JP2574640B2 - 増幅及びハイブリダイゼーションによるウイルスの検出キット - Google Patents
増幅及びハイブリダイゼーションによるウイルスの検出キットInfo
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ウイルスの保存され
た特定のヌクレオチド配列の存在又は不存在を検出する
ためのキットに関する。
た特定のヌクレオチド配列の存在又は不存在を検出する
ためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はし
ばしば致命的な日和見感染又は新生物をもたらす細胞性
免疫系の伝染性疾患である。さらに、ＡＩＤＳはしばし
ば中枢神経系機能障害を合併する。この疾患を担当する
病原体はヒトレトロウイルスとして同定され、そしてヒ
トＴ細胞白血病ウイルスIII （ＨＴＬＶIII ）、リンパ
腺症関連ウイルス（ＬＡＶ又はＬＡＶＡ）、及びＡＩＤ
Ｓ関連ウイルス（ＡＲＶ−２）と命名されている。さら
に最近、これらのウイルスはヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）と総称されている。
ばしば致命的な日和見感染又は新生物をもたらす細胞性
免疫系の伝染性疾患である。さらに、ＡＩＤＳはしばし
ば中枢神経系機能障害を合併する。この疾患を担当する
病原体はヒトレトロウイルスとして同定され、そしてヒ
トＴ細胞白血病ウイルスIII （ＨＴＬＶIII ）、リンパ
腺症関連ウイルス（ＬＡＶ又はＬＡＶＡ）、及びＡＩＤ
Ｓ関連ウイルス（ＡＲＶ−２）と命名されている。さら
に最近、これらのウイルスはヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）と総称されている。
【０００３】種々の研究室からの単離体は種々の基準
（すなわち、形態、エンベロープ蛋白質ヌクレオキャプ
シド蛋白質の免疫的交差反応性、並びにＴ４抗原を用い
るヘルパーＴ細胞への導入）により同一であるか又は密
接に関連したウイルスを提示している。ヒトにおけるＡ
ＩＤＳと区別できない症状を有するチンパンジー及びマ
カーク（ｍａｃｏｑｕｅ）から単離されたシミアンウイ
ルスもまたこれら同じ基準により密接に関連する。Ｐ．
Ｊ．Ｋａｎｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：９５１−
９５４（１９８５）。
（すなわち、形態、エンベロープ蛋白質ヌクレオキャプ
シド蛋白質の免疫的交差反応性、並びにＴ４抗原を用い
るヘルパーＴ細胞への導入）により同一であるか又は密
接に関連したウイルスを提示している。ヒトにおけるＡ
ＩＤＳと区別できない症状を有するチンパンジー及びマ
カーク（ｍａｃｏｑｕｅ）から単離されたシミアンウイ
ルスもまたこれら同じ基準により密接に関連する。Ｐ．
Ｊ．Ｋａｎｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：９５１−
９５４（１９８５）。
【０００４】ＡＩＤＳに関連するウイルスについての一
層当惑させる観察は、レンチビリデー（Ｌｅｎｔｉｖｉ
ｒｉｄａｅ）亜科の成熟ビリオンとのそれらの類似性で
ある。この病原性であるがしかし発癌性ではないウイル
ス群の構成員にはビスナ（ｖｉｓｎａ）ウイルス、及び
ウマ感染性貧血ウイルスが包含される。ＡＩＤＳ関連ウ
イルスとレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）との
間の類似性にはビリオンの形態、免疫的交差反応性、ヌ
クレオチド配列、脳における局在、複製、及び顕著な不
均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が包含される。
層当惑させる観察は、レンチビリデー（Ｌｅｎｔｉｖｉ
ｒｉｄａｅ）亜科の成熟ビリオンとのそれらの類似性で
ある。この病原性であるがしかし発癌性ではないウイル
ス群の構成員にはビスナ（ｖｉｓｎａ）ウイルス、及び
ウマ感染性貧血ウイルスが包含される。ＡＩＤＳ関連ウ
イルスとレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）との
間の類似性にはビリオンの形態、免疫的交差反応性、ヌ
クレオチド配列、脳における局在、複製、及び顕著な不
均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が包含される。
【０００５】ＡＩＤＳ関連ウイルスに対する抗体を含有
する血清を同定するための最近の免疫診断試験（Ｇａｌ
ｌｏ等の米国特許No. ４，５２０，１１３を参照のこ
と）は潜在的に感染性の血液を除去するために血液銀行
において使用されている。ＨＴＬＶ群中のレトロウイル
スを検出するためのモノクローナル抗体の調製において
有用なレトロウイルスポリペプチドについては１９８６
年３月２７日に公開されたＷＯ８６／０１８３４（カリ
ホルニア大学）をも参照のこと。
する血清を同定するための最近の免疫診断試験（Ｇａｌ
ｌｏ等の米国特許No. ４，５２０，１１３を参照のこ
と）は潜在的に感染性の血液を除去するために血液銀行
において使用されている。ＨＴＬＶ群中のレトロウイル
スを検出するためのモノクローナル抗体の調製において
有用なレトロウイルスポリペプチドについては１９８６
年３月２７日に公開されたＷＯ８６／０１８３４（カリ
ホルニア大学）をも参照のこと。
【０００６】ＡＩＤＳ関連ウイルスと一般にレンチウイ
ルス又は特にビスナウイルスとの類似性が有意な量のウ
イルス粒子を生産することなくＤＮＡコピーとして存在
するウイルスの能力にまで拡がるため、ＡＩＤＳ関連ウ
イルスを検出するための直接的免疫学的方法は、一貫し
て感染しているが症状を有しない個体の有意な割合にお
いて不成功であることが証明されよう。感染された組織
及び血液中のウイルス粒子の数は少い（ウイルスが無活
動であるため）ため、感染された細胞を許容Ｔセルライ
ンと共に同時培養しなければウイルス粒子又はＲＮＡ／
ＤＮＡを直接検出することは不可能ではないにしても困
難であろう。
ルス又は特にビスナウイルスとの類似性が有意な量のウ
イルス粒子を生産することなくＤＮＡコピーとして存在
するウイルスの能力にまで拡がるため、ＡＩＤＳ関連ウ
イルスを検出するための直接的免疫学的方法は、一貫し
て感染しているが症状を有しない個体の有意な割合にお
いて不成功であることが証明されよう。感染された組織
及び血液中のウイルス粒子の数は少い（ウイルスが無活
動であるため）ため、感染された細胞を許容Ｔセルライ
ンと共に同時培養しなければウイルス粒子又はＲＮＡ／
ＤＮＡを直接検出することは不可能ではないにしても困
難であろう。
【０００７】同時培養を行ったとしても、ウイルスの単
離により示されるＨＩＶにより感染された個体の数は、
感染された個体の真の数より過少である。すなわち、Ａ
ＩＤＳ患者の５０％、ＡＲＣの８５％、及びＡＩＤＳの
危険がある健康な個体の３０％のみからウイルスが単離
される〔Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，
８２，５５３０−４（１９８５）〕。
離により示されるＨＩＶにより感染された個体の数は、
感染された個体の真の数より過少である。すなわち、Ａ
ＩＤＳ患者の５０％、ＡＲＣの８５％、及びＡＩＤＳの
危険がある健康な個体の３０％のみからウイルスが単離
される〔Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，
８２，５５３０−４（１９８５）〕。
【０００８】Ｓａｉｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，
１３５０−１３５４（１９８５）は、核酸配列の検出を
促進するために標識されたＲＮＡ又はＤＮＡハイブリダ
イゼーションプローブを使用して該核酸配列を増幅する
方法を記載している。この方法においては、プライマー
を使用してプライマー延長生成物を得、これを鋳型とし
て使用してこのヌクレオチドの存在下で追加の相補鎖を
合成する。
１３５０−１３５４（１９８５）は、核酸配列の検出を
促進するために標識されたＲＮＡ又はＤＮＡハイブリダ
イゼーションプローブを使用して該核酸配列を増幅する
方法を記載している。この方法においては、プライマー
を使用してプライマー延長生成物を得、これを鋳型とし
て使用してこのヌクレオチドの存在下で追加の相補鎖を
合成する。
【０００９】Ｓａｉｋｉ等の論文はまた、プローブを所
望の配列にハイブリダイズせしめた後、制限酵素を加え
てハイブリドを所望の配列内の部位で開裂せしめ、そし
て次に制限消化物を標識化断片について分析する技法を
記載している。Ｓａｉｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，３：１００８−１０１２（１９８５）はこの後者
の技法を一層詳細に記載している。
望の配列にハイブリダイズせしめた後、制限酵素を加え
てハイブリドを所望の配列内の部位で開裂せしめ、そし
て次に制限消化物を標識化断片について分析する技法を
記載している。Ｓａｉｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，３：１００８−１０１２（１９８５）はこの後者
の技法を一層詳細に記載している。
【００１０】Ｌａｎｄｒｙ等、Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅ
ｄ．（１９８５）５，５１３−５２９の総説論文はウイ
ルスの検出に使用される核酸ハイブリダイゼーションの
分野を記載している。１９８６年３月１３日に公開され
たＷＯ８６／０１５３５、及び１９８６年３月５日に公
開されたＥＰ１７３，５２９はＨＴＬＶIII の分子クロ
ーニング及びＡＩＤＳを検出するためのプローブとして
のこのクローンの使用を開示している。さらに、１９８
６年３月５日に公開されたＥＰ特許出願１７３，３３９
は、外来微生物の感染を検出するためのＤＮＡプローブ
を使用する遺伝子分析を開示している。
ｄ．（１９８５）５，５１３−５２９の総説論文はウイ
ルスの検出に使用される核酸ハイブリダイゼーションの
分野を記載している。１９８６年３月１３日に公開され
たＷＯ８６／０１５３５、及び１９８６年３月５日に公
開されたＥＰ１７３，５２９はＨＴＬＶIII の分子クロ
ーニング及びＡＩＤＳを検出するためのプローブとして
のこのクローンの使用を開示している。さらに、１９８
６年３月５日に公開されたＥＰ特許出願１７３，３３９
は、外来微生物の感染を検出するためのＤＮＡプローブ
を使用する遺伝子分析を開示している。
【００１１】１９８６年６月２５日に公表されたＥＰ１
８５，４４４は細胞溶解物中のＨＴＬＶIII ウイルスを
検出するためのプローブとして使用する組換ペプチドを
開示している。オンコール社（Ｏｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）
は、１９８６年９月に、ＡＩＤＳウイルスを検出するた
めの放射性血液試験を開発したと発表した。米国特許N
o. ４，５９１，５５２は、サンプル中の抗原、特に肝
炎Ｂ抗原の存在を検出するための標識化プローブの使用
を開示している。
８５，４４４は細胞溶解物中のＨＴＬＶIII ウイルスを
検出するためのプローブとして使用する組換ペプチドを
開示している。オンコール社（Ｏｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）
は、１９８６年９月に、ＡＩＤＳウイルスを検出するた
めの放射性血液試験を開発したと発表した。米国特許N
o. ４，５９１，５５２は、サンプル中の抗原、特に肝
炎Ｂ抗原の存在を検出するための標識化プローブの使用
を開示している。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】潜伏ウイルス、例えば
ＡＩＤＳウイルス及び他のウイルスを検出するためのハ
イブリダイゼーションプローブの使用は、一貫して感染
しているがしかしウイルスを生産しない個体、又は抗体
反応陰性であるが培養陽性である個体の同定を可能に
し、そしてウイルスを培養することを必要としないで感
染細胞を検出することを可能にするであろう。増幅によ
るウイルスのウイルス核酸コピー数の増加は感染された
個体におけるウイルス核酸の同定を促進するであろう。
ＡＩＤＳウイルス及び他のウイルスを検出するためのハ
イブリダイゼーションプローブの使用は、一貫して感染
しているがしかしウイルスを生産しない個体、又は抗体
反応陰性であるが培養陽性である個体の同定を可能に
し、そしてウイルスを培養することを必要としないで感
染細胞を検出することを可能にするであろう。増幅によ
るウイルスのウイルス核酸コピー数の増加は感染された
個体におけるウイルス核酸の同定を促進するであろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウイルスの単
離体間で実質的に保存されておりそして該ウイルス中の
核酸に特異的であり、そしてサンプル中に含有されると
予想される核酸配列の存在又は不存在を検出又は監視す
るキットであって、（ａ）検出されるべき核酸の各鎖の
ためのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は各特異的核酸配列の各鎖に実質的に相補的であり、一
のプライマーから合成された延長生成物は、それがその
相補体から分離された場合、他のプライマーの延長生成
物の合成のため鋳型として機能することができる）；及
び（ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることができ
る標識されたプローブ；を含んで成るキットに関する。
離体間で実質的に保存されておりそして該ウイルス中の
核酸に特異的であり、そしてサンプル中に含有されると
予想される核酸配列の存在又は不存在を検出又は監視す
るキットであって、（ａ）検出されるべき核酸の各鎖の
ためのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は各特異的核酸配列の各鎖に実質的に相補的であり、一
のプライマーから合成された延長生成物は、それがその
相補体から分離された場合、他のプライマーの延長生成
物の合成のため鋳型として機能することができる）；及
び（ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることができ
る標識されたプローブ；を含んで成るキットに関する。
【００１４】好ましくは、このキットはさらに重合のた
めの試薬、４種類の異るヌクレオチド、及びプローブと
配列とのハイブリドを検出するための手段を含む。本発
明のキットは研究試験、臨床試験及び他の診断的用途に
おいて使用することができる。さらに、このキットはウ
イルスを培養することなく感染細胞を検出するために使
用することができ、これは感染を解消するために種々の
療法剤により治療された患者を監視するために有用な特
徴である。
めの試薬、４種類の異るヌクレオチド、及びプローブと
配列とのハイブリドを検出するための手段を含む。本発
明のキットは研究試験、臨床試験及び他の診断的用途に
おいて使用することができる。さらに、このキットはウ
イルスを培養することなく感染細胞を検出するために使
用することができ、これは感染を解消するために種々の
療法剤により治療された患者を監視するために有用な特
徴である。
【００１５】
【具体的な説明】この明細書において“ウイルス”なる
語は、ウイルス中の核酸の間で実質的に保存されており
そして該核酸に特異的である配列を有する任意の単離
体、又は一連の関連する単離体に関する。このようなウ
イルスの例にはＨＩＶ、肝炎Ｂウイルス、ヘルペスウイ
ルス類、肝炎Ａウイルス、リノウルス（ｒｈｉｎｏｖｉ
ｒｕｓ）、乳頭腫（パピローマ）ウイルス、エプスタイ
ン−バールウイルス等が含まれる。この発明の好ましい
ウイルスはＡＩＤＳ及び肝炎Ｂウイルスである。
語は、ウイルス中の核酸の間で実質的に保存されており
そして該核酸に特異的である配列を有する任意の単離
体、又は一連の関連する単離体に関する。このようなウ
イルスの例にはＨＩＶ、肝炎Ｂウイルス、ヘルペスウイ
ルス類、肝炎Ａウイルス、リノウルス（ｒｈｉｎｏｖｉ
ｒｕｓ）、乳頭腫（パピローマ）ウイルス、エプスタイ
ン−バールウイルス等が含まれる。この発明の好ましい
ウイルスはＡＩＤＳ及び肝炎Ｂウイルスである。
【００１６】本発明は、ウイルスに関連する核酸配列を
含有すると予想される核酸サンプル中の該核酸配列を検
出し又は監視するための方法又はキットに関する。以下
の検討は特にＨＩＶ及び肝炎Ｂウイルスに関するが、こ
の明細書に定義するあらゆるウイルスに適用することが
できる。
含有すると予想される核酸サンプル中の該核酸配列を検
出し又は監視するための方法又はキットに関する。以下
の検討は特にＨＩＶ及び肝炎Ｂウイルスに関するが、こ
の明細書に定義するあらゆるウイルスに適用することが
できる。
【００１７】ＨＩＶは非常に多様であるから、ＡＩＤＳ
関連ウイルスの有意な割合を検出するために使用するた
めには、ウイルスのバリアント間に共通な要素（本発明
において定義する特異的プライマーが重合を開始するこ
とを可能にする長さを有する保存された領域）を見出す
ことが必要である。有意な割合とは、試験を診断的又は
商業的に実施可能なものとするのに十分な個体の数を意
味する。
関連ウイルスの有意な割合を検出するために使用するた
めには、ウイルスのバリアント間に共通な要素（本発明
において定義する特異的プライマーが重合を開始するこ
とを可能にする長さを有する保存された領域）を見出す
ことが必要である。有意な割合とは、試験を診断的又は
商業的に実施可能なものとするのに十分な個体の数を意
味する。
【００１８】最近、４種類のＨＩＨ，ＡＲＶ，ＨＴＬＶ
III ，ＬＡＶ、及びＬＡＶＡが配列決定され、そして５
種類のヒト肝炎Ｂウイルス、並びにウードチャック（ｗ
ｏｏｄｃｈｕｃｋ）、グラウンド・スクイレル（ｇｒｏ
ｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）及びアヒルに感染する関連
ウイルスが配列決定された。最初の４種類のＨＩＶ及び
それらの関連ウイルスは、この明細書において“ＡＩＤ
Ｓウイルス”と称し、そして５種類の肝炎Ｂウイルス、
並びにウードチャック、グラウンド・スクイレル（ｇｒ
ｏｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）及びアヒルに感染する肝
炎Ｂ関連ウイルスを“ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎ
ａｖｉｒｕｓ）”と称する。
III ，ＬＡＶ、及びＬＡＶＡが配列決定され、そして５
種類のヒト肝炎Ｂウイルス、並びにウードチャック（ｗ
ｏｏｄｃｈｕｃｋ）、グラウンド・スクイレル（ｇｒｏ
ｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）及びアヒルに感染する関連
ウイルスが配列決定された。最初の４種類のＨＩＶ及び
それらの関連ウイルスは、この明細書において“ＡＩＤ
Ｓウイルス”と称し、そして５種類の肝炎Ｂウイルス、
並びにウードチャック、グラウンド・スクイレル（ｇｒ
ｏｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）及びアヒルに感染する肝
炎Ｂ関連ウイルスを“ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎ
ａｖｉｒｕｓ）”と称する。
【００１９】増幅されるべき配列はまたＡＩＤＳウイル
ス又はヘパドナウイルスに特異的でなければならない。
すなわち、それぞれ、ＨＴＬＶＩもしくはＨＴＬＶII又
は他の非−ＡＩＤＳウイルスと反応してはならず、又は
非−ヘパドナウイルスと反応してはならない。
ス又はヘパドナウイルスに特異的でなければならない。
すなわち、それぞれ、ＨＴＬＶＩもしくはＨＴＬＶII又
は他の非−ＡＩＤＳウイルスと反応してはならず、又は
非−ヘパドナウイルスと反応してはならない。
【００２０】４種類のＨＩＶ単離体及びそれらのバリア
ントの完全なゲノムは、ＡＲＶについてはＳｃｉｅｎｃ
ｅ，２２７，４８４−４９２；ＨＴＬＶIII については
Ｓｔａｒｃｉｃｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，５３８
−５４０（１９８５）；ＬＡＶについてはＷａｉｎ−Ｈ
ｏｂｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ，４０，９−１７（１９８
５）；及びＬＡＶＡについてはＭｕｅｓｉｎｇ等、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１３，４５０−４５８（１９８５）により
与えられている。これらのウイルスはすべて同じ株のバ
リアントであるという一般的合意が存在する。これらは
１つの種の中に保存されている。すなわち、これらはバ
リアントを有しない。
ントの完全なゲノムは、ＡＲＶについてはＳｃｉｅｎｃ
ｅ，２２７，４８４−４９２；ＨＴＬＶIII については
Ｓｔａｒｃｉｃｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，５３８
−５４０（１９８５）；ＬＡＶについてはＷａｉｎ−Ｈ
ｏｂｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ，４０，９−１７（１９８
５）；及びＬＡＶＡについてはＭｕｅｓｉｎｇ等、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１３，４５０−４５８（１９８５）により
与えられている。これらのウイルスはすべて同じ株のバ
リアントであるという一般的合意が存在する。これらは
１つの種の中に保存されている。すなわち、これらはバ
リアントを有しない。
【００２１】アヒル肝炎Ｂウイルスの完全なゲノムは
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９：７８２−７９２（１９８４）
中に、そしてヒト及びウートチャックウイルスゲノムは
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．中に引用された文献中に与えられてい
る。グラウンド・スクイレル（ｇｒｏｕｎｄ ｓｑｕｉ
ｒｒｅｌ）肝炎Ｂウイルスの完全なゲノムはＪ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，４１：５１−６５（１９８２）中に与えられて
いる。
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９：７８２−７９２（１９８４）
中に、そしてヒト及びウートチャックウイルスゲノムは
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．中に引用された文献中に与えられてい
る。グラウンド・スクイレル（ｇｒｏｕｎｄ ｓｑｕｉ
ｒｒｅｌ）肝炎Ｂウイルスの完全なゲノムはＪ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，４１：５１−６５（１９８２）中に与えられて
いる。
【００２２】検出されるべき配列に適用される“実質的
に保存されている”なる用語は、少なくとも室温におい
て重合のための試薬及び４種類のヌクレオシドトリホス
フェートの存在下で重合を開始するのに十分なだけ、そ
の配列が検出されるべきウイルス中の核酸に相補的でな
ければならないことを意味する。
に保存されている”なる用語は、少なくとも室温におい
て重合のための試薬及び４種類のヌクレオシドトリホス
フェートの存在下で重合を開始するのに十分なだけ、そ
の配列が検出されるべきウイルス中の核酸に相補的でな
ければならないことを意味する。
【００２３】使用されるプライマーは、ウイルス中の有
意な数の核酸上での重合の特異的開始をもたらすような
任意の長さと配列を有するオリゴヌクレオチドであろ
う。特に、この明細書で使用する場合、“プライマー”
なる語は、２個又はそれより多くの、さらに好ましくは
３個より多くのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドから成る分子であって、核酸鎖に対して実質的
に相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘導され
る条件下、すなわちヌクレオシドトリホスフェート及び
ＤＮＡポリメラーゼのごとき重合用試薬の存在下適当な
温度及びpHに置かれた場合に合成の開始点として機能す
ることができる分子を意味する。
意な数の核酸上での重合の特異的開始をもたらすような
任意の長さと配列を有するオリゴヌクレオチドであろ
う。特に、この明細書で使用する場合、“プライマー”
なる語は、２個又はそれより多くの、さらに好ましくは
３個より多くのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドから成る分子であって、核酸鎖に対して実質的
に相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘導され
る条件下、すなわちヌクレオシドトリホスフェート及び
ＤＮＡポリメラーゼのごとき重合用試薬の存在下適当な
温度及びpHに置かれた場合に合成の開始点として機能す
ることができる分子を意味する。
【００２４】プライマーは、増幅における最大の効率の
ため、好ましくは単鎖であるが、２本鎖でもよい。２本
鎖の場合、延長生成物の調製のために使用される前に、
プライマーはまずその個々の鎖に分離される。好ましく
は、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであ
る。プライマーは、重合のための誘導剤の存在下で延長
生成物の合成を開始するために十分な長さでなければな
らない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、プ
ライマーのヌクレオチド組成及び由来を含む多くの因子
に依存するであろう。
ため、好ましくは単鎖であるが、２本鎖でもよい。２本
鎖の場合、延長生成物の調製のために使用される前に、
プライマーはまずその個々の鎖に分離される。好ましく
は、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであ
る。プライマーは、重合のための誘導剤の存在下で延長
生成物の合成を開始するために十分な長さでなければな
らない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、プ
ライマーのヌクレオチド組成及び由来を含む多くの因子
に依存するであろう。
【００２５】この発明の目的のため、オリゴヌクレオチ
ドプライマーは典型的には１５〜２５又はこれより多く
のヌクレオチドを含有するが、さらに少数のヌクレオチ
ドを含有することもできる。ウイルスがＡＩＤＳウイル
スである場合、プライマーは好ましくはｇａｇ領域から
のものである。ウイルスがヘパドナウイルスである場
合、プライマーは好ましくはこれらのウイルスのポリメ
ラーゼ遺伝子又はエンベロープ遺伝子からのものであ
る。
ドプライマーは典型的には１５〜２５又はこれより多く
のヌクレオチドを含有するが、さらに少数のヌクレオチ
ドを含有することもできる。ウイルスがＡＩＤＳウイル
スである場合、プライマーは好ましくはｇａｇ領域から
のものである。ウイルスがヘパドナウイルスである場
合、プライマーは好ましくはこれらのウイルスのポリメ
ラーゼ遺伝子又はエンベロープ遺伝子からのものであ
る。
【００２６】この発明においてプライマーは、増幅され
るべき特定の配列の各鎖に対して“実質的に”相補的で
ある様に選択される。このことは、重合のための試薬が
機能することを可能にする条件下でプライマーがそれら
の対応する鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的で
なければならないこと、すなわち、プライマーが増幅さ
れるべき鎖の配列とハイブリダイズしそしてそれによっ
て他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型を形
成するのに十分な、該配列との相補性を有することを意
味する。好ましくは、プライマーは鎖と正確な相補性を
有する。
るべき特定の配列の各鎖に対して“実質的に”相補的で
ある様に選択される。このことは、重合のための試薬が
機能することを可能にする条件下でプライマーがそれら
の対応する鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的で
なければならないこと、すなわち、プライマーが増幅さ
れるべき鎖の配列とハイブリダイズしそしてそれによっ
て他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型を形
成するのに十分な、該配列との相補性を有することを意
味する。好ましくは、プライマーは鎖と正確な相補性を
有する。
【００２７】注目の関連ウイルスの間で実質的に保存さ
れている領域から増幅されるべき配列を選択することが
できる。従って、プライマー及びプローブを任意の適当
な手段により同定することができる。これは、該当する
ウイルスゲノム、例えばＡＩＤＳウイルスゲノム又は４
種類の肝炎Ｂゲノムの公表されているヌクレオチド配列
の領域を手仕事的に比較することにより行うことができ
る。
れている領域から増幅されるべき配列を選択することが
できる。従って、プライマー及びプローブを任意の適当
な手段により同定することができる。これは、該当する
ウイルスゲノム、例えばＡＩＤＳウイルスゲノム又は４
種類の肝炎Ｂゲノムの公表されているヌクレオチド配列
の領域を手仕事的に比較することにより行うことができ
る。
【００２８】他の一層便利な方法は配列を比較するため
にコンピュータープログラムを使用することである。こ
の目的のため、ナショナル・バイオケミカル・リサーチ
・ファウンデーションにより供給される、ドットマトリ
クスを用いる基礎コンピューターアルゴリズムを用いる
市販のプログラムを使用するのが便利である。このプロ
グラムにおいては、注目の種々の核酸配列を入力し、そ
して塩基対の相同性のウインドウサイズを定義する。こ
のプログラムは、異る軸上の配列を比較するグラフィッ
クを用い、そして少なくとも実質的な相同性が存在する
ドットが現われる。好ましくは、ウインドウサイズは６
塩基以上である。
にコンピュータープログラムを使用することである。こ
の目的のため、ナショナル・バイオケミカル・リサーチ
・ファウンデーションにより供給される、ドットマトリ
クスを用いる基礎コンピューターアルゴリズムを用いる
市販のプログラムを使用するのが便利である。このプロ
グラムにおいては、注目の種々の核酸配列を入力し、そ
して塩基対の相同性のウインドウサイズを定義する。こ
のプログラムは、異る軸上の配列を比較するグラフィッ
クを用い、そして少なくとも実質的な相同性が存在する
ドットが現われる。好ましくは、ウインドウサイズは６
塩基以上である。
【００２９】ＡＩＤＳウイルスについて、ドットマトリ
クスプログラムは、ヌクレオカプシド遺伝子としても知
られているゲノムのｇａｇ領域が４つのバリアントのコ
ード領域の間で最も保存されていることを示す。次の最
も保存されているコード領域はゲノムのｐｏｌ領域及び
それに続くｅｎｖ領域である。ｇａｇがコード領域中で
最も保存されているため、これが配列を検出するための
プローブ及びプライマーを選択するための最も好ましい
領域である。
クスプログラムは、ヌクレオカプシド遺伝子としても知
られているゲノムのｇａｇ領域が４つのバリアントのコ
ード領域の間で最も保存されていることを示す。次の最
も保存されているコード領域はゲノムのｐｏｌ領域及び
それに続くｅｎｖ領域である。ｇａｇがコード領域中で
最も保存されているため、これが配列を検出するための
プローブ及びプライマーを選択するための最も好ましい
領域である。
【００３０】使用すべきプライマーのための配列を決定
するために、蛋白質をコードしないウイルスゲノムの領
域を使用することもできる。この発明の目的のため、感
度及び特異性を最大にするために、検出されるべき配列
は、プローブ及び制限部位が使用される場合には、関連
ウイルスの間で特に制限開裂部位において、実質的に保
存されている、特異的プライミングを可能にするのに十
分な長さの配列と相同である。
するために、蛋白質をコードしないウイルスゲノムの領
域を使用することもできる。この発明の目的のため、感
度及び特異性を最大にするために、検出されるべき配列
は、プローブ及び制限部位が使用される場合には、関連
ウイルスの間で特に制限開裂部位において、実質的に保
存されている、特異的プライミングを可能にするのに十
分な長さの配列と相同である。
【００３１】増幅及びその後の生成物の検出のために使
用される技法はＳａｉｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、前掲、及びＳａｉｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前掲
に詳細に記載されている。一般に、増幅方法は、関与す
る反応段階の数に対して指数的な量で特異的核酸配列を
調製するための酵素的鎖反応を用いる。この場合、要求
される配列の両末端が、それらのハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドプライマーが合成され得るために十分
に詳細に知られていること、及び鎖反応を開始するため
に少量の該配列が入手し得ることが条件となる。
用される技法はＳａｉｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、前掲、及びＳａｉｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前掲
に詳細に記載されている。一般に、増幅方法は、関与す
る反応段階の数に対して指数的な量で特異的核酸配列を
調製するための酵素的鎖反応を用いる。この場合、要求
される配列の両末端が、それらのハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドプライマーが合成され得るために十分
に詳細に知られていること、及び鎖反応を開始するため
に少量の該配列が入手し得ることが条件となる。
【００３２】１つのプライマーは負鎖（−）に対して相
補的であり、そして他方のプライマーは正鎖（＋）に対
して相補的である。変性された核酸へのプライマーのア
ニーリング、及びこれに続くＤＮＡポリメラーゼＩ大断
片（Ｋｌｅｎｏｗ）のごとき酵素及びヌクレオチドを用
いる延長が標的配列を含有する新たに合成された＋鎖及
び−鎖をもたらす。これらの新たに合成された配列もま
たプライマーのための鋳型であるため、変性、プライマ
ーアニーリング及び延長の反復サイクルがプライマーに
より定義される領域の指数的蓄積をもたらす。鎖反応の
生成物は、使用された特異的プライマーの末端に対応す
る末端を有する別々の核酸デュプレックスであろう。
補的であり、そして他方のプライマーは正鎖（＋）に対
して相補的である。変性された核酸へのプライマーのア
ニーリング、及びこれに続くＤＮＡポリメラーゼＩ大断
片（Ｋｌｅｎｏｗ）のごとき酵素及びヌクレオチドを用
いる延長が標的配列を含有する新たに合成された＋鎖及
び−鎖をもたらす。これらの新たに合成された配列もま
たプライマーのための鋳型であるため、変性、プライマ
ーアニーリング及び延長の反復サイクルがプライマーに
より定義される領域の指数的蓄積をもたらす。鎖反応の
生成物は、使用された特異的プライマーの末端に対応す
る末端を有する別々の核酸デュプレックスであろう。
【００３３】増幅工程を模式的に後記する。ここで、相
補的な鎖〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を含んで成る所望の配列
〔Ｓ〕を含有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用され
る。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もとの
鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、
プライマーの１つのみにより停止する無限長の新しいSS
ＤＮＡ分子生成物を生成する。今後“長生成物”と称す
るこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。すなわ
ち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル数に
比例するであろう。
補的な鎖〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を含んで成る所望の配列
〔Ｓ〕を含有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用され
る。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もとの
鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、
プライマーの１つのみにより停止する無限長の新しいSS
ＤＮＡ分子生成物を生成する。今後“長生成物”と称す
るこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。すなわ
ち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル数に
比例するであろう。
【００３４】こうして生成された長生成物は、その後の
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、そして所望の配列〔Ｓ+ 〕又
は〔Ｓ- 〕の分子を生成するであろう。これらの分子も
また、一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの
鋳型として機能してさらに〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を生成
し、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度で
の〔Ｓ〕の蓄積をもたらすであろう鎖反応が継続され得
る。
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、そして所望の配列〔Ｓ+ 〕又
は〔Ｓ- 〕の分子を生成するであろう。これらの分子も
また、一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの
鋳型として機能してさらに〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を生成
し、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度で
の〔Ｓ〕の蓄積をもたらすであろう鎖反応が継続され得
る。
【００３５】意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションにより生成される副産物は自己触媒的ではな
く、そしてそれ故に直線的速度で蓄積する。
イゼーション以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションにより生成される副産物は自己触媒的ではな
く、そしてそれ故に直線的速度で蓄積する。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】１つのプライマーのオリゴヌクレオチド配
列で停止する各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所
望される特定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。この
工程の段階は無限に反復することができ、プライマー１
及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによってのみ
限定される。もとのヌクレオチドは複製されないので、
その量は全工程を通じて一定に維持される。
列で停止する各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所
望される特定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。この
工程の段階は無限に反復することができ、プライマー１
及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによってのみ
限定される。もとのヌクレオチドは複製されないので、
その量は全工程を通じて一定に維持される。
【００４１】長生成物はもとの核酸からのみ生成される
のでその量は直線的に増加する。特異的配列の量は指数
的に増加する。すなわち、特異的配列は支配的な種とな
る。これは次の表に示される。この表は、各サイクルの
効率を１００％として、ｎサイクル後に存在する種の相
対量を示す。
のでその量は直線的に増加する。特異的配列の量は指数
的に増加する。すなわち、特異的配列は支配的な種とな
る。これは次の表に示される。この表は、各サイクルの
効率を１００％として、ｎサイクル後に存在する種の相
対量を示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】鋳型として単鎖ヌクレオチドが使用される
場合、サイクル当り１個のみの長生成物が生成する。
場合、サイクル当り１個のみの長生成物が生成する。
【００４４】この明細書において使用する場合、“制限
エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”なる語は、特定
のヌクレオチド配列において又はその近傍において２本
鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素に関する。この発明のプラ
イマーは次の規準により選択することができ、この規準
は考慮すべき要素であるが排他的でも決定的でもない。
エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”なる語は、特定
のヌクレオチド配列において又はその近傍において２本
鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素に関する。この発明のプラ
イマーは次の規準により選択することができ、この規準
は考慮すべき要素であるが排他的でも決定的でもない。
【００４５】第１に、プライマーはウイルスゲノムの保
存された領域から選択される。ＡＩＤＳゲノムの場合に
はｇａｇ領域（ヌクレオキャプシド遺伝子）がコード領
域の最も保存された領域であり、ｐｏｌ及びｅｎｖ領域
がこれに続く。従ってｇａｇ領域が最初の研究のために
選択された。肝炎Ｂゲノムの場合には、ゲノムの全コー
ド領域が１つの種内で保存されている。
存された領域から選択される。ＡＩＤＳゲノムの場合に
はｇａｇ領域（ヌクレオキャプシド遺伝子）がコード領
域の最も保存された領域であり、ｐｏｌ及びｅｎｖ領域
がこれに続く。従ってｇａｇ領域が最初の研究のために
選択された。肝炎Ｂゲノムの場合には、ゲノムの全コー
ド領域が１つの種内で保存されている。
【００４６】第２に、プライマーは試験を妨害すると予
想されるウイルスゲノムのいかなる配列とも相同性を有
しない。例えば、Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．等、ＰＮＡＳ（ＵＳ
Ａ）８０：３６１８−３６２２（１９８３）により発表
されたＨＴＬＶＩの配列はＡＩＤＳの試験を妨害するで
あろう。
想されるウイルスゲノムのいかなる配列とも相同性を有
しない。例えば、Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．等、ＰＮＡＳ（ＵＳ
Ａ）８０：３６１８−３６２２（１９８３）により発表
されたＨＴＬＶＩの配列はＡＩＤＳの試験を妨害するで
あろう。
【００４７】第３に、プライマーは好ましくは増幅され
た核酸において二次構造を形成しない。この二次構造は
増幅酵素、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ、好まし
くはＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片と称する部
分による延長を妨害するであろう。これは、増幅媒体中
にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を約１５重量％ま
で、好ましくは５〜１０重量％使用することによって、
そして／又は増幅温度を３０〜４０℃、好ましくは３５
〜４０℃に上昇せしめることにより達成することができ
る。
た核酸において二次構造を形成しない。この二次構造は
増幅酵素、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ、好まし
くはＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片と称する部
分による延長を妨害するであろう。これは、増幅媒体中
にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を約１５重量％ま
で、好ましくは５〜１０重量％使用することによって、
そして／又は増幅温度を３０〜４０℃、好ましくは３５
〜４０℃に上昇せしめることにより達成することができ
る。
【００４８】第４に、プライマーは好ましくはグアニン
及びシトシンを約５０％含有し、そして不安定なハイブ
リドをもたらすであろうプライマーの３′末端の複数の
連続するアデニン及びチミンを含有しない。最後に、増
幅された生成物が制限酵素の使用によって検出される場
合、プローブは内部（非−末端）制限部位を有しなけれ
ばならない。
及びシトシンを約５０％含有し、そして不安定なハイブ
リドをもたらすであろうプライマーの３′末端の複数の
連続するアデニン及びチミンを含有しない。最後に、増
幅された生成物が制限酵素の使用によって検出される場
合、プローブは内部（非−末端）制限部位を有しなけれ
ばならない。
【００４９】オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の
適当な方法、例えば前記のホスホトリエステル法及びホ
スホジエステル法、又はその自動化された方法を用いて
調製することができる。このような１つの自動化された
方法においては、ジエチルホスホラミダイトが出発材料
として使用され、そしてこれはＢｅａｕｃａｇｅ等、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ（１９８１），２
２：１８５９−１８６２により記載されたようにして合
成される。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチ
ドを合成するための１つの方法が米国特許No. ４，４５
８，０６６に記載されている。生物起源から単離された
プライマー、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物を使
用することも可能である。
適当な方法、例えば前記のホスホトリエステル法及びホ
スホジエステル法、又はその自動化された方法を用いて
調製することができる。このような１つの自動化された
方法においては、ジエチルホスホラミダイトが出発材料
として使用され、そしてこれはＢｅａｕｃａｇｅ等、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ（１９８１），２
２：１８５９−１８６２により記載されたようにして合
成される。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチ
ドを合成するための１つの方法が米国特許No. ４，４５
８，０６６に記載されている。生物起源から単離された
プライマー、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物を使
用することも可能である。
【００５０】検出されるべきウイルスと関連する特異的
核酸配列を含有しているか又は含有していると予想され
るものである限り、精製された形態又は精製されていな
い形態のあらゆる起源の核酸を出発核酸として使用する
ことができる。すなわち、この方法は、１本鎖又は２本
鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡを
用いることができる。鋳型としてＲＮＡを使用すべき場
合、該鋳型をＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び
／又は条件を使用する。さらに、それぞれの１つの鎖を
含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドを使用することがで
きる。
核酸配列を含有しているか又は含有していると予想され
るものである限り、精製された形態又は精製されていな
い形態のあらゆる起源の核酸を出発核酸として使用する
ことができる。すなわち、この方法は、１本鎖又は２本
鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡを
用いることができる。鋳型としてＲＮＡを使用すべき場
合、該鋳型をＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び
／又は条件を使用する。さらに、それぞれの１つの鎖を
含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドを使用することがで
きる。
【００５１】これらの核酸配列のいずれかの混合物を使
用することができ、又は同一の又は異るプライマーを用
いるこの発明の先行する増幅反応から生成した核酸を用
いることもできる。増幅されるべき核酸配列は大きな分
子の一部分のみでもよく、又は特定の配列が全体核酸で
あるように最初に別個の分子として存在することもでき
る。
用することができ、又は同一の又は異るプライマーを用
いるこの発明の先行する増幅反応から生成した核酸を用
いることもできる。増幅されるべき核酸配列は大きな分
子の一部分のみでもよく、又は特定の配列が全体核酸で
あるように最初に別個の分子として存在することもでき
る。
【００５２】増幅されるべき配列は最初に純粋な形で存
在することは必要ではなく、それは複雑な混合物の小部
分、例えば全体ヒトＤＮＡ中に含有されるウイルス−コ
ード遺伝子の部分であってもよい。出発核酸は、同一で
もよく又は異っていてもよく、１より多くの所望の特定
の核酸配列を含有していてもよい。従って、この発明の
方法は、１つの特定の核酸配列の多量生産のためのみな
らず、同一の又は異る核酸分子上に位置する１より多く
の異る特定の核酸配列を増幅するために有用である。
在することは必要ではなく、それは複雑な混合物の小部
分、例えば全体ヒトＤＮＡ中に含有されるウイルス−コ
ード遺伝子の部分であってもよい。出発核酸は、同一で
もよく又は異っていてもよく、１より多くの所望の特定
の核酸配列を含有していてもよい。従って、この発明の
方法は、１つの特定の核酸配列の多量生産のためのみな
らず、同一の又は異る核酸分子上に位置する１より多く
の異る特定の核酸配列を増幅するために有用である。
【００５３】核酸は任意の由来、例えば、動物のごとき
高等生物からの天然ＤＮＡ又はＲＮＡから得ることがで
きる。ＤＮＡ又はＲＮＡは体サンプル、例えば血液、組
織材料、例えば絨毛、又は羊膜細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ
ｃｅｌｌ）から、種々の技法により、例えばＭａｎｉ
ａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８２），２８０−２８１により記載されている技法に
より抽出することができる。
高等生物からの天然ＤＮＡ又はＲＮＡから得ることがで
きる。ＤＮＡ又はＲＮＡは体サンプル、例えば血液、組
織材料、例えば絨毛、又は羊膜細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ
ｃｅｌｌ）から、種々の技法により、例えばＭａｎｉ
ａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８２），２８０−２８１により記載されている技法に
より抽出することができる。
【００５４】サンプルが不純な例えば血漿、血清又は血
液である場合、増幅の前にこれを、サンプルの細胞、
液、組織、ウイルスキャプシド又は動物細胞膜を開き、
そして核酸の鎖を露出しそして／又は分離するために効
果的な試薬の一定量により処理することができる。鎖を
露出しそして分離するためのこの細胞溶解（ｌｙｓｉｎ
ｇ）及び核酸変性段階は、一層容易に増幅が起こること
を可能にするであろう。
液である場合、増幅の前にこれを、サンプルの細胞、
液、組織、ウイルスキャプシド又は動物細胞膜を開き、
そして核酸の鎖を露出しそして／又は分離するために効
果的な試薬の一定量により処理することができる。鎖を
露出しそして分離するためのこの細胞溶解（ｌｙｓｉｎ
ｇ）及び核酸変性段階は、一層容易に増幅が起こること
を可能にするであろう。
【００５５】さらに、サンプルを増幅試薬で処理するに
先立ってサンプル中のＡＩＤＳウイルスを培養する必要
がない。サンプルを遠心分離してバフィーコートを得、
次にこれをカラムに通して白血球を得ることができる。
次に、この白血球を処理して、増幅されるべきサンプル
として使用するために該白血球から核酸を抽出すること
ができる。
先立ってサンプル中のＡＩＤＳウイルスを培養する必要
がない。サンプルを遠心分離してバフィーコートを得、
次にこれをカラムに通して白血球を得ることができる。
次に、この白血球を処理して、増幅されるべきサンプル
として使用するために該白血球から核酸を抽出すること
ができる。
【００５６】この発明の方法により、任意の特異的核酸
配列を製造することができる。必要なことは、配列の両
端の十分な数の塩基が十分に詳細に知られており、その
結果、所望の配列の異る鎖に、そして１つのプライマー
から合成された延長生成物が、それがその鋳型（相補
体）から分離された場合に、定義された長さの核酸への
他方のプライマーの延長のための鋳型として機能するこ
とができるような配列上の相対位置においてハイブリダ
イズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製す
ることができることのみである。
配列を製造することができる。必要なことは、配列の両
端の十分な数の塩基が十分に詳細に知られており、その
結果、所望の配列の異る鎖に、そして１つのプライマー
から合成された延長生成物が、それがその鋳型（相補
体）から分離された場合に、定義された長さの核酸への
他方のプライマーの延長のための鋳型として機能するこ
とができるような配列上の相対位置においてハイブリダ
イズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製す
ることができることのみである。
【００５７】配列の両端の塩基についての知識が多くな
るに従って、標的核酸配列のためのプライマーの特異性
を大きくすることができ、そしてそれ故に工程の効率が
高くなる。増幅されるべき断片の末端配列に関する情報
に幾らかのあいまいさが存在する場合特に、この明細書
においてこれ以後に使用されるプライマーなる用語は１
個より多くのプライマーを意味することがあると理解す
べきである。
るに従って、標的核酸配列のためのプライマーの特異性
を大きくすることができ、そしてそれ故に工程の効率が
高くなる。増幅されるべき断片の末端配列に関する情報
に幾らかのあいまいさが存在する場合特に、この明細書
においてこれ以後に使用されるプライマーなる用語は１
個より多くのプライマーを意味することがあると理解す
べきである。
【００５８】例えば、核酸配列が蛋白質配列情報から得
られる場合、遺伝子コードの縮重に基くすべての可能性
あるコドンの多様性を代表する配列を含有する複数のプ
ライマー集合が各鎖のために使用されるであろう。この
集合からの１つのプライマーが増幅されるべき所望の配
列の末端と共に実質的に保存されるであろう。
られる場合、遺伝子コードの縮重に基くすべての可能性
あるコドンの多様性を代表する配列を含有する複数のプ
ライマー集合が各鎖のために使用されるであろう。この
集合からの１つのプライマーが増幅されるべき所望の配
列の末端と共に実質的に保存されるであろう。
【００５９】特定の核酸配列はその配列を含有する核酸
を鋳型として使用することにより製造される。サンプル
の標的核酸配列が２本の鎖を含む場合、それを鋳型とし
て使用することができる前に、プライマー延長生成物の
合成と同時に又は別個の段階として、核酸の２本の鎖を
分離する必要がある。この鎖分離は適当な変性条件、例
えば物理的手段、化学的手段又は酵素的手段により達成
することができ、この明細書において使用される“変
性”なる語はこれらすべての手段を包含する。
を鋳型として使用することにより製造される。サンプル
の標的核酸配列が２本の鎖を含む場合、それを鋳型とし
て使用することができる前に、プライマー延長生成物の
合成と同時に又は別個の段階として、核酸の２本の鎖を
分離する必要がある。この鎖分離は適当な変性条件、例
えば物理的手段、化学的手段又は酵素的手段により達成
することができ、この明細書において使用される“変
性”なる語はこれらすべての手段を包含する。
【００６０】核酸の鎖を分離するための１つの物理的方
法は、核酸が変性されるまでそれを加熱することを含
む。典型的な加熱変性は約１〜１０分間にわたる約８０
℃〜１０５℃の温度を用いる。鎖分離はまた、ヘリカー
ゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）として知られる酵素群からの酵
素、又はヘリカーゼ活性を有しそしてリボＡＴＰの存在
下でＤＮＡを変性することが知られている酵素ＲｅｃＡ
によっても誘導され得る。
法は、核酸が変性されるまでそれを加熱することを含
む。典型的な加熱変性は約１〜１０分間にわたる約８０
℃〜１０５℃の温度を用いる。鎖分離はまた、ヘリカー
ゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）として知られる酵素群からの酵
素、又はヘリカーゼ活性を有しそしてリボＡＴＰの存在
下でＤＮＡを変性することが知られている酵素ＲｅｃＡ
によっても誘導され得る。
【００６１】ヘリカーゼによる核酸鎖の分離のために適
当な反応条件はＫｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌ
ｉｎｇ，ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，４３：６３（１９７８）により記載されてお
り、そしてＲｅｃＡを用いるための技法はＣ．Ｒａｄｄ
ｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４
０５−３７（１９８２）に総説されている。
当な反応条件はＫｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌ
ｉｎｇ，ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，４３：６３（１９７８）により記載されてお
り、そしてＲｅｃＡを用いるための技法はＣ．Ｒａｄｄ
ｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４
０５−３７（１９８２）に総説されている。
【００６２】増幅されるべき配列を含有するもとの核酸
配列が単鎖である場合、それに１又は２種類のオリゴヌ
クレオチドプライマーを添加することにより、該単鎖の
相補体が合成される。適切な１つのプライマーが添加さ
れた場合、該プライマー、重合のための試薬及び下記の
４種類のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でプラ
イマー延長生成物が合成される。
配列が単鎖である場合、それに１又は２種類のオリゴヌ
クレオチドプライマーを添加することにより、該単鎖の
相補体が合成される。適切な１つのプライマーが添加さ
れた場合、該プライマー、重合のための試薬及び下記の
４種類のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でプラ
イマー延長生成物が合成される。
【００６３】この生成物は、前記単鎖核酸に部分的に相
補的であり、そして該核酸鎖とハイブリダイズして異る
長さの鎖のデュプレックスを形成することができ、この
デュプレックスは次に上記のように単鎖に分離され、２
本の分離された相補的な単鎖が生成する。他の方法とし
て、前記単鎖核酸に２つの適切なプライマーを添加して
反応を行うこともできる。もとの核酸が増幅されるべき
配列を構成する場合、生成するプライマー延長生成物は
もとの核酸と完全に又は実質的に相補的であり、そして
それとハイブリダイズして同じ長さの２本の鎖のデュプ
レックスが形成され、このデュプレックスが単鎖分子に
分離されるであろう。
補的であり、そして該核酸鎖とハイブリダイズして異る
長さの鎖のデュプレックスを形成することができ、この
デュプレックスは次に上記のように単鎖に分離され、２
本の分離された相補的な単鎖が生成する。他の方法とし
て、前記単鎖核酸に２つの適切なプライマーを添加して
反応を行うこともできる。もとの核酸が増幅されるべき
配列を構成する場合、生成するプライマー延長生成物は
もとの核酸と完全に又は実質的に相補的であり、そして
それとハイブリダイズして同じ長さの２本の鎖のデュプ
レックスが形成され、このデュプレックスが単鎖分子に
分離されるであろう。
【００６４】核酸の相補的な鎖が分離される場合、その
核酸がもともと２本鎖であっても又は単鎖であっても、
それらの鎖は追加の核酸鎖の合成のための鋳型として容
易に使用される。この合成は、プライマーと鋳型とのハ
イブリダイゼーションが起る条件下で行われる。一般
に、これは緩衝化された水性溶液中、好ましくは７〜９
のpH、最も好ましくは約８のpHにおいて起こる。好まし
くは、過剰モル（ゲノム核酸について、通常約１０8 ：
１＝プライマー：鋳型）の２種類のオリゴヌクレオチド
プライマーを、分離された鋳型鎖を含有する緩衝液に加
える。
核酸がもともと２本鎖であっても又は単鎖であっても、
それらの鎖は追加の核酸鎖の合成のための鋳型として容
易に使用される。この合成は、プライマーと鋳型とのハ
イブリダイゼーションが起る条件下で行われる。一般
に、これは緩衝化された水性溶液中、好ましくは７〜９
のpH、最も好ましくは約８のpHにおいて起こる。好まし
くは、過剰モル（ゲノム核酸について、通常約１０8 ：
１＝プライマー：鋳型）の２種類のオリゴヌクレオチド
プライマーを、分離された鋳型鎖を含有する緩衝液に加
える。
【００６５】しかしながら、この発明が診断用途のため
に行われる場合、相補鎖の量が知られないから相補鎖の
量に対するプライマーの量を正確に決定することができ
ないことが理解される。しかしながら、実際問題とし
て、増幅されるべき配列が複雑な核酸鎖の混合物中に含
有される場合、添加されるプライマーの量は一般に相補
鎖（鋳型）の量に対して過剰モルであろう。工程の効率
を改善するため、大過剰モルが好ましい。
に行われる場合、相補鎖の量が知られないから相補鎖の
量に対するプライマーの量を正確に決定することができ
ないことが理解される。しかしながら、実際問題とし
て、増幅されるべき配列が複雑な核酸鎖の混合物中に含
有される場合、添加されるプライマーの量は一般に相補
鎖（鋳型）の量に対して過剰モルであろう。工程の効率
を改善するため、大過剰モルが好ましい。
【００６６】デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰもまた適当
な量で、プライマーと別々に又は一緒に合成混合物に加
え、そして得られる溶液を約９０〜１００℃に、約１〜
１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱期
間の後、溶液を室温に放冷する。室温はプライマーハイ
ブリダイゼーションのために適当な温度である。冷却さ
れた混合物に、プライマー延長反応を行うのに適当な試
薬（この明細書においては“重合のための試薬”と称す
る）を加え、そして当業界において知られている条件下
で反応を生じさせる。
トｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰもまた適当
な量で、プライマーと別々に又は一緒に合成混合物に加
え、そして得られる溶液を約９０〜１００℃に、約１〜
１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱期
間の後、溶液を室温に放冷する。室温はプライマーハイ
ブリダイゼーションのために適当な温度である。冷却さ
れた混合物に、プライマー延長反応を行うのに適当な試
薬（この明細書においては“重合のための試薬”と称す
る）を加え、そして当業界において知られている条件下
で反応を生じさせる。
【００６７】重合のための試薬も、もしそれが熱安定性
であれば、他の試薬と一緒に加えることができる。この
合成反応は、室温ないしそれより高い温度では重合のた
めの試薬がもはや機能しない温度において起こることが
できる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを試薬と
して使用する場合、温度は一般に約４０℃以下である。
最も便利には反応は室温において起こる。
であれば、他の試薬と一緒に加えることができる。この
合成反応は、室温ないしそれより高い温度では重合のた
めの試薬がもはや機能しない温度において起こることが
できる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを試薬と
して使用する場合、温度は一般に約４０℃以下である。
最も便利には反応は室温において起こる。
【００６８】重合のための試薬は、プライマー延長生成
物の合成を達成するであろう任意の化合物又は系であれ
ばよく、酵素を包含する。この目的のために適当な酵素
には、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｅ．コリ
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ類、
ポリメラーゼ ミューテイン、逆転写酵素、及びその他
の酵素が含まれ、その他の酵素には熱安定性酵素類（す
なわち、変性を生じさせるために十分に上昇した温度に
かけられた後にプライマー延長を行う酵素類）が含ま
れ、これらは各核酸鎖に相補的であるプライマー延長生
成物を生成するために適当な態様でのヌクレオチドの結
合を容易にするであろう。
物の合成を達成するであろう任意の化合物又は系であれ
ばよく、酵素を包含する。この目的のために適当な酵素
には、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｅ．コリ
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ類、
ポリメラーゼ ミューテイン、逆転写酵素、及びその他
の酵素が含まれ、その他の酵素には熱安定性酵素類（す
なわち、変性を生じさせるために十分に上昇した温度に
かけられた後にプライマー延長を行う酵素類）が含ま
れ、これらは各核酸鎖に相補的であるプライマー延長生
成物を生成するために適当な態様でのヌクレオチドの結
合を容易にするであろう。
【００６９】一般に、この合成は各プライマーの３′末
端において開始され、そして鋳型鎖にそって５′方向
に、合成が停止するまで進行し、異る長さの分子を生成
する。しかしながら、５′末端において合成を開始し、
そして他方向に進行する重合のための試薬も存在し、こ
の場合も上記の同じ方法を使用することができる。
端において開始され、そして鋳型鎖にそって５′方向
に、合成が停止するまで進行し、異る長さの分子を生成
する。しかしながら、５′末端において合成を開始し、
そして他方向に進行する重合のための試薬も存在し、こ
の場合も上記の同じ方法を使用することができる。
【００７０】新たに合成された鎖及びその相補的な核酸
鎖は、もし標的配列が存在すれば、上記のハイブリダイ
ゼーション条件のもとで２本鎖分子を形成し、そしてこ
のハイブリドがこの方法の次の段階において使用されよ
う。次の段階においては、ハイブリダイゼーション条件
下で処理されたサンプルを、前記の方法のいずれかを用
いる変性条件にかけることにより、標的配列が存在すれ
ば単鎖分子が得られる。
鎖は、もし標的配列が存在すれば、上記のハイブリダイ
ゼーション条件のもとで２本鎖分子を形成し、そしてこ
のハイブリドがこの方法の次の段階において使用されよ
う。次の段階においては、ハイブリダイゼーション条件
下で処理されたサンプルを、前記の方法のいずれかを用
いる変性条件にかけることにより、標的配列が存在すれ
ば単鎖分子が得られる。
【００７１】単鎖分子上で新たな核酸が合成される。上
記の条件下で反応を進行せしめるために必要であればさ
らに、重合のための試薬、ヌクレオチド及びプライマー
を追加することができる。やはり、合成は各オリゴヌク
レオチドプライマーの一端から始まり、そして鋳型の単
鎖にそって進行し、追加の核酸をもたらすであろう。こ
の段階の後、延長生成物の半分は２つのプライマーによ
り挟まれた核酸配列から成るであろう。
記の条件下で反応を進行せしめるために必要であればさ
らに、重合のための試薬、ヌクレオチド及びプライマー
を追加することができる。やはり、合成は各オリゴヌク
レオチドプライマーの一端から始まり、そして鋳型の単
鎖にそって進行し、追加の核酸をもたらすであろう。こ
の段階の後、延長生成物の半分は２つのプライマーによ
り挟まれた核酸配列から成るであろう。
【００７２】検出のために必要な程度に標的核酸配列を
増幅するために必要な回数だけ変性段階及び延長生成物
の合成の段階を反復することができる。さらに詳細に下
記するように、生産された特定の核酸配列の量は指数的
に蓄積されるであろう。最初の核酸又は核酸混合物から
１種類より多くの特定の核酸配列を生成することが望ま
しい場合、対応する数の異るオリゴヌクレオチドプライ
マーが使用される。例えば、２種類の異る特定の核酸配
列を生成せしめるべき場合には４種類のプライマーを使
用する。プライマーの内の２つは特定の核酸配列の１つ
に対して特異的であり、そして他の２つのプライマーは
第２の特定の核酸配列に対して特異的である。このよう
にして、２つの異る特定の配列のそれぞれがこの発明の
方法によって指数的に生成され得る。
増幅するために必要な回数だけ変性段階及び延長生成物
の合成の段階を反復することができる。さらに詳細に下
記するように、生産された特定の核酸配列の量は指数的
に蓄積されるであろう。最初の核酸又は核酸混合物から
１種類より多くの特定の核酸配列を生成することが望ま
しい場合、対応する数の異るオリゴヌクレオチドプライ
マーが使用される。例えば、２種類の異る特定の核酸配
列を生成せしめるべき場合には４種類のプライマーを使
用する。プライマーの内の２つは特定の核酸配列の１つ
に対して特異的であり、そして他の２つのプライマーは
第２の特定の核酸配列に対して特異的である。このよう
にして、２つの異る特定の配列のそれぞれがこの発明の
方法によって指数的に生成され得る。
【００７３】この発明の方法は、各段階の後に新たな試
薬を添加して段階的に行うことができ、あるいはすべて
の試薬を最初の段階で添加して同時に行うことができ、
あるいは所与の数の段階の後に新たな試薬を加えて半段
階的且つ半同時間に行うことができる。熱感受性酵素の
場合のように重合のための試薬を不活性化するであろう
加熱のごとき変性方法を用いる場合、各鎖分離段階の後
に該試薬を補充することが必要である。
薬を添加して段階的に行うことができ、あるいはすべて
の試薬を最初の段階で添加して同時に行うことができ、
あるいは所与の数の段階の後に新たな試薬を加えて半段
階的且つ半同時間に行うことができる。熱感受性酵素の
場合のように重合のための試薬を不活性化するであろう
加熱のごとき変性方法を用いる場合、各鎖分離段階の後
に該試薬を補充することが必要である。
【００７４】鎖分離段階のために酵素的手段を使用する
場合、同時的方法を使用することができる。同時的方法
においては、反応混合物は、所望の配列を含有する核酸
鎖のほかに、鎖分離酵素（例えばヘリカーゼ）、鎖分離
酵素のための適当なエネルギー源、例えばｒＡＴＰ、４
種類のヌクレオシドトリホスフェート、過剰モル量のオ
リゴヌクレオチドプライマー、及び重合のための試薬、
例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断
片を含有するであろう。
場合、同時的方法を使用することができる。同時的方法
においては、反応混合物は、所望の配列を含有する核酸
鎖のほかに、鎖分離酵素（例えばヘリカーゼ）、鎖分離
酵素のための適当なエネルギー源、例えばｒＡＴＰ、４
種類のヌクレオシドトリホスフェート、過剰モル量のオ
リゴヌクレオチドプライマー、及び重合のための試薬、
例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断
片を含有するであろう。
【００７５】同時的方法において変性のために加熱を使
用する場合、熱安定性試薬例えば熱安定性ポリメラーゼ
を使用することができ、このものは上昇した温度、好ま
しくは試薬に依存して５０℃〜１０５℃において作用
し、この混合物においては核酸は平衡状態の単鎖及び２
本鎖から成るであろう。より短い長さの核酸について
は、約４０℃〜５０℃のより低い温度を使用することが
できる。
用する場合、熱安定性試薬例えば熱安定性ポリメラーゼ
を使用することができ、このものは上昇した温度、好ま
しくは試薬に依存して５０℃〜１０５℃において作用
し、この混合物においては核酸は平衡状態の単鎖及び２
本鎖から成るであろう。より短い長さの核酸について
は、約４０℃〜５０℃のより低い温度を使用することが
できる。
【００７６】上方温度は酵素が分解するであろう温度、
又はそれより高ければ不十分なレベルのプライマーハイ
ブリダイゼーションが起こるであろう温度に依存するで
あろう。このような熱安定性酵素は例えばＡ．Ｓ．Ｋａ
ｌｅｄｉｎ等、Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，４５，６４４−
６５１（１９８０）により記載されている。この定温反
応が成功するため、プライマーはそれらの３′末端を相
互の６〜８塩基対以内に有する。
又はそれより高ければ不十分なレベルのプライマーハイ
ブリダイゼーションが起こるであろう温度に依存するで
あろう。このような熱安定性酵素は例えばＡ．Ｓ．Ｋａ
ｌｅｄｉｎ等、Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，４５，６４４−
６５１（１９８０）により記載されている。この定温反
応が成功するため、プライマーはそれらの３′末端を相
互の６〜８塩基対以内に有する。
【００７７】この方法の各段階は、すべての試薬類が最
初から存在しているにもかかわらず逐次的に進行するで
あろう。必要により追加の試薬類を添加することができ
る。所望量の特定の配列を生成せしめるために適切な時
間が経過した後、任意の既知方法により酵素を不活性化
することにより、又は反応成分を分離することにより反
応を停止せしめることができる。
初から存在しているにもかかわらず逐次的に進行するで
あろう。必要により追加の試薬類を添加することができ
る。所望量の特定の配列を生成せしめるために適切な時
間が経過した後、任意の既知方法により酵素を不活性化
することにより、又は反応成分を分離することにより反
応を停止せしめることができる。
【００７８】増幅はまた温度循環反応によっても行うこ
とができ、この方法においては温度を連続的に９０℃〜
１０５℃に上昇せしめることによって変性を可能にし、
そして次に３５℃〜６５℃又はさらに低下せしめること
により熱安定性酵素を用いながら延長及びアニーリング
を可能にする。実際には温度を単に約９５℃に上昇せし
め、約６５℃又はさらに低く３７℃に低下せしめ、そし
て再び約９５℃に上昇せしめ、そしてこのサイクルを所
望の期間続ける。
とができ、この方法においては温度を連続的に９０℃〜
１０５℃に上昇せしめることによって変性を可能にし、
そして次に３５℃〜６５℃又はさらに低下せしめること
により熱安定性酵素を用いながら延長及びアニーリング
を可能にする。実際には温度を単に約９５℃に上昇せし
め、約６５℃又はさらに低く３７℃に低下せしめ、そし
て再び約９５℃に上昇せしめ、そしてこのサイクルを所
望の期間続ける。
【００７９】自動化された方法の他の態様においては、
変性領域、試薬添加領域及び反応領域を通して反応を循
環することにより本発明の方法を連続的に行うことがで
きる。他の態様においては、プライマー延長生成物の合
成のために使用される酵素をカラム中に固定化すること
ができる。他の反応成分はカラム及び加熱コイルを直列
的に通して、ポンプにより連続的に循環せしめることが
でき、こうして酵素を不活性化することなく、生成され
た核酸を反復して変性せしめることができる。
変性領域、試薬添加領域及び反応領域を通して反応を循
環することにより本発明の方法を連続的に行うことがで
きる。他の態様においては、プライマー延長生成物の合
成のために使用される酵素をカラム中に固定化すること
ができる。他の反応成分はカラム及び加熱コイルを直列
的に通して、ポンプにより連続的に循環せしめることが
でき、こうして酵素を不活性化することなく、生成され
た核酸を反復して変性せしめることができる。
【００８０】増幅された生成物は、放射性プローブを使
用しないでサザンブロットによりそれを分析することに
よって検出することができる。この方法においては、例
えば、ＡＩＤＳと関連する非常に低レベルの配列を含有
する末梢血リンパ球からのＤＮＡの小サンプルを増幅
し、そしてサザンブロット技法により分析する。高レベ
ルの増幅されたシグナルによって非放射性プローブの使
用が容易となる。
用しないでサザンブロットによりそれを分析することに
よって検出することができる。この方法においては、例
えば、ＡＩＤＳと関連する非常に低レベルの配列を含有
する末梢血リンパ球からのＤＮＡの小サンプルを増幅
し、そしてサザンブロット技法により分析する。高レベ
ルの増幅されたシグナルによって非放射性プローブの使
用が容易となる。
【００８１】他の検出方法は、増幅された核酸配列とハ
イブリダイズすることができる標識されたプローブを用
い、そして該プローブがハイブリダイズしたか否かを決
定する検出法を含む。この様なプローブは必然的に、ウ
イルス（例えばＡＩＤＳウイルス、ＨＴＬＶIII ，ＡＲ
Ｖ，ＬＡＶ，ＬＡＶＡ、又はそれらのバリアント）のゲ
ノムからの実質的に保存された核酸配列を含有し、そし
てプライマー及び増幅される配列について上記したよう
にして選択される。ＡＩＤＳについては、プローブは好
ましくはＡＩＤＳゲノムのｇａｇ領域から選択される。
イブリダイズすることができる標識されたプローブを用
い、そして該プローブがハイブリダイズしたか否かを決
定する検出法を含む。この様なプローブは必然的に、ウ
イルス（例えばＡＩＤＳウイルス、ＨＴＬＶIII ，ＡＲ
Ｖ，ＬＡＶ，ＬＡＶＡ、又はそれらのバリアント）のゲ
ノムからの実質的に保存された核酸配列を含有し、そし
てプライマー及び増幅される配列について上記したよう
にして選択される。ＡＩＤＳについては、プローブは好
ましくはＡＩＤＳゲノムのｇａｇ領域から選択される。
【００８２】１つのこのようなプローブ法は、１９８５
年１２月１１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開N
o. １６４，０５４に記載されているオリゴマー制限技
法である。この方法においては、増幅された核酸を変性
し、そして溶液中で、標的配列に特異的にハイブリダイ
ズし（プライマーにより含有される特定の保存された領
域を含む）そして注目の少なくとも１個の制限部位を含
む標識されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダ
イズせしめる。
年１２月１１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開N
o. １６４，０５４に記載されているオリゴマー制限技
法である。この方法においては、増幅された核酸を変性
し、そして溶液中で、標的配列に特異的にハイブリダイ
ズし（プライマーにより含有される特定の保存された領
域を含む）そして注目の少なくとも１個の制限部位を含
む標識されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダ
イズせしめる。
【００８３】標的とプローブとの間で形成されたデュプ
レックスは制限部位を再構成し、そして制限酵素、例え
ばＢｓｔＮＩ，ＰｖｏII，ＤｄｅＩ又はＤｒａＩにより
開列された場合、ゲル電気泳動により全長プローブから
分離され得る標識されたプローブ断片を放出するであろ
う。次に、得られたゲルをオートラジオグラフ処理す
る。この方法による増幅された生成物の分析は迅速であ
る。すなわち、数時間以内に結果が得られる。
レックスは制限部位を再構成し、そして制限酵素、例え
ばＢｓｔＮＩ，ＰｖｏII，ＤｄｅＩ又はＤｒａＩにより
開列された場合、ゲル電気泳動により全長プローブから
分離され得る標識されたプローブ断片を放出するであろ
う。次に、得られたゲルをオートラジオグラフ処理す
る。この方法による増幅された生成物の分析は迅速であ
る。すなわち、数時間以内に結果が得られる。
【００８４】好ましくは、プローブは３０〜５０塩基の
長さを有し、そして標識されている。また、制限酵素は
好ましくは、検出されるべき配列がＡＩＤＳウイルスに
由来するものであればＢｓｔＮＩ又はＰｖｏIIであり、
そして検出されるべき配列がヘパドナウイルスに由来す
るものであればＤｄｅＩである。増幅された生成物を分
析するために使用される他の方法はドットブロット法で
ある。この方法においては、増幅されたサンプルを膜上
に直接スポットし、そして標識されたプローブとハイブ
リダイズせしめる。標識は、分光法により、光化学法に
より、又は生化学的、免疫化学的もしくは化学的手段に
より検出され得る。
長さを有し、そして標識されている。また、制限酵素は
好ましくは、検出されるべき配列がＡＩＤＳウイルスに
由来するものであればＢｓｔＮＩ又はＰｖｏIIであり、
そして検出されるべき配列がヘパドナウイルスに由来す
るものであればＤｄｅＩである。増幅された生成物を分
析するために使用される他の方法はドットブロット法で
ある。この方法においては、増幅されたサンプルを膜上
に直接スポットし、そして標識されたプローブとハイブ
リダイズせしめる。標識は、分光法により、光化学法に
より、又は生化学的、免疫化学的もしくは化学的手段に
より検出され得る。
【００８５】この例には、アルカリ性ホスファターゼの
ごとき酵素、32Ｐのごとき放射性標識、蛍光レベル、又
はビオチンが含まれる。１つの態様においては、ビオチ
ン化プローブが使用され、この場合、ビオチンが次の
式： −Ｙ−（ＣＨ2 ）2 −Ｏ−〔（ＣＨ2 ）x Ｏ〕y −ＣＨ2 ＣＨ2 −ＮＨ− （式中、ＹはＯ，ＮＨ、又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１
〜４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わ
されるスペーサーアームに付加されている。このスペー
サーアームは今度は次の式：
ごとき酵素、32Ｐのごとき放射性標識、蛍光レベル、又
はビオチンが含まれる。１つの態様においては、ビオチ
ン化プローブが使用され、この場合、ビオチンが次の
式： −Ｙ−（ＣＨ2 ）2 −Ｏ−〔（ＣＨ2 ）x Ｏ〕y −ＣＨ2 ＣＨ2 −ＮＨ− （式中、ＹはＯ，ＮＨ、又はＮ−ＣＨＯであり、ｘは１
〜４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わ
されるスペーサーアームに付加されている。このスペー
サーアームは今度は次の式：
【００８６】
【化１】
【００８７】で表わされるプソラレン成分に付加されて
いる。このプソラレン成分は、Ｃｏｕｒａｇｅ−Ｔｅｂ
ｂｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
６９７（１９８２）１−５により記載されている様に、
“ギャップを有する円形”プローブに挿入されそしてこ
れを架橋する。この場合、ギャップを有する円形プロー
ブの単鎖ハイブリダイゼーション領域はプライマー間に
含まれる領域を含む。このビオチン化及びドットブロッ
ト法の詳細は米国特許No. ４，５８２，７８９及びNo.
４，６１７，２６１にさらに十分に記載されている。ビ
オチン化プローブは放射性同位元素の必要性を排除す
る。
いる。このプソラレン成分は、Ｃｏｕｒａｇｅ−Ｔｅｂ
ｂｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
６９７（１９８２）１−５により記載されている様に、
“ギャップを有する円形”プローブに挿入されそしてこ
れを架橋する。この場合、ギャップを有する円形プロー
ブの単鎖ハイブリダイゼーション領域はプライマー間に
含まれる領域を含む。このビオチン化及びドットブロッ
ト法の詳細は米国特許No. ４，５８２，７８９及びNo.
４，６１７，２６１にさらに十分に記載されている。ビ
オチン化プローブは放射性同位元素の必要性を排除す
る。
【００８８】別の方法として、“逆”ドットブロット方
式においては、プローブをまず膜上に必要であればプレ
ハイブリダイゼーション条件下でスポットし、そして次
に増幅された生成物を前処理された膜にハイブリダイゼ
ーション条件下で添加する。ドットブロット法において
は、膜をまずプレハイブリダイズせしめそして次にプロ
ーブとハイブリダイズせしめなければならないので、こ
の方法は前記のオリゴマー制限法に比べてより多くの時
間を要する。
式においては、プローブをまず膜上に必要であればプレ
ハイブリダイゼーション条件下でスポットし、そして次
に増幅された生成物を前処理された膜にハイブリダイゼ
ーション条件下で添加する。ドットブロット法において
は、膜をまずプレハイブリダイズせしめそして次にプロ
ーブとハイブリダイズせしめなければならないので、こ
の方法は前記のオリゴマー制限法に比べてより多くの時
間を要する。
【００８９】しかしながら、急速に変異するウイルスに
ついては、この方法は、限定された塩基のミスマッチを
含有する配列がなお適当なハイブリダイゼーション条件
下で検出されるという利点を有し、他方オリゴマー制限
法においては、ウイルスの可変性に基き制限部位の廃止
をもたらす変異を担持するすべてのウイルスは検出され
ないであろう。
ついては、この方法は、限定された塩基のミスマッチを
含有する配列がなお適当なハイブリダイゼーション条件
下で検出されるという利点を有し、他方オリゴマー制限
法においては、ウイルスの可変性に基き制限部位の廃止
をもたらす変異を担持するすべてのウイルスは検出され
ないであろう。
【００９０】この発明はまた、使用される各プライマー
及びプローブの容器を有するパッケージされた多容器を
含んで成るキットに関する。このキットはまた、プライ
マー延長生成物を合成するための重合用試薬、例えば酵
素を含む容器、４種類のヌクレオシドトリホスフェート
のそれぞれを含む容器、及び標識を検出する手段（例え
ば、標識がビオチンであればアビジン−酵素複合体）を
含む容器を有することができる。
及びプローブの容器を有するパッケージされた多容器を
含んで成るキットに関する。このキットはまた、プライ
マー延長生成物を合成するための重合用試薬、例えば酵
素を含む容器、４種類のヌクレオシドトリホスフェート
のそれぞれを含む容器、及び標識を検出する手段（例え
ば、標識がビオチンであればアビジン−酵素複合体）を
含む容器を有することができる。
【００９１】さらに、このキットは、注目のウイルスゲ
ノム（例えばＡＩＤＳ）の配列を有する１もしくは複数
の核酸を含む陽性対照を収容する容器、及び／又はこの
ような核酸を含まない陰性対照を収容する容器を有する
ことができる。さらに、このキットは、プローブ中の配
列中に含まれる部位において、標的配列を含む核酸を開
裂せしめることができる各制限酵素のための容器を有す
ることができる。
ノム（例えばＡＩＤＳ）の配列を有する１もしくは複数
の核酸を含む陽性対照を収容する容器、及び／又はこの
ような核酸を含まない陰性対照を収容する容器を有する
ことができる。さらに、このキットは、プローブ中の配
列中に含まれる部位において、標的配列を含む核酸を開
裂せしめることができる各制限酵素のための容器を有す
ることができる。
【００９２】次の例は、この発明の種々の態様を例示す
るが、この発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。これらの例においては、特にことわらない限
り、すべての部及び％は液体については容量基準であ
り、そして固体については重量基準であり、そして温度
は℃で表わす。
るが、この発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。これらの例においては、特にことわらない限
り、すべての部及び％は液体については容量基準であ
り、そして固体については重量基準であり、そして温度
は℃で表わす。
【００９３】例１．増幅されるべき所望の配列は、１９
４ＢＫ，３４２，３６７，３６１，３６８Ｈ，２０７，
３０７，３０８Ｂ，３２３，３２６、及び３４０として
同定され、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｅ
ｎｔｅｒ，ＳＵＮＹ Ｕｐｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ニューヨーク １
３２１０のＢｅｒｎａｒｄ Ｐｏｉｅｓｚ博士から入手
した１１個の暗号が付されたＤＮＡサンプル中に含有さ
れる。
４ＢＫ，３４２，３６７，３６１，３６８Ｈ，２０７，
３０７，３０８Ｂ，３２３，３２６、及び３４０として
同定され、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｅ
ｎｔｅｒ，ＳＵＮＹ Ｕｐｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ニューヨーク １
３２１０のＢｅｒｎａｒｄ Ｐｏｉｅｓｚ博士から入手
した１１個の暗号が付されたＤＮＡサンプル中に含有さ
れる。
【００９４】増幅されるべき配列、プライマー、及びプ
ローブは前記のドットマトリクスプログラムにより同定
した。ここで、選択された配列ウインドウは２０塩基対
以上の長さであり、配列をＡＩＤＳウイルスの保存され
た領域内で選択した。コードされたサンプルをまずＰｏ
ｅｉｓｚ博士によりインターロイキン−２の存在下で培
養し、ウイルスの存在について試験した。次に、下記の
方法によりＤＮＡを抽出した。
ローブは前記のドットマトリクスプログラムにより同定
した。ここで、選択された配列ウインドウは２０塩基対
以上の長さであり、配列をＡＩＤＳウイルスの保存され
た領域内で選択した。コードされたサンプルをまずＰｏ
ｅｉｓｚ博士によりインターロイキン−２の存在下で培
養し、ウイルスの存在について試験した。次に、下記の
方法によりＤＮＡを抽出した。
【００９５】１．１〜２×１０8 の培養された細胞を試
験管中で２０mlのドデシル硫酸ナトリウム細胞溶解緩衝
液（１％ＳＤＳ，１５０mM ＮａＣｌ，２５mM Ｎａ2
ＥＤＴＡ）により溶解した。 ２．プロテイナーゼＫの５mg／ml溶液４００μｌを各試
験に加え、そして３７℃にて一夜インキュベートした。 ３．ＤＮＡを、フェノール、及びＣＨＣｌ3 ：イソプロ
ピルアルコールにより次々と抽出し、そして次にエタノ
ールで沈澱せしめた。 ４．ＤＮＡをガラス棒上に巻き付け、そして１×ＴＥ緩
衝液（１０mM Ｔｒｉｓ，１mM Ｎａ2 ＥＤＴＡ，pH
７．５）中に再懸濁し、そして１×ＴＥ緩衝液に対して
十分に透析した。
験管中で２０mlのドデシル硫酸ナトリウム細胞溶解緩衝
液（１％ＳＤＳ，１５０mM ＮａＣｌ，２５mM Ｎａ2
ＥＤＴＡ）により溶解した。 ２．プロテイナーゼＫの５mg／ml溶液４００μｌを各試
験に加え、そして３７℃にて一夜インキュベートした。 ３．ＤＮＡを、フェノール、及びＣＨＣｌ3 ：イソプロ
ピルアルコールにより次々と抽出し、そして次にエタノ
ールで沈澱せしめた。 ４．ＤＮＡをガラス棒上に巻き付け、そして１×ＴＥ緩
衝液（１０mM Ｔｒｉｓ，１mM Ｎａ2 ＥＤＴＡ，pH
７．５）中に再懸濁し、そして１×ＴＥ緩衝液に対して
十分に透析した。
【００９６】Ｉ．プライマーの合成 それぞれＳＫ０１及びＳＫ０２と称する２つのオリゴデ
オキシリボヌクレオチドプライマーを下記の方法により
調製した。 ５′−CAGGGAGCTAGAACGAT −３′ （ＳＫ０１） ５′−CTTCTGATCCTGTCTGA −３′ （ＳＫ０２） ＳＫ０１及びＳＫ０２は、ＨＴＬＶIII 単離体ＢＨ１０
のヌクレオチド９００及び１００６の間の１０７塩基の
増幅をもたらすように選択した。
オキシリボヌクレオチドプライマーを下記の方法により
調製した。 ５′−CAGGGAGCTAGAACGAT −３′ （ＳＫ０１） ５′−CTTCTGATCCTGTCTGA −３′ （ＳＫ０２） ＳＫ０１及びＳＫ０２は、ＨＴＬＶIII 単離体ＢＨ１０
のヌクレオチド９００及び１００６の間の１０７塩基の
増幅をもたらすように選択した。
【００９７】Ａ．自動合成法 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）２２：１８
５９−１８６２の方法に従って合成されたジエチルホス
ホラミダイトを、ヌクレオシドで誘導体化さた調節され
た細孔を有するガラス支持体に、ビオサーチ（Ｂｉｏｓ
ｅａｒｃｈ）ＳＡＭ−１を用いて逐次縮合せしめた。
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）２２：１８
５９−１８６２の方法に従って合成されたジエチルホス
ホラミダイトを、ヌクレオシドで誘導体化さた調節され
た細孔を有するガラス支持体に、ビオサーチ（Ｂｉｏｓ
ｅａｒｃｈ）ＳＡＭ−１を用いて逐次縮合せしめた。
【００９８】この方法は、ジクロロメタン中トリクロロ
酢酸を用いる脱トリチル化、活性化陽子供与体としてベ
ンゾトリアゾールを用いる縮合、並びにテトラヒドロフ
ラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピリジ
ンを用いるキャッピングを含む。サイクル時間に約３０
分間であった。各段階における収率は本質的に定量的で
あり、そして脱トリチル化中に放出されるジメトキシト
リチルアルコールの収集及び分光的試験により決定され
た。
酢酸を用いる脱トリチル化、活性化陽子供与体としてベ
ンゾトリアゾールを用いる縮合、並びにテトラヒドロフ
ラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピリジ
ンを用いるキャッピングを含む。サイクル時間に約３０
分間であった。各段階における収率は本質的に定量的で
あり、そして脱トリチル化中に放出されるジメトキシト
リチルアルコールの収集及び分光的試験により決定され
た。
【００９９】Ｂ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱
保護及び精製方法 固体支持体をカラムから取り出し、そして密閉チューブ
中で室温にて４時間１mlの濃水酸化アンモニウムに暴露
した。次に、支持体を濾過により除去し、そして部分的
に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶
液を５時間にわたり５５℃にした。アンモニアを除去
し、そして残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用
した。３０ボルト／cmにて９０分間電気泳動し、この後
生成物を含有するバンドを螢光プレートのＵＶシャドウ
イングにより同定した。
保護及び精製方法 固体支持体をカラムから取り出し、そして密閉チューブ
中で室温にて４時間１mlの濃水酸化アンモニウムに暴露
した。次に、支持体を濾過により除去し、そして部分的
に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶
液を５時間にわたり５５℃にした。アンモニアを除去
し、そして残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用
した。３０ボルト／cmにて９０分間電気泳動し、この後
生成物を含有するバンドを螢光プレートのＵＶシャドウ
イングにより同定した。
【０１００】バンドを切り出し、そして１mlの蒸留水に
より４℃にて一夜溶出した。この溶液をアルテック（Ａ
ｌｔｅｃｈ）ＲＰ１８カラムに適用し、そして１％酢酸
アンモニウム緩衝液（pH６．０）中アセトニトリルの７
〜１３％のグラジエントにより溶出した。溶出を２６０
nmにおけるＵＶ吸収によりモニターし、そして適切な画
分を集め、一定の容量中でのＵＶ吸収により定量し、そ
して真空遠心分離機中室温にて蒸発乾固した。
より４℃にて一夜溶出した。この溶液をアルテック（Ａ
ｌｔｅｃｈ）ＲＰ１８カラムに適用し、そして１％酢酸
アンモニウム緩衝液（pH６．０）中アセトニトリルの７
〜１３％のグラジエントにより溶出した。溶出を２６０
nmにおけるＵＶ吸収によりモニターし、そして適切な画
分を集め、一定の容量中でのＵＶ吸収により定量し、そ
して真空遠心分離機中室温にて蒸発乾固した。
【０１０１】Ｃ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの特
徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリ
ヌクレオチドキナーゼ及びγ−32Ｐ−ＡＴＰにより32Ｐ
標識した。標識された化合物を、５０ボルト／cmにて４
５分間にわたる電気泳動の後の１４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験し
た。この方法は分子量を確認する。
徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリ
ヌクレオチドキナーゼ及びγ−32Ｐ−ＡＴＰにより32Ｐ
標識した。標識された化合物を、５０ボルト／cmにて４
５分間にわたる電気泳動の後の１４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験し
た。この方法は分子量を確認する。
【０１０２】ヘビ毒ジエステラーゼ及び細菌アルカリ性
ホスファターゼによりオリゴデオキシリボヌクレオチド
をヌクレオチドに消化し、そして次に逆相ＨＰＬＣカラ
ム及び１０％アセトニトリル、１％酢酸アンモニウム移
動相を用いて前記ヌクレオチドを分離しそして定量する
ことにより、塩基組成を決定した。
ホスファターゼによりオリゴデオキシリボヌクレオチド
をヌクレオチドに消化し、そして次に逆相ＨＰＬＣカラ
ム及び１０％アセトニトリル、１％酢酸アンモニウム移
動相を用いて前記ヌクレオチドを分離しそして定量する
ことにより、塩基組成を決定した。
【０１０３】II．増幅反応 Ｐｏｉｅｓｚ博士からの１１個の暗号が付されたＤＮＡ
サンプルの各々からの１μｇずつのＤＮＡを、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），５０mM塩化ナトリウム
及び１０mM塩化マグネシウムから成り、１００pmolのプ
ライマーＳＫ０１、１００pmolのプライマーＳＫ０２、
並びに１５０nmolずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びＴＴＰを含有する緩衝液１００μｌに加えた。
サンプルの各々からの１μｇずつのＤＮＡを、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），５０mM塩化ナトリウム
及び１０mM塩化マグネシウムから成り、１００pmolのプ
ライマーＳＫ０１、１００pmolのプライマーＳＫ０２、
並びに１５０nmolずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びＴＴＰを含有する緩衝液１００μｌに加えた。
【０１０４】得られた溶液を１０分間１００℃に加熱
し、そして２分間にわたり室温に放冷し、その後１ユニ
ットのＥ．コリＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片
を含有する２μｌを添加した。室温にて２分間反応を行
わせ、その後９５℃にて２分間にわたり加熱することに
より不活性化した。変性、プライマーアニーリング、Ｋ
ｌｅｎｏｗによる延長（段階当り２分間）、及びポリメ
ラーゼの添加を１９回反復した。
し、そして２分間にわたり室温に放冷し、その後１ユニ
ットのＥ．コリＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片
を含有する２μｌを添加した。室温にて２分間反応を行
わせ、その後９５℃にて２分間にわたり加熱することに
より不活性化した。変性、プライマーアニーリング、Ｋ
ｌｅｎｏｗによる延長（段階当り２分間）、及びポリメ
ラーゼの添加を１９回反復した。
【０１０５】III ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの
合成及びリン酸化 次の配列： ５−* AATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAG−３′ （配列中* は標識を示す）を有する標識されたＤＮＡプ
ローブＳＫ０３をセクションＩに記載した方法により合
成した。１０pmole のプローブを、70mM Ｔｒｉｓ（pH
７．６），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１．５mMスペルミン及
び２．５mMジチオスレイトールを含有する反応容量４０
μｌ中４ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
５０pmol γ−32Ｐ−ＡＴＰ（約７２００Ｃｉ／mmol）
と３７℃にて９０分間接触せしめることによりプローブ
を標識した。
合成及びリン酸化 次の配列： ５−* AATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAG−３′ （配列中* は標識を示す）を有する標識されたＤＮＡプ
ローブＳＫ０３をセクションＩに記載した方法により合
成した。１０pmole のプローブを、70mM Ｔｒｉｓ（pH
７．６），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１．５mMスペルミン及
び２．５mMジチオスレイトールを含有する反応容量４０
μｌ中４ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
５０pmol γ−32Ｐ−ＡＴＰ（約７２００Ｃｉ／mmol）
と３７℃にて９０分間接触せしめることによりプローブ
を標識した。
【０１０６】次に、全量を２５mM ＥＤＴＡにより１０
０μｌに調整し、そしてＴＣＡ沈澱により比活性を決定
するためにアリコートを取り出した。濃縮装置を用いて
標識されたプローブを濃縮し、そしてＴｒｉｓ−硼酸−
ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液（８９mM Ｔｒｉｓ，８９mM
硼酸、２．５mM ＥＤＴＡ，pH８．３）中１８％ポリア
クリルアミドゲル上で５００vhr 電気泳動により精製し
た。
０μｌに調整し、そしてＴＣＡ沈澱により比活性を決定
するためにアリコートを取り出した。濃縮装置を用いて
標識されたプローブを濃縮し、そしてＴｒｉｓ−硼酸−
ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液（８９mM Ｔｒｉｓ，８９mM
硼酸、２．５mM ＥＤＴＡ，pH８．３）中１８％ポリア
クリルアミドゲル上で５００vhr 電気泳動により精製し
た。
【０１０７】オートラジオグラフィーによる位置決定の
後、標識されたプローブを含有するゲルの部分を切り出
し、破砕し、そして０．２mlのＴＥ緩衝液に４℃にて一
夜溶出した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、比活性が２Ｃ
ｉ／mmolであり、そして最終濃度が２０pmol／mlである
ことを示した。
後、標識されたプローブを含有するゲルの部分を切り出
し、破砕し、そして０．２mlのＴＥ緩衝液に４℃にて一
夜溶出した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、比活性が２Ｃ
ｉ／mmolであり、そして最終濃度が２０pmol／mlである
ことを示した。
【０１０８】IV．増幅されたゲノムＤＮＡとプローブと
のハイブリダイゼーション及びＢｓｔＮＩによる消化 １０μｌの増幅されたＤＮＡ（７１ngのゲノムＤＮＡに
相当する前増幅を含む）を１．５mlのミクロフュージチ
ューブに入れ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液により３０
μｌの最終容量とした。サンプルを９５℃にて１０分間
変性せしめた。０．０２pmolのＳＫ０３プローブを含有
する１０μｌの０．６Ｍ ＮａＣｌをチューブに加え、
ゆっくりと混合し、鉱油を重層し、そして５６℃の加熱
ブロックに１時間移した。
のハイブリダイゼーション及びＢｓｔＮＩによる消化 １０μｌの増幅されたＤＮＡ（７１ngのゲノムＤＮＡに
相当する前増幅を含む）を１．５mlのミクロフュージチ
ューブに入れ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液により３０
μｌの最終容量とした。サンプルを９５℃にて１０分間
変性せしめた。０．０２pmolのＳＫ０３プローブを含有
する１０μｌの０．６Ｍ ＮａＣｌをチューブに加え、
ゆっくりと混合し、鉱油を重層し、そして５６℃の加熱
ブロックに１時間移した。
【０１０９】１０μｌのmM ＭｇＣｌ2 及び１μｌのＢ
ｓｔＮＩ（１０ユニット）を加え、そして再アニールし
たＤＮＡを５６℃にて３０分間消化した。４μｌの７５
mMＥＤＴＡ及び６μｌのトラッキング色素を６０μｌの
最終容量に加えることにより反応を停止せしめた。
ｓｔＮＩ（１０ユニット）を加え、そして再アニールし
たＤＮＡを５６℃にて３０分間消化した。４μｌの７５
mMＥＤＴＡ及び６μｌのトラッキング色素を６０μｌの
最終容量に加えることにより反応を停止せしめた。
【０１１０】鉱油を０．２mlのクロロホルムで抽出し、
そして１３μｌの反応混合物（約１５ngのゲノムＤＮ
Ａ）を、電気泳動装置中３０％ポリアクリルアミドミリ
ゲル上に負荷した。ブロムフェノールブルー色素フロン
トが原点から３．０cm移動するまで、ゲルを約３００ボ
ルトにて１時間電気泳動した。ゲルの上１．５cmを除去
し、そして残りのゲルを少なくとも一夜、２個の増強ス
クリーンを用いて−７０℃にて暴露した。
そして１３μｌの反応混合物（約１５ngのゲノムＤＮ
Ａ）を、電気泳動装置中３０％ポリアクリルアミドミリ
ゲル上に負荷した。ブロムフェノールブルー色素フロン
トが原点から３．０cm移動するまで、ゲルを約３００ボ
ルトにて１時間電気泳動した。ゲルの上１．５cmを除去
し、そして残りのゲルを少なくとも一夜、２個の増強ス
クリーンを用いて−７０℃にて暴露した。
【０１１１】Ｖ．結果の考察 オートラジオグラフはサンプル３６８ＨのみにＡＩＤＳ
のＤＮＡ配列が有在することを示した。このサンプルが
唯一のＨＴＬＶIII 陽性ＤＮＡであることが後で見出さ
れた。他の１０個のサンプルは次の通りであった。
のＤＮＡ配列が有在することを示した。このサンプルが
唯一のＨＴＬＶIII 陽性ＤＮＡであることが後で見出さ
れた。他の１０個のサンプルは次の通りであった。
【０１１２】（ａ）１９４ＢＫ＝白血病患者からのＤＮ
Ａ（ウイルスは単離されず）、（ｂ）３４２＝ＨＴＬＶ
Ｉ、（ｃ）３６７＝ＨＴＬＶＩ、（ｄ）３６１＝ＨＴＬ
ＶＩ、（ｅ）２０７＝活動的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）
白血病を有する患者から（皮膚関与）、（ｆ）３０７＝
ＨＴＬＶＩプロトタイプ細胞系（最高のウイルスＤＮ
Ａ）、（ｇ）３０８Ｂ＝ＨＴＬＶＩ、（ｈ）３２３＝Ｈ
ＴＬＶII、（ｉ）３２６＝ＨＴＬＶＩ、及び（ｊ）３４
０＝活動的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）白血病〔（ｅ）と
は異る〕を有する患者から。
Ａ（ウイルスは単離されず）、（ｂ）３４２＝ＨＴＬＶ
Ｉ、（ｃ）３６７＝ＨＴＬＶＩ、（ｄ）３６１＝ＨＴＬ
ＶＩ、（ｅ）２０７＝活動的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）
白血病を有する患者から（皮膚関与）、（ｆ）３０７＝
ＨＴＬＶＩプロトタイプ細胞系（最高のウイルスＤＮ
Ａ）、（ｇ）３０８Ｂ＝ＨＴＬＶＩ、（ｈ）３２３＝Ｈ
ＴＬＶII、（ｉ）３２６＝ＨＴＬＶＩ、及び（ｊ）３４
０＝活動的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）白血病〔（ｅ）と
は異る〕を有する患者から。
【０１１３】従って、使用されたプライマーは、プロー
ブが正しく配列を検出することを可能にするためにＤＮ
Ａを増幅することができた。他のサンプルは追加の増幅
サンプルを用いてさえ陰性のままであった。３７℃にお
ける１０％のＤＭＳＯ（２次構造の形成を最少にする）
の存在下での増幅はＨＴＬＶIII サンプルを唯一の陽性
サンプルとして示した。
ブが正しく配列を検出することを可能にするためにＤＮ
Ａを増幅することができた。他のサンプルは追加の増幅
サンプルを用いてさえ陰性のままであった。３７℃にお
ける１０％のＤＭＳＯ（２次構造の形成を最少にする）
の存在下での増幅はＨＴＬＶIII サンプルを唯一の陽性
サンプルとして示した。
【０１１４】例２．この例においては、例１に記載した
のと同じ方法を用いたが、使用したプライマーはＳＫ２
４及びＳＫ１８と称し、次の通りであった。 ５′−ATCCCAGTAGGAGAA −３′ （ＳＫ２４） ５′−TTATGTCCAGAATGC −３′ （ＳＫ１８） ＳＫ２４に代るプライマーはプライマーＳＫ２５であっ
た。 ５′−ATAATCCACCTATCCCAG−３′ （ＳＫ２５） 使用したプローブＳＫ１９は次の配列： ５′−* ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC −３′
のと同じ方法を用いたが、使用したプライマーはＳＫ２
４及びＳＫ１８と称し、次の通りであった。 ５′−ATCCCAGTAGGAGAA −３′ （ＳＫ２４） ５′−TTATGTCCAGAATGC −３′ （ＳＫ１８） ＳＫ２４に代るプライマーはプライマーＳＫ２５であっ
た。 ５′−ATAATCCACCTATCCCAG−３′ （ＳＫ２５） 使用したプローブＳＫ１９は次の配列： ５′−* ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC −３′
【０１１５】（配列中、* は標識を示す）であった。こ
のプローブをセクションIII に記載したのと同様にして
標識した。ＳＫ２４及びＳＫ１８は、ＨＴＬＶIII のヌ
クレオチド１５５２〜１６４２のｇａｇの親水性領域の
増幅を得るために選択した。ＳＫ２５及びＳＫ１８は、
ＨＴＬＶIII のヌクレオチド１５４１〜１６４２のｇａ
ｇの親水性領域の増幅を得るために選択した。ＳＫ１９
は、増幅されたＤＮＡにアニールした場合、ＢｓｔＮＩ
部位を再構成する。この酵素による消化が４−ｍｅｒを
放出する。
のプローブをセクションIII に記載したのと同様にして
標識した。ＳＫ２４及びＳＫ１８は、ＨＴＬＶIII のヌ
クレオチド１５５２〜１６４２のｇａｇの親水性領域の
増幅を得るために選択した。ＳＫ２５及びＳＫ１８は、
ＨＴＬＶIII のヌクレオチド１５４１〜１６４２のｇａ
ｇの親水性領域の増幅を得るために選択した。ＳＫ１９
は、増幅されたＤＮＡにアニールした場合、ＢｓｔＮＩ
部位を再構成する。この酵素による消化が４−ｍｅｒを
放出する。
【０１１６】５３℃でのハイブリダイゼーション及び制
限処理のオートラジオグラフは、例１において見出され
たＨＴＬＶIII サンプルのみを陽性として示した。すべ
てのサンプルにおいて生ずるバックグラウンドバンドは
ハイブリダイゼーション及び制限処理の温度を５３℃か
ら６０℃に上げることにより消失した。上昇した温度が
プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを最小にし
たものと予想される。
限処理のオートラジオグラフは、例１において見出され
たＨＴＬＶIII サンプルのみを陽性として示した。すべ
てのサンプルにおいて生ずるバックグラウンドバンドは
ハイブリダイゼーション及び制限処理の温度を５３℃か
ら６０℃に上げることにより消失した。上昇した温度が
プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを最小にし
たものと予想される。
【０１１７】例３．ＢａｍＨＩ末端を含有する１８６塩
基対を有するｇａｇの親水性領域をコードする１８０bp
ＤＮＡ断片（ＨＴＬＶIII 単離体ＢＨ１０のヌクレオ
チド１４７０−１６４９）を、まず１０個のオーバーラ
ップするオリゴマーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連
結することにより造成した。オリゴマーを図２に示す。
次に、得られた断片を、商業的に入手できるＭ１３ｍｐ
１０ＷのＢａｍＨＩ部位にクローン化した。配列決定さ
れたクローンはいずれも正確な所望の配列を有していな
かった。
基対を有するｇａｇの親水性領域をコードする１８０bp
ＤＮＡ断片（ＨＴＬＶIII 単離体ＢＨ１０のヌクレオ
チド１４７０−１６４９）を、まず１０個のオーバーラ
ップするオリゴマーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連
結することにより造成した。オリゴマーを図２に示す。
次に、得られた断片を、商業的に入手できるＭ１３ｍｐ
１０ＷのＢａｍＨＩ部位にクローン化した。配列決定さ
れたクローンはいずれも正確な所望の配列を有していな
かった。
【０１１８】しかしながら、図３に示す２つのクローン
（図中Ｘは遺伝子中の変異を示す）を用いて、クローン
Ｍ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７のＳｐｅＩ／ＢｓｔＸＩ断片を
クローンＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６のＳｐｅＩ／ＢｓｔＸ
Ｉ断片で置換することにより正しい配列を有するクロー
ンを造成した。Ｍ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７からのＤＮＡを
ＳｐｅＩ及びＢｓｔＸＩで消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理し、そして大ベクター含有断片をアガロー
スゲルから精製した。
（図中Ｘは遺伝子中の変異を示す）を用いて、クローン
Ｍ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７のＳｐｅＩ／ＢｓｔＸＩ断片を
クローンＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６のＳｐｅＩ／ＢｓｔＸ
Ｉ断片で置換することにより正しい配列を有するクロー
ンを造成した。Ｍ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７からのＤＮＡを
ＳｐｅＩ及びＢｓｔＸＩで消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理し、そして大ベクター含有断片をアガロー
スゲルから精製した。
【０１１９】クローンＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６からのＳ
ｐｅＩ／ＢｓｔＸＩ ＤＮＡ断片を、上記と同じ酵素で
消化した後にポリアクリルアミドゲルから精製した。Ｍ
１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７及びＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６から
の精製された断片を連結し、そしてアメリカン・タイプ
・カルチュアー・コレクションから入手可能なＥ．コリ
ＤＧ９８株に形質転換した。Ｍ−１３−ＧＡＧと称する
得られたクローンは正しい配列を含有しており、そして
１９８６年１月８日に、ＡＴＣＣNo. ４０，２１８とし
てＡＴＣＣに寄託された。
ｐｅＩ／ＢｓｔＸＩ ＤＮＡ断片を、上記と同じ酵素で
消化した後にポリアクリルアミドゲルから精製した。Ｍ
１３ｍｐ１０Ｗ：Ｃ７及びＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６から
の精製された断片を連結し、そしてアメリカン・タイプ
・カルチュアー・コレクションから入手可能なＥ．コリ
ＤＧ９８株に形質転換した。Ｍ−１３−ＧＡＧと称する
得られたクローンは正しい配列を含有しており、そして
１９８６年１月８日に、ＡＴＣＣNo. ４０，２１８とし
てＡＴＣＣに寄託された。
【０１２０】このＭ−１３−ＧＡＧを使用して前記のギ
ャップを有する円形プローブを造成することにより、ア
イソトープを使用しないドットブロット法において、増
幅されたサンプルを評価することができる。増幅された
生成物を２つのプライマーＳＫ２３及びＳＫ２８を用い
て調製することができる。これらのプライマーはＭ−１
３−ＧＡＧ中の全１８０ｍｅｒをまたぎ、そして次の配
列を有する。
ャップを有する円形プローブを造成することにより、ア
イソトープを使用しないドットブロット法において、増
幅されたサンプルを評価することができる。増幅された
生成物を２つのプライマーＳＫ２３及びＳＫ２８を用い
て調製することができる。これらのプライマーはＭ−１
３−ＧＡＧ中の全１８０ｍｅｒをまたぎ、そして次の配
列を有する。
【０１２１】 ５′−ATGAGAGAACCAAGG −３′ （ＳＫ２３） ５′−CCTTGTCTTATGTCCAG −３′ （ＳＫ２８） ヌクレオチド１４６８及び１６４９の間を増幅するため
に選択されたこれらのプライマーは、プローブＳＫ１９
を用いてすでに試験されており、そしてＨＴＬＶIII サ
ンプルを好結果に検出することが見出された。
に選択されたこれらのプライマーは、プローブＳＫ１９
を用いてすでに試験されており、そしてＨＴＬＶIII サ
ンプルを好結果に検出することが見出された。
【０１２２】例４．例２に記載した方法を用いてＤｒ．
Ｐｏｉｅｓｚにより抽出されたＤＮＡの７１個の暗号を
付されたサンプルをまず、例１のＳＫ０１及びＳＫ０２
プライマー対又はＳＫ１７及びＳＫ１８のプライマー対
を用いてそれらのＤＮＡにより分析した。ＳＫ１８は例
２において定義されており、そしてＳＫ１７は次の配
列： ５′−CCAGTAGGAGAAAT−３′ を有し、これはＨＴＬＶIII のヌクレオチド１５５５〜
１６４２のｇａｇの親水性領域を増幅するために選択さ
れたものである。
Ｐｏｉｅｓｚにより抽出されたＤＮＡの７１個の暗号を
付されたサンプルをまず、例１のＳＫ０１及びＳＫ０２
プライマー対又はＳＫ１７及びＳＫ１８のプライマー対
を用いてそれらのＤＮＡにより分析した。ＳＫ１８は例
２において定義されており、そしてＳＫ１７は次の配
列： ５′−CCAGTAGGAGAAAT−３′ を有し、これはＨＴＬＶIII のヌクレオチド１５５５〜
１６４２のｇａｇの親水性領域を増幅するために選択さ
れたものである。
【０１２３】プライマー対ＳＫ１７及びＳＫ１８を用い
る増幅を、１０重量％のＤＭＳＯの存在下で３７℃にお
いて、しかし他の点では例１の方法に従って行った。増
幅の後、プローブＳＫ０３（例１）又はＳＫ１９（例
２）を用いて、例１の方法によりＤＮＡを検出した。幾
つかのあいまいなサンプルはさらに例２のＳＫ１８及び
ＳＫ２４のプライマー対を用い、そして室温にてプロー
ブＳＫ１９を用いてさらに分析した。
る増幅を、１０重量％のＤＭＳＯの存在下で３７℃にお
いて、しかし他の点では例１の方法に従って行った。増
幅の後、プローブＳＫ０３（例１）又はＳＫ１９（例
２）を用いて、例１の方法によりＤＮＡを検出した。幾
つかのあいまいなサンプルはさらに例２のＳＫ１８及び
ＳＫ２４のプライマー対を用い、そして室温にてプロー
ブＳＫ１９を用いてさらに分析した。
【０１２４】これらの結果が示すところによれば、この
発明の試験により陽性として同定されたすべてのサンプ
ルはＡＩＤＳ又はＡＲＣ患者から単離されたＤＮＡであ
り、Ｐｏｉｅｓｚ博士により同定されたＨＴＬＶIII 単
離体、ＬＡＬ単離体及びＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＡ
Ｖ）が包含された。さらに、ＡＩＤＳ患者と複数回接触
したことがある抗体陽性、逆転写酵素陰性の健康な同性
愛者も両セットのプライマー対により陽性と同定され
た。ＳＫ１７−ＳＫ１８、及びＳＫ２４−ＳＫ１８プラ
イマー対はＳＫ０１−ＳＫ０２プライマー対に比べて多
くの陽性を検出する様であった。
発明の試験により陽性として同定されたすべてのサンプ
ルはＡＩＤＳ又はＡＲＣ患者から単離されたＤＮＡであ
り、Ｐｏｉｅｓｚ博士により同定されたＨＴＬＶIII 単
離体、ＬＡＬ単離体及びＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＡ
Ｖ）が包含された。さらに、ＡＩＤＳ患者と複数回接触
したことがある抗体陽性、逆転写酵素陰性の健康な同性
愛者も両セットのプライマー対により陽性と同定され
た。ＳＫ１７−ＳＫ１８、及びＳＫ２４−ＳＫ１８プラ
イマー対はＳＫ０１−ＳＫ０２プライマー対に比べて多
くの陽性を検出する様であった。
【０１２５】陰性対照サンプル（正常Ｔ細胞、非感染セ
ルライン又はＨＴＬＶII）はいずれもこの発明のアッセ
イにおいて陽性ではなかった。この発明の試験は、逆転
写酵素によっては陰性であった１０個の感染サンプルを
陽性として同定した。他方、逆転写酵素陽性である５個
のサンプル（５個の内３個は±）はこの発明の試験にお
いて陰性であった。７１個すべてのサンプルはＥＬＩＳ
Ａ陽性であることが証明され、ＥＬＩＳＡはＡＩＤＳウ
イルスについて非常に識別力ある又は特異的試験ではな
いことが示された。
ルライン又はＨＴＬＶII）はいずれもこの発明のアッセ
イにおいて陽性ではなかった。この発明の試験は、逆転
写酵素によっては陰性であった１０個の感染サンプルを
陽性として同定した。他方、逆転写酵素陽性である５個
のサンプル（５個の内３個は±）はこの発明の試験にお
いて陰性であった。７１個すべてのサンプルはＥＬＩＳ
Ａ陽性であることが証明され、ＥＬＩＳＡはＡＩＤＳウ
イルスについて非常に識別力ある又は特異的試験ではな
いことが示された。
【０１２６】上記の例は、ＡＩＤＳウイルスＤＮＡがＡ
ＩＤＳ又はＡＲＣを有する患者からの血液、精液単核細
胞、及び精液上清により感染されたセルラインにおいて
同定され得ることを示している。
ＩＤＳ又はＡＲＣを有する患者からの血液、精液単核細
胞、及び精液上清により感染されたセルラインにおいて
同定され得ることを示している。
【０１２７】例５．この例は、この発明の技法が、ウイ
ルスをまず培養する必要がなく、鮮血の末梢単核細胞中
のＡＩＤＳウイルスＤＮＡ配列の同定に直接適用され得
ることを示す。ＡＩＤＳ患者からの暗号を付された血液
サンプルをＰｏｅｉｓｚ博士の方法に従って処理した。
まずこれらを低速遠心分離（約３０００Xg）を用いて遠
心分離してすべての細胞をペレット化し、こうしてバフ
ィーコートをフィコール−ハイパーク密度カラムに通
し、そしてカラムから白血球を集めた。例１に記載した
方法によって白血球からＤＮＡを抽出した。
ルスをまず培養する必要がなく、鮮血の末梢単核細胞中
のＡＩＤＳウイルスＤＮＡ配列の同定に直接適用され得
ることを示す。ＡＩＤＳ患者からの暗号を付された血液
サンプルをＰｏｅｉｓｚ博士の方法に従って処理した。
まずこれらを低速遠心分離（約３０００Xg）を用いて遠
心分離してすべての細胞をペレット化し、こうしてバフ
ィーコートをフィコール−ハイパーク密度カラムに通
し、そしてカラムから白血球を集めた。例１に記載した
方法によって白血球からＤＮＡを抽出した。
【０１２８】それぞれ例２及び４に記載されているＳＫ
１７及びＳＫ１８のプライマー対を用いて、ＤＮＡを１
０重量％のＤＭＳＯの存在下３７℃にて、例１に記載し
た方法に従って、１ユニット、２ユニット及び４ユニッ
トのＫｌｅｎｏｗ断片により増幅した。増幅の後、例１
の方法に従って、プローブＳＫ０３（例１）又はＳＫ１
９（例２）のいずれかを使用した。幾つかのあいまいな
サンプルは、例２のＳＫ２４及びＳＫ１８のプライマー
対及びプローブＳＫ１９を用いて室温にてさらに分析を
行った。
１７及びＳＫ１８のプライマー対を用いて、ＤＮＡを１
０重量％のＤＭＳＯの存在下３７℃にて、例１に記載し
た方法に従って、１ユニット、２ユニット及び４ユニッ
トのＫｌｅｎｏｗ断片により増幅した。増幅の後、例１
の方法に従って、プローブＳＫ０３（例１）又はＳＫ１
９（例２）のいずれかを使用した。幾つかのあいまいな
サンプルは、例２のＳＫ２４及びＳＫ１８のプライマー
対及びプローブＳＫ１９を用いて室温にてさらに分析を
行った。
【０１２９】一夜暴露した後の結果は、幾人かのＡＩＤ
Ｓ又はＡＲＣ遺伝から単離されたＤＮＡは陽性と同定さ
れた。プライマー対ＳＫ２３及びＳＫ２８（例３に記
載）、並びにプローブＳＫ１９（例２）を使用して実験
を反復した。次の配列： ５′−ACCTGCCACCTGTAGTAG−３′ （ＳＫ３２） ５′−GCCATATTCCTGGACTACAG−３′ （ＳＫ３３） を有するプライマー対ＳＫ３２及びＳＫ３３、並びに次
の配列： ５′−TAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCC −３′ （ＳＫ３４） を有するプローブＳＫ３４を用いて実験を再度反復し
た。ＳＫ３４の制限部位を開裂せしめるために制限酵素
ＰｖｕIIを使用した。６日間の暴露の後の両実験の結果
は、幾人かのＡＩＤＳ又はＡＲＣ患者から単離されたＤ
ＮＡが陽性であることを示した。
Ｓ又はＡＲＣ遺伝から単離されたＤＮＡは陽性と同定さ
れた。プライマー対ＳＫ２３及びＳＫ２８（例３に記
載）、並びにプローブＳＫ１９（例２）を使用して実験
を反復した。次の配列： ５′−ACCTGCCACCTGTAGTAG−３′ （ＳＫ３２） ５′−GCCATATTCCTGGACTACAG−３′ （ＳＫ３３） を有するプライマー対ＳＫ３２及びＳＫ３３、並びに次
の配列： ５′−TAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCC −３′ （ＳＫ３４） を有するプローブＳＫ３４を用いて実験を再度反復し
た。ＳＫ３４の制限部位を開裂せしめるために制限酵素
ＰｖｕIIを使用した。６日間の暴露の後の両実験の結果
は、幾人かのＡＩＤＳ又はＡＲＣ患者から単離されたＤ
ＮＡが陽性であることを示した。
【０１３０】例６．増幅されるべき所望の配列はＡｌｂ
ｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅのＣｈｕｃｋ Ｒｏｇｌｅｒからのウー
ドチャック肝炎ウイルス分子クローン、及びスタンホー
ド大学から入手されそしてＳｎｉｎｓｋｙ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ，２７９：３４６−３４８（１９７９）により記載
されているｐＢＲ３２２中挿入ｐＨＢＶ１を有するａｄ
ｗ2 サブタイプのヒト肝炎Ｂクローン中に含有される。
ｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅのＣｈｕｃｋ Ｒｏｇｌｅｒからのウー
ドチャック肝炎ウイルス分子クローン、及びスタンホー
ド大学から入手されそしてＳｎｉｎｓｋｙ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ，２７９：３４６−３４８（１９７９）により記載
されているｐＢＲ３２２中挿入ｐＨＢＶ１を有するａｄ
ｗ2 サブタイプのヒト肝炎Ｂクローン中に含有される。
【０１３１】増幅されるべき配列、プライマー及びプロ
ーブは前記のようにドットマトリクスプログラムにより
同定した。この場合、配列がヘパドナウイルスの保存さ
れた領域内で選択されるように、選択された配列ウイン
ドーは２０塩基対以上の長さであった。連続する２０塩
基の相同領域が配列決定されたウイルスゲノム及びその
バリアントの対比較の後に位置決定された。
ーブは前記のようにドットマトリクスプログラムにより
同定した。この場合、配列がヘパドナウイルスの保存さ
れた領域内で選択されるように、選択された配列ウイン
ドーは２０塩基対以上の長さであった。連続する２０塩
基の相同領域が配列決定されたウイルスゲノム及びその
バリアントの対比較の後に位置決定された。
【０１３２】Ｉ．プライマーの合成 それぞれＭＤ０３及びＭＤ０６と称する次の２つのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを例１、セクシ
ョンＩに記載した方法により調製した。 ５′−CTCAAGCTTCATCATCCATATA−３′ （ＭＤ０３） ５′−CTTGGATCCTATGGGAGTGG−３′ （ＭＤ０６） これらのプライマーはヘパドナウイルスのポリメラーゼ
遺伝子から選択した。
ゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを例１、セクシ
ョンＩに記載した方法により調製した。 ５′−CTCAAGCTTCATCATCCATATA−３′ （ＭＤ０３） ５′−CTTGGATCCTATGGGAGTGG−３′ （ＭＤ０６） これらのプライマーはヘパドナウイルスのポリメラーゼ
遺伝子から選択した。
【０１３３】II．増幅反応 １０pmolの各プラスミドを、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５），５０mM塩化ナトリウム及び１０mM塩化マ
グネシウムから成り、そして１００pmolのプライマーＭ
Ｄ０３，１００pmolのプライマーＭＤ０６，１０重量％
のＤＭＳＯ並びに１５０nmolずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含有する緩衝液１００μｌに
加えた。この得られる溶液を例１．セクションIIに記載
した方法により２５サイクル処理した。但し、室温では
なく３７℃において行った。
（pH７．５），５０mM塩化ナトリウム及び１０mM塩化マ
グネシウムから成り、そして１００pmolのプライマーＭ
Ｄ０３，１００pmolのプライマーＭＤ０６，１０重量％
のＤＭＳＯ並びに１５０nmolずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含有する緩衝液１００μｌに
加えた。この得られる溶液を例１．セクションIIに記載
した方法により２５サイクル処理した。但し、室温では
なく３７℃において行った。
【０１３４】III ．プローブの合成及びリン酸化 次の配列： ５′−* GGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATT
TGTTC −３′ （配列中* は標識を示す）を有する標識されたＤＮＡプ
ローブＭＤ０９を例１．セクションＩに記載した方法に
従って合成した。プローブを例１．セクションIII に記
載したようにして標識した。
TGTTC −３′ （配列中* は標識を示す）を有する標識されたＤＮＡプ
ローブＭＤ０９を例１．セクションＩに記載した方法に
従って合成した。プローブを例１．セクションIII に記
載したようにして標識した。
【０１３５】IV．プローブとのハイブリダイゼーション
及び消化 ハイブリダイゼーション及び消化のために例１．セクシ
ョンIVの方法を用いた。但しＤｄｅＩを制限酵素して使
用してプローブを開裂せしめた。
及び消化 ハイブリダイゼーション及び消化のために例１．セクシ
ョンIVの方法を用いた。但しＤｄｅＩを制限酵素して使
用してプローブを開裂せしめた。
【０１３６】Ｖ．結果 オートラジオグラムが示すところによれば、対照（ＳＣ
−１、これは１９８５年３月１９日にＡＴＣＣに寄託さ
れており、そして肝炎ゲノムを有さず鎌状赤血球貧血対
立遺伝子についてホモ接合体であるＥＢＶ−形質転換Ｂ
セルラインである）（増幅が起こらなかった）に比べて
本発明のプライマーを使用することにより陽性のシグナ
ルが生ずる。従って、本発明の技法を用いてヘパドナウ
イルスの増幅が可能である。
−１、これは１９８５年３月１９日にＡＴＣＣに寄託さ
れており、そして肝炎ゲノムを有さず鎌状赤血球貧血対
立遺伝子についてホモ接合体であるＥＢＶ−形質転換Ｂ
セルラインである）（増幅が起こらなかった）に比べて
本発明のプライマーを使用することにより陽性のシグナ
ルが生ずる。従って、本発明の技法を用いてヘパドナウ
イルスの増幅が可能である。
【０１３７】プライマーＤＭ０６及びＤＭ０３の代り
に、次の配列： ５′−GCGGGATCCCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGG−３′ （Ｍ
Ｄ１４） ５′−GCGAAGCTTGTTAGGGTTTAAATGTATACCC −３′ （Ｍ
Ｄ１３） を有するプライマーＭＤ１４及びＭＤ１３を用いて前記
の実験を行った場合、結果は同じであった。これらのプ
ライマーは、ヘパドナウイルスのエンベロープ遺伝子か
ら選択した。
に、次の配列： ５′−GCGGGATCCCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGG−３′ （Ｍ
Ｄ１４） ５′−GCGAAGCTTGTTAGGGTTTAAATGTATACCC −３′ （Ｍ
Ｄ１３） を有するプライマーＭＤ１４及びＭＤ１３を用いて前記
の実験を行った場合、結果は同じであった。これらのプ
ライマーは、ヘパドナウイルスのエンベロープ遺伝子か
ら選択した。
【０１３８】次の寄託が行われた。 株 寄 託 日 ＡＴＣＣ No. Ｍ１３−ＧＡＧ １９８６年１月８日 ４０，２１８ この寄託は、特許手続のための微生物の寄託国際的承認
に関するブタペスト条約及びその規則の規定（ブタペス
ト条約）のもとになされた。これは、寄託の日から３０
年にわたる生存培養物の維持を保証する。この微生物は
ＡＴＣＣによりブタペスト条約の規定のもとに、及び申
請者とＡＴＣＣとの合意に従って入手可能にされる。
に関するブタペスト条約及びその規則の規定（ブタペス
ト条約）のもとになされた。これは、寄託の日から３０
年にわたる生存培養物の維持を保証する。この微生物は
ＡＴＣＣによりブタペスト条約の規定のもとに、及び申
請者とＡＴＣＣとの合意に従って入手可能にされる。
【０１３９】この合意は、培養物の子孫の永久的且つ限
定されない入手可能性を公衆に、関連米国特許の発効の
後又は米国もしくは外国の特許出願の公衆への公開の
後、いずれが最初に到来するにしても保証し、そして、
該子孫の入手可能性を３５ＵＳＣ§１２２及びこれに基
く長官規則（８８６ ＯＧ ６３８への特別な言及を伴
う３７ＣＦＲ§１．１４を含む）に従って米国特許商標
局長官によりその資格を有すると決定された者に保証す
る。
定されない入手可能性を公衆に、関連米国特許の発効の
後又は米国もしくは外国の特許出願の公衆への公開の
後、いずれが最初に到来するにしても保証し、そして、
該子孫の入手可能性を３５ＵＳＣ§１２２及びこれに基
く長官規則（８８６ ＯＧ ６３８への特別な言及を伴
う３７ＣＦＲ§１．１４を含む）に従って米国特許商標
局長官によりその資格を有すると決定された者に保証す
る。
【０１４０】本出願人は、寄託中の培養物が適切な条件
下に培養された場合に死滅しもしくは失われ又は破損し
た場合に、通知の後これが同じ培養物の生存サンプルに
より速やかに置き代えられることを承諾する。寄託され
た菌株の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとに
その国の特許法に従って認められた権利に違反してこの
発明を実施するための許諾であると解してはならない。
下に培養された場合に死滅しもしくは失われ又は破損し
た場合に、通知の後これが同じ培養物の生存サンプルに
より速やかに置き代えられることを承諾する。寄託され
た菌株の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとに
その国の特許法に従って認められた権利に違反してこの
発明を実施するための許諾であると解してはならない。
【図１】図１は、長末端反復（ＬＴＲ）非コード領域並
びにｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，Ｑ（又はｓｏｒ）及びＦ
（又は３′ＯＲＦ）コード領域から成る完全なＡＩＤＳ
ゲノムの模式図であり、そしてこの発明の例のためにど
の部位からプライマーを選択したかを示す。
びにｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，Ｑ（又はｓｏｒ）及びＦ
（又は３′ＯＲＦ）コード領域から成る完全なＡＩＤＳ
ゲノムの模式図であり、そしてこの発明の例のためにど
の部位からプライマーを選択したかを示す。
【図２】図２は、増幅された生成物を検出するためのド
ットブロットにおいて使用すべきハイブリダイゼーショ
ンプローブのための１８０bp ＤＮＡ断片を形成するた
めに連結されたＡＩＤＳ配列の１０個のオリゴヌクレオ
チドの模式図である。
ットブロットにおいて使用すべきハイブリダイゼーショ
ンプローブのための１８０bp ＤＮＡ断片を形成するた
めに連結されたＡＩＤＳ配列の１０個のオリゴヌクレオ
チドの模式図である。
【図３】図３は、ＡＩＤＳウイルスと同じ配列を得るた
めに、核酸配列の変更を含む２つのクローンＭ１３ｍｐ
１０Ｗ：Ｃ７及びＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６をいかに処理
したかを示す流れ図である。生成するクローンＭ−１３
−ＧＡＧはドットブロットにおいてハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用するための１８０bp挿入部を含
有する。
めに、核酸配列の変更を含む２つのクローンＭ１３ｍｐ
１０Ｗ：Ｃ７及びＭ１３ｍｐ１０Ｗ：Ｄ６をいかに処理
したかを示す流れ図である。生成するクローンＭ−１３
−ＧＡＧはドットブロットにおいてハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用するための１８０bp挿入部を含
有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイビッド ヘンリー マック アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702，バークレイ，ホプキンス スト リート １，1458 (72)発明者 シルレイ イー クウォク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94563，サン ラモン，ロウモンド サ ークル 611
Claims (6)
- 【請求項１】 ウイルスの単離体間で実質的に保存され
ておりそしてウイルス中の核酸に特異的であり、そして
サンプル中に含有されると予想される核酸配列の存在又
は不存在を検出又は監視するためのキットであって、 （ａ）検出されるべき核酸の各鎖のための２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマー（このプライマーは各特異的核
酸配列の各鎖に実質的に相補的であり、一のプライマー
から合成された延長生成物は、それがその相補体から分
離された場合、他のプライマーの延長生成物の合成のた
め鋳型として機能することができる）； 及び （ｂ）前記増幅された核酸配列とハイブリダイズするこ
とができるプローブ； を含んで成るキット。 - 【請求項２】 前記プローブがラベルされたプローブで
ある、請求項１に記載のキット。 - 【請求項３】 重合のための試薬をさらに含んで成る、
請求項１又は２に記載のキット。 - 【請求項４】 前記ウイルスがＡＩＤＳウイルス又はヘ
パドナウイルスである請求項１〜３のいずれか１項に記
載のキット。 - 【請求項５】 ４種類の異るヌクレオシドトリホスフェ
ートの各々、及び前記プローブと前記増幅された配列と
のハイブリドを検出するための手段をさらに含んで成る
請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項６】 前記ウイルスがＡＩＤＳウイルスであ
り、そして前記キットがＡＩＤＳウイルスゲノムの配列
を有する１もしくは複数の核酸を有する陽性対照、及び
／又はＡＩＤＳウイルスの単離体間で実質的に保存され
ている配列を有するいかなる核酸も含有しない陰性対
照、及び予想される配列を含有する核酸をプローブ中の
配列に含まれる特定の制限部位において開裂せしめるこ
とができる１つの制限酵素をさらに含んで成る請求項１
〜５のいずれか１項に記載のキット。
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