JP2893480B2 - ネコ―ｔ―リンホトロピックレンチウイルスに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の背景 この出願は、1989年１月５日出願のO'Connorらの米国
出願第293,906号、“ネコ−Ｔ−リンホトロピックレン
チウイルスに対するモノクローナル抗体”の部分継続出
願である。その出願も、更に、1988年12月５日に出願さ
れたO'Connorらの米国出願第279,989号、“ネコ−Ｔ−
リンホトロピックレンチウイルスに対するモノクローナ
ル抗体”の部分継続出願である。それ故、それらの両者
とも（図を含めて）ここで参照して引用する。

この発明は、ネコ−Ｔ−リンホトロピックレンチウイ
ルス（ネコ免疫不全ウイルス、FIVとも呼ばれる）に対
するモノクローナル抗体及びこのウイルスの検出及び精
製へのそれらのモノクローナル物の利用に関する。

Pedersonら、235、Science、790、1987年は、免疫不
全様症候群の家ネコからのFIVの検出及び単離を記載し
ている。そのウイルスは、0.1M NaCl及び1mMEDTAを含む
pH7.4のトリスベース中のショ糖勾配上の遠心分離によ
り精製された。勾配精製したウイルスからのウエスタン
ブロット及びそれらの実験的に感染されたネコ由来の血
清との反応を測定した。多少の蛋白質バンドが検出さ
れ、“抗原性の比較は行わなかったが、これらのバンド
の位置は、HIVの主要コア蛋白質p24、gag前駆体蛋白質p
55及びエンドヌクレアーゼ蛋白質p32に対し得る”。

1987年８月26日に出願されたPedersonらの米国特許出
願“ネコ−Ｔ−リンホトロピックレンチウイルス”（こ
れは本出願の先行技術ではない）は、Pederson（前記文
書）により提出された結果を記載し、FIV感染細胞溶解
物のウエスタンブロッティングは、約22−26kD（普通は
約24kD）、50−60kD（普通は約55kD）及び28−36kD（普
通は約32kD）の主要なバンドを生じたと述べている。彼
らは、KohlerとMilstein、６、Eur.J.Immol.551、1976
年に記載されたようにして、標準的技術によりFIV抗原
に対するモノクローナル抗体を製造出来ると述べてい
る。

発明の要約 第一の面において、この発明は、FIVにコードされる
抗原、例えば、蛋白質、ポリペプチド又は糖蛋白質の抗
原決定基に特異的なモノクローナル抗体を記載する。モ
ノクローナル抗体とは、抗体産生細胞系統を作るために
クローン化された単一の抗体産生細胞から作られる任意
の抗体を意味する。それはポリクローナル標品、即ち、
動物に抗原を接種してその結果の血清を回収することに
より作られる標品中に見出される多用な抗体は含まな
い。抗原決定基とは抗体により認識される任意の特異的
アミノ酸配列、修飾アミノ酸配列、又は蛋白質の二次又
は三次構造を意味する。この抗原決定基はFIVの一つ以
上の抗原に存在し得るが、普通にFIVに会合する他の如
何なる成分（例えば、ネコの細胞及び血清）中にも存在
しない。

好ましい実施例において、この抗原決定基は、FIVのp
10、p15、p26、p47、p110、gp40及びgp130抗原（即ち、
下記のごとく分子量10、15、26、40、50、110又は130kD
を有するFIVにコードされた抗原）からなるグループか
ら選ばれる抗原上に存在する。抗体はFIVの免疫アッセ
イにおいてその抗原決定基を選択的に同定するためにそ
の抗原決定基に対する十分な親和性を有する。抗体は検
出可能な標識と結合されており、その標識は抗体の抗原
決定基に対する特異性又は親和性を妨げない。最も好ま
しくは、その標識は酵素、例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼであり、抗体はAmerican Type Culture Collec
tionに寄託された細胞系統（HB9888、HB9889又はHB989
0）により産生される。

第二の面において、この発明は、上記のモノクローナ
ル抗体を複数含み、各抗体はFIVにコードされる抗原の
抗原決定基に特異的である溶液を記載する。

第三の面において、この発明は、この抗原決定基に特
異的なモノクローナル抗体を供給し、その抗体をその抗
原決定基と複合体を形成する条件下で試料と接触させ、
そしてその複合体を検出する（複合体の存在は試料中の
抗原決定基の存在を示す）ステップを含む、試料中のFI
Vにコードされる抗原の抗原決定基を検出する方法を記
述する。

この発明は、FIVのアッセイ及び精製に用いるのに適
したモノクローナル抗体を供給する。出願人は、これら
のモノクローナル抗体を単離してスクリーニング手順に
おいてそのようなモノクローナル抗体の存在を検出する
ための十分純粋なFIV抗原を製造することの出来る方法
を決定した。出願人はこの発明中で、有用な抗体を有用
でない抗体から区別し得る方法をも記載した。

この発明の他の特徴及び有利さは下記の好ましい具体
例の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。

図面の簡単な説明 まず、図面を簡単に説明する。

図面 図１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）に
より同定され及びクーマシーブルーR250（レーンＡ）に
より染色されたFIVの主要ウイルス結合蛋白質の写真で
ある。分子量標準はレーンＢに示されている。そして 図２は、FIV抗体に対するELISAにより陽性と同定され
たネコ由来の血清中に見出されたFIVに対する抗体のウ
エスタン免疫ブロット分析の写真である。

好ましい具体例の説明 FIV抗原 FIV抗原はFIV感染細胞から引き出され、FIVウイルス
粒子の形成を有するか、又は、FIVウイルス粒子から下
記のように引き出される（合成抗原も又このアッセイに
適しており、それは実質的に純粋なFIV粒子から引き出
されたポリペプチドである）。マスターシードウイルス
産生培養は、Neils Pederson博士（カリフォルニア大
学、Davis、California）によるFIV単離株＃2427（CRFK
−FIV又はPetaluma株）に感染した継代ネコ細胞系統の
形態で得られた。親細胞系統は持続的にFIVに感染したC
randellネコ腎臓細胞である。その細胞系統は、1988年
７月13日にAmerian Type Culture Collectionに、番号C
RL9761で寄託された。出願人及びその譲受人は、もしそ
れがここで発行された特許の機関の終了前か又は最後の
培養の要求の後５年以内或は30年以内（いずれか長い
方）に死んだ場合は、この培養を交換する責任及びその
ような特許の発行を寄託所に知らせる責任（その時点で
寄託物は一般に公開される）を認める。そのときまで寄
託物は特許庁長官により、米国特許法37C.F.R.§１−14
及び35U.S.C.§112に基づいて入手可能にされるであろ
う。

他のウイルス培養はPederson（前記文書）又はHarbou
rら、122、The Veterinary Record 84、1988年により記
載されたようにして得られる。ウイルス産生細胞培養の
シードストックは、培養における少なくとも19のポスト
インフェクションパッセージ（post infection passag
e）の後の、FIV感染したマスターシード細胞培養のフリ
ーズダウン（freeze−downs）により得られた。ウイル
ス産生培養の追加のシードストックは、連続ネコ細胞培
養のFIVマスターシードウイルスによる感染か又は元のF
IV感染マスターシード細胞培養由来の高レベルのFIV産
生者の単一細胞マイクロウェルクローニングにより得ら
れた。増殖のために、マスターシードウイルス感染ネコ
細胞培養を組織細胞培養フラスコ中に接種した。コンフ
ルエントな単層細胞に成長した後、組織培養液を２−５
日の間隔で採取した。

作用性（working）シードウイルスはFIVで永続的に感
染したマスターシード細胞系統による増殖により産生し
た。接種物を組織培養フラスコに加えた［2mM L−グル
タミンを含み及び4.5g/l グルコース（100単位/mlのペ
ニシリン及びストレプトマイシン並びに2mMグルタミン
を含む）を含むダルベッコ改変イーグル培地中］。接種
物を組織培養フラスコに加え、インキュベートし、そし
て消費された組織培養液を細胞がコンフルエントに成長
したときに採取した。その細胞を培養器からトリプシン
/EDTAを用いて遊離させ、培養液で1:5〜1:25に希釈し
た。典型的には、液及び細胞を採取する前に、そのフラ
スコを36−38℃で最大７日間（３〜７日）インキュベー
トした。細胞物質を含む採取した液は高速で遠心分離
（Sorval RC−5B又はBeckman J2−21）して上清と細胞
ペレット物質を分離した。細胞ペレットは捨て、上清の
培養液は作用ウイルスを調製するのに用いた。澄んだ上
清をNaCl中で0.5Mに、及びポリエチレングリコール（PE
G8000、Sigma）中で４−10％（普通は７％）にした。一
晩２−７℃でインキュベート後、ウイルスをペレット化
し（13,000×ｇで30分）、緩衝液（10mMトリス、pH7.
6、300mM NaCl、1mM EDTA、２−７℃）中に再懸濁し
た。一晩インキュベートした後、ウイルスを13,000×ｇ
で30分遠心分離し、ペレットは捨て、上清を10mMトリス
300mMNaCl、1mMEDTA、pH7.6中の50％/80％不連続グリセ
ロールステップ勾配上で遠心分離した。遠心分離は100,
000×で３時間、４℃で行い、FIVウイルスのバンドを50
％−80％界面で採取した。そのバンドを10mMトリス、0.
3M NaCl及び1mM EDTAに懸濁し、その緩衝液で1:3に希釈
し、そして100,000×ｇ、１時間の遠心で再ペレット化
した。その結果のペレットは精製されたウイルスであ
り、上記の緩衝液に再懸濁して−70℃に保存した。この
結果のウイルスは実質的にFIV宿主細胞蛋白質を含ま
ず、少なくとも５％のp26（主要ヌクレオキャプシド蛋
白質で、クーマシーブルー250染色したSDS/PAGEのデン
シトメーターのスキャンにより全蛋白質として測定され
る）から成っていた。そのような抗原は、モノクローナ
ル抗体の調製用に、及び適当なモノクローク抗体をスク
リーニングするために十分純粋である。

そのような精製した抗原は他の技術によって得られる
が、出願人はウイルス標品中に存在する高分子量の夾雑
物を勾配遠心法において用いられる高濃度塩（即ち、生
理的塩濃度範囲より高濃度）を用いることにより排除し
得るということを見出した。

FIV糖蛋白質 ウイルス糖蛋白質に対するモノクローナル抗体を調製
するために、まず抗原性糖蛋白質を下記のように調製し
た。

活発に成長しているCRFK FTLV感染細胞をローラーボ
トルからこすり取り、リン酸緩衝塩溶液（PBS）で穏や
かに洗い、ペレット化した。その細胞ペレットをユダヤ
かに10mM リン酸ナトリウム、pH7.2中に細胞ペレット
0.1ml当り1mlの緩衝液の比率で再懸濁した。この懸濁液
を氷上でインキュベートし、又は５−10分間冷却し、30
秒間激しく回転混合させ、そして1mM PMSFを含む４容の
PBSを加えた。この混合物を、次いで、Brinkmannホモジ
ェナイザーPT10/35中で、PTA20ジェネレーターを用いて
90−120秒間激しくホモジェナイズした。

その結果のホモジェネートを20分間、5,000gで遠心分
離した。その上清画分を捨て、細胞膜ペレットをPBS＋
0.2％トリトンＸ−100中に、元の細胞ペレット0.1ml当
り緩衝液2.5mlの比率で再懸濁した。この混合物を、次
いで、BrinkmannホモジェナイザーPT10/35中で、PTA20
ジェネレーターを用いて90−120秒間激しくホモジェナ
イズした。その結果のホモジェネートを100,000g、１時
間の遠心まで澄まし、上清をデカントし、バッチを一晩
20−23℃でファルマシアレンチルレクチンセファロース
4B上に、元の細胞ペレット5ml当り6mlの樹脂の比率で結
合させた。

レンチルレクチン懸濁液をカラムに通し、その樹脂を
集め、そして15カラム容のPBS＋0.2％トリトンＸ−100
で洗った。糖蛋白質を、次いで、樹脂を５−10容のPBS
＋0.2％トリトンＸ−100＋200mMメチルα−Ｄマンノピ
ラノシドに投入し、１カラム容／管のフラクションを集
めることにより樹脂から溶出した。

糖蛋白質の単離は９％SDS−PAGE電気泳動により確か
め、³⁵S−放射標識した細胞標品を用いてRIPAのデータ
と共にチェックした。

ウイルス糖蛋白質の宿主細胞糖蛋白質からの更なる精
製はHPLCの使用又はアフィニティークロマトグラフィー
用のポリクローナル抗体の使用を含む。

FIVモノクローナル抗体の調製 Balb/CJ（Jackson Labs）マウスを、マウス当り50μ
ｇのFIVをDifco Bacto完全アジュバントと1:1に混合し
たものを最初の注射に用いて免疫化した。２週間後、FI
V抗原100μｇのブースター注射を各マウスにアジュバン
トを用いないで静脈注射した。ブースター注射の３日
後、マウスミエローマ細胞系統FO即ちp3X63−Ag8,653と
の融合を行った。中間対数期（mid log phase）のミエ
ローマ系統を融合の日に採取し、生存力を調べた。その
細胞を300×ｇ、８分間遠心して成育培地から分離し、
無血清DME中に再懸濁した。

融合のために、FIVを接種したマウスを頸椎脱臼によ
り殺し、脾臓を無菌的に取り出した。脾臓を無血清DME
で３回洗い、20mlの完全培地（20％ウシ胎児血清、100
単位/mlのペニシリン及びストレプトマイシン、及び1mM
ピルビン酸ナトリウムを含むDME）を含む無菌のペトリ
皿中に置いた。細胞を遊離させるために、脾臓を23ゲー
ジ針を用いて灌流した。

細胞を50mlの円錘形遠心管に入れて、300×ｇ、８分
間遠心してペレット化した。そのペレットを5mlの0.17M
塩化アンモニウムに再懸濁し、氷上に８分間置いた。5m
lのウシ胎児血清（20％）を加え、細胞を300×ｇ、８分
間で再びペレット化した。10mlのDME中に再懸濁した
後、細胞を計数し、脾臓及びミエローマ細胞を3:1の比
で混合した。その細胞混合物を200×ｇ、10分間でペレ
ット化し、上清をデカントし、そしてペレットを５分間
置いた。１分間ごとに1mlの50％PEG（PEG1500をHepes p
H8.1と1:1に混合する）を37℃で加えた。37℃で１分間
のインキュベーションの後、1mlのDMEを他の１分間に渡
って加え、次いで、無血清培地の第二の1mlを１分間に
渡って加えた。最後に、10mlのDMEを２分間に渡って加
えた。最後に、10mlのDMEを２分間に渡って加え、細胞
を200×ｇ、８分間でペレット化し、そして、そのペレ
ットを0.016mMチミジン、0.1mMヒポキサンチン、0.5マ
イクロモルアミノプテリン及び10％ハイブリドーマクロ
ーン化因子を含む完全培地（１×HAT）中に再懸濁し
た。その細胞を96ウェルのプレート上にプレートした。

３、５とよび７日後に、融合プレート中の培地の半分
を除去し新鮮な１×HATで置換した。11日後、ハイブリ
ッド細胞上清をELISA試験でスクリーニングした。この
試験において、96ウェルプレートは標準技術によりFIV
抗原でコートされた。各ウェルからの100μｌの上清を
スクリーニングプレート上の対応するウェルに加え、１
時間20−22℃でインキュベートした。インキュベーショ
ンの後、各ウェルを蒸留水で３回洗い、ヤギ抗マウスIg
G（Ｈ＋Ｌ）、Ａ、Ｍの西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合体（1:1500希釈）100μｌを各ウェルに加え、１時間2
0−22℃でインキュベートした。蒸留水で３回洗った
後、基質のOPD−過酸化水素を加え、５−15分間インキ
ュベヒションを続けた。次いで、100μｌの停止溶液（1
M塩酸）を加え、490nmの吸光度を読んだ。コントロール
ウェルより光学密度の読みの大きい培養を２cm²の培養
皿に移し、１×HT培地中で正常マウス脾臓細胞を加え
た。更に３日後、すべての２cm²の培養を抗体について
再スクリーニングし、再び陽性のものを限界希釈法によ
りクローン化した。各２cm²の培養中の細胞を計数し、
細胞濃度を１×10⁵細胞/mlに調成した。細胞を完全培地
中で希釈し、５、10及び50細胞/mlのハイブリドーマ細
胞の濃度で正常マウス脾臓細胞を加えた。その細胞をそ
れぞれ希釈するために96ウェルプレートにプレートし
た。10日後、クローニングプレートを成長でスクリーニ
ングした。全ウェルの約37％が成長を示した。成長陽性
のウェルを抗体についてスクリーニングし、試験陽性の
ものを２cm²の培養に拡張し、正常マウス脾臓細胞を供
給した。このクローニング手順を安定な抗体産生ハイブ
リドーマが得られるまで２回繰り返した。この時点で、
細胞培養を２cm²から9,75、150cm²の培養器へと拡大
し、腹水産生を開始することが出来た。

腹水産生のために、プリスタン投与された雌のIRCF1
マウスを用いた。0.5mlのプリスタンを各マウスに腹腔
内（IP）注射し、そのマウスを10−60日間休ませた。こ
の時は、4.5×10⁶細胞を各マウスにIP注射し、７−14日
で腹水が形成された。腹水液は腹膜の穴を通してパスツ
ールピペットで採取した。

モノクローナル抗体の反応性 この発明で有用なモノクローナル物はFIVに特異的な
もの及びFIV抗原決定基との十分に強い相互作用を形成
するもの及びFIV抗原を含み、例えば、FIV抗原を検出す
るためのELISA等の免疫アッセイにおいて有用である。
上記のモノクローナル抗体のどれがこの発明において有
用であるかを決定するために２種の主要な試験を用い
た。第一のものは、モノクローナル抗体がFIV抗原と結
合出来て、ポリクローナル抗体のFIVへの結合体により
検出されるかどうかを決定するためのものであった（EL
ISA試験、下記に詳述）。第二の試験は、モノクローナ
ル抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体を形成
し、次いで、モノクローナル抗体がそれ自身とFIV抗原
を競合し得るかどうか及び他のモノクローナル抗体とそ
の抗原を競合するかどうかを決定するためのものであっ
た。後者の試験はモノクローナル抗体の混合物中でどの
モノクローナル物が有用であるかを決定するために有用
である。一般に、異なる反応性を有する抗体は互いに結
合して試料中のより広い範囲のFIV抗原の検出を可能に
する。そのような結合は感度を大いに増大させる。

他の試験は、モノクローナル抗体が一つ以上のFIV抗
原と十分な反応性を有するかどうかを決定するためのウ
エスタンブロットを行うことである。一般に、僅かの反
応性しか示さない、即ち、ウエスタンブロットでかすか
なバンドしか生じないモノクローナル抗体はこの発明に
おいて適当でない。また、他の試験は³⁵S−メチオニン
で標識されたFIVウイルスがモノクローナル抗体と反応
して免疫沈降を生じる放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）
を含み、免疫沈降はSDS−PAGEにおいて行われ、そして
標識された蛋白質を検出するためにオートラジオグラフ
ィーが行われる。この分析はどのモノクローナル抗体が
前駆体FIV蛋白質及び成熟したての蛋白質を検出し得る
かを決定する。

そのような試験の実施例は、モノクローナル抗体を区
別し得る様々なFIV抗原（即ち蛋白質）の同定の記述を
伴って下記に提出される。これらの実施例はこの発明を
制限するものではない。

第１図を参照すると、精製FIVに伴う蛋白質をSDS/PAG
Eによって分析しかつ未感染細胞の消費された培地から
同様にして分離した蛋白質と比較した。クマージーブル
ー染色したゲルを分析して、分子量約10、15及び26kDを
有する３つの主要蛋白質（それぞれp10,p15及びp26と呼
ばれる）を示した。

破砕FIVを用いてELISA試験を行ってネコが保有するFI
V蛋白質に対するポリクローナル抗体を同定し、次いでE
LISAによって陽性であることが判明したネコの血清につ
いてウエスタンブロット分析を行った。ネコの各々は、
分子量p10、15、26、40及び65kDの一種或はそれ以上の
蛋白質或は抗原と使用条件下で反応する抗体を有してい
た。

第２図を参照すると、標準ウエスタン免疫ブロット
を、Towbin等が76 Proc,Natl,Acad,Sci USA 4350、1979
に記載する通りにして行った。簡単に言えば、FIVをSDS
で分裂させ、蛋白質をニトロセルロースのシートに移し
た。ニトロセルロースシートを、30％ウシ血清、１％ウ
シ血清アルブミン（BSA）及びダルベッコのリン酸緩衝
塩溶液中0.05％Tween20でブロックした。シートを切断
して0.5cmの細片にし、ブロッキング緩衝液中で血清サ
ンプルを1:100に希釈して20〜22℃において２時間イン
キュベートした。細片を洗浄用緩衝液（ダルベッコのリ
ン酸緩衝塩溶液中0.05％Tween20）で繰返し洗浄し、次
いで第二抗体（ネコの重及び軽鎖1gについて特異性）西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（メリーランド、ゲイ
ザースバーグ KirkguardSTRIand Perry Laboratories
Inc.から得られる）でインキュベートした。細片を１時
間インキュベートした後に、洗浄用緩衝液で繰返し洗浄
しかつ沈殿用基質４−クロルナフトールで10分間インキ
ュベートした。細片を部分乾燥し、結果を直に判断し
た。Ａ−Ｇ列の各々における血清は、FIVを感染させた
種々のネコから得た。p26及びp15との並びに度合いは小
さいがp10との支配的な反応性が検出された。分子量3
2、40,47及び65kDの他の蛋白質もまた検出された。

抗体或は糖蛋白質もまた分離することができる。特
に、分子量40kD（gp40）及び130kD（gp130）の２つの糖
蛋白質は、それぞれPAGE及びRIPAを用いて検出すること
ができる。例えば、エンベロープ前駆体蛋白質gp130及
びトランスメンブレン蛋白質が保有する抗原部位を認識
することができるエンベロープ蛋白質gp40に対する抗体
（2F11）を下記の通りにして分離した。この抗体とこれ
らの糖蛋白質との反応性は、³⁵S−メチオニン／システ
イン標識したFIV感染した細胞溶解液をRIPA−PAGE分析
して求めた。抗体によって同定した130kDは、グリコシ
ダーゼＨ（糖蛋白質の分子量を75kDに減少させた）によ
る処理に感応することから、gp130であることが確認さ
れた。検出した40kD蛋白質は、この酵素による処理に対
して耐性であった。

2F11抗体は、マウス−Balb/C（Amitek）及び破砕全ウ
イルスを用いて分離した（StaphA緩衝液1:1で20°〜25
°において半時間）。抗原300μｇに完全フロイントア
ジュバントを1:1て混合し、ブースト300μｇをアジュバ
ント無しで２週間の間隔で与えた。細胞融合は最初の免
疫化から５週目に２−300μｇのブーストで行った。マ
ウスは融合の前に３日間休ませた。融合相手はFO ATCC
CRL1646（J.Immunol.Methods 35;1−21、1980）であっ
た。生成した抗体を融合板上でスクリーニングし、再ス
クリーニングし、サブクローン化し、サブクローンを増
大させて腹水産生させた。抗体はサブタイプIgG₁ Kappa
軽鎖からなる。

ある種のウイルス性蛋白質、例えばgag（p26）抗原は
精製ウイルス標品中にたくさんあり、他のウイルス蛋白
質、例えばウイルス性エンベロープ蛋白質（gp130）は
精製する間に失われる傾向にあり、ウエスタンブロット
分析のための泳動トランスファーがgag抗原に比べて効
率的に劣る。よって、ウイルス性エンベロープ及びgag
前駆体蛋白質を一層容易に検出するために、FIV細胞抽
出物を³⁵S−メチオニン及びシステインで標識し、免疫
沈降（RIPA）によって調べた。FIVを感染させた融合性
培養を、メチオニン及びシステインの存在しないダルベ
ッコ改変イーグル培地中で30分間インキュベートした。
細胞培養を、次いで³⁵S−メチオニン及び³⁵S−システイ
ン（比活性1200キュリー/mM、マサチューセッツ、ボス
トン New England Nuclear Corporation）を1ml当り10
0マイクロキュリー含有する同じ培地8ml中で４時間イン
キュベートした。放射性組織培養液を取り出し、細胞
を、NaC1100mM、Triton X1001％、ナトリウムデオキシ
クロレート0.5％、SDS0.1％、フェニルメチルスルホニ
ルフルオリド0.1mM及び100Kallikren不活化剤単位のア
プロテニン/1ml（ミズーリ、セントルイス Sigma Chem
ical Co.）を含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.5）5mlで溶解させた。細胞溶解液を、使用する前に、
100,000gて30分間遠心分離して清澄にし、ペレットを捨
てた。標識した溶解液のアリコート（0.1ml）及び試験
する血清５μｌをマイクロ遠心機チューブで混合し、37
℃において１時間、次いで４℃において一晩インキュベ
ートした。次の日、NaCl100mM、Triton X−100 1％及び
SDS0.1％を含有する10mMのりん酸塩緩衝液中プロテイン
ＡセファロースCL−4Bビーズの５％懸濁液0.2mlを各々
のチューブに加えて４℃において30分間混合した。プロ
テインＡセファロースビーズに結合した抗体／抗原複合
体を遠心分離（２分間、20,000×ｇ）で集め、溶解緩衝
液で３回洗った。最終ペレットを25μｌのSDS/PAGEロー
ディング用緩衝液に再懸濁し、100℃に３分間加熱し
た。セファロースビーズを遠心分離により除去し、上清
をPAGEにアプライした。ゲルをエンライトニング^TM（Ne
w England Nuclear Corporation,Boston,MA）を用いて
フルオログラフィーを行い、−70℃でKodakXR−５フィ
ルムに露光した。実験的に感染させたネコ由来の血清は
15、22、36、40、47、110及び130kDの蛋白質を認識す
る。いくらかの定量的及び定性的差異はあったが、すべ
てのネコはp22、gp40、gp47及びgp130への応答を高める
ようである。

RIPA−PAGE分析により同定されたどの蛋白質が主要内
部構造蛋白質、p26に関係しているかを決定するためにR
IPA−PAGE分析をウエスタンブロッティングで決定され
るp26と反応するモノクローナル抗体を用いて行った。
このモノクローナル物は蛋白質P47、p36、p22及びp15を
免疫沈降させた。p26特異的モノクローナル抗体により
検出されなかったFIVの高分子量蛋白質（120kD）。分子
量100kDの蛋白質も又幾つかの感染ネコから得られた血
清抗体を用いて検出可能であった。

上記のように単離され、上記の技術により試験された
モノクローナル物は、p10、p15、p26、p47と特異的に反
応し、サブタイプIgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG2A及びIg
G2Bに属することが見出された。幾つかのモノクローナ
ル物がp26及びp47と僅かしか反応せず、他のものが強く
或は中程度のレベルで反応したことは当然である。我々
は任意の特異的抗体の有用性の最も重要な試験はELISA
試験であることを見出した。特異的試験において、ミク
ロ滴定プレートはウェル当り１μｇのコート用緩衝液
（0.1M NaHPO₄、pH7.2）中の抗−FIVモノクローナル抗
体でコートした。モノクローナル抗体を３℃で一晩イン
キュベートした。次いで、プレートをリン酸緩衝塩溶液
及び0.05％Tween−20で２回洗い、残留液を吸引した。
次に、ウェルを0.1MトリスpH7中の１％ウシ血清アクブ
ミンでブロックし、この洗浄溶液を吸引した。次に、ウ
ェルを0.1MトリスpH7中の１％ウシ血清アルブミンでブ
ロックし、この洗浄溶液を吸引した。FIV試料又は既知
のFIV抗原を、次いで、標準手順により加えた。西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合体を、精製ヤギ抗−FIVIgG又
は第二の抗−FIVモノクローナル抗体を用いて調製し
た。次いで、結合体を試験用ウェルに供給した。洗浄に
続いて、基質−クロモーゲン混合物（TMB/H₂O₂）を試験
用ウェルに加え、15分間インキュベートした。次いで、
ウェルの光学密度を650nmで測定した。この試験におい
て、正常の陰性試料は約0.060.D.単位の結果を与えた。
培養は十分な抗体産生O.D.の読み0.5〜1.0を有したが、
１μg/mlのFIV抗原を供給された僅かのモノクローナル
抗体は0.5未満のO.D.の読みを与えた。十分なモノクロ
ーナル抗体は典型的には0.2を上回るO.D.を生じ、その
場合、1ml当り1ngが供給された。

第二の実験において、それぞれのモノクローナル抗体
は西洋ワサビペルオキシダーゼと結合して、FIV抗原に
対する競合アッセイで分析した。この方法で、どのモノ
クローナル抗体が混合物中でFIVに対する標準的免疫ア
ッセイとして用い得るかを決定した。特に良好な混合物
は、2D4又は3H8（p26に特異的）、4F2（p15、p26及びp5
0に特異的）及び6E6（p26及びp50に特異的）を含む。

寄託 モノクローナル抗体3H8、4F2及び6E6を産生する細胞
系統は、ATCCに、1988年11月１日に寄託し、寄託番号
（designation number）HB9888、HB9889及びHB9890をそ
れぞれ与えられた。このモノクローナル抗体2FI1産生細
胞系統はATCCに1988年11月17日に寄託し、寄託番号HB10
295を与えられた。

出願人の譲受人、Idexx Corpは、特許期間の終了前、
培養の最後の要求の後５年、又は30年（いずれか長い
方）の内にこれらの培養が死んだ場合はそれを置き換え
る責任及びそのような特許の発行を寄託所に知らせる
（その時点で寄託物は最終的に一般に入手可能となる）
責任を認める。その時までは、寄託物は特許庁長官によ
り米国特許法37CFR§１−14及び35USC§112に基づいて
入手可能となるであろう。

他の具体例は下記の請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ−９８８９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ−９８９０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１０２９５ (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ 235（1987）ｐ．790 −793 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｒ．Ｓｃｉ．50［１ ］（1988．Ｆｅｂ．）ｐ．39−44 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】FIVにコードされる抗原の抗原決定基に特
   異的なモノクローナル抗体であって、該抗原決定基がp1
   0、p15、p47、p110、gp40及びgp130からなるグループか
   ら選ばれるFIV抗原上に存在する、上記のモノクローナ
   ル抗体。
2. 【請求項２】上記の抗体がFIVに対する免疫アッセイに
   おいて上記の抗原決定基を選択的に同定するために上記
   の抗原決定基に対する十分な親和性を有する、請求項１
   に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】上記の抗体がFIV粒子上の抗原決定基を認
   識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】検出可能な標識に結合され、該標識が上記
   の抗体の上記の抗原決定基への特異性又は親和性を有意
   に妨害しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】上記の標識が酵素である、請求項４に記載
   のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】上記の酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ
   である、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】ATCC番号HB9888、HB9889、HB9890又はHB10
   295で寄託された、FIVにコードされる抗原に特異的であ
   る、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
8. 【請求項８】複数のモノクローナル抗体を含む溶液であ
   って、各抗体がp10、p15、p47、p110、gp40及びgp130か
   らなるグループから選ばれるFIVにコードされる抗原の
   抗原決定基に特異的である溶液。
9. 【請求項９】試料中のp10、p15、p47、p110、gp40及びg
   p130からなるグループから選ばれるFIVにコードされる
   抗原の抗原決定基の検出方法であって、下記のステッ
   プ： ａ）上記の抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体を
   供給し、 ｂ）上記の抗体を上記の試料に上記の抗体が上記の抗原
   決定基と複合体を形成する条件下で接触させ、そして ｃ）上記の複合体を検出し、上記の複合体の存在が上記
   の試料中の上記の抗原決定基の存在を示す ことを含む検出方法。