JP3083355B2

JP3083355B2 - Ｌ−カルニチンの製造法

Info

Publication number: JP3083355B2
Application number: JP20610691A
Authority: JP
Inventors: 貞夫上山; なつ子田村; 邦子長田; 雅章綿貫
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1991-07-24
Filing date: 1991-07-24
Publication date: 2000-09-04
Anticipated expiration: 2015-09-04
Also published as: JPH0523190A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血中脂質レベル改善効
果、心不全改善効果の点で期待される微生物による生合
成を利用したＬ−カルニチンの製造法の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】次の化１に構造を示したＬ−カルニチン
は、血中脂質レベル改善効果、心不全改善効果の点で期
待されており、また、高カロリー輸液として用いること
ができることが知られている。特に、Ｌ−カルニチン
は、活性化した長鎖の遊離脂肪酸をミトコンドリア膜か
ら通過させる担体としての働きを有する物質でビタミン
Ｂ_T とも呼ばれている。

【０００３】

【化１】

【０００４】天然中に存在するカルニチンは左旋性のＬ
−カルニチンであり、一方、右旋性のＤ−カルニチンは
拮抗阻害を示す。従来、ラセミ体（ＤＬ−体）のカルニ
チンが食欲昂進剤などに用いられてきたが、ラセミ体の
カルニチンを長期間投与した場合、心筋に対する副作用
が認められることなどから、心血管系疾患等の治療学的
使用には、Ｌ−カルニチンのみを使用する方が効果的で
あることが明らかとなった。

【０００５】カルニチンが化学合成法によって製造され
ることは、既に知られているが化学合成法によると、ラ
セミ体が生成するため、その化学分割のための工程が必
要となり、製造工程が煩雑となる。

【０００６】３−デヒドロカルニチン、γ−ブチロベタ
イン、クロトノベタイン、ｏ−アシルカルニチンを前駆
物質として、微生物或いはその微生物の生産する酵素に
より、Ｌ−カルニチンを製造する方法も知られている
が、何れも前駆物質が不安定であったり、前駆物質或い
は補酵素が高価であったり、前駆物質とＬ−カルニチン
の分離が困難である等の問題を有している。

【０００７】また、化学合成法による製造、微生物或い
は酵素による変換工程を含む半合成法による製造法を用
いて生産されるＬ−カルニチンは合成品であり、医薬外
への利用は認められていない。

【０００８】合成品以外のＬ−カルニチンの調製法とし
ては、乳あるいは乳製品より分離調製する方法が知られ
ている（特開昭６２−６３５５３号）が、乳あるいは乳
製品自体が高価であり、この乳あるいは乳製品からＬ−
カルニチンを取り出すには、乳中には多量の無機塩が存
在しており、それらを除去するため精製工程が煩雑とな
る。

【０００９】そこで、エメリセラ属微生物を用いたＬ−
カルニチン及びγ−ブチロベタインの製造法（特開昭６
０−２１４８９０号）及び食品等に添加することができ
るＬ−カルニチンを得ることを目的として、伝統的な発
酵食品に利用されている微生物を用いたＬ−カルニチン
の製造法が提案されている（特願平１−３９２１５
号）。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述の
微生物による製造法では、Ｌ−カルニチンの生産能が著
しく低く、実用的でない等の問題があった。

【００１１】そこで、本発明は、ノイロスポラ属（Neur
ospora）、ペニシリウム属（Penicillium ）、リゾープ
ス属（Rhizopus）等の微生物を用いたＬ−カルニチンの
製造法において、Ｌ−カルニチンの生産能を飛躍的に高
め、大量に蓄積した培養物からＬ−カルニチンを採取す
ることができる製造法を得ることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明
に係るＬ−カルニチンの製造法では、Ｌ−カルニチン産
生能を有する糸状菌を培養し、該培養物より、Ｌ−カル
ニチンを採取するＬ−カルニチンの製造法において、前
記糸状菌として、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、リ
ゾープス属の何れかの属に属したものを用い、該糸状菌
の培養に際し、 (a)低分子化有機窒素化合物成分； (b)豆類又は豆由来加工品成分； (c)油脂成分；から選ばれる成分の１種又は２種以上を培地中に加える
ものである。

【００１３】

【００１４】

【作用】本発明では、Ｌ−カルニチンを産生する糸状菌
を(a) 低分子化有機窒素化合物成分；(b) 豆類又は豆由
来加工品成分；(c) 油脂成分；から選ばれる成分の１種
又は２種以上を加えた培地で培養し、該培養物より、Ｌ
−カルニチンを採取するものであるため、従来のフスマ
培地でのＬ−カルニチンの産生と比較して、飛躍的にＬ
−カルニチンの産生能を向上させることができる。

【００１５】例えば、低分子化有機窒素化合物を加えた
培地では、従来の培地でのＬ−カルニチンの産生と比べ
て１．５〜１０倍程度にＬ−カルニチンの産生能を向上
させることができ、またこれに豆類又は豆由来加工品を
加えた培地では、更に約１．５〜２０倍程度にＬ−カル
ニチンの産生能を向上させることができ、更にこれに油
脂を加えた培地でのＬ−カルニチンの産生は、約５０〜
１００倍程度にＬ−カルニチンの産生能を向上させるこ
とができる。

【００１６】さて、この低分子化有機窒素化合物の添加
によるＬ−カルニチンの産生能の向上は、詳細は不明で
あるが、従来の培地中に添加されていた窒素源（例え
ば、硝酸ナトリウム）と比較して、資化され易いのでは
ないかと考えられる。尚、低分子化有機窒素化合物と
は、尿素、粉末酵母エキス、乳カゼイン由来ポリペプト
ン（例：日本製薬（株）製「ポリペプトン」）、コーン
スティーブリカー、全脂粉乳、魚肉エキス（例：焼津水
産化学工業製「カルチベータ No.100 」）、肉エキス、
乳アルブミン濃縮物（例：協和発酵（株）製「アスプロ
ＬＡ」）、酸分解アミノ酸混液（例：味の素（株）製
「淡口味液」）、乳蛋白由来アミノ酸（例：コスモ食品
（株）製「ラクトアミノサンＳＬ」）等が挙げられる。

【００１７】また、この豆類又は豆由来加工品の添加に
よるＬ−カルニチンの産生能の向上は、詳細は不明であ
るが、豆類の蛋白質はその大部分が水に溶け易い水溶性
蛋白質であり、しかもＬ−カルニチンの生合成の初発物
質であるリシン又はメチオニン等のアミノ酸が豊富であ
ることが、要因の一つと思われる。

【００１８】尚、豆類又は豆由来加工品とは、各種まめ
類を原料とし、本発明の培地成分として利用するために
適当に加工（粉末化、フレーク化等）したものが上げら
れるが、その他各種食品及び食品素材を目的として加工
したものも、また食品以外の用途（飼料用等）を目的と
して加工したものも、特に限定はなく、本発明に利用可
能である。また、食品用途外の豆類も本発明の効果には
影響がないので、勿論利用可能である。更に、厳密には
豆類に属さなくてもこれに類するもので同じ効果を有す
るものも含まれる。

【００１９】具体的には、豆加工品としては、脱脂加工
品、醸造用加工品（こうじ豆等）、飼料用加工品、粒状
加工した豆蛋白、またその他豆蛋白（大豆蛋白）加工
品、全脂豆類の粉末状加工品（きなこ等）、同繊維状加
工品、同フレーク状加工品、同粒状加工品、豆乳、また
豆乳加工飲料、おから等が挙げられる。また、豆の種類
としては大豆が一般的であるが、大豆以外の豆として
は、いんげん豆、そら豆、えんどう豆、落花生、黒豆、
小豆、うずら豆、大福豆、とら豆、金時豆、高原豆、ひ
よこ豆、レンズ豆等が挙げられる。また、これに類する
ものとしては、菜種油の搾り粕（油粕）、胡麻油の搾り
粕、コーン加工品などの効果を確認した。

【００２０】更に、この油脂の添加によるＬ−カルニチ
ンの産生能の向上は、詳細は不明であるが、前記の低分
子化有機窒素化合物、及び豆類又はまめ由来加工品と同
時に添加することで、相乗的効果が得られる。

【００２１】尚、油脂成分としては、動物・魚類・植物
由来の油脂、各種高級脂肪酸、およびこれらの加工品が
利用可能であるが、具体的には、動物・魚類由来のもの
としては牛脂、豚脂等の畜肉脂肪、鱈脂、鮫油等の魚肉
由来の油脂が利用可能であり、また、植物由来のものと
しては大豆油、ゴマ油、ヒマシ油、ツバキ油、オリーブ
油、綿実油、紅花油、菜種油、コーン油、椰子油等が挙
げられる。各種高級脂肪酸としては、リノール酸、オレ
イン酸、ステアリン酸、リノレン酸、パルミチン酸、ト
リオレイン酸等が好適である。また、これらの加工品と
して、パーム油を原料としたショートニング等も利用で
きる。

【００２２】また、本発明に使用されるカビとしては、
ノイロスポラ属、ペニシリウム属、リゾープス属に属
し、Ｌ−カルニチンの生産能を有する菌株のどれでも使
用し得る。例えば、東南アジア（インドネシア）の伝統
的発酵食品テンペの製造に用いられるリゾープス・オリ
ゴスポラス・サイト（Rhizopus oligosporus Saito
）、インドネシアの西部ジャワのオンチョム製造に用
いられるノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sito
phila ）、ヨーロッパの白カビチーズであるカマンベー
ルチーズ製造に用いられるペニシリウム・カゼイカラム
（Penicillium caseicolum）等を挙げることができる。

【００２３】更に、Ｌ−カルニチンの産生用培地として
は、これら菌株が栄養源として利用し得る物質で、且つ
Ｌ−カルニチン生産性向上に寄与し得る天然物より構成
される培地を使用する。Ｌ−カルニチン高産生性を与え
る培地組成は、炭素源、窒素源、無機物質、必要に応じ
てビタミン等を適切な割合で組合わせたものから構成さ
れる。

【００２４】固型培養においては、固型構造体を保つ基
材を配合し、栄養源を兼ねた固型培養の基材としては、
豆類及び豆類由来のもの、及び培養時、培地の物理性状
改善のためフスマ、その他穀物類を組合わせて使用して
もよい。さらにＬ−カルニチン産生能を強化するため
に、動植物油脂及び脂肪酸等、油関連物質及び窒素源と
してアミノ酸、ペプチド含量の高い天然含窒素物あるい
は乳関連物質等を添加し、菌糸の成育を促進させるため
に易資化性の糖、糖アルコール、有機酸を用いる。その
他ビタミン類、無機物質も用いる。

【００２５】無機塩としては、ナトリウム、カリウム、
マグネシウム、二価鉄化合物、リン酸塩等を用いる。そ
の他特定の有機物として、ビタミン類のＢ₆ ，ニコチン
酸、Ｃ、葉酸も添加効果を発揮する。その他、界面活性
剤Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレート）、Ｓｐａｎ２０（ソルビタンモノラウレ
イト）等の添加も、Ｌ−カルニチン産生性を高める。但
し、酢酸、プロピオン酸、酪酸等低級脂肪酸の添加は菌
糸の成育を抑制阻害する傾向にあり、カルニチンの産生
性には寄与しない。

【００２６】固型培養では通常２５℃から３７℃の温度
範囲で、初発ｐＨ４〜７付近でＬ−カルニチンが最大産
生量に達するまで培養を続ける。その期間は通常５日か
ら７日の付近である。生成したＬ−カルニチンは、固型
培養では培地に蓄積するので、培養を続けることによっ
て、Ｌ−カルニチンを多量含有する培養物を得ることが
できる。

【００２７】更に、この培養物の中のＬ−カルニチンを
抽出、高純度化するには、一般的な精製手段を応用して
行う。例えば、Ｌ−カルニチン含有培養物にＬ−カルニ
チン可溶化溶媒、一例として、水を加えて抽出後、固液
分離し、Ｌ−カルニチン含有の液相からＬ−カルニチン
を濃縮・分離・精製する方法を採用するものである。即
ち、分子量分画、イオン交換クロマトグラフィー、濃
縮、結晶化、脱色等を有効に、且つ効率的に利用し、そ
れらを組合わせた方法により精製する。

【００２８】精製例を次に示す。固型培養物を粗砕きし
た後、ワーリングブレンダー中で水を加えて充分に粉砕
し、水を浸透させたのち、遠心分離或いは濾過により抽
出液を得る。この抽出液を限外濾過、例えば分画分子量
６０００のモジュール［旭化成工業（株）社］を用い
て、高分子物質を除去する。さらに電気透析例えば、分
画分子量１００のイオン交換膜ＡＣ−１１０−１０をマ
イクロアシライザー［旭化成工業（株）製］にセットし
て低分子電解質を除去する。このような操作により、高
分子物質、例えば蛋白、高分子多糖を含まず、更に低分
子の塩類含量の非常に低いＬ−カルニチン含有抽出液を
得ることができる。

【００２９】更にＬ−カルニチン純度を上げるには、こ
の液あるいは、限外濾過膜透過液を陰イオン交換樹脂、
例えばダイアイオンＳＡ１１Ａ［三菱化成工業（株）
製］で脱色し、次いで溶イオン交換樹脂、例えばダイア
イオンＳＫ１Ｂ［三菱化成工業（株）製］のＨ⁺ 形に通
液して、Ｌ−カルニチンを吸着させ、アルカリ水溶液、
例えばアンモニア水で溶出させる。溶出液を濃縮し、必
要に応じ、脱塩する。脱塩手段としては、ゲル濾過、電
気透析等を採用する。このようにして得たＬ−カルニチ
ン含有液を減圧濃縮してＬ−カルニチン含有シロップを
つくる。更に高純度のものを必要とする場合には、有機
溶媒を用いて再結晶操作を行う。例えば、シロップを乾
固後エタノール・アセトンから再結晶する。

【００３０】

【実施例】実施例．Ａ次の組成の培地を用意し、Ｌ−カルニチン産生量の相違
を検討した。比較例（フスマ培地）：小麦フスマ［日清製粉（株）］
（５ｇ）、可溶性澱粉［岩井化学薬品（株）製］（０．
０２５ｇ）、ＫＨ₂ ＰＯ₄ （０．０５ｇ）、ＮａＮＯ₃
（０．０５ｇ）、水道水（６ml）を３００mlのコルベン
に入れ、１２０℃、３０分加熱滅菌した。実施例Ｉ（低分子化有機窒素化合物添加培地）：上記の
フスマ培地のＮａＮＯ₃ の代わりに、低分子化有機窒素
化合物として魚肉エキス［焼津水産化学工業製「カルチ
ベータ No.400 」］（０．０５ｇ）を加えて、同様に加
熱滅菌した。実施例II（豆類又は豆由来加工品添加培地）：上記フス
マ培地中のＮａＮＯ₃の代わりに、低分子化有機窒素化
合物として魚肉エキス［焼津水産化学工業製「カルチベ
ータ No.400 」］（０．２５ｇ）を用い、小麦フスマの
代わりに豆加工品として脱脂大豆［不二製油（株）製、
脱脂大豆Ｆ］（５．０ｇ）を用い、同様に加熱滅菌し
た。実施例III （油脂添加培地）：上記実施例Ｉの培地に更
に、油脂成分として大豆油２mlを加えて、同様に加熱滅
菌した。

【００３１】同一組成の培地、１０％量にて４日間前培
養した各菌・テンペ生産菌リゾープス・オリゴポラス
（Rhizopus oligsporus)・ストレインIII ，リゾープス
・オリゴスポラス・サイト・ＩＦＯ８６３１，カマン
ベールチーズ製造用ペニシリウム・カゼイコラム（Peni
cillium caseicolum）・ＩＦＯ５８４９，及びオンチ
ョム製造用ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora si
tophila ）・ＩＦＯ４５９６を用意した各培地に植菌
し、６日間培養した。培養は、リゾープス及びノイロス
ポラについては、２８℃で、ペニシリウムについては２
５℃で行った。

【００３２】各実施例の培地から得られたＬ−カルニチ
ン産生量を表１に示す。表１に示した通り、各実施例の
培地では何れも培養３日目で比較例のフスマ培地の６日
間培養した際のＬ−カルニチン量を上回る結果が出た。
尚、各単位は培地１ｇ当りのμｇである。

【００３３】

【表１】

【００３４】実施例．Ｂ種々の低分子有機窒素化合物の添加効果を検討した。フ
スマ培地組成中のＮａＮＯ₃ の代わりに、低分子化有機
窒素化合物として尿素、粉末酵母エキス、乳カゼイン由
来ポリペプトン（日本製薬（株）製「ポリペプト
ン」）、コーンスティーブリカー、全脂粉乳、魚肉エキ
ス（焼津水産化学工業製「カルチベータ No.100 」）、
肉エキス、乳アルブミン濃縮物（協和発酵（株）製「ア
スプロＬＡ」）、酸分解アミノ酸混液（味の素（株）製
「淡口味液」）、乳蛋白由来アミノ酸（コスモ食品
（株）製「ラクトアミノサンＳＬ」）を用いた。尚、添
加量，培養条件等は前述の実施例．Ａと同様に行なっ
た。結果を次の表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２に示す通り、何れの低分子化有機窒素
化合物も比較例のフスマ培地の６日間培養した際のＬ−
カルニチン量を上回る結果が出た。

【００３７】実施例．Ｃ種々の大豆の加工品の添加効果を検討した。フスマ培地
組成中のＮａＮＯ₃ の代わりに低分子化有機窒素化合物
として魚肉エキス（焼津水産化学工業製「カルチベータ
No.100 」）を使用し、更に大豆油１mlを添加し、フス
マの代わりに、大豆の脱脂加工品，醸造用加工品（こう
じ豆），飼料用加工品，大豆蛋白加工品（粒状加工した
豆蛋白），おから，全脂豆類の粉末状加工品（きな
こ），同繊維状加工品，同フレーク状加工品，同粒状加
工品を用いた。尚、検討した菌株はテンペ産生菌リゾー
プス・オリゴスポラス・ストレインIII 及びカマンベー
ルチーズ製造用ペニシリウム・カゼイコラム・ＩＦＯ
５８４９の２つについて行なった。結果を次の表３に示
す。

【００３８】

【表３】

【００３９】表３に示す通り、何れの大豆の加工品につ
いて、２〜１００倍程度のＬ−カルニチンの産生能の向
上が確認された。

【００４０】実施例．Ｄ大豆だけでなく、種々の豆類について添加効果を検討し
た。フスマ培地組成中のＮａＮＯ₃ の代わりに低分子化
有機窒素化合物として魚肉エキス（焼津水産化学工業製
「カルチベータ No.100 」）を使用し、更に大豆油１ml
を添加し、フスマの代わりに、小豆，うずら豆，大福
豆，レンズ豆，ひよこ豆，金時豆，高原豆，黒豆，とら
豆の粉砕物及び豆類類似のものとして菜種滓，コーン末
を用いた。尚、検討した菌株はテンペ産生菌リゾープス
・オリゴスポラス・ストレインIII 及びカマンベールチ
ーズ製造用ペニシリウム・カゼイコラム・ＩＦＯ５８
４９の２つについて行なった。結果を次の表４に示す。

【００４１】

【表４】

【００４２】表４に示す通り、何れの豆類及び豆類類似
のものについても、２〜８０倍程度のＬ−カルニチンの
産生能の向上が確認された。

【００４３】実施例．Ｅ種々の油脂について添加効果を検討した。フスマ培地組
成中のＮａＮＯ₃の代わりに低分子化有機窒素化合物と
して魚肉エキス（焼津水産化学工業製「カルチベータ N
o.100 」）を使用し、更にフスマの代わりに、脱脂大豆
［不二製油（株）製、脱脂大豆Ｆ］５ｇを使用し、大豆
油，リノール酸，オレイン酸，ステアリン酸，リノレン
酸，パルミチン酸，ゴマ油，ヒマシ油，ツバキ油，オリ
ーブ油，綿実油，紅花油，菜種油，コーン油，椰子油，
ショートニング，牛脂，豚脂，鯨油，鮫油，鱈油を各２
ml添加して、Ｌ−カルニチンの産生量の差を求めた。
尚、検討した菌株はテンペ産生菌リゾープス・オリゴス
ポラス・ストレインIII 及びカマンベールチーズ製造用
ペニシリウム・カゼイコラム・ＩＦＯ５８４９の２つ
について行なった。結果を次の表５に示す。

【００４４】

【表５】

【００４５】表５に示す通り、油脂の添加によるＬ−カ
ルニチンの産生能の向上が確認された。

【００４６】以上のように、本発明は、ムコール属、ノ
イロスポラ属、ペニシリウム属、リゾープス属に属して
いるＬ−カルニチン産生能菌を培養した場合に、Ｌ−カ
ルニチンを大量に産生，蓄積することのできる組成の培
地を完成させたこと、及び培地に大量に蓄積させて、Ｌ
−カルニチン高含有培養物を得ること、及びそのような
培養物からＬ−カルニチンの抽出、濃縮等を行うことに
より、Ｌ−カルニチン含有量を高めたＬ−カルニチン含
有抽出液を得ること、を特徴とするＬ−カルニチン製造
法である。

【００４７】

【発明の効果】以上説明した通り、Ｌ−カルニチンを産
生する糸状菌を(a)低分子化有機窒素化合物成分；(b)
豆類又は豆由来加工品成分；(c) 油脂成分；から選ばれ
る成分の１種又は２種以上を加えた培地で培養し、該培
養物より、Ｌ−カルニチンを採取するものであるため、
従来のフスマ培地でのＬ−カルニチンの産生と比較し
て、飛躍的にＬ−カルニチンの産生能を向上させること
ができる。

【００４８】例えば、低分子化有機窒素化合物を加えた
培地では、従来の培地でのＬ−カルニチンの産生と比べ
て１．５〜１０倍程度にＬ−カルニチンの産生能を向上
させることができ、またこれに豆類又は豆由来加工品を
加えた培地では、更に約１．５〜２０倍程度にＬ−カル
ニチンの産生能を向上させることができ、更にこれに油
脂を加えた培地でのＬ−カルニチンの産生は、約５０〜
１００倍程度にＬ−カルニチンの産生能を向上させるこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者綿貫雅章東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内 (56)参考文献特開昭60−214890（ＪＰ，Ａ) 特開平２−69188（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−カルニチン産生能を有する糸状菌を
培養し、該培養物より、Ｌ−カルニチンを採取するＬ−
カルニチンの製造法において、前記糸状菌として、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、
リゾープス属の何れかの属に属したものを用い、該糸状
菌の培養に際し、 (a)低分子化有機窒素化合物成分； (b)豆類又は豆由来加工品成分； (c)油脂成分；から選ばれる成分の１種又は２種以上を培地中に加える
ことを特徴とするＬ−カルニチンの製造法。