JP2990805B2 - 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法Info
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- JP2990805B2 JP2990805B2 JP2417059A JP41705990A JP2990805B2 JP 2990805 B2 JP2990805 B2 JP 2990805B2 JP 2417059 A JP2417059 A JP 2417059A JP 41705990 A JP41705990 A JP 41705990A JP 2990805 B2 JP2990805 B2 JP 2990805B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は無血清培地、動物細胞の
培養方法および異種蛋白質の製造方法に関する。
培養方法および異種蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】近年、ＤＮ
Ａの組換え技術の進歩により、細胞生成物（例えば、蛋
白質）を製造するための動物細胞の培養が次第に重要に
なっている。このような細胞培養を工業的規模で行うに
は、多量の培地が必要になる。
Ａの組換え技術の進歩により、細胞生成物（例えば、蛋
白質）を製造するための動物細胞の培養が次第に重要に
なっている。このような細胞培養を工業的規模で行うに
は、多量の培地が必要になる。
【０００３】従来、動物細胞を生育（増殖）させる際の
培地としては、極めて多種の培地、例えば、ＤＭＥＭ培
地〔Morton,H.J.J.(1970)In vitro 6,89〕、Ｆ１２培地
〔Ham,R.O.(1965) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53,288〕お
よびＲＰＭＩ１６４０培地〔Goding,J.W.(1980)J.Immun
ol.Methods 39,285,JAMA 199(1957)519 〕等が使用され
てきた。しかし、これらの培地を使用して動物細胞を生
育（増殖）させるには、培地に血清を加えなければなら
ない。このため、一般には、ウシ胎児、ウマまたはヒト
等の血清を１〜１５％程度の濃度で使用しなければなら
なかった。
培地としては、極めて多種の培地、例えば、ＤＭＥＭ培
地〔Morton,H.J.J.(1970)In vitro 6,89〕、Ｆ１２培地
〔Ham,R.O.(1965) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53,288〕お
よびＲＰＭＩ１６４０培地〔Goding,J.W.(1980)J.Immun
ol.Methods 39,285,JAMA 199(1957)519 〕等が使用され
てきた。しかし、これらの培地を使用して動物細胞を生
育（増殖）させるには、培地に血清を加えなければなら
ない。このため、一般には、ウシ胎児、ウマまたはヒト
等の血清を１〜１５％程度の濃度で使用しなければなら
なかった。
【０００４】しかし、血清含有培地を使用する際には以
下の様な問題があった。 血清自体が高価なためコス
ト高となる。 血清にはロット差があり、再現性のあ
る培養には不利である。 産生物の培養上清からの精
製が困難となる。 ウイルスやマイコプラズマの汚染
源となる恐れがある。
下の様な問題があった。 血清自体が高価なためコス
ト高となる。 血清にはロット差があり、再現性のあ
る培養には不利である。 産生物の培養上清からの精
製が困難となる。 ウイルスやマイコプラズマの汚染
源となる恐れがある。
【０００５】このような現状に鑑みて、培地中の血清濃
度を減少させる方法が検討されている。血清濃度の減少
によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅
し、所望の細胞生成物（例えば、蛋白質）の収量が著し
く減少するなどの問題があり、培地中の血清濃度の減少
は困難であった。
度を減少させる方法が検討されている。血清濃度の減少
によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅
し、所望の細胞生成物（例えば、蛋白質）の収量が著し
く減少するなどの問題があり、培地中の血清濃度の減少
は困難であった。
【０００６】このような理由から、細胞が増殖性を失わ
ずに培養されうる無血清培地に対して多大な関心が持た
れている。例えば、ＣＨＯ細胞の培養に適し、ハム（Ｈ
ａｍ）のＦ１２培地およびＤＭＥＭ培地を１：１の割合
で含有する血清不含培地であって、これにトランスフェ
リン、インシュリンおよび亜セレン酸塩の付加された培
地が知られている〔In vitro Cell.Dev. Biol.21 (198
5) 588 〜592 〕。
ずに培養されうる無血清培地に対して多大な関心が持た
れている。例えば、ＣＨＯ細胞の培養に適し、ハム（Ｈ
ａｍ）のＦ１２培地およびＤＭＥＭ培地を１：１の割合
で含有する血清不含培地であって、これにトランスフェ
リン、インシュリンおよび亜セレン酸塩の付加された培
地が知られている〔In vitro Cell.Dev. Biol.21 (198
5) 588 〜592 〕。
【０００７】しかし、公知の無血清培地は次の如き問題
点を有する。即ち、細胞の培養の間に若干の時間間隔で
ウシ胎児血清をしばしば追加する必要がある。同様に通
常、血清含有培地中で保持される基本培養物を無血清培
地に移すことも徐々の適応によってのみ可能である。
点を有する。即ち、細胞の培養の間に若干の時間間隔で
ウシ胎児血清をしばしば追加する必要がある。同様に通
常、血清含有培地中で保持される基本培養物を無血清培
地に移すことも徐々の適応によってのみ可能である。
【０００８】本発明の第１番目の目的は、取扱いが容易
で、安価かつ動物細胞の発育に適した無血清培地を提供
することである。
で、安価かつ動物細胞の発育に適した無血清培地を提供
することである。
【０００９】本発明の第２番目の目的は、効率的な動物
細胞の培養方法を提供することである。
細胞の培養方法を提供することである。
【００１０】本発明の第３番目の目的は、形質転換させ
た動物細胞より異種蛋白質を大量に製造する方法を提供
することである。
た動物細胞より異種蛋白質を大量に製造する方法を提供
することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究を重ねた結果、インスリン、ペ
プトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有させ
た無血清培地が、動物細胞の培養に適していること、ま
た、この培地を使用することにより、異種蛋白質を大量
に生産できることを見出して本発明を完成した。
を達成するため鋭意研究を重ねた結果、インスリン、ペ
プトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有させ
た無血清培地が、動物細胞の培養に適していること、ま
た、この培地を使用することにより、異種蛋白質を大量
に生産できることを見出して本発明を完成した。
【００１２】即ち、第１番目の本発明は、基礎培地にイ
ンスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミ
ンを含有させることを特徴とする無血清培地である。
ンスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミ
ンを含有させることを特徴とする無血清培地である。
【００１３】第２番目の発明は、上記第１番目の本発明
培地を使用する動物細胞の培養方法である。
培地を使用する動物細胞の培養方法である。
【００１４】第３番目の発明は、形質転換させた動物細
胞を上記第１番目の本発明培地で培養して異種蛋白質を
発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法であ
る。
胞を上記第１番目の本発明培地で培養して異種蛋白質を
発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法であ
る。
【００１５】本発明の無血清培地は、実質的に血清を含
有しないものであり、当該培地は、通常被培養物、例え
ば動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源およ
び無機塩等を含有させることができる。また、必要に応
じて微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を
配合してもよい。炭素源としては、グルコース、マンニ
トール、グリセロール、フルクトースなどがあり、窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、コーンス
チープリカー、大豆粉、乾燥酵母などの有機窒素化合
物、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素
化合物が挙げられる。本発明の培地はかかる成分を含む
培地を基礎培地とし、さらに上記インスリン、ペプト
ン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有せしめた
培地である。かかる基礎培地としては、細胞培養のため
のすべての公知培地を使用することができ、例えばＤＭ
ＥＭ培地、Ｆ１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が例
示され、就中ＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。
有しないものであり、当該培地は、通常被培養物、例え
ば動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源およ
び無機塩等を含有させることができる。また、必要に応
じて微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を
配合してもよい。炭素源としては、グルコース、マンニ
トール、グリセロール、フルクトースなどがあり、窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、コーンス
チープリカー、大豆粉、乾燥酵母などの有機窒素化合
物、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素
化合物が挙げられる。本発明の培地はかかる成分を含む
培地を基礎培地とし、さらに上記インスリン、ペプト
ン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有せしめた
培地である。かかる基礎培地としては、細胞培養のため
のすべての公知培地を使用することができ、例えばＤＭ
ＥＭ培地、Ｆ１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が例
示され、就中ＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。
【００１６】本発明の無血清培地における各種添加物の
量は、インスリン０．１〜５mg／Ｌ、就中０．１〜２mg
／Ｌ、ペプトン１〜１０ｇ／Ｌ、就中４〜６ｇ／Ｌ、ト
ランスフェリン５〜１５mg／Ｌ、就中９〜１１mg／Ｌ、
アルブミン０．１〜５ｇ／Ｌ、就中０．１〜２ｇ／Ｌで
ある。
量は、インスリン０．１〜５mg／Ｌ、就中０．１〜２mg
／Ｌ、ペプトン１〜１０ｇ／Ｌ、就中４〜６ｇ／Ｌ、ト
ランスフェリン５〜１５mg／Ｌ、就中９〜１１mg／Ｌ、
アルブミン０．１〜５ｇ／Ｌ、就中０．１〜２ｇ／Ｌで
ある。
【００１７】本発明において使用されるインスリンは、
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒトまたはウシ由来のものが使用される。本発明に
おいて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限
はなく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒトまたはウシ由来のものが使用される。本発明に
おいて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限
はなく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
【００１８】本発明の無血清培地には、必要により、更
にヒポキサンチン０．１〜１００mg／Ｌ、就中１０〜１
５mg／Ｌ、チミジン０．０１〜１００mg／Ｌ、就中２〜
５mg／Ｌ、セレン０．０１〜１００μｇ／Ｌ、就中２〜
５μｇ／Ｌ、α−トコフェロール（ビタミンＥ）０．０
０１〜１０mg／Ｌ、就中０．１〜０．５mg／Ｌを加える
ことができる。
にヒポキサンチン０．１〜１００mg／Ｌ、就中１０〜１
５mg／Ｌ、チミジン０．０１〜１００mg／Ｌ、就中２〜
５mg／Ｌ、セレン０．０１〜１００μｇ／Ｌ、就中２〜
５μｇ／Ｌ、α−トコフェロール（ビタミンＥ）０．０
０１〜１０mg／Ｌ、就中０．１〜０．５mg／Ｌを加える
ことができる。
【００１９】また、耐性遺伝子を有するベクターを含有
する形質転換された動物細胞を培養しようとする場合に
は、プラスミド形質転換の安定性を保つために該培地に
更にベクター中に含有された耐性遺伝子に相応する選択
剤を加えることもある。選択剤としては、当業者には周
知のもの、例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、マイ
コフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン、アミノ
ブチリンまたはメトトレキセイト（ＭＴＸ）およびその
誘導体が例示される。
する形質転換された動物細胞を培養しようとする場合に
は、プラスミド形質転換の安定性を保つために該培地に
更にベクター中に含有された耐性遺伝子に相応する選択
剤を加えることもある。選択剤としては、当業者には周
知のもの、例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、マイ
コフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン、アミノ
ブチリンまたはメトトレキセイト（ＭＴＸ）およびその
誘導体が例示される。
【００２０】本発明の無血清培地で培養可能な動物細胞
としては、細胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、Ｈ
ｅｌａ細胞、chinese hamsterovary(CHO)Cell line 、
Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、MDCK Cell line、Ｃ１
２７、ＨＫＧ、Human kidneyCell lineなどが挙げられ
る。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ1(チャイニーズハムスター
卵巣細胞 : ATCC CCL61)、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎
細胞 : ATCC CCL10)、ＣＯＳ−７(CV-1 Origin,SV-40細
胞 : ATCC CRL1651)、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎
細胞 : ATCC CCL-81) などがある。
としては、細胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、Ｈ
ｅｌａ細胞、chinese hamsterovary(CHO)Cell line 、
Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、MDCK Cell line、Ｃ１
２７、ＨＫＧ、Human kidneyCell lineなどが挙げられ
る。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ1(チャイニーズハムスター
卵巣細胞 : ATCC CCL61)、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎
細胞 : ATCC CCL10)、ＣＯＳ−７(CV-1 Origin,SV-40細
胞 : ATCC CRL1651)、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎
細胞 : ATCC CCL-81) などがある。
【００２１】本発明の無血清培地を使用する動物細胞の
培養方法は、通常次の通りにして行われる。即ち、本発
明の無血清培地を使用する動物細胞の培養には、培養用
としてよく知られているディッシュ、フラスコ、ローラ
ーボトル、スピンナーフラスコあるいは中空糸を用いた
培養装置などの培養容器が使えるがこれらに限定されな
い。培養方法としては、上記の培養容器などで通常行わ
れる継代培養のほか、培養槽内から、連続的に、あるい
は間歇的に古い培養液を細胞を含んだまま、あるいは細
胞と分離して抜き出しつつ、それと見合う量の新しい培
養液を供給して、長期間培養条件を一定に制御しつつ細
胞を培養する連続的な培養法などが挙げられるが、特に
限定されない。
培養方法は、通常次の通りにして行われる。即ち、本発
明の無血清培地を使用する動物細胞の培養には、培養用
としてよく知られているディッシュ、フラスコ、ローラ
ーボトル、スピンナーフラスコあるいは中空糸を用いた
培養装置などの培養容器が使えるがこれらに限定されな
い。培養方法としては、上記の培養容器などで通常行わ
れる継代培養のほか、培養槽内から、連続的に、あるい
は間歇的に古い培養液を細胞を含んだまま、あるいは細
胞と分離して抜き出しつつ、それと見合う量の新しい培
養液を供給して、長期間培養条件を一定に制御しつつ細
胞を培養する連続的な培養法などが挙げられるが、特に
限定されない。
【００２２】本培地の使用により、その生育（増殖）に
支持体を必要とする付着細胞（ＣＨＯ細胞など）を、支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能となる。
支持体を必要とする付着細胞（ＣＨＯ細胞など）を、支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能となる。
【００２３】本発明で使用される形質転換された動物細
胞は、自体既知の手段にて調製することができる。
胞は、自体既知の手段にて調製することができる。
【００２４】当該形質転換細胞による異種蛋白質の発現
も、自体既知の手段にて行えばよい。かかる手段として
は、たとえば特開昭６１−１７７９８７号公報、特開昭
６３−１４６７８９号公報等に記載の方法などがあげら
れる。
も、自体既知の手段にて行えばよい。かかる手段として
は、たとえば特開昭６１−１７７９８７号公報、特開昭
６３−１４６７８９号公報等に記載の方法などがあげら
れる。
【００２５】本発明の異種蛋白質の製造方法によれば、
たとえばアンチトロンビン−III 、プロウロキナーゼ、
組織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面抗
原、プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−
γ、コロニー形成刺激因子などの異種蛋白質を製造する
ことができる。
たとえばアンチトロンビン−III 、プロウロキナーゼ、
組織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面抗
原、プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−
γ、コロニー形成刺激因子などの異種蛋白質を製造する
ことができる。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明をより詳細に説明するために
実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。
実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。
【００２７】実施例１ 無血清培地（ＧＣＭ００１培地）の作製 基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０培地〔Goding,J.W(198
0)J.Immunol.Methods39,285,JAMA 199(1957) 〕１０．
２ｇを用い、添加物としてインスリン１mg、ＢＰ（牛肉
由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０mg、ＨＳＡ
（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３mg、
チミジン４mg、α−トコフェロール０．１３mgおよびセ
レン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ００１
培地」という。）１Ｌを作製した。
0)J.Immunol.Methods39,285,JAMA 199(1957) 〕１０．
２ｇを用い、添加物としてインスリン１mg、ＢＰ（牛肉
由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０mg、ＨＳＡ
（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３mg、
チミジン４mg、α−トコフェロール０．１３mgおよびセ
レン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ００１
培地」という。）１Ｌを作製した。
【００２８】 無血清培養による変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生ＣＨＯ細胞（Ｕ７−２細胞）（特開昭６３−
１４６７８９号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒト
プロウロキナーゼ産生性における添加物依存性 ＧＣＭ００１培地からそれぞれの添加物を除いた培地で
Ｕ７−２細胞を培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０
4 細胞／ウェルで６穴プレート（Falcon,3046)の各ウェ
ルに植え込んだ。３７℃、５％二酸化炭素下で４日間培
養し、細胞数をコールターカウンターおよび血球計算盤
を用いて計測した。また、変異ヒトプロウロキナーゼ産
生性を測定するため、培養上清中のプラスミノーゲンア
クチベーター活性を平板法で調べた。
ナーゼ産生ＣＨＯ細胞（Ｕ７−２細胞）（特開昭６３−
１４６７８９号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒト
プロウロキナーゼ産生性における添加物依存性 ＧＣＭ００１培地からそれぞれの添加物を除いた培地で
Ｕ７−２細胞を培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０
4 細胞／ウェルで６穴プレート（Falcon,3046)の各ウェ
ルに植え込んだ。３７℃、５％二酸化炭素下で４日間培
養し、細胞数をコールターカウンターおよび血球計算盤
を用いて計測した。また、変異ヒトプロウロキナーゼ産
生性を測定するため、培養上清中のプラスミノーゲンア
クチベーター活性を平板法で調べた。
【００２９】結果は、図１に示す通りである。細胞増殖
性についてはＢＰとインスリンに、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性についてはインスリン、トランスフェリ
ン、ＨＳＡに強い要求性が認められた。
性についてはＢＰとインスリンに、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性についてはインスリン、トランスフェリ
ン、ＨＳＡに強い要求性が認められた。
【００３０】 Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地にお
けるインスリン依存性の検討 上記と同様の方法で試験を行った。結果は、図２およ
び図３に示す通りである。上記の結果と同様、細胞増
殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性ともにイン
スリンの依存性が高いことが明らかになった。また、図
２から明らかなように、細胞増殖性に関してはインスリ
ンの濃度に依存性があり、１mg／Ｌにおける結果が最も
優れていた。
けるインスリン依存性の検討 上記と同様の方法で試験を行った。結果は、図２およ
び図３に示す通りである。上記の結果と同様、細胞増
殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性ともにイン
スリンの依存性が高いことが明らかになった。また、図
２から明らかなように、細胞増殖性に関してはインスリ
ンの濃度に依存性があり、１mg／Ｌにおける結果が最も
優れていた。
【００３１】 細胞増殖性と変異ヒトプロウロキナー
ゼ産生性におけるＧＣＭ００１培地の効果について 比較として血清含有培地としてHam's F12(日水製薬
(株) 製）に１０％非働化ウシ胎児血清(Boehringer Man
nhaim GmbH,Lot.698071 02)を加えた培地を使用した。
また、無血清培地としてＡＳＦ（味の素 (株) 製）を使
用し、上記と同様の方法で試験を行った。
ゼ産生性におけるＧＣＭ００１培地の効果について 比較として血清含有培地としてHam's F12(日水製薬
(株) 製）に１０％非働化ウシ胎児血清(Boehringer Man
nhaim GmbH,Lot.698071 02)を加えた培地を使用した。
また、無血清培地としてＡＳＦ（味の素 (株) 製）を使
用し、上記と同様の方法で試験を行った。
【００３２】結果は、図４および図５に示す通りであ
る。ＧＣＭ００１培地は、比較として使用した無血清培
地より細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生
性ともにはるかに優れ、血清含有培地と同等の効果を示
すことが明らかになった。
る。ＧＣＭ００１培地は、比較として使用した無血清培
地より細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生
性ともにはるかに優れ、血清含有培地と同等の効果を示
すことが明らかになった。
【００３３】 ＧＣＭ００１培地を用いたスピンナー
培養 ＧＣＭ００１培地が長期の浮遊培養に使用できるかどう
か調べるために、バッチ法によるスピンナー培養を行っ
た。培養開始１週間後の細胞の浮遊状態は、ほとんどが
単個の細胞であったが、それ以後、数百個の細胞からな
ると思われるクランプが増加していった。そして、約１
ヶ月後には、ほぼ大きさの等しいクランプが多数を占め
るようになった。このクランプは、プロペラの回転を止
めるとすぐに沈降し、十数分間の静置により１０％程度
の細胞数の損失で培地交換ができた。３〜４日毎に２／
３量の培地を交換し、約３ヶ月間培養を続けた。その間
の細胞数と培養上清中のｍ−ＰＰＡ活性を図６に示し
た。これによると、細胞数は１０6 個から２×１０6 個
の間を維持しており、ｍ−ＰＰＡ活性は、多少変動は認
められるが、概ね１００ＩＵ／ml以上を維持していた。
培養 ＧＣＭ００１培地が長期の浮遊培養に使用できるかどう
か調べるために、バッチ法によるスピンナー培養を行っ
た。培養開始１週間後の細胞の浮遊状態は、ほとんどが
単個の細胞であったが、それ以後、数百個の細胞からな
ると思われるクランプが増加していった。そして、約１
ヶ月後には、ほぼ大きさの等しいクランプが多数を占め
るようになった。このクランプは、プロペラの回転を止
めるとすぐに沈降し、十数分間の静置により１０％程度
の細胞数の損失で培地交換ができた。３〜４日毎に２／
３量の培地を交換し、約３ヶ月間培養を続けた。その間
の細胞数と培養上清中のｍ−ＰＰＡ活性を図６に示し
た。これによると、細胞数は１０6 個から２×１０6 個
の間を維持しており、ｍ−ＰＰＡ活性は、多少変動は認
められるが、概ね１００ＩＵ／ml以上を維持していた。
【００３４】以上の結果から、ＧＣＭ００１培地を用い
ることによりＵ７−２細胞の増殖性および変異ヒトプロ
ウロキーゼ産生性について血清含有培地と同等の効果を
示すことが明らかになった。加えて、元来、付着・伸展
性増殖をする細胞を浮遊状態でも培養することが可能と
なり、ここに高密度培養も可能な浮遊培養系が確立され
た。
ることによりＵ７−２細胞の増殖性および変異ヒトプロ
ウロキーゼ産生性について血清含有培地と同等の効果を
示すことが明らかになった。加えて、元来、付着・伸展
性増殖をする細胞を浮遊状態でも培養することが可能と
なり、ここに高密度培養も可能な浮遊培養系が確立され
た。
【００３５】実施例２ ＧＣＭ００１培地における変異ヒトプロウロキナー
ゼ産生ＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯ細胞（Ａｓｎ ２４ −ＰＰ
Ａ産生４μＭ ＭＴＸ耐性細胞）（特願平２−１２３５
７３号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒトプロウロ
キナーゼ産生性Ａｓｎ ２４ −ＰＰＡ産生細胞は、Ｕｒｌ
ａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７７：４２１６（１９８
０）に記載の方法で調製され増殖させたＤＨＦＲ活性欠
損ＣＨＯセルラインから作製した。実施例１で得たＧＣ
Ｍ００１培地を使用してＡｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞を
培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０４細胞／ウェル
で６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）の各ウェル
に植え込む。３７℃、５％二酸化炭素下で６日間培養
し、細胞数をコールターカウンターおよひ血球計算盤を
用いて測定した。また、変異ヒトプロウロキナーゼ産生
性を測定するため、培養上清中のプラスミノーゲンアク
チベーター活性を平板法で調べた。
ゼ産生ＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯ細胞（Ａｓｎ ２４ −ＰＰ
Ａ産生４μＭ ＭＴＸ耐性細胞）（特願平２−１２３５
７３号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒトプロウロ
キナーゼ産生性Ａｓｎ ２４ −ＰＰＡ産生細胞は、Ｕｒｌ
ａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７７：４２１６（１９８
０）に記載の方法で調製され増殖させたＤＨＦＲ活性欠
損ＣＨＯセルラインから作製した。実施例１で得たＧＣ
Ｍ００１培地を使用してＡｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞を
培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０４細胞／ウェル
で６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）の各ウェル
に植え込む。３７℃、５％二酸化炭素下で６日間培養
し、細胞数をコールターカウンターおよひ血球計算盤を
用いて測定した。また、変異ヒトプロウロキナーゼ産生
性を測定するため、培養上清中のプラスミノーゲンアク
チベーター活性を平板法で調べた。
【００３６】結果は、図７および図８に示す通りであ
る。
る。
【００３７】
【発明の効果】本発明の無血清培地を使用することよ
り、従来の無血清培地に比し、短期間で順化が可能とな
る。血清含有培地を使用した場合と同等の細胞増殖性お
よび蛋白産生性を示すことができ、又、長期継代培養も
可能である。また、該培地を使用することにより、元
来、付着・伸展性増殖でしか培養できなかった細胞を浮
遊状態でも培養することが可能となる。
り、従来の無血清培地に比し、短期間で順化が可能とな
る。血清含有培地を使用した場合と同等の細胞増殖性お
よび蛋白産生性を示すことができ、又、長期継代培養も
可能である。また、該培地を使用することにより、元
来、付着・伸展性増殖でしか培養できなかった細胞を浮
遊状態でも培養することが可能となる。
【図１】細胞数とプラスミノーゲンアクチベーター活性
をＧＣＭ００１培地での場合に対する比率で示した図で
ある。
をＧＣＭ００１培地での場合に対する比率で示した図で
ある。
【図２】細胞増殖性に及ぼすインスリン濃度の影響を示
した図である。
した図である。
【図３】変異ヒトプロウロキナーゼ産生に及ぼすインス
リン濃度の影響を示した図である。
リン濃度の影響を示した図である。
【図４】Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地での細胞増殖
性を示した図である。
性を示した図である。
【図５】Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地での変異ヒト
プロウロキナーゼ産生を示した図である。
プロウロキナーゼ産生を示した図である。
【図６】ＧＣＭ００１培地を用いたＵ７−２細胞のスピ
ンナー培養での細胞数およびｍ−ＰＰＡ活性を示した図
である。
ンナー培養での細胞数およびｍ−ＰＰＡ活性を示した図
である。
【図７】ＧＣＭ００１培地におけるＡｓｎ24−ＰＰＡ産
生細胞の細胞増殖性を示した図である。
生細胞の細胞増殖性を示した図である。
【図８】ＧＣＭ００１培地におけるＡｓｎ24−ＰＰＡ産
生細胞の変異ヒトプロウロキナーゼ産生を示した図であ
る。
生細胞の変異ヒトプロウロキナーゼ産生を示した図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−5859（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−62981（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 動物細胞の細胞増殖期において血清の添
加を必要としない無血清培地であって、基礎培地にイン
スリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミン
を含有させることを特徴とする培地（但し、該培地はリ
ン酸基、カルボキシル基および／または硫酸基で置換さ
れたβ−Ｄ−キシロピラノースを成分として含まな
い）。 - 【請求項２】 動物細胞を請求項１記載の培地にて培養
し、増殖させることを特徴とする動物細胞の培養方法。 - 【請求項３】 異種蛋白質ＤＮＡを含む形質転換された
動物細胞を、細胞増殖期から請求項１記載の無血清培地
で培養して異種蛋白質を発現させることを特徴とする異
種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417059A JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417059A JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04234982A JPH04234982A (ja) | 1992-08-24 |
| JP2990805B2 true JP2990805B2 (ja) | 1999-12-13 |
Family
ID=18525205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2417059A Expired - Lifetime JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2990805B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234223A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-01-18 | 南京基蛋生物医药有限公司 | 低蛋白无血清细胞培养基 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998000521A1 (fr) * | 1996-06-28 | 1998-01-08 | The Green Cross Corporation | Milieux exempts de serum, methode de culture de cellules d'origine animale, et procede de production de substances physiologiquement actives |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0736755B2 (ja) * | 1983-09-13 | 1995-04-26 | 株式会社ミドリ十字 | プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体含有組成物 |
| DE3801236A1 (de) * | 1988-01-18 | 1989-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pentosansulfat-medium |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP2417059A patent/JP2990805B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234223A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-01-18 | 南京基蛋生物医药有限公司 | 低蛋白无血清细胞培养基 |
| CN109234223B (zh) * | 2018-11-21 | 2021-01-19 | 南京基蛋生物医药有限公司 | 低蛋白无血清细胞培养基 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04234982A (ja) | 1992-08-24 |
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