leu Glu Lys Glu 260 265 270 Gln Leu Glu Cys Val Leu Lys Thr Glu Lys Asp Glu Lys Glu Leu Tyr 275 280 285 Lys Ile His Leu Lys Asn Thr Glu Ile Glu Asn Thr Lys Leu Val Lys 290 295 300 Glu Ile Glu Thr Phe Lys Asn Leu Asp Ala Asn Lys Glu Asn Met Ile 305 310 315 320 Ser Tyr Tyr Lys Glu Glu Val Gly Arg Leu Gln Leu Phe Ile Ala Glu 325 330 335 Lys Glu Asn Met Lys Lys Ala Phe Leu Leu Thr Ser Ser Asn Lys Glu 340 345 350 Asp Ala Ala Ile Leu Lys Glu Gln Leu Arg Lys Ala Glu Asp Gln Ile 355 360 365 Gln Ala Ser Lys Gln Glu Ala Val Leu Met Ser Lys Glu Leu Ser Asp 370 375 380 Ala Val Asn Val Arg Asp Lys Thr Met Ala Asp Leu His Ser Ala Arg 385 390 395 400 Leu Glu Asn Glu Lys Leu Lys Lys Gln Leu Ala Asp Ala Leu Ala Glu 405 410 415 Leu Lys Lys Ile Thr Ala Leu Lys Asn Glu Gln Glu Thr Ser Asn Thr 420 425 430 Thr Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Val Glu Asp Leu Lys Leu Arg Leu 435 440 445 Gln Met Ala Ala Asp His Tyr Lys Glu Lys Phe Lys Glu Cys Gln Lys 450 455 460 Leu Gln Lys Gln Val Asn Lys Phe Thr Glu Gln Ala Lys Ile Val Gly 465 470 475 480 Asn Gln Gln Lys Leu Thr Asp Ala Ser Asn Thr Val Thr Ala Thr Ala 485 490 495 Ile Val Thr Asp Lys Lys Leu Pro Ala Ser Pro Val Ser Pro Ile Ser 500 505 510 Ser Asp Val Val Ser Glu Phe Met Val Lys Glu Gln Val Arg Glu Met 515 520 525 Asn Lys Glu Ile Ala Glu Lys Thr Glu Glu Lys 530 535 <210> 2 <211> 3181 <212> DNA <213> Chicken <400> 2 tggtgaccac aaaagctgga cttcttgagt ttaaaattga aaaaatagta aaagaaaaag 60 aagagctatt aaaggttact tctgttctgg agaaagaaac agcacaactc cgggatcaag 120 ttgaaagact ggaaaaagaa cttaaccttg aaaagcagag atgtgaccaa ctgcggccac 180 gcgtcgacta gtacgggggg ggggttggat ggtggaagcc ccatgttgat gtccccggcg 240 tcctccgcgc ctgcctaatc aatcatgtca tcctttcaag aagttccatc ctcagctaac 300 gctttacaga cttccaattt tgcacatgtg atttttcaga atgtggccaa aagttatctt 360 ccgaacacac accttgaatg tcactacact ctgacccagt ttatccatcc tcatcagaaa 420 gactgggttg gtattttcaa ggttggttgg agtactgcaa gagattatta cacgtttctg 480 tggtcaccta tgccagaaaa ttatgtggaa ggaccaactg tcaactgtgt cctgaacttt 540 caaggatatt acctaccaaa tgatgatgga gaattctacc agttctgtta cgtgactcat 600 aaaggtgaaa tccgtggagc aagcacacct ttccagttcc gtacctcttc tcctgttgaa 660 gaattgctca ctatggaaga tgaaggaaac tctgacatgc tggtggtgac cacaaaagct 720 ggacttcttg agtttaaaat tgaaaaaata gtaaaagaaa aagaagagct attaaaggtt 780 acttctgttc tggagaaaga aacagcacaa ctccgggatc aagttgaaag actggaaaaa 840 gaacttaacc ttgaaaagca gagatgtgac caactgcaaa cagagcaaaa gactaatatt 900 caagcatcag aaagtctgaa aactgaaaac gatgatttga agaagaagca tgatgaggtt 960 gcttcaaaag tgctccagct tgaggaagac atcatgactg ttactcagaa agccattgca 1020 aaagaaacag agttagacag tatgaaggac aagctgaaga aagtgatgct tgagaaggag 1080 caacttgaat gcgtgttaaa aacagaaaag gatgaaaaag aactttataa gatacacttg 1140 aagaatacag aaatagaaaa caccaaacta gtaaaagaga tcgagacgtt taagaatttg 1200 gatgcaaaca aagaaaacat gatatcgtat tataaagagg aggttggcag attacagcta 1260 tttatagctg aaaaagaaaa tatgaagaaa gcttttttgc tcacctcatc aaataaggag 1320 gatgcagcta ttttaaaaga gcagcttcgg aaagctgaag atcagattca ggctagcaaa 1380 caagaagctg tcctaatgtc aaaagagctg agtgacgcag taaatgtgcg ggataaaaca 1440 atggcagatc ttcacagtgc acgtctggaa aatgagaagt tgaaaaagca gcttgccgat 1500 gctttagctg aacttaaaaa aatcacagct ttgaaaaatg aacaggaaac ttcaaacaca 1560 acggagcagg aactgcgcag agaagttgaa gatctgaagc ttcgtttaca aatggctgct 1620 gaccattaca aggaaaaatt caaagaatgt caaaaacttc agaaacaagt gaacaagttt 1680 acagaacagg caaaaatcgt ggggaatcag cagaaactga cagatgcatc taacactgtg 1740 acagctactg ccatcgttac agacaaaaag ttgcctgcat ctccagttag ccccatttca 1800 tctgatgtag tttcggaatt catggttaag gagcaagtac gtgaaatgaa taaagaaatt 1860 gctgagaaaa cagaagaaaa gtagacagaa aatagagaag aaaatagaaa aaaaaaagta 1920 gaagagagaa ggtagaaaat agaaaaaaca taaaagaagg cagtagctcg tgccgaattc 1980 ggcacgagca tccatgttat gtattgaaga tcctctcctg cctggaaacg acgttggcag 2040 aagttcttac ggtgccatgc aagtgaaaca agtttttgat tatgcctaca ttgttcttag 2100 ccatgcagta tcaccacttg caagatcata tccaaataga gattctgaga gcacattagg 2160 tagaatcatc aaagtgaccc aagaagtgat tgactacagg gcctggatta aaaagaagtg 2220 ggggagcaaa attaatttat cacctgaact tgataatagg ttgaaaataa gagaccagat 2280 agctccatgc aatggagagc agaacaacaa cagagactct gaatcatctt acaaccaacg 2340 cttgactttg tcattggcta gtacacaaca gttatcctct ggctcatctg catcgtctgt 2400 atcatcactc tctggcagtg acattgattc tgatacacca ccttgcacag ctcctaatgt 2460 ttaccagttc agtctgcaag caccgactca acttatggcc agtttaccac cagcattgcc 2520 tatgccaagt ggtaaacccc aatctgcgcc tacgagaacc ttgataatgg ccgccagtaa 2580 tcagcagcac actggaatga agttttccat gaaaggaact cataaccaag gcaacagcta 2640 cagtcctgtc aacagtggag gcatgaggca accagttggt aacagaggac accaccagta 2700 caatcgtaat atatggagaa gaaaaaaaca cagagacagt ttacctatta gtctgagcag 2760 ataatggcag atgccaaaat gaccttccct gttcacacaa actgagcgag tgccactcga 2820 cttaggggat ggagaccagc atccagcaca tcgttttatt ggtgttgcca aatatctgca 2880 gctgacttct ttgcatgttt ctttgtgtgg tggttcagtc catcttcaag aagtagttgt 2940 gcttatctgt gaagccttat taaatgtgga agtttgtttt tctgccttcc cacaatggtt 3000 catacagtgc cgaagcagct ctgacagtgg aactgcaagg acatttacaa atgctgtggc 3060 tttttttgct gtggctacat ctgttcctat gtgggttctg ttttctttta ttttggaagt 3120 gaaggaaact tcagcccctt cgattttttt tttcctttgc agcaaatcaa gtcgggaatt 3180 c 3181 <210> 3 <211> 3181 <212> DNA <213> Chicken <400> 3 tggtgaccac aaaagctgga cttcttgagt ttaaaattga aaaaatagta aaagaaaaag 60 aagagctatt aaaggttact tctgttctgg agaaagaaac agcacaactc cgggatcaag 120 ttgaaagact ggaaaaagaa cttaaccttg aaaagcagag atgtgaccaa ctgcggccac 180 gcgtcgacta gtacgggggg ggggttggat ggtggaagcc ccatgttgat gtccccggcg 240 tcctccgcgc ctgcctaatc aatc atg tca tcc ttt caa gaa gtt cca tcc 291 Met Ser Ser Phe Gln Glu Val Pro Ser 1 5 tca gct aac gct tta cag act tcc aat ttt gca cat gtg att ttt cag 339 Ser Ala Asn Ala Leu Gln Thr Ser Asn Phe Ala His Val Ile Phe Gln 10 15 20 25 aat gtg gcc aaa agt tat ctt ccg aac aca cac ctt gaa tgt cac tac 387 Asn Val Ala Lys Ser Tyr Leu Pro Asn Thr His Leu Glu Cys His Tyr 30 35 40 act ctg acc cag ttt atc cat cct cat cag aaa gac tgg gtt ggt att 435 Thr Leu Thr Gln Phe Ile HisPro His Gln Lys Asp Trp Val Gly Ile 45 50 55 ttc aag gtt ggt tgg agt act gca aga gat tat tac acg ttt ctg tgg 483 Phe Lys Val Gly Trp Ser Thr Ala Arg Asp Tyr Tyr Thr Phe Leu Trp 60 65 70 tca cct atg cca gaa aat tat gtg gaa gga cca act gtc aac tgt gtc 531 Ser Pro Met Pro Glu Asn Tyr Val Glu Gly Pro Thr Val Asn Cys Val 75 80 85 ctg aac ttt caa gga tat tac cta cca aat gat gat gga gaa ttc tac 579 Leu Asn Phe Gln Gly Tyr Tyr Leu Pro Asn Asp Asp Gly Glu Phe Tyr 90 95 100 105 cag ttc tgt tac gtg act cat aaa ggt gaa atc cgt gga gca agc aca 627 Gln Phe Cys Tyr Val Thr His Lys Gly Glu Ile Arg Gly Ala Ser Thr 110 115 120 cct ttc cag ttc cgt acc tct tct cct gtt gaa gaa ttg ctc act atg 675 Pro Phe Gln Phe Arg Thr Ser Ser Pro Val Glu Glu Leu Leu Thr Met 125 130 135 gaa gat gaa gga aac tct gac atg ctg gtg gtg acc aca aaa gct gga 723 Glu Asp Glu Gly Asn Ser Asp Met Leu Val Val Thr Thr Lys Ala Gly 140 145 150 ctt ctt gag ttt aaa att gaa aaa ata gta aaa gaa aaa gaa gag cta 771 Leu Leu Glu Phe Lys Ile Glu Lys Ile Val Lys Glu Lys Glu Glu Leu 155 160 165 tta aag gtt act tct gtt ctg gag aaa gaa aca gca caa ctc cgg gat 819 Leu Lys Val Thr Ser Val Leu Glu Lys Glu Thr Ala Gln Leu Arg Asp 170 175 180 185 caa gtt gaa aga ctg gaa aaa gaa ctt aac ctt gaa aag cag aga tgt 867 Gln Val Glu Arg Leu Glu Lys Glu Leu Asn Leu Glu Lys Gln Arg Cys 190 195 200 gac caa ctg caa aca gag caa aag act aat att caa gca tca gaa agt 915 Asp Gln Leu Gln Thr Glu Gln Lys Thr Asn Ile Gln Ala Ser Glu Ser 205 210 215 ctg aaa act gaa aac gat gat ttg aag aag aag cat gat gag gtt gct 963 Leu Lys Thr Glu Asn Asp Asp Leu Lys Lys Lys His Asp Glu Val Ala 220 225 230 tca aaa gtg ctc cag ctt gag gaa gac atc atg act gtt act cag aaa 1011 Ser Lys Val Leu Gln Leu Glu Glu Asp Ile Met Thr Val Thr Gln Lys 235 240 245 gcc att gca aaa gaa aca gag tta gac agt atg aag gac aag ctg aag 1059 Ala Ile Ala Lys Glu Thr Glu Leu Asp Ser Met Lys Asp Lys Leu Lys 250 255 260 265 aaa gtg atg ctt gag aag gag caa ctt gaa tgc gtg tta aaa aca gaa 1107 Lys Val Met Leu Glu Lys Glu Gln Leu Glu Cys Val Leu Lys Thr Glu 270 275 280 aag gat gaa aaa gaa ctt tat aag ata cac ttg aag aat aca gaa ata 1155 Lys Asp Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile His Leu Lys Asn Thr Glu Ile 285 290 295 gaa aac acc aaa cta gta aaa gag atc gag acg ttt aag aat ttg gat 1203 Glu Asn Thr Lys Leu Val Lys Glu Ile Glu Thr Phe Lys Asn Leu Asp 300 305 310 gca aac aaa gaa aac atg ata tcg tat tat aaa gag gag gtt ggc aga 1251 Ala Asn Lys Glu Asn Met Ile Ser Tyr Tyr Lys Glu Glu Val Gly Arg 315 320 325 tta cag cta ttt ata gct gaa aaa gaa aat atg aag aaa gct ttt ttg 1299 Leu Gln Leu Phe Ile Ala Glu Lys Glu Asn Met Lys Lys Ala Phe Leu 330 335 340 345 ctc acc tca tca aat aag gag gat gca gct att tta aaa gag cag ctt 1347 Leu Thr Ser Ser Asn Lys Glu Asp Ala Ala Ile Leu Lys Glu Gln Leu 350 355 360 cgg aaa gct gaa gat cag att cag gct agc aaa caa gaa gct gtc cta 1395 Arg Lys Ala Glu Asp Gln Ile Gln Ala Ser Lys Gln Glu Ala Val Leu 365 370 375 atg tca aaa gag ctg agt gac gca gta aat gtg cgg gat aaa aca atg 1443 Met Ser Lys Glu Leu Ser Asp Ala Val Asn Val Arg Asp Lys Thr Met 380 385 390 gca gat ctt cac agt gca cgt ctg gaa aat gag aag ttg aaa aag cag 1491 Ala Asp Leu His Ser Ala Arg Leu Glu Asn Glu Lys Leu Lys Lys Gln 395 400 405 ctt gcc gat gct tta gct gaa ctt aaa aaa atc aca gct ttg aaa aat 1539 Leu Ala Asp Ala Leu Ala Glu Leu Lys Lys Ile Thr Ala Leu Lys Asn 410 415 420 425 gaa cag gaa act tca aac aca acg gag cag gaa ctg cgc aga gaa gtt 1587 Glu Gln Glu Thr Ser Asn Thr Thr Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Val 430 435 440 gaa gat ctg aag ctt cgt tta caa atg gct gct gac cat tac aag gaa 1635 Glu Asp Leu Lys Leu Arg Leu Gln Met Ala Ala Asp His Tyr Lys Glu 445 450 455 aaa ttc aaa gaa tgt caa aaa ctt cag aaa caa gtg aac aag ttt aca 1683 Lys Phe Lys Glu Cys Gln Lys Leu Gln Lys Gln Val Asn Lys Phe Thr 460 465 470 gaa cag gca aaa atc gtg ggg aat cag cag aaa ctg aca gat gca tct 1731 Glu Gln Ala Lys Ile Val Gly Asn Gln Gln Lys Leu Thr Asp Ala Ser 475 480 485 aac act gtg aca gct act gcc atc gtt aca gac aaa aag ttg cct gca 1779 Asn Thr Val Thr Ala Thr Ala Ile Val Thr Asp Lys Lys Leu Pro Ala 490 495 500 505 tct cca gtt agc ccc att tca tct gat gta gtt tcg gaa ttc atg gtt 1827 Ser Pro Val Ser Pro Ile Ser Ser Asp Val Val Ser Glu Phe Met Val 510 515 520 aag gag caa gta cgt gaa atg aat aaa gaa att gct gag aaa aca gaa 1875 Lys Glu Gln Val Arg Glu Met Asn Lys Glu Ile Ala Glu Lys Thr Glu 525 530 535 gaa aag tagacagaaa atagagaaga aaatagaaaa aaaaaagtag aagagagaag 1931 Glu Lys 539 gtagaaaata gaaaaaacat aaaagaaggc agtagctcgt gccgaattcg gcacgagcat 1991 ccatgttatg tattgaagat cctctcctgc ctggaaacga cgttggcaga agttcttacg 2051 gtgccatgca agtgaaacaa gtttttgatt atgcctacat tgttcttagc catgcagtat 2111 caccacttgc aagatcatat ccaaatagag attctgagag cacattaggt agaatcatca 2171 aagtgaccca agaagtgatt gactacaggg cctggattaa aaagaagtgg gggagcaaaa 2231 ttaatttatc acctgaactt gataataggt tgaaaataag agaccagata gctccatgca 2291 atggagagca gaacaacaac agagactctg aatcatctta caaccaacgc ttgactttgt 2351 cattggctag tacacaacag ttatcctctg gctcatctgc atcgtctgta tcatcactct 2411 ctggcagtga cattgattct gatacaccac cttgcacagc tcctaatgtt taccagttca 2471 gtctgcaagc accgactcaa cttatggcca gtttaccacc agcattgcct atgccaagtg 2531 gtaaacccca atctgcgcct acgagaacct tgataatggc cgccagtaat cagcagcaca 2591 ctggaatgaa gttttccatg aaaggaactc ataaccaagg caacagctac agtcctgtca 2651 acagtggagg catgaggcaa ccagttggta acagaggaca ccaccagtac aatcgtaata 2711 tatggagaag aaaaaaacac agagacagtt tacctattag tctgagcaga taatggcaga 2771 tgccaaaatg accttccctg ttcacacaaa ctgagcgagt gccactcgac ttaggggatg 2831 gagaccagca tccagcacat cgttttattg gtgttgccaa atatctgcag ctgacttctt 2891 tgcatgtttc tttgtgtggt ggttcagtcc atcttcaaga agtagttgtg cttatctgtg 2951 aagccttatt aaatgtggaa gtttgttttt ctgccttccc acaatggttc atacagtgcc 3011 gaagcagctc tgacagtgga actgcaagga catttacaaa tgctgtggct ttttttgctg 3071 tggctacatc tgttcctatg tgggttctgt tttcttttat tttggaagtg aaggaaactt 3131 cagccccttc gatttttttt ttcctttgca gcaaatcaag tcgggaattc 3181

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の蛋白質のアミノ配列を１文字記号で表
した図である。

【図２】本発明の核酸配列を表した図である。

【図３】本発明の蛋白質のアミノ配列と核酸配列を表し
た図である。

【図４】本発明の蛋白質（１〜５３９（Ｍ３１０）；
●）、除神経した筋抽出液に含まれる蛋白質（ＰＤ；
■）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ；▼）、蛋白質非添加（×）を終脳で試験した結果を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 15/09 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/48 C12N 15/00 - 15/90 A61K 38/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】神経突起伸長活性を有する、配列番号１の
   １〜５３９で表される蛋白質、あるいは、１又は複数個
   のアミノ酸が置換、欠失又は付加された該蛋白質誘導
   体。
2. 【請求項２】神経突起伸長活性を有する、配列番号１の
   １〜５３９で表される蛋白質あるいは、１又は複数個の
   アミノ酸が置換、欠失又は付加された該蛋白質誘導体を
   コードする核酸配列を含むＤＮＡ。
3. 【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡとストリンジェン
   トな条件下にハイブリダイズし得るＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号２で表される請求項３に記載のＤ
   ＮＡ。
5. 【請求項５】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
   神経突起伸長剤。
6. 【請求項６】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
   抗痴呆剤。
7. 【請求項７】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
   記憶改善剤。
8. 【請求項８】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
   脳機能賦活剤。
9. 【請求項９】請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを
   組み込んだベクター。
10. 【請求項１０】請求項９のベクターを宿主細胞に導入し
    てなる形質転換体。
11. 【請求項１１】請求項１０に記載の形質転換体を培養
    し、培養液から請求項２又は３のＤＮＡでコードされる
    蛋白質を回収することを特徴とする神経突起伸長活性を
    有する蛋白質の製造法。