JP2997042B2 - ポリオウイルスの細胞受容体をコードするゲノム及びｃＤＮＡ配列の分子クローニング - Google Patents
ポリオウイルスの細胞受容体をコードするゲノム及びｃＤＮＡ配列の分子クローニングInfo
- Publication number
- JP2997042B2 JP2997042B2 JP2505086A JP50508690A JP2997042B2 JP 2997042 B2 JP2997042 B2 JP 2997042B2 JP 2505086 A JP2505086 A JP 2505086A JP 50508690 A JP50508690 A JP 50508690A JP 2997042 B2 JP2997042 B2 JP 2997042B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- picornavirus
- poliovirus
- receptor
- cell
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 title claims description 86
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title description 61
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 63
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 claims abstract description 62
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 46
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 139
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 63
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 102220473066 Chemerin-like receptor 2_H20A_mutation Human genes 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 208000005155 Picornaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 21
- 208000025223 poliovirus infection Diseases 0.000 abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 abstract 2
- 108010048507 poliovirus receptor Proteins 0.000 description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 102100029740 Poliovirus receptor Human genes 0.000 description 65
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 64
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 14
- 102100030368 Phospholipid phosphatase-related protein type 4 Human genes 0.000 description 13
- 108091014577 Phospholipid phosphatase-related protein type 4 Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 13
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 12
- 102100030288 Phospholipid phosphatase-related protein type 1 Human genes 0.000 description 12
- 101710139496 Phospholipid phosphatase-related protein type 1 Proteins 0.000 description 12
- 101150012848 PVR gene Proteins 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 8
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 8
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 7
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 5
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 4
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Chemical group 0.000 description 3
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000709701 Human poliovirus 1 Species 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 229940124867 Poliovirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 2
- 201000006995 paralytic poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 101150038671 strat gene Proteins 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- 101100290380 Caenorhabditis elegans cel-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282551 Cercopithecus Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 241001184731 Eira Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001138133 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100020769 Immunoglobulin kappa variable 1-5 Human genes 0.000 description 1
- 102000012960 Immunoglobulin kappa-Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010090227 Immunoglobulin kappa-Chains Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100348044 Mus musculus Ncam1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100030383 Phospholipid phosphatase-related protein type 3 Human genes 0.000 description 1
- 108091016353 Phospholipid phosphatase-related protein type 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003198 cerebellar cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 208000014380 ornithine aminotransferase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960001539 poliomyelitis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical group 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本出願は1989年３月10日に出願の米国特許No.321,957
の部分継続出願であり、前記出願の内容は参考として本
開示に含むものとする。
の部分継続出願であり、前記出願の内容は参考として本
開示に含むものとする。
発明の背景 ポリオウイルスは麻痺性灰白髄炎の原因菌として最も
よく知られている小さな、正20面体のRNA含有ピコルナ
ウイルスである。ウイルスが取り込まれ、消化管内で複
製されて感染が始まり、ウイルス血症を引き起こす。少
数の感染個体内では、ウイルスが血液から中枢神経系に
進入する。脳及び脊髄中の運動神経での溶菌的なウイル
スの複製によりこれらの細胞が破壊され、灰白髄炎に特
徴的な弛緩性麻痺が起こる［Bodian D.,Science 12:105
−108（1955）］。
よく知られている小さな、正20面体のRNA含有ピコルナ
ウイルスである。ウイルスが取り込まれ、消化管内で複
製されて感染が始まり、ウイルス血症を引き起こす。少
数の感染個体内では、ウイルスが血液から中枢神経系に
進入する。脳及び脊髄中の運動神経での溶菌的なウイル
スの複製によりこれらの細胞が破壊され、灰白髄炎に特
徴的な弛緩性麻痺が起こる［Bodian D.,Science 12:105
−108（1955）］。
ウイルス血症の段階の間に多くの組織がポリオウイル
スに暴露されるにもかかわらず、複製は口腔咽頭及び腸
粘膜、回腸のパイエル板及び中枢神経系内の運動神経に
限定されている。いくつかの実験の結果は、特異的なウ
イルス結合部位すなわち受容体の発現が限定されている
ことによりポリオウイルスの組織親和性（トロピズム）
が限定されるとの示唆を支持するものである。組織ホモ
ジェネートを使用する結合実験では、ポリオウイルス受
容体はポリオウイルス複製部位である組織でのみ検出さ
れる［Holland,J.J.Virology 15:312−326（1961）］さ
らに、霊長類及び非霊長類細胞型の両者でのポリオウイ
ルス感染に対する感受性の欠如はトランスフェクション
により細胞内にウイルス性RNAを導入して避けることが
でき、感染に対する耐性はポリオウイルス粒子の結合、
進入または脱外被の阻止によるものであることを示唆し
ている［Holland,J.J.,McLaren,J.C.及びSyverton,J.
T.,J.Exp.Med.110:65−80（1959）］。最後に、遺伝子
導入実験の結果はヒトDNAで形質転換したマウスＬ細胞
は細胞表面でポリオウイルス受容体を発現し、感染に対
して感受性となることを示唆した［Mendelsohn,C.,John
son,B.,Leonetti,K.A.,Nobis,P.,Wimmer,E.及びRacanie
llo,V.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7845−7849（198
6）］。
スに暴露されるにもかかわらず、複製は口腔咽頭及び腸
粘膜、回腸のパイエル板及び中枢神経系内の運動神経に
限定されている。いくつかの実験の結果は、特異的なウ
イルス結合部位すなわち受容体の発現が限定されている
ことによりポリオウイルスの組織親和性（トロピズム）
が限定されるとの示唆を支持するものである。組織ホモ
ジェネートを使用する結合実験では、ポリオウイルス受
容体はポリオウイルス複製部位である組織でのみ検出さ
れる［Holland,J.J.Virology 15:312−326（1961）］さ
らに、霊長類及び非霊長類細胞型の両者でのポリオウイ
ルス感染に対する感受性の欠如はトランスフェクション
により細胞内にウイルス性RNAを導入して避けることが
でき、感染に対する耐性はポリオウイルス粒子の結合、
進入または脱外被の阻止によるものであることを示唆し
ている［Holland,J.J.,McLaren,J.C.及びSyverton,J.
T.,J.Exp.Med.110:65−80（1959）］。最後に、遺伝子
導入実験の結果はヒトDNAで形質転換したマウスＬ細胞
は細胞表面でポリオウイルス受容体を発現し、感染に対
して感受性となることを示唆した［Mendelsohn,C.,John
son,B.,Leonetti,K.A.,Nobis,P.,Wimmer,E.及びRacanie
llo,V.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7845−7849（198
6）］。
他のウイルス系での研究は組織トロピズム及び病原性
における細胞受容体に非常に関与している。例えば、ヒ
トＴ細胞糖蛋白質CD4はHIV−Ｉの受容体である［Maddo
n,P.J.,Dalgeleish,A.G.,McDougal,J.S.,Clapham,P.R.,
Weiss,R.A.及びAxel,R.Cell 47:333−348（1986）］。
Ｔヘルパー細胞でのCD4の発現が、HIV−Ｉ感染に耐性
で、CD4受容体をコードするCD4クローンをコードするcD
NAクローンでトランスフェクトすることにより感染に感
受性となるHIV−ＩヒトCD4−陰性細胞に感染した個体で
認められるこれらの細胞の選択的感染及び破壊の原因と
考えられている。
における細胞受容体に非常に関与している。例えば、ヒ
トＴ細胞糖蛋白質CD4はHIV−Ｉの受容体である［Maddo
n,P.J.,Dalgeleish,A.G.,McDougal,J.S.,Clapham,P.R.,
Weiss,R.A.及びAxel,R.Cell 47:333−348（1986）］。
Ｔヘルパー細胞でのCD4の発現が、HIV−Ｉ感染に耐性
で、CD4受容体をコードするCD4クローンをコードするcD
NAクローンでトランスフェクトすることにより感染に感
受性となるHIV−ＩヒトCD4−陰性細胞に感染した個体で
認められるこれらの細胞の選択的感染及び破壊の原因と
考えられている。
生化学的研究はポリオウイルス受容体が膜内在蛋白質
であることを示した［Krah,D.L.及びCrowell,R.L.,Viro
logy 118:148−156（1982）］。しかし、恐らくは各々
の結合部位の性質の故に、ウイルスまたは抗体の結合を
必要とするアッセイを使用して膜調製物から受容体蛋白
質を精製することはできなかった。培養細胞へのポリオ
ウイルスの結合を阻害するいくつかのモノクローナル抗
体が単離されている［Minor,P.D.,Pipkin,P.A.,Hockle
y,D.,Schild,G.C.及びAlmond,J.W.,Virus Res.１:203−
212（1984）;Nobis,P.,Zibirre,R.,Meyer,G.,Kuhne,J.,
Warnecke,G.及びKock,G.J.Gen.Virol.６:2563−2569（1
985）;Shepley,M.P.,Sherry,B.及びWeiner,H.L.Proc.Na
tl.Acad.Sci,USA 85:7743−7747（1988）］。モノクロ
ーナル抗体D171は受容性の細胞で共通の高親和性結合部
位について３つのポリオウイルス血清型と競合し、ポリ
オウイルス感染に耐性な細胞とは結合しない［Nobis
ら，（1985）］。HeLa細胞は約100,000個のD171結合部
位［P.Nobis,私信］及び3000個のポリオウイルス結合部
位［Lonberg−Holm,K及びPhilipson,L.Receptors and R
ecognition.（Chapman and Hall,London）（1981）］を
含有しており、ウイルスが多価結合することを示唆して
いる。第二の型のモノクローナル抗体は２型ポリオウイ
ルスの感染を部分的に阻止し、１型ポリオウイルスの感
染をより低い程度に阻止するが、３型のウイルスの結合
にはほとんど作用しない［Shepleyら，（1988）］。こ
の抗体はポリオウイルス感受性セルラインの膜及びヒト
脊髄の100kdの蛋白質を認識し、神経筋接合部のニュー
ロンを特異的に染色する。
であることを示した［Krah,D.L.及びCrowell,R.L.,Viro
logy 118:148−156（1982）］。しかし、恐らくは各々
の結合部位の性質の故に、ウイルスまたは抗体の結合を
必要とするアッセイを使用して膜調製物から受容体蛋白
質を精製することはできなかった。培養細胞へのポリオ
ウイルスの結合を阻害するいくつかのモノクローナル抗
体が単離されている［Minor,P.D.,Pipkin,P.A.,Hockle
y,D.,Schild,G.C.及びAlmond,J.W.,Virus Res.１:203−
212（1984）;Nobis,P.,Zibirre,R.,Meyer,G.,Kuhne,J.,
Warnecke,G.及びKock,G.J.Gen.Virol.６:2563−2569（1
985）;Shepley,M.P.,Sherry,B.及びWeiner,H.L.Proc.Na
tl.Acad.Sci,USA 85:7743−7747（1988）］。モノクロ
ーナル抗体D171は受容性の細胞で共通の高親和性結合部
位について３つのポリオウイルス血清型と競合し、ポリ
オウイルス感染に耐性な細胞とは結合しない［Nobis
ら，（1985）］。HeLa細胞は約100,000個のD171結合部
位［P.Nobis,私信］及び3000個のポリオウイルス結合部
位［Lonberg−Holm,K及びPhilipson,L.Receptors and R
ecognition.（Chapman and Hall,London）（1981）］を
含有しており、ウイルスが多価結合することを示唆して
いる。第二の型のモノクローナル抗体は２型ポリオウイ
ルスの感染を部分的に阻止し、１型ポリオウイルスの感
染をより低い程度に阻止するが、３型のウイルスの結合
にはほとんど作用しない［Shepleyら，（1988）］。こ
の抗体はポリオウイルス感受性セルラインの膜及びヒト
脊髄の100kdの蛋白質を認識し、神経筋接合部のニュー
ロンを特異的に染色する。
本発明はHeLa細胞から単離したポリオウイルス受容体
をコードするゲノム及びcDNAクローンを開示している。
２つのcDNAのいずれかで耐性マウス細胞を形質転換する
と細胞表面で受容体を発現させ、ポリオウイルス感染に
感受性となる。ノーザンハイブリッド形成分析は、ポリ
オウイルス結合能を有さず、ポリオウイルス複製部位で
はない腎臓を含む多くのヒト細胞に、3.3kb受容体トラ
ンスクリプトが存在することを示している。従って、少
なくとも腎臓内では、ポリオウイルス受容体RNAの発現
はウイルス感染を引き起こすには不十分である。ポリオ
ウイルス受容体cDNAクローンは、同一の細胞外及びトラ
ンスメンブランドメインを含有するが細胞質テールが異
なる43,000及び45,000ダルトンの推定ポリペプチドをコ
ードする。蛋白質の相同性を比較すると、ポリオウイル
ス受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーの新しい
一員であることが明かとなった［免疫グロブリンスーパ
ーファミリーについての総説は、Williams,A.F.及びBar
caly A.N.Ann.Rev.Immunol.,６:381−405（1988）参
照］。受容体の細胞外部分は鎖内ジスルフィド結合で安
定化した３つのドメインからなる構造内に折り込まれて
いるであろう。
をコードするゲノム及びcDNAクローンを開示している。
２つのcDNAのいずれかで耐性マウス細胞を形質転換する
と細胞表面で受容体を発現させ、ポリオウイルス感染に
感受性となる。ノーザンハイブリッド形成分析は、ポリ
オウイルス結合能を有さず、ポリオウイルス複製部位で
はない腎臓を含む多くのヒト細胞に、3.3kb受容体トラ
ンスクリプトが存在することを示している。従って、少
なくとも腎臓内では、ポリオウイルス受容体RNAの発現
はウイルス感染を引き起こすには不十分である。ポリオ
ウイルス受容体cDNAクローンは、同一の細胞外及びトラ
ンスメンブランドメインを含有するが細胞質テールが異
なる43,000及び45,000ダルトンの推定ポリペプチドをコ
ードする。蛋白質の相同性を比較すると、ポリオウイル
ス受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーの新しい
一員であることが明かとなった［免疫グロブリンスーパ
ーファミリーについての総説は、Williams,A.F.及びBar
caly A.N.Ann.Rev.Immunol.,６:381−405（1988）参
照］。受容体の細胞外部分は鎖内ジスルフィド結合で安
定化した３つのドメインからなる構造内に折り込まれて
いるであろう。
発明の概要 本発明はピコルナウイルス受容体の生物活性を有する
ポリペプチドをコードする核酸を含む単離核酸分子を提
供する。
ポリペプチドをコードする核酸を含む単離核酸分子を提
供する。
さらに、本発明はピコルナウイルス受容体の生物活性
を有する精製ポリペプチドを提供する。
を有する精製ポリペプチドを提供する。
本発明はまた、宿主ベクター系内での発現ベクターの
使用を含むポリペプチドの産生を誘導する方法も提供す
る。ピコルナウイルス受容体の生物活性を有する精製ポ
リペプチドを含む治療用組成物及びヒトポリオウイルス
感染を治療及び予防する方法も提供する。
使用を含むポリペプチドの産生を誘導する方法も提供す
る。ピコルナウイルス受容体の生物活性を有する精製ポ
リペプチドを含む治療用組成物及びヒトポリオウイルス
感染を治療及び予防する方法も提供する。
さらに、本発明はヒトピコルナウイルスを発現するト
ランスジェニック動物を作製する方法を提供する。この
方法は、ピコルナウイルスをコードするDNAを雌性動物
から回収した受精卵に導入し；雌性動物がその卵で妊娠
する条件下で、得られた卵を偽妊娠動物の卵管に移すこ
とからなる。次に、動物を雌が出産する条件で処理し、
次いでヒトピコルナウイルス受容体をコードするDNAが
安定に組込まれ、発現している同産の動物から選択す
る。
ランスジェニック動物を作製する方法を提供する。この
方法は、ピコルナウイルスをコードするDNAを雌性動物
から回収した受精卵に導入し；雌性動物がその卵で妊娠
する条件下で、得られた卵を偽妊娠動物の卵管に移すこ
とからなる。次に、動物を雌が出産する条件で処理し、
次いでヒトピコルナウイルス受容体をコードするDNAが
安定に組込まれ、発現している同産の動物から選択す
る。
また、本発明は、ワクチンを上記トランスジェニック
動物に投与し、得られたトランスジェニック動物がヒト
ピコルナウイルス感染から保護されるか否を測定するこ
とからなるピコルナウイルスワクチンの有効性を試験す
る方法も提供する。
動物に投与し、得られたトランスジェニック動物がヒト
ピコルナウイルス感染から保護されるか否を測定するこ
とからなるピコルナウイルスワクチンの有効性を試験す
る方法も提供する。
最後に、本発明は上記トランスジェニック動物へのピ
コルナウイルスワクチンの有毒性を調べ、動物に対する
ワクチンの生理作用を測定する方法を提供する。
コルナウイルスワクチンの有毒性を調べ、動物に対する
ワクチンの生理作用を測定する方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図 形質転換体及び組換えバクテリオファージ中の
受容体DNAの分析 Ａ）ポリオウイルス受容体を発現する二次Ｌ細胞形質転
換体のサザンブロットハイブリッド形成分析。10μｇの
ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼ/BamH Iで消化し、
0.8％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースに移
し、ヒトAluクローンblur−８由来の32P−標識RNA SP6
トランスクリプトとハイブリッド形成させた［Jelinek
ら，（1980）］。二次形質転換セルラインCM−1.1、CM
−1.9、CM−1.17、CM−1.24及びCM−1.27は一次形質転
換体CM−１由来であった。マーカーの位置はHind IIIで
消化したλDNAの同時電気泳動で決定した。マーカーの
大きさはキロ塩基対で表す。
受容体DNAの分析 Ａ）ポリオウイルス受容体を発現する二次Ｌ細胞形質転
換体のサザンブロットハイブリッド形成分析。10μｇの
ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼ/BamH Iで消化し、
0.8％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースに移
し、ヒトAluクローンblur−８由来の32P−標識RNA SP6
トランスクリプトとハイブリッド形成させた［Jelinek
ら，（1980）］。二次形質転換セルラインCM−1.1、CM
−1.9、CM−1.17、CM−1.24及びCM−1.27は一次形質転
換体CM−１由来であった。マーカーの位置はHind IIIで
消化したλDNAの同時電気泳動で決定した。マーカーの
大きさはキロ塩基対で表す。
Ｂ）受容体ゲノムクローンλPVR−２、λPVR−３及びλ
PVR−４の制限地図。実線はヒトの配列を示し、点線は
マウスの配列を示す。BamH I制限部位の位置を示す。λ
PVR−２の10kb及び6kb断片は二次形質転換体を発現する
ポリオウイルス受容体に共通の10kb及び6kb Alu−含有B
amH I断片に対応する（第1A図参照）。置換ベクターλ2
001のクローニング部位及びアームは図示しない。λPVR
−２のBamH I断片の順序はλDNAの左右の付着末端に相
補的な32P−標識オリゴヌクレオチドプローブにアニー
ルさせた部分消化産物のゲル電気泳動で決定した。
PVR−４の制限地図。実線はヒトの配列を示し、点線は
マウスの配列を示す。BamH I制限部位の位置を示す。λ
PVR−２の10kb及び6kb断片は二次形質転換体を発現する
ポリオウイルス受容体に共通の10kb及び6kb Alu−含有B
amH I断片に対応する（第1A図参照）。置換ベクターλ2
001のクローニング部位及びアームは図示しない。λPVR
−２のBamH I断片の順序はλDNAの左右の付着末端に相
補的な32P−標識オリゴヌクレオチドプローブにアニー
ルさせた部分消化産物のゲル電気泳動で決定した。
第２図 ノーザンハイブリッド形成分析 Ａ）ポリオウイルス耐性Ltk-細胞及びHeLa細胞、二次Ｌ
細胞形質転換体CM−1.9及びヒト神経芽細胞腫SY5Yを含
むポリオウイルス感受性セルラインから調製した全細胞
RNA。DNAプローブはλPVR−２から単離した1kbのBamH I
ゲノム断片である（第1B図）。
細胞形質転換体CM−1.9及びヒト神経芽細胞腫SY5Yを含
むポリオウイルス感受性セルラインから調製した全細胞
RNA。DNAプローブはλPVR−２から単離した1kbのBamH I
ゲノム断片である（第1B図）。
Ｂ）ポリオウイルス受容体cDNAクローンpSVL−H20A及び
PSVL−H20Bを発現する形質転換体から調製した全細胞RN
A。全HeLa細胞RNA及びニシン精子DNAで形質転換したLtk
-細胞由来RNAも示す。使用したDNAプローブは0.97kb Ec
oR I cDNA断片である。
PSVL−H20Bを発現する形質転換体から調製した全細胞RN
A。全HeLa細胞RNA及びニシン精子DNAで形質転換したLtk
-細胞由来RNAも示す。使用したDNAプローブは0.97kb Ec
oR I cDNA断片である。
Ｃ）HeLa細胞、二次形質転換体CM−1.9及びLtk-細胞由
来のオリゴｄ（Ｔ）−選択RNA。使用したDNAプローブは
0.97kb EcoR I cDNA断片である。28S及び18S RNAマーカ
ーの位置は全パネルで示す。
来のオリゴｄ（Ｔ）−選択RNA。使用したDNAプローブは
0.97kb EcoR I cDNA断片である。28S及び18S RNAマーカ
ーの位置は全パネルで示す。
第３図 ポリオウイルス受容体cDNAクローンの制限地図。HeLa
細胞cDNAライブラリーから単離した４つのcDNAクローン
についてEcoR I、Xho I、Sma I及びBgl II部位の位置を
示す。cDNAクローンの大きさは次の通りである:HeLa1.
7、1,666bp;HeLa1.5、1,446bp;H20A、2,930bpと、ヌク
レオチド配列が決定されていない0.45kb 3′−EcoR I断
片;H20B、2,957bp。クローンH20B及びHeLa1.7は白色の
棒で表す各３′末端に同じ配列を含んでいる。クローン
H20Aは斜線で示すXho I部位の右側に非反復３′末端配
列を含有している。クローンH20A及びH20Bは５′EcoR I
部位からXho I部位までは同じであるが、H20Aの５′Eco
R I断片では５−末端から20bpの30個のヌクレオチドが
欠失している。点線で示すHeLa1.5cDNAの最初の５′−5
00bpは他のcDNAクローンとの配列相同性を有しておら
ず、配列の非同一性はEcoR I部位をやや越えたところま
で延びている。ポリオウイルス受容体cDNAがコードする
予想蛋白質の大きさはダルトンで表す。この研究でハイ
ブリッド形成プローブとして使用したDNA断片を同定す
る。
細胞cDNAライブラリーから単離した４つのcDNAクローン
についてEcoR I、Xho I、Sma I及びBgl II部位の位置を
示す。cDNAクローンの大きさは次の通りである:HeLa1.
7、1,666bp;HeLa1.5、1,446bp;H20A、2,930bpと、ヌク
レオチド配列が決定されていない0.45kb 3′−EcoR I断
片;H20B、2,957bp。クローンH20B及びHeLa1.7は白色の
棒で表す各３′末端に同じ配列を含んでいる。クローン
H20Aは斜線で示すXho I部位の右側に非反復３′末端配
列を含有している。クローンH20A及びH20Bは５′EcoR I
部位からXho I部位までは同じであるが、H20Aの５′Eco
R I断片では５−末端から20bpの30個のヌクレオチドが
欠失している。点線で示すHeLa1.5cDNAの最初の５′−5
00bpは他のcDNAクローンとの配列相同性を有しておら
ず、配列の非同一性はEcoR I部位をやや越えたところま
で延びている。ポリオウイルス受容体cDNAがコードする
予想蛋白質の大きさはダルトンで表す。この研究でハイ
ブリッド形成プローブとして使用したDNA断片を同定す
る。
第４図 受容体cDNA H20A及びH20Bのヌクレオチド配列及び予
想される酸配列。５′−及び３′−非コーディング配列
は図示しない。ヌクレオチドにはフレームATGから始
め、右端に番号を付ける。アミノ酸の番号は配列の上部
に示す。信号配列（アミノ酸１−20）及びトランスメン
ブランドメイン（アミノ酸433−367）は箱で囲む。Ｎ−
結合グリコシル化の可能性のある部位には下線を示す。
ヌクレオチド1153からのH20A及びH20Bの異なるカルボキ
シ末端配列を下部に示す。
想される酸配列。５′−及び３′−非コーディング配列
は図示しない。ヌクレオチドにはフレームATGから始
め、右端に番号を付ける。アミノ酸の番号は配列の上部
に示す。信号配列（アミノ酸１−20）及びトランスメン
ブランドメイン（アミノ酸433−367）は箱で囲む。Ｎ−
結合グリコシル化の可能性のある部位には下線を示す。
ヌクレオチド1153からのH20A及びH20Bの異なるカルボキ
シ末端配列を下部に示す。
第５図 Igスーパーファミリーのメンバーとポリオウイルス受
容体ドメイン１のアミノ酸相同性。同じアミノ酸は箱で
囲み、保持されたシステイン及びトリプトファン残基に
は陰影を付した。IgG λはIgλ鎖Ｖ−II領域、ヒトNig
−58である［Takayasuら，（1981）］。OX−２はラット
膜糖蛋白質前駆体OX−２である［McCaughanら，（198
7）］。IgカッパはマウスL6 Igカッパ鎖Ｖ領域である
［Pechら，（1981）］。バイアスで操作し、6.120ラン
ダムランのブレーキペナルティを実施したFASTPプログ
ラム［Dayhoffら，（1983）］を使用してNBRF蛋白質デ
ータベースを検索して相同性を検出した。
容体ドメイン１のアミノ酸相同性。同じアミノ酸は箱で
囲み、保持されたシステイン及びトリプトファン残基に
は陰影を付した。IgG λはIgλ鎖Ｖ−II領域、ヒトNig
−58である［Takayasuら，（1981）］。OX−２はラット
膜糖蛋白質前駆体OX−２である［McCaughanら，（198
7）］。IgカッパはマウスL6 Igカッパ鎖Ｖ領域である
［Pechら，（1981）］。バイアスで操作し、6.120ラン
ダムランのブレーキペナルティを実施したFASTPプログ
ラム［Dayhoffら，（1983）］を使用してNBRF蛋白質デ
ータベースを検索して相同性を検出した。
第６図 ポリオウイルス受容体ペプチドの構造。ポリオウイル
ス受容体のドメイン構造は推定アミノ酸配列に基づく。
３システイン対及び各システイン対間及びループ間のア
ミノ酸の数も示す。トランスメンブランドメインは点描
棒で示す。H20A及びH20Bの異なるCOOH−末端細胞質領域
の長さはアミノ酸残基で示す。第７図 ヒトの組織及びセルラインでのポリオウイルス受容体
トランスクリプト。ヒトの組織及びセルライン由来の全
RNAをノーザンハイブリッド形成で分析した。使用した
プローブを付けたDNAはH20Bの0.4kb Sma 1−EcoR I断片
である（第３図）。ヒト組織試料は術後または死後に得
たもので、28S及び18SリボソームRNAの割合及び量から
は分解の証拠は示されていない。Ｂ−リンパ球RNAはJ55
8プラズマ細胞腫セルラインから、Ｔ細胞RNAはジャーカ
ットＴセルラインから単離した。マクロファージは［Ho
rowitz及びSilverstein,（1980）］に記載のようにヒト
血液から精製した。28S及び18S RNAマーカーの位置を示
す。
ス受容体のドメイン構造は推定アミノ酸配列に基づく。
３システイン対及び各システイン対間及びループ間のア
ミノ酸の数も示す。トランスメンブランドメインは点描
棒で示す。H20A及びH20Bの異なるCOOH−末端細胞質領域
の長さはアミノ酸残基で示す。第７図 ヒトの組織及びセルラインでのポリオウイルス受容体
トランスクリプト。ヒトの組織及びセルライン由来の全
RNAをノーザンハイブリッド形成で分析した。使用した
プローブを付けたDNAはH20Bの0.4kb Sma 1−EcoR I断片
である（第３図）。ヒト組織試料は術後または死後に得
たもので、28S及び18SリボソームRNAの割合及び量から
は分解の証拠は示されていない。Ｂ−リンパ球RNAはJ55
8プラズマ細胞腫セルラインから、Ｔ細胞RNAはジャーカ
ットＴセルラインから単離した。マクロファージは［Ho
rowitz及びSilverstein,（1980）］に記載のようにヒト
血液から精製した。28S及び18S RNAマーカーの位置を示
す。
第８図 PVR遺伝子を含有するコスミドクローンPRG−１及びPR
G−３由来のDNA挿入物の制限地図。制限エンドヌクレア
ーゼBamH I（Ｂ）の部位を示す。コスミドDNAのサザン
ブロットハイブリッド形成分析で決定したPVR cDNAク
ローンH20AとH20Bの蛋白質コーディング領域の配列相同
性［Mendelsohnら，（1989）］を示す。
G−３由来のDNA挿入物の制限地図。制限エンドヌクレア
ーゼBamH I（Ｂ）の部位を示す。コスミドDNAのサザン
ブロットハイブリッド形成分析で決定したPVR cDNAク
ローンH20AとH20Bの蛋白質コーディング領域の配列相同
性［Mendelsohnら，（1989）］を示す。
第９図 トランスジェニック及び非トランスジェニックマウス
の組織ホモジェネートのポリオウイルス結合アッセイ。
種々のマウス組織のホモジェネートをMahoney型ポリオ
ウイルスと混合し、室温で２時間インキュベートし、感
染ウイルスをHeLa細胞単層でのプラークアッセイで測定
した。結合率は100−（ホモジェネートとのインキュベ
ート後のウイルス価/PBSとのインキュベート後のウイル
ス価x100）として計算した。
の組織ホモジェネートのポリオウイルス結合アッセイ。
種々のマウス組織のホモジェネートをMahoney型ポリオ
ウイルスと混合し、室温で２時間インキュベートし、感
染ウイルスをHeLa細胞単層でのプラークアッセイで測定
した。結合率は100−（ホモジェネートとのインキュベ
ート後のウイルス価/PBSとのインキュベート後のウイル
ス価x100）として計算した。
第10図 Mahoney 1型ポリオウイルスによるマウスの感染。８
匹のPRG−１−17のトランスジェニックF1マウス及び８
匹の非トランスジェニックマウスにMahoney型ポリオウ
イルス1x105pfuを脳内接種した。接種日から毎日、１匹
のマウスを殺し、脳及び脊髄を取り出し、PBS中でホモ
ジェネートとし、HeLa細胞でのプラークアッセイで組織
内のウイルス含量を測定した。殺す前にマウスの麻痺性
疾患についても評価した。第３日及び第５日には２匹の
トランスジェニックマウスが麻痺を示した。これら両者
を殺し、脳及び脊髄内のウイルス価を各々測定した。２
匹のマウスについての平均値をグラフに示す。上のパネ
ルは時間に対する麻痺を起こしたマウス全数であり；ま
ん中のパネルは脳1mg当りのウイルス価であり；下のパ
ネルは脊髄1mg当りのウイルス価である。トランジェニ
ック及び非トランスジェニックマウスでの曲線を示す。
匹のPRG−１−17のトランスジェニックF1マウス及び８
匹の非トランスジェニックマウスにMahoney型ポリオウ
イルス1x105pfuを脳内接種した。接種日から毎日、１匹
のマウスを殺し、脳及び脊髄を取り出し、PBS中でホモ
ジェネートとし、HeLa細胞でのプラークアッセイで組織
内のウイルス含量を測定した。殺す前にマウスの麻痺性
疾患についても評価した。第３日及び第５日には２匹の
トランスジェニックマウスが麻痺を示した。これら両者
を殺し、脳及び脊髄内のウイルス価を各々測定した。２
匹のマウスについての平均値をグラフに示す。上のパネ
ルは時間に対する麻痺を起こしたマウス全数であり；ま
ん中のパネルは脳1mg当りのウイルス価であり；下のパ
ネルは脊髄1mg当りのウイルス価である。トランジェニ
ック及び非トランスジェニックマウスでの曲線を示す。
詳細な説明 本発明はピコルナウイルス受容体の生物活性を有する
ポリペプチドをコードする核酸を含む単離核酸分子を提
供する。ピコルナウイルスにはライノウイルス、コクサ
ッキーウイルス、エコーウイルス及びヒトポリオウイル
ス等を含む。小さな正20面体のRNA含有ピコルナウイル
スであるヒトポリオウイルスは本発明に特に重要であ
る。核酸はRNA及びDNAの両者を包含するものであり、好
適実施例では核酸はDNA及びcDNAである。最も好ましいc
DNA分子は第４図に示すヌクレオチド配列を有するH20A
及びH20Bと表すものである。本発明はまたピコルナウイ
ルス受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードす
る核酸を含むコスミド発現ベクターも提供する。ピコル
ナウイルス受容体の生物活性を有するポリペプチドをコ
ードする核酸分子を含むコスミドの例にはPRG−１及びP
RG−３と表すコスミドを包含するが、これに限定される
ものではない。PRG−１及びPRG−２は1990年３月９日に
American Type Culture Collection（ATCC）、12301 Pa
rklawn Drive,Rockville,Maryland U.S.A.に寄託してお
り、寄託番号は各々68252及び68253である。この寄託は
特許手続上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト
条約（ブダペスト条約）に従ってなされたものである。
本発明はさらにゲノムDNA分子の使用も提供する。
ポリペプチドをコードする核酸を含む単離核酸分子を提
供する。ピコルナウイルスにはライノウイルス、コクサ
ッキーウイルス、エコーウイルス及びヒトポリオウイル
ス等を含む。小さな正20面体のRNA含有ピコルナウイル
スであるヒトポリオウイルスは本発明に特に重要であ
る。核酸はRNA及びDNAの両者を包含するものであり、好
適実施例では核酸はDNA及びcDNAである。最も好ましいc
DNA分子は第４図に示すヌクレオチド配列を有するH20A
及びH20Bと表すものである。本発明はまたピコルナウイ
ルス受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードす
る核酸を含むコスミド発現ベクターも提供する。ピコル
ナウイルス受容体の生物活性を有するポリペプチドをコ
ードする核酸分子を含むコスミドの例にはPRG−１及びP
RG−３と表すコスミドを包含するが、これに限定される
ものではない。PRG−１及びPRG−２は1990年３月９日に
American Type Culture Collection（ATCC）、12301 Pa
rklawn Drive,Rockville,Maryland U.S.A.に寄託してお
り、寄託番号は各々68252及び68253である。この寄託は
特許手続上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト
条約（ブダペスト条約）に従ってなされたものである。
本発明はさらにゲノムDNA分子の使用も提供する。
ピコルナウイルスに結合できる可溶性ポリペプチドを
コードする核酸分子をも、この核酸がコードする可溶性
ポリペプチドと共に提供する。この核酸分子はピコルナ
ウイルスがヒトポリオウイルスからなるときに特に有用
である。この核酸がコードする可溶性ポリペプチドも本
発明産物である。
コードする核酸分子をも、この核酸がコードする可溶性
ポリペプチドと共に提供する。この核酸分子はピコルナ
ウイルスがヒトポリオウイルスからなるときに特に有用
である。この核酸がコードする可溶性ポリペプチドも本
発明産物である。
ピコルナウイルス受容体の生物活性を有する精製ポリ
ペプチドも本発明が開示する。この精製ポリペプチドは
本発明が開示する任意の方法で産生できる。好適実施態
様では、精製ポリペプチドはヒトポリオウイルス受容体
の生物活性を有する精製ポリペプチドからなる。上記の
ような核酸分子がコードする精製ペプチドも提供する。
このポリペプチドはピコルナウイルス受容体の生物活性
を有している。
ペプチドも本発明が開示する。この精製ポリペプチドは
本発明が開示する任意の方法で産生できる。好適実施態
様では、精製ポリペプチドはヒトポリオウイルス受容体
の生物活性を有する精製ポリペプチドからなる。上記の
ような核酸分子がコードする精製ペプチドも提供する。
このポリペプチドはピコルナウイルス受容体の生物活性
を有している。
さらに、本発明はcDNA分子H20Aがコードし、計算上の
分子量45,000を特徴とする精製ポリペプチドを開示す
る。cDNA分子H20Bがコードする精製ポリペプチドは計算
上の分子量43,000を特徴とする。
分子量45,000を特徴とする精製ポリペプチドを開示す
る。cDNA分子H20Bがコードする精製ポリペプチドは計算
上の分子量43,000を特徴とする。
本発明は任意の上記ポリペプチドをコードする核酸を
含む発現ベクターも提供する。これらの発現ベクター
は、１）ピコルナウイルス受容体の生物活性を有する精
製ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター;
2）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性を有する精製
ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター;3）
計算上の分子量約45,000で特性化されるcDNA分子H20Aが
コードする精製ポリペプチドをコードする核酸を含む発
現ベクター;4）計算上の分子量約43,000で特性化される
cDNA分子H20Bがコードする精製ポリペプチドをコードす
る核酸を含む発現ベクター;5）ピコルナウイルス受容体
の生物活性を有する可溶性ポリペプチドをコードする核
酸を含む発現ベクター；及び６）ヒトポリオウイルス受
容体の生物活性を有する可溶性ポリペプチドをコードす
る核酸を含む発現ベクターを包含するが、これに限定さ
れるものではない。上記発現ベクター、ファージ発現ベ
クター、酵母発現ベクター、ウイルス発現ベクター、哺
乳類発現ベクターまたはこれらの任意の変異体を本発明
が提供する。
含む発現ベクターも提供する。これらの発現ベクター
は、１）ピコルナウイルス受容体の生物活性を有する精
製ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター;
2）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性を有する精製
ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター;3）
計算上の分子量約45,000で特性化されるcDNA分子H20Aが
コードする精製ポリペプチドをコードする核酸を含む発
現ベクター;4）計算上の分子量約43,000で特性化される
cDNA分子H20Bがコードする精製ポリペプチドをコードす
る核酸を含む発現ベクター;5）ピコルナウイルス受容体
の生物活性を有する可溶性ポリペプチドをコードする核
酸を含む発現ベクター；及び６）ヒトポリオウイルス受
容体の生物活性を有する可溶性ポリペプチドをコードす
る核酸を含む発現ベクターを包含するが、これに限定さ
れるものではない。上記発現ベクター、ファージ発現ベ
クター、酵母発現ベクター、ウイルス発現ベクター、哺
乳類発現ベクターまたはこれらの任意の変異体を本発明
が提供する。
本発明は好適宿主と上記の発現ベクターからなる宿主
ベクター系も提供する。宿主ベクター系は、１）好適細
菌細胞とプラスミドまたはファージまたは発現ベクタ
ー;2）好適酵母細胞と酵母発現ベクター;3）好適真核細
胞とウイルス発現ベクター；及び４）好適哺乳類細胞と
哺乳類発現ベクターを包含する。
ベクター系も提供する。宿主ベクター系は、１）好適細
菌細胞とプラスミドまたはファージまたは発現ベクタ
ー;2）好適酵母細胞と酵母発現ベクター;3）好適真核細
胞とウイルス発現ベクター；及び４）好適哺乳類細胞と
哺乳類発現ベクターを包含する。
本発明は、ポリペプチドを産生する条件下で前記宿主
ベクター系を培養または増殖させ、ポリペプチドを回収
することからなるポリペプチド産生法も提供する。発現
ベクターを産生し、また適切な宿主ベクター系を選択す
る方法は当業者に公知である。本発明の新規性はこれま
で知られていなかった核酸を使用してピコルナウイルス
に結合するポリペプチドを産生することにある。従っ
て、公知方法の詳細についてはこの項では記述しない。
しかし、具体的な材料については実験の詳細の項に記載
することもあろう。
ベクター系を培養または増殖させ、ポリペプチドを回収
することからなるポリペプチド産生法も提供する。発現
ベクターを産生し、また適切な宿主ベクター系を選択す
る方法は当業者に公知である。本発明の新規性はこれま
で知られていなかった核酸を使用してピコルナウイルス
に結合するポリペプチドを産生することにある。従っ
て、公知方法の詳細についてはこの項では記述しない。
しかし、具体的な材料については実験の詳細の項に記載
することもあろう。
本発明はまた上記ポリペプチドの１つの治療上有効量
と製剤上許容される担体とを含む治療用組成物も提供す
る。ポリペプチドには、１）ピコルナウイルス受容体の
生物活性を有する精製ポリペプチド;2）ヒトポリオウイ
ルス受容体の生物活性を有する精製ポリペプチド;3）計
算上の分子量約45,000を特徴とし、第４図に示すヌクレ
オチド配列を有するH20Aと表すcDNA分子がコードする精
製ポリペプチド;4）計算上の分子量約43,000を特徴と
し、第４図に示すヌクレオチド配列を有するH20Bと表す
cDNA分子がコードする精製ポリペプチド;5）ピコルナウ
イルス受容体に結合しうる可溶性ポリペプチド；及び
６）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性に結合しうる
可溶性ポリペプチドを含むが、これらに限定されるもの
ではない。薬剤上許容される担体には滅菌溶液、錠剤、
コーティング錠及びカプセルのような任意の標準的薬剤
担体を包含する。典型的には、これらの担体にはでんぷ
ん、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼラチン、ステリッ
ク酸、タルク、植物性油脂、ガム、グリコールまたは他
の公知の賦形剤のような賦形剤を含有する。これらの担
体は香料、着色料または他の成分も含有してよい。この
ような担体からなる組成物はよく知られた慣用の方法で
処方する。しかし、本発明ポリペプチドからなる組成物
は未知のものである。
と製剤上許容される担体とを含む治療用組成物も提供す
る。ポリペプチドには、１）ピコルナウイルス受容体の
生物活性を有する精製ポリペプチド;2）ヒトポリオウイ
ルス受容体の生物活性を有する精製ポリペプチド;3）計
算上の分子量約45,000を特徴とし、第４図に示すヌクレ
オチド配列を有するH20Aと表すcDNA分子がコードする精
製ポリペプチド;4）計算上の分子量約43,000を特徴と
し、第４図に示すヌクレオチド配列を有するH20Bと表す
cDNA分子がコードする精製ポリペプチド;5）ピコルナウ
イルス受容体に結合しうる可溶性ポリペプチド；及び
６）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性に結合しうる
可溶性ポリペプチドを含むが、これらに限定されるもの
ではない。薬剤上許容される担体には滅菌溶液、錠剤、
コーティング錠及びカプセルのような任意の標準的薬剤
担体を包含する。典型的には、これらの担体にはでんぷ
ん、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼラチン、ステリッ
ク酸、タルク、植物性油脂、ガム、グリコールまたは他
の公知の賦形剤のような賦形剤を含有する。これらの担
体は香料、着色料または他の成分も含有してよい。この
ような担体からなる組成物はよく知られた慣用の方法で
処方する。しかし、本発明ポリペプチドからなる組成物
は未知のものである。
本発明は任意の上記ポリペプチドに対する抗体も提供
する。これらの抗体は当業界で公知の任意の方法で産生
できる。抗体にはIgG、IgA、IgD、IgA、IgM及び抗体断
片例えばＦ（ab′）２及びFabを含むものとする。
する。これらの抗体は当業界で公知の任意の方法で産生
できる。抗体にはIgG、IgA、IgD、IgA、IgM及び抗体断
片例えばＦ（ab′）２及びFabを含むものとする。
治療上有効量の薬剤が結合した上記ポリペプチドに対
する抗体のある量と薬剤上許容される担体とを含む治療
用組成物も提供する。
する抗体のある量と薬剤上許容される担体とを含む治療
用組成物も提供する。
抗体を検出可能なマーカーで標識することもできる。
これらには、放射能、放射線不透過性もしくは常磁性を
有するものまたは金属を含みうるが、これに限定される
ものではない。これらの標識した抗体はピコルナウイル
スを含有する体の部分をイメージ形成するために使用で
き、当業者に公知のＸ線またはMRIイメージ形成手法で
検出できる。
これらには、放射能、放射線不透過性もしくは常磁性を
有するものまたは金属を含みうるが、これに限定される
ものではない。これらの標識した抗体はピコルナウイル
スを含有する体の部分をイメージ形成するために使用で
き、当業者に公知のＸ線またはMRIイメージ形成手法で
検出できる。
本発明で開示したポリペプチドを検出可能なマーカー
で標識することもできる。次に、これらの標識したポリ
ペプチドを標識抗体と同じ方法で使用してピコルナウイ
ルス受容体を発現する細胞に結合させることもできる。
また、標識には放射能、放射線不透過性もしくは常磁性
を有するものまたは金属を含みうる。
で標識することもできる。次に、これらの標識したポリ
ペプチドを標識抗体と同じ方法で使用してピコルナウイ
ルス受容体を発現する細胞に結合させることもできる。
また、標識には放射能、放射線不透過性もしくは常磁性
を有するものまたは金属を含みうる。
本発明は、ヒトポリオウイルス受容体の生物活性を有
する精製ポリペプチドに結合しうるヒトポリオウイルス
粒子の断片とポリオウイルス粒子に結合した薬剤を含む
治療薬も提供する。好適実施態様では、薬剤は共有結合
している。治療上有効量の上記治療剤と薬剤上許容され
る担体が提供される。薬剤上許容される担体については
既に述べた通りである。
する精製ポリペプチドに結合しうるヒトポリオウイルス
粒子の断片とポリオウイルス粒子に結合した薬剤を含む
治療薬も提供する。好適実施態様では、薬剤は共有結合
している。治療上有効量の上記治療剤と薬剤上許容され
る担体が提供される。薬剤上許容される担体については
既に述べた通りである。
上記２つの治療用組成物はピコルナウイルスまたは特
定的にはヒトポリオウイルスの受容体を有する細胞の近
くの薬剤濃度を上昇させるために使用することができ
る。本発明は、ある量の１）ピコルナウイルス受容体の
生物活性を有するポリペプチドに対する抗体；または
２）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性を有するポリ
ペプチドに結合しうるヒトポリオウイルス粒子の断片の
いずれかからなる治療用組成物を患者に投与することか
らなる薬剤分配（デリバリー）法を提供する。投与方法
は経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下を含む、し
かしこれらに限定されない標準的方法のいずれであって
もよい。投与の適正な形態は所望の効果及び付随する環
境により変化しよう。しかし、当業者は最も適切な投与
形態及び必要な容量を容易に決定できよう。
定的にはヒトポリオウイルスの受容体を有する細胞の近
くの薬剤濃度を上昇させるために使用することができ
る。本発明は、ある量の１）ピコルナウイルス受容体の
生物活性を有するポリペプチドに対する抗体；または
２）ヒトポリオウイルス受容体の生物活性を有するポリ
ペプチドに結合しうるヒトポリオウイルス粒子の断片の
いずれかからなる治療用組成物を患者に投与することか
らなる薬剤分配（デリバリー）法を提供する。投与方法
は経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下を含む、し
かしこれらに限定されない標準的方法のいずれであって
もよい。投与の適正な形態は所望の効果及び付随する環
境により変化しよう。しかし、当業者は最も適切な投与
形態及び必要な容量を容易に決定できよう。
本発明方法は、ヒトポリオウイルスに結合する生物活
性を有するポリペプチドの１つの予防上有効量を対象者
に投与することからなるヒトでのポリオウイルス感染予
防法を提供する。好適実施態様では、ポリペプチドはピ
コルナウイルス、最も好ましくはヒトポリオウイルスに
結合しうる可溶性ポリペプチドをコードする核酸分子が
コードするポリペプチドである。
性を有するポリペプチドの１つの予防上有効量を対象者
に投与することからなるヒトでのポリオウイルス感染予
防法を提供する。好適実施態様では、ポリペプチドはピ
コルナウイルス、最も好ましくはヒトポリオウイルスに
結合しうる可溶性ポリペプチドをコードする核酸分子が
コードするポリペプチドである。
本発明はヒトポリオウイルス感染症患者の治療法も提
供し、この方法はピコルナウイルスに結合しうるポリペ
プチドの１つの治療上有効量を含む組成物を患者に投与
することからなる。
供し、この方法はピコルナウイルスに結合しうるポリペ
プチドの１つの治療上有効量を含む組成物を患者に投与
することからなる。
ヒトポリオウイルス感染の予防法及び治療法の両方と
も特に小児及びその両親への使用に適している。この方
法では、ワクチン接種後及び既存の経口ワクチン投与の
補助剤として使用できる。また、「タイピング−アッ
プ」ヒトポリオウイルスの直接法を適用することによ
り、ヒトポリオウイルスに対する免疫が抑制されている
患者を治療できる。
も特に小児及びその両親への使用に適している。この方
法では、ワクチン接種後及び既存の経口ワクチン投与の
補助剤として使用できる。また、「タイピング−アッ
プ」ヒトポリオウイルスの直接法を適用することによ
り、ヒトポリオウイルスに対する免疫が抑制されている
患者を治療できる。
本発明は動物の染色体DNAに安定に組込まれた、ピコ
ルナウイルス受容体の生物活性を有するポリペプチドを
コードするDNAを有するトランスジェニック動物を提供
する。このDNAは１）cDNA;2）第４図に示すヌクレオチ
ド配列を有するH20Aと表すcDNA;3）第４図に示すヌクレ
オチド配列を有するH20Bと表すcDNA;5）PRG−１と表す
コスミドDNA;6）PRG−３と表すコスミドDNA;及び７）ゲ
ノムDNAを含むが、これらに限定されるものではない。
好適実施態様では動物はマウスである。
ルナウイルス受容体の生物活性を有するポリペプチドを
コードするDNAを有するトランスジェニック動物を提供
する。このDNAは１）cDNA;2）第４図に示すヌクレオチ
ド配列を有するH20Aと表すcDNA;3）第４図に示すヌクレ
オチド配列を有するH20Bと表すcDNA;5）PRG−１と表す
コスミドDNA;6）PRG−３と表すコスミドDNA;及び７）ゲ
ノムDNAを含むが、これらに限定されるものではない。
好適実施態様では動物はマウスである。
ヒトポリオウイルス受容体を発現するトランスジェニ
ック動物の作製法も提供する。この方法は、１）雌性動
物から回収した受精卵にピコルナウイルス受容体をコー
ドするDNAを導入し;2）雌性動物がその卵で妊娠するよ
うな条件で偽妊娠期の動物の卵管に得られた卵を移し;
3）得られた妊娠雌性動物が出産するように取り扱い；
そして４）ヒトピコルナウイルス受容体をコードするDN
Aが安定に組込まれかつこれを発現する同産の動物から
選択することからなる。ステップの概要は、１）妊娠し
た雌性動物の卵管から卵を回収し;2）好ましくはプロモ
ータ配列を含有するDNAを雄性の前核にミクロ注入し;
3）その卵を偽妊娠期の雌性動物に移し；そして４）子
孫から組織を取り出して標準法でDNAの取り込みを測定
することである。この方法の技術的な側面はポリオウイ
ルス受容体を発現するトランスジェニックマウスの作製
についての実験の詳細説明の項で詳述する。好適な実地
態様において、ピコルナウイルスはヒトポリオウイルス
であり、トランスジェニック動物はマウスである。
ック動物の作製法も提供する。この方法は、１）雌性動
物から回収した受精卵にピコルナウイルス受容体をコー
ドするDNAを導入し;2）雌性動物がその卵で妊娠するよ
うな条件で偽妊娠期の動物の卵管に得られた卵を移し;
3）得られた妊娠雌性動物が出産するように取り扱い；
そして４）ヒトピコルナウイルス受容体をコードするDN
Aが安定に組込まれかつこれを発現する同産の動物から
選択することからなる。ステップの概要は、１）妊娠し
た雌性動物の卵管から卵を回収し;2）好ましくはプロモ
ータ配列を含有するDNAを雄性の前核にミクロ注入し;
3）その卵を偽妊娠期の雌性動物に移し；そして４）子
孫から組織を取り出して標準法でDNAの取り込みを測定
することである。この方法の技術的な側面はポリオウイ
ルス受容体を発現するトランスジェニックマウスの作製
についての実験の詳細説明の項で詳述する。好適な実地
態様において、ピコルナウイルスはヒトポリオウイルス
であり、トランスジェニック動物はマウスである。
ピコルナウイルスワクチンの効果測定法も提供する。
この方法は、染色体DNAに安定的に組込まれた、ピコル
ナウイルスに結合するポリペプチドをコードするDNAを
有するトランスジェニック動物にワクチンを投与し、得
られたトランスジェニック動物がヒトピコルナウイルス
感染から保護されたかを測定することからなる。トラン
スジェニック動物の保護は種々の生物学的方法で測定で
き、これらの方法は、血清、脊髄液または器官内のウイ
ルス量の測定：ウイルスによる器官損傷の観察；及びウ
イルスによる全体としての運動機能障害の観察を含む
が、これらに限定されない。好適実施態様では、ピコル
ナウイルスはヒトポリオウイルスであり、トランスジェ
ニック動物はマウスである。
この方法は、染色体DNAに安定的に組込まれた、ピコル
ナウイルスに結合するポリペプチドをコードするDNAを
有するトランスジェニック動物にワクチンを投与し、得
られたトランスジェニック動物がヒトピコルナウイルス
感染から保護されたかを測定することからなる。トラン
スジェニック動物の保護は種々の生物学的方法で測定で
き、これらの方法は、血清、脊髄液または器官内のウイ
ルス量の測定：ウイルスによる器官損傷の観察；及びウ
イルスによる全体としての運動機能障害の観察を含む
が、これらに限定されない。好適実施態様では、ピコル
ナウイルスはヒトポリオウイルスであり、トランスジェ
ニック動物はマウスである。
最後に、本発明はピコルナウイルスワクチンの毒性を
テストする方法を提供し、この方法は上記のトランスジ
ェニック動物にワクチンを投与し、動物に対する生理作
用を測定することからなる。この方法はポリオウイルス
ワクチン及び他のピコルナウイルスワクチンをテストす
る経済的な方法を提供する。現在、使用されているワク
チンの毒性を調べるには霊長類を使用しなければならな
い。これはヒトポリオウイルスがヒトポリオウイルス受
容体を有する動物にのみ作用するであろうという理由に
よる。
テストする方法を提供し、この方法は上記のトランスジ
ェニック動物にワクチンを投与し、動物に対する生理作
用を測定することからなる。この方法はポリオウイルス
ワクチン及び他のピコルナウイルスワクチンをテストす
る経済的な方法を提供する。現在、使用されているワク
チンの毒性を調べるには霊長類を使用しなければならな
い。これはヒトポリオウイルスがヒトポリオウイルス受
容体を有する動物にのみ作用するであろうという理由に
よる。
本発明はピコルナウイルス、特にヒトポリオウイルス
の受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードする
DNAを有するトランスジェニック動物を提供する。高価
で限定された霊長類を使用することなくワクチンのテス
トを可能にすることにより、本発明は従来技術に対し明
確な利点を有する。ヒトポリオウイルスワクチンをテス
トする方法では、霊長類を殺し、神経組織を組織学的に
調べて種々の量のワクチンによる損傷の程度を測定する
必要がある。トランスジェニック動物がマウスであり、
測定する生理学的作用が神経損傷である好適実施態様で
は、現在霊長類系で使用されている処方を適用して、ヒ
トポリオウイルスの効果を調べる安価で容易に反復でき
る方法が得られる。
の受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードする
DNAを有するトランスジェニック動物を提供する。高価
で限定された霊長類を使用することなくワクチンのテス
トを可能にすることにより、本発明は従来技術に対し明
確な利点を有する。ヒトポリオウイルスワクチンをテス
トする方法では、霊長類を殺し、神経組織を組織学的に
調べて種々の量のワクチンによる損傷の程度を測定する
必要がある。トランスジェニック動物がマウスであり、
測定する生理学的作用が神経損傷である好適実施態様で
は、現在霊長類系で使用されている処方を適用して、ヒ
トポリオウイルスの効果を調べる安価で容易に反復でき
る方法が得られる。
実験の詳細説明 細胞、ウイルス及び抗体 ［La Monica,N.,Meriam,C.及びRacaniello,V.R.J.Vir
ol.57:515−525（1986）］に記載のようにHeLaS3細胞を
浮遊培養または単層で培養した。Ltk-aprt-繊維芽は10
％子牛血清、1ml当り100μｇのペニシリン、1ml当り100
μｇのストレプトマイシン、1ml当り20μｇのブロモデ
オキシウリジン及び1ml当り50μｇのジアミノプリンを
含有するダルベッコの修飾イーグル培地（DMEM）に維持
した。Ltk-aprt-細胞はDNA形質転換48時間前にブロモデ
オキシウリジン及びジアミノプリンを含有しない同じ培
地で継代培養した。一次及び二次ポリオウイルス感受性
形質転換細胞は、10％牛胎児血清、100Mmヒポキサンチ
ン/0.4mMアミノプテリン/16mMチミジン含有DMEM培地（H
AT）で培養した。使用したポリオウイルス株は１型Maho
ney、２型Lansing及び３型Leonであった。ヒトポリオウ
イルス受容対に対するマウスモノクローナル抗体D171は
P.Nobisより厚意で贈られた物であった［Nibisら，（19
85）］。
ol.57:515−525（1986）］に記載のようにHeLaS3細胞を
浮遊培養または単層で培養した。Ltk-aprt-繊維芽は10
％子牛血清、1ml当り100μｇのペニシリン、1ml当り100
μｇのストレプトマイシン、1ml当り20μｇのブロモデ
オキシウリジン及び1ml当り50μｇのジアミノプリンを
含有するダルベッコの修飾イーグル培地（DMEM）に維持
した。Ltk-aprt-細胞はDNA形質転換48時間前にブロモデ
オキシウリジン及びジアミノプリンを含有しない同じ培
地で継代培養した。一次及び二次ポリオウイルス感受性
形質転換細胞は、10％牛胎児血清、100Mmヒポキサンチ
ン/0.4mMアミノプテリン/16mMチミジン含有DMEM培地（H
AT）で培養した。使用したポリオウイルス株は１型Maho
ney、２型Lansing及び３型Leonであった。ヒトポリオウ
イルス受容対に対するマウスモノクローナル抗体D171は
P.Nobisより厚意で贈られた物であった［Nibisら，（19
85）］。
DNA形質転換 48時間薬剤なしで培養したLtk-aprt-細胞（7.5×1
05）を、使用12時間前に10cmのプラスチックの細胞培養
プレートに接種した。各プレートを、高分子量DNA25μ
ｇ及び［Graham,F.及びvan der Eb,J.Virol 52:456−45
7（1973）;Wigler,M.,Pellicer,A.,Silverstein,S.,Axe
l,R.Cell 14:725−731（1978）］に記載のように調製し
たヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子含有プラス
ミド１μｇからなるDNA−燐酸カルシウム共沈物1mlで処
理した。37℃で16時間インキュベートした後、培地を換
え、さらに24時間インキュベートしてからHAT培地を加
えた。HAT培地で２週間培養した後、各プレートには100
0−5000tk+のコロニーが含まれていた。
05）を、使用12時間前に10cmのプラスチックの細胞培養
プレートに接種した。各プレートを、高分子量DNA25μ
ｇ及び［Graham,F.及びvan der Eb,J.Virol 52:456−45
7（1973）;Wigler,M.,Pellicer,A.,Silverstein,S.,Axe
l,R.Cell 14:725−731（1978）］に記載のように調製し
たヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子含有プラス
ミド１μｇからなるDNA−燐酸カルシウム共沈物1mlで処
理した。37℃で16時間インキュベートした後、培地を換
え、さらに24時間インキュベートしてからHAT培地を加
えた。HAT培地で２週間培養した後、各プレートには100
0−5000tk+のコロニーが含まれていた。
ウイルス感染 ポリオウイルス感受性のＬ細胞形質転換細胞を同定す
るために、Ltk+細胞の単層を1:2継代培養し、１つのプ
レートは感染多重度0.1で１型Mahoney型のポリオウイル
スに感染させた。吸着後、プレートを３回洗って未結合
ウイルスを除去し、培地を換えた。インキュベーション
後の種々の時間に上清のアリコートを取り、HeLa細胞単
層上でのプラークアッセイでウイルス価を測定した［La
Monicaら，（1986）］。
るために、Ltk+細胞の単層を1:2継代培養し、１つのプ
レートは感染多重度0.1で１型Mahoney型のポリオウイル
スに感染させた。吸着後、プレートを３回洗って未結合
ウイルスを除去し、培地を換えた。インキュベーション
後の種々の時間に上清のアリコートを取り、HeLa細胞単
層上でのプラークアッセイでウイルス価を測定した［La
Monicaら，（1986）］。
ロゼット形成及び計画 ポリオウイルス受容体を発現する形質転換細胞はその
場でのロゼットアッセイ法［Littmen,D.,Thomas,Y.,Mad
don,P.,Chess,L.及びAxel,R.Cell 40:237−246（198
5）］を使用してtk+形質転換細胞のプレート上で可視化
した。細胞の単層を先ず1ml当り1.25μｇのモノクロー
ナル抗受容体抗体D171、次にヤギ抗マウスIgG抗体で被
覆したヒト赤血球で処理した。ポリオウイルス受容体を
発現する細胞は赤血球で被覆され、局在化し、クローニ
ングシリンダでプレートから除去され、大きな培養物へ
と増殖できた。細胞培養物は［Mendelsohnら，（198
6）］が記載したパンニング手法を使用してポリオウイ
ルス受容体陽性細胞に富んだものとした。
場でのロゼットアッセイ法［Littmen,D.,Thomas,Y.,Mad
don,P.,Chess,L.及びAxel,R.Cell 40:237−246（198
5）］を使用してtk+形質転換細胞のプレート上で可視化
した。細胞の単層を先ず1ml当り1.25μｇのモノクロー
ナル抗受容体抗体D171、次にヤギ抗マウスIgG抗体で被
覆したヒト赤血球で処理した。ポリオウイルス受容体を
発現する細胞は赤血球で被覆され、局在化し、クローニ
ングシリンダでプレートから除去され、大きな培養物へ
と増殖できた。細胞培養物は［Mendelsohnら，（198
6）］が記載したパンニング手法を使用してポリオウイ
ルス受容体陽性細胞に富んだものとした。
RNA及びDNAの単離 4Mグアニジンイソチオシアネート中でホモジェネート
し、CsClのクッション上で遠心することにより培養細胞
及び組織から全RNAを単離した［Chirgwin,J.,Przybyla,
A.,MacDonald,R.及びRutter W.Biochem. 18:5294−5299
（1979）］。ポリＡ＋ RNAは製造業者に方法に従って
予め充填したオリゴDtセルロースカラム（Collaborativ
e Research）クロマトグラフィーで選択した。［Mendel
sohnら，（1986）］に記載のように培養細胞からゲノム
DNAを調製した。
し、CsClのクッション上で遠心することにより培養細胞
及び組織から全RNAを単離した［Chirgwin,J.,Przybyla,
A.,MacDonald,R.及びRutter W.Biochem. 18:5294−5299
（1979）］。ポリＡ＋ RNAは製造業者に方法に従って
予め充填したオリゴDtセルロースカラム（Collaborativ
e Research）クロマトグラフィーで選択した。［Mendel
sohnら，（1986）］に記載のように培養細胞からゲノム
DNAを調製した。
ノーザンおよびサザンハイブリッド形成 RNAを１％アガロースホルムアルデヒドゲルで分画し
［Goldberg,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5794−5799
（1980）］、Zeta−Probe（Bio−Rad）またはニトロセ
ルロース（Schleicher ＆ Schuell）膜に移した。サザ
ンハイブリッド形成については、ゲノムDNAをNew Engla
nd Biolabsの推奨する条件下で制限エンドヌクレアーゼ
（４単位／μｇ）で消化し、0.8％アガロースゲル上で
分画した。サザンの方法［Southern,E.M.J.Mol.Biol.9
8:503−517（1975）］に従ってDNAをニトロセルロース
フィルターに移した。ニトロセルロースフィルターとDN
Aプローブとのハイブリッド形成条件は（Schleicher及
びSchuell）の記載の通りであった。ニトロセルロース
フィルターとRNAプローブとのハイブリッド形成の条件
は［Melton,D.,Krieg,P.,Rebagliati,M.,Maniatis,T.,Z
inn,K.及びGreen,M.Nucleic Acids Res.12:7035−7056
（1984）］に記載の通りであった。ハイブリッド形成
後、サザンブロット及びノーザンブロットの両者を室温
で３回、次に65℃で１回、0.5％NaDodSO4（ニトロセル
ロースフィルター用）または１％NaDodSO4（Zeta−Prob
e膜用）を含有する0.3M NaCl/0.03Mクエン酸ナトリウム
（pH7.0）で洗った。32P−標識DNAプローブをオリゴ標
識キット（Pharmacia）で調製した。ヒトAlu反復blur−
８によるサザンハイブリッド形成はSP6ポリメラーゼを
使用してin vitroで合成したRNAプローブで実施した［M
eltonら，（1984）］。
［Goldberg,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5794−5799
（1980）］、Zeta−Probe（Bio−Rad）またはニトロセ
ルロース（Schleicher ＆ Schuell）膜に移した。サザ
ンハイブリッド形成については、ゲノムDNAをNew Engla
nd Biolabsの推奨する条件下で制限エンドヌクレアーゼ
（４単位／μｇ）で消化し、0.8％アガロースゲル上で
分画した。サザンの方法［Southern,E.M.J.Mol.Biol.9
8:503−517（1975）］に従ってDNAをニトロセルロース
フィルターに移した。ニトロセルロースフィルターとDN
Aプローブとのハイブリッド形成条件は（Schleicher及
びSchuell）の記載の通りであった。ニトロセルロース
フィルターとRNAプローブとのハイブリッド形成の条件
は［Melton,D.,Krieg,P.,Rebagliati,M.,Maniatis,T.,Z
inn,K.及びGreen,M.Nucleic Acids Res.12:7035−7056
（1984）］に記載の通りであった。ハイブリッド形成
後、サザンブロット及びノーザンブロットの両者を室温
で３回、次に65℃で１回、0.5％NaDodSO4（ニトロセル
ロースフィルター用）または１％NaDodSO4（Zeta−Prob
e膜用）を含有する0.3M NaCl/0.03Mクエン酸ナトリウム
（pH7.0）で洗った。32P−標識DNAプローブをオリゴ標
識キット（Pharmacia）で調製した。ヒトAlu反復blur−
８によるサザンハイブリッド形成はSP6ポリメラーゼを
使用してin vitroで合成したRNAプローブで実施した［M
eltonら，（1984）］。
ゲノムライブラリーの構築 Maniatis［Maniatis,T.,Fritsch,E.及びSambrook,J.M
olecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring H
arbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）］
に従ってゲノムライブラリーを構築し、CM−1.24 L−細
胞形質転換細胞から調製した高分子量ゲノムDNA300μｇ
をSau 3A（New England Biolabs）36単位で部分的に消
化し、10−40％の蔗糖勾配で分画した。15−20kbの大き
さの断片を含有する画分を集め、BamH I及びHind III
（Stratgene）で予め消化したλ2001アームに連結し、G
igapack Gold抽出物（Stratagene）を使用して充填し
た。ライブラリーを大腸菌P2392上に載せ、サザンブロ
ットについて述べたハイブリッド形成及び洗浄条件を使
用してblur−8 RNAプローブで２重スクリーニングした
［Jelinek,W.,Toomey,P.,Leinwand,L.Duncan,C.,Biro,
P.,Choudary,P.,Weissman,S.,Rubin,C.,Houck,C.,Deini
nger,P.及びSchmid,C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1398
−1402（1980）］。
olecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring H
arbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）］
に従ってゲノムライブラリーを構築し、CM−1.24 L−細
胞形質転換細胞から調製した高分子量ゲノムDNA300μｇ
をSau 3A（New England Biolabs）36単位で部分的に消
化し、10−40％の蔗糖勾配で分画した。15−20kbの大き
さの断片を含有する画分を集め、BamH I及びHind III
（Stratgene）で予め消化したλ2001アームに連結し、G
igapack Gold抽出物（Stratagene）を使用して充填し
た。ライブラリーを大腸菌P2392上に載せ、サザンブロ
ットについて述べたハイブリッド形成及び洗浄条件を使
用してblur−8 RNAプローブで２重スクリーニングした
［Jelinek,W.,Toomey,P.,Leinwand,L.Duncan,C.,Biro,
P.,Choudary,P.,Weissman,S.,Rubin,C.,Houck,C.,Deini
nger,P.及びSchmid,C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1398
−1402（1980）］。
cDNAライブラリー オリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィー２回で
精製したHeLa細胞ポリ（Ａ）＋ RNAからcDNAを合成し
た。Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Bethesd
a Research Laboratories）を製造業者の提供する条件
に従って使用してcDNAの第一ストランドを合成した。cD
NAの第二ストランドはGubler及びHoffmannの手順［Gubl
er,U.及びHoffman,B.Gene 25:263−269（1983）］を使
用して合成した。第二ストランド合成後、二本鎖cDNAを
T4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）で処理
し、EcoR Iアダプター（Pharmacia）に連結した。アダ
プター含有cDNAをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehri
nger Mannheim）を使用して燐酸化し、Sepharose CL−6
Bスピンカラム（５′−３′、Inc.）で分画して小さいc
DNA産物及び非連結EcoR Iアダプターを除去した。二本
鎖cDNAをEcoR Iで消化したλgt10アーム（Stratagene）
に連結し、Gigapack Gold抽出物（Stratagene）を使用
して充填した。1.2×106個の組換え体を含有する非増幅
cDNAライブラリーを大腸菌C600Hf1−に載せた。ノーザ
ン及びサザンブロットについて述べたハイブリッド形成
及び洗浄条件を使用して、２組の（duplicate）フィル
ターをオリゴ標識法で調製したDNAプローブとハイブリ
ッド形成させた。
精製したHeLa細胞ポリ（Ａ）＋ RNAからcDNAを合成し
た。Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Bethesd
a Research Laboratories）を製造業者の提供する条件
に従って使用してcDNAの第一ストランドを合成した。cD
NAの第二ストランドはGubler及びHoffmannの手順［Gubl
er,U.及びHoffman,B.Gene 25:263−269（1983）］を使
用して合成した。第二ストランド合成後、二本鎖cDNAを
T4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）で処理
し、EcoR Iアダプター（Pharmacia）に連結した。アダ
プター含有cDNAをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehri
nger Mannheim）を使用して燐酸化し、Sepharose CL−6
Bスピンカラム（５′−３′、Inc.）で分画して小さいc
DNA産物及び非連結EcoR Iアダプターを除去した。二本
鎖cDNAをEcoR Iで消化したλgt10アーム（Stratagene）
に連結し、Gigapack Gold抽出物（Stratagene）を使用
して充填した。1.2×106個の組換え体を含有する非増幅
cDNAライブラリーを大腸菌C600Hf1−に載せた。ノーザ
ン及びサザンブロットについて述べたハイブリッド形成
及び洗浄条件を使用して、２組の（duplicate）フィル
ターをオリゴ標識法で調製したDNAプローブとハイブリ
ッド形成させた。
cDNAクローンHeLa1.5及びHeLa1.7は、1kb BamH Iゲノ
ムプローブを使用してgtll（Stratgene,Inc.）内でHeLa
細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより
得た。HeLa1.5由来の0.97kb EcoR I DNAプローブで上記
のHeLacDNAライブラリーをスクリーニングしてH20A及び
H20Bを得た。
ムプローブを使用してgtll（Stratgene,Inc.）内でHeLa
細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより
得た。HeLa1.5由来の0.97kb EcoR I DNAプローブで上記
のHeLacDNAライブラリーをスクリーニングしてH20A及び
H20Bを得た。
受容体cDNAクローンの発現 H20Aからの1.8Sma I−Bgl II画分をSma I及びBamH I
クローニング部位で発現ベクターPSVL（Pharmacia）に
サブクローニングし、PSVL−H20Aを得た。2.3kb Sma I
−Bgl II画分を使用して、同様の方法でPSVL−H20Bを構
築した。両方の構築物はポリオウイルス受容体の全コー
ド配列を含有している。これらのcDNAが機能性受容体を
コードするか否かを決定するために、上記のようなPSVL
−H20A、PSVL−H20Bまたはニシン精子DNAのいずれかを
含有するCaPO4沈澱物でＬ細胞を形質転換した。上記の
ように形質転換細胞はポリオウイルス感染への感受性に
ついてアッセイした。機能性ポリオウイルス受容体を発
現する安定なLtk+セルラインを上記のように単離した。
クローニング部位で発現ベクターPSVL（Pharmacia）に
サブクローニングし、PSVL−H20Aを得た。2.3kb Sma I
−Bgl II画分を使用して、同様の方法でPSVL−H20Bを構
築した。両方の構築物はポリオウイルス受容体の全コー
ド配列を含有している。これらのcDNAが機能性受容体を
コードするか否かを決定するために、上記のようなPSVL
−H20A、PSVL−H20Bまたはニシン精子DNAのいずれかを
含有するCaPO4沈澱物でＬ細胞を形質転換した。上記の
ように形質転換細胞はポリオウイルス感染への感受性に
ついてアッセイした。機能性ポリオウイルス受容体を発
現する安定なLtk+セルラインを上記のように単離した。
DNA配列決定 制限断片はM13ベクター内にサブクローニングしたク
ローン化cDNA挿入物由来であり［Vanisch−Peron,C.,Vi
eira,J.及びMessing,J.Gene 33:103−119（1985）］、
ジデオキシ法［Sanger,F.,Nicklen,S.及びCoulson,A.Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467（1977）］でヌク
レオチド配列を決定した。場合によっては、Exo−Mung
系（Stratagene）またはCyclone系（International Bio
technolgies,Inc.）を使用して巣状欠失（nested delet
ions）を構築した。
ローン化cDNA挿入物由来であり［Vanisch−Peron,C.,Vi
eira,J.及びMessing,J.Gene 33:103−119（1985）］、
ジデオキシ法［Sanger,F.,Nicklen,S.及びCoulson,A.Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467（1977）］でヌク
レオチド配列を決定した。場合によっては、Exo−Mung
系（Stratagene）またはCyclone系（International Bio
technolgies,Inc.）を使用して巣状欠失（nested delet
ions）を構築した。
ポリオウイルス細胞受容体（PVR）をコードする遺伝子
を含有するコスミドクローンの単離 ゲノムDNAを［Mendelsohnら,Cellular Receptor for
Poliovirus:Nucleotide Sequence and Expression of a
New Member of the Immunoglobulin Superfamily,Cel
l,56:855−865（1989）］に記載のようにHeLa細胞から
調製し、制限エンドヌクレアーゼMbo Iで部分消化し
た。消化したDNAを低融点アガロースゲル電気泳動で分
画した。36−48kbのDNAをゲルから切り出し、アガロー
スを溶融し、フェノール抽出及びエタノール沈澱でDNA
を精製した。DNAをBamH Iで予め消化したコスミドベク
ターpWE15（Stratagene）に連結した。連結混合物をバ
クテリオファージλヘッド（Gigapack Gold,Stratagen
e）に充填し、カナマイシン選択下で大腸菌NM554に載せ
た。PVRcDNA由来のDNAプローブ［Mendelsohnら,1989］
を使用して、コロニーハイブリッド形成［Maniatisら,1
982］によりPVR遺伝子挿入について得られたコロニーを
スクリーニングした。全体で1.1×106個のコロニーをス
クリーニングし、６個のハイブリッド形成陽性クローン
を得た。さらに分析するためにPRG−１及びPRG−３と呼
ぶ２つのコスミドクローンを選択した。これらのコスミ
ドクローンの制限地図を第８図に示す。PRG−１のDNA挿
入は長さ37kbであり、PRG−３では36kbである。クロー
ン化したPVRcDNAによるサザン分析［Mendelsohnら,198
9］により、両方のコスミドクローンがPVRコード領域を
含有していることが明かとなった。さらに、PRG−３はP
RG−１に比べ５′−方向に延びているのに対し、PRG−
１はPRG−３より３′方向に伸びていた。コスミドクロ
ーンPRG−１及びPRG−３は機能性PVRをコードする コスミドクローンPRG−１及びPRG−３が機能性PVRを
コードするかを決定するために、コスミドDNAを培養マ
ウスＬ細胞に形質転換し、48時間後に［Mendelsohnら,1
989］に記載のように細胞をポリオウイルス感染させ
た。ウイルス感染０及び24時間後に細胞培養培地のサン
プルを採取した。結果（第２表）は、感染24時間後の細
胞培養培地内にウイルスが存在することから示されるよ
うに、両方のコスミドがポリオウイルスの機能性細胞受
容体をコードすることを示している。いずれかのコスミ
ドクローンを発現する安定なＬ細胞形質転換体も［Mend
elsohnら,1989］に述べたように樹立した。ポリオウイ
ルス感染への感受性から判定すると、両方のコスミドク
ローンはPVRを発現するＬ細胞形質転換体を生じさせ
た。ポリオウイルスに感受性のＬクローンが高頻度（75
％）で得られ、このことはコスミドクローンがPVRプロ
モータ配列を含有していることを示している。
を含有するコスミドクローンの単離 ゲノムDNAを［Mendelsohnら,Cellular Receptor for
Poliovirus:Nucleotide Sequence and Expression of a
New Member of the Immunoglobulin Superfamily,Cel
l,56:855−865（1989）］に記載のようにHeLa細胞から
調製し、制限エンドヌクレアーゼMbo Iで部分消化し
た。消化したDNAを低融点アガロースゲル電気泳動で分
画した。36−48kbのDNAをゲルから切り出し、アガロー
スを溶融し、フェノール抽出及びエタノール沈澱でDNA
を精製した。DNAをBamH Iで予め消化したコスミドベク
ターpWE15（Stratagene）に連結した。連結混合物をバ
クテリオファージλヘッド（Gigapack Gold,Stratagen
e）に充填し、カナマイシン選択下で大腸菌NM554に載せ
た。PVRcDNA由来のDNAプローブ［Mendelsohnら,1989］
を使用して、コロニーハイブリッド形成［Maniatisら,1
982］によりPVR遺伝子挿入について得られたコロニーを
スクリーニングした。全体で1.1×106個のコロニーをス
クリーニングし、６個のハイブリッド形成陽性クローン
を得た。さらに分析するためにPRG−１及びPRG−３と呼
ぶ２つのコスミドクローンを選択した。これらのコスミ
ドクローンの制限地図を第８図に示す。PRG−１のDNA挿
入は長さ37kbであり、PRG−３では36kbである。クロー
ン化したPVRcDNAによるサザン分析［Mendelsohnら,198
9］により、両方のコスミドクローンがPVRコード領域を
含有していることが明かとなった。さらに、PRG−３はP
RG−１に比べ５′−方向に延びているのに対し、PRG−
１はPRG−３より３′方向に伸びていた。コスミドクロ
ーンPRG−１及びPRG−３は機能性PVRをコードする コスミドクローンPRG−１及びPRG−３が機能性PVRを
コードするかを決定するために、コスミドDNAを培養マ
ウスＬ細胞に形質転換し、48時間後に［Mendelsohnら,1
989］に記載のように細胞をポリオウイルス感染させ
た。ウイルス感染０及び24時間後に細胞培養培地のサン
プルを採取した。結果（第２表）は、感染24時間後の細
胞培養培地内にウイルスが存在することから示されるよ
うに、両方のコスミドがポリオウイルスの機能性細胞受
容体をコードすることを示している。いずれかのコスミ
ドクローンを発現する安定なＬ細胞形質転換体も［Mend
elsohnら,1989］に述べたように樹立した。ポリオウイ
ルス感染への感受性から判定すると、両方のコスミドク
ローンはPVRを発現するＬ細胞形質転換体を生じさせ
た。ポリオウイルスに感受性のＬクローンが高頻度（75
％）で得られ、このことはコスミドクローンがPVRプロ
モータ配列を含有していることを示している。
第２表 コスミド ｔ＝０ ｔ＝24 pWE15 120 180 pSVL−H20A 80 4.3x104 PRG−１ 90 2.4x104 PRG−１ 80 4.3x104 PRG−３ 30 7.1x103 PRG−３ 110 4.6x103 ポリオウイルス受容体を発現するトランスジェニックマ
ウスの作製 プロモータ配列を含むヒトポリオウイルス受容体遺伝
子を含有するDNA断片は適切な制限エンドヌクレアーゼ
を使用してベクター配列から切り出し、低融点アガロー
ス電気泳動で精製することができる。DNA断片を含有す
るバンドを切り出し、アガロースを溶融し、フェノール
抽出及びエタノール沈澱によりDNAを精製できる。次に1
0−20μｇのDNAをCsCl勾配中で遠心して平衡化し、DNA
含有画分を10mMトリス（pH7.4）、0.2MmEDTAに対して２
−３日透析し、−20℃で保存した。
ウスの作製 プロモータ配列を含むヒトポリオウイルス受容体遺伝
子を含有するDNA断片は適切な制限エンドヌクレアーゼ
を使用してベクター配列から切り出し、低融点アガロー
ス電気泳動で精製することができる。DNA断片を含有す
るバンドを切り出し、アガロースを溶融し、フェノール
抽出及びエタノール沈澱によりDNAを精製できる。次に1
0−20μｇのDNAをCsCl勾配中で遠心して平衡化し、DNA
含有画分を10mMトリス（pH7.4）、0.2MmEDTAに対して２
−３日透析し、−20℃で保存した。
妊娠した雌の卵管を切開して、前夜に交尾させた雌の
マウスから受精卵を回収することができる。卵を回収
し、M2培地に保存できる［Hogan,B.,Constantini,F.及
びLacy,E.“Manipulating the Mouse Embryo:A Laborat
ory Manual"Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,（1986）］。マイクロ注入針は自動ピペット
プラー（David Kopf,700C型）での毛細管作成（Clark E
lectromedical Instruments,カタログ番号GC100TF−1
5）により調製した。マイクロ注入針にDNA溶液を充填
し、ライツ機器管に結合し、圧力注入装置に接続した
［Hoganら，（1986）］。機器管はライツマイクロマニ
ピュレータに接続しており、最終的にその運動を制御で
きる。M2培地を含有する凹型スライド内に卵を置き、No
marski干渉対照レンズを具備したNikon Diaphot顕微鏡
下で見ることができる。注入すべき卵を火炎艶だしガラ
ス保持ピペットの端で吸い上げて固定化する［Hoganら,
1986］。前核が膨潤したように見えるまで圧力でマイク
ロ注入針を挿入することができる。次に針を引き抜き、
残りの卵で操作を繰り返す。
マウスから受精卵を回収することができる。卵を回収
し、M2培地に保存できる［Hogan,B.,Constantini,F.及
びLacy,E.“Manipulating the Mouse Embryo:A Laborat
ory Manual"Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,（1986）］。マイクロ注入針は自動ピペット
プラー（David Kopf,700C型）での毛細管作成（Clark E
lectromedical Instruments,カタログ番号GC100TF−1
5）により調製した。マイクロ注入針にDNA溶液を充填
し、ライツ機器管に結合し、圧力注入装置に接続した
［Hoganら，（1986）］。機器管はライツマイクロマニ
ピュレータに接続しており、最終的にその運動を制御で
きる。M2培地を含有する凹型スライド内に卵を置き、No
marski干渉対照レンズを具備したNikon Diaphot顕微鏡
下で見ることができる。注入すべき卵を火炎艶だしガラ
ス保持ピペットの端で吸い上げて固定化する［Hoganら,
1986］。前核が膨潤したように見えるまで圧力でマイク
ロ注入針を挿入することができる。次に針を引き抜き、
残りの卵で操作を繰り返す。
約500個の卵に上記のように注入し、その後約400個が
生存可能であろう。生存可能な卵を偽妊娠期の（pseudo
pregnant）雌性マウスの卵管に移し、出産させる［Hoga
nら，（1986）］。移した卵の約15％（60個）から産ま
れる。３週令で、各マウスの尾の末端1cmを取り、標準
手順［Hoganら，（1986）］でDNAを単離することができ
る。ポリオウイルス受容体のゲノムまたはcDNAクローン
由来のDNAプローブを使用してDNAをサザンブロットハイ
ブリッド形成で分析し、どのマウスがトランスジェニッ
クであり、注入した遺伝子の完全なコピーを有している
かを決定できる。これらのトランスジェニックマウスの
各々は新しいトランスジェニック株のファウンダーとし
て使用できる。この目的で、各マウスを正常（非トラン
スジェニック）な相手と交尾させ、子孫を生み出すこと
ができる。トランスジェニックな子孫は尾のDNAのサザ
ンブロットで同定できる。
生存可能であろう。生存可能な卵を偽妊娠期の（pseudo
pregnant）雌性マウスの卵管に移し、出産させる［Hoga
nら，（1986）］。移した卵の約15％（60個）から産ま
れる。３週令で、各マウスの尾の末端1cmを取り、標準
手順［Hoganら，（1986）］でDNAを単離することができ
る。ポリオウイルス受容体のゲノムまたはcDNAクローン
由来のDNAプローブを使用してDNAをサザンブロットハイ
ブリッド形成で分析し、どのマウスがトランスジェニッ
クであり、注入した遺伝子の完全なコピーを有している
かを決定できる。これらのトランスジェニックマウスの
各々は新しいトランスジェニック株のファウンダーとし
て使用できる。この目的で、各マウスを正常（非トラン
スジェニック）な相手と交尾させ、子孫を生み出すこと
ができる。トランスジェニックな子孫は尾のDNAのサザ
ンブロットで同定できる。
PVR;PRG−１及びPRG−３を発現するトランスジェニック
マウスの構築 コスミドPRG−１及びPRG−３をNot1で切断し、PVR遺
伝子断片を低融点アガロースゲル電気泳動で単離した。
DNA断片をゲルから切り出し、アガロースを溶融させ、
フェノール抽出及びエタノール沈澱でDNAを精製した。1
0−20μｇのDNAをCsCl勾配中で遠心して平衡化し、DNA
含有画分を10mMトリス（pH7.4）、0.2mMEDTAに対して２
−３日透析し、20℃で保存した。
マウスの構築 コスミドPRG−１及びPRG−３をNot1で切断し、PVR遺
伝子断片を低融点アガロースゲル電気泳動で単離した。
DNA断片をゲルから切り出し、アガロースを溶融させ、
フェノール抽出及びエタノール沈澱でDNAを精製した。1
0−20μｇのDNAをCsCl勾配中で遠心して平衡化し、DNA
含有画分を10mMトリス（pH7.4）、0.2mMEDTAに対して２
−３日透析し、20℃で保存した。
妊娠した雌の卵管を切開し、前夜に交尾させた雌のマ
ウスから受精卵を回収した。卵を回収し、M2培地に保存
した［Hogan,B.ら,Manipulating the Mouse Embryo: A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor,（1986）］。マイクロ注入針は自動
ピペットプラー（David Kopf,700C型）での毛細管作成
（Clark Electromedical Instruments,カタログ番号GC1
00TF−15）により調製した。マイクロ注入針にDNA溶液
を充填し、ライツ機器管に結合し、圧力注入装置に接続
した［Hoganら，（1986）］。機器管はライツマイクロ
マニピュレータに接続しており、最終的にその運動を制
御した。卵をM2培地を含有する凹型スライド内に置き、
Nomarski干渉対照レンズを具備したNikon Diaphot顕微
鏡下で見た。注入すべき卵を火炎艶だしガラス保持ピペ
ットの端で吸い上げて固定化した［Hoganら,1986］。前
核が膨潤したように見えるまで圧力でマイクロ注入針を
挿入することがきる。次に針を引き抜き、残りの卵で操
作を繰り返す。
ウスから受精卵を回収した。卵を回収し、M2培地に保存
した［Hogan,B.ら,Manipulating the Mouse Embryo: A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor,（1986）］。マイクロ注入針は自動
ピペットプラー（David Kopf,700C型）での毛細管作成
（Clark Electromedical Instruments,カタログ番号GC1
00TF−15）により調製した。マイクロ注入針にDNA溶液
を充填し、ライツ機器管に結合し、圧力注入装置に接続
した［Hoganら，（1986）］。機器管はライツマイクロ
マニピュレータに接続しており、最終的にその運動を制
御した。卵をM2培地を含有する凹型スライド内に置き、
Nomarski干渉対照レンズを具備したNikon Diaphot顕微
鏡下で見た。注入すべき卵を火炎艶だしガラス保持ピペ
ットの端で吸い上げて固定化した［Hoganら,1986］。前
核が膨潤したように見えるまで圧力でマイクロ注入針を
挿入することがきる。次に針を引き抜き、残りの卵で操
作を繰り返す。
約1000個の卵に上記のようにDNAを注入した。生存可
能な卵を偽妊娠期の雌性マウスの卵管に移し、出産させ
た［Hoganら,1986］。３週令で、各マウスの尾の末端1c
mを取り、標準手順［Hoganら,1986］でDNAを単離した。
ポリオウイルス受容体のcDNAクローン由来のDNAプロー
ブを使用してDNAをサザンブロットハイブリッド形成で
分析し、どのマウスがトランスジェニックであり、注入
した遺伝子の完全なコピーを有しているか決定できる。
能な卵を偽妊娠期の雌性マウスの卵管に移し、出産させ
た［Hoganら,1986］。３週令で、各マウスの尾の末端1c
mを取り、標準手順［Hoganら,1986］でDNAを単離した。
ポリオウイルス受容体のcDNAクローン由来のDNAプロー
ブを使用してDNAをサザンブロットハイブリッド形成で
分析し、どのマウスがトランスジェニックであり、注入
した遺伝子の完全なコピーを有しているか決定できる。
生まれたマウス54匹のうち21匹はPRG−１配列を含有
しており、生まれたマウス37匹のうち13匹はPRG−３配
列を含有しいた。サザンブロット分析から各ファウンダ
ーマウスは頭から尾に組込まれたPVR遺伝子のコピーを
種々の数で含有していることが明らかとなった。
しており、生まれたマウス37匹のうち13匹はPRG−３配
列を含有しいた。サザンブロット分析から各ファウンダ
ーマウスは頭から尾に組込まれたPVR遺伝子のコピーを
種々の数で含有していることが明らかとなった。
何匹かのトランスジェニックファウンダーを正常（非
トランスジェニック）な相手と交尾させ、F1子孫を得る
ことができる。尾のDNAのサザンブロット分析によりト
ランスジェニック動物を同定した。これらのマウスを下
記の研究に使用した。次のトランスジェニックファウン
ダーを使用した:PRG−１−17、雄性、PVR遺伝子のコピ
ー10個を含有している;PRV−３−６、雄性、PVR遺伝子
のコピーを４個含有している;PRV−３−６、雄性、PVR
遺伝子のコピーを30個含有している；及びPRG−１−
７、雌性、PVR遺伝子のコピーを30個含有している。ト
ランスジェニックマウスの器官RNAのノーザンブロット
分析 どのトランスジェニックマスウ組織がPVR RNAを発現
するかを決定するために、F1トランスジェニックマウス
から種々の器官を切除し、グアニジンチオシアネート法
［Mendelsohnら,1989］でRNAを調製した。PVRcDNAプロ
ーブを使用してRNAをノーザン分析にかけた。ファウン
ダーPRG−１−17、PRG−１−７、PRG−３−６及びPRG−
３−９のトランスジェニックな子孫では、肝臓での発現
は常に非常に低いものであったが、脳、脊髄、肺、肝
臓、心臓、腎臓、小腸、脾臓及び筋肉を含む検査した全
器官で3.3kbPVRR NAが検出された。3.3kbRNAは検査し
たヒトの全組織で以前検出された［Mendelsohnら,198
9］。これらの結果は、これらトランスジェニックマウ
スラインの全ての器官でPVR遺伝子が発現されることを
示している。マウス組織ホモジェネートによるポリオウ
イルス結合アッセイ 機能性PVRがトランスジェニックマウス組織中で発現
されるかを決定するために、組織ホモジェネートでポリ
オウイルス結合アッセイを実施した。PRG−１−17 F1ト
ランスジェニックマウスから種々の器官を切除し、５％
（w/v）ホモジェネートを燐酸塩緩衝食塩水（PBS）中で
調製した。1/10mlのホモジェネートを１型ポリオウイル
スMahony株0.01mlと混合し、室温で２時間インキュベー
トした。次に、［La Monicaら，（1986）Mapping of Se
quences Required For Mouse Neurovirulence of Polio
virus Type 2,Lansing J.Virol.57;515−525）に記載の
ように、HeLa細胞単層上でのプラークアッセイにより混
合物を感染性ポリオウイルスについてアッセイした。結
合活性により混合物中の感染性粒子数は減少する。１型
ポリオウイルスMahoney種はマウスに感染せず、マウス
がこの種の受容体を有していないことが知られているた
め、この種をこれらの研究に使用した。
トランスジェニック）な相手と交尾させ、F1子孫を得る
ことができる。尾のDNAのサザンブロット分析によりト
ランスジェニック動物を同定した。これらのマウスを下
記の研究に使用した。次のトランスジェニックファウン
ダーを使用した:PRG−１−17、雄性、PVR遺伝子のコピ
ー10個を含有している;PRV−３−６、雄性、PVR遺伝子
のコピーを４個含有している;PRV−３−６、雄性、PVR
遺伝子のコピーを30個含有している；及びPRG−１−
７、雌性、PVR遺伝子のコピーを30個含有している。ト
ランスジェニックマウスの器官RNAのノーザンブロット
分析 どのトランスジェニックマスウ組織がPVR RNAを発現
するかを決定するために、F1トランスジェニックマウス
から種々の器官を切除し、グアニジンチオシアネート法
［Mendelsohnら,1989］でRNAを調製した。PVRcDNAプロ
ーブを使用してRNAをノーザン分析にかけた。ファウン
ダーPRG−１−17、PRG−１−７、PRG−３−６及びPRG−
３−９のトランスジェニックな子孫では、肝臓での発現
は常に非常に低いものであったが、脳、脊髄、肺、肝
臓、心臓、腎臓、小腸、脾臓及び筋肉を含む検査した全
器官で3.3kbPVRR NAが検出された。3.3kbRNAは検査し
たヒトの全組織で以前検出された［Mendelsohnら,198
9］。これらの結果は、これらトランスジェニックマウ
スラインの全ての器官でPVR遺伝子が発現されることを
示している。マウス組織ホモジェネートによるポリオウ
イルス結合アッセイ 機能性PVRがトランスジェニックマウス組織中で発現
されるかを決定するために、組織ホモジェネートでポリ
オウイルス結合アッセイを実施した。PRG−１−17 F1ト
ランスジェニックマウスから種々の器官を切除し、５％
（w/v）ホモジェネートを燐酸塩緩衝食塩水（PBS）中で
調製した。1/10mlのホモジェネートを１型ポリオウイル
スMahony株0.01mlと混合し、室温で２時間インキュベー
トした。次に、［La Monicaら，（1986）Mapping of Se
quences Required For Mouse Neurovirulence of Polio
virus Type 2,Lansing J.Virol.57;515−525）に記載の
ように、HeLa細胞単層上でのプラークアッセイにより混
合物を感染性ポリオウイルスについてアッセイした。結
合活性により混合物中の感染性粒子数は減少する。１型
ポリオウイルスMahoney種はマウスに感染せず、マウス
がこの種の受容体を有していないことが知られているた
め、この種をこれらの研究に使用した。
トランスジェニックマウスのポリオウイルス感染への感
受性 PVRを発現するトランスジェニックマウスがポリオウ
イルス感染に感受性であるかを決定するために、２つの
実験を実施した。最初の実験では、ファウンダーPRG−
１−17のトランスジェニックなF1子孫８匹及び非トラン
スジェニックな子孫８匹の脳内に１型Mahoneyポリオウ
イルス１×105プラーク形成単位を接種した。マウスは
麻酔の兆候について毎日観察した。接種日（０日）から
毎日少なくとも１匹のトランスジェニック及び非トラン
スジェニックマウスを殺し、脳及び脊髄を取り出し、PB
S中でホモジェネートとし、組織中のウイルス含量をHeL
a細胞単層上でのプラークアッセイで測定した。結果を
第３図に示す。
受性 PVRを発現するトランスジェニックマウスがポリオウ
イルス感染に感受性であるかを決定するために、２つの
実験を実施した。最初の実験では、ファウンダーPRG−
１−17のトランスジェニックなF1子孫８匹及び非トラン
スジェニックな子孫８匹の脳内に１型Mahoneyポリオウ
イルス１×105プラーク形成単位を接種した。マウスは
麻酔の兆候について毎日観察した。接種日（０日）から
毎日少なくとも１匹のトランスジェニック及び非トラン
スジェニックマウスを殺し、脳及び脊髄を取り出し、PB
S中でホモジェネートとし、組織中のウイルス含量をHeL
a細胞単層上でのプラークアッセイで測定した。結果を
第３図に示す。
結果 ポリオウイルス受容体を発現する二次形質転換細胞 本発明では、HeLa細胞からマウスＬ細胞にポリオウイ
ルス感染への感受性を移すためにDNA形質転換を使用し
て、ポリオウイルス受容体の分子クローンを得た。ヒト
Alu反復配列への結合によりヒト受容体遺伝子をマウス
ゲノム内で同定した。HeLa細胞でDNAでＬ細胞を形質転
換して得たセルラインCM−１の単離については既に述べ
られている［Mendelsohnら，（1986）］。CM−１セルラ
インはポリオウイルス受容体を発現し、３つのポリオウ
イルス血清型全てに感受性である。
ルス感染への感受性を移すためにDNA形質転換を使用し
て、ポリオウイルス受容体の分子クローンを得た。ヒト
Alu反復配列への結合によりヒト受容体遺伝子をマウス
ゲノム内で同定した。HeLa細胞でDNAでＬ細胞を形質転
換して得たセルラインCM−１の単離については既に述べ
られている［Mendelsohnら，（1986）］。CM−１セルラ
インはポリオウイルス受容体を発現し、３つのポリオウ
イルス血清型全てに感受性である。
クローン化したAluDNAプローブを使用するサザンハイ
ブリッド形成分析により測定すると、CM−１細胞は大量
にヒトDNAを含有している（第1A図、線１）。ポリオウ
イルス受容体遺伝子の発現に不必要なヒトDNA配列を除
去するために、Ltk-細胞をヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ遺伝子及び一次形質転換細胞CM−１から調製した
ゲノムDNAで同時形質転換させた。CM−１セルラインに
ついて記載したように［Mendelsohnら，（1986）］、５
つの独立したポリオウイルス感受性二次形質転換細胞を
単離した。Alu反復プローブblur−８を使用した、二次
形質転換細胞からのゲノムDNAのサザンハイブリッド形
成分析を第1A図に示す。５つのセルライン全ては10kb B
amH I制限断片を含有しており、一方CM−1.17以外は全
て6kb及び2kb BamH I断片を含有している。さらに、3kb
BamH I断片はCM−1.17及びCM−1.27に共通である。こ
れらの結果は、ポリオウイルス受容体遺伝子は内部Alu
反復配列を含有しており、ポリオウイルス受容体をコー
ドするゲノムクローンを二次形質転換細胞から単離する
ためにblur−８プローブを使用できることを示す。
ブリッド形成分析により測定すると、CM−１細胞は大量
にヒトDNAを含有している（第1A図、線１）。ポリオウ
イルス受容体遺伝子の発現に不必要なヒトDNA配列を除
去するために、Ltk-細胞をヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ遺伝子及び一次形質転換細胞CM−１から調製した
ゲノムDNAで同時形質転換させた。CM−１セルラインに
ついて記載したように［Mendelsohnら，（1986）］、５
つの独立したポリオウイルス感受性二次形質転換細胞を
単離した。Alu反復プローブblur−８を使用した、二次
形質転換細胞からのゲノムDNAのサザンハイブリッド形
成分析を第1A図に示す。５つのセルライン全ては10kb B
amH I制限断片を含有しており、一方CM−1.17以外は全
て6kb及び2kb BamH I断片を含有している。さらに、3kb
BamH I断片はCM−1.17及びCM−1.27に共通である。こ
れらの結果は、ポリオウイルス受容体遺伝子は内部Alu
反復配列を含有しており、ポリオウイルス受容体をコー
ドするゲノムクローンを二次形質転換細胞から単離する
ためにblur−８プローブを使用できることを示す。
ポリオウイルス受容体をコードするゲノムクローンの単
離 二次形質転換細胞Ｃ−1.24由来のDNAを使用して置換
ベクターλ2001でゲノムライブラリーを構築した。blur
−８プローブで約400,000個のバクテリオファージをス
クリーンし、重複DNA挿入物を含有する３つのバクテリ
オファージ組換え体を単離した（第1B図）。全体とし
て、ファージ挿入物は約30kbのヒトゲノムDNAに及ぶ。
λPVR−４はマウスの配列を有しており、従ってCM−1.2
4に見られるマウス及びヒトDNAの分岐の１つを含有して
いる。λPVR−２は6kbと、Aluとは反応しないが二次形
質転換細胞の全部に存在する10kbのAlu−反応性BamH I
断片のほとんどを含有している（データは示さない）。
離 二次形質転換細胞Ｃ−1.24由来のDNAを使用して置換
ベクターλ2001でゲノムライブラリーを構築した。blur
−８プローブで約400,000個のバクテリオファージをス
クリーンし、重複DNA挿入物を含有する３つのバクテリ
オファージ組換え体を単離した（第1B図）。全体とし
て、ファージ挿入物は約30kbのヒトゲノムDNAに及ぶ。
λPVR−４はマウスの配列を有しており、従ってCM−1.2
4に見られるマウス及びヒトDNAの分岐の１つを含有して
いる。λPVR−２は6kbと、Aluとは反応しないが二次形
質転換細胞の全部に存在する10kbのAlu−反応性BamH I
断片のほとんどを含有している（データは示さない）。
ポリオウイルスに感受性の細胞中でのみRNAとハイブ
リッド形成するエキソン特異プローブを同定するため
に、ノーザンハイブリッド形成実験のプローブとしてゲ
ノムクローン由来の制限断片を使用した。λPVR−２及
びλPVR−３に含まれる1kbのBamH I制限断片はHeLa細胞
及びSY5Y神経芽細胞腫中の3.3kbRNA並びに二次形質転換
細胞CM−1.9中の3.0kbRNAとハイブリッド形成した（第2
A図）。形質転換細胞中のより短いRNAは、マウスゲノム
内に受容体配列を組込む間に生じた５′及び３′非コー
ディングエキソンの欠失によるものと思われる。1kbのB
amH I断片ポリオウイルス受容体を発現しないＬ細胞か
ら単離したRNAとはハイブリッド形成しなかった（第2A
図）。
リッド形成するエキソン特異プローブを同定するため
に、ノーザンハイブリッド形成実験のプローブとしてゲ
ノムクローン由来の制限断片を使用した。λPVR−２及
びλPVR−３に含まれる1kbのBamH I制限断片はHeLa細胞
及びSY5Y神経芽細胞腫中の3.3kbRNA並びに二次形質転換
細胞CM−1.9中の3.0kbRNAとハイブリッド形成した（第2
A図）。形質転換細胞中のより短いRNAは、マウスゲノム
内に受容体配列を組込む間に生じた５′及び３′非コー
ディングエキソンの欠失によるものと思われる。1kbのB
amH I断片ポリオウイルス受容体を発現しないＬ細胞か
ら単離したRNAとはハイブリッド形成しなかった（第2A
図）。
ポリオウイルス受容体をコードするcDNAクローンの単離 ポリオウイルス受容体をコードするcDNAクローンを単
離するために、上記の1kbBamH IゲノムプローブでcDNA
プローブをスクリーニングした。ノーザンハイブリッド
形成及びヌクレオチド配列分析の結果、HeLa細胞ライブ
ラリーから単離した４つのcDNAクローン（HeLa1.7、HeL
a1.5、H20A及びH20B、第３図）は少なくとも３つの異な
るmRNA種を表していることが判った。４つのcDNAは全て
ほぼ第二EcoR I部位から第一Xho I部位を通って伸びて
いる中心の0.85kb断片を共有している。この共通の中心
断片に対し、２つの異なるEco RI断片のいずれかが５′
−末端に、また２つのXho I−EcoR I断片のいずれかが
３′−末端に側位に位置（flank）している。
離するために、上記の1kbBamH IゲノムプローブでcDNA
プローブをスクリーニングした。ノーザンハイブリッド
形成及びヌクレオチド配列分析の結果、HeLa細胞ライブ
ラリーから単離した４つのcDNAクローン（HeLa1.7、HeL
a1.5、H20A及びH20B、第３図）は少なくとも３つの異な
るmRNA種を表していることが判った。４つのcDNAは全て
ほぼ第二EcoR I部位から第一Xho I部位を通って伸びて
いる中心の0.85kb断片を共有している。この共通の中心
断片に対し、２つの異なるEco RI断片のいずれかが５′
−末端に、また２つのXho I−EcoR I断片のいずれかが
３′−末端に側位に位置（flank）している。
２つの最も長いcDNAクローンH20A及びH20Bのヌクレオ
チド配列分析は、各々に、第一EcoR I断片内のメチオニ
ンコドンから始まり、第一Xho I部位を越えた２つの異
なる位置の終結コドンで終わっている読み取り枠が存在
することを示している（第３図）。従って、形質転換実
験では、ポリオウイルス受容体の発現を司る能力につい
てH20A及びH20Bをテストした。H20A由来の1.8kb Sma I
−Bgl II断片及びH20B由来の2.3kb Sma I−Bgl II断片
を発現ベクターPSVL内にサブクローニングし、Ltk-細胞
を構築物またはニシン精子DNAのいずれかで形質転換し
た。形質転換48時間後、細胞をポリオウイルスに感染さ
せ、24時間後に細胞培養培地を感染性ウイルスの存在に
ついてアッセイした。PSVL−H20AまたはPSVL−H20Bのい
ずれかで形質転換したＬ細胞をポリオウイルスに感染さ
せると、大量のウイルス子孫が生み出され（第１表）、
cDNAクローンがポリオウイルス受容体をコードしている
ことを確認した。対照的に、ニシン精子DNAで形質転換
したＬ細胞はポリオウイルス感染に感受性ではなかっ
た。PSVL−H20A及びPSVL−H20Bの両者もポリオウイルス
感染に感受性であり、その場でのロゼット実験では抗受
容体モノクローナル抗体と反応した（データは示さな
い）。
チド配列分析は、各々に、第一EcoR I断片内のメチオニ
ンコドンから始まり、第一Xho I部位を越えた２つの異
なる位置の終結コドンで終わっている読み取り枠が存在
することを示している（第３図）。従って、形質転換実
験では、ポリオウイルス受容体の発現を司る能力につい
てH20A及びH20Bをテストした。H20A由来の1.8kb Sma I
−Bgl II断片及びH20B由来の2.3kb Sma I−Bgl II断片
を発現ベクターPSVL内にサブクローニングし、Ltk-細胞
を構築物またはニシン精子DNAのいずれかで形質転換し
た。形質転換48時間後、細胞をポリオウイルスに感染さ
せ、24時間後に細胞培養培地を感染性ウイルスの存在に
ついてアッセイした。PSVL−H20AまたはPSVL−H20Bのい
ずれかで形質転換したＬ細胞をポリオウイルスに感染さ
せると、大量のウイルス子孫が生み出され（第１表）、
cDNAクローンがポリオウイルス受容体をコードしている
ことを確認した。対照的に、ニシン精子DNAで形質転換
したＬ細胞はポリオウイルス感染に感受性ではなかっ
た。PSVL−H20A及びPSVL−H20Bの両者もポリオウイルス
感染に感受性であり、その場でのロゼット実験では抗受
容体モノクローナル抗体と反応した（データは示さな
い）。
Ltk-細胞を表示したDNAで形質転換し、48時間後に１
型ポリオウイルスに感染させた。細胞培養培地中のPFU/
mlは感染０及び24時間後に測定した。
型ポリオウイルスに感染させた。細胞培養培地中のPFU/
mlは感染０及び24時間後に測定した。
PSVL−H20AまたはPSVL−H20Bのいずれかを含有するポ
リオウイルスに感受性の形質転換細胞が適切な長さの特
異的トランスクリプトを発現することを確認するため
に、プローブとしてHeLa1.5の0.97kb EcoR I断片を使用
するノーザンハイブリッド形成により、安定なＬ細胞形
質転換細胞からのRNAを分析した。PSVL−H20A形質転換
細胞では2.4kbRNAが検出され、2.9kbの主要トランスク
リプトはSVL−H20B形質転換体で検出された（第2B
図）。これらはPSVL中での受容体cDNAの転写により得ら
れるRNAの大きさである。ニシン精子DNAで形質転換した
Ｌ細胞から調製したRNAは0.97kbプローブとハイブリッ
ド形成しなかった。
リオウイルスに感受性の形質転換細胞が適切な長さの特
異的トランスクリプトを発現することを確認するため
に、プローブとしてHeLa1.5の0.97kb EcoR I断片を使用
するノーザンハイブリッド形成により、安定なＬ細胞形
質転換細胞からのRNAを分析した。PSVL−H20A形質転換
細胞では2.4kbRNAが検出され、2.9kbの主要トランスク
リプトはSVL−H20B形質転換体で検出された（第2B
図）。これらはPSVL中での受容体cDNAの転写により得ら
れるRNAの大きさである。ニシン精子DNAで形質転換した
Ｌ細胞から調製したRNAは0.97kbプローブとハイブリッ
ド形成しなかった。
HeLa細胞及び二次形質転換細胞中で発現されるポリオ
ウイルス受容体mRNAを同定するために、HeLa細胞、二次
形質転換細胞CM−1.9及びLtk-細胞（第2C図）から調製
したポリ（Ａ）＋RNAを含有するノーザンブロットとHeL
a1.5由来の0.97kb EcoR I断片をハイブリッド形成させ
た。0.97kbのプローブはHeLa細胞の3.3kb及び5.6kbmRNA
とハイブリッド形成した。二次形質転換細胞CM−1.9で
は、0.85kbのプローブが約3.0kbの単一のmRNA種とハイ
ブリッド形成し（大きさの違いは短時間の暴露で目に見
える）；非形質転換Ltk-細胞由来のポリ（Ａ）＋RNAと
のハイブリッド形成は認められなかった。HeLa受容体cD
NAとハイブリッド形成するCM−1.9細胞中にmRNAが存在
することは、cDNAが二次形質転換細胞中で発現される受
容体遺伝子をコードすることを示している。
ウイルス受容体mRNAを同定するために、HeLa細胞、二次
形質転換細胞CM−1.9及びLtk-細胞（第2C図）から調製
したポリ（Ａ）＋RNAを含有するノーザンブロットとHeL
a1.5由来の0.97kb EcoR I断片をハイブリッド形成させ
た。0.97kbのプローブはHeLa細胞の3.3kb及び5.6kbmRNA
とハイブリッド形成した。二次形質転換細胞CM−1.9で
は、0.85kbのプローブが約3.0kbの単一のmRNA種とハイ
ブリッド形成し（大きさの違いは短時間の暴露で目に見
える）；非形質転換Ltk-細胞由来のポリ（Ａ）＋RNAと
のハイブリッド形成は認められなかった。HeLa受容体cD
NAとハイブリッド形成するCM−1.9細胞中にmRNAが存在
することは、cDNAが二次形質転換細胞中で発現される受
容体遺伝子をコードすることを示している。
ポリオウイルス受容体mRNAの転写パターンをさらに特
性化するために別のノーザンハイブリッド形成分析も実
施した（データは示さない）。H20A及びH20BcDNAの共通
領域及び分岐領域の両者から得たDNAプローブはHeLa細
胞の3.3kbmRNAとハイブリッド形成し、3.3kbmRNAが２つ
の同時に移動する種からなることを示している。しか
し、H20BcDNAが表すmRNAはH20AcDNAが表すmRNAより少な
いように思われる。5.6kbmRNAがH20Aには存在するがH20
Bには存在しない３′−末端配列とハイブリッド形成す
ることは、H20A配列の一部または全部がより大きなトラ
ンスクリプトに含まれており、クローンH20Bは3.3kbト
ランスクリプトにのみ表れることを示している。
性化するために別のノーザンハイブリッド形成分析も実
施した（データは示さない）。H20A及びH20BcDNAの共通
領域及び分岐領域の両者から得たDNAプローブはHeLa細
胞の3.3kbmRNAとハイブリッド形成し、3.3kbmRNAが２つ
の同時に移動する種からなることを示している。しか
し、H20BcDNAが表すmRNAはH20AcDNAが表すmRNAより少な
いように思われる。5.6kbmRNAがH20Aには存在するがH20
Bには存在しない３′−末端配列とハイブリッド形成す
ることは、H20A配列の一部または全部がより大きなトラ
ンスクリプトに含まれており、クローンH20Bは3.3kbト
ランスクリプトにのみ表れることを示している。
ポリオウイルス受容体cDNAクローンのヌクレオチド配列
分析 最初に枠内メチオニンコドンで始まる機能的に活性な
クローンH20A及びH20Bのヌクレオチド及び予想されるア
ミノ酸配列を第４図に示す２つのcDNAクローンに共通の
５′−非翻訳配列及び分岐した３′−非翻訳配列は図示
しない。cDNA配列は２つの緊密に詰まったメチオニンコ
ドンで始まり、その両者は開始コドンの一般法則に従
い、AUGに関して−３及び＋１の位置のプリンを有して
いる［Kozak M.,Cell.44:283−292（1986）］。最初の
メチオニンの次に、20個の非荷電疎水性アミノ末端信号
配列が伸びている。一般には344個のアミノ酸からなる
アミノ酸残基から始まるトランスメンブランドメインは
24個の疎水性非極性アミノ酸からなり、それにいくつか
の塩基性残基が続いている。トランスメンブランドメイ
ンのすぐ後で２つのcDNAの配列が分岐し、細胞質ドメイ
ンでは異なるアミノ酸配列を形成している。クローンH2
0Bはアミノ酸25個の長さの細胞質テールを有しており、
一方、H20Aはセリン及びスレオニン残基の多い、多分燐
酸化の部位であるアミノ酸50個の細胞質テールを有して
いる。H20A及びH20Bはアミノ酸417個及び392個の読み取
り枠を含んでおり、これらは各々約45,000及び43,000ダ
ルトンのポリペプチドをコードしている。
分析 最初に枠内メチオニンコドンで始まる機能的に活性な
クローンH20A及びH20Bのヌクレオチド及び予想されるア
ミノ酸配列を第４図に示す２つのcDNAクローンに共通の
５′−非翻訳配列及び分岐した３′−非翻訳配列は図示
しない。cDNA配列は２つの緊密に詰まったメチオニンコ
ドンで始まり、その両者は開始コドンの一般法則に従
い、AUGに関して−３及び＋１の位置のプリンを有して
いる［Kozak M.,Cell.44:283−292（1986）］。最初の
メチオニンの次に、20個の非荷電疎水性アミノ末端信号
配列が伸びている。一般には344個のアミノ酸からなる
アミノ酸残基から始まるトランスメンブランドメインは
24個の疎水性非極性アミノ酸からなり、それにいくつか
の塩基性残基が続いている。トランスメンブランドメイ
ンのすぐ後で２つのcDNAの配列が分岐し、細胞質ドメイ
ンでは異なるアミノ酸配列を形成している。クローンH2
0Bはアミノ酸25個の長さの細胞質テールを有しており、
一方、H20Aはセリン及びスレオニン残基の多い、多分燐
酸化の部位であるアミノ酸50個の細胞質テールを有して
いる。H20A及びH20Bはアミノ酸417個及び392個の読み取
り枠を含んでおり、これらは各々約45,000及び43,000ダ
ルトンのポリペプチドをコードしている。
H20A及びH20Bの配列は細胞質ドメインでヌクレオチド
1153からcDNAの３′−末端を通って分岐している。両方
のcDNAの５′EcoR I断片は最初の開始コドンのＡに対し
て−29位で始まり、−３位で終わるAlu相同領域を含ん
でいる。Alu相同領域は開始コドンAUGの前で始まってお
り、この領域が翻訳されないことを示している。長さ約
1.9kbのH20Aの３′非コーディング領域はヌクレオチド1
663で始まり、ヌクレオチド1700で終わる第二のAlu相同
領域を含んでいる（配列は図示しない）。Alu反復エレ
メントは、マウス第Ｉ種主要組織適合性抗原［Hood,L.,
Steinmetz,M.及びMalissen,B.,Ann.Rev.Immunol.１:529
−568（1983）］及び低密度リポ蛋白質受容体（Yamamot
o,T.,Davis,C.G.,Brown,M.,Schneider,W.,Casey,M.L.,G
oldstein,J.及びRussell,D.,Cell 39:27−38（1984）］
を含むいくつかのmRNAの３′非翻訳領域で見い出されて
いる。長さ1.5kbのH20Bの３′非コーディング領域はヌ
クレオチド1702で始まり、ヌクレオチド1752で終わる推
定のmRNA脱安定化配列を含んでいる。脱安定化配列は配
列ATTTAのいくつかの双頭（tandom）反復からなる［Sha
w,G.及びKamen,R.,Cell.46:659−667（1986）］。この
配列の存在によって、HeLa細胞内でこのRNAが比較的少
ないことを説明できる。
1153からcDNAの３′−末端を通って分岐している。両方
のcDNAの５′EcoR I断片は最初の開始コドンのＡに対し
て−29位で始まり、−３位で終わるAlu相同領域を含ん
でいる。Alu相同領域は開始コドンAUGの前で始まってお
り、この領域が翻訳されないことを示している。長さ約
1.9kbのH20Aの３′非コーディング領域はヌクレオチド1
663で始まり、ヌクレオチド1700で終わる第二のAlu相同
領域を含んでいる（配列は図示しない）。Alu反復エレ
メントは、マウス第Ｉ種主要組織適合性抗原［Hood,L.,
Steinmetz,M.及びMalissen,B.,Ann.Rev.Immunol.１:529
−568（1983）］及び低密度リポ蛋白質受容体（Yamamot
o,T.,Davis,C.G.,Brown,M.,Schneider,W.,Casey,M.L.,G
oldstein,J.及びRussell,D.,Cell 39:27−38（1984）］
を含むいくつかのmRNAの３′非翻訳領域で見い出されて
いる。長さ1.5kbのH20Bの３′非コーディング領域はヌ
クレオチド1702で始まり、ヌクレオチド1752で終わる推
定のmRNA脱安定化配列を含んでいる。脱安定化配列は配
列ATTTAのいくつかの双頭（tandom）反復からなる［Sha
w,G.及びKamen,R.,Cell.46:659−667（1986）］。この
配列の存在によって、HeLa細胞内でこのRNAが比較的少
ないことを説明できる。
ポリオウイルス受容体は免疫グロブリンスーパーファミ
リーの一員である NBRF蛋白質データベースの検索から、ポリオウイルス
受容体ポリペプチドと免疫グロブリン類メンバーの間の
相同性が明かとなった（第５図）。ポリオウイルス受容
体の細胞外領域は３つのドメイン構造に折り畳まれてい
る可能性がある（第６図）。各ドメインは免疫グロブリ
ン類のメンバー間でよく保持されているアミノ酸を含ん
でいる。これらのアミノ酸は免疫グロブリンスーパーフ
ァミリーのメンバー中に存在するV1、C1及びC2ドメイン
に折り畳まれうるβ鎖を有している［Williams及びBarc
lay,（1988）］。特に、３つのポリオウイルスドメイン
の各々は通常免疫グロブリンドメインの構造を安定化し
ている保持されたシステイン対を含んでいる。
リーの一員である NBRF蛋白質データベースの検索から、ポリオウイルス
受容体ポリペプチドと免疫グロブリン類メンバーの間の
相同性が明かとなった（第５図）。ポリオウイルス受容
体の細胞外領域は３つのドメイン構造に折り畳まれてい
る可能性がある（第６図）。各ドメインは免疫グロブリ
ン類のメンバー間でよく保持されているアミノ酸を含ん
でいる。これらのアミノ酸は免疫グロブリンスーパーフ
ァミリーのメンバー中に存在するV1、C1及びC2ドメイン
に折り畳まれうるβ鎖を有している［Williams及びBarc
lay,（1988）］。特に、３つのポリオウイルスドメイン
の各々は通常免疫グロブリンドメインの構造を安定化し
ている保持されたシステイン対を含んでいる。
ポリオウイルス受容体の第一ドメインはヒトIgλ鎖と
最大の相同性を示し、ラット糖蛋白質OX−２及びマウス
Igカッパ鎖とはより低い程度の相同性を示している（AL
IGNスコアーは第５図の説明中に示す）。このドメイン
はシステイン残基間の距離がより長い（アミノ酸73個）
ことによりＶ型である可能性が最も高い。Ｖ型ドメイン
にＣ′及びＣ″β鎖が存在する結果、システイン残基間
の長さが増加している。ポリオウイルス受容体はＶドメ
インのいくつかのＣ′領域に存在する86位にチロシンを
含有しており、Ｖ型としての分類に一致している。Ig類
のメンバーとドメイン２及び３の相同性はそれほど確か
なものではなく、従ってアミノ酸配列は示していない。
しかし、これらのドメインはIg様蛋白質に典型的な保持
されたシステイン及びトリプトファン残基を含有してい
る。ドメイン２とIg類メンバーとの比較で生じた最も高
いALIGNスコアーは次の通りである：ヒトHLAクラスII組
織適合性抗原では2.47;ヒトIgγ定常鎖では1.72。ドメ
イン３との相同性比較ではIg定常領域または可変領域で
は高いALIGNスコアーは得られなかった。しかし、ドメ
イン３はマウスNCAMドメイン３及び４と顕著な相同性を
示す（ALIGNスコアは各々7.42及び5.68である）。ポリ
オウイルス受容体はGenbankまたはNBRFデータベースの
他の蛋白質またはヌクレオチド配列とは広範な相同性は
有していないため、多分免疫グロブリンスーパーファミ
リーの新しい一員であろう。
最大の相同性を示し、ラット糖蛋白質OX−２及びマウス
Igカッパ鎖とはより低い程度の相同性を示している（AL
IGNスコアーは第５図の説明中に示す）。このドメイン
はシステイン残基間の距離がより長い（アミノ酸73個）
ことによりＶ型である可能性が最も高い。Ｖ型ドメイン
にＣ′及びＣ″β鎖が存在する結果、システイン残基間
の長さが増加している。ポリオウイルス受容体はＶドメ
インのいくつかのＣ′領域に存在する86位にチロシンを
含有しており、Ｖ型としての分類に一致している。Ig類
のメンバーとドメイン２及び３の相同性はそれほど確か
なものではなく、従ってアミノ酸配列は示していない。
しかし、これらのドメインはIg様蛋白質に典型的な保持
されたシステイン及びトリプトファン残基を含有してい
る。ドメイン２とIg類メンバーとの比較で生じた最も高
いALIGNスコアーは次の通りである：ヒトHLAクラスII組
織適合性抗原では2.47;ヒトIgγ定常鎖では1.72。ドメ
イン３との相同性比較ではIg定常領域または可変領域で
は高いALIGNスコアーは得られなかった。しかし、ドメ
イン３はマウスNCAMドメイン３及び４と顕著な相同性を
示す（ALIGNスコアは各々7.42及び5.68である）。ポリ
オウイルス受容体はGenbankまたはNBRFデータベースの
他の蛋白質またはヌクレオチド配列とは広範な相同性は
有していないため、多分免疫グロブリンスーパーファミ
リーの新しい一員であろう。
ヒト組織でのポリオウイルス受容体RNAの発現 重要な問題はヒト組織内でのポリオウイルス受容体ト
ランスクリプトの発現がポリオウイルスの組織トロピズ
ムの公知のパターンと相関しているかどうかということ
である。ウイルスの複製は口腔咽喉粘膜、回腸のパイエ
ル板及びCNSの運動神経を含む霊長類の少数の部分に限
定されている。心臓、肺及び腎臓を含むほとんどの他の
組織ではウイルス結合能及び複製は観察されていない
［Bodian,（1955）;Sabin,A.B.,Science 123:1151−115
7（1956）;Holland,（1961）］。
ランスクリプトの発現がポリオウイルスの組織トロピズ
ムの公知のパターンと相関しているかどうかということ
である。ウイルスの複製は口腔咽喉粘膜、回腸のパイエ
ル板及びCNSの運動神経を含む霊長類の少数の部分に限
定されている。心臓、肺及び腎臓を含むほとんどの他の
組織ではウイルス結合能及び複製は観察されていない
［Bodian,（1955）;Sabin,A.B.,Science 123:1151−115
7（1956）;Holland,（1961）］。
ヒト組織から調製したRNAでノーザンブロットハイブ
リッド形成を実施し、どこでポリオウイルス受容体トラ
ンスクリプトが発現されるかを決定した。使用したハイ
ブリッド形成プローブはH20A由来の0.4kb EcoR I−Sma
I断片（第３図）であり、これは予想した蛋白質の最初
の93個のアミノ酸を含有している。3.3kbトランスクリ
プトはHeLa細胞及び前頭葉皮質、小脳皮質、運動皮質、
腎臓及び回腸を含む検討したヒト組織全部で検出された
（第７図）。3.3kbmRNAは培養Ｂ及びＴ細胞を含む免疫
系の細胞、及びヒト血液から単離したマクロファージで
も検出された。0.4kbプローブはマウスＬ細胞から単離
したRNAとはハイブリッド形成しなかった。
リッド形成を実施し、どこでポリオウイルス受容体トラ
ンスクリプトが発現されるかを決定した。使用したハイ
ブリッド形成プローブはH20A由来の0.4kb EcoR I−Sma
I断片（第３図）であり、これは予想した蛋白質の最初
の93個のアミノ酸を含有している。3.3kbトランスクリ
プトはHeLa細胞及び前頭葉皮質、小脳皮質、運動皮質、
腎臓及び回腸を含む検討したヒト組織全部で検出された
（第７図）。3.3kbmRNAは培養Ｂ及びＴ細胞を含む免疫
系の細胞、及びヒト血液から単離したマクロファージで
も検出された。0.4kbプローブはマウスＬ細胞から単離
したRNAとはハイブリッド形成しなかった。
3.3kbトランスクリプトの他に、５′プローブは前頭
葉皮質にのみ存在する5.6kbRNAとハイブリッド形成した
（第７図）。別の実験では、同じフィルターは保持した
0.97kb EcoR I DNAプローブとハイブリッド形成した
（第３図）。0.4kb Sma I−EcoR I断片が0.97kb EcoR I
配列を含まないトランスクリプトに含まれうることを除
き、５′プローブで見られたと同様のハイブリッド形成
パターンが観察された。３′−非コーディング領域由来
のハイブリッド形成プローブを使用する実験は、H20A及
びH20Bに相補的なRNAの組織特異的発現を示唆している
（データは示さない）。ポリオウイルス受容体3.3kbト
ランスクリプトがポリオウイルス感染が不可能で、ポリ
オウイルス粒子に結合しない腎臓で認められていること
から、3.3kbポリオウイルス受容体RNAの発現は組織でポ
リオウイルス感染を起こさせるには不十分である。
葉皮質にのみ存在する5.6kbRNAとハイブリッド形成した
（第７図）。別の実験では、同じフィルターは保持した
0.97kb EcoR I DNAプローブとハイブリッド形成した
（第３図）。0.4kb Sma I−EcoR I断片が0.97kb EcoR I
配列を含まないトランスクリプトに含まれうることを除
き、５′プローブで見られたと同様のハイブリッド形成
パターンが観察された。３′−非コーディング領域由来
のハイブリッド形成プローブを使用する実験は、H20A及
びH20Bに相補的なRNAの組織特異的発現を示唆している
（データは示さない）。ポリオウイルス受容体3.3kbト
ランスクリプトがポリオウイルス感染が不可能で、ポリ
オウイルス粒子に結合しない腎臓で認められていること
から、3.3kbポリオウイルス受容体RNAの発現は組織でポ
リオウイルス感染を起こさせるには不十分である。
DNA結合アッセイ−トランスジェニックマウス 結合アッセイの結果を第９図に示す。それらの結果
は、PRG−１−17F1トランスジェニックマウスの脳、腎
臓、小腸及び多分肝臓がポリオウイルス結合部位を発現
し、そのためPVRトランス遺伝子を機能的に発現するこ
とを示している。ファウンダーPRG−１−７のF1トラン
スジェニックマウスからの組織ホモジェネートからも同
様の結果が得られた。
は、PRG−１−17F1トランスジェニックマウスの脳、腎
臓、小腸及び多分肝臓がポリオウイルス結合部位を発現
し、そのためPVRトランス遺伝子を機能的に発現するこ
とを示している。ファウンダーPRG−１−７のF1トラン
スジェニックマウスからの組織ホモジェネートからも同
様の結果が得られた。
トランスジェニックマウスのポリオウイルス感染への感
受性 ポリオウイルスを接種した８匹のトランスジェニック
マウス中全部で６匹が麻痺を起こした。対照的に、ウイ
ルス接種した正常（非トランスジェニック）マウスでは
疾患の兆候は全く示さなかった。ウイルス価を測定する
ために第０日及び第１日に１匹のマウスを殺した。この
時間は麻痺が起こるには不十分な長さである。その後、
残りのトランスジェニックマウスが麻痺を起こしたこと
を考慮すると、その動物は第０日及び第１日に殺されな
ければその後に麻痺疾患を起こしたであろう。トランス
ジェニックマウスは麻痺性灰白髄炎の立った毛並、１つ
以上の麻痺した四肢及び振戦行動の典型的な兆候を示し
た［Jubeltら，（1980）Pathogenesis of Human Poliov
irus Infection In Mice,I Clinical and Pathological
Studies,J.Neuropathology,Exp.Neurol.39:139−14
8］。ウイルスはトランスジェニックマウスの脳及び脊
髄では高い値で複製するが、非トランスジェニックマウ
スではそうではないことも明かである（第10図）。これ
らの結果は、トランスジェニックマウスが通常のマウス
には感染できないポリオウイルス株の感染に感受性であ
り、灰白髄炎と思れる疾患を起こすことを示している。
受性 ポリオウイルスを接種した８匹のトランスジェニック
マウス中全部で６匹が麻痺を起こした。対照的に、ウイ
ルス接種した正常（非トランスジェニック）マウスでは
疾患の兆候は全く示さなかった。ウイルス価を測定する
ために第０日及び第１日に１匹のマウスを殺した。この
時間は麻痺が起こるには不十分な長さである。その後、
残りのトランスジェニックマウスが麻痺を起こしたこと
を考慮すると、その動物は第０日及び第１日に殺されな
ければその後に麻痺疾患を起こしたであろう。トランス
ジェニックマウスは麻痺性灰白髄炎の立った毛並、１つ
以上の麻痺した四肢及び振戦行動の典型的な兆候を示し
た［Jubeltら，（1980）Pathogenesis of Human Poliov
irus Infection In Mice,I Clinical and Pathological
Studies,J.Neuropathology,Exp.Neurol.39:139−14
8］。ウイルスはトランスジェニックマウスの脳及び脊
髄では高い値で複製するが、非トランスジェニックマウ
スではそうではないことも明かである（第10図）。これ
らの結果は、トランスジェニックマウスが通常のマウス
には感染できないポリオウイルス株の感染に感受性であ
り、灰白髄炎と思れる疾患を起こすことを示している。
PVR遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが経
口生ポリオワクチンのテストに使用できるかを決定する
ために、次の実験を実施した。３匹のPRG−１−17系ト
ランスジェニックマウスに１型Mahoneyを5.4x105pfu脳
内接種し、２匹のトランスジェニックマウスには経口ポ
リオウイルスワクチン株である１型Sabinを同量接種し
た。４匹の非トランスジェニックマウスにも各ウイルス
を接種した。約２週間後、Mahoneyを接種したマウスの
２匹で麻痺を起こしたが、sabin株を接種したマウスで
は疾患の兆候は認められなかった。MahoneyまたはSabin
を接種した非トランスジェニックマウスのいずれも疾患
の兆候を示さなかった。この実験はPVRを発現するトラ
ンスジェニックマウスが１型Mahoneyポリオウイルスに
感受性であることを確認している。さらに、この結果は
小児に投与する経口生ワクチンの一部である弱毒ウイル
スのSabin 1株接種後にはトランスジェニックマウスが
疾患を起こさないことを示している。現在、ポリオウイ
ルスの経口ワクチン株はCercopithecusサルでテストし
ている。これらの動物は、１型Mahoneyのようなポリオ
ウイルスの神経毒株を脳または脊髄内に接種すると麻痺
を起こすが、Sabin 1のような弱毒株接種後には疾患を
起こさない。PVR遺伝子を発現するトランスジェニック
マウスでの結果はこのマウスモデルがポリオウイルス経
口ワクチン株のテスト及び恐らく新規のポリオウイルス
ワクチン株の開発に好適であることを示している。
口生ポリオワクチンのテストに使用できるかを決定する
ために、次の実験を実施した。３匹のPRG−１−17系ト
ランスジェニックマウスに１型Mahoneyを5.4x105pfu脳
内接種し、２匹のトランスジェニックマウスには経口ポ
リオウイルスワクチン株である１型Sabinを同量接種し
た。４匹の非トランスジェニックマウスにも各ウイルス
を接種した。約２週間後、Mahoneyを接種したマウスの
２匹で麻痺を起こしたが、sabin株を接種したマウスで
は疾患の兆候は認められなかった。MahoneyまたはSabin
を接種した非トランスジェニックマウスのいずれも疾患
の兆候を示さなかった。この実験はPVRを発現するトラ
ンスジェニックマウスが１型Mahoneyポリオウイルスに
感受性であることを確認している。さらに、この結果は
小児に投与する経口生ワクチンの一部である弱毒ウイル
スのSabin 1株接種後にはトランスジェニックマウスが
疾患を起こさないことを示している。現在、ポリオウイ
ルスの経口ワクチン株はCercopithecusサルでテストし
ている。これらの動物は、１型Mahoneyのようなポリオ
ウイルスの神経毒株を脳または脊髄内に接種すると麻痺
を起こすが、Sabin 1のような弱毒株接種後には疾患を
起こさない。PVR遺伝子を発現するトランスジェニック
マウスでの結果はこのマウスモデルがポリオウイルス経
口ワクチン株のテスト及び恐らく新規のポリオウイルス
ワクチン株の開発に好適であることを示している。
考察 本発明はポリオウイルスの細胞性受容体をコードする
機能性cDNAクローンの単離について開示している。これ
はＬ細胞をHeLa細胞DNAで形質転換した後、一次及び二
次マウス細胞形質転換細胞を得るものであり、これらは
細胞表面でヒトポリオウイルス受容体を発現し、３つの
ポリオウイルス血清型全てによる感染に感受性を示す。
ヒトの反復プローブでゲノムライブラリーをプロービン
グすることによりヒト受容体遺伝子をマウス細胞形質転
換細胞のゲノムから取り出した。次に、ポリオウイルス
受容体ゲノムクローン由来のプローブを使用してHeLa細
胞から２つの受容体cDNAクローンを単離したが、これら
は機能性ポリオウイルス受容体をコードし、細胞表面分
子の免疫グロブリン類の一員である。ポリオウイルス受
容体は複数のRNAがコードする ノーザンブロット実験の結果は、HeLa細胞がポリオウ
イルス受容体cDNAとハイブリッド形成する少なくとも３
つのトランスクリプト:5.6kbRNA及び約3.3kbで同時に移
動する２つのRNAを含んでいることを示す。H20A及びH20
BcDNAクローンは多分3.3kbmRNAを表す。5.6kbHeLa mRNA
はH20AcDNA由来のコーディング及び３′非コーディング
プローブとはハイブリッド形成するが、H20BcDNA由来の
３′−非コーディングプローブとはハイブリッド形成し
ないにもかかわらず、その起源は明かではない（データ
は示さない）。これらの結果は、5.6kbRNAはH20A配列と
今まで主張されていなかった別の配列とを有しているこ
とを示す。
機能性cDNAクローンの単離について開示している。これ
はＬ細胞をHeLa細胞DNAで形質転換した後、一次及び二
次マウス細胞形質転換細胞を得るものであり、これらは
細胞表面でヒトポリオウイルス受容体を発現し、３つの
ポリオウイルス血清型全てによる感染に感受性を示す。
ヒトの反復プローブでゲノムライブラリーをプロービン
グすることによりヒト受容体遺伝子をマウス細胞形質転
換細胞のゲノムから取り出した。次に、ポリオウイルス
受容体ゲノムクローン由来のプローブを使用してHeLa細
胞から２つの受容体cDNAクローンを単離したが、これら
は機能性ポリオウイルス受容体をコードし、細胞表面分
子の免疫グロブリン類の一員である。ポリオウイルス受
容体は複数のRNAがコードする ノーザンブロット実験の結果は、HeLa細胞がポリオウ
イルス受容体cDNAとハイブリッド形成する少なくとも３
つのトランスクリプト:5.6kbRNA及び約3.3kbで同時に移
動する２つのRNAを含んでいることを示す。H20A及びH20
BcDNAクローンは多分3.3kbmRNAを表す。5.6kbHeLa mRNA
はH20AcDNA由来のコーディング及び３′非コーディング
プローブとはハイブリッド形成するが、H20BcDNA由来の
３′−非コーディングプローブとはハイブリッド形成し
ないにもかかわらず、その起源は明かではない（データ
は示さない）。これらの結果は、5.6kbRNAはH20A配列と
今まで主張されていなかった別の配列とを有しているこ
とを示す。
H20A及びH20Bで表すトランスクリプトは単一の遺伝子
からのものであろう。サザンハイブリッド形成実験で
は、両方のcDNAの３′−末端由来のプローブはポリオウ
イルス受容体を表現する二次形質転換細胞及びHeLa細胞
の１つの制限断片とハイブリッド形成する（データは示
さない）。形質転換細胞がAlu−反応性配列の含量に基
づき約30kbのヒトDNAを含有しているために、２つの別
々の受容体遺伝子が非常に緊密に結合していなければ、
これらの遺伝子がH20AとH20Bトランスクリプトを生じさ
せることはないであろう。３′エキソンの他のスプライ
シングまたは異なる３つのポリアデニル化部位の使用
は、異なる細胞質テールと分岐した３′非コーディング
配列を含有するH20A及びH20BcDNAクローンが表すmRNAの
構造を説明できる。
からのものであろう。サザンハイブリッド形成実験で
は、両方のcDNAの３′−末端由来のプローブはポリオウ
イルス受容体を表現する二次形質転換細胞及びHeLa細胞
の１つの制限断片とハイブリッド形成する（データは示
さない）。形質転換細胞がAlu−反応性配列の含量に基
づき約30kbのヒトDNAを含有しているために、２つの別
々の受容体遺伝子が非常に緊密に結合していなければ、
これらの遺伝子がH20AとH20Bトランスクリプトを生じさ
せることはないであろう。３′エキソンの他のスプライ
シングまたは異なる３つのポリアデニル化部位の使用
は、異なる細胞質テールと分岐した３′非コーディング
配列を含有するH20A及びH20BcDNAクローンが表すmRNAの
構造を説明できる。
H20BcDNAの３′末端に存在する脱安定化配列はある種
の細胞型で転写後の制御系として機能できる。脱安定化
配列を持たない大量のH20Aメッセージと比較してH20BmR
NA量がHeLa細胞内で低いという知見がこの考えを支持し
ている。しかし、他の機構が２つのRNA量を調製してい
る可能性もある。
の細胞型で転写後の制御系として機能できる。脱安定化
配列を持たない大量のH20Aメッセージと比較してH20BmR
NA量がHeLa細胞内で低いという知見がこの考えを支持し
ている。しかし、他の機構が２つのRNA量を調製してい
る可能性もある。
ポリオウイルス受容体mRNAの発現及びポリオウイルス組
織トロピズム ポリオウイルス受容体遺伝子の発現がポリオウイルス
結合活性について報告されているパターンと同じパター
ンを示すかを知るために、ポリオウイルス受容体転写物
の発現についてヒト組織を調べた。結果から、ポリオウ
イルスの結合部位の発現は恐らく転写後に制御されてい
ることが示された。例えば、ノーザンハイブリッド形成
実験はポリオウイルス受容体cDNA由来のコーディング及
び３′−非コーディングプローブの両者とハイブリッド
形成するヒト腎臓内の3.3kbRNAの存在を示している。腎
臓はポリオウイルスの複製部位ではなく、検出可能なポ
リオウイルス結合能を持たないことから、ポリオウイル
ス受容体mRNAの発現はこの組織内で機能性受容体活性を
コードするには不十分であると結論した。
織トロピズム ポリオウイルス受容体遺伝子の発現がポリオウイルス
結合活性について報告されているパターンと同じパター
ンを示すかを知るために、ポリオウイルス受容体転写物
の発現についてヒト組織を調べた。結果から、ポリオウ
イルスの結合部位の発現は恐らく転写後に制御されてい
ることが示された。例えば、ノーザンハイブリッド形成
実験はポリオウイルス受容体cDNA由来のコーディング及
び３′−非コーディングプローブの両者とハイブリッド
形成するヒト腎臓内の3.3kbRNAの存在を示している。腎
臓はポリオウイルスの複製部位ではなく、検出可能なポ
リオウイルス結合能を持たないことから、ポリオウイル
ス受容体mRNAの発現はこの組織内で機能性受容体活性を
コードするには不十分であると結論した。
腎臓で発現される受容体mRNAが検出可能なポリオウイ
ルス結合能を誘導しないであろういくつかの理由があ
る。腎臓で観察される受容体mRNAが蛋白質に翻訳されな
い可能性がある。また、腎臓で発現されたmRNAはアミノ
酸配列の差によりポリオウイルスに結合できない蛋白質
をコードするかもしれない。組織内でのポリオウイルス
受容体部位の発現が翻訳後の修飾に依存することも考え
られる。例えば、リガンド結合領域の外側部位に、負に
荷電したα−2,8−結合ポリシアル酸を次第に（develop
mentally）制御して添加することがNCAM結合能の制御に
主要な役割を果たすと考えられる［Edelman,G.,Ann.Re
v.Cell.Biol.２:81−116（1986）］。他の型の翻訳後修
飾、例えばＮ−結合オリゴ糖の燐酸化及び硫酸化もNCAM
活性及び発現の制御に関与すると考えられている［Edel
man,1986;Cunningham,B.,Hemperly,J.,Murray,B.,Predi
ger,E.,Brackenbury,R.,Edelman,G.,Science 236:799−
806（1987）］。
ルス結合能を誘導しないであろういくつかの理由があ
る。腎臓で観察される受容体mRNAが蛋白質に翻訳されな
い可能性がある。また、腎臓で発現されたmRNAはアミノ
酸配列の差によりポリオウイルスに結合できない蛋白質
をコードするかもしれない。組織内でのポリオウイルス
受容体部位の発現が翻訳後の修飾に依存することも考え
られる。例えば、リガンド結合領域の外側部位に、負に
荷電したα−2,8−結合ポリシアル酸を次第に（develop
mentally）制御して添加することがNCAM結合能の制御に
主要な役割を果たすと考えられる［Edelman,G.,Ann.Re
v.Cell.Biol.２:81−116（1986）］。他の型の翻訳後修
飾、例えばＮ−結合オリゴ糖の燐酸化及び硫酸化もNCAM
活性及び発現の制御に関与すると考えられている［Edel
man,1986;Cunningham,B.,Hemperly,J.,Murray,B.,Predi
ger,E.,Brackenbury,R.,Edelman,G.,Science 236:799−
806（1987）］。
もう１つの可能性は機能性ポリオウイルス受容体が他
の膜蛋白質と会合した45Kポリペプチドからなることで
ある。例えば、Ｔリンパ球には低親和性部位と高親和性
部位の２種のインターロイキン−２結合部位がある［Ro
bb,R.,Green,W.及びRusk,C.,J.Exp.Med.160:1126（198
4）］。形質転換実験は、クローニングしたIL−２受容
体cDNAが低親和性結合部位のみをコードすることを示し
ている［Green W.,Robb,R.,Svetlik,P.,Rusk,C.,Deppe
r,J及びLeonard,W.J.Exp.Med.162:363−368（198
5）］。二次蛋白質の低親和性IL−２受容体サブユニッ
トとの会合は高親和性IL−２結合部位を作り出すために
必要である［Sharon,M.,Klausner,R.,Cyllen,B.,Chizzo
nite,R.及びLeonard,W.,Scinece 234 859−863（198
6）］。多分ポリオウイルスの高親和性結合は同様の機
構が仲介している。
の膜蛋白質と会合した45Kポリペプチドからなることで
ある。例えば、Ｔリンパ球には低親和性部位と高親和性
部位の２種のインターロイキン−２結合部位がある［Ro
bb,R.,Green,W.及びRusk,C.,J.Exp.Med.160:1126（198
4）］。形質転換実験は、クローニングしたIL−２受容
体cDNAが低親和性結合部位のみをコードすることを示し
ている［Green W.,Robb,R.,Svetlik,P.,Rusk,C.,Deppe
r,J及びLeonard,W.J.Exp.Med.162:363−368（198
5）］。二次蛋白質の低親和性IL−２受容体サブユニッ
トとの会合は高親和性IL−２結合部位を作り出すために
必要である［Sharon,M.,Klausner,R.,Cyllen,B.,Chizzo
nite,R.及びLeonard,W.,Scinece 234 859−863（198
6）］。多分ポリオウイルスの高親和性結合は同様の機
構が仲介している。
ポリオウイルスが筆者らのクローニングした受容体の
天然リガンドではないため、この受容体の天然の機能に
は結合部位の制御が多分重要である。受容体が免疫グロ
ブリン類の他のメンバーと同様に細胞認識または接着に
関与していれば、この蛋白質の活性の発現は発達段階
（development）及び組織の両者に特異的な方法で厳し
く制御されていると予想されよう。
天然リガンドではないため、この受容体の天然の機能に
は結合部位の制御が多分重要である。受容体が免疫グロ
ブリン類の他のメンバーと同様に細胞認識または接着に
関与していれば、この蛋白質の活性の発現は発達段階
（development）及び組織の両者に特異的な方法で厳し
く制御されていると予想されよう。
組織の分散とその後のin vitroの培養によって、ポリ
オウイルスの結合部位を発現しない腎臓及び羊膜のよう
な組織で受容体活性の発現を誘導できることが知られて
いる［Holland,（1961）］。ポリオウイルス結合部位の
発現が受容体蛋白質の翻訳後の修飾により制御されてい
れば、器官または組織をin vitroで培養することによっ
て修飾を誘発できるであろう。また、ウイルスの結合能
に必要な補助蛋白質がin vitroの培養で誘発されうるで
あろう。
オウイルスの結合部位を発現しない腎臓及び羊膜のよう
な組織で受容体活性の発現を誘導できることが知られて
いる［Holland,（1961）］。ポリオウイルス結合部位の
発現が受容体蛋白質の翻訳後の修飾により制御されてい
れば、器官または組織をin vitroで培養することによっ
て修飾を誘発できるであろう。また、ウイルスの結合能
に必要な補助蛋白質がin vitroの培養で誘発されうるで
あろう。
ポリオウイルス受容体は免疫グロブリンスーパーファミ
リーの一員である 蛋白質の相同性の比較からポリオウイルス受容体と免
疫グロブリン類の間のアミノ酸保持領域が明かとなっ
た。ポリオウイルス受容体はウイルス受容体として働く
免疫グロブリン類の３番目の既知のメンバーである。免
疫系の細胞上で発現されるCD4受容体はAIDSの原因菌で
あるHIV−Ｉの受容体であることが示されている［Maddo
nら、（1986）］。ヒト組織で広く発現されている細胞
間接着分子１（ICAM−１）は主要なライノウイルス受容
体である［Greve及びMcCellend,私信］。興味深い問題
は、免疫グロブリン類分子に共通のドメイン構造がある
種のウイルスの細胞への侵入を仲介する蛋白質に共通の
特徴であるか否か、または多くの細胞表面分子がIg様で
あるという事実を単に反映したものなのかということで
ある。いくらかの他のウイルス例えばインフルエンザウ
イルス及びエプスタイン−バーウイルスの公知の受容体
が免疫グロブリン類のメンバーであることは特記すべき
である［Weis,W.,Brown,J.H.,Cusack,S.,Paulson,J.C.,
Skehel,J.J.及びWiley,D.C.,Nature 333:426−431（198
8）;Fingeroth J.D.,Weis,J.J.,Tedder,T.F.,Strominge
r,J.L.,Biro,A.P.及びFearon,D.T.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 81:4510−4514（1984）］。
リーの一員である 蛋白質の相同性の比較からポリオウイルス受容体と免
疫グロブリン類の間のアミノ酸保持領域が明かとなっ
た。ポリオウイルス受容体はウイルス受容体として働く
免疫グロブリン類の３番目の既知のメンバーである。免
疫系の細胞上で発現されるCD4受容体はAIDSの原因菌で
あるHIV−Ｉの受容体であることが示されている［Maddo
nら、（1986）］。ヒト組織で広く発現されている細胞
間接着分子１（ICAM−１）は主要なライノウイルス受容
体である［Greve及びMcCellend,私信］。興味深い問題
は、免疫グロブリン類分子に共通のドメイン構造がある
種のウイルスの細胞への侵入を仲介する蛋白質に共通の
特徴であるか否か、または多くの細胞表面分子がIg様で
あるという事実を単に反映したものなのかということで
ある。いくらかの他のウイルス例えばインフルエンザウ
イルス及びエプスタイン−バーウイルスの公知の受容体
が免疫グロブリン類のメンバーであることは特記すべき
である［Weis,W.,Brown,J.H.,Cusack,S.,Paulson,J.C.,
Skehel,J.J.及びWiley,D.C.,Nature 333:426−431（198
8）;Fingeroth J.D.,Weis,J.J.,Tedder,T.F.,Strominge
r,J.L.,Biro,A.P.及びFearon,D.T.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 81:4510−4514（1984）］。
１型ポリオウイルス及び14型ライノウイルスの原子構
造は正20面体状のカプシドの12個の頂点の各々を取り囲
む「キャニオン（canyon）」と呼ばれるビリオン内の共
通の裂け目を明らかにしている［Rossman,M.G.,Arnold,
E.,Erickson,J.W.,Frankenberger,E.A.,Griffith,J.P.,
Hect,H.J.,Johnson,J.E.及びKramer,D.J.Science 229:1
368−1365（1985）］。この裂け目は細胞性受容体に結
合するビリオン上の部位であると提起されている［Ross
manら，（1985）］。キャニオンが宿主免疫系に比較的
近づきにくいことから、ウイルスではこのような結合部
位はほとんどの中和抗体が発生する進化圧を受けないこ
とが示唆されている。露出したアミノ酸ループで形成し
た突起がキャニオンを囲んでおり、その配列は比較的可
変性で、種々のウイルス血清型に伴うよく特性化された
抗原部位のいくらかを含んでいる［Hogleら，（198
5）］。ライノウイルスのキャニオンの壁及び底に誘起
した変位によりウイルス結合の親和性が変化し、キャニ
オンが受容体結合部位であることを示唆している［Colo
nno,R.,Condra,J.,Mizutani,S.,Callahan,P.,Davies,M.
及びMurcko,M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5453−6559
（1988）］。ポリオウイルスとライノウイルスの両者が
Ig様の受容体を使用することから、ピコルナウイルスの
キャニオンがIg様分子のドメイン構造に結合するのに特
に適していると推測できよう。他のピコルナウイルス受
容体の同定がこの問題の解決には必要であろう。HIVのg
p120上のCD4結合部位もキャニオン様構造であるかどう
かを知ることも興味深い。
造は正20面体状のカプシドの12個の頂点の各々を取り囲
む「キャニオン（canyon）」と呼ばれるビリオン内の共
通の裂け目を明らかにしている［Rossman,M.G.,Arnold,
E.,Erickson,J.W.,Frankenberger,E.A.,Griffith,J.P.,
Hect,H.J.,Johnson,J.E.及びKramer,D.J.Science 229:1
368−1365（1985）］。この裂け目は細胞性受容体に結
合するビリオン上の部位であると提起されている［Ross
manら，（1985）］。キャニオンが宿主免疫系に比較的
近づきにくいことから、ウイルスではこのような結合部
位はほとんどの中和抗体が発生する進化圧を受けないこ
とが示唆されている。露出したアミノ酸ループで形成し
た突起がキャニオンを囲んでおり、その配列は比較的可
変性で、種々のウイルス血清型に伴うよく特性化された
抗原部位のいくらかを含んでいる［Hogleら，（198
5）］。ライノウイルスのキャニオンの壁及び底に誘起
した変位によりウイルス結合の親和性が変化し、キャニ
オンが受容体結合部位であることを示唆している［Colo
nno,R.,Condra,J.,Mizutani,S.,Callahan,P.,Davies,M.
及びMurcko,M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5453−6559
（1988）］。ポリオウイルスとライノウイルスの両者が
Ig様の受容体を使用することから、ピコルナウイルスの
キャニオンがIg様分子のドメイン構造に結合するのに特
に適していると推測できよう。他のピコルナウイルス受
容体の同定がこの問題の解決には必要であろう。HIVのg
p120上のCD4結合部位もキャニオン様構造であるかどう
かを知ることも興味深い。
ポリオウイルスはビリオンの脱外被に必要な低いpH相
で、受容体が仲介したエンドサイト−シスにより細胞内
に入ると信じられている［Madshus,I.H.,Olsnes,S.及び
Sandvig,K.J.Cell.Biol.98:1194−1200（1984）］。ポ
リオウイルス受容体の機能性で、クローニングしたコピ
ーが入手できると、部位特異性変位によって、ウイルス
結合のみでなく侵入及び脱外被に必要な受容体の領域が
分析できよう。受容体ポリペプチド及びウイルス−受容
体複合体の原子構造を解くこともできる可能性がある。
ウイルスとその細胞受容体の間の結果と併せて、この知
識はこれからの抗ウイルス戦略の計画には重要であろ
う。
で、受容体が仲介したエンドサイト−シスにより細胞内
に入ると信じられている［Madshus,I.H.,Olsnes,S.及び
Sandvig,K.J.Cell.Biol.98:1194−1200（1984）］。ポ
リオウイルス受容体の機能性で、クローニングしたコピ
ーが入手できると、部位特異性変位によって、ウイルス
結合のみでなく侵入及び脱外被に必要な受容体の領域が
分析できよう。受容体ポリペプチド及びウイルス−受容
体複合体の原子構造を解くこともできる可能性がある。
ウイルスとその細胞受容体の間の結果と併せて、この知
識はこれからの抗ウイルス戦略の計画には重要であろ
う。
ポリオウイルス受容体の天然の機能を同定することも
重要であろう。Ig類の多くのメンバーが細胞認識及び接
着に関与しており、本発明の機能性cDNAを使用してポリ
オウイルス受容体がこれらの活性を仲介できるかを決定
することができよう。
重要であろう。Ig類の多くのメンバーが細胞認識及び接
着に関与しており、本発明の機能性cDNAを使用してポリ
オウイルス受容体がこれらの活性を仲介できるかを決定
することができよう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/13 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 49/00 Ｃ０７Ｋ 14/105 Ｃ０７Ｋ 14/105 16/10 16/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 レイキヤニエツロ，ビンセント アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・ 10128、ニユー・ヨーク、イースト・ナ インテイフオース・ストリート・152・ アパートメント・11・ビー (72)発明者 マンデルソン，キヤテイ フランス国、67000・ストラスブール、 リユ・カジユネツク・ニユメロ・３ (72)発明者 コスタンテイーニ，フランク アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・ 10021、ニユー・ヨーク、ヨーク・アベ ニユー・1611・アパートメント・４―ジ エイ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｖｏｌ．83（1986) ｐ．7845−7849 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｖｏｌ．85（1988) ｐ．7743−7747 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/41 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＤＤＢＪ／ ＧｅｎＢａｎｋ ＥＭＢＬ／ＧＥＮＥＳＥＱ
Claims (29)
- 【請求項１】願書に添付された図４に示されているアミ
ノ酸配列の位置21のTrpから願書に添付された図４に示
されているアミノ酸配列の位置344のAsnまでの連続する
アミノ酸を包含していて、ピコルナウイルス受容体のま
たはピコルナウイルスへの結合の生物活性を有するポリ
ペプチド。 - 【請求項２】願書に添付された図４に示されているアミ
ノ酸配列の位置１のMetから願書に添付された図４に示
されているアミノ酸配列の位置20のSerまでの連続する
アミノ酸をさらに包含している請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項３】願書に添付された図４に示されているアミ
ノ酸配列の位置345のAlaから願書に添付された図４に示
されているアミノ酸配列の位置368のTrpまでの連続する
アミノ酸をさらに包含している請求項１または２に記載
のポリペプチド。 - 【請求項４】願書に添付された図４にH20Bとして示され
ているアミノ酸配列の位置385のGluから願書に添付され
た図４にH20Bとして示されているアミノ酸配列の位置39
2のAsnまでの連続するアミノ酸をさらに包含している請
求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項５】願書に添付された図４にH20Aとして示され
ているアミノ酸配列の位置385のThrから願書に添付され
た図４にH20Aとして示されているアミノ酸配列の位置41
6のArgまでの連続するアミノ酸をさらに包含している請
求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項６】ピコルナウイルスがヒトポリオウイルスで
ある請求項１ないし５のいすれか一項に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項７】ヒトポリオウイルスに結合することができ
る請求項１ないし６のいずれか一項に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項８】水溶性である請求項１ないし７のいずれか
一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項９】細胞中に含まれているか細胞に結合してい
る請求項１ないし７のいずれか一項に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項１０】検出可能なマーカーで標識されている請
求項１ないし７のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】請求項１ないし９のいずれか一項に記載
のポリペプチドをコードしているDNA。 - 【請求項１２】請求項11に記載のDNAを包含している発
現ベクター。 - 【請求項１３】コスミドベクター、プラスミドベクタ
ー、ファージベクター、酵母ベクター、ウイルスベクタ
ーおよび哺乳動物ベクターからなる群より選択されるベ
クター由来の請求項12に記載の発現ベクター。 - 【請求項１４】DNAが細胞のクロモソームDNA中に安定し
て組み込まれるように請求項11のDNAが挿入されている
か、請求項12または13の発現ベクターにより形質転換さ
れている細胞。 - 【請求項１５】細菌細胞、酵母細胞、真核生物細胞また
は哺乳動物細胞である請求項14に記載の細胞。 - 【請求項１６】ピコルナウイルスへの結合の生物活性を
有するポリペプチドを生産する能力を有する請求項14ま
たは15に記載の細胞。 - 【請求項１７】ピコルナウイルス受容体の生物活性を発
現することができる請求項14または15に記載の細胞。 - 【請求項１８】非ヒト動物のクロモソームDNA中に安定
して組み込まれている請求項11に記載のDNAが挿入され
ている、ピコルナウイルスに非感受性の非ヒト動物由来
の、ピコルナウイルスに感受性のトランスジェニック動
物。 - 【請求項１９】マウスである請求項18に記載のトランジ
ェニック動物。 - 【請求項２０】ピコルナウイルスがヒトポリオウイルス
である請求項18または19に記載のトランスジェニック動
物。 - 【請求項２１】雌性動物から回収した受精卵に請求項１
ないし６のいずれか一項に記載のDNAを導入することを
包含する請求項18ないし20のいずれか一項に記載のトラ
ンスジェニック動物を作製する方法。 - 【請求項２２】請求項16に記載の細胞を培養することを
包含する、ピコルナウイルスへの結合の生物活性を有す
るポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項２３】請求項17に記載の細胞を培養することを
包含する、ピコルナウイルス受容体の生物活性を発現す
ることができる細胞を製造する方法。 - 【請求項２４】ピコルナウイルス感染に起因する疾病を
治療するのに有効な量の請求項１ないし８のいずれか一
項に記載のポリペプチドを包含するピコルナウイルス感
染に起因する疾病を治療するための医薬組成物。 - 【請求項２５】ピコルナウイルスがヒトポリオウイルス
である請求項24に記載の医薬組成物。 - 【請求項２６】請求項１ないし８のいずれか一項に記載
のポリペプチドに対する抗体。 - 【請求項２７】検出可能なマーカーにより標識されてい
る請求項26に記載の抗体。 - 【請求項２８】請求項18ないし20のいずれか一項に記載
のトランスジェニック動物にピコルナウイルスワクチン
を投与すること、および上記トランスジェニック動物へ
のピコルナウイルスの生理的影響を測定することを包含
する、ピコルナウイルスの有効性また毒性を試験する方
法。 - 【請求項２９】ピコルナウイルスがヒトポリオウイルス
である請求項28に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32195789A | 1989-03-10 | 1989-03-10 | |
| US321,957 | 1989-03-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04504200A JPH04504200A (ja) | 1992-07-30 |
| JP2997042B2 true JP2997042B2 (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=23252787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2505086A Expired - Lifetime JP2997042B2 (ja) | 1989-03-10 | 1990-03-09 | ポリオウイルスの細胞受容体をコードするゲノム及びｃＤＮＡ配列の分子クローニング |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0462215B1 (ja) |
| JP (1) | JP2997042B2 (ja) |
| AT (1) | ATE219513T1 (ja) |
| AU (1) | AU653915B2 (ja) |
| CA (1) | CA2048993A1 (ja) |
| DE (1) | DE69033974D1 (ja) |
| WO (1) | WO1990010699A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5986171A (en) * | 1994-03-18 | 1999-11-16 | Japan Poliomyelitis Research Institute | Method for examining neurovirulence of polio virus |
| US5907080A (en) * | 1995-11-30 | 1999-05-25 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Method for development of transgenic dwarf goats |
| CA2285447A1 (en) * | 1997-03-28 | 1998-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
| JP5686361B2 (ja) * | 2010-01-28 | 2015-03-18 | 国立大学法人 筑波大学 | 可溶型ｃｄ１５５タンパク質を用いた癌の検出方法 |
| WO2022258049A1 (en) * | 2021-06-10 | 2022-12-15 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric pvrig |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3575574D1 (de) * | 1984-05-01 | 1990-03-01 | Unilever Nv | Fluessige bleichmittelzusammensetzungen. |
| US4828747A (en) * | 1988-03-25 | 1989-05-09 | Lever Brothers Company | Suspending system for insoluble peroxy acid bleach |
-
1990
- 1990-03-09 AU AU53378/90A patent/AU653915B2/en not_active Ceased
- 1990-03-09 DE DE69033974T patent/DE69033974D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-09 EP EP90905140A patent/EP0462215B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-09 CA CA002048993A patent/CA2048993A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-09 WO PCT/US1990/001320 patent/WO1990010699A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-09 AT AT90905140T patent/ATE219513T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-09 JP JP2505086A patent/JP2997042B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｖｏｌ．８３（１９８６）ｐ．７８４５−７８４９ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｖｏｌ．８５（１９８８）ｐ．７７４３−７７４７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69033974D1 (de) | 2002-07-25 |
| EP0462215A4 (en) | 1992-09-23 |
| WO1990010699A1 (en) | 1990-09-20 |
| CA2048993A1 (en) | 1990-09-11 |
| JPH04504200A (ja) | 1992-07-30 |
| AU5337890A (en) | 1990-10-09 |
| ATE219513T1 (de) | 2002-07-15 |
| EP0462215A1 (en) | 1991-12-27 |
| AU653915B2 (en) | 1994-10-20 |
| EP0462215B1 (en) | 2002-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mendelsohn et al. | Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily | |
| Bingham et al. | Stability of an expanded trinucleotide repeat in the androgen receptor gene in transgenic mice | |
| Ren et al. | Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: a new model for poliomyelitis | |
| US5616491A (en) | Knockout mice | |
| US5824837A (en) | Expression of human interleukin-1β in a transgenic animal | |
| DE69828574T2 (de) | Transgenes Tier als Modell für Allergie und seine Verwendung | |
| US6552246B1 (en) | Transgenic mice comprising CD45 knockout | |
| JPH09501319A (ja) | トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産 | |
| JPH06507782A (ja) | アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物 | |
| US5753521A (en) | Molecular cloning of genomic and CDNA sequences encoding cellular receptors for poliovirus | |
| AU668856B2 (en) | Transgenic, cross-linked hemoglobin | |
| US6545198B1 (en) | Transgenically produced prolactin | |
| JP2997042B2 (ja) | ポリオウイルスの細胞受容体をコードするゲノム及びｃＤＮＡ配列の分子クローニング | |
| Snyder et al. | Developmental and tissue‐specific expression of human CD4 in transgenic rabbits | |
| EP0975746A1 (en) | Transgenic mouse expressing human cd4 and fusin (cxcr4) | |
| US5936138A (en) | Gene encoding mutant L3T4 protein which facilitates HIV infection and transgenic mouse expressing such protein | |
| Rubin et al. | Introduction and expression of the human Bs-globin gene in transgenic mice. | |
| JPH07509599A (ja) | キメラ受容体ポリペプチド，ヒトｈ１３タンパク質，ならびにその使用 | |
| JP2005500835A (ja) | Ｐｅｒｖスクリーニング法およびその使用 | |
| JPH05505096A (ja) | ウィルス感染のトランスジェニック動物モデル | |
| CA2172073A1 (en) | Expression of viral decoy proteins under the control of a locus control region and uses thereof | |
| US5610137A (en) | Transgenic, cross-linked hemoglobin | |
| WO1993004168A1 (en) | Transgenic non-human animal model for developing and testing therapies to treat sepsis | |
| WO1998021224A1 (en) | The cloning of duffy blood group antigen | |
| Streeter et al. | Abnormal Development of Peripheral Lymphoid Organs in Mice Deficient in Lymphotoxin |