JP2706697B2 - 動物における筋肉組織の増大 - Google Patents
動物における筋肉組織の増大Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明はｃ−ski遺伝子に関する。特に、本発明はニ
ワトリｃ−skiタンパク質をコード化するDNA断片、該DN
A断片を含むDNA構築物およびそれにより形質転換された
細胞に関する。本発明はさらに、筋肉の大きさが増大し
た動物に関する。
ワトリｃ−skiタンパク質をコード化するDNA断片、該DN
A断片を含むDNA構築物およびそれにより形質転換された
細胞に関する。本発明はさらに、筋肉の大きさが増大し
た動物に関する。
背景的情報 ｖ−ski腫瘍遺伝子を含むウイルスは試験管内での形
態学的形質転換を引き起こすことができるだけでなく、
筋原性分化を誘導することも可能である（Stavnezer等,
1981,J.Virol.39,920〜934;Li等,1986,J.Virol.57,1065
−1072;Stavnezer等,1986,J.Virol.57,1073−1083;Colm
enaresおよびStavnezer,1989,Cell 59,293−303）。ｃ
−ski cDNAを保持・発現するウイルスもまた病巣および
筋原性分化を誘導する（Sutrave等,1990,Mol.Cell.Bio
l.10,3137−3144）。このことは、skiの２つの公知作
用、すなわち形質転換および分化は矛盾した特性である
ように考えられるので、ski腫瘍遺伝子が二元機能性で
ある可能性を示唆する。ｖ−skiプローブを用いて、ｃ
−skiに対するゲノムクローンが単離され、そして部分
的に配列決定されている（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.
Biol.9,4038−4045）。一方のスプライシングにより関
連づけられるｃ−skiの２形態、ならびに様々なｖ−ski
およびｃ−ski欠失突然変異体の比較により、形質転換
および分化に必要なskiの部分はかなり類似しているこ
とが示された。これらの結果は、形質転換を引起し、そ
して分化を誘導するｃ−skiおよびｖ−skiの能力が２つ
の分断した機能というよりもむしろskiの単一特性の関
連した面であり得ることを示唆する。
態学的形質転換を引き起こすことができるだけでなく、
筋原性分化を誘導することも可能である（Stavnezer等,
1981,J.Virol.39,920〜934;Li等,1986,J.Virol.57,1065
−1072;Stavnezer等,1986,J.Virol.57,1073−1083;Colm
enaresおよびStavnezer,1989,Cell 59,293−303）。ｃ
−ski cDNAを保持・発現するウイルスもまた病巣および
筋原性分化を誘導する（Sutrave等,1990,Mol.Cell.Bio
l.10,3137−3144）。このことは、skiの２つの公知作
用、すなわち形質転換および分化は矛盾した特性である
ように考えられるので、ski腫瘍遺伝子が二元機能性で
ある可能性を示唆する。ｖ−skiプローブを用いて、ｃ
−skiに対するゲノムクローンが単離され、そして部分
的に配列決定されている（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.
Biol.9,4038−4045）。一方のスプライシングにより関
連づけられるｃ−skiの２形態、ならびに様々なｖ−ski
およびｃ−ski欠失突然変異体の比較により、形質転換
および分化に必要なskiの部分はかなり類似しているこ
とが示された。これらの結果は、形質転換を引起し、そ
して分化を誘導するｃ−skiおよびｖ−skiの能力が２つ
の分断した機能というよりもむしろskiの単一特性の関
連した面であり得ることを示唆する。
skiタンパク質の生化学的機能についてはあまり知ら
れていない。研究されたｃ−skiおよびｖ−skiの生物学
的に活性な形態の全ては主として核内に局在している
（Barkas等,1986,Virology 151,131−138;Sutrave等,19
90,Mol.Cell.Biol.10,3137−3144）。ｃ−skiタンパク
質がニワトリ細胞内で過剰に発現されると、異なる形態
のｃ−skiはそれらの核内での局在が異なるが、しかし
これらの相違に重要性があるかもしれないが、依然とし
て不明である。クロマチンが細胞分裂のために濃縮する
際に、過剰発現したｃ−skiタンパク質は濃縮クロマチ
ンと凝縮される（Sutrave等,1990,Mol.Cell.Biol.10,31
37−3144）。生化学的研究により、ｃ−skiの少なくと
も１つの形態がその他のタンパク質の存在下にDNAに結
合し得ることもまた示された（Nagase等,1990,Nucl.Aci
ds Res.18,337−343）。
れていない。研究されたｃ−skiおよびｖ−skiの生物学
的に活性な形態の全ては主として核内に局在している
（Barkas等,1986,Virology 151,131−138;Sutrave等,19
90,Mol.Cell.Biol.10,3137−3144）。ｃ−skiタンパク
質がニワトリ細胞内で過剰に発現されると、異なる形態
のｃ−skiはそれらの核内での局在が異なるが、しかし
これらの相違に重要性があるかもしれないが、依然とし
て不明である。クロマチンが細胞分裂のために濃縮する
際に、過剰発現したｃ−skiタンパク質は濃縮クロマチ
ンと凝縮される（Sutrave等,1990,Mol.Cell.Biol.10,31
37−3144）。生化学的研究により、ｃ−skiの少なくと
も１つの形態がその他のタンパク質の存在下にDNAに結
合し得ることもまた示された（Nagase等,1990,Nucl.Aci
ds Res.18,337−343）。
成長および発達（もしあるならば）におけるその役割
に関するか、または作用機作への直接的洞察を得るよう
なｃ−skiの正常機能を推論することを、利用可能なデ
ータは可能にはしない。
に関するか、または作用機作への直接的洞察を得るよう
なｃ−skiの正常機能を推論することを、利用可能なデ
ータは可能にはしない。
発明の要約 本発明の目的は、単離され、そして特徴づけられたｃ
−ski cDNAを提供することである。
−ski cDNAを提供することである。
本発明の別の目的は、動物において筋肉の大きさを増
大する遺伝子を提供することである。
大する遺伝子を提供することである。
本発明の別の目的は、増大された筋肉の大きさおよび
減少された脂肪組織を有する家畜を提供することであ
る。
減少された脂肪組織を有する家畜を提供することであ
る。
本発明のその他の目的は、重大の筋肉障害または筋肉
変性疾病に苦しむ患者の治療を提供することである。
変性疾病に苦しむ患者の治療を提供することである。
本発明の種々のその他の目的および利点は本発明に関
する図面および以下の記載から明らかとなるであろう。
する図面および以下の記載から明らかとなるであろう。
一実施態様において、本発明はニワトリｃ−skiタン
パク質をコード化するDNA断片または該断片に相補的なD
NA断片に関する。
パク質をコード化するDNA断片または該断片に相補的なD
NA断片に関する。
別の実施態様において、本発明はニワトリｃ−skiタ
ンパク質をコード化するDNA断片およびベクターを含むD
NA構築物に関する。その他の実施態様において、本発明
はｃ−skiの機能を有する先端切除ニワトリｃ−skiタン
パク質をコード化するDNA断片およびベクターを含むDNA
構築物に関する。本発明はまた、上記の２種のDNA構築
物のいずれかで安定に、該構築物にコード化されたタン
パク質の発現を可能にするように形質転換された宿主細
胞に関する。
ンパク質をコード化するDNA断片およびベクターを含むD
NA構築物に関する。その他の実施態様において、本発明
はｃ−skiの機能を有する先端切除ニワトリｃ−skiタン
パク質をコード化するDNA断片およびベクターを含むDNA
構築物に関する。本発明はまた、上記の２種のDNA構築
物のいずれかで安定に、該構築物にコード化されたタン
パク質の発現を可能にするように形質転換された宿主細
胞に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は筋肉の大きさ
が増大した動物に関し、その動物の細胞の全てが、動物
または動物の先祖に導入された、skiタンパク質をコー
ド化するDNA断片およびベクターを含むDNA構築物を含有
する。DNA断片は全体のタンパク質または先端が切断さ
れた変形物をコード化し得る。
が増大した動物に関し、その動物の細胞の全てが、動物
または動物の先祖に導入された、skiタンパク質をコー
ド化するDNA断片およびベクターを含むDNA構築物を含有
する。DNA断片は全体のタンパク質または先端が切断さ
れた変形物をコード化し得る。
その他の実施態様において、本発明は筋肉の大きさが
増大した動物に関し、その動物の細胞の全てが、動物ま
たは動物の先祖に導入された、skiの機能を有する先端
切除skiタンパク質をコード化するDNA断片およびベクタ
ーを含むDNA構築物を含有する。
増大した動物に関し、その動物の細胞の全てが、動物ま
たは動物の先祖に導入された、skiの機能を有する先端
切除skiタンパク質をコード化するDNA断片およびベクタ
ーを含むDNA構築物を含有する。
別の実施態様において、本発明は、本発明のDNA構築
物のタンパク質が発現されて、筋肉成長が誘導されるよ
うな条件下で、本発明のDNA構築物を筋肉に伝達するこ
とからなる、筋肉成長を刺激するか、または筋肉変性を
防止する方法に関する。
物のタンパク質が発現されて、筋肉成長が誘導されるよ
うな条件下で、本発明のDNA構築物を筋肉に伝達するこ
とからなる、筋肉成長を刺激するか、または筋肉変性を
防止する方法に関する。
その他の実施態様において、本発明は、本発明のDNA
構築物のタンパク質が発現されて、治療が達成されるよ
うな条件下で、本発明のDNA構築物を影響を受けた筋肉
に伝達することからなる、筋肉変性疾病を治療する方法
に関する。
構築物のタンパク質が発現されて、治療が達成されるよ
うな条件下で、本発明のDNA構築物を影響を受けた筋肉
に伝達することからなる、筋肉変性疾病を治療する方法
に関する。
図面の簡単な説明 図1:c−ski cDNAクローンの構造。
cDNAの長さは一定の率で拡大して描かれ、そして制限
部位が示されている。ｖ−skiは比較のために示されて
いる。ｖ−skiにおけるドットを付した四角はウイルスS
KVを鋭敏に形質転換する際のgag−ski融合のgag領域を
示す。A,B,CおよびＤは、S1ヌクレアーゼ保護分析のた
めの一本鎖プローブを生成するために使用される領域を
示す。矢印の次の数字はエキソン番号に一致する。
部位が示されている。ｖ−skiは比較のために示されて
いる。ｖ−skiにおけるドットを付した四角はウイルスS
KVを鋭敏に形質転換する際のgag−ski融合のgag領域を
示す。A,B,CおよびＤは、S1ヌクレアーゼ保護分析のた
めの一本鎖プローブを生成するために使用される領域を
示す。矢印の次の数字はエキソン番号に一致する。
図2:FB29型のcDNAの完全コード配列および部分的コー
ド領域。
ド領域。
これは、FB29の５′末端配列がFB28およびCELクロー
ンの５′末端に類似していると仮定している。↑はFB28
およびCELが異なっている部位を示す。CELクローンにだ
け見いだされた25塩基は示されていない。↓はｖ−ski
の境界を示す。エキソン境界には番号が付され、そして
交互にスプライシングされたエキソンは四角で囲まれて
いる。ｃ−skiとｖ−skiの一個の塩基およびアミノ酸の
変化もまた破線の四角で囲まれている。翻訳停止コドン
は太線で囲まれている。可能性のあるポリアデニル化シ
グナルは太く下線が付されている。mRNA安定性に包含さ
れ得るATTTA配列を含むATリッチ領域は破線で下線が付
されている。
ンの５′末端に類似していると仮定している。↑はFB28
およびCELが異なっている部位を示す。CELクローンにだ
け見いだされた25塩基は示されていない。↓はｖ−ski
の境界を示す。エキソン境界には番号が付され、そして
交互にスプライシングされたエキソンは四角で囲まれて
いる。ｃ−skiとｖ−skiの一個の塩基およびアミノ酸の
変化もまた破線の四角で囲まれている。翻訳停止コドン
は太線で囲まれている。可能性のあるポリアデニル化シ
グナルは太く下線が付されている。mRNA安定性に包含さ
れ得るATTTA配列を含むATリッチ領域は破線で下線が付
されている。
図3:cDNA配列分析から予測されるようなｃ−ski遺伝
子座に対して生成された交互のmRNAの説明図。エキソン
は一定の率で描かれていない。ｃ−skimRNAはｖ−skiに
関連して示されている。黒い部分は非コード領域であ
り、一方白い四角はcDNAのタンパク質コード領域であ
る。ｖ−skiの両末端にあるドットを付した四角はskiウ
イルスを形質転換する際のgag−ski融合のgag領域であ
る。推定上の翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンの相
対的位置もまた示されている。図4:全RNAのS1ヌクレア
ーゼ保護分析。
子座に対して生成された交互のmRNAの説明図。エキソン
は一定の率で描かれていない。ｃ−skimRNAはｖ−skiに
関連して示されている。黒い部分は非コード領域であ
り、一方白い四角はcDNAのタンパク質コード領域であ
る。ｖ−skiの両末端にあるドットを付した四角はskiウ
イルスを形質転換する際のgag−ski融合のgag領域であ
る。推定上の翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンの相
対的位置もまた示されている。図4:全RNAのS1ヌクレア
ーゼ保護分析。
図4Aは、ハイブリダイセーションに使用された均一に
標識した一本鎖プローブが各写真の下に図式で示されて
おり、太線がcDNA配列を表し、そして細線はM13配列を
表す図面を示す。プローブの全体の長さおよび保護断片
の予想長さもまた示されている。RNAハイブリダイゼー
ションは各列の上に示されている。列上の番号（8,10,1
2,15または17）はRNAが調製された胚の齢を示す。図4B
はFB27/29型のKpn I−Hind III断片を含有するプローブ
Ａ（図１参照）を示す。このプローブは矢印で示される
ような645塩基対（bp）と断片１種と262および272bpの
２種のより短い断片を産生した。図4CはFB28型のKpn I
−Hind III断片を含有するプローブＢ（図１参照）を示
す。プローブは矢印で示されるような534bpの断片１種
を産生した。より小さい断片は検出されなかった。図4D
はM13配列に連結したFB27型の497bpHind III断片を含有
するプローブＣ（図１参照）を示す。該プローブは497b
pの断片１種と243/254のより小さい断片２種をもたらし
た。479bpの断片だけが矢印で示されている。図4EはFB2
8/29型のHind III断片を含有する長さ1116bpであるプロ
ーブＤ（図１参照）を示す。プローブＤは矢印で示され
ている799bpの断片を生じた。
標識した一本鎖プローブが各写真の下に図式で示されて
おり、太線がcDNA配列を表し、そして細線はM13配列を
表す図面を示す。プローブの全体の長さおよび保護断片
の予想長さもまた示されている。RNAハイブリダイゼー
ションは各列の上に示されている。列上の番号（8,10,1
2,15または17）はRNAが調製された胚の齢を示す。図4B
はFB27/29型のKpn I−Hind III断片を含有するプローブ
Ａ（図１参照）を示す。このプローブは矢印で示される
ような645塩基対（bp）と断片１種と262および272bpの
２種のより短い断片を産生した。図4CはFB28型のKpn I
−Hind III断片を含有するプローブＢ（図１参照）を示
す。プローブは矢印で示されるような534bpの断片１種
を産生した。より小さい断片は検出されなかった。図4D
はM13配列に連結したFB27型の497bpHind III断片を含有
するプローブＣ（図１参照）を示す。該プローブは497b
pの断片１種と243/254のより小さい断片２種をもたらし
た。479bpの断片だけが矢印で示されている。図4EはFB2
8/29型のHind III断片を含有する長さ1116bpであるプロ
ーブＤ（図１参照）を示す。プローブＤは矢印で示され
ている799bpの断片を生じた。
図5:c−skiとトリ白血症ウイルスからのgagのp19領域
との配列相同性。ｃ−ski配列は218ないし242位であ
り、gag領域のp19の配列は633ないし658位である。相同
領域は四角で囲まれている。
との配列相同性。ｃ−ski配列は218ないし242位であ
り、gag領域のp19の配列は633ないし658位である。相同
領域は四角で囲まれている。
図6:c−ski発現カセット。
図中に示されたPvu IないしNru I断片はプラスミドの
二重消化に続いてゲル電気泳動により単離された。線状
のDNAが受精卵のマイクロインジェクションによりトラ
ンスジェニックマウスを創成するために使用された。
二重消化に続いてゲル電気泳動により単離された。線状
のDNAが受精卵のマイクロインジェクションによりトラ
ンスジェニックマウスを創成するために使用された。
図7:c−skiを発現するトランスジェニックマウスおよ
びその通常同腹子。
びその通常同腹子。
ｃ−skiトランス遺伝子は交配で正常に分離すると考
えられる。写真は筋肉の発達した表現型（前方）を示す
ヘテロ接合マウスおよびDNA陰性の同腹子を示す。二重
盲検DNA分析により、筋肉の発達のした表現型がトラン
ス遺伝子と共に分離することが確認された。
えられる。写真は筋肉の発達した表現型（前方）を示す
ヘテロ接合マウスおよびDNA陰性の同腹子を示す。二重
盲検DNA分析により、筋肉の発達のした表現型がトラン
ス遺伝子と共に分離することが確認された。
図8:トランス遺伝子発現のノーザン転写分析 パネルＡはTG8566系のマウスの種々の組織から単離さ
れたRNAの分析を示す。該パネルの上側にはニワトリｃ
−skiとハイブリダイゼーションした後のオートラジオ
グラムを示す。トランス遺伝子から正確に転写されたｃ
−skiメッセージの移動の予測位置は2.5kbである。2.5k
bに相当する位置には印（Ski）が付されている。下側の
パネルにはニワトリβ−アクチンcDNAへのハイブリダイ
ゼーションに続く同一フィルターからのオートラジオグ
ラムを示す。β−アクチンcDNAはβ−アクチンmRNAだけ
でなく、その他のアクチンメッセージとハイブリダイゼ
ーションするであろう。β−アクチンおよびα−アクチ
ンmRNAの両方の移動の予測位置はパネルの右側に示され
ている。
れたRNAの分析を示す。該パネルの上側にはニワトリｃ
−skiとハイブリダイゼーションした後のオートラジオ
グラムを示す。トランス遺伝子から正確に転写されたｃ
−skiメッセージの移動の予測位置は2.5kbである。2.5k
bに相当する位置には印（Ski）が付されている。下側の
パネルにはニワトリβ−アクチンcDNAへのハイブリダイ
ゼーションに続く同一フィルターからのオートラジオグ
ラムを示す。β−アクチンcDNAはβ−アクチンmRNAだけ
でなく、その他のアクチンメッセージとハイブリダイゼ
ーションするであろう。β−アクチンおよびα−アクチ
ンmRNAの両方の移動の予測位置はパネルの右側に示され
ている。
パネルB:パネルＢに示されたオートラジオグラムは、RN
Aが３種のその他のトランスジェニック系に由来するこ
とを除いて、パネルＡに示されたものと同様である。RN
Aを調製するために使用された系は図面の右端に示され
ている。パネルＢに示されたフィルターは同時に行わ
れ、パネルＡに示されたものは異なる日に行われた。
Aが３種のその他のトランスジェニック系に由来するこ
とを除いて、パネルＡに示されたものと同様である。RN
Aを調製するために使用された系は図面の右端に示され
ている。パネルＢに示されたフィルターは同時に行わ
れ、パネルＡに示されたものは異なる日に行われた。
図9:トランス遺伝子からのRNAのRNアーゼ保護。図面
の上側にゲルのトラジオグラムを示す。第１列はRNアー
ゼ消化をしていないアンチセンスRNAプローブを含む。
次の２つの列はRNAを添加しないか、またはtRNAを添加
したプローブのハイブリダイゼーションの後の消化の結
果を示す。次の８つの列は４種のトランスジェニック系
の心臓（Heart）または骨格筋（Sk.Muscle）のいずれか
ら単離されたRNAに対するハイブリダイゼーションの結
果を示す。次の列は、トランス遺伝子を保持しないマウ
スの骨格筋からのRNAにプローブをハイブリダイゼーシ
ョンした結果を示す（Control Sk.Muscle）。最後の列
は分子量マーカーを含有する。オートラジオグラムの下
側には、アンチセンスRNAプローブに関するMSV LTR c−
ski発現カセットの説明図がある。T7転写はｃ−skiコー
ド領域の中央で始まり、そしてMSV LTRを介してpBR322
（pBRと表記）に由来する隣接配列に進む。トランス遺
伝子に由来する転写が正確に開始するならば、そのとき
984塩基の断片が保護されるであろう。
の上側にゲルのトラジオグラムを示す。第１列はRNアー
ゼ消化をしていないアンチセンスRNAプローブを含む。
次の２つの列はRNAを添加しないか、またはtRNAを添加
したプローブのハイブリダイゼーションの後の消化の結
果を示す。次の８つの列は４種のトランスジェニック系
の心臓（Heart）または骨格筋（Sk.Muscle）のいずれか
ら単離されたRNAに対するハイブリダイゼーションの結
果を示す。次の列は、トランス遺伝子を保持しないマウ
スの骨格筋からのRNAにプローブをハイブリダイゼーシ
ョンした結果を示す（Control Sk.Muscle）。最後の列
は分子量マーカーを含有する。オートラジオグラムの下
側には、アンチセンスRNAプローブに関するMSV LTR c−
ski発現カセットの説明図がある。T7転写はｃ−skiコー
ド領域の中央で始まり、そしてMSV LTRを介してpBR322
（pBRと表記）に由来する隣接配列に進む。トランス遺
伝子に由来する転写が正確に開始するならば、そのとき
984塩基の断片が保護されるであろう。
図10:トランスジェニックマウスにおけるニワトリｃ
−skiタンパク質発現。
−skiタンパク質発現。
抽出物は対照マウス（Control）またはｃ−skiトラン
ス遺伝子を保持し発現するマウスの肝臓（Liv）または
骨格筋（Sk.M）から調製された。放射標識された分子量
標準の移動位置は図面の左側に示されている。
ス遺伝子を保持し発現するマウスの肝臓（Liv）または
骨格筋（Sk.M）から調製された。放射標識された分子量
標準の移動位置は図面の左側に示されている。
図11:（ａ）対照マウスおよび（ｂ）TG8566系のマウ
スからの脚底の筋肉の丁度中央から調製された横断切
片。両方の図面は同じ倍率であり、サイズマーカーは20
0μである。（ｃ）対照マウスの脚底および（ｄ）作用
を受けたマウスの脚底からのより高倍率の図面。（ｃ）
および（ｄ）におけるサイズマーカーは100μである。
スからの脚底の筋肉の丁度中央から調製された横断切
片。両方の図面は同じ倍率であり、サイズマーカーは20
0μである。（ｃ）対照マウスの脚底および（ｄ）作用
を受けたマウスの脚底からのより高倍率の図面。（ｃ）
および（ｄ）におけるサイズマーカーは100μである。
図12:通常およびトランスジェニックマウスからの選
択された筋肉における繊維径の分布。
択された筋肉における繊維径の分布。
パネルA:c−skiを発現するトランスジェニックマウスに
おいて横隔膜は正常のように見える。筋肉の発達した表
現型を有するマウス（TG8566）からの横隔膜および通常
の対照マウスからの横隔膜は切断され、そして得られた
横断切片領域の個々の筋繊維の数が記録された。
おいて横隔膜は正常のように見える。筋肉の発達した表
現型を有するマウス（TG8566）からの横隔膜および通常
の対照マウスからの横隔膜は切断され、そして得られた
横断切片領域の個々の筋繊維の数が記録された。
パネルB:前方脛骨筋はTG8566系からのマウスにおいて大
きく増大されている。縦断切片はトランスジェニックマ
ウスおよび対照マウスの両方からの調製された。各々の
得られた横断切片領域の繊維数が記録された。この筋肉
は２種類の異なるタイプの繊維からなり、そのいくつか
は、対照に見いだされた繊維に比べ、より小さく、その
他はより大きい（図11もまた参照せよ）。
きく増大されている。縦断切片はトランスジェニックマ
ウスおよび対照マウスの両方からの調製された。各々の
得られた横断切片領域の繊維数が記録された。この筋肉
は２種類の異なるタイプの繊維からなり、そのいくつか
は、対照に見いだされた繊維に比べ、より小さく、その
他はより大きい（図11もまた参照せよ）。
図13:TG8566からの特定の筋肉におけるトランス遺伝
子発現 全RNA20μｇを電気泳動により分画し、そしてニトロ
セルロース膜に転写する。転写物はニワトリｃ−skiで
まず探索され、次にフィルターを細片化し、そしてニワ
トリβ−アクチンcDNAで再び探索された（Cleveland等,
1980,Cell 20,95−105）。RNAは横隔膜、脚底または大
骨格筋（Sk Muscle）から単離された。
子発現 全RNA20μｇを電気泳動により分画し、そしてニトロ
セルロース膜に転写する。転写物はニワトリｃ−skiで
まず探索され、次にフィルターを細片化し、そしてニワ
トリβ−アクチンcDNAで再び探索された（Cleveland等,
1980,Cell 20,95−105）。RNAは横隔膜、脚底または大
骨格筋（Sk Muscle）から単離された。
図14:作用を受けたマウスのロームボイドイスキャピ
ティス筋の中央から調製された切片の免疫蛍光染色。
（ａ）スローMHCに特異的なモノクローナル抗体NOQ7 5
4Dでの染色。スロー繊維は肥大していない。（ｂ）II a
MHCに特異的なモノクローナル抗体SC711での染色。II a
繊維は肥大していない。（ｃ）すべてのファストMHCイ
ソ体と反応するモノクローナル抗体2G3での染色。全て
の肥大した繊維はこの抗体で染まる。（ｄ）はII bMHC
に特異的なm/aBF−F3での染色。全てではないが多くの
肥大した繊維が染まる。倍率230倍。
ティス筋の中央から調製された切片の免疫蛍光染色。
（ａ）スローMHCに特異的なモノクローナル抗体NOQ7 5
4Dでの染色。スロー繊維は肥大していない。（ｂ）II a
MHCに特異的なモノクローナル抗体SC711での染色。II a
繊維は肥大していない。（ｃ）すべてのファストMHCイ
ソ体と反応するモノクローナル抗体2G3での染色。全て
の肥大した繊維はこの抗体で染まる。（ｄ）はII bMHC
に特異的なm/aBF−F3での染色。全てではないが多くの
肥大した繊維が染まる。倍率230倍。
発明の詳細な説明 本発明はニワトリｃ−skiタンパク質の全体またはユ
ニーク部分をコード化するDNA断片に関する。該DNA断片
は種々のニワトリｃ−skiタンパク質の１種、例えばFB2
9、FB28およびFB27をコード化し得る。本明細書で使用
される「ユニーク部分」とは、少なくとも５個（または
６個）のアミノ酸、またはそれに相当する少なくとも15
個（または18個）のヌクレオチドからなるものと定義さ
れる。本発明はまた、そのようなDNA断片を含有するDNA
構築物およびそれらで形質転換された細胞に関する。
ニーク部分をコード化するDNA断片に関する。該DNA断片
は種々のニワトリｃ−skiタンパク質の１種、例えばFB2
9、FB28およびFB27をコード化し得る。本明細書で使用
される「ユニーク部分」とは、少なくとも５個（または
６個）のアミノ酸、またはそれに相当する少なくとも15
個（または18個）のヌクレオチドからなるものと定義さ
れる。本発明はまた、そのようなDNA断片を含有するDNA
構築物およびそれらで形質転換された細胞に関する。
本発明は図２に示されたエキソン６のアミノ酸配列ま
たは図２に示されたエキソ７のアミノ酸配列をコード化
するDNA断片に関する。本発明はまた、エキソン７の他
に、図２に示されたエキソン１、エキソン２、エキソン
３、エキソン４、エキソン５またはエキソン６からなる
群から選択される少なくとも４つのエキソンをさらに含
むDNA断片に関する。そのようなDNA断片の例はFB29、FB
28およびFB27を包含する。
たは図２に示されたエキソ７のアミノ酸配列をコード化
するDNA断片に関する。本発明はまた、エキソン７の他
に、図２に示されたエキソン１、エキソン２、エキソン
３、エキソン４、エキソン５またはエキソン６からなる
群から選択される少なくとも４つのエキソンをさらに含
むDNA断片に関する。そのようなDNA断片の例はFB29、FB
28およびFB27を包含する。
本発明が関するDNA断片はまた、例えば図１のアミノ
酸配列のアレリック体を包含する図１のエキソンにおい
てコード化される実質的に同様のタンパク質をコード化
するものを包含する。本発明はまた、上記配列に相補的
なDNA断片に関する。本発明のDNA断片のユニーク部分ま
たはその相補的断片はDNAまたはRNA試料中の相補的鎖の
存在を検出するためのプローブとして使用され得る。
酸配列のアレリック体を包含する図１のエキソンにおい
てコード化される実質的に同様のタンパク質をコード化
するものを包含する。本発明はまた、上記配列に相補的
なDNA断片に関する。本発明のDNA断片のユニーク部分ま
たはその相補的断片はDNAまたはRNA試料中の相補的鎖の
存在を検出するためのプローブとして使用され得る。
本発明はさらに、DNA構築物またはそれで形質転換さ
れた宿主細胞に関する。一実施態様において、本発明の
DNA構築物は本発明のｃ−skiタンパク質をコード化する
DNA断片およびベクター、例えばpMEXneoからなる。別の
実施態様において、DNA構築物はｃ−skiの機能を有する
先端切除ｃ−skiタンパク質をコード化するDNA断片（例
えばΔFB29）およびベクター（例えばpMEXneo）からな
る。DNA構築物は宿主細胞を形質転換するのに適当であ
る。宿主細胞は原核細胞であるか、または好ましくは真
核細胞（例えば哺乳細胞）であってよい。
れた宿主細胞に関する。一実施態様において、本発明の
DNA構築物は本発明のｃ−skiタンパク質をコード化する
DNA断片およびベクター、例えばpMEXneoからなる。別の
実施態様において、DNA構築物はｃ−skiの機能を有する
先端切除ｃ−skiタンパク質をコード化するDNA断片（例
えばΔFB29）およびベクター（例えばpMEXneo）からな
る。DNA構築物は宿主細胞を形質転換するのに適当であ
る。宿主細胞は原核細胞であるか、または好ましくは真
核細胞（例えば哺乳細胞）であってよい。
本発明はさらに、筋肉の大きさが増大した動物、例え
ば家畜に関する。増大した筋肉を有する家畜のそのよう
な品種の開発は通常の育種計画の主要な目的であり続け
る。（本明細書で使用されている家畜はその肉のために
飼育される動物、例えばブタ、ニワトリ、七面鳥、アヒ
ル、ヒツジ、ウシおよび魚、特にマスおよびナマズに関
する）。
ば家畜に関する。増大した筋肉を有する家畜のそのよう
な品種の開発は通常の育種計画の主要な目的であり続け
る。（本明細書で使用されている家畜はその肉のために
飼育される動物、例えばブタ、ニワトリ、七面鳥、アヒ
ル、ヒツジ、ウシおよび魚、特にマスおよびナマズに関
する）。
種々の遺伝子をマウスおよび種々のタイプの家畜の生
殖系列に導入することは当業者に比較的通常の操作であ
る。本発明者は、ΔFB29とpMEXneoベクターとを含むDNA
構築物を受精卵に導入することにより筋肉の大きさが増
大したマウスを創成した。生成した創形マウスおよびそ
れらの子孫はそれらの全ての体細胞および生殖細胞に当
該DNA構築物を有する。
殖系列に導入することは当業者に比較的通常の操作であ
る。本発明者は、ΔFB29とpMEXneoベクターとを含むDNA
構築物を受精卵に導入することにより筋肉の大きさが増
大したマウスを創成した。生成した創形マウスおよびそ
れらの子孫はそれらの全ての体細胞および生殖細胞に当
該DNA構築物を有する。
skiタンパク質（例えばｃ−skiタンパク質）をコード
化するDNA構築物の動物の受精卵への導入（例えばマイ
クロインジェクション）により、増大した筋肉発達およ
び減少した脂肪組織を有する動物の品種を生じる。当業
者が理解するであろうように、本発明の大きさの増大し
た筋肉を有する動物はまた、様々な種からのskiタンパ
ク質をコード化するDNAを用いて創成され得る（ニワト
リが丁度そのような例である）。さらに、本発明の動物
はskiに関連するタンパク質をコード化するDNA構築物、
例えばsno遺伝子を用いて創成され得る。
化するDNA構築物の動物の受精卵への導入（例えばマイ
クロインジェクション）により、増大した筋肉発達およ
び減少した脂肪組織を有する動物の品種を生じる。当業
者が理解するであろうように、本発明の大きさの増大し
た筋肉を有する動物はまた、様々な種からのskiタンパ
ク質をコード化するDNAを用いて創成され得る（ニワト
リが丁度そのような例である）。さらに、本発明の動物
はskiに関連するタンパク質をコード化するDNA構築物、
例えばsno遺伝子を用いて創成され得る。
フレームシフト突然変異により作成されたDNA断片ΔF
B29は先端切除タンパク質を生じる。しかしながら、当
業者が理解するであろうように、本発明のトランスジェ
ニック動物はまた、全長のskiタンパク質、skiタンパク
質の一部をコード化するDNA断片、例えば１種もしくは
２種のエキソンまたは生物学的に活性な欠失誘導体、例
えばウイルスタンパク質に融合した先端切除ｃ−skiを
発現するｖ−skiを含むDNA構築物により製造され得る。
さらに、筋肉組織におけるタンパク質の選択的発現がpM
EXneo以外のベクターにおいて創成されたDNA構築物に由
来し得ることも理解される。
B29は先端切除タンパク質を生じる。しかしながら、当
業者が理解するであろうように、本発明のトランスジェ
ニック動物はまた、全長のskiタンパク質、skiタンパク
質の一部をコード化するDNA断片、例えば１種もしくは
２種のエキソンまたは生物学的に活性な欠失誘導体、例
えばウイルスタンパク質に融合した先端切除ｃ−skiを
発現するｖ−skiを含むDNA構築物により製造され得る。
さらに、筋肉組織におけるタンパク質の選択的発現がpM
EXneo以外のベクターにおいて創成されたDNA構築物に由
来し得ることも理解される。
本発明はまた、動物例えばヒトにおける筋肉成長を刺
激する、および筋肉変性を防止する方法に関する。筋肉
組織の損失を生じる傷害および筋肉の変性を生じる神経
性障害に対する可能な治療は筋肉の成長を刺激すること
であろう。筋肉の損失の場合に、この治療は組織の再生
の刺激を含むであろう。一方、神経性障害の場合には、
筋肉成長は消失性神経刺激物と関係なくなされる必要が
あろう。本発明によれば、筋肉成長はskiタンパク質を
コード化するDNA構築物にコード化されたタンパク質が
発現されるような条件下で筋肉組織に該DNA構築物を伝
達することにより刺激され得る。上記構築物は当業者に
は公知の標準法を用いて筋肉に標的化され、そして伝達
され得る。
激する、および筋肉変性を防止する方法に関する。筋肉
組織の損失を生じる傷害および筋肉の変性を生じる神経
性障害に対する可能な治療は筋肉の成長を刺激すること
であろう。筋肉の損失の場合に、この治療は組織の再生
の刺激を含むであろう。一方、神経性障害の場合には、
筋肉成長は消失性神経刺激物と関係なくなされる必要が
あろう。本発明によれば、筋肉成長はskiタンパク質を
コード化するDNA構築物にコード化されたタンパク質が
発現されるような条件下で筋肉組織に該DNA構築物を伝
達することにより刺激され得る。上記構築物は当業者に
は公知の標準法を用いて筋肉に標的化され、そして伝達
され得る。
本発明はさらに、筋肉変性疾病、例えば筋ジストロフ
ィーおよび筋萎縮性側索硬化症（ルイ・ゲーリック症と
しても知られている）を治療する方法に関する。治療は
本発明のDNA構築物にコード化されたタンパク質が発現
されて、治療が達成されるような条件下で、本発明のDN
A構築物を影響を受けた筋肉に伝達することからなる。
ィーおよび筋萎縮性側索硬化症（ルイ・ゲーリック症と
しても知られている）を治療する方法に関する。治療は
本発明のDNA構築物にコード化されたタンパク質が発現
されて、治療が達成されるような条件下で、本発明のDN
A構築物を影響を受けた筋肉に伝達することからなる。
実施例 cDNAライブラリィのスクリーニング ２種のニワトリcDNAライブラリィが標準的プロトコル
（Maniatis等,1982,Molecular Cloning.A Laboratory M
anual.コールド・スプリング・ハーバー研究所，ニュー
ヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）を用いてｖ
−skiプローブでスクリーニングされた。一方のライブ
ラリィは10日胚の体壁から単離されたポリＡ′mRNAから
作成され、他方はAEV形質転換されたニワトリ赤芽細胞
から単離されたmRNAから作成された。４種の異なるｃ−
skicDNAが単離され、３種は体壁ライブラリィからであ
り（これらのクローンはFB27,FB28およびFB29と表記さ
れた）、そして１種のcDNAクローンは赤芽細胞ライブラ
リィからだった（CELと表記された）。これらのcDNAは
ウイルスに存在するskiの部分の両方の５′および３′
を延長する配列を含んでいた。そのcDNAは、ｖ−skiが
単一の細胞遺伝子に由来することを示し、そして別個の
skiタンパク質をコード化する多重ｃ−ski mRNAが交互
スプライシングによりｃ−ski遺伝子座から産生される
ことを示唆し（Leff等,1986,Ann.Rev.Biochem.55,1091
−1117）、これはこの様式で多重mRNAを産生することが
知られている腫瘍遺伝子の増加するリストに加えられる
（Ben−Neviah等,1986,Cell 44,577−586;Levy等,1987,
Mol.Cell.Biol.7,4142−4145;Martinez等,1987,Science
237,411−415;McGrath等,1983,Nature 304,501−50
6）。
（Maniatis等,1982,Molecular Cloning.A Laboratory M
anual.コールド・スプリング・ハーバー研究所，ニュー
ヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）を用いてｖ
−skiプローブでスクリーニングされた。一方のライブ
ラリィは10日胚の体壁から単離されたポリＡ′mRNAから
作成され、他方はAEV形質転換されたニワトリ赤芽細胞
から単離されたmRNAから作成された。４種の異なるｃ−
skicDNAが単離され、３種は体壁ライブラリィからであ
り（これらのクローンはFB27,FB28およびFB29と表記さ
れた）、そして１種のcDNAクローンは赤芽細胞ライブラ
リィからだった（CELと表記された）。これらのcDNAは
ウイルスに存在するskiの部分の両方の５′および３′
を延長する配列を含んでいた。そのcDNAは、ｖ−skiが
単一の細胞遺伝子に由来することを示し、そして別個の
skiタンパク質をコード化する多重ｃ−ski mRNAが交互
スプライシングによりｃ−ski遺伝子座から産生される
ことを示唆し（Leff等,1986,Ann.Rev.Biochem.55,1091
−1117）、これはこの様式で多重mRNAを産生することが
知られている腫瘍遺伝子の増加するリストに加えられる
（Ben−Neviah等,1986,Cell 44,577−586;Levy等,1987,
Mol.Cell.Biol.7,4142−4145;Martinez等,1987,Science
237,411−415;McGrath等,1983,Nature 304,501−50
6）。
cDNAクローンの構造 DNA配列決定（Sanger等,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 74,5463−5467）により特徴づけられたｃ−ski cDNA
クローンの全ての構造およびそれらのｖ−skiとの関係
は図１に示されている。
A 74,5463−5467）により特徴づけられたｃ−ski cDNA
クローンの全ての構造およびそれらのｖ−skiとの関係
は図１に示されている。
FB28およびCELだけがｖ−skiの５′配列を有し;FB27
およびFB29の両方は５′末端で切除されている。FB29の
５′末端の消失配列がFB28およびCELのものと類似して
いると仮定して、混成ヌクレオチド配列およびFB29型の
cDNAに対する予想アミノ酸配列が図２に示されている。
実質的な下流読み枠を有する最初のATGはヌクレオチド1
68位に位置する。このATGの上流には読み枠は開放され
ておらず、これらの配列が５′非翻訳領域を表すことを
示唆する。
およびFB29の両方は５′末端で切除されている。FB29の
５′末端の消失配列がFB28およびCELのものと類似して
いると仮定して、混成ヌクレオチド配列およびFB29型の
cDNAに対する予想アミノ酸配列が図２に示されている。
実質的な下流読み枠を有する最初のATGはヌクレオチド1
68位に位置する。このATGの上流には読み枠は開放され
ておらず、これらの配列が５′非翻訳領域を表すことを
示唆する。
cDNA配列分析ならびにゲノム配列からの公知のスプラ
イシングドナーおよびアクセプター部位の位置の比較
（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4045）に
基づいて、エキソン境界が誘導された（図３参照）。こ
の図面に見られるように、ｃ−ski配列は７つのエキソ
ンにわたって分布されている。FB29は７つの全てのエキ
ソンを含有し、FB28およびFB27はそれぞれエキソン２お
よびエキソン６を欠いている。この特異なスプライシン
グは３種のcDNAのタンパク質コード能力に影響する。
イシングドナーおよびアクセプター部位の位置の比較
（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4045）に
基づいて、エキソン境界が誘導された（図３参照）。こ
の図面に見られるように、ｃ−ski配列は７つのエキソ
ンにわたって分布されている。FB29は７つの全てのエキ
ソンを含有し、FB28およびFB27はそれぞれエキソン２お
よびエキソン６を欠いている。この特異なスプライシン
グは３種のcDNAのタンパク質コード能力に影響する。
エキソン２の特異なスプライシングは読み取り枠下流
のコード能力に影響を及ぼすことなく37個のアミノ酸を
欠失する。しかしながら、エキソン６の特異なスプライ
シングはエキソン７のコード能力に影響を及ぼす。エキ
ソン５がエキソン７にスプライシングされるならば（FB
27 cDNAにおいて見られる）、翻訳停止コドンがスプラ
イシング結合部位に生成し、そしてエキソン７は非コー
ド性エキソンになる。しかしながら、FB28/29のよう
に、エキソン５がエキソン６に、そしてエキソン６がエ
キソン７にスプライシングされるならば、このとき読み
取り枠はエキソン７において追加のアミノ酸129個をコ
ード化する417ヌクレオチドが続く。
のコード能力に影響を及ぼすことなく37個のアミノ酸を
欠失する。しかしながら、エキソン６の特異なスプライ
シングはエキソン７のコード能力に影響を及ぼす。エキ
ソン５がエキソン７にスプライシングされるならば（FB
27 cDNAにおいて見られる）、翻訳停止コドンがスプラ
イシング結合部位に生成し、そしてエキソン７は非コー
ド性エキソンになる。しかしながら、FB28/29のよう
に、エキソン５がエキソン６に、そしてエキソン６がエ
キソン７にスプライシングされるならば、このとき読み
取り枠はエキソン７において追加のアミノ酸129個をコ
ード化する417ヌクレオチドが続く。
FB29およびFB27mRNAの消失性５′末端がFB28およびCE
Lに存在するものと同一の配列を含有すると仮定する
と、そのときcDNAの３種の異なるタイプに相当するmRNA
の翻訳は３種のタンパク質の生成を導くであろう。その
１つ目は750個のアミノ酸（FB29からの）を含み、２つ
目は713個のアミノ酸（FB28からの）を含み、そして３
つ目のタンパク質は510個のアミノ酸（FB27からの）を
含む。
Lに存在するものと同一の配列を含有すると仮定する
と、そのときcDNAの３種の異なるタイプに相当するmRNA
の翻訳は３種のタンパク質の生成を導くであろう。その
１つ目は750個のアミノ酸（FB29からの）を含み、２つ
目は713個のアミノ酸（FB28からの）を含み、そして３
つ目のタンパク質は510個のアミノ酸（FB27からの）を
含む。
CELクローンは３′配列を消失している。体壁（FB）
ライブラリィに由来するcDNAは、ヌクレオチド2803ない
し2898からの95塩基対（bp）のATリッチ領域を含む長い
３′非翻訳領域を有する。この領域内には、ｃ−myc、
インターフェロン、ｃ−junおよびｃ−fos等の一時的に
誘導される種々のmRNAにおいてmRNA脱安定化に関与した
配列ATTTA2コピーがある（Meijlink等,1985,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 82,4987−4991;Ryder等,1985,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 85,1487−1491;Shaw等,1986,Cell 46,659
−667）。これら配列の付加または欠失はｃ−fosの形質
転換能力に影響を及ぼすことが示された（Meijlink等,1
985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,4987−4991）。
ライブラリィに由来するcDNAは、ヌクレオチド2803ない
し2898からの95塩基対（bp）のATリッチ領域を含む長い
３′非翻訳領域を有する。この領域内には、ｃ−myc、
インターフェロン、ｃ−junおよびｃ−fos等の一時的に
誘導される種々のmRNAにおいてmRNA脱安定化に関与した
配列ATTTA2コピーがある（Meijlink等,1985,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 82,4987−4991;Ryder等,1985,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 85,1487−1491;Shaw等,1986,Cell 46,659
−667）。これら配列の付加または欠失はｃ−fosの形質
転換能力に影響を及ぼすことが示された（Meijlink等,1
985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,4987−4991）。
ｃ−ski cDNAは3348位と4167位に位置する２つの強力
なポリ（Ａ）シグナル（AATAAA）を含む。３種の全ての
クローンはFBライブラリィから同じ位置で単離されたけ
れども、ポリ（Ａ）尾部を持たない。それ故に、ｃ−sk
imRNAの３′末端はこれらのクローンに含まれていない
といえそうである。単離され、そして特徴づけられた4.
2kbのcDNAはノーザン転写分析により検出された5.7−8.
0kbおよび10.0kbのmRNA（Li等,1986,J.Virol.57,1065−
1072）より小さい、この矛盾は説明されていないが、ポ
リ（Ａ）尾部を欠くこれまで単離されたクローンもまた
mRNAの３′末端からの配列を欠いていることが示唆され
る。
なポリ（Ａ）シグナル（AATAAA）を含む。３種の全ての
クローンはFBライブラリィから同じ位置で単離されたけ
れども、ポリ（Ａ）尾部を持たない。それ故に、ｃ−sk
imRNAの３′末端はこれらのクローンに含まれていない
といえそうである。単離され、そして特徴づけられた4.
2kbのcDNAはノーザン転写分析により検出された5.7−8.
0kbおよび10.0kbのmRNA（Li等,1986,J.Virol.57,1065−
1072）より小さい、この矛盾は説明されていないが、ポ
リ（Ａ）尾部を欠くこれまで単離されたクローンもまた
mRNAの３′末端からの配列を欠いていることが示唆され
る。
ｃ−ski mRNAの５′末端 ５′末端での配列比較は、FB28およびCELの両方が推
定上の翻訳開始ATGコドンの上流89bp位まで共直線性で
あることを示す。FB28は追加の76bpを有するが、CELはF
B28に見いだされたものとは異なる25bpを有する。２つ
の配列が異なるこの領域がゲノムクローンからの配列と
比較され（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4
045）、そしてFB28における上流配列はゲノム配列と共
直線性である。
定上の翻訳開始ATGコドンの上流89bp位まで共直線性で
あることを示す。FB28は追加の76bpを有するが、CELはF
B28に見いだされたものとは異なる25bpを有する。２つ
の配列が異なるこの領域がゲノムクローンからの配列と
比較され（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4
045）、そしてFB28における上流配列はゲノム配列と共
直線性である。
CELとFB28とが相違する点でのゲノムDNAの配列の試験
は、ドナーまたはスプライシング部位のためのコンセン
サス配列を明らかにしない。クローンの信頼性を確認す
るために、S1ヌクレアーゼ保護分析が行われた。この結
果は、FB28に存在する配列が通常の胚においてmRNAとし
て発現されることを示した。同様のS1分析はCELクロー
ンの５′最末端での25bpのmRNA中の存在に対する証拠を
与えなかった。このことにより、CELクローンの最初の2
5塩基はクローニング人工物の結果であること、およびF
B28クローンに見いだされた配列はｃ−ski mRNA中に発
現されることが示唆される。
は、ドナーまたはスプライシング部位のためのコンセン
サス配列を明らかにしない。クローンの信頼性を確認す
るために、S1ヌクレアーゼ保護分析が行われた。この結
果は、FB28に存在する配列が通常の胚においてmRNAとし
て発現されることを示した。同様のS1分析はCELクロー
ンの５′最末端での25bpのmRNA中の存在に対する証拠を
与えなかった。このことにより、CELクローンの最初の2
5塩基はクローニング人工物の結果であること、およびF
B28クローンに見いだされた配列はｃ−ski mRNA中に発
現されることが示唆される。
どのくらい多くのｃ−ski mRNAの５′非翻訳領域がFB
28中に含まれるかを決定するために、プライマー伸長分
析が行われた。FB28中に存在する５′セグメントの複製
により約280塩基の伸長産物が得られるべきである。し
かしながら、220塩基のプライマー伸長産物が見られ
た。S1分析データは、この断片がRNAにおいて発現され
ることを示した。観察されたプライマー伸長産物は未熟
な停止の結果であるかもしれないが、ｃ−ski mRNAのた
めの多重５′末端があることも可能である。
28中に含まれるかを決定するために、プライマー伸長分
析が行われた。FB28中に存在する５′セグメントの複製
により約280塩基の伸長産物が得られるべきである。し
かしながら、220塩基のプライマー伸長産物が見られ
た。S1分析データは、この断片がRNAにおいて発現され
ることを示した。観察されたプライマー伸長産物は未熟
な停止の結果であるかもしれないが、ｃ−ski mRNAのた
めの多重５′末端があることも可能である。
内部エキソンの機構 FB27、FB28およびFB29ならびにCELcDNAの中心部での
配列比較は、FB28が37個のアミノ酸を失うであろう1079
−1191の111bp（エキソ２）の小さい領域を欠いてるこ
とを示す。相当する領域でのゲノム配列（Stavnezer等,
1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4045）は、cDNAが別々に
スプライシングされたmRNAから誘導されることを示唆す
る、欠失の境界でのコンセンサス・スプライシングドナ
ーおよびアクセプター配列の存在を明らかに示す。
配列比較は、FB28が37個のアミノ酸を失うであろう1079
−1191の111bp（エキソ２）の小さい領域を欠いてるこ
とを示す。相当する領域でのゲノム配列（Stavnezer等,
1989,Mol.Cell.Biol.9,4038−4045）は、cDNAが別々に
スプライシングされたmRNAから誘導されることを示唆す
る、欠失の境界でのコンセンサス・スプライシングドナ
ーおよびアクセプター配列の存在を明らかに示す。
FB28およびFB28/29型のmRNAの存在を確認するため
に、S1分析が全RNAに関して行われた。全RNAは標準的プ
ロトコル（Chirgwin等,1979,Biochemistry 18,5294−52
99）を用いて８、10、12、15および17日齢のニワトリ胚
から単離された。全RNA約20ないし30μｇが標準的プロ
トコル（Maniatis等,1982,Molecular Cloning.A Labora
tory Maual.コールド・スプリング・ハーバー研究所，
ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）を用
いる核S1分析のために使用された。
に、S1分析が全RNAに関して行われた。全RNAは標準的プ
ロトコル（Chirgwin等,1979,Biochemistry 18,5294−52
99）を用いて８、10、12、15および17日齢のニワトリ胚
から単離された。全RNA約20ないし30μｇが標準的プロ
トコル（Maniatis等,1982,Molecular Cloning.A Labora
tory Maual.コールド・スプリング・ハーバー研究所，
ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）を用
いる核S1分析のために使用された。
FB29/27またはFB28のKpn IとHind III部位との間の領
域に及ぶ均一に標識された一本鎖プローブ（図１のプロ
ーブＡおよびＢ）を全体の細胞RNAとハイブリダイゼー
ションさせた。図4Bに示されるように、mRNAへのハイブ
リダイゼーション、続くFB29に由来するプローブのS1消
化により、FB27/29型のmRNAへのハイブリダイゼーショ
ンを示す645bpの保護断片および前記プローブがFB28型
のmRNAとハイブリダイゼーションさせた場合に予想され
る262/272bp断片が得られた。FB28（プローブＢ）は534
bpの断片を保護した（図4C参照）。FB28プローブのFB27
/29型のmRNAへのハイブリダイゼーションからのより小
さい断片は観察されなかったが、S1はRNAのループ外の
領域に効果的に反対のDNAプローブを常に切断するわけ
ではない。これらの試験は、第２エキソンを含むFB27/2
9型の両方に相当するmRNAおよび第２エキソンを欠くFB2
8型に相当するmRNAが通常の細胞中に発現されることを
示す。
域に及ぶ均一に標識された一本鎖プローブ（図１のプロ
ーブＡおよびＢ）を全体の細胞RNAとハイブリダイゼー
ションさせた。図4Bに示されるように、mRNAへのハイブ
リダイゼーション、続くFB29に由来するプローブのS1消
化により、FB27/29型のmRNAへのハイブリダイゼーショ
ンを示す645bpの保護断片および前記プローブがFB28型
のmRNAとハイブリダイゼーションさせた場合に予想され
る262/272bp断片が得られた。FB28（プローブＢ）は534
bpの断片を保護した（図4C参照）。FB28プローブのFB27
/29型のmRNAへのハイブリダイゼーションからのより小
さい断片は観察されなかったが、S1はRNAのループ外の
領域に効果的に反対のDNAプローブを常に切断するわけ
ではない。これらの試験は、第２エキソンを含むFB27/2
9型の両方に相当するmRNAおよび第２エキソンを欠くFB2
8型に相当するmRNAが通常の細胞中に発現されることを
示す。
３′コード性エキソンの機構 ３種の繊維芽細胞クローンの配列比較は、FB28および
FB29がFB27に欠けている断片（エキソン６）を含むこと
を示した。cDNAが異なっている位置に相当する位置での
ゲノムDNAの試験はコンセンサス・スプライシングドナ
ーを明らかにする（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.
9,4038−4045）。２種のcDNAはエキソン６を包含する
か、または排除するスプライシングに由来するように考
えられる。この相互のエキソンの下流で、３種全てのcD
NAの３′部分は同一である。
FB29がFB27に欠けている断片（エキソン６）を含むこと
を示した。cDNAが異なっている位置に相当する位置での
ゲノムDNAの試験はコンセンサス・スプライシングドナ
ーを明らかにする（Stavnezer等,1989,Mol.Cell.Biol.
9,4038−4045）。２種のcDNAはエキソン６を包含する
か、または排除するスプライシングに由来するように考
えられる。この相互のエキソンの下流で、３種全てのcD
NAの３′部分は同一である。
両方のタイプのcDNAが通常の細胞mRNAを表現するかど
うかを調べるために、S1分析が行われた。均一に標識さ
れた一本鎖プローブはFB28の３′末端からの799bpHind
III（プローブD,図１参照）およびM13mp18中にサブクロ
ーン化されたFB27の３′末端からの497bpHind III断片
（プローブＣ）から製造された。一本鎖プローブを製造
し、そして異なる齢の全体のニワトリ胚から調製された
全RNA20μｇにハイブリダイゼーションさせた。図4Eに
示されるように、RNAのプローブＤ（FB28）へのハイブ
リダイゼーションにおよび続くS1処理により、FB28/29
型のmRNAが存在する場合に予想されるであろう799bp断
片が得られた。FB27型のmRNAとハイブリダイゼーション
するFB28プローブにより生成されるであろうより小さい
断片は検出されなかった。FB27プローブ（プローブＣ）
のS1消化により、497bpの断片および243ないし254bpの
２種のより小さい断片が得られた（図4D参照）。これら
のより小さい断片は、FB27プローブがFB28/29型のmRNA
と異なる部位での該プローブのS1切断に由来すると考え
られる。これらのデータはFB28/29型mRNAの存在を確認
するが、しかしFB27mRNAが存在する場合、FB28/29に比
べより低いレベルで存在すると考えられる。
うかを調べるために、S1分析が行われた。均一に標識さ
れた一本鎖プローブはFB28の３′末端からの799bpHind
III（プローブD,図１参照）およびM13mp18中にサブクロ
ーン化されたFB27の３′末端からの497bpHind III断片
（プローブＣ）から製造された。一本鎖プローブを製造
し、そして異なる齢の全体のニワトリ胚から調製された
全RNA20μｇにハイブリダイゼーションさせた。図4Eに
示されるように、RNAのプローブＤ（FB28）へのハイブ
リダイゼーションにおよび続くS1処理により、FB28/29
型のmRNAが存在する場合に予想されるであろう799bp断
片が得られた。FB27型のmRNAとハイブリダイゼーション
するFB28プローブにより生成されるであろうより小さい
断片は検出されなかった。FB27プローブ（プローブＣ）
のS1消化により、497bpの断片および243ないし254bpの
２種のより小さい断片が得られた（図4D参照）。これら
のより小さい断片は、FB27プローブがFB28/29型のmRNA
と異なる部位での該プローブのS1切断に由来すると考え
られる。これらのデータはFB28/29型mRNAの存在を確認
するが、しかしFB27mRNAが存在する場合、FB28/29に比
べより低いレベルで存在すると考えられる。
特異なスプライシング cDNAクローンの核酸配列分析から予測されるような３
種のｃ−ski mRNAの特異なスプライシングの説明図は図
３に示されている。ニワトリ胚から誘導された全RNAのS
1分析により、エキソン２を含むものと含まないものと
の２種のクラスのmRNAの存在が確認された。同様のプロ
トコルを用いて、エキソン６を含むmRNAの存在が確認さ
れた。この技術を利用して、FB27cDNAに相当するであろ
うエキソン６を欠くmRNAの存在を示すことはできなかっ
たが、一連の議論は、エキソン27cDNAが単純なクローニ
ング人工物でないことを示唆する。FB27にない配列は確
かなスプライシング結合部により結合されている（cDNA
配列および利用可能なゲノムDNA配列の両方の試験によ
り判断されるように）。おそらく部分的にプロセシング
されたmRNAが逆転写されるから、１またはそれ以上のイ
ントロンを含むcDNAがときおり得られるけれども、エキ
ソンを人工的に消失しているcDNAの単離は理論に基づい
ておそらく少なく、そしてcDNAライブラリィの作成にお
いて、たとえあってもまれにしか起こらないように思わ
れる。これらの理由のために、FB27が、比較的まれであ
るならば、実際のｃ−ski mRNAを表現するという理解は
現在支持されるている。
種のｃ−ski mRNAの特異なスプライシングの説明図は図
３に示されている。ニワトリ胚から誘導された全RNAのS
1分析により、エキソン２を含むものと含まないものと
の２種のクラスのmRNAの存在が確認された。同様のプロ
トコルを用いて、エキソン６を含むmRNAの存在が確認さ
れた。この技術を利用して、FB27cDNAに相当するであろ
うエキソン６を欠くmRNAの存在を示すことはできなかっ
たが、一連の議論は、エキソン27cDNAが単純なクローニ
ング人工物でないことを示唆する。FB27にない配列は確
かなスプライシング結合部により結合されている（cDNA
配列および利用可能なゲノムDNA配列の両方の試験によ
り判断されるように）。おそらく部分的にプロセシング
されたmRNAが逆転写されるから、１またはそれ以上のイ
ントロンを含むcDNAがときおり得られるけれども、エキ
ソンを人工的に消失しているcDNAの単離は理論に基づい
ておそらく少なく、そしてcDNAライブラリィの作成にお
いて、たとえあってもまれにしか起こらないように思わ
れる。これらの理由のために、FB27が、比較的まれであ
るならば、実際のｃ−ski mRNAを表現するという理解は
現在支持されるている。
ｃ−skiとｖ−skiとの比較 レトロウイルスによりｃ−oncの形質導入はｃ−oncに
おける先端切除、欠失または点突然変異をしばしば生じ
る（Bishop,J.M.,1983,Ann Rev.Biochem.52,301−35
4）。ｃ−ski配列とｖ−ski配列の比較により、ｖ−ski
遺伝子が５′および３′の両方の末端で先端切除され、
そしてｃ−skiコード領域の一部だけを表現することが
示されている（図１および３参照）。ｖ−ski配列は244
位で始まり（推定上のイニシエーターATGは168位にあ
る）、そして1541位で終わる（図３参照）。５′および
３′の先端切除の生物学的意義は知られていない。ｖ−
skiが「Ｃ」を有し、そしてｃ−skiが「Ｔ」を有する12
84位で、ｃ−skiに対してｖ−skiには１個の塩基変化だ
けがある。この塩基変化はｃ−skiにおけるTrpからｖ−
skiにおけるArgに変更する。ｖ−skiの欠失分析は、上
記アミノ酸変化がｖ−skiの形質転換能力に重要な役割
を演じないことを意味する。cDNAの生物学的活性は複製
能力のあるレトロウイルスベクター（Hughes等,1987,J.
Virol.61,3004−3012）を用いるcDNAからのコード領域
を発現することにより評価される。
おける先端切除、欠失または点突然変異をしばしば生じ
る（Bishop,J.M.,1983,Ann Rev.Biochem.52,301−35
4）。ｃ−ski配列とｖ−ski配列の比較により、ｖ−ski
遺伝子が５′および３′の両方の末端で先端切除され、
そしてｃ−skiコード領域の一部だけを表現することが
示されている（図１および３参照）。ｖ−ski配列は244
位で始まり（推定上のイニシエーターATGは168位にあ
る）、そして1541位で終わる（図３参照）。５′および
３′の先端切除の生物学的意義は知られていない。ｖ−
skiが「Ｃ」を有し、そしてｃ−skiが「Ｔ」を有する12
84位で、ｃ−skiに対してｖ−skiには１個の塩基変化だ
けがある。この塩基変化はｃ−skiにおけるTrpからｖ−
skiにおけるArgに変更する。ｖ−skiの欠失分析は、上
記アミノ酸変化がｖ−skiの形質転換能力に重要な役割
を演じないことを意味する。cDNAの生物学的活性は複製
能力のあるレトロウイルスベクター（Hughes等,1987,J.
Virol.61,3004−3012）を用いるcDNAからのコード領域
を発現することにより評価される。
図５に示されるように、20bpのうち18bpがｃ−skiと
親ALVにおけるgagのp19領域との間で同一である。相同
のこの領域はウイルス配列とｖ−skiとの間に５′結合
部を含有する。そのような長い範囲の相同があれば、
５′組換え結合部を正確に確認することが不可能であ
る。実質的な相同性は３′ski/ALV結合部に正確に示さ
れ得ない。しかしながら、３′結合部のすぐ下流に、ｖ
−ski/ALV結合部の３′に見られたｃ−skiの断片にきわ
めて相同であるALV配列がある。組換えに包含される核
酸の並列において相同のこの領域を引き起こすことが可
能である。
親ALVにおけるgagのp19領域との間で同一である。相同
のこの領域はウイルス配列とｖ−skiとの間に５′結合
部を含有する。そのような長い範囲の相同があれば、
５′組換え結合部を正確に確認することが不可能であ
る。実質的な相同性は３′ski/ALV結合部に正確に示さ
れ得ない。しかしながら、３′結合部のすぐ下流に、ｖ
−ski/ALV結合部の３′に見られたｃ−skiの断片にきわ
めて相同であるALV配列がある。組換えに包含される核
酸の並列において相同のこの領域を引き起こすことが可
能である。
形質導入機構 レトロウイルスが細胞性腫瘍遺伝子を必要とする正確
な機構は不明確なままである。第１段階として、ウイル
スDNAが細胞性腫瘍遺伝子の隣りかまたはその中に組み
込まれることが示唆されている（Bishop,J.M.,1983,Ann
Rev.Biochem.52,301−354）。レトロウイルスおよび細
胞の配列は次のDNA欠失法（Bishop,J.M.,1983,Ann Rev.
Biochem.52,301−354;Czernilofsky等,1983,Nature 30
1,736−738）またはRNAリードスルー（Herman等,1987,S
cience 236,845−848;Nilsen等,1985,Cell 41,1719−17
16）により融合され得るが、相同性はこれらの方法のい
ずれかに関連することは知られていない。skiの場合に
おいて、ｃ−ski配列とp19コード領域との比較はskiウ
イルスの生成におけるいくつかの過程が相同的組換えを
含んでいたことを意味する。しかしながら、相同的組換
えは２次的であってよい。元の過程が非相同的であり、
そして直接反復を含むウイルスゲノムを生成するなら
ば、ルイ悪性腫瘍ウイルスに観察されたよう、おそらく
逆転写の間のコピー選択を介して反復間の配列がウイル
ス培養の間の組換えにより消失され得ることが期待され
るであろう。しかしながら、腫瘍遺伝子がｃ−oncと複
製可能ウイルスとの間の相同組換えにより要求されるモ
デルを提案することが可能である。相同の短い長さはウ
イルス腫瘍遺伝子の両末端（Banner等,1985,Mol.Cell.B
iol.5,1400−1407;Van Beveren等,1983,Cell 32,1241−
1255）または左側もしくは５′組換え結合部（Besmer
等,1986,Nature（London）320,415−421;Roebroek等,19
87,J.Virol.61,2009−2016）だけに観察された。このデ
ータは、５′相同組換えが１次的であるか、または２次
的であるかの決定を可能にしない。
な機構は不明確なままである。第１段階として、ウイル
スDNAが細胞性腫瘍遺伝子の隣りかまたはその中に組み
込まれることが示唆されている（Bishop,J.M.,1983,Ann
Rev.Biochem.52,301−354）。レトロウイルスおよび細
胞の配列は次のDNA欠失法（Bishop,J.M.,1983,Ann Rev.
Biochem.52,301−354;Czernilofsky等,1983,Nature 30
1,736−738）またはRNAリードスルー（Herman等,1987,S
cience 236,845−848;Nilsen等,1985,Cell 41,1719−17
16）により融合され得るが、相同性はこれらの方法のい
ずれかに関連することは知られていない。skiの場合に
おいて、ｃ−ski配列とp19コード領域との比較はskiウ
イルスの生成におけるいくつかの過程が相同的組換えを
含んでいたことを意味する。しかしながら、相同的組換
えは２次的であってよい。元の過程が非相同的であり、
そして直接反復を含むウイルスゲノムを生成するなら
ば、ルイ悪性腫瘍ウイルスに観察されたよう、おそらく
逆転写の間のコピー選択を介して反復間の配列がウイル
ス培養の間の組換えにより消失され得ることが期待され
るであろう。しかしながら、腫瘍遺伝子がｃ−oncと複
製可能ウイルスとの間の相同組換えにより要求されるモ
デルを提案することが可能である。相同の短い長さはウ
イルス腫瘍遺伝子の両末端（Banner等,1985,Mol.Cell.B
iol.5,1400−1407;Van Beveren等,1983,Cell 32,1241−
1255）または左側もしくは５′組換え結合部（Besmer
等,1986,Nature（London）320,415−421;Roebroek等,19
87,J.Virol.61,2009−2016）だけに観察された。このデ
ータは、５′相同組換えが１次的であるか、または２次
的であるかの決定を可能にしない。
トランス遺伝子およびトランスジェニックマウスの創成 ｃ−skiの７種全てのコード性エキソン由来の配列を
含むFB29であり、そしてDNA配列により判断され、750個
のアミノ酸のｃ−skiタンパク質をコード化する単離さ
れたcDNAの最大のものは誘導体ΔFB29の創成に使用され
た。ΔFB29は第５のコード性エキソン内の1475位にフレ
ームシフト突然変異を有し（一続きの５個のＣ中の１個
のＣがフレームシフト突然変異体において消失した）、
そして最初の436個のアミノ酸がｃ−skiのFB29体の最初
の436個のアミノ酸に同一である448個のアミノ酸のタン
パク質を生じることが予測される（最後の12個のアミノ
酸がフレームシフト突然変異を受け、そのためｃ−ski
のFB29体のものと異なっている）。トランス遺伝子の調
製において使用されるΔFB29は図６に模式的に示されて
いる。
含むFB29であり、そしてDNA配列により判断され、750個
のアミノ酸のｃ−skiタンパク質をコード化する単離さ
れたcDNAの最大のものは誘導体ΔFB29の創成に使用され
た。ΔFB29は第５のコード性エキソン内の1475位にフレ
ームシフト突然変異を有し（一続きの５個のＣ中の１個
のＣがフレームシフト突然変異体において消失した）、
そして最初の436個のアミノ酸がｃ−skiのFB29体の最初
の436個のアミノ酸に同一である448個のアミノ酸のタン
パク質を生じることが予測される（最後の12個のアミノ
酸がフレームシフト突然変異を受け、そのためｃ−ski
のFB29体のものと異なっている）。トランス遺伝子の調
製において使用されるΔFB29は図６に模式的に示されて
いる。
トランス遺伝子のski部分の構築は既に記載されてい
る（SutraveおよびHughes,1989,Mol.Cell.Biol.9,4046
−4051;Sutrave等,1990,Mol.Cell.Biol.10,3137−314
4）。要するに、ΔFB29と呼ばれる先端切除ニワトリｃ
−ski cDNAはアダプタープラスミドC1a12Ncoに予めクロ
ーン化された。ΔFB29と呼ばれる先端切除ニワトリｃ−
ski cDNAはアダプタープラスミドC1a12Ncoに予めクロー
ン化された。ΔFB29断片はCla1消化によりアダプタープ
ラスミドから切り出され、そして５′突出部をE.coliDN
AポリメラーゼＩのクレノウ断片および４種全てのdNTP
を用いて充填する。このブラント末端断片を、EcoRI制
限酵素での消化およびクレノウ断片とのブラント末端化
を行ったpMEXneoベクターに連結した。正しい配向に挿
入されたクローンを選択し、そしてPvu IおよびNru I両
方の制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらの酵素
はMSV LTRおよびSV40ポリＡシグナルが両端に配置され
たΔFB29cDNAを含む断片を遊離する（図６参照）。この
断片をゲル精製し、そしてマウス受精卵に注入するため
に用いた〔Hogan等,1986,Manipulating the mouse embr
yo.A Laboratory Manual.（コールド・スプリング・ハ
ーバー研究所，ニューヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー）〕。
る（SutraveおよびHughes,1989,Mol.Cell.Biol.9,4046
−4051;Sutrave等,1990,Mol.Cell.Biol.10,3137−314
4）。要するに、ΔFB29と呼ばれる先端切除ニワトリｃ
−ski cDNAはアダプタープラスミドC1a12Ncoに予めクロ
ーン化された。ΔFB29と呼ばれる先端切除ニワトリｃ−
ski cDNAはアダプタープラスミドC1a12Ncoに予めクロー
ン化された。ΔFB29断片はCla1消化によりアダプタープ
ラスミドから切り出され、そして５′突出部をE.coliDN
AポリメラーゼＩのクレノウ断片および４種全てのdNTP
を用いて充填する。このブラント末端断片を、EcoRI制
限酵素での消化およびクレノウ断片とのブラント末端化
を行ったpMEXneoベクターに連結した。正しい配向に挿
入されたクローンを選択し、そしてPvu IおよびNru I両
方の制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらの酵素
はMSV LTRおよびSV40ポリＡシグナルが両端に配置され
たΔFB29cDNAを含む断片を遊離する（図６参照）。この
断片をゲル精製し、そしてマウス受精卵に注入するため
に用いた〔Hogan等,1986,Manipulating the mouse embr
yo.A Laboratory Manual.（コールド・スプリング・ハ
ーバー研究所，ニューヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー）〕。
ΔFB29クローンはMSV LTRとSV40ポリアデニル化部位
との間に先端切除ｃ−ski cDNAがあるような配向でpMEX
発現プラスミド内に置かれている（図６参照）。このプ
ラスミドをPvu IおよびNru Iで消化して発現カセットを
遊離した。該発現カセットはゲル電気泳動により精製さ
れ、そしてマイクロインジェクションによりマウス受精
卵に導入された。44匹の創成マウが２回の別々の注射の
後に得られた。マウスは尾切断部から単離されたDNAの
ドットブロット分析により同定された。この分析はサザ
ン転写により確認された。44匹の創成マウスのうち３匹
が明らかな筋肉表現型を示した（TG8566,TG8821およびT
G8562）。この３匹の創成マウスおよび完全なトランス
遺伝子の再配列されていないコピーを含むが、しかし表
現型を示さない１匹のマウス（TG8542）が系を生成する
ために使用された。TG8566、TG8821、TG8562およびTG85
42からのDNAのサザン転写分析は、各系のトランス遺伝
子の組み込み部位が異なり、そしてコピー数がゲノムあ
たり約５−35コピーに及ぶことを示唆する。
との間に先端切除ｃ−ski cDNAがあるような配向でpMEX
発現プラスミド内に置かれている（図６参照）。このプ
ラスミドをPvu IおよびNru Iで消化して発現カセットを
遊離した。該発現カセットはゲル電気泳動により精製さ
れ、そしてマイクロインジェクションによりマウス受精
卵に導入された。44匹の創成マウが２回の別々の注射の
後に得られた。マウスは尾切断部から単離されたDNAの
ドットブロット分析により同定された。この分析はサザ
ン転写により確認された。44匹の創成マウスのうち３匹
が明らかな筋肉表現型を示した（TG8566,TG8821およびT
G8562）。この３匹の創成マウスおよび完全なトランス
遺伝子の再配列されていないコピーを含むが、しかし表
現型を示さない１匹のマウス（TG8542）が系を生成する
ために使用された。TG8566、TG8821、TG8562およびTG85
42からのDNAのサザン転写分析は、各系のトランス遺伝
子の組み込み部位が異なり、そしてコピー数がゲノムあ
たり約５−35コピーに及ぶことを示唆する。
３つの系（TG8566,TG8821およびTG8562）からのDNA陽
性マウスは異常な筋肉成長を生じる同様の明確な外観を
有していた。３つの系のマウスは腫瘍遺伝子を保持する
けれども、いずれの系も腫瘍の高められた発生を有する
ようには見えない。ニワトリが感染細胞を注射されない
ならば、ｖ−skiウイルスはその鳥において腫瘍原性で
ないから、上記の結果は全体的に予期されない〔E.Stav
nezer,1988,The Oncogene Handbook,E.P.Reddy,A.Akalk
aおよびT.Curran編，（アムステルダム：エンセビエル
・サイエンス出版社）393−401頁〕。３つの系統のマウ
スは骨格筋の他は高レベルのトランス遺伝子を発現しな
い。このことは、ｃ−skiが骨格筋細胞に直接影響を及
ぼすもので、改変された運動神経機能の二次的結果とし
てではないという知見と一致する。大部分の骨格筋が包
含される。この表現型を有するマウスは拡大された前脚
筋および顎筋の外観により容易に同定され得る（図
７）。表現型は３つの別々の創成体で得られるから、最
も妥当な説明は表現型がニワトリｃ−skiトランス遺伝
子により引き起こされるということである。それ故に、
マウスの全４種の系、筋肉の発達した表現型を有する３
系および観察できる表現型を持たなかった１系が、トラ
ンス遺伝子の発現のために試験された。
性マウスは異常な筋肉成長を生じる同様の明確な外観を
有していた。３つの系のマウスは腫瘍遺伝子を保持する
けれども、いずれの系も腫瘍の高められた発生を有する
ようには見えない。ニワトリが感染細胞を注射されない
ならば、ｖ−skiウイルスはその鳥において腫瘍原性で
ないから、上記の結果は全体的に予期されない〔E.Stav
nezer,1988,The Oncogene Handbook,E.P.Reddy,A.Akalk
aおよびT.Curran編，（アムステルダム：エンセビエル
・サイエンス出版社）393−401頁〕。３つの系統のマウ
スは骨格筋の他は高レベルのトランス遺伝子を発現しな
い。このことは、ｃ−skiが骨格筋細胞に直接影響を及
ぼすもので、改変された運動神経機能の二次的結果とし
てではないという知見と一致する。大部分の骨格筋が包
含される。この表現型を有するマウスは拡大された前脚
筋および顎筋の外観により容易に同定され得る（図
７）。表現型は３つの別々の創成体で得られるから、最
も妥当な説明は表現型がニワトリｃ−skiトランス遺伝
子により引き起こされるということである。それ故に、
マウスの全４種の系、筋肉の発達した表現型を有する３
系および観察できる表現型を持たなかった１系が、トラ
ンス遺伝子の発現のために試験された。
発現カセットもまた当業界で公知の標準法を用いてブ
タ受精卵内に導入された。創成ブタは遺伝子の発現の予
期された筋肉に特定した選択を示し、従って、当該ブタ
が創成マウスにおいて見られたのと同様の筋肉表現型を
有するであろうことが予測される。
タ受精卵内に導入された。創成ブタは遺伝子の発現の予
期された筋肉に特定した選択を示し、従って、当該ブタ
が創成マウスにおいて見られたのと同様の筋肉表現型を
有するであろうことが予測される。
DNA/RNA分析 全体の細胞DNAおよびRNAは標準法により単離された。
RNA単離のために、組織を細かく切断し、RNAゾル（シナ
・バイオテックス）中にホモジナイズした後にすぐに液
体窒素中で凍結させ、そして製造業者の推奨に従って処
理した。ノーザン転写分析のために、異なる組織から全
RNA約20μｇを、2.2Mホルムアルデヒド含有1.5％アガロ
ースゲル上での電気泳動により分画した。RNAをニトロ
セルロース膜に転写し、そしてニック翻訳されたニワト
リski cDNAまたはニワトリβ−アクチンcDNAのいずれか
をプローブとして検索した。β−アクチンcDNAのコード
領域はその他の作用に対するメッセージと交差反応し、
そしてほとんどの組織からのRNAの定量および定性のた
めに使用され得る。
RNA単離のために、組織を細かく切断し、RNAゾル（シナ
・バイオテックス）中にホモジナイズした後にすぐに液
体窒素中で凍結させ、そして製造業者の推奨に従って処
理した。ノーザン転写分析のために、異なる組織から全
RNA約20μｇを、2.2Mホルムアルデヒド含有1.5％アガロ
ースゲル上での電気泳動により分画した。RNAをニトロ
セルロース膜に転写し、そしてニック翻訳されたニワト
リski cDNAまたはニワトリβ−アクチンcDNAのいずれか
をプローブとして検索した。β−アクチンcDNAのコード
領域はその他の作用に対するメッセージと交差反応し、
そしてほとんどの組織からのRNAの定量および定性のた
めに使用され得る。
脾臓、肺、脳、腎臓、肝臓、胃、心臓および脚（骨
格）筋からの全RNAが上記のように単離され、そして結
果が図８に示されている。表現型を有する３種の全ての
系（TG8566,TG8821およびTG8562）は骨格筋において高
レベルに2.5kbニワトリｃ−ski特定転写物を発現した
が、いくつかの系のマウスはその他の組織において低レ
ベルのニワトリｃ−skiRNAを示した。TG8562系は、骨格
筋中に比べ低いけれども、心臓中にトランス遺伝子から
のRNAを有する。TG8562マウスからの心臓の組織病理学
は、該組織への重要な影響がないことを示した。あらゆ
る表現型を示していないTG8542系は、表現型を示した系
に比べ、筋肉においてトランス遺伝子からのより低いレ
ベルのRNAを有していた。MSV LTRはその他の遺伝子に連
結された場合に種々の組織において発現されることが示
されているので（Khillan等,1987,Genes Dev.1,1327−1
335）、発現が筋肉に制限されたという観察は予期され
なかった。
格）筋からの全RNAが上記のように単離され、そして結
果が図８に示されている。表現型を有する３種の全ての
系（TG8566,TG8821およびTG8562）は骨格筋において高
レベルに2.5kbニワトリｃ−ski特定転写物を発現した
が、いくつかの系のマウスはその他の組織において低レ
ベルのニワトリｃ−skiRNAを示した。TG8562系は、骨格
筋中に比べ低いけれども、心臓中にトランス遺伝子から
のRNAを有する。TG8562マウスからの心臓の組織病理学
は、該組織への重要な影響がないことを示した。あらゆ
る表現型を示していないTG8542系は、表現型を示した系
に比べ、筋肉においてトランス遺伝子からのより低いレ
ベルのRNAを有していた。MSV LTRはその他の遺伝子に連
結された場合に種々の組織において発現されることが示
されているので（Khillan等,1987,Genes Dev.1,1327−1
335）、発現が筋肉に制限されたという観察は予期され
なかった。
skiトランス遺伝子を発現する組織において転写が適
当な部位で開始されたかどうかを決定するために、RNA
アーゼ保護アッセイがMeltonにより記載されたように行
われた（Melton等,1984,Nucl.Acids Res.12,7035−703
6）。Pvu IないしBgl Iの1.8kb断片をブルースクリプト
KSベクター中でサブクローン化し、そしてT7プロモータ
ーからの放射標識RNAを生成するために使用した。全RNA
約10μｇをプローブ５×105cpmとハイブリダイゼーショ
ンさせた。ハイブリダイゼーションは80％ホルムアミド
および１倍緩衝液（５倍ハイブリダイゼーション緩衝液
は0.2M Pipes,pH6.4,2M塩化ナトリウム,5mM EDTAであ
る）中50℃で一晩行われた。ハイブリダイゼーションの
後、試料をリボヌクレアーゼ消化緩衝液（10mMトリスC
1,pH7.5,0.3M塩化ナトリウム5mM EDTA）中に希釈し、そ
してRNアーゼT1と1u/μの濃度で30℃60分間処理し
た。20％SDS10μおよびプロテイナーゼＫ（保存液10m
g/ml）４μの添加および37℃で15分間の保温によりRN
アーゼ消化を停止させた。消化試料をフェノール−クロ
ロホルム（1:1混合液）で抽出し、担体tRNAとエタノー
ル沈殿させた。ペレットを70％エタノールで１回すす
ぎ、乾燥させ、そしてブロモフェノールブルーおよびキ
シレンシアノール染料を含有するホルムアミド中に溶解
させた。試料を100℃で変性させ、そして7.5M尿素含有
の６％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
当な部位で開始されたかどうかを決定するために、RNA
アーゼ保護アッセイがMeltonにより記載されたように行
われた（Melton等,1984,Nucl.Acids Res.12,7035−703
6）。Pvu IないしBgl Iの1.8kb断片をブルースクリプト
KSベクター中でサブクローン化し、そしてT7プロモータ
ーからの放射標識RNAを生成するために使用した。全RNA
約10μｇをプローブ５×105cpmとハイブリダイゼーショ
ンさせた。ハイブリダイゼーションは80％ホルムアミド
および１倍緩衝液（５倍ハイブリダイゼーション緩衝液
は0.2M Pipes,pH6.4,2M塩化ナトリウム,5mM EDTAであ
る）中50℃で一晩行われた。ハイブリダイゼーションの
後、試料をリボヌクレアーゼ消化緩衝液（10mMトリスC
1,pH7.5,0.3M塩化ナトリウム5mM EDTA）中に希釈し、そ
してRNアーゼT1と1u/μの濃度で30℃60分間処理し
た。20％SDS10μおよびプロテイナーゼＫ（保存液10m
g/ml）４μの添加および37℃で15分間の保温によりRN
アーゼ消化を停止させた。消化試料をフェノール−クロ
ロホルム（1:1混合液）で抽出し、担体tRNAとエタノー
ル沈殿させた。ペレットを70％エタノールで１回すす
ぎ、乾燥させ、そしてブロモフェノールブルーおよびキ
シレンシアノール染料を含有するホルムアミド中に溶解
させた。試料を100℃で変性させ、そして7.5M尿素含有
の６％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
均一に標識されたアンチセンスRNAがMSV LTRとｃ−sk
iに及ぶ断片からのT7 RNAポリメラーゼにより製造され
た（図９参照）、３種の陽性トランスジェニック系から
のRNAを用いると、約980塩基の保護断片が見られるが、
これは転写がMSV LTR内の実際の開始部位で開始される
場合に予想される大きさである（図９参照）。この分析
はまた、表現型陽性および表現型陰性のマウス系の両方
の心筋および骨格筋においてトランス遺伝子RNAのレベ
ルのより定量的な評価を与える。図９はTG8821の心臓中
のトランス遺伝子RNAのレベルが骨格筋中に見いだされ
たレベルに比べより低いことを示す（概算で1/10ないし
1/20）、さらにこの分析は、表現型陰性の系TG8542が低
いが骨格筋中に検出可能なレベルのトランス遺伝子RNA
を有することを示す。これらのデータは筋肉の発達した
表現型がニワトリｃ−skiトランス遺伝子の発現と関連
するだけでなく、筋肉表現型を製造するために最低いき
値レベルのｃ−skiRNAが達成されていなければならない
ことを示唆する。実際、これらのデータは、トランス遺
伝子の効果を見るための最低いき値レベルは高く、おそ
らく被試験ニワトリ組織における内因性ｃ−ski発現（S
utraveおよびHughes,1989,Mol.Cell.Biol.9,4046−405
1）の数千倍のレベルであることを示唆する。
iに及ぶ断片からのT7 RNAポリメラーゼにより製造され
た（図９参照）、３種の陽性トランスジェニック系から
のRNAを用いると、約980塩基の保護断片が見られるが、
これは転写がMSV LTR内の実際の開始部位で開始される
場合に予想される大きさである（図９参照）。この分析
はまた、表現型陽性および表現型陰性のマウス系の両方
の心筋および骨格筋においてトランス遺伝子RNAのレベ
ルのより定量的な評価を与える。図９はTG8821の心臓中
のトランス遺伝子RNAのレベルが骨格筋中に見いだされ
たレベルに比べより低いことを示す（概算で1/10ないし
1/20）、さらにこの分析は、表現型陰性の系TG8542が低
いが骨格筋中に検出可能なレベルのトランス遺伝子RNA
を有することを示す。これらのデータは筋肉の発達した
表現型がニワトリｃ−skiトランス遺伝子の発現と関連
するだけでなく、筋肉表現型を製造するために最低いき
値レベルのｃ−skiRNAが達成されていなければならない
ことを示唆する。実際、これらのデータは、トランス遺
伝子の効果を見るための最低いき値レベルは高く、おそ
らく被試験ニワトリ組織における内因性ｃ−ski発現（S
utraveおよびHughes,1989,Mol.Cell.Biol.9,4046−405
1）の数千倍のレベルであることを示唆する。
タンパク質分析 基礎にある仮定は、ｃ−skiRNA発現が筋肉の発達した
発現型を直接生じるということではなく、むしろ該発現
型がｃ−skiタンパク質の存在のためであるということ
である。従って、ｃ−skiタンパク質がウエスタン転写
アッセイにおいて観察さた。ｃ−skiの50kd体を特異的
に認識するウサギ抗血清が調製されたけれども（Sutrav
e等,1990,Mol.Cell.Biol.10,3137−3144）、これらの抗
血清はウエスタン転写アッセイにおいて十分に作用しな
い。ｃ−skiを認識し、ウエスタン転写アッセイにおい
て十分に作用するマウスモノクローナル抗体が開発され
たが、これらの試薬の使用は技術的問題を提示する。こ
れらのモノクローナル抗体は直接標識を可能にする十分
量利用できなかった。例えば標識ウサギ抗マウスを用い
る間接標準法は、抗skiモノクロナールだけでなく、内
因性マウス重鎖をも検出し、これはトランス遺伝子から
製造されたｃ−skiの50kd体と一緒に移動する。この問
題を解決するために、通常対照およびトランスジェニッ
クマウスからの筋肉および対照組織（肝臓）の抽出物が
調製された。内因性マウス抗体は下記のようにウサギ抗
マウス抗体との沈殿によりこれらの抽出物から除去され
た。
発現型を直接生じるということではなく、むしろ該発現
型がｃ−skiタンパク質の存在のためであるということ
である。従って、ｃ−skiタンパク質がウエスタン転写
アッセイにおいて観察さた。ｃ−skiの50kd体を特異的
に認識するウサギ抗血清が調製されたけれども（Sutrav
e等,1990,Mol.Cell.Biol.10,3137−3144）、これらの抗
血清はウエスタン転写アッセイにおいて十分に作用しな
い。ｃ−skiを認識し、ウエスタン転写アッセイにおい
て十分に作用するマウスモノクローナル抗体が開発され
たが、これらの試薬の使用は技術的問題を提示する。こ
れらのモノクローナル抗体は直接標識を可能にする十分
量利用できなかった。例えば標識ウサギ抗マウスを用い
る間接標準法は、抗skiモノクロナールだけでなく、内
因性マウス重鎖をも検出し、これはトランス遺伝子から
製造されたｃ−skiの50kd体と一緒に移動する。この問
題を解決するために、通常対照およびトランスジェニッ
クマウスからの筋肉および対照組織（肝臓）の抽出物が
調製された。内因性マウス抗体は下記のようにウサギ抗
マウス抗体との沈殿によりこれらの抽出物から除去され
た。
トランスジェニックおよび対照マウスからの組織中の
skiタンパク質の検出のために、組織１−5mgをRIPA緩衝
液1ml、20mMトリスC1pH7.5、150mM NaC1、0.5％SDS、0.
5％NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDT
A、1mM PMSFおよび35μ/mlアプロテイニン中にホモジナ
イズした。ホモジネートを10000rpmで10分間の遠心分離
により清澄化した。1mg/mlウサギ抗マウスIgG（PBS中）
10μとの氷上で２時間の保温により、マウスIgGが上
澄み100μから除去された。複合体がRIPA緩衝液中の4
0％プロテインＡセファロースビーズ100μを添加する
ことにより除去された。生成する上澄みが集められ、そ
して20μが10％SDSポリアクリルアミドゲル上で分画
された。タンパク質を、0.125MトリスC1、0.092Mグリシ
ンおよび20％メタノール、pH8.3含有の緩衝液中で一晩
ニトロセルロース膜に転写した。TBS緩衝液（0.5Mトリ
スC1,pH7.4および0.2M塩化ナトリウム）中の４％乾燥脱
脂乳を用いて室温で２時間フィルターをブロックし、そ
して３種の抗skiモノクローナル抗体の混合物と1:3000
の希釈で２時間室温で保温し、次いでTBSで３回洗浄し
た。ウサギ抗マウスIgGとの２回目の保温は室温で２時
間行われた（1mg/ml貯蔵液から1:2000希釈）。フィルタ
ーを上記のように洗浄し、そして最後に126Iプロテイン
Ａ（アマルシャム，比活性30mCi/mg）５μCiと室温で２
時間保温した。フィルターをTBSで３回洗浄し、そしてX
ARコダックフィルムに−70℃で６日間暴露した。
skiタンパク質の検出のために、組織１−5mgをRIPA緩衝
液1ml、20mMトリスC1pH7.5、150mM NaC1、0.5％SDS、0.
5％NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDT
A、1mM PMSFおよび35μ/mlアプロテイニン中にホモジナ
イズした。ホモジネートを10000rpmで10分間の遠心分離
により清澄化した。1mg/mlウサギ抗マウスIgG（PBS中）
10μとの氷上で２時間の保温により、マウスIgGが上
澄み100μから除去された。複合体がRIPA緩衝液中の4
0％プロテインＡセファロースビーズ100μを添加する
ことにより除去された。生成する上澄みが集められ、そ
して20μが10％SDSポリアクリルアミドゲル上で分画
された。タンパク質を、0.125MトリスC1、0.092Mグリシ
ンおよび20％メタノール、pH8.3含有の緩衝液中で一晩
ニトロセルロース膜に転写した。TBS緩衝液（0.5Mトリ
スC1,pH7.4および0.2M塩化ナトリウム）中の４％乾燥脱
脂乳を用いて室温で２時間フィルターをブロックし、そ
して３種の抗skiモノクローナル抗体の混合物と1:3000
の希釈で２時間室温で保温し、次いでTBSで３回洗浄し
た。ウサギ抗マウスIgGとの２回目の保温は室温で２時
間行われた（1mg/ml貯蔵液から1:2000希釈）。フィルタ
ーを上記のように洗浄し、そして最後に126Iプロテイン
Ａ（アマルシャム，比活性30mCi/mg）５μCiと室温で２
時間保温した。フィルターをTBSで３回洗浄し、そしてX
ARコダックフィルムに−70℃で６日間暴露した。
トランスジェニック動物からの作用を受けた組織（骨
格筋）だけが50kdのｃ−skiタンパク質を含有する（図1
0）。これらのデータはまた、３種の陽性系の筋肉中の
ｃ−skiタンパク質のレベルに違いがあり得るというこ
とを示唆するが、この実験における操作の複雑さは定量
的理解を不確かな問題にする。
格筋）だけが50kdのｃ−skiタンパク質を含有する（図1
0）。これらのデータはまた、３種の陽性系の筋肉中の
ｃ−skiタンパク質のレベルに違いがあり得るというこ
とを示唆するが、この実験における操作の複雑さは定量
的理解を不確かな問題にする。
組織学 組織学のために、TG8566系からの選択された筋肉が起
始点および着生点で付着したままであるように分離さ
れ、次に２％ホルムアルデヒド、２％グルタルアルデヒ
ド中に固定された。固定された筋肉を筋膨大部の中央を
正確に通って切開し、そしてJB4プラスチック（ポリサ
イエンセズ，ペンシルベニア州）中に包埋した。
始点および着生点で付着したままであるように分離さ
れ、次に２％ホルムアルデヒド、２％グルタルアルデヒ
ド中に固定された。固定された筋肉を筋膨大部の中央を
正確に通って切開し、そしてJB4プラスチック（ポリサ
イエンセズ，ペンシルベニア州）中に包埋した。
免疫細胞化学のために、組織を液体窒素中で冷却した
イソペンタン中で急速冷凍した。免疫化学染色のための
操作はNarusawa等に概略従った〔（1987）,J.Cell.Bio
l.104,447−459〕。
イソペンタン中で急速冷凍した。免疫化学染色のための
操作はNarusawa等に概略従った〔（1987）,J.Cell.Bio
l.104,447−459〕。
結果は、トランス遺伝子の発現がほとんどあり、そし
てその作用は筋肉に制限され、発現および作用が少なく
ともTG8566系においては、特定の筋肉、明確には特定の
繊維型に限定されていることを示した。しかしながら、
作用を受けた繊維は同型の全てであるわけではない。
てその作用は筋肉に制限され、発現および作用が少なく
ともTG8566系においては、特定の筋肉、明確には特定の
繊維型に限定されていることを示した。しかしながら、
作用を受けた繊維は同型の全てであるわけではない。
心筋は正常であり、そしてこれらの動物において内蔵
の平滑筋の異常はなかった。図11aおよび11bは成熱オス
対照マウスとトランスジェニックマウスからの脚低筋の
中央から正確に作成された横断切片を比較する。対照の
横断切片面積は2.7μ２であり、TG8566マウスのそれは
対照値の２倍以上である9.4μ２である。この増大した
成長は一般化されている。横断切片における匹敵する増
大はTG8566系のオスおよびメスのマウスを通じてほぼ全
ての軸性および虫垂筋に見られた。３種の筋肉だけ：
舌、横隔膜および脚底が正常であることが見いだされ
た。これらはトランスジェニックマウスにおいて対照マ
ウスのものと同じ大きさである（図12参照）。RNAはTG8
566マウスの横隔膜および脚底筋から単離された。ノー
ザン転写分析により、ニワトリｃ−skiRNAのレベルが同
系からの作用を受けた筋肉に比べこれら２つの表現型的
に通常の筋肉においてより低いことが示される（図1
3）。
の平滑筋の異常はなかった。図11aおよび11bは成熱オス
対照マウスとトランスジェニックマウスからの脚低筋の
中央から正確に作成された横断切片を比較する。対照の
横断切片面積は2.7μ２であり、TG8566マウスのそれは
対照値の２倍以上である9.4μ２である。この増大した
成長は一般化されている。横断切片における匹敵する増
大はTG8566系のオスおよびメスのマウスを通じてほぼ全
ての軸性および虫垂筋に見られた。３種の筋肉だけ：
舌、横隔膜および脚底が正常であることが見いだされ
た。これらはトランスジェニックマウスにおいて対照マ
ウスのものと同じ大きさである（図12参照）。RNAはTG8
566マウスの横隔膜および脚底筋から単離された。ノー
ザン転写分析により、ニワトリｃ−skiRNAのレベルが同
系からの作用を受けた筋肉に比べこれら２つの表現型的
に通常の筋肉においてより低いことが示される（図1
3）。
最も明らかなその他の全体的な形態学的異常性は、ト
ランスジェニック動物にほぼ全体的に脂肪がないのに対
し、対照動物が実質量の皮下脂肪および腹膜組織内脂肪
を含むことである。このために、対照マウスとTG8566マ
ウスには体重の違いがほとんどない。骨格の異常性もあ
る：トランスジェニック動物の脛骨は大きさが正常であ
るが、明らかに、全部脛骨と伸長ジギトラム筋の大きさ
２倍以上の増大に順応するための適応として、頭蓋骨の
ように湾曲している。
ランスジェニック動物にほぼ全体的に脂肪がないのに対
し、対照動物が実質量の皮下脂肪および腹膜組織内脂肪
を含むことである。このために、対照マウスとTG8566マ
ウスには体重の違いがほとんどない。骨格の異常性もあ
る：トランスジェニック動物の脛骨は大きさが正常であ
るが、明らかに、全部脛骨と伸長ジギトラム筋の大きさ
２倍以上の増大に順応するための適応として、頭蓋骨の
ように湾曲している。
対照マウスにおける筋肉はある範囲の横断切片面積を
有する繊維からなる。大きさの範囲はTG8566マウスにお
いて極めて増大されている（図11および12）。全ての繊
維が作用を受けているわけではない。肥大は選ばれた数
の繊維に限定されている（図11d）。これらの繊維の肥
大はTG8566系における筋肉量の増大を明らかに説明す
る。繊維数は個々の筋肉において顕著に増大していると
いう証拠はなかった。例えば、対照脚底における繊維数
は912±111（ｎ＝３）であり、TG8566では991±87（ｎ
＝３）である。同様に、TG8566マウスと対照マウスの伸
長ジギトラム長筋内の繊維総数に違いは見られなかっ
た。
有する繊維からなる。大きさの範囲はTG8566マウスにお
いて極めて増大されている（図11および12）。全ての繊
維が作用を受けているわけではない。肥大は選ばれた数
の繊維に限定されている（図11d）。これらの繊維の肥
大はTG8566系における筋肉量の増大を明らかに説明す
る。繊維数は個々の筋肉において顕著に増大していると
いう証拠はなかった。例えば、対照脚底における繊維数
は912±111（ｎ＝３）であり、TG8566では991±87（ｎ
＝３）である。同様に、TG8566マウスと対照マウスの伸
長ジギトラム長筋内の繊維総数に違いは見られなかっ
た。
繊維のどの型がTG8566系において作用を受けているか
を調べるため、スローミオシン重鎖（MHC）（NOQ7 5 4
D,Narusawa等,1987,J.Cell.Biol.104,447−459）、全て
のファストMHC（2G3,Narusawa等,1987,J.Cell.Biol.10
4,447−459）II型ファストMHC（SC7 11,Schiaffino等,1
989,J.Muscle Res.and Cell Motil,10,197−205）およ
びII b型ファストMHC（BF−F3,Schiaffino等,1989,J.Mu
scle Res.and Cell Motil.10,197−205）を特異的に認
識する３種のモノクローナル抗体が使用された。図14は
これらの３種の抗体を有するロームボイドスキャピティ
ス筋からの切片の免疫蛍光染色を示す。スロー繊維が増
大している証拠は見られず（図14a）、そしてTG8566マ
ウスからのロームボイドイスキャピティス筋のスロー繊
維の総数（120）は対照マウスからのロームボイドイス
キャピティス筋に見いだされたスロー繊維の数（117）
に近似する。II a型繊維の多くは肥大繊維間にあり、そ
してそれらの近傍への広がりにより圧迫されるかのよう
に、しばしば形が歪められている（図14b）。
を調べるため、スローミオシン重鎖（MHC）（NOQ7 5 4
D,Narusawa等,1987,J.Cell.Biol.104,447−459）、全て
のファストMHC（2G3,Narusawa等,1987,J.Cell.Biol.10
4,447−459）II型ファストMHC（SC7 11,Schiaffino等,1
989,J.Muscle Res.and Cell Motil,10,197−205）およ
びII b型ファストMHC（BF−F3,Schiaffino等,1989,J.Mu
scle Res.and Cell Motil.10,197−205）を特異的に認
識する３種のモノクローナル抗体が使用された。図14は
これらの３種の抗体を有するロームボイドスキャピティ
ス筋からの切片の免疫蛍光染色を示す。スロー繊維が増
大している証拠は見られず（図14a）、そしてTG8566マ
ウスからのロームボイドイスキャピティス筋のスロー繊
維の総数（120）は対照マウスからのロームボイドイス
キャピティス筋に見いだされたスロー繊維の数（117）
に近似する。II a型繊維の多くは肥大繊維間にあり、そ
してそれらの近傍への広がりにより圧迫されるかのよう
に、しばしば形が歪められている（図14b）。
小さいファストII a型繊維および全ての肥大繊維はモ
ノクローナル抗体2G3で染色され（図14c）、全てが肥大
繊維がファストであることを示す。ロームボイドイスキ
ャピティスにおいて、全てでないがほとんどの大きい繊
維もまた、II bMHCに特異的であるモノクローナル抗体B
F−F3で染色される（図14d）。脚底では、反応性に多く
の相違があり、そして肥大繊維の50％のみがBF−F3で染
色される。これらの結果は、TG8566マウスにおける繊維
の肥大変形が少なくとも２つの型のファスト繊維を含む
ことを示す。これらの１つはII b型である。排除によ
り、われわれは他方がIIX繊維（Schiaffino等,1989,J.M
uscle Res.and Cell Motil.10,197−205;Termin等,198
9,Histochemistry 92,453−457;Gorza,1990,J.Histoche
m.Cytochem.38,257−265）であることを示唆する。
ノクローナル抗体2G3で染色され（図14c）、全てが肥大
繊維がファストであることを示す。ロームボイドイスキ
ャピティスにおいて、全てでないがほとんどの大きい繊
維もまた、II bMHCに特異的であるモノクローナル抗体B
F−F3で染色される（図14d）。脚底では、反応性に多く
の相違があり、そして肥大繊維の50％のみがBF−F3で染
色される。これらの結果は、TG8566マウスにおける繊維
の肥大変形が少なくとも２つの型のファスト繊維を含む
ことを示す。これらの１つはII b型である。排除によ
り、われわれは他方がIIX繊維（Schiaffino等,1989,J.M
uscle Res.and Cell Motil.10,197−205;Termin等,198
9,Histochemistry 92,453−457;Gorza,1990,J.Histoche
m.Cytochem.38,257−265）であることを示唆する。
酸予備保温後の肥大繊維のアクトミオシンATPアーゼ
組織化学的反応での染色における相違、ミトコンドリア
酵素活性のためのDPNH染色およびPAS染色の全てが１以
上のファスト繊維型がこの系のトランスジェニックマウ
スにおいて作用を受けるという結論を支持する。これら
の結果はまた、II bおよびIIX繊維の両方が肥大してい
るという解釈を支持する。
組織化学的反応での染色における相違、ミトコンドリア
酵素活性のためのDPNH染色およびPAS染色の全てが１以
上のファスト繊維型がこの系のトランスジェニックマウ
スにおいて作用を受けるという結論を支持する。これら
の結果はまた、II bおよびIIX繊維の両方が肥大してい
るという解釈を支持する。
偶発的壊死性および再生性繊維がTG8566マウスの筋肉
の全てではないがいくつかに見いだされた。後ろ脚にお
いて、これらは全部脛骨筋に最も広範囲に存在するよう
に見え、それらはロームボイドイスキャピティス、首の
表面筋には決して見いだされなかった。
の全てではないがいくつかに見いだされた。後ろ脚にお
いて、これらは全部脛骨筋に最も広範囲に存在するよう
に見え、それらはロームボイドイスキャピティス、首の
表面筋には決して見いだされなかった。
＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 上記の全ての刊行物は引用によりそれら全体が本明細
書に編入される。
書に編入される。
以上、本発明は明確化および理解のためにある程度詳
細に記載されてきたが、本明細書の開示を読めば、当業
者により、形態および詳細の種々の変化は本発明の真の
範囲および特許請求の範囲を離脱せずになされ得ること
が理解されるであろう。
細に記載されてきたが、本明細書の開示を読めば、当業
者により、形態および詳細の種々の変化は本発明の真の
範囲および特許請求の範囲を離脱せずになされ得ること
が理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スートレイブ，プラモード アメリカ合衆国，メリーランド 21701, フレデリック，２ディー，ラトルエッジ プレイス 1211 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，57（３），1065−1072（1986) Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ａｂｓｔ ｒａｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｂ，47（９），3649（1987) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９ （９），4038−4045（1989) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９ （９），4046−4051（1989) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，10 （６），3137−3144（1990) Ｃｅｌｌ，59，293−303（1989) Ｓｃｉｅｎｃｅ，240，1483−1488 （1988），Ｓｃｉｅｎｃｅ，242，1575 −1578（1988) Ｓｃｉｅｎｃｅ，244，1275−1281 （1988），Ｐｒｏｃ，Ｎａｌｔ，Ａｃａ ｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，85，3150−3154 （1988)
Claims (5)
- 【請求項１】ニワトリｃ−skiタンパク質をコード化す
るか、またはニワトリｃ−skiタンパク質をコード化す
る配列に相補的であるDNA断片であって、前記ニワトリ
ｃ−skiタンパク質は下記のアミノ酸配列を有する、前
記DNA断片。 - 【請求項２】ｉ）請求項１記載のDNA断片、および ii）ベクター を含むDNA構築物。
- 【請求項３】前記ベクターが、先端切除ニワトリｃ−sk
iタンパク質をコード化するDNA断片を挟んでMSV LTRお
よびSV50ポリＡシグナルを、隣接する制限部位Pvu IとN
ru Iとの間にあるDNA断片内に有する請求項２記載の構
築物。 - 【請求項４】請求項２記載の構築物においてコード化さ
れた前記タンパク質の発現を可能にする様式で、前記構
築物で安定に形質転換された宿主細胞。 - 【請求項５】哺乳動物細胞である請求項４記載の宿主細
胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37386489A | 1989-06-30 | 1989-06-30 | |
| US373,864 | 1989-06-30 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9180679A Division JPH10117785A (ja) | 1989-06-30 | 1997-06-20 | 動物における筋肉組織の増大 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04502559A JPH04502559A (ja) | 1992-05-14 |
| JP2706697B2 true JP2706697B2 (ja) | 1998-01-28 |
Family
ID=23474210
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2510457A Expired - Fee Related JP2706697B2 (ja) | 1989-06-30 | 1990-07-02 | 動物における筋肉組織の増大 |
| JP9180679A Pending JPH10117785A (ja) | 1989-06-30 | 1997-06-20 | 動物における筋肉組織の増大 |
Family Applications After (1)
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|---|---|---|---|
| JP9180679A Pending JPH10117785A (ja) | 1989-06-30 | 1997-06-20 | 動物における筋肉組織の増大 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0483219A4 (ja) |
| JP (2) | JP2706697B2 (ja) |
| AU (1) | AU633606B2 (ja) |
| CA (1) | CA2059137C (ja) |
| WO (1) | WO1991000287A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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| AU2016305490B2 (en) | 2015-08-07 | 2022-07-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method for producing an animal comprising a germline genetic modification |
-
1990
- 1990-07-02 JP JP2510457A patent/JP2706697B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-02 CA CA002059137A patent/CA2059137C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-02 EP EP19900911082 patent/EP0483219A4/en not_active Withdrawn
- 1990-07-02 WO PCT/US1990/003729 patent/WO1991000287A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-07-02 AU AU60548/90A patent/AU633606B2/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-06-20 JP JP9180679A patent/JPH10117785A/ja active Pending
Non-Patent Citations (8)
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|---|
| Ｃｅｌｌ，５９，２９３−３０３（１９８９） |
| Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｂ，４７（９），３６４９（１９８７） |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５７（３），１０６５−１０７２（１９８６） |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（６），３１３７−３１４４（１９９０） |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（９），４０３８−４０４５（１９８９） |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（９），４０４６−４０５１（１９８９） |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４８３−１４８８（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５７５−１５７８（１９８８） |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２７５−１２８１（１９８８），Ｐｒｏｃ，Ｎａｌｔ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８５，３１５０−３１５４（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0483219A1 (en) | 1992-05-06 |
| EP0483219A4 (en) | 1992-08-26 |
| CA2059137A1 (en) | 1990-12-31 |
| AU633606B2 (en) | 1993-02-04 |
| CA2059137C (en) | 2005-04-19 |
| AU6054890A (en) | 1991-01-17 |
| JPH10117785A (ja) | 1998-05-12 |
| JPH04502559A (ja) | 1992-05-14 |
| WO1991000287A1 (en) | 1991-01-10 |
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