JP2683180B2 - 走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エネルギー移動理論に
基づくエネルギー受容体の発光を利用した走査型光学顕
微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】微小な物体を観察するのに種々の顕微鏡
が作られ利用されている。このうち、光学顕微鏡は手軽
であるため広く使われているのだが、また、試料を非破
壊的に観察できるのも大きな利点の一つである。しか
し、光学顕微鏡は、光の干渉が生じることからその光の
波長程度の分解能までしか得られないことが理論的に知
られている。光を用いた顕微鏡では、この点が大きなネ
ックになっていたのであるが、この限界を越え得るもの
として注目されているものに近接場走査型光学顕微鏡が
ある（Ｏ plus Ｅ 1989.Sept.「近接場走査型顕微蛍光
分析法の開発と生体観察への試み」岡崎 敏 京都大学
理学部）。

【０００３】近接場走査型光学顕微鏡は、光の波長より
も小さなピンホール（スリット）から漏れる光を利用す
るもので、ピンホールを試料に当ててピンホール及び試
料を透過する光を観察し、ピンホールを走査して試料の
像を得ている。この近接場走査型光学顕微鏡では、ピン
ホールが小さいほど分解能が向上し、１０〜２０ｎｍの
分解能を得ることが予想され、その達成するための研究
がなされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】光を用いた顕微鏡にお
いては、試料を非破壊的に観察できるという大きな利点
があるのだが、光学顕微鏡には波長に基づく分解能の限
界があり、近接場走査型光学顕微鏡は現在研究中で実用
化に至ってはいない。また、近接場走査型光学顕微鏡の
分解能は１０〜２０ｎｍになると予想されているが、Ｄ
ＮＡ工学への応用を考えた場合、より高い分解能のもの
が必要になることが想定される。光を用いた顕微鏡の利
点を生かし、より高い分解能のものが望まれる。

【０００５】また、透過型の系では、光学的に散乱しや
すい試料或いは不透明な試料の観察には適さない。しか
し、一般的に近接場走査型光学顕微鏡では反射型の系を
構成し画像化を試みることが困難である。

【０００６】本発明は、前述の問題点に鑑み、新しい原
理に基づいた反射型の顕微鏡を提案するとともにその実
用化にあたって生じる欠点をあわせて解決した反射型の
顕微鏡を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の走査型光学顕微鏡は、試料中の物質の吸収
波長特性と同一の波長領域を含む発光波長特性を有する
エネルギー供与体と物質の発光波長特性と同一の波長領
域を含む吸収波長特性を有するエネルギー受容体を備え
ている探針と、エネルギー供与体を励起させて試料中の
物質へ励起エネルギーを伝達させる励起手段と、試料中
の物質の励起エネルギーを受けて励起されたエネルギー
受容体が発する光を検出する検出手段と、探針と試料と
の相対的な位置を制御する制御手段とを備えたことを特
徴とする。

【０００８】

【０００９】

【００１０】また、本発明の走査型光学顕微鏡は、試料
中のエネルギー供与体の発光波長特性と同一の波長領域
を含む吸収波長特性を有するエネルギー受容体を有する
とともにエネルギー供与体を励起する励起光を透過させ
る探針と、励起光を出力する励起手段と、エネルギー供
与体の励起エネルギーを受けて励起されたエネルギー受
容体が発する光を検出する検出手段と、試料と探針との
相対的な位置を制御する制御手段とを備えたことを特徴
とする。

【００１１】

【作用】本発明の走査型光学顕微鏡では、励起手段で励
起された上述のエネルギー供与体から上述の試料中の物
質へ非放射的に励起エネルギーが伝達され、この試料中
の物質は励起状態になる。そして、励起状態の物質から
上述のエネルギー受容体へ非放射的に励起エネルギーが
伝達される。励起状態になったエネルギー受容体が基底
状態に遷移する際に光が生じる。そして、この光が検出
手段で検出される。探針のエネルギー供与体−試料中の
物質間、試料中の物質−探針のエネルギー受容体間に伝
達される励起エネルギー量は、その距離の６乗に反比例
し、この場合、２度やり取りするので１２乗に反比例す
ることになる。この距離即ち試料と探針との相対的な位
置は、制御手段にて制御されており、励起される試料中
の位置及び範囲が制御される。これによって、物質の位
置に対応した試料の像が得られる。また、この像の分解
能は、伝達される範囲で決められる。

【００１２】また、エネルギー供与体の励起光を透過さ
せてエネルギー供与体を励起する探針とした場合、探針
を透過した励起光によって励起された試料のエネルギー
供与体から探針のエネルギー受容体へ非放射的に励起エ
ネルギーへ伝達され、エネルギー受容体は励起状態にな
る。この励起状態から基底状態に遷移する際に光が生
じ、この発光が検出手段で検出される。そして、前述と
同様にして、特定物質または材料の位置に対応した試料
の像が得られ、分解能は伝達される範囲で決められる。

【００１３】

【実施例】本発明の実施例を図面を参照して説明する。
図１には、本発明の一実施例に係る走査型光学顕微鏡の
構成が示されている。この走査型光学顕微鏡は、光学
系，駆動系及びこれらの演算制御系とで構成される。

【００１４】光学系は、探針１００のエネルギー供与体
（以下、ドナー）でエネルギー試料１１０の蛍光性物質
を励起させ、この励起された蛍光性物質にて探針１００
のエネルギー受容体（以下、アクセプター）を励起させ
その発光を検出するもので、レーザ光源１２０，ダイク
ロイックミラー１２２，カップリングレンズ１４２，ラ
イトガイド１４４，ＳＭＬレンズ１０８，探針１００，
バリアフィルタ１３５，光検出器１３０で構成される。
探針１００は、図２のような構造を有し、ホルダ１００
ｄ内部の石英チップ１００ｅの先端にはドナー１００ｘ
及びアクセプター１００ｙで満たされている。この先端
の部分はアルミニウムの膜１００ｃで覆われ、ピンホー
ル１００ｂが設けられている。レーザ光源１２０はその
出力するレーザ光にてドナー１００ｘを励起する。ダイ
クロイックミラー１２２，カップリングレンズ１４２，
ライトガイド１４４，ＳＭＬレンズ１０８，バリアフィ
ルタ１３５は、レーザ光を探針１００へ導く光学系を形
成するとともにアクセプター１００ｙが励起状態から基
底状態に遷移する際に発する蛍光を分光して光検出器１
３０へ導く光学系を形成する。光検出器１３０は、蛍光
を検出し検出信号Ｓｉとして出力する。

【００１５】駆動系は、演算制御系の制御により試料１
１０と探針１００との相対的な位置を制御するもので、
ＸＹステージ２４０，ＸＹピエゾアクチュエータ２３
０，Ｚステージ２２０，Ｚピエゾアクチュエータ２１０
で構成される。ＸＹステージ２４０，Ｚステージ２２０
は、内蔵のステップモータにて試料１１０を３次元的に
移動させ、探針１００に対し所定の位置になるように試
料１１０を動かす。ＸＹピエゾアクチュエータ２３０，
Ｚピエゾアクチュエータ２１０は、内蔵のピエゾ素子に
より試料１１０の３次元的な微小の位置合わせを行う。
ＸＹステージ２４０，ＸＹピエゾアクチュエータ２３０
はＸＹ方向（レーザ光に垂直な面方向）について、Ｚス
テージ２２０，Ｚピエゾアクチュエータ２１０はＺ方向
（レーザ光に平行に方向）について試料１１０を移動さ
せる。これらの動作は、演算装置１５０の制御信号によ
り行われる。

【００１６】演算制御系は、駆動系及び光学系のレーザ
光源１２０の出力を制御するとともに光検出器１３０か
ら試料１１０の像の構築などを行うもので、演算装置１
５０，モニタ１６０，入力部（キーボード，マウスな
ど）１７０で構成される。演算装置１５０は、入力部１
７０からの入力に基づいて上述の各部に制御信号を出力
するとともに検出信号ＳｉをＡ／Ｄ変換してディジタル
データとして保持し、このディジタルデータから画像を
生成してモニタ１６０に表示する。入力部１７０からの
入力よってなされる演算装置１５０の制御により次に示
す様々なモードの動作がなされる。

【００１７】つぎに、図１の装置を用いた試料の観察及
び装置の動作について説明する。

【００１８】まず、蛍光性物質１１０ｚを含む或いは添
加された試料１１０及びこの試料１１０の蛍光性物質１
１０ｚに対応するドナー１００ｘ及びアクセプター１０
０ｙをもつ探針１００をセットする。蛍光性物質１１０
ｚ、アクセプター１００ｙ、及びドナー１００ｘは、蛍
光を発するものであって、エネルギー移動理論に基づい
て非放射的に励起エネルギーがドナー１００ｘから蛍光
性物質１１０ｚへ、また、蛍光性物質１１０ｚからアク
セプター１００ｙに移動することがその組み合わせの条
件となる。この点に付いてエネルギー移動理論を用いて
説明するとつぎのようになる。

【００１９】エネルギー移動は、励起された分子または
原子から他の分子または原子に励起エネルギーが移動す
る現象を言う。この現象は、さまざまな様式の相互作用
により起こるが、弱い双極子間相互作用によるもので
は、長い距離において働くことと２分子間の距離の６乗
に逆比例すると言う大きな特徴を持つ。エネルギー移動
の速度ｋｔは式（１）で表される。この式は、ドナーの
発光とアクセプターの吸収が重なり合う全領域の積分値
を含んでいる。

【００２０】

【数１】

【００２１】この式（１）から明らかなように、ドナー
１００ｘの発光と蛍光性物質１１０ｚの吸収、または、
蛍光性物質１１０ｚの発光とアクセプター１００ｙの吸
収が重なり合う領域があれば、距離の６乗に反比例して
エネルギー移動が起こることを示している。共鳴エネル
ギー移動の効率は２分子間のスペクトルの重なり積分の
値と２分子間の距離により影響を受ける。したがって、
このような関係から、螢光および吸収スペクトルの重な
り合う領域のあるドナー１００ｘと蛍光性物質１１０
ｚ，かつ蛍光性物質１１０ｚのとアクセプター１００ｙ
が存在することが用いるための条件となる。即ち、探針
１００としては、ドナーとアクセプターが存在する物質
を用いる。そして、光励起により生じたドナーの励起エ
ネルギーをドナーから試料中に存在する蛍光物質へ移動
し得ること、また、蛍光物質からアクセプターへエネル
ギー移動によりアクセプターから移動した励起エネルギ
ーを蛍光として発生し得ること、さらに、ドナーの蛍光
スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりが
ないことがその条件になる。

【００２２】本発明者は、上記エネルギー移動の系を満
足させる反射型の顕微鏡を構成させることを意図して、
探針１００の構成物質として、分子内にナフタレン構造
とペリレン構造とを持つ２官能性有機物結晶を用い、被
観察用試料１１０として、アントラセン構造を含む試薬
でラベル化された試料を用いた。図４はそれを模式的に
示したもので、図５，６，７は、それらナフタレン構
造，アントラセン構造，ペリレン構造の有機物の吸収ス
ペクトルおよび蛍光スペクトルを示したものである。２
５０〜２９０ｎｍの紫外光を励起光として探針１００に
照射することにより、まず探針１００のナフタレン構造
部位から被観察用試料のアントラセン構造部位へ、次
に、そのアントラセン構造部位から光学探針内のペリレ
ン構造部位へのエネルギー移動が起こり、２段階エネル
ギー移動を起こす反射型の近接場走査型光学顕微鏡が実
現する（図４）。

【００２３】試料１１０及び探針１００のセットを終え
ると、入力部１７０からつぎの動作の指示を与える。す
ると、演算装置１５０からの制御信号によってレーザ光
源１２０からのレーザー光が光学系を通って探針１００
に照射され、ドナー１００ｘが励起される。また、駆動
系の動作制御も行われ、探針１００を試料１１０に近接
させ、探針１００が試料１１０表面を２次元的にラスタ
走査される。このラスタ走査の際、探針１００近傍に試
料１１０の蛍光性物質１１０ｚがあると、この蛍光性物
質１１０ｚはドナー１００ｘによって励起される。蛍光
性物質１１０ｚの励起エネルギーはアクセプター１００
ｙに移動し、アクセプター１００ｙの状態遷移の際、蛍
光を発する。この蛍光は、光学系を経て分光され、光検
出器１３０で検出される。蛍光は、移動した励起エネル
ギー即ち励起された蛍光性物質１１０ｚの量に比例し
（式（１）など）、ドナー１００ｘと蛍光性物質１１０
ｚの距離が近いと励起される蛍光性物質１１０ｚが多く
なる。蛍光性物質１１０ｚがない場合は蛍光性物質１１
０ｚの蛍光が生じず、ドナー１００ｘからの蛍光が放出
される。これらの蛍光の強度が検出信号Ｓｉ（ｉ＝１，
２…）としてそれぞれ出力される。

【００２４】この検出信号Ｓｉには、目的とする２段階
エネルギー移動によるアクセプター１００ｙからの蛍光
の他に、探針１００でのドナー１００ｘからアクセプタ
ー１００ｙへの１段階のエネルギー移動、および励起光
によるアクセプター１００ｙへの直接光励起などによっ
て、アクセプター１００ｙから余分な蛍光が生じてい
る。レーザー光源１２０からの励起光によるアクセプタ
ー１００ｙへの直接励起による余分な蛍光量は、励起光
の波長と強さにより決まる。この余分な蛍光に対して
は、これを定数値（オフセット）として測定値より減ず
ることにより、その効果を除去される。また、探針１０
０のドナー１００ｘからアクセプター１００ｙへのエネ
ルギー移動による余分な蛍光に対しては、ドナー１００
ｘの発光の遷移モーメントとアクセプター１００ｙの吸
収の遷移モーメントが直交するように探針１００を構成
することにより防ぎうる。

【００２５】演算装置１５０では、制御信号による駆動
系が制御された位置と検出信号Ｓｉとから蛍光の強度分
布が求められる。そしてこの強度分布がモニタ１６０に
表示される。蛍光の強度は、前述したようにドナーと蛍
光性物質１１０ｚの距離の１２乗に反比例するため、試
料１１０表面の凸凹が強調されることになる。そこで、
入力部１７０の指示により蛍光の強度の１２乗根または
対数が求められ、これによって画像全体を見渡せるよう
表示が見やすくしている。

【００２６】入力部１７０の指示により高解像度動作を
させる場合、ドナー１００ｘに与える光を減少させ、エ
ネルギー移動が起こる範囲で探針１００を試料１１０か
ら近付け、ラスタ走査の間隔を狭める、という制御がな
される。探針１００を試料１１０から近付けることで、
式（１）から明らかなように、アクセプター１００ｙの
蛍光の強度が増加するのであるが、ドナー１００ｘに与
える光を減少させることで、この増加の補償がなされ検
出器の飽和を抑える。また、励起される蛍光性物質１１
０ｚは狭い範囲のものとなり（図６（ａ））、駆動系の
ラスタ走査の間隔を狭めて、コントラストを大きくして
いる。これによって高解像度の動作がなされている。

【００２７】拡大像を得るための動作では、上記動作に
て解像度を増加させ、ラスタ走査の範囲を狭くして動作
速度を向上させている。こうして拡大率に見合った動作
がなされる。

【００２８】入力部１７０の指示により低解像度動作を
させる場合、ドナー１００ｘに与える光を増加させ、探
針１００を試料１１０により遠ざけ、ラスタ走査の間隔
を広げる、という制御がなされる。探針１００を試料１
１０から遠ざけることで、アクセプター１００ｙの蛍光
の強度が減少するが、ドナー１００ｘに与える光を増加
させることで、この強度が減少の補償がなされる。ま
た、励起される蛍光性物質１１０ｚは広い範囲のものと
なり、（図６（ｂ））、ラスタ走査の間隔を広げて、低
解像度の動作がなされている。

【００２９】縮小像を得るための動作では、上記動作に
て解像度を減少させ、ラスタ走査の範囲を広くして縮小
率に見合った動作がなされる。

【００３０】このように、本発明では、エネルギー移動
理論を用いて走査型光学顕微鏡を構成し、２段階のエネ
ルギー移動を起こさせるような系を実現している。これ
によって、エネルギー移動理論に基づいて試料の凹凸に
関して非常に敏感な感度を持つ反射型顕微鏡が実現され
ている。特に、２段階のエネルギー移動を起こすという
ことで、感度が、距離の１２乗に関する感度により向上
されている。

【００３１】前述の従来例で紹介したような一般的な走
査型顕微鏡では、探針からの放射光強度は、試料と探針
との距離の３．７乗に反比例して減少する。一方、本発
明の走査型光学顕微鏡では、エネルギー移動理論による
ものであるため、エネルギー移動効率は１２乗に反比例
して減少する。そのため、実際に画像化を行った場合、
試料と探針とを結ぶ方向即ち光軸方向に感度が敏感なも
のになっている（これはトンネル顕微鏡などでいうとこ
ろの感度に類する）。また、エネルギー移動の方向即ち
指向性も前述の従来例のものよりも鋭く、本発明の走査
型光学顕微鏡に大きな優位性がある。

【００３２】また、単にエネルギー移動理論を適用する
だけでは、光軸方向の感度が強すぎる、指向性が強すぎ
る、画像化した際得られる画像が妙に強調されるなどの
問題点が生じることになるのであるが、これらについて
は、演算処理系で適切な制御，画像処理を行うことで解
決されている。

【００３３】また、上述した反射型の走査型光学顕微鏡
の構成に対し、図９のような構成にすることも可能であ
る。この図９の構成ではレーザー光源１２０からの光を
探針１００で透過させて試料１１０の蛍光性分子１１０
ｚを直接励起し、さらにその励起された試料から探針１
００へエネルギー移動を起こさせる、という励起エネル
ギーの移動がなされる。このような試料１１０を光励起
するという方法では、探針１００にエネルギー受容体１
１０ｙを存在させることにより、光励起された蛍光分子
１１０ｚから探針１００のエネルギー受容体１１０ｙへ
とエネルギー移動が生じ、この移動した励起エネルギー
によってエネルギー受容体１１０ｙから蛍光が発生す
る。これを検出して画像化が行われる。この場合も、当
然試料中の蛍光分子１１０ｚとエネルギー受容体の関係
はエネルギー移動理論が満たされている。

【００３４】この変形例では、光遮断皮膜１００ｃに関
係なく、試料１００の蛍光性分子１１０ｚとエネルギー
受容体１１０ｙのエネルギー移動を起こすことが可能で
ある。このため、少ない損失で試料１００から移動した
励起エネルギーによる蛍光を検出することができる。一
般的な近接場走査型光学顕微鏡を反射型で用いた場合、
光は光学探針先端部にあるピンホールを２回通過するこ
とになる。このためピンホールによる制限を受け、特に
試料からの蛍光はピンホールを通過したものに限られて
しまって検出しづらくなる。しかし、この変形例では、
このような制限がなくなり、より高感度の検出を可能に
している。

【００３５】

【発明の効果】以上の通り本発明の走査型光学顕微鏡に
よれば、試料と探針との相対的な位置を制御手段にて制
御することで、その位置に対応した試料の像が得られ、
この像の分解能は、エネルギーが伝達される範囲で決め
られるため、その像に応じたものにすることができ、ま
た、非常に高分解能にすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例の構成図。

【図２】探針の構成図。

【図３】蛍光強度分布のグラフ。

【図４】探針と試料の位置関係の模式図。

【図５】ナフタレンの吸収および蛍光スペクトルの分布
図。

【図６】アントラセンの吸収および蛍光スペクトルの分
布図。

【図７】ペリレンの吸収および蛍光スペクトルの分布
図。

【図８】本実施例においてエネルギー移動の範囲の変化
を示す図。

【図９】変形例の要部の構成図。

【符号の説明】

１００…探針、１００ｘ…ドナー、１００ｙ…アクセプ
ター、１１０…試料、１１０ｚ…蛍光性物質、１２０…
レーザ光源、１３０…光検出器、１５０…演算装置、２
１０…Ｚピエゾアクチュエータ、２２０…Ｚステージ、
２３０…ＸＹピエゾアクチュエータ、２４０…ＸＹステ
ージ。

フロントページの続き (72)発明者 土屋 広司 静岡県浜松市市野町1126番地の１ 浜松 ホトニクス株式会社内 (56)参考文献 特開 昭59−121310（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−278014（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233555（ＪＰ，Ａ) 特公 昭60−18940（ＪＰ，Ｂ１) Ｏ ＰＬＵＳ Ｅ， ＮＯ．118 （1989−９）， ＰＰ．110−116 ＡＰＰＬ．ＰＨＹＳ．ＬＥＴＴ．，49 〜11！ （ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ 1986），ＰＰ．674−676；Ａ．ＨＡＲＯ ＯＴＵＮＩＡＮ ＥＴ ＡＬ．：”ＳＵ ＰＥＲ−ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ ＦＬＵ ＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＮＥＡＲ−ＦＩＥ ＬＤ ＯＰＴＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＳＣ ＯＰＹ"

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の物質の吸収波長特性と同一の波
   長領域を含む発光波長特性を有するエネルギー供与体
   と、前記物質の発光波長特性と同一の波長領域を含む吸
   収波長特性を有するエネルギー受容体を備えている探針
   と、 前記エネルギー供与体を励起させて前記試料中の物質へ
   励起エネルギーを伝達させる励起手段と、 前記試料中の物質の励起エネルギーを受けて励起された
   前記エネルギー受容体が発する光を検出する検出手段
   と、 前記探針と試料との相対的な位置を制御する制御手段
   と、 を備えたことを特徴とする走査型光学顕微鏡。
2. 【請求項２】 試料中のエネルギー供与体の発光波長特
   性と同一の波長領域を含む吸収波長特性を有するエネル
   ギー受容体を有するとともに、前記エネルギー供与体を
   励起する励起光を透過させる探針と、 前記励起光を出力する励起手段と、 前記エネルギー供与体の励起エネルギーを受けて励起さ
   れた前記エネルギー受容体が発する光を検出する検出手
   段と、 前記試料と前記探針との相対的な位置を制御する制御手
   段と、 を備えたことを特徴とする走査型光学顕微鏡。