JP2875739B2 - ＮＦκＢ活性阻害剤 - Google Patents
ＮＦκＢ活性阻害剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、NFκBの活性阻害剤又
はNFκB活性阻害作用に基づく、抗炎症，抗自己免疫疾
患及び抗ウイルス剤等に関する。
はNFκB活性阻害作用に基づく、抗炎症，抗自己免疫疾
患及び抗ウイルス剤等に関する。
【０００２】
〈発明の背景〉遺伝子の本体であるDNAは、様々な因子
により調節を受けており、遺伝情報の発現が制御されて
いる。例えばDNAからmRNAへの転写は、その遺伝子上の
数個から数十個の塩基配列を認識し結合する複数個のDN
A結合タンパク質により制御を受けている。このようなD
NA結合タンパク質の一つとして知られるNFκBは、抗体
産生細胞であるB細胞の核抽出液中に存在し、免疫グロ
ブリンκ軽鎖(Igκ)遺伝子のエンハンサーに結合する因
子として同定された。その後研究が進むと、刺激誘導さ
れる多くの遺伝子の発現誘導などに関与する転写因子で
あり、広く生命現象の制御に関わることが明らかになっ
てきた。
により調節を受けており、遺伝情報の発現が制御されて
いる。例えばDNAからmRNAへの転写は、その遺伝子上の
数個から数十個の塩基配列を認識し結合する複数個のDN
A結合タンパク質により制御を受けている。このようなD
NA結合タンパク質の一つとして知られるNFκBは、抗体
産生細胞であるB細胞の核抽出液中に存在し、免疫グロ
ブリンκ軽鎖(Igκ)遺伝子のエンハンサーに結合する因
子として同定された。その後研究が進むと、刺激誘導さ
れる多くの遺伝子の発現誘導などに関与する転写因子で
あり、広く生命現象の制御に関わることが明らかになっ
てきた。
【０００３】このNFκBは、通常細胞質内に分子量50kD
のタンパク質のホモダイマーまたは分子量50kDのタンパ
ク質と分子量65kDのタンパク質のヘテロダイマーが、I
κBという活性を抑制するタンパク質と結合して存在し
ている。そして細胞に一定の刺激が与えられるとIκBが
修飾を受けて複合体からはずれてNFκBが活性化され、
そのダイマーが核内へ移行することによりDNA結合活性
が検出されるようになる。この活性はセカンドメッセン
ジャーなど別の遺伝子の発現を介さない直接的な活性化
の結果生じることがわかっている。
のタンパク質のホモダイマーまたは分子量50kDのタンパ
ク質と分子量65kDのタンパク質のヘテロダイマーが、I
κBという活性を抑制するタンパク質と結合して存在し
ている。そして細胞に一定の刺激が与えられるとIκBが
修飾を受けて複合体からはずれてNFκBが活性化され、
そのダイマーが核内へ移行することによりDNA結合活性
が検出されるようになる。この活性はセカンドメッセン
ジャーなど別の遺伝子の発現を介さない直接的な活性化
の結果生じることがわかっている。
【０００４】また、DNA上のNFκB結合配列は様々な遺伝
子に見出されており、実際に遺伝子の機能発現に重要で
あることが示されている。その結合配列（κBモチー
フ）は、約10塩基より構成され、共通するのはG(ク゛アニン)
のクラスターで始まりC(シトシン)のクラスターで終ること
である。ところで、炎症タンパク質として知られている
インターロイキン-1(IL-1)や腫瘍壊死因子(TNF)の遺伝
子上にも多くのDNA結合タンパク質が結合する配列が存
在するが、その中にNFκBの結合配列も存在することが
わかっており(Clark,B.D.etal.,Nucl.Acids Res.,14,7
898,1984;Nedospasov,S.A.et al.,Cold Spring Harb. S
ymp. Quant. Biol.,51,611,1986)、実際にNFκBの結合
がmRNAへの転写を制御していることが報告されている(H
iscott,J.et al.,Mol. Cell. Biol.,13,6231,1993;Coll
art,M.A.et al.,Mol. Cell. Biol.,10,1498,1990)。
子に見出されており、実際に遺伝子の機能発現に重要で
あることが示されている。その結合配列（κBモチー
フ）は、約10塩基より構成され、共通するのはG(ク゛アニン)
のクラスターで始まりC(シトシン)のクラスターで終ること
である。ところで、炎症タンパク質として知られている
インターロイキン-1(IL-1)や腫瘍壊死因子(TNF)の遺伝
子上にも多くのDNA結合タンパク質が結合する配列が存
在するが、その中にNFκBの結合配列も存在することが
わかっており(Clark,B.D.etal.,Nucl.Acids Res.,14,7
898,1984;Nedospasov,S.A.et al.,Cold Spring Harb. S
ymp. Quant. Biol.,51,611,1986)、実際にNFκBの結合
がmRNAへの転写を制御していることが報告されている(H
iscott,J.et al.,Mol. Cell. Biol.,13,6231,1993;Coll
art,M.A.et al.,Mol. Cell. Biol.,10,1498,1990)。
【０００５】〈従来技術〉従来NFκBの転写活性を阻害
する物質としては、NFκB結合性タンパク質がヨーロッ
パ特許公開公報第５８４２３８号に開示されている。
する物質としては、NFκB結合性タンパク質がヨーロッ
パ特許公開公報第５８４２３８号に開示されている。
【０００６】また、以下の式で表される化合物（１），
（２）はIL-1とTNF産生をそれぞれのmRNAの産生レベル
で抑制することが報告されている(Goto,M.et al.,Agent
s Actions.,32,225,1991;Miyamoto,K.et al,Agents Act
ions.,37,297,1992)。
（２）はIL-1とTNF産生をそれぞれのmRNAの産生レベル
で抑制することが報告されている(Goto,M.et al.,Agent
s Actions.,32,225,1991;Miyamoto,K.et al,Agents Act
ions.,37,297,1992)。
【０００７】
【化５】
【０００８】
【化６】
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】生体膜を構成するリン
脂質は、種々の刺激により誘導されるホスホリパーゼに
よってアラキドン酸を遊離する。このアラキドン酸がリ
ポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼ等の酵素系で代
謝されることによりロイコトリエン，トロンボキサン，
プロスタグランジン等が産生される。これらの物質は複
雑な生理活性を示し、生体の維持・調節に重要な働きを
有している。例えば、ロイコトリエンB4は白血球の遊
走、リソゾーム酵素分泌や活性酸素産生などに関与する
一方、免疫系に対して促進的に作用し、インターロイキ
ン1，2の産生を促進したり、リンパ球の活性化を増強す
ることが知られている。トロンボキサンB2はトロンボキ
サンA2の安定代謝物で、トロンボキサンA2 は細動脈収
縮作用や血小板凝集作用により局所微小循環に関与す
る。またプロスタグランジンE2は血管拡張作用や血管透
過性抗進作用を有し、炎症作用に寄与する。また、免疫
系に対しては抑制的に作用しさらに、サイトプロテクシ
ョンにより細胞を種々の刺激から保護することも報告さ
れている。
脂質は、種々の刺激により誘導されるホスホリパーゼに
よってアラキドン酸を遊離する。このアラキドン酸がリ
ポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼ等の酵素系で代
謝されることによりロイコトリエン，トロンボキサン，
プロスタグランジン等が産生される。これらの物質は複
雑な生理活性を示し、生体の維持・調節に重要な働きを
有している。例えば、ロイコトリエンB4は白血球の遊
走、リソゾーム酵素分泌や活性酸素産生などに関与する
一方、免疫系に対して促進的に作用し、インターロイキ
ン1，2の産生を促進したり、リンパ球の活性化を増強す
ることが知られている。トロンボキサンB2はトロンボキ
サンA2の安定代謝物で、トロンボキサンA2 は細動脈収
縮作用や血小板凝集作用により局所微小循環に関与す
る。またプロスタグランジンE2は血管拡張作用や血管透
過性抗進作用を有し、炎症作用に寄与する。また、免疫
系に対しては抑制的に作用しさらに、サイトプロテクシ
ョンにより細胞を種々の刺激から保護することも報告さ
れている。
【００１０】生体は外からの様々な刺激を受けることに
より、種々のサイトカインが遊離され炎症反応を生じ
る。従来の薬物は、ヒスタミン等のメディエーターレセ
プターへの拮抗作用やいわゆるアラキドン酸カスケード
中のリポキシゲナーゼまたはサイクロオキシゲナーゼ等
の代謝酵素を阻害することによりヒスタミンやロイコト
リエンB4若しくはプロスタグランジンE2等の炎症タンパ
クの発現を抑制するものである。しかし、非ステロイド
系の薬物ではその効果は対症療法を期待するものであり
根本治療としては十分なものとはいえず、ステロイド系
の薬物は有効ではあるが副作用が強く、長期投与ができ
ないという問題があった。特に自己免疫疾患等の炎症性
の疾患は、慢性化することが多く、長期療養が必要とな
り副作用のある薬物の使用には向いていない。また、ヨ
ーロッパ特許公開公報第５８４２３８号に開示されてい
る物質は蛋白質であり、その安定性から薬物として投与
するときにさまざまな障害がある。本発明者等は、炎症
性疾患に対する原因療法を確立すべく、各種炎症性のサ
イトカインを根本的に抑制する方法や物質について永年
にわたり鋭意検討を重ね、転写因子NFκBの活性阻害作
用に基づき、各種サイトカイン等を遺伝子レベルで抑制
する化合物を見いだし本発明を完成した。
より、種々のサイトカインが遊離され炎症反応を生じ
る。従来の薬物は、ヒスタミン等のメディエーターレセ
プターへの拮抗作用やいわゆるアラキドン酸カスケード
中のリポキシゲナーゼまたはサイクロオキシゲナーゼ等
の代謝酵素を阻害することによりヒスタミンやロイコト
リエンB4若しくはプロスタグランジンE2等の炎症タンパ
クの発現を抑制するものである。しかし、非ステロイド
系の薬物ではその効果は対症療法を期待するものであり
根本治療としては十分なものとはいえず、ステロイド系
の薬物は有効ではあるが副作用が強く、長期投与ができ
ないという問題があった。特に自己免疫疾患等の炎症性
の疾患は、慢性化することが多く、長期療養が必要とな
り副作用のある薬物の使用には向いていない。また、ヨ
ーロッパ特許公開公報第５８４２３８号に開示されてい
る物質は蛋白質であり、その安定性から薬物として投与
するときにさまざまな障害がある。本発明者等は、炎症
性疾患に対する原因療法を確立すべく、各種炎症性のサ
イトカインを根本的に抑制する方法や物質について永年
にわたり鋭意検討を重ね、転写因子NFκBの活性阻害作
用に基づき、各種サイトカイン等を遺伝子レベルで抑制
する化合物を見いだし本発明を完成した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、式
【００１２】
【化７】
【００１３】または
【００１４】
【化８】
【００１５】で表される化合物又はその薬理学的に許容
できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害剤、及び、
式
できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害剤、及び、
式
【００１６】
【化９】
【００１７】または
【００１８】
【化１０】
【００１９】で表される化合物又はその薬理学的に許容
できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害作用が有効
な疾患の治療・予防剤、並びに、NFκB活性阻害作用に
基づく、抗炎症，抗自己免疫疾患及び抗ウイルス剤、及
び、炎症性疾患，自己免疫性疾患及びウイルス性疾患治
療予防剤である。
できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害作用が有効
な疾患の治療・予防剤、並びに、NFκB活性阻害作用に
基づく、抗炎症，抗自己免疫疾患及び抗ウイルス剤、及
び、炎症性疾患，自己免疫性疾患及びウイルス性疾患治
療予防剤である。
【００２０】前記式で表される化合物（３），（４）は
転写因子NFκBの活性を阻害することにより、NFκB認識
配列を有するDNAの転写を阻害する。従ってNFκB認識配
列を有する遺伝子であれば、その遺伝子に対応するタン
パク質の発現を有効に阻害することが可能である。従っ
てIL-1，TNFを始めインターロイキン-2(IL-2)，インタ
ーロイキン-6(IL-6)，インターロイキン-8(IL-８)，顆
粒球コロニー刺激因子（G-CSF)，インターフェロンβ(I
NF-β)等のサイトカインを始め、インターロイキン-1レ
セプターアンタゴニスト(IL-1RA)等の炎症性サイトカイ
ンのレセプターアンタゴニストおよび、その他の主要組
織適合抗原系(MHC)クラスI，MHCクラスII，β2マイクロ
グロブリン，免疫グロブリン軽鎖，血清アミロイドA，
アンジオテンシノーゲン，補体B，補体C4タンパクの遺
伝子や、オンコジーンの一つであるC-myc遺伝子、ヒュ
ーマンイミュノデフィシェンシィーウイルス(HIV)，シ
ミアンウイルス40(SV40)，サイトメガロウイルス(CM
V)，アデノウイルス等ウイルスの遺伝子等の発現を抑制
することにより、これらが関連する疾患を予防・治療す
ることができる。以下にその疾患を例示する。慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、ベ
ーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、活動
性慢性肝炎、糸球体腎炎などを初めとする各種自己免疫
疾患；変形性関節症、痛風、アテローム硬化症、乾癬、
アトピー性皮膚炎、肉芽腫を伴う肺疾患、各種脳炎など
炎症症状が病態の基本になっている難治性各種疾患、エ
ンドトキシンショック、敗血症、炎症性大腸炎、糖尿
病、急性骨髄芽球性白血病、肺炎、心臓移植、脳脊髄
炎、食欲不振、急性肝炎、慢性肝炎、薬物中毒性肝障
害、アルコール性肝炎、ウイルス肝炎、黄疸、肝硬変、
肝不全、心房粘液腫、キャッスルマン症候群、多発性骨
髄腫、レンネルトＴリンパ腫、メサンギウム増殖性腎
炎、腎細胞癌、サイトメガロウイルス性肺炎、サイトメ
ガロウイルス性網膜症、アデノウイルス性感冒、アデノ
ウイルス性プール熱、アデノウイルス性眼炎、エイズな
どの疾患の治療及び予防に効果を示す。
転写因子NFκBの活性を阻害することにより、NFκB認識
配列を有するDNAの転写を阻害する。従ってNFκB認識配
列を有する遺伝子であれば、その遺伝子に対応するタン
パク質の発現を有効に阻害することが可能である。従っ
てIL-1，TNFを始めインターロイキン-2(IL-2)，インタ
ーロイキン-6(IL-6)，インターロイキン-8(IL-８)，顆
粒球コロニー刺激因子（G-CSF)，インターフェロンβ(I
NF-β)等のサイトカインを始め、インターロイキン-1レ
セプターアンタゴニスト(IL-1RA)等の炎症性サイトカイ
ンのレセプターアンタゴニストおよび、その他の主要組
織適合抗原系(MHC)クラスI，MHCクラスII，β2マイクロ
グロブリン，免疫グロブリン軽鎖，血清アミロイドA，
アンジオテンシノーゲン，補体B，補体C4タンパクの遺
伝子や、オンコジーンの一つであるC-myc遺伝子、ヒュ
ーマンイミュノデフィシェンシィーウイルス(HIV)，シ
ミアンウイルス40(SV40)，サイトメガロウイルス(CM
V)，アデノウイルス等ウイルスの遺伝子等の発現を抑制
することにより、これらが関連する疾患を予防・治療す
ることができる。以下にその疾患を例示する。慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、ベ
ーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、活動
性慢性肝炎、糸球体腎炎などを初めとする各種自己免疫
疾患；変形性関節症、痛風、アテローム硬化症、乾癬、
アトピー性皮膚炎、肉芽腫を伴う肺疾患、各種脳炎など
炎症症状が病態の基本になっている難治性各種疾患、エ
ンドトキシンショック、敗血症、炎症性大腸炎、糖尿
病、急性骨髄芽球性白血病、肺炎、心臓移植、脳脊髄
炎、食欲不振、急性肝炎、慢性肝炎、薬物中毒性肝障
害、アルコール性肝炎、ウイルス肝炎、黄疸、肝硬変、
肝不全、心房粘液腫、キャッスルマン症候群、多発性骨
髄腫、レンネルトＴリンパ腫、メサンギウム増殖性腎
炎、腎細胞癌、サイトメガロウイルス性肺炎、サイトメ
ガロウイルス性網膜症、アデノウイルス性感冒、アデノ
ウイルス性プール熱、アデノウイルス性眼炎、エイズな
どの疾患の治療及び予防に効果を示す。
【００２１】本発明における式
【００２２】
【化１１】
【００２３】または
【００２４】
【化１２】
【００２５】で表される化合物の製造方法は特に限定さ
れないが、例えば、それぞれ特開平2-256645号公報、特
開平3-188042号公報に示される方法により合成すること
ができる。また、本発明にかかる化合物は、その構造式
から明らかなように二重結合を有するので、シス，トラ
ンスの幾何異性体が存在しうるが、いかなる異性体も本
発明の範囲に包含される。
れないが、例えば、それぞれ特開平2-256645号公報、特
開平3-188042号公報に示される方法により合成すること
ができる。また、本発明にかかる化合物は、その構造式
から明らかなように二重結合を有するので、シス，トラ
ンスの幾何異性体が存在しうるが、いかなる異性体も本
発明の範囲に包含される。
【００２６】本発明化合物をこれらの疾患の治療・予防
剤として投与する場合は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセ
ル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよい
し、また坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤などとして非経
口的に投与してもよいが、本発明の場合は、経口剤とし
て投与することが望ましい。投与量は、疾患の種類、症
状の程度、年齢などにより著しく異なるが、例えば経口
剤としてヒトに投与する場合は、0.001〜20mg/kg、好ま
しくは0.01〜15mg/kgであり、更に好ましくは0.1〜10mg
/kgを１日１〜数回に分けて投与する。経口・非経口投
与のための製剤化は、通常の製薬的に許容できる担体を
用い、常法により製造する。
剤として投与する場合は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセ
ル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよい
し、また坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤などとして非経
口的に投与してもよいが、本発明の場合は、経口剤とし
て投与することが望ましい。投与量は、疾患の種類、症
状の程度、年齢などにより著しく異なるが、例えば経口
剤としてヒトに投与する場合は、0.001〜20mg/kg、好ま
しくは0.01〜15mg/kgであり、更に好ましくは0.1〜10mg
/kgを１日１〜数回に分けて投与する。経口・非経口投
与のための製剤化は、通常の製薬的に許容できる担体を
用い、常法により製造する。
【００２７】すなわち経口用固形製剤を調製する場合
は、主薬に賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスター
チ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二
酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニル
アルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、
メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチ
ン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウ
ム、デキストリン、ペクチン等が、滑沢剤としては、例
えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては
医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯
臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ
油、龍脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤、顆粒
剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーテ
ィングすることはもちろん差し支えない。また必要に応
じて防腐剤、抗酸化剤等を添加することができる。
は、主薬に賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスター
チ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二
酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニル
アルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、
メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチ
ン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウ
ム、デキストリン、ペクチン等が、滑沢剤としては、例
えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては
医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯
臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ
油、龍脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤、顆粒
剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーテ
ィングすることはもちろん差し支えない。また必要に応
じて防腐剤、抗酸化剤等を添加することができる。
【００２８】注射剤、点滴剤などを調製する場合は、主
薬に必要によりpH調製剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤
などを添加し、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法
により皮下・筋肉・静脈内用注射剤、点滴注射剤とす
る。以下に、本発明の具体的な代表的実施例を挙げる
が、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
薬に必要によりpH調製剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤
などを添加し、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法
により皮下・筋肉・静脈内用注射剤、点滴注射剤とす
る。以下に、本発明の具体的な代表的実施例を挙げる
が、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００２９】
実験例実験例１ ゲルシフトアッセイ TNF-αとHIV-1のNFκBプローブを用いてゲルシフトアッ
セイを行った。TNF-αのNFκBプローブとしては、転写
開始位置からそれぞれ634番目のNFκB様サイト［下線
部］(κB-1,5'-GGGTCTGTGAATTCCCGGGGGTGA-3')を用い
た。HIV-1のNFκBプローブとしては、転写開始位置から
それぞれ103番目と90番目(5'-GGCTACAAGGGACTTTCCGCTGG
GGACTTTCCAGG-3')のNFκB様サイトを用いた。DNAは二本
鎖で用い、[α-32P]dCTPとクレノウフラグメント(Kleno
w Fragment)を用いて常法により標識し、NAP-5カラム
（ゲルろ過カラム)で精製した。核抽出物2μgと32P-標
識したTNF-α又はHIV-1のNFκBプローブ(10,000-20,000
cpm)を結合緩衝液（10mMTris-HCl，40mMNaCl，10%glyce
rol，1mMEDTA，1mMDTT，1%NP-40，1%デオキシコレイ
ト，3μg/mlpoly[dI-dC]）中、室温で30分間結合反応さ
せた。DNA-NFκB複合体と遊離のオリゴヌクレオチドを
分離するために5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000イメージ
アナライザーにて核抽出物中のNFκBとこれに結合した
オリゴヌクレオチド複合体のバンド（黒化度）を定量し
た。同様に試験化合物の効果を試すために核抽出物はヒ
ト単球を10ng/mlのLPSで2時間刺激して得たものを用い
た。そして、2μgの抽出物又はヒト組換えp50タンパク
とTNF-α又はHIV-1のNFκBプローブを前記化合物（１）
の存在、非存在下で室温で反応させ、比較した。ヒト単
球のLPS刺激によるNFκB結合活性化に対する化合物
（１）の作用(抑制率%)を表１に示した。
セイを行った。TNF-αのNFκBプローブとしては、転写
開始位置からそれぞれ634番目のNFκB様サイト［下線
部］(κB-1,5'-GGGTCTGTGAATTCCCGGGGGTGA-3')を用い
た。HIV-1のNFκBプローブとしては、転写開始位置から
それぞれ103番目と90番目(5'-GGCTACAAGGGACTTTCCGCTGG
GGACTTTCCAGG-3')のNFκB様サイトを用いた。DNAは二本
鎖で用い、[α-32P]dCTPとクレノウフラグメント(Kleno
w Fragment)を用いて常法により標識し、NAP-5カラム
（ゲルろ過カラム)で精製した。核抽出物2μgと32P-標
識したTNF-α又はHIV-1のNFκBプローブ(10,000-20,000
cpm)を結合緩衝液（10mMTris-HCl，40mMNaCl，10%glyce
rol，1mMEDTA，1mMDTT，1%NP-40，1%デオキシコレイ
ト，3μg/mlpoly[dI-dC]）中、室温で30分間結合反応さ
せた。DNA-NFκB複合体と遊離のオリゴヌクレオチドを
分離するために5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000イメージ
アナライザーにて核抽出物中のNFκBとこれに結合した
オリゴヌクレオチド複合体のバンド（黒化度）を定量し
た。同様に試験化合物の効果を試すために核抽出物はヒ
ト単球を10ng/mlのLPSで2時間刺激して得たものを用い
た。そして、2μgの抽出物又はヒト組換えp50タンパク
とTNF-α又はHIV-1のNFκBプローブを前記化合物（１）
の存在、非存在下で室温で反応させ、比較した。ヒト単
球のLPS刺激によるNFκB結合活性化に対する化合物
（１）の作用(抑制率%)を表１に示した。
【００３０】
【表１】
【００３１】実験例２ トランスフェクション実験 HIV-1のロングターミナルリピート(LTR)上に存在するNF
κB配列を4個組み込み、分泌型のヒト胎盤型アルカリフ
ォスファターゼ(PLAP)を連結させたプラスミド(HIV-1-
κB-PLAP)、HIV-1 LTRにPLAPを連結させたプラスミド(H
IV-1 LTR-PLAP：NIHより入手)、ヒトTNF-α遺伝子の転
写開始部位から1.4kb上流領域配列にPLAPを連結させた
プラスミド(TNF-α-PLAP)、SV40のpromoterをPLAPに連
結したプラスミド(pSV2-PLAP)を作成した。前者3つのプ
ラスミドはNFκB配列を有している。これらのプラスミ
ドを、それぞれマウスのマクロファージ細胞株のRaw26
4.7にDEAE-デキストラン法を用いてトランスフェクトし
た。これらの細胞を前記化合物（１）の存在下、非存在
下にLPS(1μg/ml)で48時間刺激後、培養上清中に放出さ
れたアルカリフォスファターゼを蛍光検出試薬ルミステ
イン(商標：住友金属社製)を用いてMicroLumat LB96P
(EG&G,BERTHOLD)にて蛍光を測定した。化合物（１）非
存在下で得られた蛍光に対する抑制率を表２に示した。
κB配列を4個組み込み、分泌型のヒト胎盤型アルカリフ
ォスファターゼ(PLAP)を連結させたプラスミド(HIV-1-
κB-PLAP)、HIV-1 LTRにPLAPを連結させたプラスミド(H
IV-1 LTR-PLAP：NIHより入手)、ヒトTNF-α遺伝子の転
写開始部位から1.4kb上流領域配列にPLAPを連結させた
プラスミド(TNF-α-PLAP)、SV40のpromoterをPLAPに連
結したプラスミド(pSV2-PLAP)を作成した。前者3つのプ
ラスミドはNFκB配列を有している。これらのプラスミ
ドを、それぞれマウスのマクロファージ細胞株のRaw26
4.7にDEAE-デキストラン法を用いてトランスフェクトし
た。これらの細胞を前記化合物（１）の存在下、非存在
下にLPS(1μg/ml)で48時間刺激後、培養上清中に放出さ
れたアルカリフォスファターゼを蛍光検出試薬ルミステ
イン(商標：住友金属社製)を用いてMicroLumat LB96P
(EG&G,BERTHOLD)にて蛍光を測定した。化合物（１）非
存在下で得られた蛍光に対する抑制率を表２に示した。
【００３２】
【表２】
【００３３】実験例３ ヒト末梢血単球のリポポリサッ
カライド(LPS)刺激により活性化されるNFκBの核内移行
に対する作用 健常成人男子静脈血よりフィコール／パック比重遠心法
により単核球画分を得た。このうち、プラスチックシャ
ーレに付着した細胞を単球として用いた。前記化合物
（１）又は（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/ml
で細胞を2時間刺激した。回収した細胞から核抽出物を
部分精製した。この核抽出物を[α-32P]dCTP（デオキシ
シチジン三リン酸）で標識したNFκB認識配列を有する
オリゴヌクレオチドと室温で30分、結合反応を行った。
なお、NFκB認識配列を有するオリゴヌクレオチドは、
各遺伝子の5'-上流域に存在する固有の配列で、IL-1β
は、5'-GGGAAAATCC-3'、TNF-αは、5'-GTGAATTCCC-3'、
IL-6は、5'-GGGATTTTCC-3'、IL-8は、5'-GGAATTTCCT-
3'、IL-1RAは、5'-GGGTATTTCC-3'という配列でありそれ
ぞれのオリゴヌクレオチドを核酸合成機にて調製した。
核抽出物中のNFκBとこれに結合したオリゴヌクレオチ
ド複合体を、遊離のオリゴヌクレオチドを分離するため
に5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000イメージアナライザー
にて核抽出物中のNFκBとこれに結合したオリゴヌクレ
オチド複合体のバンド（黒化度）を定量した。化合物
（１）及び（２）の核抽出物中のNFκBへの移行の抑制
率を表３に示した。
カライド(LPS)刺激により活性化されるNFκBの核内移行
に対する作用 健常成人男子静脈血よりフィコール／パック比重遠心法
により単核球画分を得た。このうち、プラスチックシャ
ーレに付着した細胞を単球として用いた。前記化合物
（１）又は（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/ml
で細胞を2時間刺激した。回収した細胞から核抽出物を
部分精製した。この核抽出物を[α-32P]dCTP（デオキシ
シチジン三リン酸）で標識したNFκB認識配列を有する
オリゴヌクレオチドと室温で30分、結合反応を行った。
なお、NFκB認識配列を有するオリゴヌクレオチドは、
各遺伝子の5'-上流域に存在する固有の配列で、IL-1β
は、5'-GGGAAAATCC-3'、TNF-αは、5'-GTGAATTCCC-3'、
IL-6は、5'-GGGATTTTCC-3'、IL-8は、5'-GGAATTTCCT-
3'、IL-1RAは、5'-GGGTATTTCC-3'という配列でありそれ
ぞれのオリゴヌクレオチドを核酸合成機にて調製した。
核抽出物中のNFκBとこれに結合したオリゴヌクレオチ
ド複合体を、遊離のオリゴヌクレオチドを分離するため
に5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000イメージアナライザー
にて核抽出物中のNFκBとこれに結合したオリゴヌクレ
オチド複合体のバンド（黒化度）を定量した。化合物
（１）及び（２）の核抽出物中のNFκBへの移行の抑制
率を表３に示した。
【００３４】
【表３】
【００３５】実験例４ ヒト末梢血単球のリポポリサッ
カライド(LPS)刺激によるIL-1β、TNF-α、IL-6の産生
に対する作用 ヒト末梢血単球を、前記化合物（１）または化合物
（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/mlで細胞を18
時間刺激した。培養上清中のIL-1β、TNF-α、IL-6をEL
ISAキット(R&D社)にて測定した。化合物（１）及び
（２）のIL-1β、TNF-α、IL-6産生抑制率を表４に示し
た。
カライド(LPS)刺激によるIL-1β、TNF-α、IL-6の産生
に対する作用 ヒト末梢血単球を、前記化合物（１）または化合物
（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/mlで細胞を18
時間刺激した。培養上清中のIL-1β、TNF-α、IL-6をEL
ISAキット(R&D社)にて測定した。化合物（１）及び
（２）のIL-1β、TNF-α、IL-6産生抑制率を表４に示し
た。
【００３６】
【表４】
【００３７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏ ｌ．37，（1992）ｐ．297−304 Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕ ｐｐｌ，Ｖｏｌ．32，（1991）ｐ．219 −223 Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕ ｐｐｌ，Ｖｏｌ．32，（1991）ｐ．225 −229 Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕ ｐｐｌ，Ｖｏｌ．32，（1991）ｐ．231 −235 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 31/19 A61K 31/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】式 【化１】 または 【化２】 で表せる化合物又はその薬理的に許容できる塩を有効成
分とするNFκBの活性阻害剤 - 【請求項２】式 【化３】 または 【化４】 で表せる化合物又はその薬理的に許容できる塩を有効成
分とするNFκBの活性阻害作用に基づく、インターロイ
キン-1，腫瘍壊死因子，インターロイキン-2，インター
ロイキン-6，インターロイキン-8，顆粒球コロニー刺激
因子，インターフェロンβ，インターロイキン-1レセプ
ターアンタゴニスト，主要組織適合抗原系クラスI，主
要組織適合抗原系クラスII，β2マイクログロブリン，
免疫グロブリン軽鎖，血清アミロイドA，アンジオテン
シノーゲン，補体B，補体C4，C-myc、ヒューマンイミュ
ノデフィシェンシィーウイルス，シミアンウイルス40，
サイトメガロウイルス及びアデノウイルスからなる群よ
り選ばれる１又は２以上の物質の遺伝子の発現抑制剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11196094A JP2875739B2 (ja) | 1994-04-27 | 1994-04-27 | ＮＦκＢ活性阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11196094A JP2875739B2 (ja) | 1994-04-27 | 1994-04-27 | ＮＦκＢ活性阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07291860A JPH07291860A (ja) | 1995-11-07 |
| JP2875739B2 true JP2875739B2 (ja) | 1999-03-31 |
Family
ID=14574467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11196094A Expired - Fee Related JP2875739B2 (ja) | 1994-04-27 | 1994-04-27 | ＮＦκＢ活性阻害剤 |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP2875739B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999001155A1 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Cephalo-protecteur |
| HU223344B1 (hu) * | 1997-08-13 | 2004-06-28 | Máté Hidvégi | Immunstimuláns és metasztázist gátló fermentált, szárított anyag, ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények, eljárás az előállítására és alkalmazásai |
| CN1181817C (zh) | 1998-03-20 | 2004-12-29 | 第一三得利制药株式会社 | 以苯基甲苯醌为有效成分的NF-kB抑制剂 |
| JP3002725B2 (ja) * | 1998-06-19 | 2000-01-24 | 工業技術院長 | 線維芽細胞増殖因子関連ペプチドからなる医薬組成物 |
| WO2019146801A1 (ja) * | 2018-01-29 | 2019-08-01 | 株式会社山田養蜂場本社 | 新規化合物 |
-
1994
- 1994-04-27 JP JP11196094A patent/JP2875739B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ，Ｖｏｌ．３２，（１９９１）ｐ．２１９−２２３ |
| Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ，Ｖｏｌ．３２，（１９９１）ｐ．２２５−２２９ |
| Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ，Ｖｏｌ．３２，（１９９１）ｐ．２３１−２３５ |
| Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３７，（１９９２）ｐ．２９７−３０４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07291860A (ja) | 1995-11-07 |
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