JP2818797B2 - 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット - Google Patents

新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

Info

Publication number
JP2818797B2
JP2818797B2 JP63508893A JP50889388A JP2818797B2 JP 2818797 B2 JP2818797 B2 JP 2818797B2 JP 63508893 A JP63508893 A JP 63508893A JP 50889388 A JP50889388 A JP 50889388A JP 2818797 B2 JP2818797 B2 JP 2818797B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
antigen
artificial
hiv
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63508893A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03500648A (ja
Inventor
トロジナル，ジェルジー
ワーレン，ブリッタ
ルデン，ウラ
Original Assignee
フエリング、アクチエボラーグ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20370026&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2818797(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by フエリング、アクチエボラーグ filed Critical フエリング、アクチエボラーグ
Publication of JPH03500648A publication Critical patent/JPH03500648A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2818797B2 publication Critical patent/JP2818797B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、エピトープを構成するHIVの天然に現れる
アミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置
する二つのシステイン残基を有するアミノ酸配列を有し
ており、さらに化学的酸化手段によって形成された二つ
の該システイン残基の間にイオウ架橋を有してなる人工
ペプチドに関する。さらに、本発明は、HIVによって誘
導される抗体と反応する人工抗原、HIVによって誘導さ
れる体液サンプル中の抗体を検出する方法、該方法のた
めの診断用イムノアッセイキット、および免疫化成分と
して少なくとも一つの本発明抗原を含んでなるワクチン
組成物、に関する。
背景技術 後天性免疫不全症候群（AIDS）は、汚染された血液ま
たは血液製剤を通しても伝播される性的に伝播される疾
患である。これは、感染してＴ−４リンパ球および単球
に潜伏して棲息するヒト免疫不全ウイルス（HIV、以前
にはHTLV−IIIと称された）によって起きる（Wong−Sta
al、F.およびGallo、R.C.:Human T−lymphotropic retr
oviruses.Nature 317、395−403、1985）。慢性HIV感染
者は、ほとんどの場合は性的接触によってHIVを伝播す
るかもしれない。感染の間、免疫応答が低下して、50〜
70％の場合でAIDSが発症する。感染者の残りの最終結果
についてはまだわかってはいない。AIDSは発病すると、
致死的であって、日和見感染、カポジ肉腫やその他の腫
瘍および／または神経疾患によって特徴づけられる。
HIV感染を診断するために、ウイルスを分離したり、
抗体応答を測定したりする。ウイルス分離は、無症候性
HIV感染者の30〜50％で、AIDS発病患者の90〜100％で成
功する。抗体応答は、HIVの種々の構造的および酵素的
構成分に対しての免疫グロブリンからなる。これらに
は、ウイルスのエンベロープタンパク質糖タンパク質
（gp）120、経膜的（transmembrane）タンパク質gp41お
よびこれらの前駆体gp160、内部構造群抗原（interior
structural group antigens）p24、17および7/9および
これらの前駆体p55、酵素であるところの逆転写酵素（R
T）p65/51およびエンドヌクレアーゼp32およびプロテア
ーゼが含まれる。HIVゲノムの調節領域のタンパク質に
対する抗体も作られる。HIV感染者の正しい同定は、そ
のヒトの産生する免疫グロブリン（Ig）の型（１種また
は複数種）およびイムノアッセイに用いられる抗原の正
しい成分に依存する。
抗体検出による診断を確立するためによく用いられる
一つの方法は、酵素免疫法（enzyme−linked immunosor
bent assay（ELISA））（Sarngadharan、M.G.、Popovi
c、M.、Bruch、L.、Schuepbach、J.およびGallo、R.C.:
Antibodies reactive with human T−lymphotropic ret
roviruses（HTLV−III）in the serum of patients wit
h AIDS.Science 224、506−508、1984;schuepbach,J.、
Haller、O.、Vogt、M.、Luethy、R.、Joller、H.、Oel
z、O.、Popovic、M.、Sarngadharan、M.G.およびGall
o、R.C.:Antibodies to HTLV−III in Swiss patients
witn AIDS and pre−AiDS and in groups at rist for
AIDS.The New Engl.J.Med.312、265−270、1985）。ウ
イルス抗原でコートしたマイクロプレートのウェルと調
べる血清サンプルとを反応させて、洗浄して、抗ヒトIg
を加える。後者の試薬を酵素でラベルする。洗浄の後、
血清サンプルに特異的抗ウイルスIgが存在する場合のみ
酵素でラベルした抗ヒトIgが残る。酵素の基質を加えて
これを可視化して、分光光度計によって呈色反応で定量
する。この陽性ELISA反応を確認するために、次いで血
清サンプルを、例えば、電気泳動的に分画したウイルス
サブコンポーネントを含むウエスタンブロットに加え
る。ウエスタンブロット上の免疫反応によってIgがウイ
ルスサブコンポーネントに特徴的なバンドと反応するか
どうかが示されよう。通常、二つの異なる特徴的なバン
ドがHIV抗体の明確な診断の確立には必要とされる。
HIV抗体検出の信頼性は、ELISAプレートの試薬に依存
する。感染細胞の溶解物は細胞夾雑物を含むかもしれ
ず、これによって誤った陽性の血清学的反応が起きる
（Saag、M.S.およびBritz、J.:Asymptomatic Blood don
or with a false positive HTLV−III western blot.Th
e New Engl.J.Med.314、118、1985、Martin、P.W.、Bur
ger、D.R.、Caouette、S.およびGoldstein、A.S.:Impor
tance of confirmatory tests after strongly positiv
e HTLV−III screening tests.The New Engl.J.Med.31
4、1577、1986）。通常、ウイルス溶解物は、gagタンパ
ク質の過剰表示（over−representation）をし、エンベ
ロープタンパク質はより少なく、これによって間違った
陰性反応が生じる。天然のウイルス溶解物に加えて、組
換え体によって産生されたポリペプチドも生産されてい
る（Ghrayeb、J.、Kato、I.、Mckinney、S.、Huang、J.
J.、Chanda、P.K.、Ho.D.D.、Sarngadharan、M.G.、Cha
ng、T.W.およびChang、N.T.:Human T−cell lymphotrop
ic virus type III（HTLV−III）core antigens:synthe
sis in Escherichia coli and immunoreactivity with
human sera.DNA 5、93−99、1986;Chang、T.W.、Kato、
I.、McKinney、S.、Chanda、P.、Barone、A.D.、Wong−
Staal、F.、Gallo、R.C.およびChang、N.T.:Detection
of antibodies to human T−cell lymphotropic virus
−III（HTLV−III）with an immunoassay employing a
recombinant Eschericha coli−derived viral antigen
ic peptide.Bio/Technology 3,905−909、1985）。これ
らのアッセイの特異性および感受性はよいが、100％で
はない（Chang、T.W.ら：同上、Deinhardt、F.、Eberl
e、J.およびGuertler、L.:Sensitivity and specificit
y of eight commercial and one recombinant anti−HI
V ELISA tests.Lancet、40、1987）。
エンベロープタンパク質gp120は分離物間で異なり（W
ong−Staal、F.ら：同上、Weiss、R.A.、Clapham、P.
R.、Weber、J.N.、Dalgleish、A.G.、Lasky、L.A.,およ
びBerman、P.W.:Variable and conserved neutralizati
on antigens of human immunodeficiency virus.Nature
324、572−575、1986）、したがって、これらからのペ
プチドは通常ELISA抗原としては推奨されない。代わり
に、gp41に対する抗体は、HIV感染の最も感度のよい診
断基準とみなされてきた（Sarngadharan、M.G.,ら：同
上、Schuepbach、J.,ら：同上）。gp41は、種々の分離
物間でよく保持されている領域を含んでいる。p24に対
する抗体は、病気の進行とともに消失する（Lange、J.
M.A.、Paul、D.A.、Huisman、H.G.、de Wolf、F.、Van
der Berg、H.、Coutinho、R.A.、Danner、S.A.、van de
r Noordaa、J.およびGoudsmit、J.:Persistent HIV ant
igenaemia and decline of HIV core antibodies assoc
iated with transition to AIDS.British.Med.J.293、1
459−1461、1986）が、早期に現れるものである。既知
の抗体の応答については、抗p24および抗gp41の組合せ
の測定がしたがってすべての場合で最も信頼できよう。
ウエスタンブロットの実施は時間がかかり高価であ
る。ELISAで用いる信頼できる抗原を生産することが好
ましいようである。いまのところ、単独のアッセイで10
0％の特異性と感度を得られるものはない（Deinhardt、
F.、ら：同上、Lange、J.M.A.、ら：同上）。
最近、Gnann J.W.ら（Journal of Virology、Aug.198
7、p.2639−2641）は、HIVのgp41に由来する12個のアミ
ノ酸のペプチドを同定したが、これはHIV感染血清から
の血清の100％に認められた。記述されたペプチドは二
つのシステイン残基を含んでおり、著者らはジスルフィ
ド結合形成がエピトープの抗原構造における重要な役割
を果たすという証拠を示すものであると述べていた。し
かし、そのような証拠は出されていなかった。著者ら
は、ペプチドは自然に環化したとみなしており、彼らは
いわゆるジスルフィド結合を還元することによってそれ
を証明しようとしたが、失敗した。代わりに、彼らはシ
ステインの一つをセリンに置換した別の12個のアミノ酸
のペプチドを合成して、これを試験したときにHIV−陽
性試験血清の22個のうちの二つとしか反応しなかった。
著者らは、恐らくジスルフィド結合の形成を介して、両
方のシステイン残基がエピトープの抗原構造に必須であ
ると結論づけている。彼らは調べたペプチドにジスルフ
ィド結合があったことを証明しておらず、該ペプチドの
特定の位置においてセリンよりもシステインの方がよい
ことを示した。ペプチド中の二つのシステインの存在
は、環状構造と同意ではない。環化には特定の化学的工
程が必要である。すなわち、酸化であり、その結果は方
法によって異なり得る。環化が自然に起きる場合には、
それはしばしば不完全で、重合を伴う。
原発の（primary）HIV疾患においては、期間中抗体試
験は陰性であるかもしれない（Marlink、R.G.、Allan、
J.S.、Mclane、M.F.、Essex、M.、Anderson、K.C.およ
びGroopman、J.E.:Low sensitivity of ELISA testing
in early HIV infection.The New Engl.J.Med.315、154
9、1986）。
HIVに対する抗体を検出するための、さらに感染の初
期において検出するための、単一で迅速で感度が高く特
異的なアッセイの開発が最も望まれる。
発明の開示 本発明は、HIVによって誘導される抗体の検出のため
の、迅速で感度の高い特異的なアッセイを提供する。
本発明の一つの様相において、エピトープを構成する
HIVの天然にみられるアミノ酸配列に対応し、かつ該エ
ピトープの各側に位置する二つのシステイン残基を有し
ているアミノ酸配列を有しており、化学的酸化手段によ
って形成された二つの該システイン残基間のイオウ架橋
を有する、人工ペプチドが提供される。二つのシステイ
ン残基間のイオウ架橋によるペプチドのこの安定化は、
抗体結合活性の促進や最終産物の化学的安定性などのペ
プチドの有用な性質をもたらすと確信される。
人工ペプチドは少なくとも二つのシステイン残基を含
み、これは環化してイオウ架橋を形成する。連結される
二つのシステイン残基は、それらの間にエピトープを構
成する一つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば２〜
10残基、例えば５残基）を有していてもよい。本発明に
よる人工ペプチドが二つ以上のシステイン残基を含む場
合にも、二つのシステイン残基間にはイオウ架橋が化学
的酸化手段によって一つだけ形成される。
本発明のこの様相の好ましい態様において、下記の修
飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、 および下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド からなる群から選択される人工ペプチドが提供される。
現在、本発明による最も好ましい人工ペプチドは下記
のものである。
本発明の他の様相において、HIVによって誘導される
抗体と反応する人工抗原が提供され、この抗原は、エピ
トープを構成するHIVの天然にみられるアミノ酸配列に
対応しかつ該エピトープの各側に位置する二つのシステ
イン残基を有するアミノ酸配列を有しており、さらに化
学的酸化手段によって形成された該二つのシステイン残
基の間にイオウ架橋を有する人工ペプチドから主に成
る。
本明細書および特許請求の範囲において、「人工ペプ
チドから主になる抗原］とは、抗原の抗体との反応能は
人工ペプチドに由来することを表す。
本発明のこの様相の好ましい態様において、HIVによ
って誘導される抗体と反応する人工抗原が提供され、上
記に例示したように、この抗原は、本発明による好まし
い人工ペプチドから主になる。
本発明による人工抗原は、担体、例えばミネラル担
体、例えば水酸化アルミニウム、燐酸カルシウムなど、
プラスチック表面、例えばマイクロプレートやビーズな
ど、タンパク質、例えばウシ血清アルブミンなど、ある
いは免疫成分、例えばキーホールカサガイヘモシアニ
ン、などに固定化または結合させることができる。
本発明による人工抗原は、今までのところ、HIVによ
って誘導される体液サンプル中の抗体を検出するための
診断用抗原としてのみ用いられてきたが、これらはHIV
に対するワクチン組成物中の免疫成分として用い得ると
信じられている。本発明によるペプチド（例Ｉ）（担体
を有しない）をサル（apes）に注射したところ、ペプチ
ドのＣ−末端部分に対する抗体が誘導された。
このように、本発明のさらなる様相において、本発明
による人工抗原から選択される少なくとも一つの抗原
を、非毒性で製薬学上許容できる担体および／または希
釈剤とともに免疫成分として含んでなるワクチン組成物
が提供される。
本発明のさらなる様相において、体液サンプルをイム
ノアッセイに供して本発明による人工抗原を診断用抗原
として用いる、HIVによって誘導される該体液サンプル
中の抗体を検出する方法が提供される。体液サンプルと
しては、尿、唾液、涙液、乳汁、血清または血液が用い
得る。
本発明による人工抗原を診断用抗原として用いること
ができるイムノアッセイは、酵素免疫法（ELISA）、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）、免疫拡散法または免疫電
気泳動（IE）などいずれのイムノアッセイでもよい。
本発明のこの様相の好ましい態様においてはELISAが
選択されるイムノアッセイとして用いられる。
本発明のさらなる様相において、本発明による人工抗
原を診断用抗原として含む、HIVによって誘導される体
液サンプル中の抗体を検出するための診断用イムノアッ
セイキットが提供される。用いるイムノアッセイによっ
て、キットは、陽性標準血清サンプル、陰性標準血清サ
ンプル、ELISAの場合には酵素抱合体（conjugate）およ
び必要に応じて酵素抱合体のための基質、さらには必要
に応じて緩衝液（１種または複数種）および／または洗
浄液（１種または複数種）など他の構成分を含むであろ
う。必要に応じて、キットの全試薬類は、個別に封をし
た特定のラベルを付した試験管またはバイアルに含まれ
る。
本発明による人工ペプチドの合成 本発明による人工ペプチドは、線状ペプチド配列を生
産するいかなる既知の方法を用いても生産できる。例え
ば、クローニング、分解、液体相における一つのアミノ
酸残基の次のアミノ酸残基との結合または最初のアミノ
酸のＣ末端が結合された固相（樹脂）に始まるアミノ酸
の他のアミノ酸への結合、それによって次のアミノ酸の
Ｃ末端は最初のアミノ酸等のＮ末端に結合されて最後に
完成されたペプチドが固相から遊離される（いわゆるメ
リフィールド合成）などの方法がある。一旦、適当な線
状のペプチド配列が準備できれば、その二つのシステイ
ン残基を環化するために化学的酸化手段に供され、それ
によってシステイン残基間にイオウ架橋が形成される。
合成の一般的記述 以下の諸例において、全てのペプチドを、第二の結合
後の終止ステップを備えた二重の結合プログラムを用い
てアプライドバイオシステムズ430Aペプチドシンセサイ
ザー（Applied Biosystems 430A Peptide Synthesize
r）上で合成した。用いた樹脂は、４−メチル−ベンズ
ヒドリルアミン型の理論的負荷量0.66meq/gであった（P
eptides International、Louisville、KY、米国）。合
成の最終産物を、一晩真空中で乾燥させた。乾燥後、ペ
プチド−樹脂をメタノール（70ml）に懸濁させて、アン
モニアで飽和させた。加圧（pressurized）スチール容
器に入れて、マグネチックスターラーで撹拌しながら一
晩放置した。次いで、樹脂を濾過して分別して、メタノ
ールで数回洗浄して、真空中で充分に乾燥させた。次い
で、ペプチドを、スカベンジャーとしてのアニソールお
よびエチル−メチル−スルフィド（EMS）の存在下で液
体フッ化水素（HF）による処理（HF:アニソール:EMS＝1
0:05:05）によって樹脂から切り出した。蒸発によって
フッ化水素を除去した後、残渣を酢酸エチル（100ml）
に懸濁させて、濾過した。固体を酢酸エチル（３×100m
l）を加えてフィルター上で洗浄してから切り出したペ
プチドを酢酸（100ml）で抽出した。抽出物を20％酢酸
のメタノール溶液で2dm3の容量に速やかに希釈して、微
かな茶色になるまで0.1Mのヨウ素のメタノール溶液で処
理した。次いで、アセテート型のダウエックス（Dowe
x）１×８イオン交換体（3g）（Bio−Rad、Richmond、C
A）を加えて、混合物を濾過した。濾液を蒸発させて、
残渣を１％酢酸水溶液から凍結乾燥させた。次いで、産
生物を、アセトニトリルの0.1％トリフルオロ酢酸水溶
液を含む適当な系の20〜25ミクロンのVydac（Separatio
n Group、CA）を充填したカラム上での逆相液体クロマ
トグラフィーによって精製した。カラムからサンプルを
集めて、ボンダパック（Bondapak）C18カラム（Millipo
re、Milford、Mass.）を備えた分析用HPLC−Varian 550
0（Sunnyvale、CA）によって分析した。純粋物質（＞9
9.5％）を含む画分をプールして、溶媒を蒸発させて、
産生物を１％酢酸水溶液から凍結乾燥した。最終HPLC分
析を調整産物について行い、ペプチドの構造をアミノ酸
分析およびFAB−MS（Fast atom bombardment spectrome
try）によって確認した。
合成中に用いた全てのアミノ酸は、α−アミノ−機能
においてtert−ブトキシカルボニル基によって保護され
た。用いた側鎖保護は以下の通りである。
Ser（BZL）、Thr（BZL）、Tyr（２−BrCbz）、Lys（２
−ClCbz）、Orn（Cbz）、Asp（BZL）、Glu（BZL）、Arg
（Tos）、Cys（Mob） アミノ酸誘導体は、Bachem AG、（スイス）から入手
した。
例Ｉ （HIV−１−gp−41に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。HPLCによる純度−99.9％（36％アセトニトリ
ルの0.1％トリフルオロ酢酸溶液、保持時間は2ml/分で
6.79分、223nmで検出） 構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって確認し
た。
例II （Ｃ末端のより近くに位置するシステイン残基の挿入に
よって修飾された、HIV−１−gp120に見出される配列に
対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載の方法によって調
製した。
構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって確認し
た。
例III （HIV−１−gp−41に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
例IV （HIV−１−gp−41に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
例Ｖ（参考例） （HIV−１−gp−41に見出される配列に対応する配列） ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の
一般的記述に記載した方法に従って調製した。
純度＞98.5％（HPCL） 構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって確認し
た。
例VI（参考例） （HIV−１−gp−41に見出される配列に対応する配列） ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の
一般的記述に記載した方法に従って調製した。
構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって確認し
た。
例VII （HIV−２−gp41に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
例VIII （膜内外のHIV−２に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
例IX （膜内外のHIV−２に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
例Ｘ （膜内外のHIV−２に見出される配列に対応する配列） ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って
調製した。構造をアミノ酸分析およびFAB−MSによって
確認した。
HIVによって誘導される抗体の、血液サンプルにおける
検出 HIVによって誘導される抗体の、血液サンプルにおけ
る検出のために、ELISAを用いた（Engvall、E.およびPe
rlmann、P.:Enzyme−linked immunosorbent assay（ELI
SA）.III Quantification of specific antibodies by
enzyme labelled antiimmunoglobulin in antigen−coa
ted tubes.J.Immunol.109、129−135、1972）。
材料： プレート:Nunc 96 F、Roskilde、デンマーク 抱合体:HRPOウサギ抗−ヒトIg、Dakopatts、Glostrup、
デンマーク 緩衝液： 炭酸緩衝液:0.05M炭酸ナトリウム緩衝液、pH約9.5 緩衝液A:燐酸緩衝生理食塩水（PBS）、Ca++およびMg++
を含まないもの、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）およ
び0.50％ツイーン20＋20％胎児ウシ血清（FCS）を含む
もの。４℃で１〜３日保存できる。
OPD緩衝液:0.0347Mクエン酸、0.0667M Na2HPO4、pH5.
5、１ケ月保存できる。OPD錠剤、Dakopatts、Glostru
p、デンマーク。
洗浄溶液:0.05％ツイーン20を含む0.9％NaCl 方法： コーティング：コーティング抗原（試験ペプチド）の溶
液、５〜20μg/ml、を炭酸緩衝液に調製する。100μｌ
の溶液をストライプ（stripes）または96穴マイクロプ
レートの各ウェルに加える。室温で一晩（18時間）で吸
着が起きる。コートされたプレートは、内容物とともに
４℃で使用時まで保存できる。
血清アッセイ： 1.プレートを洗浄液で４回洗浄する。
2.緩衝液Ａで1:100に希釈した血清100μｌを加える。
3.一つのウェルに緩衝液Ａのみ100μｌを加え、これを
対照とする。
4.37℃で60分間インキュベートする。（この間に、抱合
体を希釈する、６を参照されたい） 5.洗浄液で４回洗浄する。空にする。
6.100μｌの抱合体、例えば、緩衝液Ａで1:15,000に希
釈したHRPOウサギ抗−ヒトIgG、IgA、IgM（例えば、５
μｌを0.75mlに加え、1:100に希釈する）。
7.37℃で30分間インキュベートする。（この間に、基質
溶液を調製する、９を参照されたい） 8.洗浄溶液で４回洗浄する。空にする。
9.100μｌのOPD基質を加える（６錠剤/10mlOPD緩衝液。
清浄な容器を用いる。錠剤の溶解には15〜20分を要す
る。溶解したら４μlH2O2/10mlを加える）。
10.室温で30分間インキュベートする。反応を100μｌの
2.5MH2SO4で停止させる。
11.プレートを490nmで読む。陰性の値は0.250以下であ
るべきである。
上記の材料と方法とを用いて、次の材料を、感染患者
からの血清サンプル中のHIVによって誘導される抗体の
検出のための診断用抗原（コートした抗原）として試験
した。
A. 組換えタンパク質gp160（昆虫細胞中のバクロウイ
ルス（Baculo−virus）中で発現された）。Repligen Co
rp.Cambridge、Mass.、米国から入手。
B. 組換えポリペプチドp121（gp41の保存領域を有し、
大腸菌（E.coli）でクローニングされた）。Repligen C
orp.Cambridge、Mass.、米国から入手。
C.本明細書の例Ｖ（参考例）に記載の合成ペプチド（シ
ステイン残基を一つだけ含み、環状ではない）。
D.本明細書の例Ｉに記載の本発明による人工ペプチド。
E.本明細書の例IIに記載の本発明による人工ペプチド。
HIV感染ヒト患者からおよび非感染者からの血清サン
プルを試験した。
これらの血清学的な性状は、ウエスタンブロットによ
って確認しておいた。
結果は次に示される通りであった。
上記の結果から、試験した本発明による人工ペプチド
（D.およびE.）は、ともに優れた感度と優れた特異性を
示すことが明かである。
同様に、次の追加の本発明による人工ペプチドを試験
した。すなわち、 F.本明細書の例IIIに記載の人工ペプチド、 G.本明細書の例IVに記載の人工ペプチド、 H.本明細書の例VIIIに記載の人工ペプチド、 I.本明細書の例IXに記載の人工ペプチド、および J.本明細書の例Ｘに記載の人工ペプチド。
以下の結果が得られた。
これらのペプチド（F.〜J.）はペプチドD.およびE.ほ
どには良くないが、これらはHIVによって誘導される抗
体との良好な反応性を示す。
環状と線状のペプチドの、血清学的反応性の比較 上記の材料および方法（ELISA）を用いて、例Ｉの環
状ペプチドおよびそれに対応する例VIの線状のペプチド
を異なる血清濃度で試験した。
次の結果が得られた。
上記比較の結果は、対応する線状のペプチドと比較し
た環状ペプチドの優位性を示している。両ペプチドとも
最低血清希釈において全ての血清で陽性となる。しか
し、反応は線状ペプチドでは急激に低下し、一方、環状
ペプチドでは陽性抗体反応性のための構造を保持するこ
とができる（上記の表、３および４列目を参照された
い）。これは、低い抗体価を（titres）を有する血清の
確実な検出を可能にするために必要な特徴である。
ELISAにおける吸光度値の直接比較によって、環状ペ
プチドが線状ペプチドにはるかに優ることが示される
（上記の表の５および６列目を参照されたい）。
抗体−陰性血清についてはその関係は逆である。特異
性は両ペプチドで100％であるが、バックグランド値は
線状ペプチドの方が高い。これは、特異的および非特異
的反応の両方において環状ペプチドが有利であることを
示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．313（1985) ｐ450−458 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．40（1986）ｐ９− 17 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．313（1985) ｐ277−281 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．61（８) （1987）ｐ2639−2641 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/16,7/06,7/08 G01N 33/569 A61K 39/21,37/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エピトープを構成するHIVの天然に現われ
    るアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位
    置する二つのシステイン残基を有するアミノ酸配列を有
    する精製人工ペプチドであって、該ペプチドが化学的酸
    化手段によって形成された二つのシステイン残基間にイ
    オウ架橋を有すること、およびペプチトが下記のペプチ
    ド 下記のペプチド 下記のペプチド からなる群から選択されることを特徴とする、人工ペプ
    チド。
  2. 【請求項２】HIVによって誘導される抗体と反応する精
    製された人工抗原であって、抗原がエピトープを構成す
    るHIVの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該
    エピトープの各側に位置する二つのシステイン残基を有
    するアミノ酸配列を有しており、さらに化学的酸化手段
    によって形成された二つの該システイン残基の間にイオ
    ウ架橋を有する人工ペプチドであり、かつ抗原の抗体と
    の反応能が人工ペプチドに由来し、該人工ペプチドが 下記のペプチド 下記のペプチド および下記のペプチド からなる群から選択されることを特徴とする、精製人工
    抗原。
  3. 【請求項３】人工抗原を担体に固定化または結合させる
    ことを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の精製され
    た人工抗原。
  4. 【請求項４】請求の範囲第２項または３項に記載の人工
    抗原を診断用抗原として用いることを特徴とする、体液
    サンプルをイムノアッセイに供する、HIVによって誘導
    される体液サンプル中の抗体の検出法。
  5. 【請求項５】請求の範囲第２項または３項に記載の人工
    抗原を診断用コーティング抗原として用いることを特徴
    とする、該サンプルを酵素免疫法（ELISA）に供する、
    請求の範囲第４項に記載の検出法。
  6. 【請求項６】診断用抗原として請求の範囲第２項または
    ３項に記載の人工抗原を含むことを特徴とする、HIVに
    よって誘導される体液サンプル中の抗体の検出のための
    診断用イムノアッセイキット。
  7. 【請求項７】追加的に 陽性標準血清サンプル、 陰性標準血清サンプル、 酵素抱合体、 必要に応じて、酵素抱合体のための基質、および 必要に応じて、緩衝溶液および／または 洗浄溶液を含むことを特徴とする、請求の範囲第６項に
    記載の診断用イムノアッセイキット。
  8. 【請求項８】非毒性で製薬学上許容される担体および／
    または希釈剤とともに、請求の範囲第２項または３項に
    記載の人工抗原から選択される少なくとも一つの抗原を
    免疫化成分として含むことを特徴とする、ワクチン組成
    物。
JP63508893A 1987-10-28 1988-10-27 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット Expired - Lifetime JP2818797B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8704185-1 1987-10-28
SE8704185A SE8704185L (sv) 1987-10-28 1987-10-28 Nya peptider, artificiella antigener och immunoanalystestsatser

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP20944197A Division JP3231666B2 (ja) 1987-10-28 1997-08-04 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03500648A JPH03500648A (ja) 1991-02-14
JP2818797B2 true JP2818797B2 (ja) 1998-10-30

Family

ID=20370026

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63508893A Expired - Lifetime JP2818797B2 (ja) 1987-10-28 1988-10-27 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット
JP20944197A Expired - Fee Related JP3231666B2 (ja) 1987-10-28 1997-08-04 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP20944197A Expired - Fee Related JP3231666B2 (ja) 1987-10-28 1997-08-04 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5981170A (ja)
EP (1) EP0396559B1 (ja)
JP (2) JP2818797B2 (ja)
AT (1) ATE141286T1 (ja)
DE (1) DE3855479T2 (ja)
DK (1) DK104590A (ja)
FI (1) FI902143A0 (ja)
IL (1) IL88224A0 (ja)
NO (1) NO302369B1 (ja)
SE (1) SE8704185L (ja)
WO (1) WO1989003844A1 (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6210873B1 (en) 1987-08-28 2001-04-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the priming of specific cytotoxic T-lymphocyte response
US5128319A (en) 1987-08-28 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome
IL88963A (en) * 1988-01-27 1996-05-14 Iaf Biochem Int Circular synthetic peptides and their mixtures for the detection of VIH antibodies and for the formation of vaccines
US6210874B1 (en) 1988-01-27 2001-04-03 Biochem Immunosystems, Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6214537B1 (en) 1988-01-27 2001-04-10 Biochem Immunosystems, Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US5241047A (en) * 1988-12-08 1993-08-31 Biochem Pharma Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6248574B1 (en) 1989-12-13 2001-06-19 Avigdor Shaffermann Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides
FR2657016B1 (fr) * 1990-01-16 1995-08-25 Clonatec Sa Peptides derivant de la glycoproteine d'enveloppe du virus-hiv-2, leurs applications a la detection d'une infection due a ce virus et a la vaccination contre le sida.
DE69129207T2 (de) * 1990-01-16 1998-10-08 Orgenics Ltd Peptide, von Virus-HIV-Hüllen-Glycoproteinen abstammend, deren Verwendung zum Nachweis einer Infektion dieser Viren und für die Impfung gegen AIDS
AU7676891A (en) * 1990-04-03 1991-10-30 Genentech Inc. Hiv envelope polypeptides
US5603933A (en) * 1993-08-31 1997-02-18 Board Of Regents, The University Of Texas CD4 peptides for binding to viral envelope proteins
US6277824B1 (en) 1998-07-10 2001-08-21 Adherex Technologies Compounds and methods for modulating adhesion molecule function
WO2000029008A2 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US7094757B2 (en) 2001-06-22 2006-08-22 Roche Diagnostics Corporation Complexes comprising a prion protein and a peptidyl prolyl isomerase chaperone, and method for producing and using them
US6962982B2 (en) 2001-06-22 2005-11-08 Roche Diagnostics Corporation Soluble complexes of target proteins and peptidyl prolyl isomerase chaperones and methods of making and using them
US7094884B2 (en) 2001-06-22 2006-08-22 Roche Diagnostics Corporation Soluble complexes of amylod β peptide and peptidyl prolyl isomerase chaperone and methods of making and using them
DK1402015T3 (da) 2001-06-22 2011-12-05 Hoffmann La Roche Opløseligt kompleks omfattende et retroviralt overfladeglycoprotein og FkpA eller SlyD
US7615530B2 (en) * 2003-08-29 2009-11-10 Artificial Cell Technologies, Inc. Immunogenic compositions and methods of use
JPWO2005040799A1 (ja) * 2003-10-29 2007-04-19 岡田 秀親 相補性ペプチド人工抗体
WO2007050569A2 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Donald Templeton Haynie Polypeptide multilayer films and methods
US7723294B2 (en) * 2007-04-02 2010-05-25 Artificial Cell Technologies, Inc. Polypeptide films and methods
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PT2691530T (pt) 2011-06-10 2018-05-10 Univ Oregon Health & Science Glicoproteínas e vectores recombinantes cmv
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4629783A (en) * 1985-04-29 1986-12-16 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
ATE116006T1 (de) * 1985-04-29 1995-01-15 Genetic Systems Corp Synthetische antigene zum nachweis von aids.
JP2702911B2 (ja) * 1985-09-11 1998-01-26 ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法
US4735896A (en) * 1986-03-04 1988-04-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptide and process of using same for the detection and diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions
GB8525615D0 (en) * 1985-10-17 1985-11-20 Hoffmann La Roche Polypeptides
WO1987006005A1 (en) * 1986-03-24 1987-10-08 Ortho Pharmaceutical Corporation Synthetic htlv-iii peptides, compositions and uses thereof
US4879212A (en) * 1986-04-02 1989-11-07 United Biomedical Inc. Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III
US4957737A (en) * 1986-05-27 1990-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. HTLV-III (LAV) envelope peptides
DE3789633T2 (de) * 1986-05-27 1994-08-04 Hoffmann La Roche HTLV-III(LAV)Decke-Peptide.
US4812556A (en) * 1987-05-18 1989-03-14 Virovahl Synthetic peptide antigen for the detection of HIV-2 infection
DE3901857A1 (de) * 1989-01-23 1990-07-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von hiv 2 antikoerpern

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．４０（１９８６）ｐ９−１７
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．６１（８）（１９８７）ｐ２６３９−２６４１
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１３（１９８５）ｐ２７７−２８１
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１３（１９８５）ｐ４５０−４５８

Also Published As

Publication number Publication date
DK104590D0 (da) 1990-04-27
US5981170A (en) 1999-11-09
DE3855479D1 (de) 1996-09-19
NO901899D0 (no) 1990-04-27
DE3855479T2 (de) 1997-01-02
JP3231666B2 (ja) 2001-11-26
ATE141286T1 (de) 1996-08-15
FI902143A0 (fi) 1990-04-27
NO901899L (no) 1990-04-27
NO302369B1 (no) 1998-02-23
JPH10101697A (ja) 1998-04-21
DK104590A (da) 1990-06-26
SE8704185D0 (sv) 1987-10-28
IL88224A0 (en) 1989-06-30
EP0396559B1 (en) 1996-08-14
WO1989003844A1 (en) 1989-05-05
EP0396559A1 (en) 1990-11-14
SE8704185L (sv) 1989-04-29
JPH03500648A (ja) 1991-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2818797B2 (ja) 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット
RU1802871C (ru) Способ определени антител к Н @ V - 1
US4879212A (en) Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III
US4812556A (en) Synthetic peptide antigen for the detection of HIV-2 infection
EP0449955B1 (en) Synthetic hiv-like peptides, their compositions and uses
EP0538283B2 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies
EP0326490B2 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
EP0605433B1 (en) Immunoassay for the simultaneous detection of hiv-1, hiv-2, htlv-i and htlv-ii antibodies
AU627701B2 (en) Hiv peptides, artificial hiv antigens and immunoassay kits
Modrow et al. Carrier bound synthetic oligopeptides in ELISA test systems for distinction between HIV-1 and HIV-2 infection
US6210874B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
EP0470205A1 (en) New human parvovirus peptides with disulfide bridge for immunization or diagnosis
CA1341594C (en) Synthetic peptides and mixtures therof for detecting hiv antibodies
US6218102B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
RU1825424C (ru) Способ обнаружени антител к ВИЧ-2
JPH0215098A (ja) Ｈｉｖ−１感染検出用合成ペプチド杭原、その組成物およびその使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080828

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080828

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090828

Year of fee payment: 11

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090828

Year of fee payment: 11