JP2825804B2 - 抗原を導入したリポソーム - Google Patents

抗原を導入したリポソーム

Info

Publication number
JP2825804B2
JP2825804B2 JP9134805A JP13480597A JP2825804B2 JP 2825804 B2 JP2825804 B2 JP 2825804B2 JP 9134805 A JP9134805 A JP 9134805A JP 13480597 A JP13480597 A JP 13480597A JP 2825804 B2 JP2825804 B2 JP 2825804B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
liposomes
virus
hiv
liposome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP9134805A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH1072368A (ja
Inventor
セ ニコロ イヴ
エム イーラー ガレット
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HATSUPUGOODO SEE UEE
Original Assignee
HATSUPUGOODO SEE UEE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26748809&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2825804(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by HATSUPUGOODO SEE UEE filed Critical HATSUPUGOODO SEE UEE
Publication of JPH1072368A publication Critical patent/JPH1072368A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2825804B2 publication Critical patent/JP2825804B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • G01N33/555—Red blood cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の他の細胞に
対する結合およびそれとの融合を誘発する抗原タンパク
質を膜中へ導入された動物由来細胞に関する。より詳し
くは本発明は、外膜がその中に、修飾された細胞または
リポソームを種々の標的細胞、殊にウイルス例えばヒト
免疫不全ウイルス（以下ＨＩＶとして示す）に感染した
細胞に生体内および試験管内で選択的に結合させる特異
性タンパク質物質を取込んだ修飾された細胞およびリポ
ソームに関する。
【０００２】
【背景技術】後天性免疫不全症候群（エイズ）は、明瞭
に規定される年代学的配列の症状および高い死亡率を特
徴とするビルレント疾患である〔カラン（Curran, J.
W.)ほか、「エイズの疫学」、サイエンス（Science)、
２２９，１３５２〜１３５７（１９８５）〕。エイズは
１９８１年に初めて記載され、そのときから米国のみで
約４０0,０００例を有する流行割合および９０％以上の
３年死亡率に達した。今日米国中に約１００万のヒトが
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染したと推定され
る。ＨＩＶはコアタンパク質、ゲノムＲＮＡおよび酵素
逆転写酵素を含むレトロウイルスとして分類されてい
る。ＨＩＶの若干の抗原に対する抗体が感染したヒトの
血清中に存在する。
【０００３】エイズにおける免疫不全の特徴はＴ４ヘル
パー／インデューサーリンパ球の消耗である〔ゴットリ
ーブ（Gottlieb）ほか、ニュー・イングランド・ジャー
ナル・オブ・メデイシン（N. Eng J. Med.）、３０５、
１４２５〜１４３１（１９８１）〕。この欠損は主にリ
ンパ球のこの集団のＨＩＶにより選択的感染の結果であ
る。ヘルパーリンパー球の表面上に存在するＴ４分子
（ＣＤ４抗原を示す）はＴ４リンパ球の表面に対する特
異的結合後に細胞内に入るＨＩＶウイルスに対する受容
体として関連づけられた〔ダルグレイシュ（Dalgleish)
ほか、ネーチャー（Nature）、３１２、７６３〜７６７
（１９８４）〕。ウイルスが入る機構は完全には示され
なかったが、しかし、受容体仲介エンドサイト−シスま
たはＨＩＶエンペロープと細胞膜との直接融合に類似す
るであろう〔ステイン（Stein)ほか、セル（Cell），４
９，６５９〜６６８（１９８７）〕。
【０００４】フソーゲン（fusogen)タンパク質は、ｇｐ
１２０（分子量１２0,０００ドルトンの糖タンパク質）
と称される〔マクドウガル（Mc Dougall）ほか、サンエ
ンス（Science)，２３１，３８２〜３８５（１９８
６）〕、ＨＩＶ表面上に確認され、このタンパク質がウ
イルスとリンパ球との間の融合を仲介する作用をするこ
とができる。細胞の内部に入るとウイルスＲＮＡが逆転
写酵素によりＤＮＡ中へ転写される。その後ＤＮＡが宿
主ゲノム中へ組込まれる。しかし、ＨＩＶ ＤＮＡの大
部分は組込まれないで細胞質中に保たれる。現在、感染
細胞が「活性化されるまでＨＩＶ複製がこの段階で制限
されることが知られている。〔マクドウガル（Me Douga
l ）ほか、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immun
ology ）、１３５、３１５１〜３１６２（１９８
５）〕。ＨＩＶ感染後の複製の潜在的活性化因子にはウ
イルス例えばＢ型肝炎、ヒトサイトメガロウイルスおよ
び単純ヘルペスウイルスが含まれると思われている。活
性化後、ＨＩＶが複製され、次いで細胞表面上に組立て
られる。次いで成熟ビリオンがＴ４リンパ球の表面膜か
らの出芽により形成される。ＨＩＶ複製の開始後Ｔ４リ
ンパ球が殺されるであろう。
【０００５】Ｔ４リンパ球に対するＨＩＶウイルスの細
胞変性効果は現在知られていないけれども、ＨＩＶ感染
が起ると、ウイルスのｇｐ１２０抗原が感染Ｔ４リンパ
球の表面上に発現されることが観察された。このタンパ
ク質の通常存在するＣＤ４抗原に対する親和性のため
に、他のＴ４リンパ球（未感染でＣＤ４抗原を有する）
が感染リンパ球と融合することができる。生じた細胞の
結合および融合が、融合に含まれた両方またはすべての
細胞を殺すと思われる（ザグリ（Zagury）ほか、サイエ
ンス（Science)、２３１、８５０〜８５３（１９８
６）〕。例えば、表面上にＣＤ４抗原のない細胞系のＴ
４リンパ球並びに細胞と抗ＣＤ４抗体との反応により抗
原がマスクされたＴ４細胞は、通常状態下でＨＩＶ感染
Ｔ４細胞との融合を示さない〔マク ドウガル（Mc Dou
gall）、前掲〕。
【０００６】この融合過程は若干のＨＩＶ感染および多
数の非感染Ｔ４細胞を包含することができ、大シンシチ
ウムの形成を生ずることができ、それが次いで細網内皮
系の細胞により循環から除去されるか、さもなければ溶
解することができる（例えば脳のような器管中）〔ショ
ー（Shaw）ほか、サイエンス（Science)、２２７、１７
７〜１８１（１９８５）；ガートナー（Gartner)ほか、
サイエンス（Science)、２３３、２１５〜２１９（１９
８６）〕。Ｔ４リンパ球は免疫応答において中心的役割
を演ずる。それはマクロフアージ、細胞障害性Ｔ細胞、
ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＢリンパ球ととも
に均一に含まれる。従って、Ｔ４リンパ球集団の選択的
消耗でも多くの免疫欠損を生じ、エイズに特有の生命を
脅かす日和見感染を生ずる〔ボウエン（Bowen)ほか、ア
ナルス・オブ・インターナル・メデイシン（Ann. Inter
n. Med. ）、１０３、７０４〜７０９（１９８５）〕。
さらに単球およびマクロフアージの一定集団もまたＣＤ
４抗原を発現し、研究によりこれらの細胞もまたＨＩＶ
感染されることができることが示された〔ホー（Ho）ほ
か、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション（J. Clin. Invest.）、７７、１７１２〜１７１
５（１９８６）〕。単球のＨＩＶ感染は走化性における
欠損を生ずることができ、それはエイズで報告された。
感染マクロフアージはＨＩＶウイルスを中枢神経系へ運
ぶことができ、この疾患に生ずる亜急性脳炎の発現を可
能にする〔ガブズダ（Gabuzda)ほか、アナルス・オブ・
ノイロロジー（Ann. Neurology）、２０、２８９〜２９
５（１９８６）〕。ＨＩＶ感染単球は腫瘍壊死因子を含
む種々の因子を生ずることができ、それがエイズの慢性
熱およびまた悪液質の関連状態（一般栄養不良）を説明
できた。さらに、新抗原に対する低い抗体応答と組合わ
された高濃度の免疫グロブリンによる多クローン活性化
からなるＢリンパ球異常が、エイズでは普通であり、Ｈ
ＩＶ感染の直接的結果となり得る。エイズの一層進行し
た段階における患者は通常無力性である（すなわち、普
通の抗原に対する減退した免疫応答を示す）。エイズは
治療が非常に困難なことが証明され、治癒するに任され
る。これまでに若干の異なる方法が試みられた。現在研
究されている可能性のある処置は次のものである：
【０００７】(a) 逆転写酵素の阻止因子 この型の治療は、標的酵素がヒト細胞中に見出されない
ので非常に選択的であることができる。この種の始原型
薬物はアジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）であ
る。この薬物は、Ｉ、IIおよびIII 期の研究に合格し、
現在エイズ患者および以前にニューモシステイス（pneu
mocystis) に感染した患者の治療に承認されている。研
究はこの薬物で処置した患者がヘルパーＴリンパ球の高
濃度を示しまた約１／３が陽性皮膚試験を示すことを示
した（後者は以前に無力性であった）。さらに、その疾
患に特有の神経系欠損に対する改善がある〔ヤーチェン
（Yarchoan）ほか、ランセット（Lancet）、５７５〜５
８０頁（１９８６）参照〕。しかし、臨床および免疫パ
ラメーターにおける前記改善にもかかわらず、ウイルス
がリンパ球中に生き残ることが認められる。 (b) 一般抗ウイルス剤 現在リバビリン（ribavirin)、ホスカーネット（Foscar
net)（ＨＰＡ−２３）およびスラミン（Suramin)のよう
な化合物が研究中である。現在これらの物質の有効性に
ついて利用できるデータがない。 (c) 免疫修飾物質 この型の処理にはエイズ患者中の欠損免疫系を高めまた
は再構成する試みが包含される。そのような試みは数年
間行なわれた。試験された免疫修飾物質の１つはα−イ
ンターフェロン、抗ウイルス免疫修飾および抗増殖効果
を有する白血球由来糖タンパク質である。この物質は、
ヒト患者に単に最少の有効性を示したが、許容できない
毒性水準を示した〔ゲルマン（Gelmann)ほか、アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・メデイシン（Am．J. Msd.)、７
８、７３７〜７４１（１９８５）〕。エイズ患者に試験
された類似物質はインターロイキン−２である。後者は
Ｔリンパ球の全数を高め、リンパ球からのＨＩＶの分離
を低下するが、しかし排除しないことが示された。それ
はまたカポジ肉腫、後者はエイズの一層進行した期に関
連する悪性腫瘍、の最少程度の退行に関連づけられた
〔ブロダー（Broder）ほか、ランセット（Lancet）、６
２７〜６３０頁（１９８５）〕。 (d) 移植 骨髄移植が若干のエイズ患者に試みられ、その目的は患
者の免疫反応性の再構成であった。そのような療法は長
期経続よりはむしろ一過性の状態の改善を生じたにすぎ
なかった。
【０００８】リポソームと細胞または核エンベロープと
を有効に溶融させる方法が記載された〔アービンテ（Ar
vinte)ほか、バイオケミストリー（Biochemistry）、２
６、７６５〜７７２（１９８６）参照〕。多くの場合
に、そのような融合は、タンパク質、ペプチド、ポリエ
チレングリコール、ウイルスエンベロープタンパク質な
どであることができるフソーゲンといわれる誘発性物質
を用いて行なわれた。若干の場合に融合誘発性物質には
媒質の改変状態が包含される。従って、低pHがリポソー
ムと核エンベロープとの融合の誘発に有利に使用された
〔アービンテ（Arvinte)ほか、バイオケミストリー（Bi
ochemistry）、前掲〕。操作は以前には生体内の特定細
胞に対する異なる分子の標的送達のために開発された
〔ニコラウ（Nicolau)ほか、ビオシミカ・エ・ビオフイ
ジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、８０５、３
５４〜３６７（１９８４）〕。そのような標的性は二重
層中に特定的に選択された糖脂質を含有したリポソーム
の使用により実現された。そのような糖脂質はそれらの
上の、標的細胞の形質膜上の１またはそれ以上のレクチ
ン（一定の型の炭水化物構造に特異的に結合する植物細
胞から誘導された物質）により認識された末端炭水化物
の存在を基にして選択された〔ニコラウ（Nicolau)ほ
か、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）、８０、７１２８〜７１３２（１９８３）参照〕。
そのような方法が働くには、標的細胞がその膜内の他の
細胞の膜内に存在する分子に対し特異性でそれに結合す
る受容体を含まねばならない。次に細胞の融合を誘発す
ることが必要であり、それはフソーゲン物質を用いて実
験的に、または自然にウイルス感染に由来するタンパク
質のような一定の融合剤により行なうことができる〔ガ
ロ（Gallo)ほか、サイエンス（Science)、２２４、５０
０〜５０３（１９８３）〕。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、種々
の細胞毒素および溶菌物質、有利にはタンパク質リシン
を取込ませたＣＤ４保持細胞、有利には赤血球、あるい
はリポソームを生成させることによりＨＩＶ感染細胞と
ＣＤ４保持細胞との選択的融合を利用することである。
そのような方法はＨＩＶ感染細胞の選択的な殺害を生ず
る。そのような目的は形質膜または脂質二重層（場合に
よる）中にＣＤ４抗原をもち、かつ細胞障害物質、例え
ばリシン、ゲロニンおよび（または）それらと等価の物
質を含有する一群のエンジニアド（engineered) 赤血球
またはリポソームの構築により実現される。本発明の他
の目的は抗原を細胞の形質膜中へ導入する方法を提供す
ることである。
【００１０】本発明の目的はまた、毒性および細胞溶解
物質を選定リポソームおよび細胞中へ取込ませる方法を
提供することである。本発明の他の目的は、そのような
エンジニアド細胞またはリポソームの最適量罹患患者中
へ導入し、ウイルスが感染標的細胞内で複製するかまた
は他の健全細胞に対する細胞の結合を促進してウイルス
を拡散しまたはそれらに対する身体の防禦を阻害するこ
とができる前に、これらの細胞またはリポソームを生体
内でウイルス感染細胞に結合させ、それと融合して破壊
させることによりウイルス疾患状態を軽減することであ
る。本発明の目的はまた、ＣＤ４タンパク質を膜中挿入
することにより修飾した異種赤血球〔および（または）
リポソーム〕を投与し、その結果、これらの細胞〔およ
び（または）リポソーム〕をＨＩＶ感染細胞に選択的に
結合させ、付随して融合させてＨＩＶ感染細胞を循環か
ら排除させる方法を提供することである。
【００１１】これらおよび他の目的、目標および利点は
本発明により実現される。本発明は、細胞の他の細胞に
対する結合およびそれとの融合を誘発する抗原タンパク
質を膜中へ導入された、例えば人為的に取込ませた動物
例えばヒト由来細胞に関する。本発明はまた、薬理学的
に許容される希釈剤中に懸濁された前記動物由来細胞の
１種またはそれ以上の細胞障害物質と協力した治療有効
量を投与、例えば注射、することを含むウイルス誘発疾
患の治療に関する。本発明はまた、薬理学的に許容され
る希釈剤中に懸濁された前記動物由来細胞の、１種また
はそれ以上の細胞障害物質と協力した治療有効量を含む
組成物を指向する。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 (a) 本発明の性質 本発明は、ヒトＣＤ４抗原を形質膜中へ取込み、エンジ
ニアド細胞と融合する細胞を破壊できる１種またはそれ
以上の細胞障害物質を細胞内に含有する型のエンジニア
ド赤血球を具体化する。これらのエンジニアド赤血球の
代りにリポソームを製造して同様に用いることができ
る。本発明またはこれらの細胞を正常赤血球から製造す
る方法に関する。本発明はさらにこれらのエンジニアド
赤血球（またはリポソーム）をウイルス感染により起さ
れた疾患、殊に後天性免疫不全症候群（エイズ）の治療
に使用する方法を具体化する。もちろん、エンジニアド
赤血球が示されるとき常に本明細書に記載する修飾リポ
ソームもまた使用できることを留意すべきである。
【００１３】提案した治療の主な特徴は次のとおりであ
る。膜上にＣＤ４受容体をもつ赤血球はウイルスｇｐ１
２０表面糖タンパク質を表現する循環ＨＩＶ感染細胞に
結合できる。そのような凝集体は次いで脾臓マクロフア
ージおよび肝臓のクッパー（Kupffer)細胞により循環か
ら除去される。細胞凝集体の取込みによるこれらの食細
胞の細胞の可能な感染を防ぐために、一定の抗ＨＩＶ薬
例えばＡＺＴ−またはＤＤＣ−三リン酸（ＡＺＴはアジ
ド−３′−デオキシチミジンであり、ＤＤＣはジデオキ
シシチジンである）が注射前にＣＤ４保持赤血球中に封
入される。食作用は薬物の存在なくＨＩＶ感染細胞の破
壊を有効に生ずるけれども、赤血球中のそのような抗Ｈ
ＩＶ薬の取込みにより追加の保護が生ずる。
【００１４】ＨＩＶ感染細胞が選択的に結合し、ついに
はＣＤ４抗原を有する非感染細胞と融合する傾向がある
ので、この抗原を形質膜上に有する細胞が、赤血球であ
っても、ＨＩＶ感染Ｔ細胞および（または）ＨＩＶウイ
ルス自体と選択的に結合し、おそらく融合することを仮
定し、証明した。ＨＩＶ感染細胞が細胞溶解物質を含む
他の細胞と融合すると感染細胞が破壊される。ウイルス
感染細胞の破壊における作用物質として臨床的に有効で
あるために、エンジニアド細胞は次の性質を有さねばな
らない：（１）それらが長く持続する、すなわち生体内
で少くとも細胞、この場合赤血球、の正常寿命に接近す
る寿命を有さねばならない；（２）それらが、それらに
含まれる細胞障害物質が身体の組織に無差別に作用しな
いような低毒性でなければならない；（３）それら自体
が、それらの中に置かれた毒素により不利に影響されて
はならない（そうでないと、それらが標的細胞を捜し出
して選択的に融合できる前に毒されるであろう）；
（４）それらはまた標的（すなわち感染した）細胞との
融合にのみ選択的であって他の健全な細胞とは結合も融
合もしてはならない；（５）それらは、それらがレシピ
エンド中で不利な抗原反応を起し従って患者のすでに負
担のかかった免疫系にさらに負担をかけることのないよ
うに非免疫源でなければならない。本発明に含まれる修
飾赤血球（およびリポソーム）がそのような役割に対す
る良好な候補であることが発見された。これは、それら
が他の細胞の生体繁殖装置を欠き、それらの寿命の間実
質的に血流中の酸素を運ぶ役目をするヘモグロビンの嚢
にすぎないためである。従って、それらは、それら自体
その中の種々の細胞障害物質の存在により不利に影響さ
れない。赤血球は血流中の最も多い細胞の１つであるの
で、抗原修飾毒素積載細胞によるその少部の置換は生物
体にとってほとんど重大でない。さらに、毒素が修飾赤
血球内に隔離されるので、単に注射された治療薬の場合
のように生物体の組織と不規則に相互作用することが自
由でない。
【００１５】(b) リポソーム 水性媒質を囲む脂質二重層（２分子の厚さ）からなる。
リポソームは一般に水性媒質中の脂質の音波処理によ
り、乾燥脂質層の緩衝液中の再懸濁により、または有機
溶媒中に溶解した脂質の選択緩衝液に対する透析により
形成することができる。リン脂質はそれを水と混合する
と一部は分子が両性である：それらが疏水性（水不溶
性）尾部および親水性（水溶性）または「極性」頭部を
有する、ので閉鎖流体充填球体を形成する。２つの脂肪
酸鎖、それぞれ１０〜２４個の炭素原子を含む、が多く
の天然存在リン脂質分子の疎水性尾部を構成する。若干
の水溶性分子に結合したリン酸が親水性頭部を構成す
る。十分高い濃度のリン脂質を水と混合すると疎水性尾
部が自然に一緒に並んで水を排除し、親水性頭部が水を
結合する。
【００１６】その結果、脂肪酸尾部が膜の内部へ向き、
極性頭部基が外方へ向く二重層である。膜の１表面にお
ける極性基はリポソームの内部へ向き、他の表面におけ
るものは外部環境の方へ向く。研究者に薬剤のリポソー
ム中への装入を可能にさせるのはリン脂質と水とのこの
顕著な反応性である。リポソームが形成されると、水に
加えた水溶性分子が球の内部中の水性空気中に取込ま
れ、小胞形成中に溶媒に加えた脂質可溶性分子が脂質二
重層中へ取込まれる。薬物送達に使用されるリポソーム
は典型的には直径が２５０オングストローム単位〜数ミ
クロンの範囲内にあり（対照として、赤血球の直径は約
１０ミクロンである）、通常溶液中に懸濁される。それ
らは２つの標準形態：流体により分離された若干の脂質
二重層で構成される「タマネギ状皮膚」をもつ多重ラメ
ラ小胞（ＭＬＶ）および完全に流体のコアを囲む単二重
層からなる単ラメラ小胞、を有する。単ラメラ小胞は典
型的には小（ＳＵＶ）または大（ＬＵＶ）である特徴を
有する。
【００１７】適当な環境下で、リポソームはほとんどの
任意の細胞型に吸着できる。それらが球を吸着するとリ
ポソームは若干の細胞により取込まれ、または飲み込ま
れることができる。吸着されたリポソームは細胞膜と脂
質を交換することができ、またときどき細胞と融合でき
る。融合が起るとリポソーム膜は細胞膜中へ取込まれ、
リポソームの水性分は細胞中の流体と併合する。多くの
型の細胞により吸着され、結合され、ついには吸収さ
れ、そのときそれらの内容物を徐々に遊離するリポソー
ムの能力が、リポソームを時間放出薬物供給系に対する
優れた候補にする。薬物がリポソームからどのような速
さで放出されるかはリポソームの組成、封入薬物の型お
よび細胞の性質を含む多くの因子による。
【００１８】リポソームのエンドサイト−シスは限定種
類の細胞、すなわち異質粒子を摂取できるもの、の中で
生ずる。食細胞の細胞がリポソームを吸収すると、細胞
は球をリソソームとして知られる細胞下オルガネラ中へ
移動させ、そこでリポソームの膜が分解されると思われ
る。リポソームの脂質成分はリソソームからおそらく外
方へ移動して細胞膜の一部となり、リソソームの分解に
耐性の他のリポソーム成分（例えば一定の薬物）は細胞
質内へ入ることができる。脂質交換はリポソームからの
形質膜中への個々の脂質分子の移動（およびその逆）を
含み；リポソームの水性分は細胞内へ入らない。脂質交
換が起るにはリポソーム脂質が標的細胞に関連した特定
の化学を有さねばならない。リポソーム脂質が細胞膜に
接合した後、それが長時間膜中に保持され、または種々
の細胞内の膜へ再分配されることができる。薬物がとも
かくそのような交換性脂質に結合すれば、それは脂質交
換中に潜在的に細胞中へ入ることができる。
【００１９】(c) 疾患 本発明は、ヒトおよび動物の種々のウイルス、細菌アレ
ルゲンおよび寄生虫疾患との戦いに使用できる。従っ
て、本発明は次のウイルスとの戦いに使用できる：ＨＩ
Ｖ、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ血球凝集素（Ａ
／メンフイス／１０２／７２株、Ａ／Ｅng１８７８／６
９株、Ａ／ＮＴ／６０／６８／２９ｃ株、およびＡ／Ｑ
ｕ／７／７０株、Ａｏ／ＰＲ８／３４、Ａｌ／ＣＡＭ／
４６、並びにＡ２／シンガポール／１／５７；Ｂ型イン
フルエンザウイルス、例えばＢ／Ｌee４０）、家禽ペス
トウイルス血球凝集素、ワクシニア、ポリオ、風疹、サ
イトメガロウイルス、疱瘡、単純ヘルペス１および２
型、黄熱、感染性エクトロメリアウイルス、牛痘ウイル
ス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウマ鼻肺炎（ウマ流
産）ウイルス、ウシの悪性カタルウイルス、ネコ鼻気管
炎ウイルス、イヌヘルペスウイルス、エプスタイン・バ
ーウイルス（伝染性単核症およびバーキット・リンパ腫
と関連）、マレーク病ウイルス、ヒツジ肺リンパ節腫症
（ヒツジ肺腺症）ウイルス、サイトメガロウイルス、ア
デノウイルス群、ヒト乳頭腫ウイルス、ネコ汎白血球減
少症ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、サケ類（trout)の
伝染性脾臓壊死ウイルス、魚類肉腫ウイルス（種々の系
統）、ニワトリ白血病ウイルス（内臓、赤芽球および骨
髄芽球）、大理石骨病ウイルス、ニューカッスル病ウイ
ルス、パラインフルエンザウイルス１、２、３および
４、ムンプスウイルス、トルコ（Turkey）ウイルス、カ
ナダ／５８、イスジステンパーウイルス、麻疹ウイル
ス、ＲＳウイルス、例えばインフルエンザＢ型ウイルス
例えばＢ／Ｌee／４０；狂犬病ウイルス；東部ウマ脳炎
ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウイルス；西部ウマ脳炎
ウイルス；黄熱ウイルス；デング１型ウイルス（＝６
型）、デング２型ウイルス（＝５型）、デング３型ウイ
ルス、デング４型ウイルス；日本脳炎ウイルス；キャサ
ナー森林病ウイルス；跳躍病ウイルス；ミューリー谷脳
炎ウイルス；オムスク出血熱ウイルス（ＩおよびII
型）；セントルイス脳炎ウイルス；ヒトライノウイル
ス；口蹄疫ウイルス；ポリオウイルス１型；エンテロウ
イルスポリオ２；エンテロウイルスポリオ３；ニワトリ
伝染性気管支炎ウイルス；ブタ伝染性胃腸炎ウイルス；
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス；ラッサウイルス；マチ
ュポウイルス；ピチンデ（Pichinde）ウイルス；タカリ
ベウイルス；乳頭腫ウイルス；シンドビスウイルス；な
ど。
【００２０】本発明は、また細菌、例えばらい病、結
核、梅毒および淋疾を起すものとの戦いに使用できる。
本発明は、また寄生虫、例えばマラリアを運ぶ生物体
（熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫など）、住血
吸虫症、回旋糸状虫および他のフィラリア寄生虫、トリ
パノソーマ、リーシュマニア、シャガス病、アメーバ
症、鉤虫などとの戦いに使用できる。本発明は、修飾細
胞およびリポソームの特定細胞および組織に対する標的
性を可能にするので、それはまた癌増殖との戦いに有効
であることができる。
【００２１】(e) 純ＣＤ４の製造 ＨＩＶによる正常Ｔ細胞の破壊にはウイルスによる細胞
の感染とその後のウイルスによりコードされる特異糖タ
ンパク質の生成、並びに感染細胞の形質膜中へのこれら
の糖タンパク質の挿入が包含される。この糖タンパク質
は表面上にＣＤ４抗原を含む他の細胞に対する親和性を
有する。ヒト白血球抗原、ＣＤ４、は血液バンクからの
血液の遠心分離後に得られたバフイーコートを含む種々
の源から、並びにＴ細胞リンパ腫細胞系〔アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection, Rockville, Maryland,ＵＳＡ）から
得られるＣＥＭ−細胞〕から分離することができる。Ｃ
Ｄ４抗原はマドン（Maddon）ほか、セル（Cell）、４
２、９３〜１０４（１９８５）の操作により精製でき
る。この操作に対する一般的工程を図に示す。
【００２２】精製ＣＤ４はすぐに使用でき、また−２０
℃で２〜３月安定である。図１中、緩衝液組成は次のと
おりであることができた： 緩衝液Ａ＝0.２Ｍ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧＳ） 0.１５Ｍ NaCl 0.２Ｍ ＰＭＳＦ 0.０１Ｍ トリス、最終pH＝8.０ 緩衝液Ｂ＝0.１Ｍ β−マンノシドを含む緩衝液Ａ 緩衝液Ｃ＝１％（ｗ／ｗ）デオキシコール酸ナトリウム １Ｍ 酢酸ナトリウム、最終pH＝4.０ 緩衝液Ｄ＝0.１Ｍ 酢酸ナトリウム、最終pH＝4.７ 上記緩衝液Ａ中のＰＭＳＦ（フエニルメチルフルオロ硫
酸）は抽出および精製操作の間タンパク質分解の阻止に
使用される毒性物質である。しかし、それは後のクロマ
トグラフィー段階により完全に除去される。
【００２３】ＯＧＳ（オクチルガラクトシド）はＣＤ４
の抽出に使用される洗浄剤である。後に精製工程におい
てそれは天然存在胆汁酸塩であり、毒性でないＤＯＣ
（デオキシコール酸塩）により置換される。ＤＯＣ（デ
オキシコール酸ナトリウム）は精製ＣＤ４中に0.００５
％の濃度で存在し、本発明により治療したエイズ患者の
血液中に約0.000001％の濃度で存在する（それは全く安
全である）。ヒトＣＤ４タンパク質または種々の細胞中
の組換えＣＤ４分子として得ることができる。〔ウオル
トン（Walton）ほか、セル（Cell）、１９８８、印刷
中〕。
【００２４】(f) エンジニアド赤血球を形成する細胞
融合 本発明によるエンジニアド赤血球を形成する一般的操作
を図２に示す。図２中で生成された修飾ＲＢＣ（赤血
球）（未標識）は約５0,０００分子のＣＤ４毎細胞を含
み、２０℃で２０日まで安定である。クロム標識修飾Ｒ
ＢＣは毒性研究のみに用いたのでそれらの製造は任意で
あり、それらは通常治療目的に対する本発明の実際の実
施に使用されないがしかしそれらを使用できる。そのよ
うな標識細胞は活性物質として本発明を用いる試験管内
診断法における使用が見出されよう。赤血球膜中へＣＤ
４を挿入する他の方法は初めにタンパク質をリポソーム
膜中へ挿入し、次いでそれを赤血球と融合させて膜中に
ＣＤ４を含む細胞−リポソームハイブリッドを生成させ
ることである。さらにこの方法は後の融合で細胞、有利
には赤血球に対するリポソーム封入分子（有利には細胞
毒または治療物質）の送達を生ずる。
【００２５】赤血球を連続溶解および再封する技術は再
封赤血球〔イーラー（Ihler)ほか、ＰＮＡＳ、７０、２
６６３〜２６６６（１９７３）〕およびエンドサイト−
シスによる装入細胞（イーラー（Ihler)ほか、ジャーナ
ル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（J. App.
Biochem)、４、４１８〜４３５（１９８２）〕の既知概
念を基にして開発された。これらの方法は、種々の分子
を細胞中へ封入し、その寿命を不変に保つことを可能に
する〔ニコラウ（Nicolau)ほか、ＥＰ８３ ４０１３６
４−１（１９８３）およびニコラウ（Nicolau)ほか、ア
ナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・
サイエンス（Ann. N. Y. Acad. Sci）、４４５、３０４
〜３１５（１９８５）〕。本発明には生体中のウイルス
感染細胞との最終融合およびその破壊に対する「標的化
弾丸」として作用できる修飾赤血球（またはリポソー
ム）が含まれる。
【００２６】リゾチームが酸性pHでリポソームと赤血球
ゴーストとの融合を誘発することが既に示された〔アー
ビンテ（Arvinte)ほか、プロシーデイングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Nat. Acad. Sci.)，８３巻、９６２〜９６６（１９８
６）〕。その操作においてリゾチームは音波処理小胞
（リポソーム）の外部膜に共有結合させ、これらの小胞
とヒト赤血球ゴーストとの融合の誘発に作用させた。融
合の強い誘発が最適リゾチームpHで認められた（それは
リゾチームを単に懸濁液に加えたときに認められなかっ
た）。この操作は、リゾチームが電気的に中性のリポソ
ーム相互の融合を誘発しないので有用であり、従って、
リポソームと細胞との融合に十分適する。本発明には媒
質中にリゾチームを全く存在させないで融合を誘発させ
る方法が含まれる。これは大規模臨床使用に対するエン
ジニアド赤血球の形成を非常に容易にする。
【００２７】(g) エンジニアド赤血球の毒性 エンジニアド赤血球（種々の捕捉物質例えばイノシトー
ル六リン酸イソチオシアナート標識リシンを含む）の寿
命がほゞ正常値であることが示された〔ニコラウ（Nico
lau)ほか、アナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ann. N. Y. Acad. Sci.)、前
掲〕。さらに、これらの細胞の、子豚中の３０日の期間
にわたる生体内毒性が追跡された。簡単に記載すると、
少量のエンジニアド細胞の注射（３０〜４０％薬物積載
細胞、すなわち細胞懸濁液のヘマトクリットが３０〜４
０％である、約0.１〜１mlを静脈内に注射した）後、動
物血液、例えば子豚の血液、の試料を３０日の経過にわ
たってときどきとった。これをイオン（Ｋ、Na、Cl、Ca
などを含む）の濃度並びにタンパク質、尿素およびグル
コース濃度について検定した。
【００２８】ゲロニンを封入したマウスＲＢＣの寿命測
定値は正常マウスＲＢＣの寿命に比べて有意な変化を示
さなかった。（ともにマウス中で約１１日の半減期を有
する）。毒性試験の間、動物を３０日の期間にわたって
種々の時間間隔で剖検し、肝臓クッパー細胞および膵臓
マクロフアージの状態を調べた。遊離免疫毒素（リシン
が毒素であった）の直接接種は細網内皮系中の組織損傷
を示した。脾臓および肝臓中のマクロフアージは毒素を
循環から除去する〔ビテッタ（Vitetta)ほか、サイエン
ス（Science)，２１９、６４４〜６５０（１９８
３）〕。しかし、本発明により用いた免疫毒素による腎
臓細胞に対する損傷がなく、毒素積載エンジニアド細胞
が毒性でないことを示した。他のエンジニアド赤血球に
対する含有毒素の主標的は脾臓マクロフアージであろ
う。これらの細胞が幹細胞により置換されることができ
るので、生ずる損傷は不可逆性でないであろう。さらに
実験証拠は、骨髄中の細胞からのマクロフアージの置換
のために細網内皮系を消耗させることが不可能なことを
示した〔フアン・フアース・アンド・コーン（Van Furt
h andCohn) 、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル
・メデイシン（J. Exp. Med.）、１２８、４１５〜４２
４（１９６８）〕。
【００２９】(h) 標的細胞との融合 適当な免疫系の機能化に必要なＴ４細胞がＣＤ４抗原を
有するので、それらが感染細胞に選択的に結合し、つい
には溶解される。溶解は培養細胞中への放射性成分例え
ばＣｒ−５１の取込みにより試験管内で測定できる。細
胞上の媒質中への同位元素の遊離（ウエル型カウンター
を用いてモニターした）は溶解の尺度である。そのよう
な溶解はシンシチウムの形成と（ＣＤ４含有細胞とＨＩ
Ｖ感染細胞との融合により発生するので）相関する。そ
のような融合は後記の実施例５の操作によりモニターさ
れ、結果は相当する表１（後掲）に示される。ＣＤ４抗
原を挿入された赤血球はフリーズエッチング電子顕微鏡
検査並びに薄片電子顕微鏡検査により調べることができ
る。簡単に記載すると、ＣＤ４抗原を有する赤血球をマ
ウス単クローン性抗ＣＤ４とともにインキュベートす
る。洗浄後、これらの細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＧでコ
ートした１０nm金ビーズとともにインキュベートした。
フリーズフラクチャーレプリカ中で１０nmビーズがクロ
ス割断赤血球の周囲の周りに観察された。観察ビーズの
数毎細胞はフラクチャーの偶然性に依存し、必らずしも
その細胞に結合したビーズの実際の数の尺度ではない。
最良の場合にビーズはクロス割断赤血球の１側に沿って
４０〜５０nmの間隔で規則的に並んで見える。エッチン
グにより生じた「タマネギ環」効果のために赤血球膜か
らのビーズの距離を正確に決定することができない。同
一試料の薄片中に電子濃密１０nm金ビーズもまた赤血球
の膜表面に観察される。ＨＩＶ感染Ｈ９細胞とともにイ
ンキュベートした後のＣＤ４保持赤血球のフリーズエッ
チング像は赤血球膜面上の膜タンパク質の分布を変えた
１００nmの「不規則性」または「押出」を示した。これ
はウイルスの赤血球との（おそらくＣＤ４抗原に対す
る）融合を示唆する。
【００３０】二重層中にＣＤ４を有する調製リポソーム
（実施例１、後記、による）はフリーズエッチング電子
顕微鏡検査により調べることができ、３００〜５００nm
の範囲の直径の単ラメラおよび多重ラメラの両方である
と認められる。リポソームをＨＩＶ感染Ｈ９細胞ととも
に８時間インキュベートした後、ウイルス粒子はＣＤ４
タンパク質挿入リポソームに結合されるが、しかしこの
タンパク質のないものには結合しないことが認められ
る。これはまた、本発明により膜中へ挿入されるとタン
パク質が適当に配向されることを示す。ウイルス粒子は
大きさ（約１００nm）および膜タンパク質の存在の両方
により確認することができる。リポソームは大きさおよ
び封入デキストランにより確認された。ＣＤ４リポソー
ムと感染細胞との融合およびリポソームの内容物の細胞
内部への送達を示すために次の操作を用いることができ
る。フエリチンを封入しているＣＤ４−リポソーム〔実
施例１（後記）の一般操作による〕をＨＩＶ感染Ｈ９細
胞または正常Ｈ９細胞とともに８時間インキュベートす
る。次いで細胞を洗浄して固定する。ＣＤ４を有しない
が、しかしフエリチンを封入しているリポソームを同様
に用いる。薄片電子顕微鏡検査はリポソームに封入され
たフエリチンが感染細胞中の脂質小滴へ移動したことを
示した。リポソームが感染細胞内の大細胞質液泡内に認
められた。細胞の形質膜とのリポソームの融合の例もま
た認められた。これらの結果はリポソームがＣＤ４抗原
を有しなかった場合に認められなかった。膜中にホスフ
アチジルエタノールアミンリサミンローダミン〔ローダ
ミンは蛍光染料であり、こゝでは脂質に結合している）
を有して形成され、Ｆ１−デキストランを封入するＣＤ
４保持リポソームをＨＩＶ感染Ｈ９細胞とともに８時間
インキュベートし、次いで洗浄して固定する。同様の、
しかし二重層中に存在するＣＤ４抗原のないリポソーム
を用いて類似の操作を追跡する。フリーズエッチング像
は、ウイルス粒子がＣＤ４をもつリポソームに結合した
が、それのないものに結合しなかったことを示した。さ
らにＣＤ４抗原を有するリポソームがＨＩＶ感染Ｈ９細
胞との融合の過程中に示された（すなわち、それらが明
らかな膜の連続性を示した）。ＣＤ４抗原の存在しない
リポソームは細胞膜上の上に載っているが、しかし実際
の融合の証拠を示さなかった。
【００３１】これらの細胞の蛍光分析は、リポソームが
それらの二重層中にＣＤ４抗原、並びに脂質−ローダミ
ン接合体を有した実験で有意なローダミン蛍光を示し
た。この蛍光は拡散し、また中断したが、しかしすべて
の場合に細胞の核から排除された。拡散蛍光はリポソー
ムが細胞の形質膜と融合したことを示す。中断蛍光は細
胞表面上に集まるがしかし融合しないけれどもおそらく
結合および融合の初期段階にあるリポソームのためであ
ることができる。それはまた細胞の消化画室中のリポソ
ーム成分の隔離、並びにリポソームのエンドサイト−シ
スの結果に基くことができる。しかし、核からの染料の
排除が細胞がなお生存可能なことを示す。同様の試験に
未感染健全Ｈ９細胞を用いた場合に、単にときどき蛍光
が細胞表面に付着したリポソームから検出された。ＣＤ
４抗原をもたないリポソームを用いたときにＨ９細胞の
感染または非感染に関係なく有意な蛍光が検出されなか
った。ＣＤ４抗原をもつ細胞はまたウイルス糖タンパク
質（ｇｐ１２０）をもつ感染細胞に結合するので、毒素
積載細胞またはリポソーム（膜中に取込まれたＣＤ４抗
原を有する）の使用はこれらの細胞またはリポソームと
ＨＩＶ感染細胞とを融合させ、その後、それらが健全な
Ｔ４細胞に結合してそれと融合できる前に後者が破壊さ
れる。これは患者の免疫系をＨＩＶ感染細胞によるそれ
以上の破壊から、望ましくはそれが修復できない損傷を
うける前に防止作用をする。本発明に有利に使用できる
毒素の限定的でない例にはリシン（ＭＷ２5,０００のタ
ンパク質、その毒性Ａ鎖が必要なすべてである）、アブ
リン（一定植物の種子から得られる有毒アルブミン）、
ゲロニン（ＭＷ２3,０００の、非免疫源である利点を有
するタンパク質）およびジフテリア毒素が含まれる。こ
れらの多くは市販されている。ゲロニンはピール（Pih
l）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J. Biol. Chem.）、２５５、６９４７〜６９５
３（１９８０）の方法により調製される。本発明の実施
例が後に示され、毒素としてリシンおよび（または）ゲ
ロニンの使用に関して示されるが、しかし、任意の適当
な細胞障害物質を、基本操作を大きく変形することなく
これらの代りに用いることができる。
【００３２】(i) 臨床使用 本発明を構成する修飾細胞を、ＨＩＶ感染リンパ球を抹
消循環から選択的に排除することによるエイズの治療に
用いることができる。操作にはエイズウイルスに対する
受容体（ＣＤ４抗原）を自己赤血球膜中へ挿入すること
を包含される。感染細胞はその外部表面上にｇｐ１２０
フソーゲンタンパク質を発現し従ってＣＤ４含有細胞を
結合する。エイズ患者中でリンパ球（通常ＣＤ４抗原を
もつ）はＨＩＶ感染細胞（通常ｇｐ１２０タンパク質を
もつ）に結合し、これが、すべての細胞が感染するかま
たは死ぬまで感染の拡散を生じ、従って免疫系の一般的
減退をもたらす。もちろん、ＨＩＶ感染リンパ球は、正
確にＴヘルパーリンパ球とではなく、ＣＤ４をもつ細胞
と結合し、融合する。前記のように、これにはＣＤ４を
もつ赤血球が含まれる。ＣＤ４−赤血球がその中に細胞
障害物質を含む場合に、融合は両細胞の死を生ずる。さ
らに、ウイルス自体がＣＤ４タンパク質に結合するの
で、血流中の遊離ウイルスがＣＤ４保持赤血球に結合
し、その中に隔離される。赤血球が遺伝装置を欠くので
ウイルスはその中で繁殖できない。従って二重の効果が
あり：血流中の少量の遊離ウイルスを隔離し、また一層
重要なことにはｇｐ１２０をもつ感染リンパ球が健全な
Ｔ細胞に結合しウイルスを拡散することができる前にそ
れと融合し、破壊する。
【００３３】エンジニアド赤血球の静脈内注射に加え
て、毒素をリポソームの使用により他の組織中へ選択的
に導入することができる。例えば、リポソーム（その二
重層内にＣＤ４抗原をもち、リポソーム内に封入された
ゲロニン、リシンまたは若干の他の毒素を含有する）の
リンパ節内への組織内（interstitial）注射（例えば指
間）によりリンパ節中に存在する感染細胞を選択的に攻
撃することができる。そのような治療の方法の利点は、
こゝに提供される方法により発生されるリポソームが小
細胞の大きさに接近する大きさであり、従って注射後の
エンドサイト−シスにより分解されないことである。さ
らに、本発明を構成するＣＤ４をもつ細胞およびリポソ
ームは、試験管内検定の一部としてｇｐ１２０をもつ
（すなわち、感染した）リンパ球の存在の検出に使用で
きる（後記実施例５の操作を用いる）。そのような操作
には本発明による細胞またはリポソームの生成が包含さ
れる。診断試薬を構成する細胞またはリポソームはそれ
らの膜中にＣＤ４抗原を有し、それらの細胞質中に細胞
障害物質を含有し、放射性物質、有利にはクローム−５
１で標識される。ＨＩＶ感染細胞がｇｐ１２０ウイルス
タンパク質をそれらの膜内にもつのでそのような細胞
は、ＣＤ４をもち、毒素を含有し、放射性標識した細胞
と融合し、次いで放射性標識を周囲媒質中へ遊離する。
【００３４】本発明を診断試薬として用いるには、患
者、場合によりエイズをもつ疑いのあるもの、から血液
をとり、白血球（殊にリンパ球）を標準操作（例えば、
本明細書に既に記載した操作）により捕集し、リポソー
ムが例示のために使用される後記実施例５に記載される
ように、小分割量を試験管内で本発明の細胞またはリポ
ソームの分割量と混合する。３７℃またはその付近で細
胞融合が起る十分な時間、最適には２４時間まで、イン
キュベートした後、細胞媒質の試料を捕集し、放射能を
測定する。測定は正常なヒトの血液の白血球を対照とし
て用いて二重に行なわれる。対照細胞と比較して患者か
らとった細胞の周囲の媒質中の放射能（補正式による計
算後）の高水準の検出は融合、それにより患者の血液中
にｇｐ１２０タンパク質を含む細胞の存在することを示
す。後者は前記細胞がエイズウイルスで感染されたこと
および従って患者がエイズをもつことを意味すると解釈
される。ＣＤ４以外の抗原を本発明の細胞またはリポソ
ームの膜内に導入できるので他のウイルス疾患を、この
操作を用いて診断することができる。これまでは、エイ
ズに対する診断操作は通常エイズをもつ疑いのある患者
の血液中の抗ＨＩＶ抗体の存在の検出による。しかし、
そのような所見は必らずしも疾患の発生を示さないで、
単に患者がウイルスまたはその抗原の若干にさらされた
ことを示す。こゝに開示された診断法は、ウイルスが複
製されている感染細胞の存在、すなわち活性感染、を示
す利点を有する。出願人はそれらのすべての等価物を期
待する意図である。
【００３５】本発明を構成する細胞およびリポソーム
は、さらに治療量の抗ウイルス薬を細胞例えばマクロフ
アージおよびクッパー細胞に直接送達する手段として利
用できる。後者の型の細胞（細網内皮系の一部）はＨＩ
Ｖに対する受容体をもたない。しかもＨＩＶ感染細胞は
それらの表面上に異質抗原を発現し、ついにはマクロフ
アージおよびクッパー細胞により吸収され捕食される。
この経路は細網内皮系の細胞の感染に、不本意にもそれ
らの表面上のＣＤ４抗原がウイルスにより使用される。
これらの細胞を、ウイルスの住拠となりその複製を許す
ことから保護するために本発明の細胞およびリポソーム
を、治療量の抗エイズ薬をマクロフアージ、クッパー細
胞および細網内皮系の他の細胞に直接送達するために使
用できる。これは、これらの食細胞の細胞が感染細胞お
よび他のウイルス汚染砕片を摂取した後ウイルスで感染
されるのを保護する効果を有する。
【００３６】例としてＡＺＴ（アジド−３′−デオキシ
チミジン）、リババリンおよびＤＤＣが本発明の細胞お
よびリポソーム内に容易に封入される。これは１９８７
年３月２４日に発行された米国特許第4,６５2,４４９号
に開示された封入操作を用いることにより最も容易に達
成され、それらの開示は特にこゝに参照される。治療薬
の封入の前または後に、本発明の操作を用いて適当な抗
原タンパク質（エイズが治療される疾患である場合には
ＣＤ４）を赤血球およびリポソームの膜中へ挿入する。
その結果、赤血球またはリポソームは中に治療量の活性
抗エイズ薬を含有し、それをエイズウイルスで感染され
た細胞へ向かわせ、その細胞との融合を誘発させる作用
をするＣＤ４抗原を膜中に取込んでいる。融合後、この
融合細胞複合体は異質（感染細胞または細胞類の膜中の
ウイルスコードタンパク質のため）と認識され、マクロ
フアージおよび他の細網内皮細胞により捕食される。そ
の結果、抗エイズ薬が直接食細胞の細胞内へ導入され、
これらの細胞中のウイルスの複製を防ぎ、従ってウイル
スがそれ自体複製できる他の道筋を閉鎖する。
【００３７】そのような方法の利点は、薬物が血液中に
遊離しておらず、従って望ましくなく有害な副作用の生
起に利用できないことである。さらに、薬物を運ぶ細胞
またはリポソームの膜内の抗原が、膜中にｇｐ１２０タ
ンパク質をもつ細胞（すなわち、ＨＩＶ感染細胞）に対
して特異性であり、健全な細胞が薬物にさらされず、従
って薬物の固有の毒性が非常に低下する。最終の結果は
薬物の全量を減少でき、従って全コストが低下され、薬
物の有効治療細胞質濃度がまた増加される（それが身体
全体に無駄に拡散しないため）。他の利点は、薬物が抗
原修飾された赤血球およびリポソーム内に有効に隔離さ
れるので、身体の組織液（ウイルス感染細胞が存在する
ことがほとんどない場所）に拡散することができないこ
とである。本発明は次に以下の限定的でない実施例に関
して記載される。
【００３８】
【実施例】
実施例１ヒト白血球抗原ＣＤ４の赤血球形質膜中への挿入 (a) リポソームの典型的な調製を次のように行なっ
た：使用する脂質（使用前に２：１（ｖ／ｖ）クロロホ
ルム／エタノール中に−３０℃で保存した）を種々の割
合で混合した。最も普通の操作にはホスフアチジルエタ
ノールアミン〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical C
o., St. Louis 、ＭＯ）から購入し、シングレトン（Si
ngleton)ほか、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・オ
イル・ケミスツ・ソサイエテイー（J. Am. Oil. Chem.
Soc.）、４２巻、５３〜６１（１９６５）に従って精
製〕、ホスフアチジルコリン（シグマ・ケミカル社製〕
ホスフアチジルセリン（シグマ社製）およびコレステロ
ール（シグマ社製）をそれぞれ１：２：１：1.５のモル
比で混合することが含まれ、典型的には５mgの全重量を
用いた。この混合物（最終濃度１０〜３０mM）を窒素の
流れ下に、次に真空下に１時間（残留する微量の有機溶
媒を除去するため）薄膜に乾燥した。リポソームは逆相
蒸発（reverse phase evaporation)により調製した〔ス
ゾカ（Szoka)，プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat. Aca
d. Sci.)、ＵＳＡ、７５巻、４１９４〜４１９８（１９
８７）参照〕。簡単に記載すると、脂質物質を新蒸留エ
ーテル4.５mlに溶解し、浴型音波処理器中でリン酸塩緩
衝食塩水（ＰＢＳ）1.５mlとともに１５秒間音波処理し
た。可溶化は洗浄剤／脂質モル比が８：１にあるように
ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）の添加に
より補助した。エーテルを回転蒸発器中で減圧下に除去
し、リポソーム懸濁液をＰＢＳで、またはホウ酸塩緩衝
液pH7.２、中に4.５mlに希釈した。あるいはリポソーム
を、疎水性ビーズ上の吸着を用いるフイリポット（Phil
ippot)ほか、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ
（Biochim. Biophys. Acta）、１３７〜１４３（１９８
３）に記載された操作により発生させることができる。
【００３９】(b) 細構成のために、リポソームの懸濁
液（ホウ酸塩緩衝液pH7.２、１ml中に脂質５mgを含む）
を取込ませるタンパク質を含む溶液と混合した。精製Ｃ
Ｄ４（１％のＯＧを含むＰＢＳ中４〜６mgタンパク質／
mlの濃度で）を脂質−洗浄剤混合物に加えた。脂質とタ
ンパク質との重量比は５〜１０に維持した。ジメチルス
ベルイミダート（シグマ社から購入）を１０℃の温度で
1.５mg／mlの最終スベルイミダート濃度に達するまで徐
々に加えた。次いで混合物を１０℃の温度で３０分間イ
ンキュベートし、次いでホウ酸塩緩衝液に対して４℃の
温度で２時間透析した。生じた混合物を次に、未反応タ
ンパク質からリポソームを分離するためにセフアロース
（Sepharose)４Ｂカラム上でクロマトグラフにかけた。
この操作はＣＤ４抗原約5,０００〜２0,０００分子毎リ
ポソームを生ずる。リポソームはフローサイトメトリー
およびフリーズフラクチャーを用いて確認した。それら
の内部容積は１２〜１６リットル毎モル脂質であると認
められ、それらの平均外径は約４５０nmであると認めら
れた。
【００４０】純ＣＤ４を有する再構成に加えて、またタ
ンパク質混合物の一部としてＣＤ４の量に等しい量のリ
ゾチームを用いて操作を行なった。これはそのときＣＤ
４とともに取込まれ、修飾赤血球を生成させる後者の融
合段階中のリポソーム相互の融合を防ぐ利点を有する。
リゾチームの酵素活性は（リゾチームが使用されれば）
ミクロコッカス・レイソデイクチカス（Micrococcus le
isodeikticus）検定〔アービンテ（Arvinte)ほか、プロ
シーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)、ＵＳＡ、
８３、９６２〜９６６（１９８６）〕により検定するこ
とができる。 (c) 新全血を同容積のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、
５mMリン酸塩、１４５mM−NaCl、pH7.４）で希釈し、遠
心分離（６４０ｇ、４℃で３０分）により血漿から分離
した。上澄みおよび白血球のバフイーコートはともに廃
棄した。多形核白血球を吸収性綿濾過により除去した。
次いで赤血球をＰＢＳ、pH7.４、中に再懸濁し、次いで
さらに３回洗浄する（各2,０００rpm で４℃で３０分間
遠心分離）。
【００４１】(d) ヘマトクリットを７０％に調整し、
次いで赤血球（約５００〜１０００万）を等容積のリポ
ソーム懸濁液（リゾチームを有するかまたは有さず、１
〜１０リポソーム毎赤血球の比を与える十分なリポソー
ムを使用）および酢酸ナトリウム緩衝液（0.０２Ｍ酢酸
ナトリウム／0.１４５Ｍ−NaCl）1.４mlとともに最終pH
5.５で、３７℃の温度で３０分間インキュベートした。
次いで１４００ｇで、２０℃で２０分間遠心分離するこ
とにより赤血球を捕集した。蛍光標識抗ＣＤ４抗体によ
る免疫蛍光検定を用いて赤血球／リポソームハイブリッ
ドの小試料の形質膜中のＣＤ４抗原の存在を定量的に測
定した。あるいは、ＣＤ４をリポソームの使用なく挿入
することができる。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液
（0.０２Ｎ、pH4.７、0.１４５Ｍ−NaCl）１５ml、ＣＤ
４を0.１〜0.４mg含む溶液（１％オクチルグルコシド
中）６０μｌおよび赤血球懸濁液（ＲＢＣペレット５０
μｌとＰＢＳ、pH7.４、１mlとの混合により生成）３０
μｌをエッペンドルフ（Eppendorf)遠心管（１５mlサイ
ズが便宜であった）中で混合し、３７℃で６０〜９０秒
間インキュベートした。上記３溶液（緩衝液、タンパク
質およびＲＢＣ）は混合前に３７℃に加温すべきであ
る。インキュベーション後、ＰＢＳ、pH7.４、１０mlを
加え（細胞の低pHに対する暴露を停止するため）、次い
で反応混合物をエッペンドルフ遠心分離機の固定角ロー
ター中で３０００rpm で４分間遠心分離することにより
細胞を濃縮した。上澄みを除き、次いで細胞をＰＢＳ、
pH7.４、中に再懸濁させた。さらにＰＢＳ中で同条件下
に３洗浄を行なった。
【００４２】実施例２ 取込みＣＤ４抗原の測定 取込みＣＤ４抗原の抗原活性の存在をフルオレセインイ
ソチオシアナート標識抗ＣＤ４抗体を用いて蛍光活性化
細胞選別法〔コールター（Coulter)からのエピックス
（Epics)Ｖ細胞選別器を使用〕により測定した。この測
定に２試料を用いた： 試料Ａ：ＣＤ４分子を取込んだ赤血球、 試料Ｂ：ＣＤ４タンパク質を含まない赤血球。 以下の記載においてＦＩＴＣはタンパク質鎖に対する蛍
光標識のフルオレセインイソチオシアナートを示す。
【００４３】用いた操作は次のとおりであった：両試
料、ＡおよびＢ、をＰＢＳ、pH7.４、で洗浄し、遠心分
離（エッペンドルフ遠心分離機中で3,０００rpm で４分
間）により濃縮した。各試験において、細胞ペレット上
に次の単クローン性抗体の１溶液、各１０μｌを層にし
た： (1) 抗Ｔ４−ＦＩＴＣ〔Ｐel−Freez 単クローン性抗
体、Ｍ１０２−１０−ＯＡＸ、Brown Deer、ＷＩ ５３
２２３〕１０μｌ、(2) 「Ｌeu−３ａ−Ｐｅ」〔抗ヒ
トＬeu−３ａフイコエリトリン接合体、ベクトン・デイ
キンソン（Becton Dickinson, Mountain View,ＣＡ ９
４０３９製〕１０μｌ、(3) 「ＯＫＴ−４Ａ−ＦＩＴ
Ｃ」〔Ortho-mune ＯＫＴ−４ａマウス単クローン性抗
体−ＦＩＴＣ接合体、抗−ヒトインデューサー／ヘルパ
ーＴ細胞、オルト・デイアグノステイック・システムズ
社（Ortho Diagnostic Systems, Inc.,Raritan,ＮＪ
０８８６９製〕１０μｌ。
【００４４】懸濁液をかくはんして細胞塊を抗体溶液と
混合した。細胞を２２℃で１５分間蛍光標識抗ＣＤ４抗
体と反応させた。インキュベーション後、ＰＢＳ、pH7.
４、１mlを２試料に加え、細胞懸濁液を再び遠心分離
（前記のように）により濃縮した。上澄み（Ａおよび
Ｂ）は細胞に結合しなかった抗体を含有し、これを除去
した。ＰＢＳによる洗浄および遠心分離機による濃縮の
操作を２回繰返して各上澄みを除去した。細胞をＰＢＳ
中に懸濁させて試験した。試料Ａの細胞のみが顕微鏡検
査、分光測光およびＦＡＣＳ検定により蛍光性であった
ので、それらだけがそれらの膜中へＣＤ４抗原を取込ん
だと考えることができた。さらに、プールした上澄み中
の蛍光物質（ＦＩＴＣ）の量を、４７０nmの励起波長お
よび４８０〜６００nmにおける発光波長検定を用いて蛍
光分光法により測定した。
【００４５】タンパク質蛍光測定は２８０nmの励起波長
を前記と同じ発光範囲で用いた。プールした上澄みＡお
よびＢ間の蛍光強度の差異は赤血球に結合した蛍光標識
の量に正比例した。従って、初期抗体濃度および赤血球
の数を知るとＣＤ４分子毎細胞の数に対する平均値を計
算することが簡単であった。上記操作において、各試料
ＡおよびＢは約１４００万の細胞を含み、蛍光単クロー
ン性抗体の全量は約0.００２１mgであった。ＣＤ４抗原
の平均分子量が約５8,０００ドルトンであり、各インキ
ュベーション混合物は約７兆個の抗体分子を含有した。
これらの値を Ｒ＝上澄みＡの蛍光／上澄みＢの蛍光 および、Ｎ＝抗体分子の数×（１−Ｒ） を用い、タンパク質蛍光スペクトル（励起＝２８０nm）
から計算した値はＲ＝1.１であった。ＦＩＴＣ蛍光に対
する相当する値はＲ＝1.３３であった。
【００４６】細胞膜中のＣＤ４分子が抗体により飽和さ
れたと仮定すると、結合した抗体の数は取込んだＣＤ４
分子の数（上式中のＮ）に等しい。Ｒ＝1.１を用いると
Ｎに対する値は３7,０００であった。Ｒ＝1.３３を用い
ると値はＮ＝５9,３００であった。用いた値はタンパク
質蛍光またはタンパク質結合ＦＩＴＣ蛍光を測定するか
により、結果は従ってこれらの値の平均である。従って
我々の計算は３7,０００〜６0,０００ＣＤ４分子毎細胞
を示した。
【００４７】実施例３ 赤血球中のリシン毒素の封入 (a) 実施例１に示した操作により調製した赤血球を冷
0.１５Ｍ−NaClで数回洗浄し、遠心分離してペレットを
得た。次いで細胞をＰＢＳ中にpH7.４で再懸濁した。 (b) 次いで赤血球の懸濁液をＰＢＳ、pH7.４、中に0.
１mMまでの純リシン毒素（シグマ・ケミカル社の精製Ａ
鎖）を含む溶液で洗浄した。赤血球を1,０００ｇで１０
分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、最終ヘマトクリット
を食塩水で７０％に調整した。 (c) 赤血球懸濁液を４℃に冷却し、0.４１平方メート
ルの透析表面および１3.４ミクロンの膜厚を有する普通
の血液透析器の血液画室中へ連続的に流れさせた。蠕動
ポンプで２０〜６０ml／分の定赤血球流量を維持した。
血液透析器は低イオン強度緩衝液（0.０１Ｍリン酸ナト
リウム、0.０１Ｍ炭酸水素ナトリウム、0.００２Ｍグル
コース）をpH7.４で、温度を４℃に維持して５００ml／
分の定流量で供給した。この透析段階の間に、赤血球
を、8.３のＫ対Na比で１Ｍ塩化物塩を含む（毎リット
ル）高張液１／１０容積の添加による再封の前に３７℃
で溶解して捕集した（高ＡＴＰ含量を再封細胞中に維持
するため）。 (d) 次いで細胞懸濁液を捕集し、３７℃で３０分間維
持して細胞を再封させた。次いで赤血球を、１mM塩化カ
ルシウム、１mM塩化マグネシウムおよび２mMグルコース
を含む（毎リットル）0.１５Ｍ−NaCl溶液で２回洗浄す
る。次いで赤血球を、選択へマトクリットで融合前に未
変性自己血漿中に懸濁させる。
【００４８】実施例４赤血球中へリシンまたはゲロニン毒素を封入させる他の
操作 (a) 実施例１の同じ脂質混合物で開始し、残留有機溶
媒の蒸発によりそれをとり、封入させる毒性物質（例え
ば、リシン、ゲロニンなど）をフイリポット（Philippo
t)ほかにより記載された操作によりＨＥＰＥＳ緩衝液
〔１０mM−ＨＥＰＥＳ（pH7.４）／１mM−ＥＧＴＡ／１
５０mM−NaCl〕中で導入した。約0.０１〜0.０２μｇ毎
十億リポソームの最終値を与える十分な毒素を用いた。
２相系を短時間渦動し、脂質を混合物中の成分の最高転
移温度以上の温度で３０分間水和させた。少量の洗浄剤
〔トリトン（Triton）Ｘ−１００〕を加え、試料の容積
をＨＥＰＥＳ緩衝液で0.６２５mlに調整した。激しく振
りまぜた後洗浄剤を除去した。 (b) ３つの異なる方法を洗浄剤の除去に用いた： ｉ 試料を１cm幅の透析袋中に置き、0.０１Ｍトリス−
HCl （pH7.４）／１mM−ＥＤＴＡ／0.１５Ｍ−NaCl １
リットルに対し、媒質を４交換して透析した。 ii 透析媒質の量を１００mlに減少し、バイオービーズ
（Bio-Beads)〔型ＳＭ−２、バイオーラド社（Bio-Rad,
Richmond,ＣＡ）製〕を袋の外側緩衝液中に加えた。媒
質は交換しなかった。 iii 若干の試験において、バイオービーズを試験管中
のリポソーム調製物に直接加え、回転ミキサー上に置
き、１０ＲＰＭで少くとも３時間回転した。 (c) 必要なときには、リポソーム懸濁液をセフアロー
ス４Ｂカラムに通して非封入物質を除去した。次いでリ
シン含有リポソームを実施例１におけるようにリゾチー
ムおよびＣＤ４の挿入に用いる。 (d) 次いで赤血球を実施例１に記載のようにリシン
（またはゲロニン）含有リポソームとともにインキュベ
ートする。融合効率は蛍光顕微鏡検査により、およびＦ
ＡＣＳ分析によりモニターした。大規模製造に対し、蛍
光標識が単にモニターのために要求されたので蛍光標識
なくリシンを用いて操作を行なうことができる。
【００４９】実施例５ゲロニンを含むＣＤ４−リポソームによるＨＩＶ感染細
胞の試験管内相互作用 (a) Ｔ細胞集団、Ｈ９、をＨＴ細胞系からクローン化
し、細胞の若干をＨＩＶ分離株で持続感染した。次いで
細胞をＲＰＭＩ １６４０媒質（１０％補体除去ウシ胎
仔血清、0.２mMグルタミンを含む）中でヨフエ（Yoffe)
ほか、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sc
i.)、ＵＳＡ、８４、１４２９〜１４３３（１９８７）
に記載されたように培養する。Ｈ９／ＨＩＶ細胞は光学
顕微鏡検査により試験したときに未感染細胞とは形態的
に区別できない。従って、Ｈ９／ＨＩＶ細胞によるウイ
ルス生成は電子顕微鏡検査並びに標準逆転写酵素検定に
よりモニターした。 (b) 若干が抗ＨＩＶ抗体に対し陰性であり、若干が陽
性であった血液供与者からＣＤ４抗原を含む細胞を得た
〔ヨフエ（Yoffe)ほか、前掲、に記載されたように〕。 (c) 細胞を、（Ｃｒ−５１）クロム酸ナトリウム0.５
mCi 〔ニュー・イングランド・ニュークリア社（New En
giand Nuclear, Boston, ＭＡ）製〕を用いて３７℃で
９０分間標識し、次いでリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄
した。次いで標識細胞を１0,０００細胞毎ウエルの濃度
に培養皿中へ塗布した。 (d) ＣＤ４−リポソーム、ＣＤ４−リポソームプラス
遊離ゲロニン、およびゲロニン封入ＣＤ４−リポソーム
のそれぞれを、Ｔ細胞を入れた個々のウエルに、５リポ
ソーム毎Ｔ細胞の比に加えた。次いで非感染Ｈ９細胞お
よびＨＩＶ／Ｈ９細胞を個々にそれぞれのリポソーム調
製物とともに３７℃で１８時間インキュベートする。 (e) インキュベーション後、培養から上澄み液の１０
０μｌ分割量を捕集し、放射能を液体シンチレーション
により測定した。各試験に対し試験を３回行なった（す
なわち、３培養を各試験に用いる）。結果は、パーセン
ト比クロム−５１遊離（ＳＰ ＲＥＬ）に関して解釈さ
れ、それは細胞融合の程度を示し、式、 ＳＰ ＲＥＬ＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ） （式中、 ＥＲ＝試験遊離 ＭＲ＝最大遊離 ＳＲ＝自然遊離である）により示される。自然遊離（Ｓ
Ｒ）は標識細胞（すなわち、Ｈ９またはＨＩＶ／Ｈ９）
のみを入れたウエル中の上澄み液から0.１ml分割量を捕
集することにより測定した。最大遊離は１％トリトンＸ
−１００、0.１mlで溶解した標識細胞の上澄み液0.１ml
をとることにより測定した。放射能はウエルカウンター
を用いて測定した。 (f) １８時間のインキュベーション後にＨ９細胞およ
びＨＩＶ／Ｈ９細胞の両方を回収し、洗浄し、トリパン
ブルーで常法により染色して生存の程度を測定した。有
意量のＣｒ−５１遊離がＨＩＶ感染Ｈ９細胞をＣＤ４抗
原およびゲロニンの両方を含むリポソームに暴露した試
験にのみ認められ、ＣＤ４−リポソームのみを用いた場
合、またはゲロニンが媒質中に遊離しＣＤ４−リポソー
ム内に封入されなかった場合には認められなかった。こ
の試験に対する結果は表１に示される。
【００５０】
【表１】 表 １エンジニアドリポソームと感染および正常Ｈ９細胞との融合後のCr−51の遊離 ウエル＃ 細 胞 リポソーム調製物 比遊離 １ Ｈ９ ──── 2800 cpm ２ Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム 2800 cpm ３ Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム＋遊離ゲロニン 2800 cpm ４ Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム（ゲロニン含有） 2800 cpm ５ ＨＩＶ／Ｈ９ ──── 2800 cpm ６ ＨＩＶ／Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム 2800 cpm ７ ＨＩＶ／Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム＋遊離ゲロニン 2800 cpm ８ ＨＩＶ／Ｈ９ ＣＤ４−リポソーム（ゲロニン含有） 5700 cpm ＊ 実施例５により３７℃で１８時間インキュベートした後の１0,０００細胞 当りの cpmとして示した比遊離 ＊＊ 遊離ゲロニン濃度は0.０２mg毎１０11リポソームであった。
【００５１】実施例６エンジニアド赤血球による抗ＨＩＶ陽性患者の臨床治療 抗ＨＩＶ抗体に対して陽性と試験されたヒト患者はリシ
ン、アブリン、ゲロニンまたはジフテリア毒素を含有す
るエンジニアド赤血球で次のように治療される。患者は
充填エンジニアド赤血球（実質的にすべての細胞がＣＤ
４抗原および細胞毒を含む）の食塩水懸濁液２０mlまで
を静脈内（例えば腕中）に注射される。患者の状態を循
環中の抗ＨＩＶ抗体の濃度の測定並びに患者の状態の一
般的進行によりモニターする。初期注射は医師が是認さ
れると考えると追加注射により事後処置することができ
る。
【００５２】実施例７リポソームおよびエンジニアド赤血球を用いるＡＲＣを
有する患者の治療 ＡＲＣ（エイズ関連コンプレックス）を有すると思われ
るヒト患者は実施例６とほゞ同様に容態に対して治療さ
れる。しかし、このとき患者はエンジニアド赤血球とリ
ポソーム（ともに膜中のＣＤ４および細胞素を含有す
る）との組合せで注射される。この疾患状態における主
標的がリンパ節であるので、有利には患者は組織内（例
えば指間）に約１０００億個のリポソームおよび最適活
性量の修飾赤血球の混合物を注射される。患者の状態は
実施例６におけるようにモニターされ、必要に応じて追
加治療が与えられる。
【００５３】実施例８ＡＺＴを含有するエンジニアド赤血球による抗ＨＩＶ陽
性患者の臨床治療 抗ＨＩＶ抗体に対しまたは本出願において開示された診
断法により陽性と試験された患者はアジド−３′−デオ
キシチミジン（ＡＺＴ）を含む本発明の抗原修飾赤血球
またはリポソームで次のように治療される。患者は充填
赤血球またはリポソーム（該細胞またはリポソームは実
質的にすべてＣＤ４抗原および細胞質隔離治療量のＡＺ
Ｔを含有する）の食塩水懸濁液２０mlまでを静脈内（例
えば腕中）に注射される。そのような処置は臨床医によ
り調整され、薬物の全用量は安全限界内、最適には４〜
６時間当り１００〜３００mg、に保たれる。次いで患者
の状態が循環中の抗ＨＩＶ抗体の存在の測定（または本
出願において示される診断法により）、並びに患者の状
態の一般的進行がモニターされる。次いで初期注射は、
主治医が是認されると考えると４〜６時間毎に追加注射
により事後処理される。
【００５４】明細書および特許請求の範囲が本発明の例
示であって限定でなく、また発明の精神および範囲内の
他の態様が当業者に連想されると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ４抗原の精製工程を示す図。
【図２】標識した赤血球の製造工程を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 ガレット エム イーラー アメリカ合衆国 テキサス州 77840 カレッジ ステーション ラングフォー ド ストリート 1115 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/00 A61K 9/127 A61K 31/70 A61K 38/00 A61K 45/08 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 二重層内にヒトＣＤ４抗原を取込んだリ
    ポソーム。
  2. 【請求項２】 中に取込まれた１種又はそれ以上の細胞
    障害物質を更に含有する請求項１に記載のリポソーム。
  3. 【請求項３】 細胞障害物質が、リシン、ゲロニン、ア
    ブリン、及びジフテリア毒素、並びにそれらの毒性学的
    活性フラグメントからなる群から選択される、請求項２
    に記載のリポソーム。
  4. 【請求項４】 中に取込まれた１種又はそれ以上の治療
    薬を更に含有する請求項１に記載のリポソーム。
  5. 【請求項５】 前記治療薬が、ＡＺＴ、アジド−3'−デ
    オキシチミジン（ＡＺＴ）三リン酸、ジデオキシシチジ
    ン三リン酸、及びリバビリンからなる群から選択される
    請求項４に記載のリポソーム。
  6. 【請求項６】 薬学的に許容される希釈剤中に懸濁され
    た請求項２に記載のリポソームを治療有効量で含有する
    組成物。
JP9134805A 1987-06-30 1997-05-26 抗原を導入したリポソーム Expired - Lifetime JP2825804B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6828887A 1987-06-30 1987-06-30
US19744588A 1988-05-27 1988-05-27
US068288 1988-05-27
US197445 1988-05-27

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63164103A Division JP2728166B2 (ja) 1987-06-30 1988-06-30 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH1072368A JPH1072368A (ja) 1998-03-17
JP2825804B2 true JP2825804B2 (ja) 1998-11-18

Family

ID=26748809

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63164103A Expired - Fee Related JP2728166B2 (ja) 1987-06-30 1988-06-30 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞
JP9134805A Expired - Lifetime JP2825804B2 (ja) 1987-06-30 1997-05-26 抗原を導入したリポソーム

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63164103A Expired - Fee Related JP2728166B2 (ja) 1987-06-30 1988-06-30 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5677176A (ja)
EP (1) EP0298280B1 (ja)
JP (2) JP2728166B2 (ja)
AT (1) ATE114476T1 (ja)
AU (2) AU1821988A (ja)
CA (1) CA1327332C (ja)
DE (1) DE3852221T2 (ja)
ES (1) ES2067457T3 (ja)
IL (1) IL86650A0 (ja)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310654A (en) * 1985-07-31 1994-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining virulence of Yersinia
US5236835A (en) * 1988-10-05 1993-08-17 Hapgood, C.V. Electro insertion of proteins into red cell membranes
CA1327174C (en) * 1988-10-05 1994-02-22 Youssef Mouneimne Electro-insertion of proteins into animal cell membranes
US5235023A (en) * 1988-12-22 1993-08-10 The Dow Chemical Company Process for synthesis of heterocyclic polymers with trihalomethyl azole-forming site
JP3414395B2 (ja) * 1990-10-19 2003-06-09 ユニバーシティー オブ フロリダ 人工的に製造したウィルスのエンベロープ
US5252348A (en) * 1990-10-19 1993-10-12 Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. Artificial viral envelopes
US5753258A (en) * 1990-10-19 1998-05-19 University Of Florida Artificial viral envelopes
PL296382A1 (en) * 1991-02-02 1993-11-02 Nika Health Products Ltd Li Li Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system
ES2109260T3 (es) * 1991-06-14 1998-01-16 Europ Communities Eritrocitos transformados, procedimiento para prepararlos y su utilizacion en composiciones farmaceuticas.
GB9219562D0 (en) 1992-03-11 1992-10-28 Prendergast Kennet F Anti-viral peptides
EP0630407B1 (en) * 1992-03-11 2000-08-02 PRENDERGAST, Kenneth, Francis Anti-viral fusion peptides
AU5014393A (en) * 1992-08-13 1994-03-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The The use of cd4 plasma membrane vesicles (pmv) as a therapeutic agent for aids
EP0662125A1 (en) * 1992-09-22 1995-07-12 Dnx Biotherapeutics, Inc. Delivery of proteins by intermembrane transfer for preaccommodation of xenogeneic organ transplants and other purposes
US5840328A (en) * 1994-01-11 1998-11-24 The Liposome Company, Inc. Treatment using arachidonic acid metabolite and particulate formulations
HUT76331A (en) * 1994-07-15 1997-08-28 Lepetit Spa Dinucleoside-5',5'-pyrophosphates
US5591448A (en) * 1994-11-21 1997-01-07 Tepic; Slobodan Anti-viral therapeutic composition
US5834015A (en) * 1996-09-11 1998-11-10 Albany Medical College Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same
GB9721901D0 (en) 1997-10-16 1997-12-17 Univ Manchester Particles
WO2000029556A2 (en) * 1998-11-17 2000-05-25 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of glycosphingolipids that promote hiv-1 entry into cells
EP1140021B1 (en) 1998-12-23 2004-08-04 Idea Ag Improved formulation for topical non-invasive application in vivo
EP1031347B1 (en) 1999-01-27 2002-04-17 Idea Ag Transnasal transport/immunisation with highly adaptable carriers
DE69901377T2 (de) 1999-01-27 2003-01-02 Idea Ag Nichtinvasive Impfung durch die Haut
EP1921451A3 (en) * 2001-05-22 2008-05-28 Cygene, Inc. Complement mediated assays for in vivo and in vitro methods
AU2002343279B2 (en) * 2001-10-16 2008-09-25 Kode Biotech Limited Sensitivity controls for blood serology prepared from modified cells
US20050032113A1 (en) * 2003-07-17 2005-02-10 Mitsubishi Pharma Corporation Membrane protein library for proteome analysis and method for preparing same
EP2282723A2 (en) * 2008-03-26 2011-02-16 University of Oxford Endoplasmic reticulum targeting liposomes
US20100042072A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Biological targeting compositions and methods of using the same
US8211656B2 (en) 2008-08-13 2012-07-03 The Invention Science Fund I, Llc Biological targeting compositions and methods of using the same
US20100040546A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Biological targeting compositions and methods of using the same
US20110070154A1 (en) * 2008-08-13 2011-03-24 Hyde Roderick A Artificial cells
JP5822836B2 (ja) * 2009-10-08 2015-11-24 大塚製薬株式会社 悪性腫瘍の治療のための免疫活性化血液灌流フィルタ
WO2015073587A2 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
ES2865825T3 (es) 2014-04-01 2021-10-18 Rubius Therapeutics Inc Procedimientos y composiciones para inmunomodulación

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA806506B (en) * 1979-11-01 1981-09-30 Bio Response Inc A method for production of monoclonal antibodies
DE3218121A1 (de) * 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
FR2564319A1 (fr) * 1984-05-21 1985-11-22 Inst Nat Sante Rech Med Nouvelles compositions de liposomes dotees d'une action specifique vis-a-vis de la proliferation de cellules donnees
US5236835A (en) * 1988-10-05 1993-08-17 Hapgood, C.V. Electro insertion of proteins into red cell membranes

Also Published As

Publication number Publication date
US5677176A (en) 1997-10-14
IL86650A0 (en) 1988-11-30
AU1821988A (en) 1989-04-27
DE3852221T2 (de) 1995-04-06
DE3852221D1 (de) 1995-01-12
EP0298280A2 (en) 1989-01-11
ES2067457T3 (es) 1995-04-01
EP0298280A3 (en) 1990-05-02
JP2728166B2 (ja) 1998-03-18
EP0298280B1 (en) 1994-11-30
AU662154B2 (en) 1995-08-24
AU1942692A (en) 1992-09-24
CA1327332C (en) 1994-03-01
JPH01124382A (ja) 1989-05-17
JPH1072368A (ja) 1998-03-17
ATE114476T1 (de) 1994-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2825804B2 (ja) 抗原を導入したリポソーム
JP4620192B2 (ja) 赤血球内に生物学的活性薬剤をカプセル内封入する方法およびそのための装置
Magnani et al. Targeting antiretroviral nucleoside analogues in phosphorylated form to macrophages: in vitro and in vivo studies.
Davis et al. Pathology of experimental Ebola virus infection in African green monkeys
US6328972B1 (en) Compositions and methods for inducing cytotoxic T lymphocyte responses by immunization with protein antigens
JP6367314B2 (ja) １種以上の薬学上重要な物質が装填された赤血球の調製方法およびそのようにして得られた赤血球
CA2264646A1 (en) Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same
CN107137717A (zh) 一种携载抗肿瘤药物连接cd22单抗靶向淋巴瘤的血小板靶向载药体系的制备方法
DI LUZIO Employment of lipids in the measurement and modification of cellular, humoral, and immune responses
DE69528170T2 (de) Intrazelluläre verabreichung therapeutischer sustanzenmittels virosomen
Liao et al. Modulation of oxidized low-density lipoprotein-induced microvascular dysfunction by nitric oxide
US20160045573A1 (en) Nanoparticles with effects on endothelial function and membrane permeability
Peeters et al. Immunospecific targeting of immunoliposomes, F (ab′) 2 and IgG to red blood cells in vivo
JPH0155249B2 (ja)
IL105692A (en) Liposomes to which a membrane has been inserted angiotic protein
Saigo et al. Transfusion-related acute lung injury in a patient with acute myelogenous leukaemia having anti-IgA2m (1) antibody
Gill Resealed erythrocytes as a potential drug carrier system
ARISOY et al. Potential Treatment Approaches to SARS-CoV-2 and Evaluation of Drug Carrier Systems in Treatment
Mahaparale et al. Resealed RBC's: Method, Evaluation, Route of Administration and Application
Magnani et al. Red blood cells as carriers of drugs against retroviruses
Davies et al. The significance of the lysosome in toxicology
JPH06509058A (ja) リポソームニスタチン及びアンホテリシンｂの抗ｈｉｖ活性
Zhou MHC class I restricted presentation of protein antigen delivered by liposomes
JP2007269646A (ja) 表面修飾リポソームおよびその製造方法
Harini et al. A Review On Resealed Erythrocytes