JP3048665B2 - ランブル鞭毛虫の検出用核酸プローブ - Google Patents

ランブル鞭毛虫の検出用核酸プローブ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】ランブル鞭毛虫は世界中の多くの
国々での下痢の共通原因である有鞭毛原生動物寄生虫で
ある。その生活環は栄養型および嚢子の二つの過程から
成る。栄養型は小腸中で複製し、感受性宿主に発病させ
ることがある。栄養型は下痢の患者または瀉下による液
状便以外には通常見出だされない。存在する場合、それ
らは水中でのブラウン運動に似た運動性を示す。下剤を
用いると、栄養型は不活発になるものがある。それらは
小腸中で包嚢を形成することができ、糞便中に排出され
る。他の宿主はこれらの嚢子の摂取によって引き続き感
染する。
【０００２】
【従来の技術】ランブル鞭毛虫はランブル鞭毛虫症を引
き起こし、しかも腸管内で盛んに生存する。重大な臨床
的症状は、栄養型が腸壁の炎症性変化を引き起こす可能
性があるということを示唆する。この寄生虫の栄養型は
十二指腸ドレナージ中でまたは胆嚢から回復することが
できる。胃腸疾患でのその主な役割についての証明は入
手可能である［ホスキンズ・エル・シー（Ｈｏｓｋｉｎ
ｓ，Ｌ．Ｃ．）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ、５３：２６５〜２６８（１９６７）；Ｍｏｒｂｉｄ
ｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒａｌｉｔｙ、週報、センター・
フォア・ディズィーズ・コントロール（Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）１９（４
７）：４５５〜４５９（１９７０）．（１９７５）］。
【０００３】ランブル鞭毛虫症を診断するのに最も一般
的に用いられる方法は、ルゴール溶液、マーサイオデー
ト（ｍｅｒｔｈｉｏｄａｔｅ）−ヨウ素−ホルムアルデ
ヒドまたはトリクロームを用いる組織学的染色法によっ
て糞便中のランブル鞭毛虫嚢子または栄養型を確認する
ことである。これらの方法は、時間を浪費し、単調でそ
して感受性が鈍い。多数の敏速な実験室的方法が利用可
能になってきている。特異性が増大された検出方法は、
それが分析を行なう試料中に存在するランブル鞭毛虫と
他の生物とを識別することを可能にするので、臨床家に
とって有用であると思われる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ランブル鞭
毛虫が存在すると疑われる試料中のランブル鞭毛虫を選
択的に検出する方法に関する。すなわち、それは試料中
に存在するランブル鞭毛虫を試料中の（非ランブル鞭毛
虫生物と呼ばれる）他の生物を除外して確認することが
できる方法である。
【０００５】特に、本発明は、適当な条件下でランブル
鞭毛虫のリボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡにハ
イブリッド形成するが、試料中に存在することがある他
の生物（非ランブル鞭毛虫生物）のリボソームＲＮＡま
たはリボソームＤＮＡには同じ条件下でハイブリッド形
成しないＤＮＡまたはＲＮＡ配列である少なくとも１種
類の核酸プローブを利用する方法に関する。
【０００６】本発明は、それが現在利用可能な方法に勝
る下記の利点、すなわち、（１）試料中のランブル鞭毛
虫を検出するための増大された特異性、（２）ランブル
鞭毛虫の生化学的に異常な系統についての正確な確認、
および（３）この種の試験が試験を行なう前のランブル
鞭毛虫の試料からの単離を必要としないことによる一層
敏速な結果を有するので特に有用である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のラン
ブル鞭毛虫を、ランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡの少
なくとも１領域またはランブル鞭毛虫のリボソームＤＮ
Ａの少なくとも１領域（すなわち、標的ヌクレオチド配
列）にハイブリッド形成するが、他の生物（すなわち、
非ランブル鞭毛虫生物）のリボソームＲＮＡまたはリボ
ソームＤＮＡにはハイブリッド形成しない少なくとも１
種類の核酸プローブの利用によって選択的に検出する方
法である。
【０００８】要するに、本方法は下記の段階、すなわち
（１）分析を行なう試料を入手し、（２）試料を処理し
て存在する核酸を相補的ヌクレオチド配列とのハイブリ
ッド形成に利用可能にし、（３）その処理された試料お
よび少なくとも１種類の選択された核酸プローブ（すな
わち、ランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡの少なくとも
１領域にまたはランブル鞭毛虫のリボソームＤＮＡの少
なくとも１領域にハイブリッド形成する少なくとも１種
類の核酸）を、相補的配列のハイブッド形成に適当な条
件下で混合し、そして（４）ランブル鞭毛虫の存在を示
すものである選択された核酸プローブと処理された試料
中に存在する核酸とのハイブリッド形成を検出すること
を含む。
【０００９】本方法は、ランブル鞭毛虫が存在すると疑
われ、しかも試料中に存在する核酸配列と核酸プローブ
との接触および相補的配列のハイブリッド形成を生じさ
せるのに十分に液体であるいずれの試料でも用いること
ができる。試料は、臨床的試料、例えば糞便および下方
の腸からの糞便試料または水などの環境試料であること
ができる。更に、この方法は、水を精製するのに現在一
般的に用いられている濾過装置でランブル鞭毛虫を検出
するのに用いることができる。
【００１０】試料は、試料中に存在する核酸が相補的核
酸配列とのハイブリッド形成に利用可能であるような方
法で処理する。例えば、生物の細胞構造および分子構造
を破壊する薬剤で試料を処理することができる。原生動
物寄生虫のような細胞は生物の分子構造を破壊するカオ
トロピック物質を用いて破壊することができる。すなわ
ち、この物質は生物検体に通常見出だされるタンパク
質、核酸、多糖などのバイオポリマーの二次構造、三次
構造および／または四次構造を変性する。カオトロピッ
ク物質の例には、カオトロピック塩（例えば、チオシア
ン酸グアニジン）、加水分解酵素（例えば、プロテアー
ゼ）および疎水的相互作用を破壊する化合物（例えば、
ドデシル硫酸ナトリウム、フェノール、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、テトラメチル尿素また
は塩酸グアニジン）が挙げられる。分子構造を破壊する
物理的または機械的手段（例えば、ビーズビーティング
および音波処理）を用いて核酸を放出することもでき
る。必要ならば、原生動物寄生虫に存在し且つそれから
放出される核酸を更に処理して（例えば、加熱して二重
鎖配列を一重鎖にすることによって）それらが相補的核
酸配列とのハイブリッド形成に利用可能であることを確
実にすることができる。分子構造を破壊する薬剤および
方法はこの目的のために単独にまたは種々の組み合わせ
で用いることができる。
【００１１】核酸をハイブリッド形成に利用可能にした
後、その試料をランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡおよ
び／またはリボソームＤＮＡと選択的にハイブリッド形
成する核酸プローブと、またはこのようなプローブの
（２個またはそれ以上の）セットと混合する。このよう
な（選択された核酸プローブと呼ばれる）核酸プローブ
の配列はランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡおよび／ま
たはリボソームＤＮＡに対して十分に相補的であり、そ
れらはランブル鞭毛虫リボソームＲＮＡまたはＤＮＡに
ハイブリッド形成するが、（非ランブル鞭毛虫生物と呼
ばれる）他の生物に存在する核酸にはハイブリッド形成
しない。ある種の可能な検定方式では、１個のプローブ
のみがランブル鞭毛虫に特異的でなければならない。概
して、このようなプローブは検定条件下でハイブリッド
形成し且つハイブリッド形成された状態のままであるの
に十分な長さである。適切な長さは用いられる方式によ
って決定される。
【００１２】本方法において、前記に記載のように処理
した試料を選択された１個または複数個の核酸プローブ
と混合する。本方法の一つの態様では、２種類のランブ
ル鞭毛虫特異性核酸プローブであるランブル鞭毛虫特異
性末端付き捕獲プローブおよび標識付き検出用プローブ
を、同時にかまたは逐次的に試料と接触させる。
【００１３】１種類のプローブはランブル鞭毛虫特異性
末端付き捕獲プローブであり、遊離であるかまたは固体
支持体にハイブリッド形成することができる。末端付き
捕獲プローブは二つの目的に役立つ。すなわち、それら
はランブル鞭毛虫の１８ＳリボソームＲＮＡまたは１８
ＳリボソームＤＮＡの少なくとも１部分に相補的であり
（ハイブリッド形成し）、そしてそれらは下記に記載さ
れるハイブリッド形成複合体を固体支持体に結合し、そ
れゆえに、ハイブリッド形成複合体を試料の残部から分
離することを可能にする。
【００１４】捕獲プローブは、ヌクレオチドホモポリマ
ー、例えばポリデオキシリボアデニル酸塩（ポリ（ｄ
Ａ））、ポリデオキシリボシチジル酸塩（ポリ（ｄ
Ｃ））、ポリデオキシリボグアニル酸塩（ポリ（ｄ
Ｇ））またはポリデオキシリボチミジル酸塩（ポリ（ｄ
Ｔ））から形成されるのが一般的であるポリヌクレオチ
ド末端を特徴とする。プローブ末端はポリヌクレオチド
配列に対して相補的であり、固体支持体、例えば磁気ビ
ーズ、ポリスチレンビーズおよびポリスチレンディプス
ティックに固着してプローブを捕獲し且つ試料から分離
することを可能にする。
【００１５】標識付き検出用プローブは検出可能な標識
を含む核酸配列であり、少なくともランブル鞭毛虫の１
８ＳリボソームＲＮＡの一部分または１８Ｓリボソーム
ＤＮＡの一部分にハイブリッド形成する一重鎖ＲＮＡま
たはＤＮＡプローブであるのが一般的である。プローブ
は同位体で（放射能）または非同位体で標識することが
できる。特に有用な標識は、低濃度で検出可能であり、
安定性で、ハイブリッド形成反応を妨害せず、そしてバ
ックグラウンドが低いものである。リン３２、硫黄３５
およびヨウ素１２５のような放射性同位体を用いること
ができる。用いることができる非同位体標識の例は酵素
標識抗体およびアクリジニウムエステルである。修飾さ
れたシチジンを含むオリゴヌクレオチドプローブをフル
オレセインで標識する。これらの蛍光を発せらせたプロ
ーブは、酵素で標識された抗フルオレセイン抗体の利用
によってそれらの標的複合体中で検出される。アクリジ
ニウムエステル標識の利用はヌクレオチドの検出を極め
て敏感にさせ、検出は化学発光検出器を利用することに
よって行なう。更に、ＲＮＡ核酸プローブおよびランブ
ル鞭毛虫特異性配列のハイブリッド形成を、マレック病
ウィルス（ＭＤＶ）プラスミドおよびＲＮＡポリメラー
ゼであるＱβレプリカーゼを用いる増幅によって検出す
ることができる。相対的に多量の組換え体ＲＮＡの発生
はハイブリッド形成が生じたという信号として役立つと
思われる［リツァルディ・ピー・エム（Ｌｉｚａｒｄ
ｉ，Ｐ．Ｍ．）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：
１１９６〜１２０２（１９８８）］。
【００１６】本方法において、末端付き捕獲プローブは
試料中に存在する標的ヌクレオチド配列とハイブリッド
形成して捕獲プローブ／標的ヌクレオチド配列複合体を
形成することが可能である。捕獲プローブと一緒にかま
たは捕獲プローブ／標的ヌクレオチド配列複合体を形成
後かに、更に、標識付き検出用プローブを試料と接触さ
せ、相補的ヌクレオチド配列のハイブリッド形成が生じ
且つ捕獲プローブ／標的ヌクレオチド配列／検出用プロ
ーブ複合体を形成するのに適当な条件下（例えば、時
間、温度、ｐＨ、塩濃度、カオトロープ濃度）で保持す
る。用いられる捕獲プローブおよび検出用プローブは標
的ヌクレオチド配列の種々の領域に結合する。ハイブリ
ッド形成複合体と呼ばれる捕獲プローブ／標的ヌクレオ
チド配列／検出用プローブ複合体を試料混合物から除去
する。この回復は、例えば、ハイブリッド形成複合体を
含む混合物と捕獲プローブの末端に相補的なポリヌクレ
オチドで被覆されている固体支持体とを接触させること
によって行なう。ハイブリッド形成複合体に存在する捕
獲プローブの末端は相補的基質とハイブリッド形成し
て、完全なハイブリッド形成複合体を試料から分離する
ことを可能にする。予めハイブリッド形成した捕獲プロ
ーブまたは標的ヌクレオチド配列の場合、捕獲プローブ
または標的ヌクレオチド配列を結合している基質を試料
混合物から除去する。完全なハイブリッド形成複合体
は、塩基対を可逆的に破壊する処理によって固体基質か
ら脱離することができ、複合体を他の固体基質に再捕獲
することができる。すなわち、ハイブリッド形成複合体
のこの循環の結果として、固体基質に通常非特異的に結
合するノイズが減少する。
【００１７】本発明のもう一つの態様では、１種類のプ
ローブ、すなわち標識付き検出用プローブのみを必要と
する。この場合、標的ヌクレオチド配列の試料は下記に
記載の固体支持体に結合する。結合した試料は１種類以
上の液体標本中で１種類以上の標識付き検出プローブと
接触させて、固体支持体に結合した標的ヌクレオチド配
列と１個または複数個の標識付き検出用プローブとのハ
イブリッド形成を可能にする。次に、固体支持体物質
を、固体支持体に結合した標的ヌクレオチド配列に対す
る標識付き検出用プローブのハイブリッド形成複合体に
適当な検出法によって分析する。
【００１８】２種類以上の選択された核酸プローブを含
み、そのそれぞれがランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡ
またはランブル鞭毛虫のリボソームＤＮＡの種々の領域
にハイブリッド形成するプローブセットも挙げることが
できる。プローブセットの利用により、感度および特異
性を一層大きくすることができる。プローブセットは捕
獲プローブ、検出用プローブまたは捕獲プローブと検出
プローブの組み合わせから成ることができる。セット中
の各プローブはリボソームＲＮＡの種々の領域に結合す
る必要がある。
【００１９】本方法を行なうのに用いられる検定方式は
用いられる塩、溶媒、核酸濃度、容量および温度の適当
な組み合わせを決定する。このような条件は当業者によ
って経験的に決定することができる。例えば、実施例Ｉ
ＩＩに記載されるドットブロット検定の固体支持体方式
において、記載されたオリゴヌクレオチドプローブのた
めのハイブリッド形成溶液は、ＮａＣｌを０．９モル、
ｐＨ７．８のトリス−ＨＣｌを０．１２モル、ＥＤＴＡ
を６ミリモル、ＫＰＯ４を０．１モル、ＳＤＳを０．１
％、ピロリン酸を０．１％、フィコールを０．００２
％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．０２％および
ポリビニルピロリジンを０．００２％含むことができ
る。
【００２０】発明の説明をリボソームＲＮＡを検出する
ことに関して行なったが、本文中に記載したプローブお
よび本文中に記載したそれらに相補的なプローブも、リ
ボソームＲＮＡを規定する遺伝子（ＤＮＡ）の検出に有
用である。したがって、プローブはＲＮＡまたはＤＮＡ
であることができる。このようなプローブは記載された
プローブと同等であると考えられ、本発明の精神および
範囲に包含される。
【００２１】ランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡまたは
リボソームＤＮＡに対して特異的である（すなわち、ラ
ンブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡまたはＤＮＡには結合
するが、非ランブル鞭毛虫生物に存在する核酸には結合
しない）核酸プローブが構成された。このようなプロー
ブは本方法で個別にまたは組み合わせて（すなわち、プ
ローブセットの一部分として）用いることができる。本
方法で特に有用であるプローブは、ランブル鞭毛虫の１
８ＳリボソームＲＮＡの少なくとも一部分にまたは１８
ＳリボソームＤＮＡの少なくとも一部分に相補的である
ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ
である。本方法に有用なプローブのヌクレオチド配列は
標的ヌクレオチド配列に完全に相補的である必要はな
い。このようなプローブは、（１）それが標的ヌクレオ
チド配列に選択的にハイブリッド形成するのに十分に相
補的であり且つ（２）用いられる条件下で標的ヌクレオ
チド配列にハイブリッド形成した状態のままであること
が必要である。下記のオリゴヌクレオチドプローブが本
方法で有用である。
【００２２】
【００２３】本方法で有用なプローブは天然に存在する
原料から得ることができ、遺伝子工学技術を用いて製造
することができ、または化学的に合成することができ
る。
【００２４】本発明の方法は、ハイブリッド形成が水性
環境中または固体支持体上で生じるような方法で行なう
ことができる。水性環境を用いる場合、ランブル鞭毛虫
を含むと疑われる処理された試料は、生理学的塩溶液な
どの液体製剤中に存在する。核酸プローブも液体製剤中
に存在する。この２種類の製剤を一緒に混合し、存在す
るとして標的ヌクレオチド配列と、選択された核酸プロ
ーブとの接触を可能にする。標的ヌクレオチド配列が存
在する場合、選択された核酸プローブとのハイブリッド
形成が生じる。試料は、２種類以上の選択された核酸プ
ローブ、例えば各プローブ種が標的ヌクレオチド配列の
種々の位置にハイブリッド形成するプローブのセットと
混合することができる。
【００２５】ハイブリッド形成が固体支持体上で生じる
本発明の態様において、標的ヌクレオチド配列かまたは
核酸プローブを固体支持体に結合することができる。標
的ヌクレオチド配列を固体支持体に結合させる場合、固
体支持体を１個または複数個の選択された核酸プローブ
と接触させ、それによって標的ヌクレオチド配列および
選択された１個または複数個の核酸プローブのハイブリ
ッド形成が生じるのを可能にする。逆に、核酸プローブ
を固体支持体に結合させる場合、固体支持体は標的ヌク
レオチド配列を含むと疑われる試料と接触させて、標的
ヌクレオチド配列と選択された核酸プローブとのハイブ
リッド形成が生じるのを可能にする。
【００２６】本発明で用いることができる固体支持体と
して、前記に記載の捕獲プローブまたは支持体に予備ハ
イブリッド形成させる標的ヌクレオチド配列を与えるの
に十分な量の基質ポリヌクレオチドを結合することがで
きる任意の固体物質が挙げられる。概して、アガロース
ビーズまたはポリスチレンのようなポリマー性物質は支
持体として有用である。ニトロセルロースおよびナイロ
ンフィルターも用いることができる。支持体の形状は検
定の種類および検定を行なう試料の性質に応じて変化す
る。微量滴定用ウェル、繊維およびディップスティック
のような形状が本発明に有用であり、有効且つ好都合な
方法で手動によって行なう多量の試料の同時検定を可能
にする。検定は、例えば自動ピペットおよびプレート読
取機を用いて自動操作することもできる。他の固体支持
体、特に他のプラスチック固体支持体を用いることもで
きる。
【００２７】固体支持体を用いる場合、タンパク質およ
び核酸阻止物質を含む予備ハイブリッド形成溶液を加え
て固体支持体への「非特異的プローブ付着」を最小限度
にする。「非特異的プローブ付着」とはプローブの固体
支持体に対する標的とは無関係な結合を意味する。付着
の原因となる力は十分に理解されていない（したがっ
て、「非特異的」という言葉を用いる）、しかし、ファ
ン・デル・ワールス相互作用、疎水性結合および水素結
合が、おそらく結合の全エネルギーの一因であると考え
られる。
【００２８】相補的核酸配列のハイブリッド形成を検出
する方法は、用いられる標識プローブの種類によって決
定される。例えば、放射性リガンドを用いる場合、検出
計測器はシンチレーションカウンター、（オートラジオ
グラフ走査用）デンシトメーターまたはベータエミッシ
ョンカウンターであることができる。検出器標識がフル
オレセインである場合、検出計測器は蛍光分光光度計で
あることができる。酵素が検出用プローブ標識である場
合、検定試料は適当な色原体／基質と予めインキュベー
トした後に適当な波長での分光光度計によって読取られ
る。
【００２９】本文中に記載した核酸プローブを用いてラ
ンブル鞭毛虫の存在または不在を確認することを行なう
データの分析は、核酸プローブに用いられる検定方式お
よび標識の種類に関係する。例えば、実施例ＩＩＩのド
ットブロット方式および検出用放射性標識を用いる一つ
の態様において、ランブル鞭毛虫のリボソームＲＮＡま
たはリボソームＤＮＡの存在の検出を表わす正の試料
は、３種類の負の対照の１分間当りの平均計数を読取
り、その平均に計数５００／分を加えることによって測
定される。この数値はカットオフ数値を表わす。計数５
００／分を平均に加えて負の対照についての数値の標準
偏差を防止する。計数が結果として得られるカットオフ
数値を上回る試料をランブル鞭毛虫について正であると
見なす。１分間当りの計数がカットオフ数値に満たない
試料は負と見なす。
【００３０】ランブル鞭毛虫を検出する本方法を実施す
るのに有用なキットを製造することができる。このよう
なキットは、例えば、ＥＤＴＡのようなキレート化剤お
よび細胞の分子構造（例えば、膜）を破壊する薬剤（例
えば、カオトロピック物質および／またはドデシル硫酸
ナトリウムのような洗剤）を含む試料処理溶液；末端付
き捕獲プローブ；標識付き検出用プローブ；少なくとも
１種類の緩衝液；（標的転写産物の分解を防止する）Ｒ
Ｎアーゼ酵素を阻害するための薬剤；捕獲プローブ末端
に相補的であるポリヌクレオチドで被覆された固体支持
体（例えば、磁気ビーズまたはポリスチレン基質）；対
照としての試料を用いて同時に実験する基準または標準
核酸；および洗剤を含む洗浄用緩衝液を含むことができ
る。キットは、所望により、追加の洗浄用緩衝液、標識
付き検出用プローブを検出するための装置、１種類以上
の溶離緩衝液、増幅またはクローニング試薬および／ま
たは追加の正の対照試料または負の対照試料を含むこと
ができる。
【００３１】本方法の検定工程は自動操作することがで
きる。用いられる固体支持体が微量滴定プレートである
場合、（試薬の添加および洗浄工程のための）自動ピペ
ッティング装置および分光光度計読取り機を用いること
ができる。本発明を実施するための自動装置には、サー
モスタットで制御された環境（すなわち、恒温環境）中
の特定の時点で固体相に試薬を添加し且つ除去する連続
的操作を行なうことができるピペッティング部分および
検出装置を含むことができる。連続操作としては下記、
すなわち、試料、溶解溶液および固体支持体を混合また
は接触させること；支持体から液体を除去すること；洗
浄用緩衝液を加えること；前記に挙げた工程を繰り返
し、標識プローブを加え、洗浄工程を再度繰り返し、検
出物質を加え、そして検出装置で信号を検出すること；
の内の一つまたはそれ以上がある。発明を下記の具体的
な実施例によって更に例証するが、いずれにせよ制限す
ることを意図するものではない。
【００３２】
【実施例Ｉ】ランブル鞭毛虫特異性オリゴヌクレオチドプローブの設
計 長さがヌクレオチド３８〜４８個で、ランブル鞭毛虫に
選択的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを製造した。これらは、（１）ランブル鞭毛虫と、
ランブル鞭毛虫を非ランブル鞭毛虫生物と区別するため
の他の寄生虫および細菌とのヌクレオチド配列の差を利
用し、（２）標的リボソームＲＮＡ内部とプローブ分子
間との双方の自己相補性の影響を最小限度にして設計さ
れた。本発明のプローブの設計および開発に利用される
最初の工程では、ランブル鞭毛虫特異性核酸プローブに
対する標的部分として役立つことができる１８Ｓリボソ
ームＲＮＡの領域の確認を行なった。具体的には、進化
論的にランブル鞭毛虫に近縁の種のリボソームＲＮＡの
１か所または複数箇所の領域と十分に区別されるランブ
ル鞭毛虫のリボソームＲＮＡの１か所または複数箇所の
領域を確認することが可能であるならば、このような配
列に対するプローブはハイブリッド形成検定によってラ
ンブル鞭毛虫と関連生物とを区別するのに用いることが
できるということを確認することによって排他基準が満
たされると仮定した。系統分類的観察に基づいて、次
に、一層遠縁の生物のリボソームＲＮＡは、たとえその
実際の同一性を知る必要がないとしても、予測的に、前
記の進化論的にランブル鞭毛虫に近縁の種よりも特定の
領域の配列が異なるはずであると推定された。
【００３３】核酸ハイブリッド形成プローブに有用な標
的部分として潜在的に役立つことができるランブル鞭毛
虫のリボソームＲＮＡの領域を確認する場合の最初の工
程として、ランブル鞭毛虫の１８Ｓ様リボソームＲＮＡ
ヌクレオチド配列［ソジン・エム・エル（Ｓｏｇｉｎ，
Ｍ．Ｌ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：７５〜７７
（１９８９）］を他の利用可能なリボソームＲＮＡヌク
レオチド配列、特に原生動物寄生虫のものと比較した。
ランブル鞭毛虫の１８Ｓ様ｒＲＮＡヌクレオチド配列と
他の利用可能な原生動物寄生虫のｒＲＮＡヌクレオチド
配列との比較は特に有用であることが分かった。ランブ
ル鞭毛虫と非ランブル鞭毛虫生物とを区別すると思われ
る若干の領域の配列が確認された。１８Ｓ様リボソーム
ＲＮＡ配列内部のこれらの領域の位置を図１に示す。
【００３４】前記に記載のように設計されたプローブお
よびランブル鞭毛虫の１８Ｓ様リボソームＲＮＡでのそ
れらの標的配列を図１に示す。前記に記載したプローブ
の特異的ハイブリッド形成挙動は、それらを用いる検定
方式に密接に関係する。用いられる方式に応じて、核酸
プローブの特性は異なることがある。これは当業者によ
って経験的に決定することができる。例えば、これらの
特定の核酸プローブの長さはドットブロット検定での利
用に最適にした。最適のプローブ長さは選択されたハイ
ブリッド形成条件の厳格さの相関的要素であり、したが
って、このプローブの長さはそれにしたがって変更する
ことができるということは当業者に周知である。したが
って、特定のプローブの正確な長さは、ある程度までそ
の特定の意図された利用に影響される。本文中に記載し
たプローブの「本質」は前記に記載したランブル鞭毛虫
特異性配列の発見および利用にある。２種類以上の核酸
プローブのセットを用いるような態様では、いずれのプ
ローブも、それらを一緒に用いる任意の特定の方式に適
合して挙動することが必要である。
【００３５】
【実施例ＩＩ】放射性標識付き検出用プローブを用いる一般的な検定方
式 糞便２ｇを機械的均質化によってリン酸緩衝溶液１０ｍ
ｌに液化する。液状糞便を、フィルターカップ２８個を
備えた特別に設計された減圧濾過マニホールドで濾過す
る。液状糞便からの細菌および破片をフィルターで除去
する。水酸化ナトリウム溶液をフィルターカップに加え
て存在する全細胞を破裂させ、二重鎖ＤＮＡを変性させ
て、加えられたプローブとの反応を行なうことができる
一重鎖ＤＮＡにする。中和溶液を加え、続いて固定溶液
を加えて標的ランブル鞭毛虫リボソームＲＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡを不可逆的に膜に固定する。次に、カップを
破裂させ、フィルターを５０ｍｌの遠心管に入れる。そ
れ以後の全工程はこの管でのバッチで行なわれた。タン
パク質および核酸阻止物質を含む予備ハイブリッド形成
溶液を加えて次の工程でのフィルターへのプローブ付着
を最小限度にする。次に、１個または複数個のリン３２
標識プローブを加え、フィルター上で任意のジアルジア
属標的リボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡにハイ
ブリッド形成させる。このハイブリッド形成反応は６０
℃の水浴中で２時間行なう。上澄みを傾瀉し、フィルタ
ーをバッチで合計６回洗浄する。次に、シンチレーショ
ンカウンターでかまたはベータ検出器でフィルターを計
数する。１種類の正の試料（キットと一緒に与えられる
加熱殺処理されたランブル鞭毛虫）および３種類の負の
試料（加熱殺処理された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を検
定毎に対照として実験する。正の値は３種類の負の平均
を読取り且つその平均に一定の計数５００／分を加える
ことによって測定する。推定上、結果として得られるカ
ットオフを上回る試料をランブル鞭毛虫について正であ
ると見なす。計数がカットオフ数値未満の試料を負と見
なす。正の対照は標識核酸プローブの寿命に応じて計数
平均が約１０，０００〜３０，０００／分であり、検定
を適切に行なうことを確実にすることにのみ用いられ
る。この方法の感度限界は生物約５×１０６個である。
【００３６】
【実施例ＩＩＩ】プローブのハイブリッド形成挙動のドットブロット検定 本文中に記載した配列比較は、本発明のプローブがラン
ブル鞭毛虫を他の原生動物寄生虫および細菌を除外して
特異的に検出することに関して種々の有用なハイブリッ
ド形成特性を示す必要があることを示唆した。しかしな
がら、ランブル鞭毛虫の一つの配列しか検査されなかっ
た。配列分析によって検査されなかった他のランブル鞭
毛虫で配列が変化しているかも知れない可能性がある。
このような変化は若干のまたは多くの未試験ランブル鞭
毛虫単離物に対して期待されるプローブによるハイブリ
ッド形成を減少または除外すると思われる。
【００３７】同様に、プローブの包括挙動と同じくらい
重要であるのはそれらの排他挙動、すなわち、非ジアル
ジア属原生動物寄生虫および細菌に対するそれらの反応
性である。潜在的にジアルジア属を含有する試験試料で
遭遇すると思われる非ジアルジア属系統の数および種類
は極めて多数である。したがって、代表的なランブル鞭
毛虫および非ジアルジア属生物に対するプローブの挙動
はドットブロット法を用いるハイブリッド形成分析によ
って確認した。
【００３８】周知の方法であるドットブロット分析は、
核酸または核酸集団をフィルター、例えばニトロセルロ
ース、ナイロンまたは商業的に、特にこの目的に入手す
ることができる他の誘導膜上に固定することを行なう。
ＤＮＡかまたはＲＮＡをこのようなフィルター上に固定
することができ、続いて、関心の的である核酸プローブ
に関する種々の条件（すなわち、緊縮）のいずれでもハ
イブリッド形成を探査または試験することができる。緊
縮条件下において、ヌクレオチド配列の標的配列に対す
る相補性が大きいプローブは、相補性が一層小さいプロ
ーブよりも高い水準のハイブリッド形成を示す。
【００３９】結果が表１に例示されている実験では、表
示された各生物からの精製ＲＮＡの１０分の１マイクロ
グラムがニトロセルロースフィルター上で確認された。
オリゴヌクレオチドプローブは標準法を用いて放射性リ
ン３２を末端に標識した。
【００４０】本文中に記載したオリゴヌクレオチドプロ
ーブについて、（ＮａＣｌを０．９モル、ｐＨ７．８の
トリス−ＨＣｌを０．１２モル、ＥＤＴＡを６ミリモ
ル、ＫＰＯ４を０．１モル、ＳＤＳを０．１％、ピロリ
ン酸を０．１％、フィコールを０．００２％、ＢＳＡを
０．０２％およびポリビニルピロリジンを０．００２％
含むハイブリッド形成溶液中）６０℃で１４〜１６時間
のリボソームＲＮＡ標的に対するハイブリッド形成、続
いて、３回行なう（ＮａＣｌを０．０３モル、ｐＨ７．
８のトリス−ＨＣｌを０．００４モル、ＥＤＴＡを０．
２ミリモルおよびＳＤＳを０．１％中）６０℃で１５分
間のハイブリッド形成後洗浄は、表１に例証した特異性
の水準を生ずるのに十分に緊縮であった。
【００４１】前記に記載のハイブリッド形成および洗浄
に続いて、ハイブリッド形成フィルターをＸ線フィルム
に感光し、信号強度は前記に記載の既知量の標的物質
（ＲＮＡ）を含む対照スポットに関して可視的に評点さ
れた。
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【実施例ＩＶ】液体ハイブリッド形成検定でのプローブのハイブリッド
形成挙動 本発明のプローブまたはそれらの誘導体は種々のハイブ
リッド形成方式で用いることができる。この種の一つの
方式、二重のプローブ、サンドイッチ型ハイブリッド形
成検定方式（例えば、米国特許出願第２７７，５７９号
明細書、第１６９，６４６号明細書または第２３３，６
８３号明細書に記載されたホモポリマー捕獲、二重プロ
ーブ、液体ハイブリッド形成方式）をこの実施例で用い
る。概して、このような用途において、オリゴヌクレオ
チドプローブはその３′末端で修飾されて長さが約２０
〜２００残基の一連のデオキシアデノシン（ｄＡ）残基
を含む。これを用いて標的リボソームＲＮＡを捕獲し、
試験試料から、この目的のためにポリデオキシチミジン
（ｄＴ）に適当に誘導された固体支持体（例えば、ビー
ズ、プラスチック表面、フィルター等）上へと液体ハイ
ブリッド形成を行なう。第二のプローブを検出プローブ
として用い、ある種の検出可能リガンド（例えば、リン
３２、フルオレセイン、ビオチン等）で誘導する。原則
として、検出プローブは長さが異なるＤＮＡまたはＲＮ
Ａプローブであることができる。続いて、試験試料にお
ける標的核酸の存在の検出を、図２に例示の一連のハイ
ブリッド形成相互作用を介する固体表面上への検出リガ
ンドの捕獲によって表わす。これは、標的核酸が試料中
に存在する場合にのみ生じることができると思われる。
原則として、前記の図式は、例えば、検定の感度を改良
または上昇させることを目的とする多重の捕獲および検
出プローブ（プローブセット）で用いることができると
思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１８ＳリボソームＲＮＡを標的とした
本発明の好ましいプローブのヌクレオチド配列をそれら
のランブル鞭毛虫標的ヌクレオチド配列と並列させた代
表的な配列図式である。大腸菌からの１６Ｓリボソーム
ＲＮＡの対応する位置を比較のために示す。ＲＮＡ（標
的）配列は５′〜３′まで記載し、プローブ配列はＤＮ
Ａであり３′〜５′まで記載している。
【図２】図２は、固体支持体、捕獲プローブ、標的ヌク
レオチド配列および検出プローブから成るハイブリッド
形成複合体の略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:90） (72)発明者 アメリア・バーリン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02131，ロズリンデール，タインデー ル・ストリート 96 (72)発明者 デビッド・ジェイ・レーン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，オリオール・ド ライブ ９ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍ
    ｂｌｉａ）の１８Ｓ ｒＲＮＡの標的領域と、０．９Ｍ
    ＮａＣｌ、０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
    ８）、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ4、０．１
    ％ ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フィコ
    ール、０．００２％ＢＳＡおよび０．００２％ポリビニ
    ルピロリドンを含むハイブリダイゼーション溶液中で１
    ４−１６時間、６０℃の温度でインキュベートし、次い
    で、０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔｒｉｓ−
    ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡおよび
    ０．１％ ＳＤＳ中において６０℃で１５分間のハイブ
    リダイゼーション後洗浄を３回行った場合に、前記標的
    領域に特異的にハイブリダイズし、そして非ランブル鞭
    毛虫のｒＲＮＡには、その他は同一の条件下で特異的に
    ハイブリダイズしない核酸プローブであって、ここにお
    いて前記標的領域は以下の： 【化１】 5'-UCACCCGGUCGGCGCGGUCGCGGCGCGCCGAGGGCCCGAC-3' 5'-GCGGGCGCCCGCGGGCGAGCAGCGUGACGCAGCGACGGCCC-3' 5'-CCGCCACGAGGAAACGGGAGCGCUCCAGGCAGGCCCGUUG-3' 5'-CGCGCGAGCGAGGCGGGCCCACAGCCCCCGCCGCGG-3' 5'-CCUGCUAGCCGGACACCGCUGGCAACCCGGCGCCAAGACGUGCGCGCA-3' 5'-GGCCCGUUGGACCCGCCGCGUGGGACCGCGCAGCGGGCGCGGCGCGCC-3'. からなるグループから選択される、前記核酸プローブ。
  2. 【請求項２】以下の： 【化２】 5'-GTCGGGCCCTCGGCGCGCCGCGACCGCGCCGACCGGGTGA-3' 5'-GGGCCGTCGCTGCGTCACGCTGCTCGCCCGCGGGCGCCCGC-3' 5'-CAACGGGCCTGCCTGGAGCGCTCCCGTTTCCTCGTGGCGG-3' 5'-CTCCGCGGCGGGGGCTGTGGGCCCGCCTCGCTCGCGCG-3' 5'-TGCGCGACGTCTTGGCGGCGGGTTGCCAGCGGTGTCCGGCTAGCAGG-3' 5'-GGCGCGCCGCGCCCGCTGCGCGGTCCCACGCGGCGGGTCCAACGGGCC-3' からなるグループから選択される、請求項１に記載の核
    酸プローブ。
  3. 【請求項３】試料中のランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ
    ｌａｍｂｌｉａ）の１８Ｓ ｒＲＮＡの標的領域の存
    在を検出する方法であって、 ａ）前記１８Ｓ ｒＲＮＡの標的領域の存在について分
    析すべき試料を、必要により、試料中に存在する核酸が
    相補的な配列にハイブリダイゼーション可能となるよう
    に処理して、提供し； ｂ）試料を核酸プローブと適度なハイブリダイゼーショ
    ン条件下で接触させ、ここにおいて当該核酸プローブ
    は、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉ
    ａ）の１８Ｓ ｒＲＮＡの標的領域と、０．９Ｍ Ｎａ
    Ｃｌ、０．１２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、６
    ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＰＯ4、０．１％ ＳＤ
    Ｓ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フィコール、
    ０．００２％ＢＳＡおよび０．００２％ポリビニルピロ
    リドンを含むハイブリダイゼーション溶液中で１４−１
    ６時間、６０℃の温度でインキュベートし、次いで、
    ０．０３Ｍ ＮａＣｌ、０．００４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
    ｌ（ｐＨ７．８）、０．２ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％
    ＳＤＳ中において６０℃で１５分間のハイブリダイゼ
    ーション後洗浄を３回行った場合に、前記標的領域に特
    異的にハイブリダイズし、そして非ランブル鞭毛虫のｒ
    ＲＮＡには、その他は同一の条件下で特異的にハイブリ
    ダイズしない核酸プローブであって、ここにおいて前記
    標的領域は以下の： 【化３】 5'-UCACCCGGUCGGCGCGGUCGCGGCGCGCCGAGGGCCCGAC-3' 5'-GCGGGCGCCCGCGGGCGAGCAGCGUGACGCAGCGACGGCCC-3' 5'-CCGCCACGAGGAAACGGGAGCGCUCCAGGCAGGCCCGUUG-3' 5'-CGCGCGAGCGAGGCGGGCCCACAGCCCCCGCCGCGG-3' 5'-CCUGCUAGCCGGACACCGCUGGCAACCCGGCGCCAAGACGUGCGCGCA-3' 5'-GGCCCGUUGGACCCGCCGCGUGGGACCGCGCAGCGGGCGCGGCGCGCC-3' からなるグループから選択される、前記核酸プローブで
    ある；そして ｃ）試料中にランブル鞭毛虫の１８Ｓ ｒＲＮＡの標的
    領域が存在することの指標として特異的ハイブリダイゼ
    ーションを検出することを含む前記方法。
  4. 【請求項４】前記核酸プローブが、以下の： 【化４】 5'-GTCGGGCCCTCGGCGCGCCGCGACCGCGCCGACCGGGTGA-3' 5'-GGGCCGTCGCTGCGTCACGCTGCTCGCCCGCGGGCGCCCGC-3' 5'-CAACGGGCCTGCCTGGAGCGCTCCCGTTTCCTCGTGGCGG-3' 5'-CTCCGCGGCGGGGGCTGTGGGCCCGCCTCGCTCGCGCG-3' 5'-TGCGCGACGTCTTGGCGGCGGGTTGCCAGCGGTGTCCGGCTAGCAGG-3' 5'-GGCGCGCCGCGCCCGCTGCGCGGTCCCACGCGGCGGGTCCAACGGGCC-3' からなるグループから選択される、請求項３に記載の核
    酸プローブ。
  5. 【請求項５】工程ｂ）が、試料を、上記グループから選
    択されるランブル鞭毛虫の１８ＳｒＲＮＡの第二標的領
    域に選択的にハイブリダイズする第二核酸プローブと接
    触させることをさらに含む、請求項３または４に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】一つのプローブが第一標的配列にハイブリ
    ダイズする、末端付加を有する（ｔａｉｌｅｄ）捕捉用
    プローブを含むものであり、もう一方のプローブが標識
    された検出用プローブを含むものであり、そして工程
    ｂ）における条件が、捕捉用プローブ／標的核酸配列検
    出用プローブ複合体を含むハイブリダイゼーション複合
    体の形成に適当である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】以下の工程： ｉ）ランブル鞭毛虫の１８Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも一
    つの標的領域に相補的な核酸配列であり、かつポリヌク
    レオチドテールを有する、少なくとも一つの捕捉用プロ
    ーブ、および、ランブル鞭毛虫の１８Ｓ ｒＲＮＡの少
    なくとも一つの標的領域に相補的な核酸配列である標識
    された検出用プローブを、相補的な核酸配列のハイブリ
    ダイゼーションが生じるのに適当な条件下で用いて、ハ
    イブリダイゼーション複合体を形成させ； ｉｉ）工程ｉ）の生成物を、前記ハイブリダイゼーショ
    ン複合体中に存在する捕捉用プローブのポリヌクレオチ
    ドテールに相補的なポリヌクレオチドを付加させた固体
    支持体と、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーション
    が生じるのに適当な条件下で接触させて、ハイブリダイ
    ゼーション複合体と固体支持体との複合体を形成させ； ｉｉｉ）前記固体支持体を除くことにより、工程ｉｉ）
    の生成物からハイブリダイゼーション複合体と固体支持
    体との複合体を分離し；そして ｉｖ）ハイブリダイゼーション複合体と固体支持体との
    複合体を検出する、ここにおいてハイブリダイゼーショ
    ン複合体と固体支持体との複合体の存在は、試料中に標
    的核酸配列が存在することの指標となるを含む、請求項
    ３ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】プローブが標識された検出用プローブを含
    み、試料が固体支持体に結合される、請求項３または４
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】ａ）適当な固体支持体； ｂ）細胞構造を破壊する薬剤； ｃ）中和溶液； ｄ）プレハイブリダイゼーション溶液；および ｅ）ランブル鞭毛虫の１８Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも一
    つの領域に相補的な核酸配列である少なくとも一つの核
    酸プローブ、ここにおいて前記標的領域は以下の： 【化５】 5'-UCACCCGGUCGGCGCGGUCGCGGCGCGCCGAGGGCCCGAC-3' 5'-GCGGGCGCCCGCGGGCGAGCAGCGUGACGCAGCGACGGCCC-3' 5'-CCGCCACGAGGAAACGGGAGCGCUCCAGGCAGGCCCGUUG-3' 5'-CGCGCGAGCGAGGCGGGCCCACAGCCCCCGCCGCGG-3' 5'-CCUGCUAGCCGGACACCGCUGGCAACCCGGCGCCAAGACGUGCGCGCA-3' 5'-GGCCCGUUGGACCCGCCGCGUGGGACCGCGCAGCGGGCGCGGCGCGCC-3' からなるグループから選択されるを含むキット。
  10. 【請求項１０】前記核酸プローブが、以下の： 【化６】 5'-GTCGGGCCCTCGGCGCGCCGCGACCGCGCCGACCGGGTGA-3' 5'-GGGCCGTCGCTGCGTCACGCTGCTCGCCCGCGGGCGCCCGC-3' 5'-CAACGGGCCTGCCTGGAGCGCTCCCGTTTCCTCGTGGCGG-3' 5'-CTCCGCGGCGGGGGCTGTGGGCCCGCCTCGCTCGCGCG-3' 5'-TGCGCGACGTCTTGGCGGCGGGTTGCCAGCGGTGTCCGGCTAGCAGG-3' 5'-GGCGCGCCGCGCCCGCTGCGCGGTCCCACGCGGCGGGTCCAACGGGCC-3' からなるグループから選択される、請求項９に記載のキ
    ット。
  11. 【請求項１１】適当な固体支持体が、デオキシチミジニ
    ル酸（ｄＴ）またはデオキシアデニル酸（ｄＡ）の長鎖
    ポリマーで被覆されている、請求項９または１０に記載
    のキット。
  12. 【請求項１２】さらに固定溶液を含む、請求項９または
    １０に記載のキット。
  13. 【請求項１３】少なくとも１つの核酸プローブの末端
    が、ポリｄＴおよびポリｄＡから選択されるポリマーを
    付加されている、請求項９ないし１２のいずれか１項に
    記載のキット。
  14. 【請求項１４】少なくとも１つの核酸プローブが、フル
    オレセインで標識されており、当該キットは所望によ
    り、酵素で標識された抗フルオレセイン抗体をさらに含
    み、そしてさらに所望により、前記酵素に適当な基質／
    色原体混合物をさらに含む、請求項９ないし１２のいず
    れか１項に記載のキット。
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