JPH04507399A - がん治療のためのハロゲン化ｄｎａリガンド放射線増感剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 がん治療のためのハロゲン化ＤＮＡリガンド放射線増感剤この発明は、電離放射 線または紫外線によってＤＮＡ中の放射線障害を引き起こすハロゲン化ＤＮＡリ ガンドのかん治療における利用に関する。さらに具体的には、この発明はこのリ ガンドの放射線増感剤としての利用に関する。

放射線増感剤は、照射中に放射線の細胞毒効果を増大させる物質である。例えば 、低酸素性放射線増感剤である、ミソニダゾールはＸ−およびγ−放射線の細胞 毒効果を増強する。多年にわたる研究にもかかわらず、放射線と放射線増感剤と の相互作用は複雑であり、予想することが困難である。さらに、放射線増感剤と 放射線の両方ともそれ自体に細胞毒性があり、治療における利用が制限される。

光増感剤は、その存在により、紫外線または可視放射線の細胞毒を増大させる物 質である。この明細書中では、光増感剤は放射線増感剤の用語中に含まれる。

電離放射線という語は、ここでは結合を解離するに十分なエネルギーを有する光 子、例えば、放射性核からのσ、βおよびγ線、およびＸ−線などを含めて用い る。

ＢＵｄＲまたはＩＵｄＲを用いて、ＤＮＡ中に臭素またはヨウ素原子を導入して 、ＤＮＡを増感させ、電離放射線または紫外線によって切断することは公知であ る。増感作用は、ＵＶによるＢＵｄＲまたはＩＵｄＲ中の炭素−ハロゲン結合の 解離によって生じたウラシリル遊離ラジカルにより伝達され、この遊離ラジカル は電離放射線によって生産されｔ；水和電子の反応によって形成される。ウラシ リル遊離ラジカルが、隣接するヌクレオチド上の２″−デオキシリボース炭素か ら水素原子を引き抜いて鎖の切断を開始することが提案されている。

本発明者は、ＤＮＡ−結合ヨードヘキスト３３２５ｇ　（４−［５”−（４°° ′−メチルピペラジン−１″′−イル）−２”、５’−ビーＬＨ−ベンズイミダ ゾール−２＃−イル］フェノール）、すなわち、ＤＮＡの小溝中に結合している 配列−選択性ＤＮＡリガンドの、ＵＶ照射ＪこよるＤＮＡ鎖の切断の誘発を検討 した。ＤＮＡ配列ゲル上の７ラグメント生成物の分析により、鎖の切断は、ネオ カルジノスタチンによる切断と同様に、５′−デオキシリポース−炭素における 水素原子の引き抜きに起因することが判明した。ＤＮＡリガンドの光分解的脱イ オンが小溝中に偶然存在する炭素−中心遊離ラジカルを残留させ、水素原子を引 き抜き、その結果として鎖の切断をもたらす。

本発明者は、ヨード化ＤＮＡリガンドは、近紫外による細胞死滅の有力な増感剤 であることを見出した。リガンドがＤＮＡに接合したとき、電離放射線または紫 外線の照射は、実際にＤＮＡ上ではないが、ＤＮＡの非常に近くに遊離ラジカル を生じさせることも判明した。ハロゲン化リガンドの結合部位に近いＤＮＡから 水素原子を引き抜いた後、ＤＮＡの切断が起こる。今回の結果は、ハロゲン化リ ガンドは、また電離放射線の増感剤としても作用し得ることを示している。紫外 線は電離放射線より遊離ラジカルの生成においてはより効果的である。しかしな がら、紫外線は組織通過性が低く、皮相のがんの処置、または、例えば骨髄移植 前の骨髄の試料中のような、分離されたかん細胞の特定的な死滅にのみに用い得 る。

すなわち、この発明の目的の１つは、ハロゲン化ＤＮＡリガンドを含むがん治療 用放射線増感剤を提供することである。

この発明の目的の他の１つは、ＤＮＡまたはその遺伝子座を電離放射線または紫 外線を処理する前にＤＮＡに対するハロゲン化ＤＮＡリガンドの結合を生起させ るかまたは許容することを含む、放射線障害に対するＤＮＡの感受性を増強させ る方法を提供することである。

この発明のもう１つの目的は、ＤＮＡに対するハロゲン化ＤＮＡリガンドの結合 を生起させるかまたは許容し、ＤＮＡと上記結合リガンド、またはその遺伝子座 に電離放射線または紫外線の照射をおこなうことを含む、ＤＮＡ中に放射線障害 を誘発させる方法を提供することである。

ＤＮＡリガンドは、例えば、アミノアクリジンなどの挿入リガンド、またはビス −ベンズイミダゾールおよびバグレー、Ｖ、Ｃ，（Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、４３　：１６７−１８１　（１９８２）　）に記載の、例えば、下 記の構造式を有する、小溝結合リガンドなどの公知の適当なタイプであれば何で もよい。

Ｈ３ （式中、Ｘはハロゲンである。） このリガンド（とその結合ハロゲン原子）は、飲食細胞運動または他の手段によ り、放射線増感剤の細胞中への取り込みを増強させるタイプのものが好ましい。

より好ましい具体例では、小溝結合リガンドは一般式：（式中、Ｒ□、Ｒ２、Ｒ １、Ｒ６およびＲ３は同一または異なって、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アル コキシ、ニトロまたは任意の他の適当な有害でない置換基からなる群から選ばれ ；Ｒ５は、アルキル、フェニル、所望によりハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ 、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置換基により置換されたフェニル 、または、所望によりハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロまたは他の適 当な有害でない置換基により置換されていてもよいフェニルアルキル）を有する ハロゲン化ビス−ベンズイミダゾールである。

具体的には、式（１）の好ましい化合物は、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１、Ｒ４およ びＲ６は同一または異なって、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ヨードおよびブ ロモから選ばれ；Ｒ６は、メチル、フェニルまたはフェニルアルキルであるよう なものが好ましい。

ハロケン化リガンドは、ＤＮＡの糖鎖近傍の位置において、ハロゲンを含まない 基が糖鎖中の潜在的標的領域に十分近くなるように結合するようなものを選ぶの が好ましい。

さらに、添付の図面に基づいて、この発明の根拠を示す。

図１は、プラスミドＤＮＡおよびヨードヘキスト３３５２８のＵＶ−Ｂ照射混合 物の１．７％アガロースゲルを示し；図２は、分画された５’　３２Ｐ−末端− 標識制限フラグメント切断生成物のＤＮＡ−配列ゲルを示し： 図３は、高分解能（１６％アクリルアミド）配列ゲルを含む実験中に使用したｐ ＢＲ３２２制限フラグメントを示し：図４は、ヨードヘキストを４μｍの濃度で 細胞培地に添加したときの、ＬＩＶ−Ａ投与量と細胞生存の関係を示し；図５は 、ひとアルファーＤＮＡのＭ１３クローンに由来するＤＮＡ基質の結合部位の大 部分の分析を示す。

実験方法の詳細は、以下の実施例で与えられる。

ヘキスト３３２５８のＵＶスペクトルは、３３８ｎｍに吸収極大を有し、これは ＤＮＡへの結合により３５６ｎｍにシフトする。ビス−ベンズイミダゾールのフ ェニル環へのヨードの置換は最大を３４５ｎｍにシフトする。従ってＵＶ−Ａ　 （３２０−４００ｎｍ）を、ハロゲン化ヌクレオチド類の吸収にほとんど一致す るＵＶ−Ｂに優先して用いた。

プラスミドＤＮＡ及びヨードヘキスト３３２５８の照射は、明らかにマークした ストランド分裂となり（図１）、これは５０ｂｐ当り１ＤＮＡリガンド以下の入 力割合で検出可能である。検出不能の分裂が、非置換へキスｌ−３３２５８の存 在下、同一用量のＵＶ−ＡでＤＮＡのＵＶ照射により得（示さず）、ＵＶ照射の みでも得られた。

同様の結果は式（１）の以下の化合物で得られた。式中、Ｒ１−Ｒ４−Ｒ６−Ｈ ，Ｒ，−１，Ｒ３＝ＯＨ，Ｒ，−ＣＨ，；Ｒ，−Ｒａ−Ｈ，Ｒ，−Ｒ，−１，Ｒ ，−ＯＨ，Ｒａ−ｃＨｓ；Ｒ，−Ｒ，−Ｒ６−Ｈ，Ｒ２−１，Ｒ３−０ＣＨ３， Ｒ，−ＣＨ，ｉＲ１＝Ｒｓ＝Ｈ，Ｒｘ＝Ｒ−Ｉ、Ｒａ＝ＣＨ５，Ｒａ＝ＣＨ５； およびＲａ−Ｒｘ−Ｒａ−Ｒｓ＝Ｈ，Ｒｘ−Ｂｒ、Ｒａ＝ＣＨ５゜ストランド切 断をより詳細に分析するため、５　＝　−３１ｐ−末端標識化制限断片を用い、 そして、切断生成物をＤＮＡ−シーケンングゲル上で分別した。図２に示すよう に、これらの実験は、ＵＶ−誘発切断が、ＤＮＡに沿って、常に３又はそれ以上 の連続ＡＴ塩基対よりなるリガンド結合部位のちょうど、３′側に不連続部位に あったことを示した。切断の程度は一般にヨード化リガンドのより高濃度と共に 増加したが、２０μＭで（μＭＤＮＡｂｐに比べ）よリ一般的な切断が現れた。

ヒトアルファーＤＮＡのＭ１３クローンから誘導されたＤＮＡ置換分との実験は 、数多くの結合部位の、又、全てのより強い切断部位について分析を可能にし、 切断は指示結合部位の３′−末端で起きた。結果は、図５に示す。

光分解切断のメカニズムのより詳細な評価は、１ｏＯｂｐｐＢＲ３２２制限断片 末端標識化３′又５′を断片のいずれかの末で用い（図３）、より高い分解（１ ６％アクリルアミド）での実験から得ｔ；。

５′−標識化標的ＤＮＡで、切断の部位はりガン・ド結合に対し常に３゛で、切 断生成物の可動性は、マキシマム−ギルバート　シーケシングトラックにおける 対応バンドと一致し、光分解試料であるかどうかにかかわらず、熱ピペリジンで 処理する。一方、状況は３′−標識化機的ＤＮＡ断片との実験にとりより複雑で あっＩ；。主要３″−標識化データは、常に５′−標識化データから予期したよ りも約２ヌクレオチド長く、その可動性は時々、「隣接」マキシマム−ギルバー トバンドと異なった。

別法として、熱ピペリジンによる光分解試料の処理は、主要種を短かくし、切断 部位の同一ヌクレオチドへの結合は、対応５゛−標識化実験に見られた。ざらに ピペリジン処理３′−標識化種の可動性はマキシマム−ギルバートバンドと一致 した。この可動性のパターンはＤＮＡのネオカルジノスタチン中断に記載された ものと正に同じである。

広範囲な研究により、ネオカルジノスタチン中のフリーラジカル種は、デオキシ リポースの５′−炭素から水素原子を除くこと、又、その炭素での続く酸化の結 果、５′−炭素アルデヒドと３′−ホスホリルの末端をストランド切断すること を示した。続くピペリジン処理により５′−ホスホリル基を放つ塩基−糖アルデ ヒドを除く。

ヨードベキスト３３２５８光分解は、炭素−ヨード結合の光分解及び次いで５′ −炭素から水素原子を際く。ＤＮＡリガンド上の炭素中心フリーラジカルの形成 により開始する。類似の切断メカニズムを含むことが結論づけられる。

殺細胞作用の研究により、ヨードヘキストも本来有効な感光薬であることを示し た。ＤＮＡリガンドを媒体に４μＭの濃度に加えると、照射は、感光薬の不存在 できりぎりに細胞生存を減するＵＶ−入用量で３−４対数細胞死滅となる（図４ ）。細胞死滅はＤＮＡ標準切断により伝達する。

上記結果及び実験手順の詳細は、以下の非限定実施例に示される。

以下の略語を用いる。

ＰＢＳ　リン酸緩衝食塩水 ＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 実施例１（図１） ２０、ｕ＋２１の５ｍＭトリス（ｐＦ（７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣＩ／１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ＰＢＲ３２２ＤＮＡ　（１２ｇ）及び種々の量のＨＰＬＣ−精製ヨ ードヘキスト３３２５８の混合物を、開口１．５ｍＱエツペンドル７管中、ＵＶ −Ａランプ下、７５　／ＪＷＣｍ−”の測定フルエンス（ＵＶＸ−３６デテクタ ー付ＵＶラジオメーター、Ｕ、Ｖ、７’ロダクト、カリフォルニア、ニーニスエ イ）で２０１ｆｉ照射した。試料をエチジウムダロミド含有１．７％アガロース ゲル上で分別した。コントロール試料（レーン１及び３）は、照射せず暗所に優 った。別のコントロールは照射したがヨードヘキストを含まなかっｔ；（レーン ２）。試料中の最終ヨードヘキスト濃度は１μＭ（レーン４）、５μＭ（レーン ３及びレーン５）及び２０ｐＭ（レーン６）であった。

実施例２（図２） ＥｃｏＲｌ−Ｃ，ｕｔ　ｐＢＲ３２２ＤＮＡを５’　３２ｐ−未標識化し、Ｂａ ｍＨｌ及び準備ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した３７５ｂｐ標識 化断片でカントした。標識化断片の試料をキャリヤーＤＮＡ及びヨードヘキスト ３３２５８を混合し、実施例１に記載したように光分解した。ヨードヘキストの 最終濃度は１μＭ（レーンｌ）２．５μＭ（レーン４）及び５μＭ（レーン２及 び５）、ＩＯμＭ（レーン６）、２０ｐＭ（レーン７）及び４０ｐＭ（レーン８ ）であった。

そろった量の１２ｐを伴う試料をついて１６％ポリアクリルアミドシーケシング ゲル上で分析した。レーン１及び２の試料は照射しないコントロールでレーン８ はマキンマムーギルバートＧ＋Ａトラックであった。

実施例３（図３） 末端標識化制限断片はｐＢＲ３２２から誘導した。３７５ｂＰ断片はＥｃｏＲ１ 部位での３゛−又は５’　１２ｐ末端ラベリングにより調製し、次いでＢａｍＨ ｌで切断し次いで準備ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。同様に 、１００ｂＰ断片をＨｉｎｄＩＶ部位での末端−ラベリング、続＜Ｄｄｅｌによ る切断及び準備電気泳動により得た。４つの標識化断片の各々の試料をキャリヤ ーＤＮＡと混合し、実施例１に記載したように５μＭヨードヘキスト３３２５８ とＵＶ−Ａ光分解に付した。次いで試料を実施例１のようにマキシマムーギルバ ートシーケシング試料と共に１６％ンーケシングゲル上で分析した。ある場合は （点を付したｐｉｐっ、光分解試料をシーケシングゲル分析の前に１Ｍピペリジ ンで９０℃で３０分間処理に付した。矢印は、マキンマムーギルバート引用バン ドに相対的な光分解切断の部位を示す。バンドの強さは顕著に変化する星印の矢 は特に弱い部位を示す。ｐＢＲ３２２ヌクレオチド配列中のｐｂ数を示し、配列 は各般でゼロにそろえる。

実施例４（図４） ２５ｃｍ２プラスチツクフラスコ中、ｌＯ％ウシ胎児血清を伴う５ｍ＋２アルフ アＭＥＭ中の中対数（Ｍ　ｉｄ−１ｏｇ）相Ｖ７９細胞を暗所で４．ｕｍヨード ヘキスト３３２５８　（ＨＰＬＣ精製）と２時間３７℃でインキュベートし、次 いで氷上で３０分間冷却した。ＵＶ−Ａ照射の間、培養物を氷上で保った。フラ スコを上から照射した。プラス及び媒体を経てアテニュエインヨン後、一層に分 配した線量率を約５０　ｐ　Ｗｃｍ−’に計算した。適当な照射時間（０−２０ 分）後、フラスコを黒色粘着性ビニルで覆い、氷冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡで二回洗浄 シ、２ｍ（２０，０１％プロナーゼと懸濁した。細胞懸濁液の一部をＢＳＳで２ 回洗い、試料をコールタ−カウンター内でカウントし、種々のアリコツトを５０ ｍｍプラスチックペトリ皿に塗布した（ｎｌａｔｅ−ｏｕｔ）　ａ　７口径コロ ニーを固定、染色し、７５０細胞のコロニーを数えた。コントロールクローニン グ効率（〉６０％）を処理細胞の相対的クローニング効率を計算するのに用いた 。示すデータは４つの別々の実験から導かれ、異なる符号により示す。開口符号 はヨードヘキスト３３２５８のないコントロールを描く。

実施例５（図５） Ｍ１３ｍｐ９中とトアルフｙＲ１ＤＮＡの３４０ｄｐ挿入を含むクローンアルフ ァ３２を以下に記載のように有効に５′−末端標識化し、実施例１に記載のよう に有効にヨードヘキスト３３２５８の存在下ＵＶ照射した。ＤＮＡシーケシング ゲルのオートラジオグラフをレーザー密度計測により分析し、障害部位を非常に 強い（ＶＳ）、強い（Ｓ）又はメディウム（Ｍ）として示した。ＤＮＡ配列は５ ′ないし３′、左ないし右で示す。図５において切断部位は、下線を引き、その 位置はＤＮＡ配列の左に与える。ヨードベキスト３３２５８結合部位は大文字で ある。

有効５′−末端ラベリングＭ１３クローンアルファ３２の手順は、広＜　（”ｐ 〕ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを伴うｐ１７ｂｐシーケシングプライマー（ これは５′末端で合成ストランドを有効に標識する）後、ＤＮＡを有効に短時間 標識するラベリングを含む。

これは続いて冷ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰによる追跡が起こり、そして結果として３ ｏｏｏｂｐより大きなりＮＡ広範な生成となる。

ＵＶ−Ａ−＋　−＋　＋　＋ ＦＩｏ　１ ＢＩ　Ｃ５ＴＩ　Ｔ２−５　Ｔ５　ＴＩＯＴ２ＯＧ＋ＡＰＩＣＵＲＥ　２ クローン化しｔ二ひとアルファＤＮＡにおけるＵＶ／ヨードヘキスト開製部製部 位３２／３３　ｔｇテ丁エエｏａ　Ｓ　１９１　ｅｏ？丁τ鳳ｔ　３７Ｂ　ｔＡ Ａ４ｅａ　３　２２７　ｏａ丁丁丁５Ｌｔ　Ｎ８８／８９　ｔｏτ丁ττ工ｊｅ ｔ　！３　２３２ｔＯ丁丁丁丁！奉　マＳ９Ｔ　ｔｇＴＡＡ？τ工ｇｏ　Ｍ　２ ４５　＠ｇ？ＴＡＨｇ　Ｎ１１２　ｍｇＡ丁ττＨａ　３　２５０　ｇｇＡＡＡ ｏａ　Ｎ１２２　ｇｏ？？Ｔ１＠ＶＳ　２６０　ＬｇＴＴＴｌｔ　５１３１／１ ３２　ｔｏムムＴｇ　３　２６５ｇｔＡＡＪ１１ｔ　Ｍ１句Ｏ畠８ＡＡムムｇ　 Ｓ　２８２　ｇｇムτ＾丁丁’５ＬＪＩ　Ｎ１５７　ｏｃ＋ＴＡＴＡ１ａ　Ｎ　 ３１０　ＫｇムムａｃＪ　５１６０／１６１　ａｇＡＡＡｃｔ　Ｍ　３１ａ　ｇ ｉｌ１丁丁τｏｔ　５ＩＴ２　ａｇＡＡＴｌｍ　Ｂ　！’Ｔ　ｇｏＡＴＡ？丁ム τｇｏ　５１７６　＊ｇ轟τ丁１６　Ｓ　３ＪＩＪｌ　ａｇＡＡＴ工ｏ　Ｍ国際 調査報告 Ｎ電在ズＴＯ１正ｎ打ロＣ＆實α込り交λに？Ｒ口にＦＴＣＮＤａυ世込’ＩＴ （Ｎ’Ｊ、ＡＰＰＬ工ＣＡＴＩ（Ｎ　Ｎｏ、Ｉ’ｌ　ＡＵＥｌｌ）　ＯＦ　Ｗ任 ■

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハロゲン化ＤＮＡリガンドを含む、がん治療用放射線増感剤。
2. （２）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化挿入リガンドである、請求項１記 載の放射線増感剤。
3. （３）ハロゲン化挿入リガンドがハロゲン化アミノアクリジン化合物である、請 求項２記載の放射線増感剤。
4. （４）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化小溝結合リかンドである、請求項 １記載の放射線増感剤。
5. （５）ハロゲン化小溝結合リガンドがハロゲン化ビスベンズイミダゾール化合物 である、請求項４記載の放射線増感剤。
6. （６）ハロゲン化ビスベンズイミダゾールが、一般式▲数式、化学式、表等があ ります▼（Ｉ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異な って、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロまたは任意の他の適当 な有害でない置換基から選ばれ、Ｒ６はアルキル、フェニル、所望によりハロゲ ン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置換 基で置換されたフェニル、フェニルアルキル、または所望によりハロゲン、ヒド ロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置換基で置換 されたフェニルアルキルである〕 で示される、請求項５記載の放射線増感剤。
7. （７）式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、同一 または異なって、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ヨードおよびプロモから選ば れ、Ｒ６がメチル、フェニルまたはフェニルアルキルである、請求項６記載の放 射線増感剤。
8. （８）ハロゲン化リガンドが、ＤＮＡの糖鎖近傍の位置において、ハロゲンを含 まない基が糖鎖中の潜在的標的領域に充分近くなるように結合する、上記請求項 の何れか１項記載の放射線増感剤。
9. （９）ＤＮＡまたはその座を電離放射線または紫外線で処理する前にＤＮＡに対 するハロゲン化ＤＮＡリガンドの結合を生起させるかまたは許容することを含む 、放射線障害に対するＤＮＡの感受性増強方法。
10. （１０）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化挿入リガンドである、請求項９ 記載の方法。
11. （１１）ハロゲン化挿入リガンドがハロゲン化アミノアクリジン化合物である、 請求項１０記載の方法。
12. （１２）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化小溝結合リガンドである、請求 項９記載の方法。
13. （１３）ハロゲン化小溝結合リガンドがハロゲン化ビスベンズイミダゾール化合 物である、請求項１２記載の方法。
14. （１４）ハロゲン化ビスベンズイミダゾールが、一般式▲数式、化学式、表等が あります▼（Ｉ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異 なって、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロまたは任意の他の適 当な有害でない置換基から選ばれ、Ｒ６はアルキル、フェニル、所望によりハロ ゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置 換基で置換されたフェニル、フェニルアルキル、または所望によりハロゲン、ヒ ドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置換基で置 換されたフェニルアルキルである〕 で示される、請求項１３記載の方法。
15. （１５）式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、同 一または異なって、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ヨードおよびプロモから選 ばれ、Ｒ６がメチル、フェニルまたはフェニルアルキルである、請求項１４記載 の方法。
16. （１６）ハロゲン化リガンドが、ＤＮＡの糖鎖近傍の位置において、ハロゲンを 含まない基が糖鎖中の潜在的標的領域に充分近くなるように結合する、請求項９ −１５の何れか１項記載の方法。
17. （１７）ＤＮＡに対するハロゲン化ＤＮＡリかンドの結合を生起させるかまたは 許容し、結合リガンドまたはその座を電離放射線または紫外線で処理することを 含む、ＤＮＡにおける放射線障害誘導法。
18. （１８）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化挿入リガンドである、請求項１ ７記載の方法。
19. （１９）ハロゲン化挿入リガンドがハロゲン化アミノアクリジン化合物である、 請求項１８記載の方法。
20. （２０）ハロゲン化ＤＮＡリガンドがハロゲン化小溝結合リガンドである、請求 項１７記載め方法。
21. （２１）ハロゲン化小溝結合リガンドがハロゲン化ビスベンズイミダゾール化合 物である、請求項２０記載の方法。
22. （２２）ハロゲン化ビスベンズイミダゾールが、一般式▲数式、化学式、表等が あります▼（Ｉ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異 なって、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロまたは任意の他の適 当な有害でない置換基から選ばれ、Ｒ６はアルキル、フェニル、所望によりハロ ゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置 換基で置換されたフェニル、フェニルアルキル、または所望によりハロゲン、ヒ ドロキシ、アルコキシ、ニトロもしくは任意の他の適当な有害でない置換基で置 換されたフェニルアルキルである〕 で示される、請求項２１記載の方法。
23. （２３）式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、同 一または異なって、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ヨードおよびプロモから選 ばれ、Ｒ６がメチル、フェニルまたはフェニルアルキルである、請求項２２記載 の方法。
24. （２４）ハロゲン化リガンドが、ＤＮＡの糖鎖近傍の位置において、ハロゲンを 含まない基が糖鎖中の潜在的標的領域に充分近くなるように結合する、請求項１ ７−２３の何れか１項記載の方法。