JP2887733B2 - アジュバント剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的技術詳細に
は、抗原と組み合わせるべき新規なアジュバント剤に関
する。
は、抗原と組み合わせるべき新規なアジュバント剤に関
する。
【０００２】
【従来の技術】抗原と呼ばれるタンパク質または感染物
質が、動物またはヒトの体液性系に入る場合、抗体の形
成を生じさせる免疫応答が起こる。多くの場合、血液中
に産生された抗体レベルは、疾患に対し動物またはヒト
を保護するためには、または商用ワクチンの製造におけ
る使用のためには、そして科学研究における抗体の調製
のためには、低すぎる。
質が、動物またはヒトの体液性系に入る場合、抗体の形
成を生じさせる免疫応答が起こる。多くの場合、血液中
に産生された抗体レベルは、疾患に対し動物またはヒト
を保護するためには、または商用ワクチンの製造におけ
る使用のためには、そして科学研究における抗体の調製
のためには、低すぎる。
【０００３】従って、生物がさらに抗体をつくるのを助
力する方法を見出だすことは、一世紀以上に亙って活発
に行われていた努力分野である。さらに別の背景および
文献については１９９３年１０月１日の米国出願第０８
／１３０，６４５号を参照されたい。半世紀前、鉱油と
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような死ん
だマイコバクテリウムのクリーム状の乳剤から成るアジ
ュバント剤を紹介したジュール・フロイントにより、非
常に重要な貢献がなされた。これは広く知られるように
なりフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）として用い
られた。それは抗原の単なる水溶液を用いての自然な応
答に対し数桁も大きく、血液中の抗体濃度を上昇される
ことができる。総合的な概論については、Ｊ，Ｆｒｅｕ
ｎｄ著Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ Ｒｅｓｅａｃｈ ７，１３０〜４８（１９５６）
のＴｈｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔｓを参照された
い。
力する方法を見出だすことは、一世紀以上に亙って活発
に行われていた努力分野である。さらに別の背景および
文献については１９９３年１０月１日の米国出願第０８
／１３０，６４５号を参照されたい。半世紀前、鉱油と
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような死ん
だマイコバクテリウムのクリーム状の乳剤から成るアジ
ュバント剤を紹介したジュール・フロイントにより、非
常に重要な貢献がなされた。これは広く知られるように
なりフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）として用い
られた。それは抗原の単なる水溶液を用いての自然な応
答に対し数桁も大きく、血液中の抗体濃度を上昇される
ことができる。総合的な概論については、Ｊ，Ｆｒｅｕ
ｎｄ著Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ Ｒｅｓｅａｃｈ ７，１３０〜４８（１９５６）
のＴｈｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔｓを参照された
い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、フロイ
ントアジュバントは、重篤な有害反応を起こし動物を死
なせるので大きな不利な点を有する。それをヒトに適用
できない。ヒトに用いるアジュバンドは、ほぼ例外なく
水酸化アルミニウムの懸濁液、ポリカチオンで不溶化の
タンパク質吸着性コロイドからなる。フロイントアジュ
バントのその効能に匹敵させ、同時にこの剤から生じる
損傷（注射部位の重篤な損傷、関節炎や発熱により顕在
化する）を避けるための多くの努力がなされてきた。
ントアジュバントは、重篤な有害反応を起こし動物を死
なせるので大きな不利な点を有する。それをヒトに適用
できない。ヒトに用いるアジュバンドは、ほぼ例外なく
水酸化アルミニウムの懸濁液、ポリカチオンで不溶化の
タンパク質吸着性コロイドからなる。フロイントアジュ
バントのその効能に匹敵させ、同時にこの剤から生じる
損傷（注射部位の重篤な損傷、関節炎や発熱により顕在
化する）を避けるための多くの努力がなされてきた。
【０００５】フロイントアジュバントに用いられている
マイコバクテリウムの細胞壁は糖ペプチドサブユニッ
ト、例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルタミン（ＭＤＰ）とＮ−アセチルグルコサミニ
ル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ
ルタミン（ＧＭＤＰ）を含む。これらのサブユニットな
らびに数多くの化学修飾した類似体および誘導体はアジ
ュバントとして用いるために研究されてきた。
マイコバクテリウムの細胞壁は糖ペプチドサブユニッ
ト、例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルタミン（ＭＤＰ）とＮ−アセチルグルコサミニ
ル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ
ルタミン（ＧＭＤＰ）を含む。これらのサブユニットな
らびに数多くの化学修飾した類似体および誘導体はアジ
ュバントとして用いるために研究されてきた。
【０００６】ＭＤＰの免疫刺激作用の研究は食塩水中の
ＭＤＰがＤＴＨ（遅延型過敏症、抗原に対する免疫反応
の徴候）［Ｃａｒｅｌｌｉ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｄｉｂｅｒｔ
＆Ｌ．Ａ．Ｃｈｅｄｉｄ （１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３３，３１２〜１
４］を誘導しないという所説に至っている。同様に、特
にＭＤＰおよびＧＭＤＰを含むリゾチーム消化の細胞壁
ライセートは抗体数の顕著な増加を生じないことが見い
出された［Ｌ．Ａ．Ｃｈｅｄｉｄ，＆ Ｆ．Ｍ．Ａｕｄ
ｉｂｅｒｔ，米国特許第４，０９４，９７１号］。
ＭＤＰがＤＴＨ（遅延型過敏症、抗原に対する免疫反応
の徴候）［Ｃａｒｅｌｌｉ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｄｉｂｅｒｔ
＆Ｌ．Ａ．Ｃｈｅｄｉｄ （１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３３，３１２〜１
４］を誘導しないという所説に至っている。同様に、特
にＭＤＰおよびＧＭＤＰを含むリゾチーム消化の細胞壁
ライセートは抗体数の顕著な増加を生じないことが見い
出された［Ｌ．Ａ．Ｃｈｅｄｉｄ，＆ Ｆ．Ｍ．Ａｕｄ
ｉｂｅｒｔ，米国特許第４，０９４，９７１号］。
【０００７】ステアロイルＭＤＰのアジュバント作用の
研究は、ステアロイルＭＤＰが抗体産生を著しく刺激し
ないが動物を感作するので２か月後にブースターを注射
した場合、フロイントアジュベントにより産生される約
０．３の抗体応答が観察されることを見い出した。水中
の未誘導化ＭＤＰは用いられなかった。［Ｐ．Ｓｈａｒ
ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０７，１０７〜１６，Ａｌ
ａｎ Ｌｉｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］。ＭＤＰはさ
らに高い用量（例えば５００μｇ／マウス）で免疫サプ
レッサーとして作用すると報告されている［Ｃ．Ｌｅｃ
ｌｅｒｃ，Ｄ．Ｊｕｙ，Ｅ．Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ＆
Ｌ．Ｃｈｅｄｉｄ （１９７９）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４５，１９９〜２０６］。
研究は、ステアロイルＭＤＰが抗体産生を著しく刺激し
ないが動物を感作するので２か月後にブースターを注射
した場合、フロイントアジュベントにより産生される約
０．３の抗体応答が観察されることを見い出した。水中
の未誘導化ＭＤＰは用いられなかった。［Ｐ．Ｓｈａｒ
ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０７，１０７〜１６，Ａｌ
ａｎ Ｌｉｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］。ＭＤＰはさ
らに高い用量（例えば５００μｇ／マウス）で免疫サプ
レッサーとして作用すると報告されている［Ｃ．Ｌｅｃ
ｌｅｒｃ，Ｄ．Ｊｕｙ，Ｅ．Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ＆
Ｌ．Ｃｈｅｄｉｄ （１９７９）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４５，１９９〜２０６］。
【０００８】油性乳剤キャリアー中のＭＤＰのトレオニ
ン類似体から成るアジュバント剤はフロイントアジュバ
ント剤よりもより生体適合性があると仮定されていると
記載されている［Ａ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ ＆ Ｎ．
Ｅ．Ｂｙａｒｓ（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９５，１
５７〜６８；Ａ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ ＆ Ｎ．Ｅ．Ｂ
ｙａｒｓ（１９８８）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ， ４０１〜９， Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］。しかし抗体応答は、フロイント
アジュバントを用いる場合より著しく低い［Ｊ．Ｓ．Ｋ
ｅｎｎｅｙ，Ｂ．Ｗ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ｐ．Ｍａｓａ
ｄａ＆ Ａ．Ｃ． Ａｌｌｉｓｏｎ （１９８９） Ｊ
ｏｕｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ １２１，１５７〜６６］。β−ヒト絨毛性
性腺刺激ホルモンに対する抗体のレベルを増大するため
に親油性のＭＤＰ類似体の使用が研究されている。局所
的な強い傷害が報告された。ピーナツ油乳剤とともに、
１羽のウサギに付き２５０μｇの用量において、水中の
抗原だけで得られたものよりも抗体収量は２．５〜７倍
高かった。未修飾のＭＤＰは効果が弱かった。フロイン
トアジュベントとの比較はなされなかった。［Ｈ．Ａ．
Ｎａｓｈ，Ｃ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ ＆ Ｙ．Ｙ．Ｔｓｏｎ
ｇ，（１９８５） Ｊ．ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７，１５１〜６２］。
ン類似体から成るアジュバント剤はフロイントアジュバ
ント剤よりもより生体適合性があると仮定されていると
記載されている［Ａ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ ＆ Ｎ．
Ｅ．Ｂｙａｒｓ（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９５，１
５７〜６８；Ａ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ ＆ Ｎ．Ｅ．Ｂ
ｙａｒｓ（１９８８）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ， ４０１〜９， Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］。しかし抗体応答は、フロイント
アジュバントを用いる場合より著しく低い［Ｊ．Ｓ．Ｋ
ｅｎｎｅｙ，Ｂ．Ｗ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ｐ．Ｍａｓａ
ｄａ＆ Ａ．Ｃ． Ａｌｌｉｓｏｎ （１９８９） Ｊ
ｏｕｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ １２１，１５７〜６６］。β−ヒト絨毛性
性腺刺激ホルモンに対する抗体のレベルを増大するため
に親油性のＭＤＰ類似体の使用が研究されている。局所
的な強い傷害が報告された。ピーナツ油乳剤とともに、
１羽のウサギに付き２５０μｇの用量において、水中の
抗原だけで得られたものよりも抗体収量は２．５〜７倍
高かった。未修飾のＭＤＰは効果が弱かった。フロイン
トアジュベントとの比較はなされなかった。［Ｈ．Ａ．
Ｎａｓｈ，Ｃ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ ＆ Ｙ．Ｙ．Ｔｓｏｎ
ｇ，（１９８５） Ｊ．ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７，１５１〜６２］。
【０００９】アジュバントのペプチドが省略され、ポリ
オール阻止ポリマー（例えばＡ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ
＆ Ｎ．Ｅ．Ｂｙａｒｓにより初期に記載された）によ
り置換された研究において、抗体収量はフロイントアジ
ュバントで得られたものに匹敵する［Ｂ．Ｂｅｎｎｅ
ｔ，Ｉ．Ｊ．Ｃｈｅｃｋ，Ｍ．Ｒ．Ｏｌｓｅｎ ＆
Ｒ．Ｌ．Ｈｕｎｔｅｒ（１９９２） Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，
１５３，３１〜４０］。
オール阻止ポリマー（例えばＡ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ
＆ Ｎ．Ｅ．Ｂｙａｒｓにより初期に記載された）によ
り置換された研究において、抗体収量はフロイントアジ
ュバントで得られたものに匹敵する［Ｂ．Ｂｅｎｎｅ
ｔ，Ｉ．Ｊ．Ｃｈｅｃｋ，Ｍ．Ｒ．Ｏｌｓｅｎ ＆
Ｒ．Ｌ．Ｈｕｎｔｅｒ（１９９２） Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，
１５３，３１〜４０］。
【００１０】引用された研究の大部分は、比較的多量の
濃厚な油性乳剤からなり、フロイトの製法に用いられた
マイコバクテリウムの用量と等量のＭＤＰまたはその修
飾物を含むフロイント剤に関連したアジュベント剤の使
用に集中している。標準的フロイント製法のように、こ
れらの新規乳剤は、調製するのに依然として不便であ
り、より良好な効果があるようでもなく生体適合性も良
好でない。それらは、明らかにヒトに用いるために承認
されるよりよい機会もない。
濃厚な油性乳剤からなり、フロイトの製法に用いられた
マイコバクテリウムの用量と等量のＭＤＰまたはその修
飾物を含むフロイント剤に関連したアジュベント剤の使
用に集中している。標準的フロイント製法のように、こ
れらの新規乳剤は、調製するのに依然として不便であ
り、より良好な効果があるようでもなく生体適合性も良
好でない。それらは、明らかにヒトに用いるために承認
されるよりよい機会もない。
【００１１】本発明に関係するアジュバント研究の他の
態様は、添加物、例えば微量金属および、ある種の親油
性物質により果たされる免疫刺激の役割である。
態様は、添加物、例えば微量金属および、ある種の親油
性物質により果たされる免疫刺激の役割である。
【００１２】私は、引用された研究および他の多くの研
究に通常用いられたＭＤＰおよびＧＭＤＰの用量は最適
に使用するには驚くほど高いということを以前示した。
改善された刺激は１００倍低い用量で起こることが示さ
れた。さらに、このような低い用量では油性乳剤は必要
でなく単純な水溶液が同じようにまたは良好に作用する
ことを発見した（Ｎ．Ｇｒｕｂｈｏｆｅｒ ドイツ特許
第４，２３１，６７５号；米国出願第０８／１３０，６
４５号）。
究に通常用いられたＭＤＰおよびＧＭＤＰの用量は最適
に使用するには驚くほど高いということを以前示した。
改善された刺激は１００倍低い用量で起こることが示さ
れた。さらに、このような低い用量では油性乳剤は必要
でなく単純な水溶液が同じようにまたは良好に作用する
ことを発見した（Ｎ．Ｇｒｕｂｈｏｆｅｒ ドイツ特許
第４，２３１，６７５号；米国出願第０８／１３０，６
４５号）。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＭＤＰおよび
／またはＧＭＤＰおよび他の成分を含む新規のアジュバ
ント剤に関する。本発明のアジュバント剤は免疫刺激物
としての糖ペプチドの安全性、便利性、効果を著しく強
化するものである。即ち、糖ペプチド、免疫刺激性脂
質、および二価の生物学的微量金属のアミノ酸複合体の
混合物から成る本発明のアジュバント剤と抗原とを組み
合わせた水溶液を動物に注射することにより、その動物
の免疫応答を増大させることができる。
／またはＧＭＤＰおよび他の成分を含む新規のアジュバ
ント剤に関する。本発明のアジュバント剤は免疫刺激物
としての糖ペプチドの安全性、便利性、効果を著しく強
化するものである。即ち、糖ペプチド、免疫刺激性脂
質、および二価の生物学的微量金属のアミノ酸複合体の
混合物から成る本発明のアジュバント剤と抗原とを組み
合わせた水溶液を動物に注射することにより、その動物
の免疫応答を増大させることができる。
【００１４】本発明の一態様は、繰り返し注射によるブ
ースターを行うことなしに高い抗体力価を敏速に得る成
分の相乗作用である。この態様は、例えばヒトやペット
の免疫処置のように単一の注射が最も望ましい場合に適
用できることを示す。本発明の他の態様は、本発明が獣
医学、医療として承認を促進することである。なぜな
ら、本発明は低い用量で用いられる非常に低い経口性毒
性、非経口性毒性を有する免疫刺激剤から成る新規の油
を含まないアジュバント剤であり、本成分の臨床的、工
業的安全性データが既に十分に確立されている。
ースターを行うことなしに高い抗体力価を敏速に得る成
分の相乗作用である。この態様は、例えばヒトやペット
の免疫処置のように単一の注射が最も望ましい場合に適
用できることを示す。本発明の他の態様は、本発明が獣
医学、医療として承認を促進することである。なぜな
ら、本発明は低い用量で用いられる非常に低い経口性毒
性、非経口性毒性を有する免疫刺激剤から成る新規の油
を含まないアジュバント剤であり、本成分の臨床的、工
業的安全性データが既に十分に確立されている。
【００１５】
【実施例】本発明は、抗原としてウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を用いてマウスおよびウサギに主に行った免
疫化実験に基づいており、また本発明は本当の相乗作用
は単なる付加作用でなく効力を増強する筈であるという
考え方で２または３種のアジュバント化合物の相乗作用
という概念を中心にしている。生体適合性を調べ、より
効果的な免疫化業務を確立するために確認試験を他の種
および他の抗原で行った。
（ＢＳＡ）を用いてマウスおよびウサギに主に行った免
疫化実験に基づいており、また本発明は本当の相乗作用
は単なる付加作用でなく効力を増強する筈であるという
考え方で２または３種のアジュバント化合物の相乗作用
という概念を中心にしている。生体適合性を調べ、より
効果的な免疫化業務を確立するために確認試験を他の種
および他の抗原で行った。
【００１６】相乗剤の研究指針は、ＧＭＤＰがほんの８
時間後には完全に代謝され、生物から急速に消失するこ
とが見い出されたという事実から与えられた。この短い
寿命は種々の因子、例えばインターロイキンやマクロフ
ァージ刺激ポリペプチドの放出を起こすには十分であ
る。従ってＧＭＤＰは真の免疫活性調節因子として作用
する。
時間後には完全に代謝され、生物から急速に消失するこ
とが見い出されたという事実から与えられた。この短い
寿命は種々の因子、例えばインターロイキンやマクロフ
ァージ刺激ポリペプチドの放出を起こすには十分であ
る。従ってＧＭＤＰは真の免疫活性調節因子として作用
する。
【００１７】疑いもなく、酵素はこの全ての過程におい
て決定的な役割を果たさなければならない。従って、補
酵素として機能し得る免疫刺激性物質さらに、免疫反応
を増強することですでに知られている物質に注目は集ま
った。実験に用いられたウサギの品種は単一のアジュバ
ントとしての糖ペプチドにたいしては非常に微弱に反応
する特徴があった。抗体収量の増加に対して良好な生体
耐性を犠牲にしないために、糖ペプチドそのものと同様
に耐えられる相乗剤だけが考慮された。
て決定的な役割を果たさなければならない。従って、補
酵素として機能し得る免疫刺激性物質さらに、免疫反応
を増強することですでに知られている物質に注目は集ま
った。実験に用いられたウサギの品種は単一のアジュバ
ントとしての糖ペプチドにたいしては非常に微弱に反応
する特徴があった。抗体収量の増加に対して良好な生体
耐性を犠牲にしないために、糖ペプチドそのものと同様
に耐えられる相乗剤だけが考慮された。
【００１８】微量元素、銅、マンガン、亜鉛、コバルト
およびセレンをこの研究に組み入れた。最も顕著なアジ
ュベント作用が亜鉛に見い出だされ、弱い作用が銅と亜
セレン酸塩に見い出された。マンガンとコバルトは微弱
な作用を有した。
およびセレンをこの研究に組み入れた。最も顕著なアジ
ュベント作用が亜鉛に見い出だされ、弱い作用が銅と亜
セレン酸塩に見い出された。マンガンとコバルトは微弱
な作用を有した。
【００１９】ビタミンのうち、トコフェロールは免疫刺
激性を有することで知られている。しかしながら、水溶
性誘導体のみが試験された。なぜなら、それは油性乳剤
を避ける目的のためであったトコフェリルホスフェート
ならびにトコフェリルヘミスクシネートは、イソプレノ
シン、イソシン、ジメチルアミノプロパノールおよびＰ
−アミノ安息香酸の混合物が示したように限定的な作用
を示した。いくつかの界面活性剤は活性のあるアジュバ
ンドであることが知られている。本研究では、デキスト
ランおよびデキストラン硫酸のように、サポニン、第四
級アミンおよびコラミドプロピルジメチルアンモニオプ
ロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）のような両性イオン化
合物を考慮した。有望な物質の中には、調査された１０
０以上の窒素塩基中に最も免疫原性なものとしてＤ．Ｇ
ａｌｌ（１９６６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１，６６
９〜８６により見い出された第四級アミン、ジメチルジ
オクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）があった。Ｄ
ＤＡはＪ．Ｐ．Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｇａｌｌ ＆
Ｐ．Ｍ．Ｂｒａｃｋｅｎ，（１９７３）ＴｈｅＬａｎ
ｃｅｔ １９７３，２１５〜１９においてヒトへの適用
を見い出した。水酸化アルミニウムのように水中のＤＤ
Ａは、タンパク質に対してコロイド状のポリカチオン吸
着物を形成し、この穏やかさに似ているが、中等度に効
果的なアジュバントであり、強い脂質性を有するので従
ってフロイント油性乳剤にも似ている。明らかにＤＤＡ
は注射部位からレセプター細胞への抗原のキャリアーと
して働く。
激性を有することで知られている。しかしながら、水溶
性誘導体のみが試験された。なぜなら、それは油性乳剤
を避ける目的のためであったトコフェリルホスフェート
ならびにトコフェリルヘミスクシネートは、イソプレノ
シン、イソシン、ジメチルアミノプロパノールおよびＰ
−アミノ安息香酸の混合物が示したように限定的な作用
を示した。いくつかの界面活性剤は活性のあるアジュバ
ンドであることが知られている。本研究では、デキスト
ランおよびデキストラン硫酸のように、サポニン、第四
級アミンおよびコラミドプロピルジメチルアンモニオプ
ロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）のような両性イオン化
合物を考慮した。有望な物質の中には、調査された１０
０以上の窒素塩基中に最も免疫原性なものとしてＤ．Ｇ
ａｌｌ（１９６６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１，６６
９〜８６により見い出された第四級アミン、ジメチルジ
オクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）があった。Ｄ
ＤＡはＪ．Ｐ．Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｇａｌｌ ＆
Ｐ．Ｍ．Ｂｒａｃｋｅｎ，（１９７３）ＴｈｅＬａｎ
ｃｅｔ １９７３，２１５〜１９においてヒトへの適用
を見い出した。水酸化アルミニウムのように水中のＤＤ
Ａは、タンパク質に対してコロイド状のポリカチオン吸
着物を形成し、この穏やかさに似ているが、中等度に効
果的なアジュバントであり、強い脂質性を有するので従
ってフロイント油性乳剤にも似ている。明らかにＤＤＡ
は注射部位からレセプター細胞への抗原のキャリアーと
して働く。
【００２０】本発明の最も重要な結果および実際の核心
は、糖ペプチドとジメチルジオクタデシル臭化アンモニ
ウムおよびＬ−プロリンとの複合体の形での亜鉛との組
み合わせが、各個々の成分の単なる付加作用およびフロ
イントアジュバントをはるかに越える抗体力価を起こす
ことができるということの発見である。アジュバントを
添加した抗原注射を頻繁に繰り返すことにより、良好な
生体適合性と本発明による方法において必要とされる低
用量により技術が可能となり、急速に、しかも達成し得
ないと考えられていた高い抗体力価に達することができ
た。
は、糖ペプチドとジメチルジオクタデシル臭化アンモニ
ウムおよびＬ−プロリンとの複合体の形での亜鉛との組
み合わせが、各個々の成分の単なる付加作用およびフロ
イントアジュバントをはるかに越える抗体力価を起こす
ことができるということの発見である。アジュバントを
添加した抗原注射を頻繁に繰り返すことにより、良好な
生体適合性と本発明による方法において必要とされる低
用量により技術が可能となり、急速に、しかも達成し得
ないと考えられていた高い抗体力価に達することができ
た。
【００２１】本発明により得られる進展を図１に示す。
【００２２】１羽のウサギへの注射に対してＧＭＤＰ１
０μｇ、ＤＤＡ２０μｇ、１．４ｍｇのＬ−プロリンで
の複合体としてのＺｎ１００μｇの組み合わせが（試験
番号１５）、多くのウサギ実験において今までのところ
最適であった。ＧＭＤＰについて特許請求を行った（ド
イツ特許第４ ２３１ ６７５号、米国出願第０８／１
５３，４０６号）ウサギ１羽に付き最適用量ＧＭＤＰ１
０μｇは相乗剤の補充状態に関係なく確認されている。
しかしながら、大用量のＤＤＡがＢＳＡよりも抗原の場
合および大きな種の場合に必要であることが示されてい
る。
０μｇ、ＤＤＡ２０μｇ、１．４ｍｇのＬ−プロリンで
の複合体としてのＺｎ１００μｇの組み合わせが（試験
番号１５）、多くのウサギ実験において今までのところ
最適であった。ＧＭＤＰについて特許請求を行った（ド
イツ特許第４ ２３１ ６７５号、米国出願第０８／１
５３，４０６号）ウサギ１羽に付き最適用量ＧＭＤＰ１
０μｇは相乗剤の補充状態に関係なく確認されている。
しかしながら、大用量のＤＤＡがＢＳＡよりも抗原の場
合および大きな種の場合に必要であることが示されてい
る。
【００２３】Ｚｎ−Ｌ−プロリン複合体を選択した。そ
れは単なる塩に比べてＺｎ−アミノ酸複合体の低い毒性
のため、また新規の複合体（明らかに８モルのプロリン
に対し１原子の亜鉛、しかしＺｎＰｒｏ2 は過剰なプロ
リン中に可溶化し得る）のプロリン含有量が高いので、
水に実質的に溶解しないＤＤＡのためにこの複合体が優
れた分散作用を提供するため、さらにエタノール中での
可溶性のためであった。
れは単なる塩に比べてＺｎ−アミノ酸複合体の低い毒性
のため、また新規の複合体（明らかに８モルのプロリン
に対し１原子の亜鉛、しかしＺｎＰｒｏ2 は過剰なプロ
リン中に可溶化し得る）のプロリン含有量が高いので、
水に実質的に溶解しないＤＤＡのためにこの複合体が優
れた分散作用を提供するため、さらにエタノール中での
可溶性のためであった。
【００２４】他の多くの免疫刺激剤の組み合わせも調査
したが、成功しなかった。しかし正しい比率で糖ペプチ
ドや特許請求をしたような相乗物との組織を組み合わせ
ることにより入手可能となる可能性はほとんど無限であ
る。本発明は、相乗的アジュバントの組み合わせの進展
にドアを開くものである。
したが、成功しなかった。しかし正しい比率で糖ペプチ
ドや特許請求をしたような相乗物との組織を組み合わせ
ることにより入手可能となる可能性はほとんど無限であ
る。本発明は、相乗的アジュバントの組み合わせの進展
にドアを開くものである。
【００２５】［実施例１］ウサギを用いた長期の試験に
おいて、免疫刺激剤の影響下における抗ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）力価の時間的進展変化の結果を研究し、
結果の一部を表１に示す。
おいて、免疫刺激剤の影響下における抗ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）力価の時間的進展変化の結果を研究し、
結果の一部を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】実験：下記のものは、種々の免疫刺激物を
用いて抗体力価の時間的進展変化の結果を測定するため
の実験条件である。
用いて抗体力価の時間的進展変化の結果を測定するため
の実験条件である。
【００２８】動物：ウサギはラトビアン・アカデミー・
オブ・サイエンス・ウイルニアス（Ｌａｔｖｉａｎ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗｉｌｎｉｕ
ｓ）免疫学研究所で同系交配したｂ＋Ｋａｐ．１実験に
４動物を用いている。
オブ・サイエンス・ウイルニアス（Ｌａｔｖｉａｎ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗｉｌｎｉｕ
ｓ）免疫学研究所で同系交配したｂ＋Ｋａｐ．１実験に
４動物を用いている。
【００２９】抗原：１注射につきウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）１００ｍｇ。アジュバント添加抗原溶液：注
射される溶液は、抗原溶液１ｍｌをＧＭＤＰ１００μｇ
と、比例した相乗剤を含む乾燥アジュバントを入れたバ
イアルに注入し、抗原溶液中の固形物を分散して調製さ
れる。得られる液体は微細に分散したＤＤＡにより濁っ
ている。
（ＢＳＡ）１００ｍｇ。アジュバント添加抗原溶液：注
射される溶液は、抗原溶液１ｍｌをＧＭＤＰ１００μｇ
と、比例した相乗剤を含む乾燥アジュバントを入れたバ
イアルに注入し、抗原溶液中の固形物を分散して調製さ
れる。得られる液体は微細に分散したＤＤＡにより濁っ
ている。
【００３０】注射：抗原とアジュバントの溶液１００μ
ｌをウサギの後ろ腿の外側の単一部位に皮下経路で注射
する。
ｌをウサギの後ろ腿の外側の単一部位に皮下経路で注射
する。
【００３１】血清の収集：ヘパリン添加した血漿を耳静
脈出血により収集した。 抗体の測定：抗ＢＳＡ−ＩｇＧ力価を、ＢＳＡに対する
抗体のマイクロプレート・サンドイッチＥＬＩＳＡアッ
セイ（酵素免疫測定法）を用いて測定した。９６ウエル
の平底マイクロタイター・プレートを、４℃で一晩給湿
装置内でＢＳＡコーティング試薬１００μｌ（４μｇ／
ｍｌ）を用いてコートした。次に、プレートをリン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ−ゼラチンブロッ
キング溶液２００μｌを用いて３７℃で１時間ブロッキ
ングし、続いてＰＢＳで３回洗浄した。血清の希釈液１
／１０〜１／１００，０００を、１００μｌ分量にて洗
浄したプレートに加え、３７℃で２時間インキュベート
した。プレートを３回洗浄し、ペロキシダーゼ結合ウサ
ギ抗ＩｇＧ１００μｌを加え、室温で２時間インキュベ
ートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、１ウエルに付き
着色剤〔０．００９％の過酸化水素水を含むシトレート
緩衝液（ｐＨ５）中に０．４ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレ
ンジアミン〕１００μｌを加え、室温で１５分間インキ
ュベートした。２．５Ｍリン酸反応停止液１００μｌを
加え、マイクロプレート・リーダーを用いて４５０ｎｍ
で吸光度を読んだ。プレート・リーダー機械に存在する
回帰曲線を用いて直線範囲内での未処理吸光度データか
ら力価を計算した。０．７５の色を示す血清の逆数希釈
を“力価”と定義した。
脈出血により収集した。 抗体の測定：抗ＢＳＡ−ＩｇＧ力価を、ＢＳＡに対する
抗体のマイクロプレート・サンドイッチＥＬＩＳＡアッ
セイ（酵素免疫測定法）を用いて測定した。９６ウエル
の平底マイクロタイター・プレートを、４℃で一晩給湿
装置内でＢＳＡコーティング試薬１００μｌ（４μｇ／
ｍｌ）を用いてコートした。次に、プレートをリン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ−ゼラチンブロッ
キング溶液２００μｌを用いて３７℃で１時間ブロッキ
ングし、続いてＰＢＳで３回洗浄した。血清の希釈液１
／１０〜１／１００，０００を、１００μｌ分量にて洗
浄したプレートに加え、３７℃で２時間インキュベート
した。プレートを３回洗浄し、ペロキシダーゼ結合ウサ
ギ抗ＩｇＧ１００μｌを加え、室温で２時間インキュベ
ートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、１ウエルに付き
着色剤〔０．００９％の過酸化水素水を含むシトレート
緩衝液（ｐＨ５）中に０．４ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレ
ンジアミン〕１００μｌを加え、室温で１５分間インキ
ュベートした。２．５Ｍリン酸反応停止液１００μｌを
加え、マイクロプレート・リーダーを用いて４５０ｎｍ
で吸光度を読んだ。プレート・リーダー機械に存在する
回帰曲線を用いて直線範囲内での未処理吸光度データか
ら力価を計算した。０．７５の色を示す血清の逆数希釈
を“力価”と定義した。
【００３２】［実施例２］最も効率的な免疫化業務を見
い出す努力の一部として、ＧＭＤＰと相乗剤の一般的ア
ジュバンド作用を確認するために、抗原としてＢＳＡ，
ＤＮＰ−ＢＳＡおよびヒトラムダＬ鎖（ＨＩＬＣ）を用
い、試験動物としてウサギ、マウス、ニワトリに数多く
の免疫処理を行った。新規アジュバントの良好な生物耐
性のためにさらに頻繁なアジュバント添加の抗原注射が
可能となり、複数回のブースターから成るさらに効率的
な免疫化業務をここに適用し、著しく高い抗体収量を得
た。
い出す努力の一部として、ＧＭＤＰと相乗剤の一般的ア
ジュバンド作用を確認するために、抗原としてＢＳＡ，
ＤＮＰ−ＢＳＡおよびヒトラムダＬ鎖（ＨＩＬＣ）を用
い、試験動物としてウサギ、マウス、ニワトリに数多く
の免疫処理を行った。新規アジュバントの良好な生物耐
性のためにさらに頻繁なアジュバント添加の抗原注射が
可能となり、複数回のブースターから成るさらに効率的
な免疫化業務をここに適用し、著しく高い抗体収量を得
た。
【００３３】
【表２】
【００３４】相対的力価は下記の実験条件下で同じ動物
を用いてアジュバントで得られた力価をフロイントでの
抗体力価で割った力価である。
を用いてアジュバントで得られた力価をフロイントでの
抗体力価で割った力価である。
【００３５】実験； ウサギ：３羽の群。ＢＳＡ１００μｇ，ＤＮＰ−ＢＳＡ
５０μｇ，ＨＩＬＣ２０μｇ。アジュバント剤：ＧＭＤ
Ｐ１０μｇ，ＤＤＡ２０μｇ，Ｚｎ１００μｇ。免疫化
／ブースター：０，７，１４，２１日。２８日目に採
血。
５０μｇ，ＨＩＬＣ２０μｇ。アジュバント剤：ＧＭＤ
Ｐ１０μｇ，ＤＤＡ２０μｇ，Ｚｎ１００μｇ。免疫化
／ブースター：０，７，１４，２１日。２８日目に採
血。
【００３６】ニワトリ：５羽の群。ＢＳＡ５０μｇ，Ｄ
ＮＰ−ＢＳＡ２０μｇ，ＨＩＬＣ１０μｇ。アジュバン
ト剤：ＧＭＤＰ５μｇ，ＤＤＡ１０μｇ，Ｚｎ５０μ
ｇ。免疫化／ブースター：０日、２１日。２６日、３０
日の卵を貯める。重要な皮下経路はｉ／ｍ経路よりもず
っと上方である。ＥＬＩＳＡ試験のために卵の卵黄に含
まれるＩｇＹをＪ．Ｗａｌｉｍａｎｎ，Ｃ．Ｓｔａａｋ
＆ Ｅ．Ｌｕｇｅ（１９９０）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．
Ｂ３７，３１７〜２０の方法により濃縮した。
ＮＰ−ＢＳＡ２０μｇ，ＨＩＬＣ１０μｇ。アジュバン
ト剤：ＧＭＤＰ５μｇ，ＤＤＡ１０μｇ，Ｚｎ５０μ
ｇ。免疫化／ブースター：０日、２１日。２６日、３０
日の卵を貯める。重要な皮下経路はｉ／ｍ経路よりもず
っと上方である。ＥＬＩＳＡ試験のために卵の卵黄に含
まれるＩｇＹをＪ．Ｗａｌｉｍａｎｎ，Ｃ．Ｓｔａａｋ
＆ Ｅ．Ｌｕｇｅ（１９９０）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．
Ｂ３７，３１７〜２０の方法により濃縮した。
【００３７】マウス：５匹の群。ＢＳＡ２０μｇ，ＤＮ
Ｐ−ＢＳＡ１０μｇ，ＨＩＬＣ１０μｇ，アジュバンド
剤：ＧＭＤＰ１μｇ，ＤＤＡ４μｇ，Ｚｎ１０μｇ。免
疫化／ブースター：０日、１４日。２８日目に採血。血
液を尾の静脈出血により収集した。血液収集前にメトフ
ェン（ｍｅｔｏｆａｎｅ）を用いて動物を麻酔した。
Ｐ−ＢＳＡ１０μｇ，ＨＩＬＣ１０μｇ，アジュバンド
剤：ＧＭＤＰ１μｇ，ＤＤＡ４μｇ，Ｚｎ１０μｇ。免
疫化／ブースター：０日、１４日。２８日目に採血。血
液を尾の静脈出血により収集した。血液収集前にメトフ
ェン（ｍｅｔｏｆａｎｅ）を用いて動物を麻酔した。
【００３８】ＥＬＩＳＡ試験を実施例１中に記載したよ
うに行った。表２に示した結果より、本発明のアジュバ
ント剤の著しい効果が特定の１動物や１抗原に限定され
ないことが明らかに示された。さらに別のこの事実の示
すものは、本発明のアジュバント剤の個々の成分が非常
に多くの種々の抗原、動物および実験条件において同様
に低いレベルで免疫刺激剤として機能することが観察さ
れている。
うに行った。表２に示した結果より、本発明のアジュバ
ント剤の著しい効果が特定の１動物や１抗原に限定され
ないことが明らかに示された。さらに別のこの事実の示
すものは、本発明のアジュバント剤の個々の成分が非常
に多くの種々の抗原、動物および実験条件において同様
に低いレベルで免疫刺激剤として機能することが観察さ
れている。
【００３９】［実施例３］ Ｚｎ−Ｌ−プロリン原液：ＺｎＯ ＤＡＢおよびＬ−プ
ロリンＤＡＢ（モル比１：９，例えばＺｎＯ８．２８ｇ
＋Ｌ−プロリン１０５．７２ｇ）を６５％エタノール８
５０ｍｌに分散し、煮沸するまで加熱した。数分後、澄
んだ溶液が得られる。冷却した後、それを１リットル容
量のフラスコに移し、６５％エタノールを印した部分ま
で入れる。溶液を紙で濾過し密閉して貯蔵する。このＺ
ｎ−プロリン原液は１．５ｍｌに付きＺｎ１０ｍｇ，Ｌ
−プロリン１６１ｍｇを含む。
ロリンＤＡＢ（モル比１：９，例えばＺｎＯ８．２８ｇ
＋Ｌ−プロリン１０５．７２ｇ）を６５％エタノール８
５０ｍｌに分散し、煮沸するまで加熱した。数分後、澄
んだ溶液が得られる。冷却した後、それを１リットル容
量のフラスコに移し、６５％エタノールを印した部分ま
で入れる。溶液を紙で濾過し密閉して貯蔵する。このＺ
ｎ−プロリン原液は１．５ｍｌに付きＺｎ１０ｍｇ，Ｌ
−プロリン１６１ｍｇを含む。
【００４０】［実施例４］ Ｚｎ−Ｌ−プロリン複合体：前記Ｚｎ−Ｌ−プロリン原
液５ｍｌをイソプロパノールで希釈し＋４℃まで冷却す
る。一晩に大きな結晶が形成し、これを収集し、イソプ
ロパノールで洗浄し、６５％エタノール−イソプロパノ
ールで再結晶させ、乾燥させる。物質は明らかにＺｎ−
Ｌ−プロリン塩であり［Ｃｏｔｔｏｎ，Ｆ．Ａ．＆ Ｈ
ａｎｓｏｎ，Ｈ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｃｓ ２８，８３〜６］、実測値：％Ｃ４２．２
３，Ｈ５．７６、Ｎ９．４０、Ｚｎ（ＺｎＯ残基とし
て）２３．９０。ＺｎＰｒｏ2 の計測値：Ｃ10Ｈ16Ｎ7
Ｏ2Ｚｎ ％Ｃ４５．９４，Ｈ６．１７，Ｎ１０．７
１，Ｚｎ２４．９４。過剰なＬ−プロリンは、明らかに
エタノール中の物質を可溶化する役割を果たす。
液５ｍｌをイソプロパノールで希釈し＋４℃まで冷却す
る。一晩に大きな結晶が形成し、これを収集し、イソプ
ロパノールで洗浄し、６５％エタノール−イソプロパノ
ールで再結晶させ、乾燥させる。物質は明らかにＺｎ−
Ｌ−プロリン塩であり［Ｃｏｔｔｏｎ，Ｆ．Ａ．＆ Ｈ
ａｎｓｏｎ，Ｈ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｃｓ ２８，８３〜６］、実測値：％Ｃ４２．２
３，Ｈ５．７６、Ｎ９．４０、Ｚｎ（ＺｎＯ残基とし
て）２３．９０。ＺｎＰｒｏ2 の計測値：Ｃ10Ｈ16Ｎ7
Ｏ2Ｚｎ ％Ｃ４５．９４，Ｈ６．１７，Ｎ１０．７
１，Ｚｎ２４．９４。過剰なＬ−プロリンは、明らかに
エタノール中の物質を可溶化する役割を果たす。
【００４１】［実施例５］ アジュバント剤；米国特許第４３９５，３９９号、ソビ
エト優先権１９７７年１１月２日の下で英国Ｃｉｒｅｎ
ｃｅｓｔｅｒ市Ｐｅｐｔｅｃｈ Ｌｔｄ．により製造さ
れたＧＭＤＰ１００ｍｇとドイツＲｉｅｄｅｌ ｄｅ
Ｈａｅｎ Ｓｅｅｌｔｚｅにより製造されたジメチルジ
オクタデシル塩化アンモニウム２００ｍｇをＬ−Ｚｎ−
Ｌ−プロリン原液（実施例３）１５０ｍｌに溶解し、
０．２２μｍの濾過膜で濾過する。アジュバント溶液は
１．５ｍｌに付きＧＭＤＰ１ｍｇ、ＤＤＡ２ｍｇ、Ｚｎ
１０ｍｇ、およびＬ−プロリン１６１ｍｇを含む。
エト優先権１９７７年１１月２日の下で英国Ｃｉｒｅｎ
ｃｅｓｔｅｒ市Ｐｅｐｔｅｃｈ Ｌｔｄ．により製造さ
れたＧＭＤＰ１００ｍｇとドイツＲｉｅｄｅｌ ｄｅ
Ｈａｅｎ Ｓｅｅｌｔｚｅにより製造されたジメチルジ
オクタデシル塩化アンモニウム２００ｍｇをＬ−Ｚｎ−
Ｌ−プロリン原液（実施例３）１５０ｍｌに溶解し、
０．２２μｍの濾過膜で濾過する。アジュバント溶液は
１．５ｍｌに付きＧＭＤＰ１ｍｇ、ＤＤＡ２ｍｇ、Ｚｎ
１０ｍｇ、およびＬ−プロリン１６１ｍｇを含む。
【００４２】この溶液を硫酸を用いて乾燥器内で同質の
結晶性で非吸湿性の固形物に乾燥し、その重量の１０倍
の水で容易に分散させ、ＧＭＤＰとＺｎ−Ｌ−プロリン
複合物を容易に溶解し、コロイド状のＤＤＡの濁った懸
濁液を得て、これを通常の濾過紙に通し、凍結、解凍を
繰り返した後、穏やかな浸透の後、その濁度を維持す
る。
結晶性で非吸湿性の固形物に乾燥し、その重量の１０倍
の水で容易に分散させ、ＧＭＤＰとＺｎ−Ｌ−プロリン
複合物を容易に溶解し、コロイド状のＤＤＡの濁った懸
濁液を得て、これを通常の濾過紙に通し、凍結、解凍を
繰り返した後、穏やかな浸透の後、その濁度を維持す
る。
【００４３】［実施例６］ アジュバンドの用量；免疫処置に実用的に用いるための
固体アジュバンドの便利な量は、１００μｇのＧＭＤＰ
または１０μｇのＧＭＤＰであり、ウサギまたはマウス
をそれぞれ１０回免疫処置するために適した血清バイア
ル中の対応する相乗剤は実施例６に従い調製された１５
０μｌまたは１５μｌのアジュバント溶液をピペットで
バイアルに移し、（実験上のロットは乾燥器で、製造用
ロットは特別に設計された乾燥室で）硫酸で乾燥される
ことにより得られる。
固体アジュバンドの便利な量は、１００μｇのＧＭＤＰ
または１０μｇのＧＭＤＰであり、ウサギまたはマウス
をそれぞれ１０回免疫処置するために適した血清バイア
ル中の対応する相乗剤は実施例６に従い調製された１５
０μｌまたは１５μｌのアジュバント溶液をピペットで
バイアルに移し、（実験上のロットは乾燥器で、製造用
ロットは特別に設計された乾燥室で）硫酸で乾燥される
ことにより得られる。
【００４４】［実施例７］ アジュベントを用いた免疫化実験；これら実験の目的は
複数回のブースターにより敏速に免疫化経路を確立し、
ウサギでのアジュバント（ＧＭＤＰ１０μｇ、ＤＤＡ２
０μｇ、亜鉛１００μｇ，Ｌ−プロリン１．４ｍｇ）の
生物耐性を確認することである。結果は表３に要約され
ている。数値データは実施例１に記載されたように逆数
希釈で表された抗体力価を示す。
複数回のブースターにより敏速に免疫化経路を確立し、
ウサギでのアジュバント（ＧＭＤＰ１０μｇ、ＤＤＡ２
０μｇ、亜鉛１００μｇ，Ｌ−プロリン１．４ｍｇ）の
生物耐性を確認することである。結果は表３に要約され
ている。数値データは実施例１に記載されたように逆数
希釈で表された抗体力価を示す。
【００４５】１日当りのアジュバントの用量が著しく高
い場合でも動物には損傷が観察されなかった（実験４７
を比較）。非常に微弱な抗原レベルでの抗体発現は抗原
とアジュバントを用いた毎日の免疫化により強化された
（実験４３、４４）。アジュバントまたはＧＭＤＰ単独
で抗原とは別に注射することは効果がない（実験４５〜
４９）。
い場合でも動物には損傷が観察されなかった（実験４７
を比較）。非常に微弱な抗原レベルでの抗体発現は抗原
とアジュバントを用いた毎日の免疫化により強化された
（実験４３、４４）。アジュバントまたはＧＭＤＰ単独
で抗原とは別に注射することは効果がない（実験４５〜
４９）。
【００４６】
【表３】
【図１】４２日後の相対的抗体力価を示すグラフであ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/39 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】 糖ペプチド、免疫刺激性脂質、および二
価の生物学的微量金属のアミノ酸複合体の混合物から成
るアジュバント剤。 - 【請求項２】 糖ペプチドがＮ−アセチルムラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）である請求
項１に記載のアジュバント剤。 - 【請求項３】 糖ペプチドがＮ−アセチルグルコサミニ
ル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ
ルタミン（ＧＭＤＰ）である請求項１に記載のアジュバ
ント剤。 - 【請求項４】 免疫刺激性脂質が第四級アンモニア基を
含む請求項１〜３に記載のアジュバント剤。 - 【請求項５】 免疫刺激性脂質が長鎖炭化水素残基を含
む請求項１〜４に記載のアジュバント剤。 - 【請求項６】 免疫刺激性脂質がジメチルジオクタデシ
ル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）である請求項１〜５に記
載のアジュバント剤。 - 【請求項７】 二価の生物学的微量金属との複合体がＬ
−プロリン複合体である請求項１〜６に記載のアジュバ
ント剤。 - 【請求項８】 二価の生物学的微量金属との複合体が銅
を含むＬ−プロリン複合体である請求項１〜７に記載の
アジュバント剤。 - 【請求項９】 二価の生物学的微量金属との複合体が亜
鉛を含むＬ−プロリン複合体である請求項１〜８に記載
のアジュバント剤。 - 【請求項１０】 １重量のＮ−アセチルグルコサミニル
−Ｎ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
タミン（ＧＭＤＰ）、２重量部のジメチルジオクタデシ
ル臭化アンモニウム塩（ＤＤＡ）、１０重量部の亜鉛を
含む１４０重量部のＬ−プロリン複合体から成るアジュ
バント剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4333376.1 | 1993-09-30 | ||
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