JP2624217B2 - 乳酸酸化酵素及び乳酸酸化酵素遺伝子 - Google Patents
乳酸酸化酵素及び乳酸酸化酵素遺伝子Info
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- JP2624217B2 JP2624217B2 JP7146186A JP14618695A JP2624217B2 JP 2624217 B2 JP2624217 B2 JP 2624217B2 JP 7146186 A JP7146186 A JP 7146186A JP 14618695 A JP14618695 A JP 14618695A JP 2624217 B2 JP2624217 B2 JP 2624217B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−乳酸＋酸素→ピル
ビン酸＋過酸化水素で表される反応を触媒する乳酸酸化
酵素に関する。
ビン酸＋過酸化水素で表される反応を触媒する乳酸酸化
酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸酸化酵素はＬ−乳酸と酸素からピル
ビン酸と過酸化水素の生成を触媒する酵素で、血液など
の体液中の乳酸濃度を測定するのに非常に有用な酵素で
ある。該酵素はこれまでにペディオコッカス（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属に属する細菌等に存在することが知られて
いる（特公昭５８−４５５７号公報、特公昭５９−１０
１９０号公報、特開平２−１７７８８６号公報）。
ビン酸と過酸化水素の生成を触媒する酵素で、血液など
の体液中の乳酸濃度を測定するのに非常に有用な酵素で
ある。該酵素はこれまでにペディオコッカス（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属に属する細菌等に存在することが知られて
いる（特公昭５８−４５５７号公報、特公昭５９−１０
１９０号公報、特開平２−１７７８８６号公報）。
【０００３】しかしながらストレプトコッカスから得ら
れる乳酸酸化酵素は熱安定性が低く３４℃を超える温度
では急速に失活し（特公昭５８−４５５７号公報）、ア
エロコッカスから得られる乳酸酸化酵素は６５℃１０分
間の加熱処理で残存活性が５％以下にまで低下する（特
公昭５９−１０１９０号公報）。
れる乳酸酸化酵素は熱安定性が低く３４℃を超える温度
では急速に失活し（特公昭５８−４５５７号公報）、ア
エロコッカスから得られる乳酸酸化酵素は６５℃１０分
間の加熱処理で残存活性が５％以下にまで低下する（特
公昭５９−１０１９０号公報）。
【０００４】
【発明の目的】本発明の目的は耐熱性を有する乳酸酸化
酵素及びこれを発現させるための乳酸酸化酵素遺伝子を
開発することにある。
酵素及びこれを発現させるための乳酸酸化酵素遺伝子を
開発することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題につ
いて鋭意検討した結果、次のアミノ酸配列をもつ乳酸酸
化酵素（ＬＯＤ１５とＬＯＤ１とＬＯＤ１６）は顕著な
耐熱性を有することを見いだした。ＬＯＤ１５は以下の
アミノ酸配列を有す。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Glu 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 下線で示した箇所は、アエロコッカスが有する乳酸酸化
酵素との変異部分を示している。２１２位のＡｓｎ（ア
ルパラギン）がＡｓｐ（アスパラギン酸）に置換してい
る。
いて鋭意検討した結果、次のアミノ酸配列をもつ乳酸酸
化酵素（ＬＯＤ１５とＬＯＤ１とＬＯＤ１６）は顕著な
耐熱性を有することを見いだした。ＬＯＤ１５は以下の
アミノ酸配列を有す。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Glu 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 下線で示した箇所は、アエロコッカスが有する乳酸酸化
酵素との変異部分を示している。２１２位のＡｓｎ（ア
ルパラギン）がＡｓｐ（アスパラギン酸）に置換してい
る。
【０００６】また、この酵素（ＬＯＤ１５）は次の塩基
配列で表される乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。
同様にアエロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との
変異部分を下線で示す。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GAA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 ６３４位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置換して
いる。
配列で表される乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。
同様にアエロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との
変異部分を下線で示す。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GAA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 ６３４位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置換して
いる。
【０００７】次に本発明の乳酸酸化酵素ＬＯＤ１のアミ
ノ酸配列を以下に示す。下線箇所はアエロコッカスが有
する乳酸酸化酵素との変異部分であり、１６０位のＧｌ
ｕ（グルタミン酸）がＧｌｙ（グリシン）に置換してい
る。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asn Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 この乳酸酸化酵素ＬＯＤ１は、次の塩基配列で表される
乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。下線箇所はアエ
ロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との変異部分を
示す。４７９位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置
換している。ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GC
A 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA AAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 次に本発明の乳酸酸化酵素ＬＯＤ１６のアミノ酸配列を
以下に示す。下線箇所はアエロコッカスが有する乳酸酸
化酵素との変異部分であり、１６０位のＧｌｕ（グルタ
ミン酸）がＧｌｙ（グリシン）に、２１２位のＡｓｎ
（アスパラギン）がＡｓｐ（アスパラギン酸）に置換し
ている。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 この乳酸酸化酵素ＬＯＤ１６は、次の塩基配列で表され
る乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。下線箇所はア
エロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との変異部分
を示す。４７９位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）
に、６３４位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置換
している。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122
ノ酸配列を以下に示す。下線箇所はアエロコッカスが有
する乳酸酸化酵素との変異部分であり、１６０位のＧｌ
ｕ（グルタミン酸）がＧｌｙ（グリシン）に置換してい
る。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asn Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 この乳酸酸化酵素ＬＯＤ１は、次の塩基配列で表される
乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。下線箇所はアエ
ロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との変異部分を
示す。４７９位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置
換している。ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GC
A 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA AAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 次に本発明の乳酸酸化酵素ＬＯＤ１６のアミノ酸配列を
以下に示す。下線箇所はアエロコッカスが有する乳酸酸
化酵素との変異部分であり、１６０位のＧｌｕ（グルタ
ミン酸）がＧｌｙ（グリシン）に、２１２位のＡｓｎ
（アスパラギン）がＡｓｐ（アスパラギン酸）に置換し
ている。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 この乳酸酸化酵素ＬＯＤ１６は、次の塩基配列で表され
る乳酸酸化酵素遺伝子により発現される。下線箇所はア
エロコッカスが有する乳酸酸化酵素遺伝子との変異部分
を示す。４７９位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）
に、６３４位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置換
している。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122
【作用】本発明の乳酸酸化酵素は、図１及び図２に記載
されたポリヌクレオチド断片Ａ、あるいは図３及び図４
に記載されたポリヌクレオチド断片Ｂ、あるいは図５及
び図６に記載されたポリヌクレオチド断片Ｃを適当なベ
クターに挿入し、適当な宿種、例えばエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現させ、
精製することによって、乳酸酸化酵素ＬＯＤ１５、ＬＯ
Ｄ１、ＬＯＤ１６がそれぞれ得られた。得られた精製酵
素は、６５℃１０分間の加熱処理後、ＬＯＤ１５が加熱
処理前の２０％の残存活性を有し、ＬＯＤ１が加熱処理
前の５６％の残存活性を有し、ＬＯＤ１６が加熱処理前
の４３％の残存活性を有していた。
されたポリヌクレオチド断片Ａ、あるいは図３及び図４
に記載されたポリヌクレオチド断片Ｂ、あるいは図５及
び図６に記載されたポリヌクレオチド断片Ｃを適当なベ
クターに挿入し、適当な宿種、例えばエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現させ、
精製することによって、乳酸酸化酵素ＬＯＤ１５、ＬＯ
Ｄ１、ＬＯＤ１６がそれぞれ得られた。得られた精製酵
素は、６５℃１０分間の加熱処理後、ＬＯＤ１５が加熱
処理前の２０％の残存活性を有し、ＬＯＤ１が加熱処理
前の５６％の残存活性を有し、ＬＯＤ１６が加熱処理前
の４３％の残存活性を有していた。
【０００８】
［乳酸酸化酵素遺伝子の合成］遺伝子の合成はＤＮＡシ
ンセサイザー（ＭＯＤＥＬ ３８０ ＤＮＡ ＳＹＮＴ
ＨＥＳＩＺＥＲ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を用い、ＩＴＡＫＵＲＡらの方法［サイエンス
（ＳＣＩＥＮＣＥ），第１９８巻，第１０５６−１０６
３頁（１９７７）］により行った。
ンセサイザー（ＭＯＤＥＬ ３８０ ＤＮＡ ＳＹＮＴ
ＨＥＳＩＺＥＲ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を用い、ＩＴＡＫＵＲＡらの方法［サイエンス
（ＳＣＩＥＮＣＥ），第１９８巻，第１０５６−１０６
３頁（１９７７）］により行った。
【０００９】図７の矢印（ａ），（ｂ），（ｃ），
（ｄ）で示されるような一本鎖オリゴヌクレオチドをそ
れぞれ合成し、室温８時間または５５℃，１時間アンモ
ニア水で処理した後、ロータリーエバポレーターでアン
モニア水を除去し、オリゴヌクレオチドの脱保護を行っ
た。脱保護したオリゴヌクレオチドは、大塚らの方法
［大塚栄子・岩井成憲，タンパク質・ペプチドの高速液
体クロマトグラフィー（ＩＩ），第２４７頁，化学同人
（１９９０）］で逆相の高速液体クロマトグラフィー装
置（ＬＣ−１０Ａ：島津製作所製）を用いて精製した。
精製したオリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｔ４ ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａ
ｓｅ：寶酒造社製）を用いて５′末端をリン酸化した。
（ｄ）で示されるような一本鎖オリゴヌクレオチドをそ
れぞれ合成し、室温８時間または５５℃，１時間アンモ
ニア水で処理した後、ロータリーエバポレーターでアン
モニア水を除去し、オリゴヌクレオチドの脱保護を行っ
た。脱保護したオリゴヌクレオチドは、大塚らの方法
［大塚栄子・岩井成憲，タンパク質・ペプチドの高速液
体クロマトグラフィー（ＩＩ），第２４７頁，化学同人
（１９９０）］で逆相の高速液体クロマトグラフィー装
置（ＬＣ−１０Ａ：島津製作所製）を用いて精製した。
精製したオリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｔ４ ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａ
ｓｅ：寶酒造社製）を用いて５′末端をリン酸化した。
【００１０】図７の（ａ）と（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）を
それぞれアニーリングさせて、片方の５′末端が一本鎖
となっている二本鎖ＤＮＡ断片（ａｂ）と、５′末端と
３′末端が一本鎖となっている二本鎖ＤＮＡ断片（ｃ
ｄ）を得た。（ａｂ）と（ｃｄ）の５′末端は付着末端
となっているので、Ｔ４ＤＮＡライゲース（Ｔ４ ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｓｅ：寶酒造社製）を用いて（ａｂ）と
（ｃｄ）を結合させた。
それぞれアニーリングさせて、片方の５′末端が一本鎖
となっている二本鎖ＤＮＡ断片（ａｂ）と、５′末端と
３′末端が一本鎖となっている二本鎖ＤＮＡ断片（ｃ
ｄ）を得た。（ａｂ）と（ｃｄ）の５′末端は付着末端
となっているので、Ｔ４ＤＮＡライゲース（Ｔ４ ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｓｅ：寶酒造社製）を用いて（ａｂ）と
（ｃｄ）を結合させた。
【００１１】以上の手順を繰り返して、図１と図２で示
される二本鎖オリゴヌクレオチドＡ、あるいは図３と図
４で示される二本鎖オリゴヌクレオチドＢ、あるいは図
５と図６で示される二本鎖オリゴヌクレオチドＣを得
た。得られたオリゴヌクレオチドはアガロースゲル電気
泳動を用いた方法［サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ，ｅｔａｌ．），モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ），第１巻，第
６．３−６．６０頁，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ），（１９８９）］で精製した。
される二本鎖オリゴヌクレオチドＡ、あるいは図３と図
４で示される二本鎖オリゴヌクレオチドＢ、あるいは図
５と図６で示される二本鎖オリゴヌクレオチドＣを得
た。得られたオリゴヌクレオチドはアガロースゲル電気
泳動を用いた方法［サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ，ｅｔａｌ．），モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ），第１巻，第
６．３−６．６０頁，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ），（１９８９）］で精製した。
【００１２】［乳酸酸化酵素発現ベクターの作製］精製
された上記のオリゴヌクレオチドＡ又はＢ又はＣを適当
な発現ベクターに挿入し、乳酸酸化酵素発現ベクターを
作製した。例えばｐＫＫ２２３−３［ブロシウスら（Ｂ
ｒｏｓｉｕｓ，Ｊ，ｅｔａｌ．），プロク・ナトル・ア
カド・サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ），第８１巻，第６９２９頁，（１９８４）：フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（寶酒造社製）で切断し、切断末端を平滑末端
化した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：寶酒造社製）により脱リ
ン酸化した。
された上記のオリゴヌクレオチドＡ又はＢ又はＣを適当
な発現ベクターに挿入し、乳酸酸化酵素発現ベクターを
作製した。例えばｐＫＫ２２３−３［ブロシウスら（Ｂ
ｒｏｓｉｕｓ，Ｊ，ｅｔａｌ．），プロク・ナトル・ア
カド・サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ），第８１巻，第６９２９頁，（１９８４）：フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（寶酒造社製）で切断し、切断末端を平滑末端
化した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：寶酒造社製）により脱リ
ン酸化した。
【００１３】シュアクローンライゲーションキット（Ｓ
ｕｒｅ Ｃｌｏｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、オリゴヌクレオチドＡ
又はＢ又はＣを上記処理を行ったｐＫＫ２２３−３に挿
入し、フェーノール抽出後、エタノール沈殿［村松，ラ
ボマニュアル遺伝子工学，第２９−３３頁，丸善（１９
９０）］により精製した。
ｕｒｅ Ｃｌｏｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、オリゴヌクレオチドＡ
又はＢ又はＣを上記処理を行ったｐＫＫ２２３−３に挿
入し、フェーノール抽出後、エタノール沈殿［村松，ラ
ボマニュアル遺伝子工学，第２９−３３頁，丸善（１９
９０）］により精製した。
【００１４】以上の操作によりオリゴヌクレオチドＡよ
り得られるプラスミドをｐＬＯＤ１５とし、オリゴヌク
レオチドＢより得られるプラスミドをｐＬＯＤ１とし、
オリゴヌクレオチドＣより得られるプラスミドをｐＬＯ
Ｄ１６とした。ｐＬＯＤ１５、ｐＬＯＤ１、ｐＬＯＤ１
６の該酵素部分の塩基配列はジデオキシ法［サンガーら
（ＳＡＮＧＡＲ，Ｆ，ｅｔａｌ．），プロク・ナトル・
アカド・サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），第７４巻，第５４６３−５４６７頁，
（１９７７）］により、ＤＮＡシーケンサー（ＳＱ−３
０００：日立社製）を用いて塩基配列の解析を行い確認
した。
り得られるプラスミドをｐＬＯＤ１５とし、オリゴヌク
レオチドＢより得られるプラスミドをｐＬＯＤ１とし、
オリゴヌクレオチドＣより得られるプラスミドをｐＬＯ
Ｄ１６とした。ｐＬＯＤ１５、ｐＬＯＤ１、ｐＬＯＤ１
６の該酵素部分の塩基配列はジデオキシ法［サンガーら
（ＳＡＮＧＡＲ，Ｆ，ｅｔａｌ．），プロク・ナトル・
アカド・サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），第７４巻，第５４６３−５４６７頁，
（１９７７）］により、ＤＮＡシーケンサー（ＳＱ−３
０００：日立社製）を用いて塩基配列の解析を行い確認
した。
【００１５】［乳酸酸化酵素の発現］プラスミドｐＬＯ
Ｄ１５又はｐＬＯＤ１又はｐＬＯＤ１６を、適当な方法
で宿主微生物に導入した。一例として電気穿孔法により
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９：ＡＴＣＣ ５３３２３，以下
ＪＭ１０９と略記）に導入する方法を述べる。
Ｄ１５又はｐＬＯＤ１又はｐＬＯＤ１６を、適当な方法
で宿主微生物に導入した。一例として電気穿孔法により
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９：ＡＴＣＣ ５３３２３，以下
ＪＭ１０９と略記）に導入する方法を述べる。
【００１６】電気穿孔法はドゥワーらの方法［ドゥワー
ら（Ｄｏｗｅｒ ｅｔａｌ．），ヌークレイック・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ），第１６巻，ＮＯ．１３，第６１２７−６１
４５頁、（１９８８）］に従い、ｐＬＯＤ１５又はｐＬ
ＯＤ１又はｐＬＯＤ１６に、ＪＭ１０９を混合して氷中
に１分間静置した後、ジーンパルサーＴＭ（ＢｉｏＲａ
ｄ社製）を用いて２００Ω，２５μＦ，１２．５ｋＶ／
cmの条件で電気穿孔法による遺伝子の導入を行った。そ
の後、菌体をＳＯＣ培地［２％ トリプトン（Ｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ），０．５％ イーストエクストラクト（Ｙｅ
ａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ），１０ｍＭＮａＣｌ，２．５
ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ4，２０ｍＭ グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）］中
３７℃，１時間培養した。培養後菌体をＬＡＨ培地［１
％ トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ），０．５％ イー
ストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ），
０．５％ ＮａＣｌ，１．５％ アガー（Ａｇａｒ），
０．０１％ アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓ
ｏｄｉｕｍ），０．０１％ ＡＢＴＳ，５０ｍＭ Ｌ−
乳酸リチウム塩（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｌ−Ｌａｃｔａｔ
ｅ），１Ｕ／ｍｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏ
ｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）］に２０
μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧ［イソプロピルチオガラク
トピラノシド（ＩｓｏｐｒｏｐｙｌＴｈｉｏｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］とともに広げ、３７℃で
一夜培養した。コロニーの周辺が紫色に変色したものが
ｐＬＯＤ１５又はｐＬＯＤ１又はｐＬＯＤ１６によって
形質転換された株で、ＬＨＡ培地に画線培養して純化し
た。
ら（Ｄｏｗｅｒ ｅｔａｌ．），ヌークレイック・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ），第１６巻，ＮＯ．１３，第６１２７−６１
４５頁、（１９８８）］に従い、ｐＬＯＤ１５又はｐＬ
ＯＤ１又はｐＬＯＤ１６に、ＪＭ１０９を混合して氷中
に１分間静置した後、ジーンパルサーＴＭ（ＢｉｏＲａ
ｄ社製）を用いて２００Ω，２５μＦ，１２．５ｋＶ／
cmの条件で電気穿孔法による遺伝子の導入を行った。そ
の後、菌体をＳＯＣ培地［２％ トリプトン（Ｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ），０．５％ イーストエクストラクト（Ｙｅ
ａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ），１０ｍＭＮａＣｌ，２．５
ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ4，２０ｍＭ グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）］中
３７℃，１時間培養した。培養後菌体をＬＡＨ培地［１
％ トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ），０．５％ イー
ストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ），
０．５％ ＮａＣｌ，１．５％ アガー（Ａｇａｒ），
０．０１％ アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓ
ｏｄｉｕｍ），０．０１％ ＡＢＴＳ，５０ｍＭ Ｌ−
乳酸リチウム塩（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｌ−Ｌａｃｔａｔ
ｅ），１Ｕ／ｍｌ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏ
ｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）］に２０
μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧ［イソプロピルチオガラク
トピラノシド（ＩｓｏｐｒｏｐｙｌＴｈｉｏｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］とともに広げ、３７℃で
一夜培養した。コロニーの周辺が紫色に変色したものが
ｐＬＯＤ１５又はｐＬＯＤ１又はｐＬＯＤ１６によって
形質転換された株で、ＬＨＡ培地に画線培養して純化し
た。
【００１７】［乳酸酸化酵素の精製］純化した形質転換
株をＬＡ培地［１％ トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ），０．５％ イーストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ
Ｅｘｔｒａｃｔ），０．５％ＮａＣｌ，０．０１％
アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕ
ｍ），１ｍＭ ＩＰＴＧ］で３７℃、６時間培養し遠心
により集菌した。集菌した菌体を菌体湿重量の７倍量の
リン酸緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）］に懸濁し、リゾチーム
（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を１ｍｇ／ｍｌになるように加え
た。ゆっくり攪拌しながら室温で２時間放置した。細胞
懸濁液を氷中で超音波処理（ＶＰ−６０：タイテック社
製）し、ＰＭＳＦ［フェニルメチルスルフォニルフルオ
リド（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ）］とＥＤＴＡ［エチレンジアミン四酢酸
ナトリウム（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌ
ｔ）：和光純薬社製］を終濃度１ｍＭになるように加え
た。遠心で細胞被砕物を除去後、氷中でゆっくり攪拌し
ながら硫酸アンモニウム（和光純薬社製）を５０％飽和
になるように（０．３１３ｇ／ｍｌサンプル溶液）加え
た。さらに氷中で３０分攪拌した後に遠心して沈殿を集
めた。上澄み液にさらに８０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、上述の操作を繰り返して沈殿を集め
た。
株をＬＡ培地［１％ トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ），０．５％ イーストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ
Ｅｘｔｒａｃｔ），０．５％ＮａＣｌ，０．０１％
アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕ
ｍ），１ｍＭ ＩＰＴＧ］で３７℃、６時間培養し遠心
により集菌した。集菌した菌体を菌体湿重量の７倍量の
リン酸緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）］に懸濁し、リゾチーム
（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を１ｍｇ／ｍｌになるように加え
た。ゆっくり攪拌しながら室温で２時間放置した。細胞
懸濁液を氷中で超音波処理（ＶＰ−６０：タイテック社
製）し、ＰＭＳＦ［フェニルメチルスルフォニルフルオ
リド（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ）］とＥＤＴＡ［エチレンジアミン四酢酸
ナトリウム（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌ
ｔ）：和光純薬社製］を終濃度１ｍＭになるように加え
た。遠心で細胞被砕物を除去後、氷中でゆっくり攪拌し
ながら硫酸アンモニウム（和光純薬社製）を５０％飽和
になるように（０．３１３ｇ／ｍｌサンプル溶液）加え
た。さらに氷中で３０分攪拌した後に遠心して沈殿を集
めた。上澄み液にさらに８０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、上述の操作を繰り返して沈殿を集め
た。
【００１８】以上の操作から得られた沈殿を、カリウム
リン酸緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ，１００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．０）］に溶
解させ、セファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）プレパックトカラ
ムにかけて同緩衝液で溶出した。
リン酸緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ，１００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．０）］に溶
解させ、セファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）プレパックトカラ
ムにかけて同緩衝液で溶出した。
【００１９】得られた溶出液をカリウムリン酸緩衝液で
平衡化してある陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロー
スＦＦ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ：Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）を充填したカラムにかけて同緩衝液で溶出
した。溶出液の２８０nmにおける吸収が見られなくなっ
たところで溶出緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．
０）］で塩濃度勾配をつけて溶出した。活性画分を集め
て濃縮し、カリウムリン酸緩衝液で平衡化したスーパー
デックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）でゲルろ過を行い、精製乳酸酸化酵素
を得た。
平衡化してある陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロー
スＦＦ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ：Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）を充填したカラムにかけて同緩衝液で溶出
した。溶出液の２８０nmにおける吸収が見られなくなっ
たところで溶出緩衝液［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．
０）］で塩濃度勾配をつけて溶出した。活性画分を集め
て濃縮し、カリウムリン酸緩衝液で平衡化したスーパー
デックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）でゲルろ過を行い、精製乳酸酸化酵素
を得た。
【００２０】［乳酸酸化酵素の活性測定］デューカンら
の方法［Ｄｕｃａｎ ｅｔ ａｌ．、ビー・ビー・アー
ル・シー（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ），第１６４巻，Ｎｏ．２，
第９１９−９２６頁，（１９８９）］にしたがって活性
の測定を行った。２．７ｍｌの純水にＨＥＰＥＳ緩衝液
（１Ｍ，ｐＨ７．３）を１２０μｌ、Ｌ−乳酸リチウム
塩（９６ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、４−アミノアンチピ
リン（３０ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、フェノール（３１
ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，１
００Ｕ／ｍｌ）を６０μｌ加えて混合し、光路長１cmの
キュベットに入れた後、酵素溶液（乳酸酸化酵素）を６
０μｌ加えて攪拌後直ちに吸光光度計（ＵＶ−３６５：
島津製作所製）で５００nmの吸光度の時間変化を測定し
た。
の方法［Ｄｕｃａｎ ｅｔ ａｌ．、ビー・ビー・アー
ル・シー（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ），第１６４巻，Ｎｏ．２，
第９１９−９２６頁，（１９８９）］にしたがって活性
の測定を行った。２．７ｍｌの純水にＨＥＰＥＳ緩衝液
（１Ｍ，ｐＨ７．３）を１２０μｌ、Ｌ−乳酸リチウム
塩（９６ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、４−アミノアンチピ
リン（３０ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、フェノール（３１
ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，１
００Ｕ／ｍｌ）を６０μｌ加えて混合し、光路長１cmの
キュベットに入れた後、酵素溶液（乳酸酸化酵素）を６
０μｌ加えて攪拌後直ちに吸光光度計（ＵＶ−３６５：
島津製作所製）で５００nmの吸光度の時間変化を測定し
た。
【００２１】乳酸酸化酵素はカリウムリン酸緩衝液中に
２０μｇ／ｍｌになるように溶解させた。酵素溶液を６
５℃の恒温度櫓に一定時間（５，１０，２０，４０分）
静置した後、氷中に静置し、酵素活性（残存活性）を測
定した。比較例としてアエロコッカスから得られる乳酸
酸化酵素（特公昭５９−１０１９０号公報）を用いた。
図８および図９にアエロコッカスの乳酸酸化酵素と本発
明の乳酸酸化酵素の６５℃における残存活性の時間変化
をプロットしたものを示した。縦軸に図８は残存活性の
対数を表示し、図９は残存活性を％で表示した。
２０μｇ／ｍｌになるように溶解させた。酵素溶液を６
５℃の恒温度櫓に一定時間（５，１０，２０，４０分）
静置した後、氷中に静置し、酵素活性（残存活性）を測
定した。比較例としてアエロコッカスから得られる乳酸
酸化酵素（特公昭５９−１０１９０号公報）を用いた。
図８および図９にアエロコッカスの乳酸酸化酵素と本発
明の乳酸酸化酵素の６５℃における残存活性の時間変化
をプロットしたものを示した。縦軸に図８は残存活性の
対数を表示し、図９は残存活性を％で表示した。
【００２２】
【発明の効果】図８、図９にアエロコッカスから得られ
る乳酸酸化酵素（特公昭５９−１０１９０号公報）と本
発明の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５、ＬＯＤ１、ＬＯＤ１
６）を６５℃で保温したときの残存活性の時間変化を示
した。本発明の乳酸酸化酵素はアエロコッカスから得ら
れる乳酸酸化酵素に比べ顕著に耐熱性が向上しているこ
とがわかる。血液などの体液中の乳酸濃度を測定するの
に有用となる。
る乳酸酸化酵素（特公昭５９−１０１９０号公報）と本
発明の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５、ＬＯＤ１、ＬＯＤ１
６）を６５℃で保温したときの残存活性の時間変化を示
した。本発明の乳酸酸化酵素はアエロコッカスから得ら
れる乳酸酸化酵素に比べ顕著に耐熱性が向上しているこ
とがわかる。血液などの体液中の乳酸濃度を測定するの
に有用となる。
【００２３】また、本発明の乳酸酸化酵素の触媒機能を
アエロコッカスから得られる従来の乳酸酸化酵素と比較
したところ、常温での活性や検出できる乳酸濃度に劣る
点はなかった。
アエロコッカスから得られる従来の乳酸酸化酵素と比較
したところ、常温での活性や検出できる乳酸濃度に劣る
点はなかった。
【図１】化学合成したオリゴヌクレオチドＡの配列を示
す図その１である。
す図その１である。
【図２】化学合成したオリゴヌクレオチドＡの配列を示
す図その２である。
す図その２である。
【図３】化学合成したオリゴヌクレオチドＢの配列を示
す図その１である。
す図その１である。
【図４】化学合成したオリゴヌクレオチドＢの配列を示
す図その２である。
す図その２である。
【図５】化学合成したオリゴヌクレオチドＣの配列を示
す図その１である。
す図その１である。
【図６】化学合成したオリゴヌクレオチドＣの配列を示
す図その２である。
す図その２である。
【図７】ＤＮＡの化学合成の手順の一例を示す図であ
る。
る。
【図８】従来のアエロコッカスの乳酸酸化酵素と本発明
の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５）の熱安定性の違いを示す
図である。
の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５）の熱安定性の違いを示す
図である。
【図９】従来のアエロコッカスの乳酸酸化酵素と本発明
の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５、ＬＯＤ１、ＬＯＤ１６）
の熱安定性の違いを示す図である。
の乳酸酸化酵素（ＬＯＤ１５、ＬＯＤ１、ＬＯＤ１６）
の熱安定性の違いを示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をもち、 Ｌ−乳酸＋酸素→ピルビン酸＋過酸化水素で表される反
応を触媒することを特徴とする乳酸酸化酵素ＬＯＤ１
５。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Glu 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 - 【請求項２】下記に示されるアミノ酸配列をもち、 Ｌ−乳酸＋酸素→ピルビン酸＋過酸化水素で表される反
応を触媒することを特徴とする乳酸酸化酵素ＬＯＤ１。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asn Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 - 【請求項３】下記に示されるアミノ酸配列をもち、 Ｌ−乳酸＋酸素→ピルビン酸＋過酸化水素で表される反
応を触媒することを特徴とする乳酸酸化酵素ＬＯＤ１
６。 Met Asn Asn Asn Asp Ile Glu Tyr Asn Ala 10 Pro Ser Glu Ile Lys Tyr Ile Asp Val Val 20 Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ser 30 Lys Val Val Pro His Gly Gly Phe Asn Tyr 40 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Asp Glu Trp Thr 50 Lys Arg Ala Asn Asp Arg Ala Trp Lys His 60 Lys Leu Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Gln Asp 70 Val Glu Ala Pro Asp Thr Ser Thr Glu Ile 80 Leu Gly His Lys Ile Lys Ala Pro Phe Ile 90 Met Ala Pro Ile Ala Ala His Gly Leu Ala 100 His Thr Thr Lys Glu Ala Gly Thr Ala Arg 110 Ala Val Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser 120 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Glu 130 Glu Ile Ser Glu Gly Leu Asn Gly Gly Pro 140 Arg Trp Phe Gln Ile Tyr Met Ala Lys Asp 150 Asp Gln Gln Asn Arg Asp Ile Leu Asp Gly 160 Ala Lys Ser Asp Gly Ala Thr Ala Ile Ile 170 Leu Thr Ala Asp Ser Thr Val Ser Gly Asn 180 Arg Asp Arg Asp Val Lys Asn Lys Phe Val 190 Tyr Pro Phe Gly Met Pro Ile Val Gln Arg 200 Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Glu Gly Met Ser 210 Leu Asp Asn Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Gln 220 Lys Ile Ser Pro Arg Asp Ile Glu Glu Ile 230 Ala Ala His Ser Gly Leu Pro Val Phe Val 240 Lys Gly Ile Gln His Pro Glu Asp Ala Asp 250 Met Ala Ile Lys Ala Gly Ala Ser Gly Ile 260 Trp Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu 270 Tyr Glu Ala Pro Gly Ser Phe Asp Thr Leu 280 Pro Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Lys Arg 290 Val Pro Ile Val Phe Asp Ser Gly Val Arg 300 Arg Gly Glu His Val Ala Lys Ala Leu Ala 310 Ser Gly Ala Asp Val Val Ala Leu Gly Arg 320 Pro Val Leu Phe Gly Leu Ala Leu Gly Gly 330 Trp Gln Gly Ala Tyr Ser Val Leu Asp Tyr 340 Phe Gln Lys Asp Leu Thr Arg Val Met Gln 350 Leu Thr Gly Ser Gln Asn Val Glu Asp Leu 360 Lys Gly Leu Asp Leu Phe Asp Asn Pro Tyr 370 Gly Tyr Glu Tyr 374 - 【請求項４】下記に示される塩基配列で表される乳酸酸
化酵素ＬＯＤ１５の遺伝子。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GAA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 - 【請求項５】下記に示される塩基配列で表される乳酸酸
化酵素ＬＯＤ１の遺伝子。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA AAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122 - 【請求項６】下記に示される塩基配列で表される乳酸酸
化酵素ＬＯＤ１６の遺伝子。 ATG AAT AAC AAT GAC ATT GAA TAT AAT GCA 30 CCT AGT GAA ATC AAG TAC ATT GAT GTT GTC 60 AAT ACT TAC GAC TTA GAA GAA GAA GCA AGT 90 AAA GTG GTA CCA CAT GGT GGT TTT AAC TAT 120 ATT GCT GGT GCA TCT GGT GAT GAG TGG ACT 150 AAA CGC GCT AAT GAC CGT GCT TGG AAA CAT 180 AAA TTA CTA TAC CCA CGT CTA GCG CAA GAT 210 GTT GAA GCG CCC GAT ACA AGT ACT GAA ATT 240 TTA GGT CAT AAA ATT AAA GCC CCA TTC ATC 270 ATG GCA CCA ATT GCT GCA CAT GGT TTA GCC 300 CAC ACT ACT AAA GAA GCT GGT ACT GCA CGT 330 GCA GTT TCA GAA TTT GGT ACA ATT ATG TCC 360 ATC TCA GCT TAT TCT GGT GCA ACA TTT GAA 390 GAA ATT TCT GAA GGC TTA AAT GGC GGA CCC 420 CGT TGG TTC CAA ATC TAT ATG GCT AAA GAT 450 GAC CAA CAA AAC CGT GAT ATC TTA GAC GGA 480 GCT AAA TCT GAT GGT GCA ACT GCT ATC ATC 510 CTT ACA GCT GAC TCA ACT GTT TCT GGA AAC 540 CGT GAC CGT GAT GTG AAG AAT AAA TTC GTT 570 TAC CCA TTT GGT ATG CCA ATT GTT CAA CGT 600 TAC TTA CGT GGT ACA GCA GAA GGT ATG TCA 630 TTA GAC AAT ATC TAC GGT GCT TCA AAA CAA 660 AAA ATC TCA CCA AGA GAT ATT GAG GAA ATC 690 GCC GCT CAT TCT GGA TTA CCA GTA TTC GTT 720 AAA GGT ATT CAA CAC CCA GAA GAT GCA GAT 750 ATG GCA ATC AAA GCT GGT GCA TCA GGT ATC 780 TGG GTA TCT AAC CAC GGT GCT CGT CAA CTA 810 TAT GAA GCT CCA GGT TCA TTT GAC ACC CTT 840 CCA GCT ATT GCT GAA CGT GTA AAC AAA CGT 870 GTA CCA ATC GTC TTT GAT TCA GGT GTA CGT 900 CGT GGT GAA CAC GTT GCC AAA GCG CTA GCT 930 TCA GGG GCA GAC GTT GTT GCT TTA GGA CGC 960 CCA GTC TTA TTT GGT TTA GCT TTA GGT GGC 990 TGG CAA GGT GCT TAC TCA GTA CTT GAC TAC 1020 TTC CAA AAA GAC TTA ACA CGC GTA ATG CAA 1050 TTA ACA GGT TCA CAA AAT GTG GAA GAC TTG 1080 AAG GGT CTA GAT TTA TTC GAT AAC CCA TAC 1110 GGT TAT GAA TAC 1122
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7146186A JP2624217B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-06-13 | 乳酸酸化酵素及び乳酸酸化酵素遺伝子 |
| US08/625,876 US5656471A (en) | 1995-03-30 | 1996-04-01 | Lactate oxidase with an improved thermal stability and gene of the same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-95947 | 1995-03-30 | ||
| JP9594795 | 1995-03-30 | ||
| JP7146186A JP2624217B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-06-13 | 乳酸酸化酵素及び乳酸酸化酵素遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322561A JPH08322561A (ja) | 1996-12-10 |
| JP2624217B2 true JP2624217B2 (ja) | 1997-06-25 |
Family
ID=26437114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7146186A Expired - Fee Related JP2624217B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-06-13 | 乳酸酸化酵素及び乳酸酸化酵素遺伝子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5656471A (ja) |
| JP (1) | JP2624217B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7416871B2 (en) | 2003-10-21 | 2008-08-26 | Nec Corporation | Thermo-stable lactate oxidase |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2573171B1 (en) * | 2011-09-20 | 2015-04-15 | Roche Diagnostics GmbH | Mutant lactate oxidase with increased stability and product, methods and uses involving the same |
| US20230365944A1 (en) * | 2020-09-30 | 2023-11-16 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Engineered stable lactate oxidoreductases, compositions, devices, kits and uses thereof |
-
1995
- 1995-06-13 JP JP7146186A patent/JP2624217B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-01 US US08/625,876 patent/US5656471A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7416871B2 (en) | 2003-10-21 | 2008-08-26 | Nec Corporation | Thermo-stable lactate oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5656471A (en) | 1997-08-12 |
| JPH08322561A (ja) | 1996-12-10 |
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