JP3007412B2

JP3007412B2 - がん治療のためのハロゲン化ｄｎａリガンド放射線増感剤

Info

Publication number: JP3007412B2
Application number: JP2505736A
Authority: JP
Inventors: マーチン、ロジャー・フランシス; ケリー、デビッド・パターソン
Original assignee: インナー・アンド・イースタン・ヘルス・ケア・ネットワーク
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 2000-02-07
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: JPH04507399A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、電離放射線または紫外線によってDNA中
の放射線障害（または損傷）を引き起こすハロゲン化DN
Aリガンドのがん治療における利用に関する。さらに具
体的には、この発明はこのリガンドの放射線増感剤とし
ての利用に関する。

放射線増感剤は、照射中に放射線の細胞毒効果を増大
させる物質である。例えば、低酸素性放射線増感剤であ
る、ミソニダゾールはＸ−およびγ−放射線の細胞毒効
果を増強する。多年にわたる研究にもかかわらず、放射
線と放射線増感剤との相互作用は複雑であり、予想する
ことが困難である。さらに、放射線増感剤と放射線の両
方ともそれ自体に細胞毒性があり、治療における利用が
制限される。

光増感剤は、その存在により、紫外線または可視放射
線の細胞毒を増大させる物質である。この明細書中で
は、光増感剤は放射線増感剤の用語中に含まれる。

電離放射線という語は、ここでは結合を解離するに十
分なエネルギーを有する光子、例えば、放射性核からの
α、βおよびγ線、およびｘ−線などを含めて用いる。

BUdRまたはIUdRを用いて、DNA中に臭素またはヨウ素
原子を導入して、DNAを増感させ、電離放射線または紫
外線によって切断することは公知である。増感作用は、
UVによるBUdRまたはIUdR中の炭素−ハロゲン結合の解離
によって生じたウラシリル遊離ラジカルにより伝達さ
れ、この遊離ラジカルは電離放射線によって生産された
水和電子の反応によって形成される。ウラシリル遊離ラ
ジカルが、隣接するヌクレオチド上の２′−デオキシリ
ボース炭素から水素原子を引き抜いて鎖の切断を開始す
ることが提案されている。

本発明者は、DNA−結合ヨードヘキスト33258（４−
［５″−（４−メチルピペラジン−１−イル）−
２″,5′−ビ−1H−ベンズイミダゾール−２′−イル］
フェノール）、すなわち、DNAの小溝中に結合している
配列−選択性DNAリガンドの、UV照射によるDNA鎖の切断
の誘発を検討した。DNA配列ゲル上のフラグメント生成
物の分析により、鎖の切断は、ネオカルシノスタチンに
よる切断と同様に、５′−デオキシリボース−炭素にお
ける水素原子の引き抜きに起因することが判明した。DN
Aリガンドの光分解的脱イオンが小溝中に偶然存在する
炭素−中心遊離ラジカルを残留させ、水素原子を引き抜
き、その結果として鎖の切断をもたらす。

本発明者は、ヨード化DNAリガンドは、近紫外による
細胞死滅の有力な増感剤であることを見出した。リガン
ドがDNAに接合したとき、電離放射線または紫外線の照
射は、実際にDNA上ではないが、DNAの非常に近くに遊離
ラジカルを生じさせることも判明した。ハロゲン化リガ
ンドの結合部位に近いDNAから水素原子を引き抜いた
後、DNAの切断が起こる。今回の結果は、ハロゲン化リ
ガンドは、また電離放射線の増感剤としても作用し得る
ことを示している。紫外線は電離放射線より遊離ラジカ
ルの生成においてはより効果的である。しかしながら、
紫外線は組織通過性が低く、皮相のがんの処置、また
は、例えば骨髄移植前の骨髄の試料中のような、分離さ
れたがん細胞の特定的な死滅にのみに用い得る。

すなわち、この発明の目的の１つは、ハロゲン化DNA
リガンドを含むがん治療用放射線増感剤を提供すること
である。

この発明の目的の他の１つは、DNAまたはその遺伝子
座を電離放射線または紫外線を処理する前にDNAに対す
るハロゲン化DNAリガンドの結合を生起させるかまたは
許容することを含む、放射線障害（または損傷）に対す
るDNAの感受性を増強させる方法を提供することであ
る。

この発明のもう１つの目的は、DNAに対するハロゲン
化DNAリガンドの結合を生起させるかまたは許容し、DNA
と上記結合リガンド、またはその遺伝子座に電離放射線
または紫外線の照射をおこなうことを含む、DNA中に放
射線障害（または損傷）を誘発させる方法を提供するこ
とである。

DNAリガンドは、例えば、アミノアクリジンなどの挿
入リガンド、またはビス−ベンズイミダゾールおよびバ
グレー、V.C.（J.Mol.Cell.Biochem.43:167−181（198
2））に記載の、例えば、下記の構造式を有する、小溝
結合リガンドなどの公知の適当なタイプであれば何でも
よい。

（式中、Ｘはハロゲンである。）このリガンド（とその結合ハロゲン原子）は、飲食細
胞運動または他の手段により、放射線増感剤の細胞中へ
の取り込みを増強させるタイプのものが好ましい。

より好ましい具体例では、小溝結合リガンドは一般
式：（式中、R₁、R₂、R₃、R₄およびR₅は同一または異なっ
て、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ
または任意の他の適当な有害でない置換基からなる群か
ら選ばれ； R₆は、アルキル、フェニル、所望によりハロゲン、ヒ
ドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当
な有害でない置換基により置換されたフェニル、また
は、所望によりハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニ
トロまたは他の適当な有害でない置換基により置換され
ていてもよいフェニルアルキル）を有するハロゲン化ビ
ス−ベンズイミダゾールである。

具体的には、式（Ｉ）の好ましい化合物は、式中、 R₁、R₂、R₃、R₄およびR₅は同一または異なって、水
素、ヒドロキシ、アルコキシ、ヨードおよびブロモから
選ばれ； R₆は、メチル、フェニルまたはフェニルアルキルであ
るようなものが好ましい。

ハロゲン化リガンドは、DNAの糖鎖近傍の位置におい
て、ハロゲンを含まない基が糖鎖中の潜在的標的領域に
十分近くなるように結合するようなものを選ぶのが好ま
しい。

さらに、添付の図面に基づいて、この発明の根拠を示
す。

図１は、プラスミドDNAおよびヨードヘキスト33528の
UV−Ｂ照射混合物の1.7％アガロースゲルを示し；図２は、分画された５′−³²P−末端−標識制限フラ
グメント切断生成物のDNA−配列ゲルを示し；図３は、高分解能（16％アクリルアミド）配列ゲルを
含む実験中に使用したpBR322制限フラグメントを示し；図４は、ヨードヘキストを４μｍの濃度で細胞培地に
添加したときの、UV−Ａ投与量と細胞生存の関係を示
し；図５は、ひとアルファ−DNAのM13クローンに由来する
DNA基質の結合部位の大部分の分析を示す。

実験方法の詳細は、以下の実施例で与えられる。

ヘキスト33258のUVスペクトルは、338nmに吸収極大を
有し、これはDNAへの結合により356nmにシフトする。ビ
ス−ベンズイミダゾールのフェニル環へのヨードの置換
は最大を345nmにシフトする。従ってUV−Ａ（320−400n
m）を、ハロゲン化ヌクレオチド類の吸収にほとんど一
致するUV−Ｂに優先して用いた。

プラスミドDNA及びヨードヘキスト33258の照射は、明
らかにマークしたストランド分裂となり（図１）、これ
は50bp当り1DNAリガンド以下の入力割合で検出可能であ
る。検出不能の分裂が、非置換ヘキスト33258の存在
下、同一用量のUV−ＡでDNAのUV照射により得（示さ
ず）、UV照射のみでも得られた。

同様の結果は式（Ｉ）の以下の化合物で得られた。式
中、 R₁＝R₄＝R₅＝H,R₂＝I,R₃＝OH,R₆＝CH₃; R₁＝R₅＝H,R₂＝R₄＝I,R₃＝OH,R₆＝CH₃; R₁＝R₄＝R₅＝H,R₂＝I,R₃＝OCH₃,R₆＝CH₃; R₁＝R₅＝H,R₂＝R₄＝I,R₃＝OCH₃,R₆＝CH₃;および R₁＝R₃＝R₄＝R₅＝H,R₂＝Br,R₆＝CH₃. ストランド切断をより詳細に分析するため、５′−³²
P−末端標識化制限断片を用い、そして、切断生成物をD
NA−シーケシングゲル上で分別した。図２に示すよう
に、これらの実験は、UV−誘発切断が、DNAに沿って、
常に３又はそれ以上の連続AT塩基対よりなるリガンド結
合部位のちょうど、３′側に不連続部位にあったことを
示した。切断の程度は一般にヨード化リガンドのより高
濃度と共に増加したが、20μＭで（μMDNAbpに比べ）よ
り一般的な切断が現れた。ヒトアルファ−DNAのM13クロ
ーンから誘導されたDNA置換分との実験は、数多くの結
合部位の、又、全てのより強い切断部位について分析を
可能にし、切断は指示結合部位の３′−末端で起きた。
結果は、図５に示す。

光分解切断のメカニズムのより詳細な評価は、100bpp
BR322制限断片末端標識化３′又５′を断片のいずれか
の末で用い（図３）、より高い分解（16％アクリルアミ
ド）での実験から得た。５′−標識化標的DNAで、切断
の部位はリガンド結合に対し常に３′で、切断生成物の
可動性は、マキシマム−ギルバードシーケシングトラ
ックにおける対応バンドと一致し、光分解試料であるか
どうかにかかわらず、熱ピペリジンで処理する。一方、
状況は３′−標識化標的DNA断片との実験にとりより複
雑であった。主要３′−標識化断片種は、常に５′−標
識化データから予期したよりも約２ヌクレオチド長く、
その可動性は時々、「隣接」マキシマム−ギルバートバ
ンドと異なった。

別法として、熱ピペリジンによる光分解試料の処理
は、主要種を短かくし、切断部位の同一ヌクレオチドへ
の結合は、対応５′−標識化実験に見られた。さらにピ
ペリジン処理３′−標識化種の可動性はマキシマム−ギ
ルバートバンドと一致した。この可動性のパターンはDN
Aのネオカルシノスタチン切断に記載されたものと正に
同じである。

広範囲な研究により、ネオカルシノスタチン中のフリ
ーラジカル種は、デオキシリボースの５′−炭素から水
素原子を除くこと、又、その炭素での続く酸化の結果、
５′−炭素アルデヒドと３′−ホスホリルの末端をスト
ランド切断することを示した。続くピペリジン処理によ
り５′−ホスホリル基を放つ塩基−糖アルデヒドを除
く。

ヨードヘキスト33258光分解は、炭素−ヨード結合の
光分解及び次いで５′−炭素から水素原子を除く。DNA
リガンド上の炭素中心フリーラジカルの形成により開始
する。類似の切断メカニズムを含むことが結論づけられ
る。

殺細胞作用の研究により、ヨードヘキストも本来有効
な感光薬であることを示した。DNAリガンドを媒体に４
μＭの濃度に加えると、照射は、感光薬の不存在でぎり
ぎりに細胞生存を減するUV−Ａ用量で３−４対数細胞死
滅となる（図４）。細胞死滅はDNA標準切断により伝達
する。

上記結果及び実験手順の詳細は、以下の非限定実施例
に示される。

以下の略語を用いる。

PBS リン酸緩衝食塩水 EDTA エチレンジアミン四酢酸実施例１（図１） 20μｌの5mMトリス（pH7.5）/20mM NaCl/1mMEDTA
中、PBR322DNA（１μｇ）及び種々の量のHPLC−精製ヨ
ードヘキスト33258の混合物を、開口1.5mlエッペンドル
フ管中、UV−Ａランプ下、75μWcm^-2の測定フルエンス
（UVX−36 デテクター付UVラジオメーター、U.V.プロ
ダクト、カリフォルニア、ユーエスエイ）で20分間照射
した。試料をエチジウムグロミド含有1.7％アガロース
ゲル上で分別した。コントロール試料（レーン１及び
３）は、照射せず暗所に保った。別のコントロールは照
射したがヨードヘキストを含まなかった（レーン２）。
試料中の最終ヨードヘキスト濃度は１μＭ（レーン
４）、５μＭ（レーン３及びレーン５）及び20μＭ（レ
ーン６）であった。

実施例２（図２） EcoR1−Cut pBR322DNAを５′−³²P−末標識化し、Ba
mHl及び準備ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離した375bp標識化断片でカットした。標識化断片の試
料をキヤリヤ−DNA及びヨードヘキスト33258を混合し、
実施例１に記載したように光分解した。ヨードヘキスト
の最終濃度は１μＭ（レーン１）2.5μＭ（レーン４）
及び５μＭ（レーン２及び５）、10μＭ（レーン６）、
20μＭ（レーン７）及び40μＭ（レーン８）であった。

そろった量の³²Pを伴う試料をついて16％ポリアクリ
ルアミドシーケシングゲル上で分析した。レーン１及び
２の試料は照射しないコントロールでレーン８はマキシ
マム−ギルバートＧ＋Ａトラックであった。

実施例３（図３）末端標識化制限断片はpBR322から誘導した。375bP断
片はEcoRl部位での３′−又は５′−³²P末端ラベリング
により調製し、次いでBamHlで切断し次いで準備ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離した。同様に、10
0bP断片をHindlV部位での末端−ラベリング、続くDde I
による切断及び準備電気泳動により得た。４つの標識化
断片の各々の試料をキャリヤ−DNAと混合し、実施例１
に記載したように５μＭヨードヘキスト33258とUV−Ａ
光分解に付した。次いで試料を実施例１のようにマキシ
マム−ギルバートシーケシング試料と共に16％シーケシ
ングゲル上で分析した。ある場合は（点を付したpi
p⁺）、光分解試料をシーケシングゲル分析の前に1Mピペ
リジンで90℃で30分間処理に付した。矢印は、マキシマ
ム−ギルバート引用バンドに相対的な光分解切断の部位
を示す。バンドの強さは顕著に変化する星印の矢は特に
弱い部位を示す。pBR322ヌクレオチド配列中のpb数を示
し、配列は各数でゼロにそろえる。

実施例４（図４） 25cm²プラスチックフラスコ中、10％ウシ胎児血清を
伴う5mlアルファMEM中の中対数（Mid−log）相V79細胞
を暗所で４μｍヨードヘキスト33258（HPLC精製）と２
時間37℃でインキュベートし、次いで氷上で30分間冷却
した。UV−Ａ照射の間、培養物を氷上で保った。フラス
コを上から照射した。フラス及び媒体を経てアテニュエ
イション後、一層に分配した線量率を約50μWcm^-2に計
算した。適当な照射時間（０−20分）後、フラスコを黒
色粘着性ビニルで覆い、氷冷PBS/EDTAで二回洗浄し、2m
l0.01％プロナーゼと懸濁した。細胞懸濁液の一部をBSS
で２回洗い、試料をコールターカウンター内でカウント
し、種々のアリコットを50mmブラスチックペトリ皿に塗
布した（nlate−out）。７日後コロニーを固定、染色
し、750細胞のコロニーを数えた。コントロールクロー
ニング効率（＞60％）を処理細胞の相対的クローニング
効率を計算するのに用いた。示すデータは４つの別々の
実験から導かれ、異なる符号により示す。開口符号はヨ
ードヘキスト33258のないコントロールを描く。

実施例（図５） M13mp9中ヒトアルファR₁−DNAの340dp挿入を含むクロ
ーンアルファ32を以下に記載のように有効に５′−末端
標識化し、実施例１に記載のように有効にヨードヘキス
ト33258の存在下UV照射した。DNAシーケシングゲルのオ
ートラジオグラフをレーザー密度計測により分析し、障
害部位を非常に強い（VS）、強い（Ｓ）又はメディウム
（Ｍ）として示した。DNA配列は５′ないし３′、左な
いし右で示す。図５において切断部位は、下線を引き、
その位置はDNA配列の左に与える。ヨードヘキスト33258
結合部位は大文字である。

有効５′−末端ラベリングM13クローンアルファ32の
手順は、広く〔³²p〕dATP、dGTP及びdCTPを伴うp17bpシ
ーケシングプライマー（これは５′末端で合成ストラン
ドを有効に標識する）後、DNAを有効に短時間標識する
ラベリングを含む。これは続いて冷dATP及びdTTPによる
追跡が起こり、そして結果として3000bpより大きなDNA
広範な生成となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケリー、デビッド・パターソンオーストラリア連邦3136 ビクトリア、カンタベリー、プロスペクト・ヒル・ロード 146番 (56)参考文献ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＣｈｅｍｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（1978），22［３］，ｐ629〜632 ＴＨＥＭＥＲＣＫＩＮＤＥＸ, （1983）ＴＥＮＴＨ，ＥＤＩＴＩＯＮ, 7946．ＱｕｉｎａｃｒｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅの項ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ87：193904（1977) ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ86：183120（1977) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 41/00 C07H 21/04 G01N 33/53 G01N 33/534 ＷＰＩＬ（ＤＥＲＷＥＮＴ) ＣＡＯＮＬＩＮＥ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ハロゲン化DNA小溝結合リガンドを含む、
がん治療用放射線増感剤。
【請求項２】ハロゲン化DNA小溝結合リガンドがハロゲ
ン化ビスベンズイミダゾール化合物である、請求項１記
載の放射線増感剤。
【請求項３】ハロゲン化ビスベンズイミダゾール化合物
が、一般式：〔式中、R₁、R₂、R₃、R₄およびR₅は、同一または異なっ
て、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ
および任意の他の有害でない置換基から選ばれ、R₆はア
ルキル、フエニル、所望によりハロゲン、ヒドロキシ、
アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の有害でない置換
基で置換されたフエニル、フエニルアルキル、または所
望によりハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロも
しくは任意の他の有害でない置換基で置換されたフエニ
ルアルキルである。〕で示されるものである、請求項２記載の放射線増感剤。
【請求項４】一般式（Ｉ）において、R₁、R₂、R₃、R₄お
よびR₅が、同一または異なって、水素、ヒドロキシ、ア
ルコキシ、ヨートおよびブロモから選ばれ、R₆がメチ
ル、フエニルまたはフエニルアルキルである、請求項３
記載の放射線増感剤。
【請求項５】ハロゲン化DNA小溝結合リガンドが、DNAの
糖鎖近傍の位置において、ハロゲンを含まない基が糖鎖
中の潜在的標的領域に充分近くなるように結合する、請
求項１〜４のいずれか記載の放射線増感剤。
【請求項６】DNAまたはその座を放射線で処理する前にD
NAに対するハロゲン化DNA小溝結合リガンドの結合を生
起させて、放射線障害または損傷に対するDNAの感受性
を高めるために使用する、請求項１〜５のいずれか記載
の放射線増感剤。
【請求項７】放射線が電離放射線または紫外線である、
請求項１〜６のいずれか記載の放射線増感剤。