JP2709111B2 - 免疫系の感化及び腫瘍の治療のためのヘモシアニン及びアリルフォリンの使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫系の感化及び腫瘍の治療のために、ヘ
モシアニン及びアリルフォリンを使用することに関す
る。

〔従来の技術〕

ヘモシアニンは、多くの軟体動物及び節足動物の主要
な血清蛋白である。ヘモシアニンは酸素を運搬する役割
を有する、銅を含んだ青色の蛋白質である。血中におけ
るその濃度は20−120mg/mlである。ヘモシアニンは軟体
動物の中ではカタツムリ（腹足類）、イカ（頭足類）、
ヒザラガイ（多板類）、ツノガイ（堀足類）、及びイガ
イ（双殻類）に見出される。また節足動物の中では、サ
ソリ及びクモ（蛛形類）、カブトガニ（剣尾類）、エ
ビ、ロブスター、カニ及びザリガニ（甲殻類）、並びに
ムカデ類（多足類）に見出される。

アリルフォリンは昆虫（六脚類）の主要な蛋白質であ
り、フェニルアラニン及びチロシン含有量が高いことを
特徴としている。完全変態性の昆虫の幼虫及びサナギに
おいては、60mg/mlまでの濃度において見出され、また
完全変態類及び不完全変態類の成虫においてはより低い
濃度で見出される。各々の動物の種属のアリルフォリン
には、特別の名称がある（ショウジョウバエのdrosophi
lin,オオクロバエのcalliphorinその他）。アリルフォ
リンは、酸素を結合しない。物質の搬送体およびクチク
ラ成分としての種々の機能について議論がなされてきて
いる。例えば最近になって、単クローン抗体の研究の過
程において、アリルフォリンは構造的に節足動物のヘモ
シアニンと一致し、恐らくはその誘導体であることが見
出されている。

ヘモシアニン及びアリルフォリンは、特別な細胞にお
いて合成される。これらの細胞は、少なくともそれらの
生物発生の際に、血液循環中で自由に浮動することはな
く、血液と接触している特定の組織（心筋隔膜、腸腺、
脂肪体、眼窩その他）と関連している。ヘモシアニン及
びアリルフォリンはこれらの細胞中で濃縮され、血液中
へと放たれる。カタツムリの天然ヘモシアニンは円筒形
であり、ポリオウィルスと同じ体積の35nmのものであ
る。他の軟体動物のヘモシアニンは、この寸法の半分で
ある。節足動物のヘモシアニン及びアリルフォリンは構
造的に、側部の長さ10nmの立体形状に基づいている。こ
の立体形状はアリルフォリンについては半分のこともあ
り、他方ヘモシアニンについては、立体形状はしばしば
少数が会合してオリゴマーとなる。節足動物の最大のヘ
モシアニン（カブトガニ）は８つの立体形状からなり、
側部の長さが25nmと、大雑把にいってリボソームの寸法
に対応している。

節足動物のヘモシアニン及びアリルフォリンは約70,0
00−80,000の分子量を有し免疫学的に異なる８つまでの
サブユニットから成る。10nmの基本立体形状は、かかる
サブユニットから形成されたヘキソンである。各々の種
類のサブユニットは、ヘキソンが少数会合したヘモシア
ニンにおいて、特定の構造的役割を果たす。幾つかの完
全な分析手順が存在しており、また詳しいＸ線構造解析
モデルも存在する。アリルフォリンの遺伝的構造の詳細
の多くは公知である。

ヘモシアニン及びアリルフォリンは、アルカリpHに対
して透析し、二価のカチオンを除くことにより、サブユ
ニットへと分解することができる。軟体動物において
は、このサブユニットは７−８つの球状ドメインからな
り、これらのドメインの各々は、約55,000の分子量を有
している。各ドメインは、免疫学的に非常に異なってい
る。それらの内の一つは、完全に整列されている。各々
は活性な、銅２原子からなる酸素結合中心を有してい
る。元々の分子中には、このようなドメインが160個ま
で存在する。35nmの分子中におけるこれらの配列の詳細
は公知である。

上記の構造的な異質性、及び完全に異種の個体である
というその性質に基づき、軟体動物及び節足動物が旧口
動物として脊椎動物から分離されて以来少なくとも６億
年にわたり、ヘモシアニンは最も強力な抗原として知ら
れたものの一つであった。哺乳類においては、ヘモシア
ニンは非常に強力な抗血清の形成へと導き、T4/T8細胞
の割合をT4ヘルパー細胞の方へと動かし、適用部位にお
いては、局部的な紅斑及びマクロファージによる浸潤へ
と導く。このことは長年にわたって、キーホールリンペ
ットヘモシアニン（KLH）による免疫学的研究において
行われていた。

KLHは細胞障害性Ｔ細胞を生じさせ、また生体外及び
種々の実験動物の生体内で、顕著な抗腫瘍作用を草する
ことが公知である。このKLHの特性は、繰り返し証明さ
れてきている。KLHによる臨床治療は、表在性膀胱癌の
場合には再発率を大きく減少させ、一方で不快な副作用
はこれまで観察されてはおよず、また他の種類の腫瘍も
また確実に影響を受けている（ユリンシック（C.D.Juri
ncic）らの、Uroscope,Information u.Fortbilding i.
d.Urologie,1986年１号）。膀胱癌細胞に対するKLHの正
確な作用機構は、まだ完全には明らかになってはいな
い。しかしながら、作用部位はこれまでの化学療法的な
部位とは全く異なることが見出されている。化学療法の
結果というものは、部分的に矛盾している。細胞障害性
の薬剤がすべての尿路上皮細胞に作用するのに対し、KL
Hは生体全体のマクロファージを刺激する（カーチス
（J.E.Curtis）らの「キーホールリンペットヘモシアニ
ンに対する人体の免疫応答における人体の免疫応答の関
係における抗原投与量」Journal of Laboratory in Cli
n.Med.,78:61 1971年）。カーチスは、KLHが人体におけ
る細胞性の主要な遅延型過敏症及び主要な抗体反応の両
者をもたらすことを示している。

この有効な抗原は、かくしてＴ−リンパ球及びリンホ
カイン産生マクロファージを活性化する非特異性の刺激
剤として作用する。

〔発明の解決しようとする課題〕

本発明の課題は、等しいか又はより強い効果を有する
同等の種類の物質である、追加的な強力な抗原を入手可
能とすることである。

〔課題を解決するための手段〕

この課題は、免疫系の感化及び腫瘍の治療のために、
キーホールリンペットヘモシアニン以外のヘモシアニ
ン、及び／又はアリルフォリンを使用することにより解
決される。

本発明は、免疫系の感化及び腫瘍の治療のために、キ
ーホールリンペットヘモシアニン以外のヘモシアニン、
アリルフォリン、或いはこれらの組み合わせを使用する
ことを扱っている。

キーホールリンペットヘモシアニンが、表在性膀胱癌
について抗腫瘍作用を有することは公知である。好まし
くはオオクロバエ、マイマイ、タコ、ザリガニ、ガザ
ミ、カブトガニ、及びユーリペルマ（Eurypelma）の類
の動物から分離したヘモシアニン及びアリルフォリン
は、特に他の成分と結合した場合に、予期しない免疫的
及び腫瘍阻止作用を示した。

多くの種類のヘモシアニン及びアリルフォリンをそれ
らの腫瘍に対する増殖抑制作用について実験する過程に
おいて、驚くべきことに、各種の類の動物のヘモシアニ
ン及びアリルフォリンが、抗腫瘍作用における免疫的に
顕著な差異及び強度の異なりを示すことが見出された。
この観点に立ち、免疫系及び腫瘍の治療に対する好まし
い影響の故に、キーホールリンペットヘモシアニンに加
えて、他にも有用なヘモシアニン及びアリルフォリンの
類の物質を使用することができる。特に、キーホールリ
ンペットヘモシアニンの使用について知られた膀胱癌と
は別の種類の腫瘍も、これらの物質で治療しうる。既に
述べたように、ヘモシアニンの抗腫瘍作用の機構は知ら
れていない。しかしながらヘモシアニンは、免疫グロブ
リン及び主要組織適合性（抗原遺伝子）複合体即ちMHC
蛋白質の基本構造に驚くほど似ている部分的な構造を有
している。このことが、既に述べた免疫系に対する作用
をも含めて、これらが行う作用の表れ方の理由となって
いるのであろう。種々のヘモシアニンの抗腫瘍作用を、
メチルコラントレンで誘発されたマウスの繊維肉腫につ
いて試験した。得られたデータは、ヘモシアニン及びア
リルフォリンが免疫能力を予防的に増大させるという結
論を導いた。

ヘモシアニン及びアリルフォリンは、軟体動物又は節
足動物の組織から分離され、軟体動物又は節足動物の個
々の種類は、ユーリペルマ、カブトガニ、ザリガニ、カ
ザミ、オオクロバエ、マイマイ及びタコの類からなる群
から選択される。ここに述べた種類が、軟体動物或いは
節足動物の中で、免疫系の感化及び腫瘍増殖抑制作用を
有するヘモシアニン又はアリルフォリンが分離されうる
限定的な種類でないことは明らかである。

これらの種類から誘導された物質について試験して得
られた結果を表１に示す。抗腫瘍作用はいずれの場合に
おいても存在するが、例えばSDSWで変性した成分におけ
るものよりも、天然成分の方が明らかに強力であること
が見出された。

前述した種からヘモシアニン又はアリルフォリンを分
離するためには、四肢、血液小窩又は心臓を刺すことに
より軟体動物又は節足動物の血液を取り出し、血球を遠
心分離して凝固を防ぐ。かくして得られた上清即ちプラ
ズマから、調製用超遠心機においてペレット化しPBS中
に再溶解することにより、より小さい血リンパ成分から
ヘモシアニン又はアリルフォリンを精製する。生成され
るヘモシアニン又はアリルフォリン標品は、95％まで純
粋である。次いで陰イオン交換クロマトグラフィーを行
うことにより、100％の純度が得られる。別の血清蛋白
質からのアリルフォリンのさらなる精製はpH値9.6（グ
リシン/OH緩衝液、10mM EDTA）における透析によって達
成され、その場合アリルフォリンは次いでサブユニット
へと解離する。続いての陰イオン交換クロマトグラフィ
ーにより、100％純粋なアリルフォリンが得られ、これ
は中性の緩衝液（トリス／塩酸）に対して透析すること
によりヘキソンへと再構成される。

本発明で使用されるヘモシアニンは、好ましくはタラ
ンチュラ（Eurypelma californicum）、食用カタツムリ
（Helix pomatia）、マダコ（Octopus vulgaris）、川
ザリガニ（Astacus fluviatilis）、浜ガニ（Caucinus
maenas）或いはカブトガニ（Limulus polyphemus）の種
から得るべきである。

好ましいアリルフォリンは、アオバエ（Calliphora e
rythrocephala）から得られる。

上述した動物の種から作成される標品は、pH7.5の0.1
Mトリス／塩酸緩衝液において得られる。投与量は、実
験動物毎に一日当たり２部位（鼠径部又は腋窩）へと皮
下投与された、0.5mlPBS中の３×100μｇである。使用
された癌細胞は、生体内通路からとった遺伝子組成が同
じである腹水細胞（meth−Ａ−ascites cells）であっ
た。これらの細胞はトリプトファン・ブルーで試験され
た（２％陽性）。１×10⁵個の細胞が皮内に移植され
た。前述した好ましい動物の種の一つから取ったヘモシ
アニンによる治療は、＋２、＋５及び＋７日に皮下に10
0μｇを投与することによって行われた。表１は、腫瘍
の容積及び４週間後の生存率に関する結果を示してい
る。表１に示されているように、治療を行わないコント
ロール（対照標準）グループにおいては、10匹の実験動
物のうち腫瘍移植後28日の期間を生き延びたものはいな
かったが、これに対してヘモシアニンで治療された群に
おいては10匹の実験動物のうち２〜６匹がこの期間を生
き延び、28日後の腫瘍容積は、治療しないコントロール
グループにおける腫瘍容積の11〜34％であった。

28日後にける腫瘍容積の再成長は、７日目以降は治療
が打ち切られたという事実に起因するものであり、良好
な免疫的治療は約２週間だけ持続することが経験的に示
された。

完全なヘモシアニン又はアリルフォリンの抗原性ドメ
インを含むサブユニットもまた、有効に使用することが
できる。冒頭の部分で述べたように、軟体動物のヘモシ
アニンは７〜８つの球状ドメインからなるサブユニット
から構成されており、その各々は55,000程度の分子量を
有している。節足動物のヘモシアニン及びアリルフォリ
ンは、分子量70,000−80,000で免疫学的に異なる８つま
でのサブユニットを含む。ドメインのサブユニットは免
疫学的に非常に多様なものであるから、研究されたドメ
インのすべてのサブユニットが幾らかの有効性を示すと
いうことは驚くべきことである。

好ましいサブユニットは、タランチュラ、即ちユーリ
ペルマ・カリフォルニカム（Eurypelma californicum）
のヘモシアニンのａ、ｄ及び／又はｅである。しかし表
１に示されているように、腫瘍容積を減少させることに
おける効果が観察されているとはいえ、サブユニットｄ
の作用機構は未だ明らかではない。だがこの表１の結果
は明らかに、サブユニットｄについても効能が保証でき
るという結論を導くことを許すものである。

食用カタツムリ即ちヘリックス・ポマーティア（Heli
x pomatia）から取ったβｃヘモシアニンのドメインｄ
及び／又はｇという好ましい使用もまた、14〜21日後に
おける腫瘍の増殖阻止作用を示している。

タランチュラ（Eurypelma californicum）のヘモシア
ニンのサブユニットａはまた、キモトリプシンによって
分断することもできる。分断された混合物から、23個の
アミノ酸からなるペプチド断片を得ることができ、これ
が必要とされる種類の免疫学的効果を奏するものであ
る。

上記した23個のアミノ酸からなるペプチドは、好まし
くはガザミ又はタコから取ったヘモシアニン、或いはオ
オクロバエから取ったアリルフォリンに対して結合され
る。これらの23個のアミノ酸を含む結合したペプチドサ
ブユニットの作用は表１に示されており、本発明のこの
形態が特に大きな効果を有することが看取されうる。即
ち腫瘍の大きさの劇的な減少に加えて、10匹の実験動物
のうち７又は８匹という高い生存率が観察されるからで
ある。

完全なヘモシアニン又はアリルフォリン、或いは前述
したサブユニットが、混合物中において、或いは化学的
又は物理的に他の成分と結合した場合には、必要とされ
る効果の強化も達成することができる。この場合の他の
成分とは、ウイルス又はウイルスの構成成分、バクテリ
ア又はバクテリア構成成分、菌類又はその構成成分、或
いは寄生動物又はその構成成分からなるものである。こ
のような結合は、直接接種を可能ならしめるという利点
を有している。

本発明に従って使用されるヘモシアニン及びアリルフ
ォリン、或いはそれらのサブユニットのさらなる好まし
い使用は、抗体を増加し、又は結合される抗原に対する
細胞免疫系の反応性を増すという目的で、投与前に抗原
と物理的又は化学的に結合させることにある。

前述した物質が腹水癌細胞（meth−Ａ−ascites tumo
r cells）の断片と結合された場合には、特に強い効果
が達成される。表１に示されているように、この結合に
より、多大の腫瘍減少効果と共に、生存率を増大させる
効果も達成されるものである。

〔実施例〕

以下の例により、本発明をさらに詳細に説明する。

例１ ヘモシアニン及びアリルフォリンの分離 四肢、血液小窩又は心臓を刺すことにより軟体動物又
は節足動物の血液を取り出し、血球を遠心分離して凝固
を防いだ。上清（＝プラズマ）から、調製用超遠心機に
おいてペレット化し次いでPBS（リン酸緩衝食塩水）中
に再溶解することにより、より小さい血リンパ成分から
ヘモシアニン又はアリルフォリンを精製した。生成され
たヘモシアニン標品は、95％以上まで純粋であった。次
いで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことによ
り、100％の純度が得られた。ペレット化されたアリル
フォリンはより不純物を含んでいたが、これはアリルフ
ォリンが別の血清蛋白質を緩く結合していたためであ
る。このような結合は、pH値9.6（グリシン緩衝液、10m
M EDTA）においてアリルフォリンをサブユニットへと解
離することにより切断できた。続いての陰イオン交換ク
ロマトグラフィーにより、100％純粋なアリルフォリン
が生成され、これは中性の緩衝液（トリス／塩酸）に対
して透析することによりヘキソンへと再構成された。

例２ 種々のヘモシアニンの抗腫瘍効果を、メチルコラント
レンで誘発されたマウスの繊維肉腫について試験した。
この手本については、例えばムンダー（P.G.Munder）他
「生体内及び生体外における異種の物質の抗腫瘍作用」
onkologie 5,4−7,1982年に記載がある。アオバエ即ち
カリフォーラ・エリスロセファーラ（Calliphora eryth
rocephala）のアリルフォリン、及び次の動物のヘモシ
アニンが使用された。食用カタツムリ（エスカルゴ）即
ちヘリックス・ポマーティア（Helix pomatia）、マダ
コ即ちオクトパス・ヴルガリス（Octopus vulgaris）、
川ザリガニ即ちアスタカス・フルヴィアティリス（Asta
cs fluviatilis）、浜ガニ即ちカルシヌス・マエナス
（Carcinus maenas）、カブトガニ即ちリムルス・ポリ
フェムス（Limulus polyphemus）及びタランチュラ即ち
ユーリペルマ・カリフォルニカム（Eurypelma californ
icum）である。すべての標品は、pH7.5である0.1モルの
トリス／塩酸緩衝液中にあった。投与量は、実験動物毎
に一日当たり２部位（鼠径部又は腋窩）へと皮下投与さ
れた、0.5mlPBS中の３×100μｇであった。使用された
癌細胞は、生体内通路から取ったのと遺伝的組成が同様
の腹水細胞（meth−Ａ−ascites cells）であった。こ
れらの細胞は、トリプトファン・ブルーで試験された
（２％陽性）。１×10⁵個の細胞が皮内に移植された。
ヘモシアニンによる治療は、＋２、＋５及び＋７日に皮
下に100μｇを投与することによって行われた。表１
は、腫瘍の容積及び４週間後の生存率に関する結果を示
している。看取されうるように、治療を行わないコント
ロール（対照標準）グループにおいては、10匹の実験動
物のうち腫瘍移植後28日の期間を生き延びたものはいな
かったが、これに対してヘモシアニンで治療された群に
おいては10匹の実験動物のうち２〜６匹がこの期間を生
き延び、28日後の腫瘍容積は、治療しないコントロール
グループにおける腫瘍容積の11〜34％であった。記録さ
れた最小の効果は甲殻類のヘモシアニンについてのもっ
であったが、これはサブユニットの種類の数が少なく、
従って抗原デテルミナントの数が少ないことに起因して
いる（マークル（J.Markl）「節足動物からの呼吸蛋白
質ヘモシアニンにおける構造的に異なるサブユニットの
進化と機能」Biol.Bull.171,90−115,1986年参照）。

例３ ａ）タランチュラ即ちユーリペルマ・カリフォルニカム
（Eurypelma californicum）のヘモシアニンのサブユニ
ットａ、ｄ並びにｅと、食用カタツムリ即ちヘリックス
・ポマーティア（Helix pomatia）のβｃ−ヘモシアニ
ンのドメインｄ及びｇを、公知の方法（マークル（J.Ma
rkl）他「クモのヘモシアニン、IV、ユーリペルマ・カ
リフォルニカムのヘモシアニンのポリペプチド鎖の比
較」、Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.,360,639−650,
1979年；ロンティー（R.Lontie）他「ヘリックス・ポマ
ーティアのヘモシアニンの成分、機能ユニット及び活性
部位」、Life Chem.Rep.Suppl.1,109−120,1983年）に
より、天然の状態で分離し、これらの抗腫瘍作用をメス
−Ａ−肉腫（meth−Ａ−sarcoma）モデルについて試験
した。

ｂ）タランチュラのヘモシアニンのサブユニットｄ及び
カタツムリのヘモシアニンのドメインｄはまた、SDSで
変性した状態においても使用した（２％のSDS中におけ
る変性。SDSはマウスに投与する前に透析によて0.1％と
希釈した）。

ｃ）タランチュラのヘモシアニンの天然サブユニットｄ
を限界トリプシン溶解（トリプシノリシス）により、大
きさが殆ど同じで分子量が34,000及び37、000の二つの
断片と切断し、これらの断片を文献記載のようにして分
離した（シャータウ（Schartau）他「クモのヘモシアニ
ン、XIX、ユーリペルマ・カリフォルニカムのヘモシア
ニンからのサブユニットｄの完全なアミノ酸配列および
ｅ鎖に対する比較」Hoppe-Seyler'sZ.Physiol.Chem.,36
4,1383−1409,1984年）。これら二つの変性されたペプ
チド断片をｄTn34及びｄTn37と呼ぶこととし、これらも
メス−Ａ−肉腫（meth−Ａ−sarcoma）モデルについて
試験した。

すべての結果は、表１に示されている。何れの場合に
ついても抗腫瘍作用は存在したが、変性された成分より
も天然成分の方が明らかに顕著な結果が記録された。ク
モから取ったサブユニットｄの場合には、完全なポリペ
プチド鎖とＣ末端ペプチド断片ｄTn37の間には明確な差
異は観察されなかったが、一方Ｎ末端ペプチド断片ｄTn
34の作用は明らかに低かった。全体として、分離された
成分の作用は、例２による完全なヘモシアニンの作用よ
りも明らかに弱いものであった。

ｄ）最後に23個のアミノ酸からなるペプチドを、最近の
文献（マークル（J.Markl）「タランチュラのヘモシア
ニンに対する単クローン抗体の特徴付け」、Verh.Dtsc
h.Zool.Ges.80,1987年）に記載されたシーケンス結合単
クローン抗体Ec−８を利用して、サブユニットａのキモ
トリプシン切断混合物から免疫親和性クロマトグラフィ
ーにより分離した。これは特にタランチュラのサブユニ
ットａに対して選択性を有すると共に、Ec−８に対応す
る抗原デテルミナントを担持している。この分離された
抗原をガザミ（Carcinus）及びタコ（Octopus）のヘモ
シアニン、並びにオオクロバエ（Calliphora）のアリル
フォリンに対して標準的な方法（パルフレイマン（J.W.
Palfreyman）らの「小さな合成オリゴペプチドを免疫源
として使用してポリペプチド特異抗血清を製造するため
のガイドライン」、J.Immunol.Meth.75,383−393,1984
年）により結合し、この形態においてメス−Ａ−肉腫
（meth−Ａ−sarcoma）モデルについて試験した。これ
により、Ec−８抗原決定基が発生しないこれら３種の担
体分子の抗腫瘍作用が高められた（表１）。

例４ ヘモシアニン及びアリルフォリンの診断的評価の可能
性について、ユーリペルマ（タランチュラ）、カルシヌ
ス（浜ガニ）及びマダコのヘモシアニン、並びにカリフ
ォーラ（アオバエ）のアリルフォリンでもって試験し
た。この試験は、モルモットにネオ抗原として皮下注射
した後に抗体の力価（タイター）を測定することにより
行った、血球機能アッセイである。２匹のコントロール
（対照標準）モルモットを、シクロスポリンで免疫反応
を抑制した（6.25mg/kg体重、１日２回を30日）２匹の
モルモットと比較した。この方法に関しては、アムロー
（P.O.Amlot）らの「生体内における蛋白質（KLH）及び
多糖類（DNP−Ficoll）ネオ抗原に対する人体の免疫反
応：シクロスポリンを投与した骨髄移植患者と比較した
通常の患者」Clin.Exp.Immunol.64,125−135,1986年を
参照されたい。抗体の力価は、二次抗血清としてアルカ
リ性フォースファターゼと結合された抗（モルモットIg
M）及び抗（モルモットIgG）を使用して、ミクロタイタ
ーウェル当たりのヘモシアニン又はアリルフォリンを1n
gとし、ELISAにより検出した。試験された４つの物質
は、アムロー（P.O.Amlot）らにより要求されたすべて
の基準を満足し、免疫欠陥の診断のために適しているこ
とが証明された。かくして、免疫欠陥及び他の免疫的パ
ラメーターの診断のためのKLHの非常に良好な有用性
は、驚くべきことにすべてのヘモシアニン及びアリフォ
リンについても当てはまることが明らかになった。

例５ タランチュラ即ちユーリペルマ、浜ガニ即ちカルシヌ
ス、マダコ即ちオクトパスのヘモシアニン、及びアオバ
エ即ちカリフォーラのアリルフォリンを、文献記載の方
法（パルレイマン（J.W.Palreyman）他「小さな合成オ
リゴペプチドを免疫源として使用してポリペプチド特異
抗血清を製造するためのガイドライン」J.Immunol.Met
h.75,383−393,1984年）；ダーメン（Jan Dahmen）他
「血液型P₁抗原の末端多糖類（α−Ｄ−Gal−（１−＞
４）−β−Ｄ−Gal−（１−＞４）−β−Ｄ−GLcNAc）
部分のスペーサー・アーム、脂質及びエチルグリコシド
の合成；ネオ糖蛋白質の調製」Carbohyd rate Research
129,63−71,1984年；ダーメン（Jan Dahmen）他「人尿
中に見出される四糖（α−Ｄ−GLc−（１−＞６）−α
−Ｄ−GLc−（１−＞Ｄ−GLc−（１−＞４）−Ｄ−GL
c）のエチルグリコシド、及びプルランからのスペーサ
ー・アーム脂質の合成；ネオ糖蛋白質の調製」Carbohyd
rate Research 127,27−33,1984年；ダーメン（Jan Dah
men）他「血液型P^k抗原の多糖類部分（α−Ｄ−Gal−
（１−＞４）−β−Ｄ−Gal−（１−＞４）−β−Ｄ−G
Lc）のスペーサー・アーム、脂質及びエチルグリシドの
合成：ネオ糖蛋白質の調製」Carbohydrate Research 12
7,15−25,1984年；ダーメン（Jan Dahmen）他「グリコ
シド合成における２−臭化エチルグリコシド：α−Ｌ−
Fuc−（１−＞２）−Ｄ−Gal及びβ−Ｄ−Gal−（１−
＞４）−Ｄ−GLcNAcを含む糖蛋白質の調製」Carbohydra
te Research 125,237−245,1984年；レミュー（R.U.Lem
ieux）、ベイカー（D.A.Baker）及びバンドル（D.R.Bun
dle）「炭水化物特異抗体の生成のための方法論」Can.
J.Biochem.55,1977年；アプリン（J.D.Aplin）およびリ
ストン・ジュニア（J.C.Wriston,Jr.）「複合炭水化
物、或いは蛋白質及び脂質の調製、特性及び適用」CRC
Critical Reviews in Biochemistry,pp.259,1981年；ピ
ント（B.M.Pinto）及びバンドル（D.R.Bundle）「人工
抗原としての使用からの複合糖質の調製：単純化した手
順」Carbohydrate Research 124,313−318,1984年）に
より、部分的に以下に示す市販の物質と結合し、また部
分的に他の源から取った物質と結合した。

ａ）ガングリオシド GM2/GS3 ｂ）メス−Ａ−腹水腫瘍細胞のキモトリプシン断片混合
物 ｃ）ウイルス断片（ヘルペスウイルス） ｄ）バクテリア断片（BCG、ムラミルジペプチド） ｅ）クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococc
us neoformans）の菌類断片 ｆ）住血吸虫すなわちシストソーマ・マンソーニ（Schi
stosoma mansoni）のシストソームラ（Schistosomula）
表面抗原 マウスに対して投与することにより（６週間以上にわ
たる３回の標準的な免疫化）、遺伝子組成が同じメス−
Ａ−腹水断片と共に、強力なハプテン特異抗血清が得ら
れた。一方ではヘモシアニン自体の免疫転形及び抗腫瘍
機構を通じて作用し、また他方では特異な抗ハプテン抗
体を通じて作用する、組み合わせでの治療効果を示すた
めに、次の手順が行われた。ユーリペルマのヘモシアニ
ンをメス−Ａ−腹水から取った腫瘍細胞断片に結合し、
メス−Ａ−肉腫癌モデルについて試験した。表１の結果
は、純粋なユーリペルマのヘモシアニンによる処置と比
較しての治療効果の増大を示している。28日後において
も10匹のうち８匹が生存していた。従って非特異なアジ
ュバントとしてのヘモシアニンと特異な抗原成分との組
み合わせは、より有効な接種物であることが証明された
（原理に関しては、シューマッヒャー（V.Schirrmache
r）「最小の後遺症の免疫コントロールを達成する手段
としての腫瘍特異Ｔ細胞の術後活性化」ゼネラル・モー
タース癌研究財団、Accomplishments in Cncer Researc
h 1986,フオートナー及びローズ編の218−232頁を参
照）。

例６ 免疫系の一般的な強化を示すために、01.mgの食用カ
タツムリのヘモシアニンを３回皮下投与することによ
り、10匹のマウスを６週間にわたり免疫化した。さらに
３週間の後、メス−Ａ−腹水癌細胞を例２の如くにして
移植し、次いでマウスをガザミ即ちカルシヌスのヘモシ
アニンで治療した（軟体動物と節足動物のヘモシアニン
の間には、免疫的な交叉反応はない）。これとは別に、
10匹のマウスをオオクロバエ即ちカリフォーラのアリル
フォリンで予め処置し、癌細胞の移植後にタコ即ちオク
トパスのヘモシアニンで処置した。表１に示されている
如く、これらの処置の結果は何れの場合にも、予備処置
をしない動物の場合よりも著しく良好であった。カブト
ガニ、ユーリペルマ、ガザミ、タコ及びマイマイのヘモ
シアニン、並びにオオクロバエのアリルフォリンによる
モルモットの免疫化実験による測定は、投与後における
マクロファージ及びT4ヘルパー細胞の大幅な膨張を示し
ていた。全体として、これらのデータから、ヘモシアニ
ン及びアリルフォリンが免疫の能力を予防的に増大する
という結論が導かれる。

例７ 細胞免疫系の反応を得る目的で、ハプテン担体（ハプ
テンとしてEc−８特異ペプチド断片）としてガザミ及び
タコのヘモシアニン並びにオオクロバエのアリルフォリ
ンを使用することは、例３の最後の部分において既に述
べた。これと平行して、このハプテンをこれら３つの担
体と共に２匹のモルモットに注射した（皮下に0.1mgを
３回、６週間にわたり）。結果として、各々の場合にお
いて、担体分子に対するのみでなく、ハプテンに対して
も強力な抗血清が得られた。ハプテンのみを注射された
２匹の対照標準としたモルモットは、陰性反応を示し
た。陽性のモルモットにおけるハプテンの反応は、担体
分子のものとは容易に免疫的に区別され得た。なぜなら
それは、タランチュラに特異的なエピトープ（抗原決定
基）であったからである。ハプテンを標的とする免疫グ
ロブリンIgG断片は、タランチュラのヘモシアニンと結
合された臭化シアンのセファローズ（Sepharose）CL−4
B上での親和性精製により分離され、この免疫ブロッテ
ィング（immune blot）は、サブユニットａとの高度に
特異な反応を示した。この課題に関してのさらなるデー
タは、例４及び例５によって与えられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/64 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ (72)発明者 トマス・スティーフェル ドイツ連邦共和国7000シュツットガルト １，シュタインコップシュトラーセ・22 (72)発明者 ハラルド・ポルヒェー ドイツ連邦共和国7000シュツットガルト 61，ウールバハーシュトラーセ・７ (72)発明者 ユルゲン・マークル ドイツ連邦共和国6900ハイデルベルク, ヒルダシュトラーセ・24 (56)参考文献 Ｈｕｍ．Ｉｍｎｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ. ４，Ｎｏ．３，（1982）ｐ．197−208 Ｂｏｌｌ．Ｓｏｃ．Ｉｔ．Ｂｉｏｌ. Ｓｐｅｒ．，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．14, （1981）ｐ．1517−1523 Ｉｎｔ Ｃｏｇ．Ｓｅｒ．−Ｅｘｃｅ ｒｐｔａ Ｍｅｄ．，（1986）715（Ｐ ｒｏｇ．Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ．Ｒｅ ｓ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．２）ｐ．37− 45 Ｐｒｅｓｅｎｔ ＳｔａｔｕｓＮｏｎ −Ｔｏｘｉｔｉｃ Ｃｏｎｅｃｅｐｔｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ. （1987）ｐ．98−106

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘモシアニン、アリルフォリン、又はこれ
   らの組み合わせであって、ユーリペルマ（Eurypelm
   a）、カブトガニ（Limulus）、ザリガニ（Astacus）、
   ガザミ（Carcinus）、オオクロバエ（Calliphora）、マ
   イマイ（Helix）及びタコ（Octopus）の種からなる群か
   ら選択される軟体動物又は節足動物の組織から分離され
   たものを活性成分として含む腫瘍治療剤。
2. 【請求項２】ユーリペルマ・カリフォルニカム（Eurype
   lma californicum）のヘモシアニンが使用される、請求
   項１記載の腫瘍治療剤。
3. 【請求項３】ヘリックス・ポマーティア（Helix pomati
   a）のヘモシアニンが使用される、請求項２記載の腫瘍
   治療剤。
4. 【請求項４】オクトパス・ヴルガリス（Octopus vulgar
   is）のヘモシアニンが使用される、請求項１記載の腫瘍
   治療剤。
5. 【請求項５】アスタカス・フルヴィアティリス（Astacu
   s fluviatilis）のヘモシアニンが使用される、請求項
   １記載の腫瘍治療剤。
6. 【請求項６】カルシヌス・ミアナス（Carcinus meana
   s）のヘモシアニンが使用される、請求項１記載の腫瘍
   治療剤。
7. 【請求項７】リムルス・ポリフェムス（Limulus polyph
   emus）のヘモシアニンが使用される、請求項１記載の腫
   瘍治療剤。
8. 【請求項８】カリフォーラ・エリスロセファーラ（Call
   iphora erythrocephala）のアリルフォリンが使用され
   る、請求項１記載の腫瘍治療剤。
9. 【請求項９】ヘモシアニン又はアリルフォリンのサブユ
   ニットが使用される、請求項１記載の腫瘍治療剤。
10. 【請求項１０】サブユニットが抗原性ドメインを含むも
    のである請求項９記載の腫瘍治療剤。
11. 【請求項１１】約55,000の分子量を有する軟体動物のヘ
    モシアニンサブユニットの球状ドメインの一つが使用さ
    れる、請求項９又は10記載の腫瘍治療剤。
12. 【請求項１２】約70,000−80,000の分子量を有する節足
    動物のヘモシアニン又はアリルフォリンのサブユニット
    の一つが使用される、請求項９又は10記載の腫瘍治療
    剤。
13. 【請求項１３】ユーリペルマ・カリフォルニカム（Eury
    pelma californicum）のヘモシアニンのサブユニット
    ａ、ｄ、ｅ又はその組み合わせが使用される、請求項12
    記載の腫瘍治療剤。
14. 【請求項１４】キモトリプシンによるサブユニットａの
    切断により得られた、23個のアミノ酸からなるペプチド
    断片が使用される、請求項13記載の腫瘍治療剤。
15. 【請求項１５】23個のアミノ酸からなるペプチド断片が
    ガザミ（Carcinus）又はタコ（Octopus）からのヘモシ
    アニン、或いはオオクロバエ（Calliphora）からのアリ
    ルフォリンに対して結合される、請求項14記載の腫瘍治
    療剤。
16. 【請求項１６】ヘリックス・ポマーティア（Helix poma
    tia）のβｃ−ヘモシアニンのドメインｄ、ｇ又はその
    組み合わせが使用される、請求項12記載の腫瘍治療剤。
17. 【請求項１７】ヘモシアニン、アリルフォリン又はその
    組み合わせが、ウイルス又はウイルスの構成成分、バク
    テリア又はバクテリア構成成分、菌類又はその構成成
    分、或いは寄生動物又はその構成成分に対して構造的な
    類似性を示し、またはこれらと混合されるか、化学的又
    は物理的にこれらと結合される、請求項１記載の腫瘍治
    療剤。
18. 【請求項１８】結合される物質は直接接種に適したもの
    である、請求項17記載の腫瘍治療剤。
19. 【請求項１９】ヘモシアニン、アリルフォリン又はその
    組み合わせは、免疫反応を増強するため投与前に抗原と
    物理的又は化学的に結合される、請求項１記載の腫瘍治
    療剤。
20. 【請求項２０】結合はメス−Ａ−腹水断片（meth−Ａ−
    ascites fragments）において行われる、請求項19記載
    の腫瘍治療剤。