JP2560150B2 - Ｘ因子−ｌａｃｉハイブリッドタンパク質 - Google Patents
Ｘ因子−ｌａｃｉハイブリッドタンパク質Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なハイブリッドタ
ンパク質に関するものであり、さらに特に、本発明は、
それぞれヒト血漿Ｘ因子およびヒトリポタンパク質関連
凝固阻害物質（ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ＝ＬＡＣＩ）の２種のサブ配列よりなる
アミノ酸配列を有する合成血液凝固阻害剤に関するもの
である。
ンパク質に関するものであり、さらに特に、本発明は、
それぞれヒト血漿Ｘ因子およびヒトリポタンパク質関連
凝固阻害物質（ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ＝ＬＡＣＩ）の２種のサブ配列よりなる
アミノ酸配列を有する合成血液凝固阻害剤に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物の血液中で生じる凝固過程は、
２種の異なる系、いわゆる内因系および外因系よりな
る。外因系は、血液が組織トロンボプラスチン（ＩＩＩ
因子）（以下の記載において、この因子を組織因子（Ｔ
Ｆ）と記する）にさらされることによって活性化され
る。組織因子は、多くのセルタイプの血漿膜中に生じる
リポタンパク質であり、脳および肺は、この因子に特に
富んでいる。血漿ＶＩＩ因子またはその活性形体である
ＶＩＩａ因子は、ＴＦと接触すると、ＴＦとカルシウム
依存性複合体を形成し、次いでＸ因子をＸａ因子に、お
よびまた、ＩＸ因子をＩＸａ因子に、タンパク質分解的
に活性化し、これによって、最終的に、トロンビンおよ
びフィブリンの血餅の形成をもたらす段階的現象の引き
がねになる。
２種の異なる系、いわゆる内因系および外因系よりな
る。外因系は、血液が組織トロンボプラスチン（ＩＩＩ
因子）（以下の記載において、この因子を組織因子（Ｔ
Ｆ）と記する）にさらされることによって活性化され
る。組織因子は、多くのセルタイプの血漿膜中に生じる
リポタンパク質であり、脳および肺は、この因子に特に
富んでいる。血漿ＶＩＩ因子またはその活性形体である
ＶＩＩａ因子は、ＴＦと接触すると、ＴＦとカルシウム
依存性複合体を形成し、次いでＸ因子をＸａ因子に、お
よびまた、ＩＸ因子をＩＸａ因子に、タンパク質分解的
に活性化し、これによって、最終的に、トロンビンおよ
びフィブリンの血餅の形成をもたらす段階的現象の引き
がねになる。
【０００３】血漿は、活性Ｘ因子（Ｘａ）を直接に阻害
し、かつまたＸａ依存性様相で、おそらく四要素からな
るＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ複合体を形成す
ることによって、ＶＩＩａ（ａ）／ＴＦ活性を阻害す
る、リポタンパク質関連凝固阻害物質を含有している。
この点に関しては、たとえば次の刊行物を参照すること
ができる：Ｂｒｏｚｅ等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５
〜３４３頁（１９８８年）；Ｓａｎｄｅｒｓ等によるＢ
ｌｏｏｄ６６，２０４〜２１２頁（１９８５年）；およ
びＨｕｂｂａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．４
４，５２７〜５３７頁（１９８７年）。
し、かつまたＸａ依存性様相で、おそらく四要素からな
るＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ複合体を形成す
ることによって、ＶＩＩａ（ａ）／ＴＦ活性を阻害す
る、リポタンパク質関連凝固阻害物質を含有している。
この点に関しては、たとえば次の刊行物を参照すること
ができる：Ｂｒｏｚｅ等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５
〜３４３頁（１９８８年）；Ｓａｎｄｅｒｓ等によるＢ
ｌｏｏｄ６６，２０４〜２１２頁（１９８５年）；およ
びＨｕｂｂａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．４
４，５２７〜５３７頁（１９８７年）。
【０００４】相補的ＤＮＡクローンの配列分析によっ
て、ＬＡＣＩは３つの双頭状で反復しているＫｕｎｉｔ
ｚ型セリンプロテアーゼ阻害性領域を含有することが示
された。この点に関しては、たとえばＷｕｎ等による
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６００１〜６００４
頁（１９８８年）；Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍ
ｂ．Ｒｅｓ．５５，３７〜５０頁（１９８８年）；Ｇｉ
ｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ３３８，５１８〜５２０
頁（１９８９年）；およびヨーロッパ特許出願Ｎｏ．３
１８，４５１（１９８９年５月３１日公開）を参照する
ことができる。
て、ＬＡＣＩは３つの双頭状で反復しているＫｕｎｉｔ
ｚ型セリンプロテアーゼ阻害性領域を含有することが示
された。この点に関しては、たとえばＷｕｎ等による
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６００１〜６００４
頁（１９８８年）；Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍ
ｂ．Ｒｅｓ．５５，３７〜５０頁（１９８８年）；Ｇｉ
ｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ３３８，５１８〜５２０
頁（１９８９年）；およびヨーロッパ特許出願Ｎｏ．３
１８，４５１（１９８９年５月３１日公開）を参照する
ことができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＬＡＣＩの第一Ｋｕｎ
ｉｔｚ領域および第二Ｋｕｎｉｔｚ領域は両方ともに、
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害に必要である。本発明者等
は、仮定のＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害性
複合体において、ＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域はＶ
ＩＩ（ａ）／ＴＦの活性部位に結合し、他方、第二Ｋｕ
ｎｉｔｚ領域は、Ｎａｔｕｒｅ３３８，５１８〜５２０
頁（１９８９年）に報告されているように、Ｘａの活性
部位に結合するものと予想した。
ｉｔｚ領域および第二Ｋｕｎｉｔｚ領域は両方ともに、
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害に必要である。本発明者等
は、仮定のＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害性
複合体において、ＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域はＶ
ＩＩ（ａ）／ＴＦの活性部位に結合し、他方、第二Ｋｕ
ｎｉｔｚ領域は、Ｎａｔｕｒｅ３３８，５１８〜５２０
頁（１９８９年）に報告されているように、Ｘａの活性
部位に結合するものと予想した。
【０００６】凝血Ｘ因子〔スチュワート（Ｓｔｕａｒ
ｔ）因子〕は、ジスルフィド架橋によって共役結合され
ている、２本鎖よりなる分子である。ＶＩＩ（ａ）／Ｔ
Ｆ（またはＩＸａ因子とそのＶＩＩＩａ補因子）の作用
により、チモーゲンＸ因子のＨ鎖からペプチドをタンパ
ク質分解的に放出させると、活性Ｘａ酵素が生じる。Ｘ
ａのＨ鎖は触媒性部位を含有しており、他方、ＸａのＬ
鎖はＣａ++結合に関与するＮＨ2 −末端、γ−カルボキ
シグルタミン酸（ｇｌａ）−含有領域を含有しており、
その後に、特異的凝固補因子とのその相互作用を部分的
に媒介することができる、２つの成長因子様領域が続い
ている。ウシＸａをキモトリプシンで処理すると、ｇｌ
ａ−含有領域はこの分子（残基１〜４４）のＮＨ2 −末
端から開裂する。ＬＡＣＩはｇｌａ−領域が欠失してい
るＸａ、すなわちＸａ（−ＧＤ）、に結合し、これを阻
害するが、ＬＡＣＩはＸａ（−ＧＤ）の存在の下ではＶ
ＩＩ（ａ）／ＴＦの活性を阻害することはない。
ｔ）因子〕は、ジスルフィド架橋によって共役結合され
ている、２本鎖よりなる分子である。ＶＩＩ（ａ）／Ｔ
Ｆ（またはＩＸａ因子とそのＶＩＩＩａ補因子）の作用
により、チモーゲンＸ因子のＨ鎖からペプチドをタンパ
ク質分解的に放出させると、活性Ｘａ酵素が生じる。Ｘ
ａのＨ鎖は触媒性部位を含有しており、他方、ＸａのＬ
鎖はＣａ++結合に関与するＮＨ2 −末端、γ−カルボキ
シグルタミン酸（ｇｌａ）−含有領域を含有しており、
その後に、特異的凝固補因子とのその相互作用を部分的
に媒介することができる、２つの成長因子様領域が続い
ている。ウシＸａをキモトリプシンで処理すると、ｇｌ
ａ−含有領域はこの分子（残基１〜４４）のＮＨ2 −末
端から開裂する。ＬＡＣＩはｇｌａ−領域が欠失してい
るＸａ、すなわちＸａ（−ＧＤ）、に結合し、これを阻
害するが、ＬＡＣＩはＸａ（−ＧＤ）の存在の下ではＶ
ＩＩ（ａ）／ＴＦの活性を阻害することはない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によって、強力な
血液凝固阻害剤である、新規な一本鎖ハイブリッドタン
パク質が提供される。このハイブリッドタンパク質は、
それぞれヒト血漿Ｘ因子およびヒトリポタンパク質関連
凝固阻害物質（ＬＡＣＩ）の２種のサブ配列よりなるア
ミノ酸配列を有するものとして合成された。このハイブ
リッドタンパク質では、Ｘａ因子のＬ鎖はＬＡＣＩの第
一Ｋｕｎｉｔｚ領域に融合されている。
血液凝固阻害剤である、新規な一本鎖ハイブリッドタン
パク質が提供される。このハイブリッドタンパク質は、
それぞれヒト血漿Ｘ因子およびヒトリポタンパク質関連
凝固阻害物質（ＬＡＣＩ）の２種のサブ配列よりなるア
ミノ酸配列を有するものとして合成された。このハイブ
リッドタンパク質では、Ｘａ因子のＬ鎖はＬＡＣＩの第
一Ｋｕｎｉｔｚ領域に融合されている。
【０００８】好適態様において、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活
性を直接に阻害する、Ｘ因子のＬ鎖とＬＡＣＩの第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域よりなるハイブリッドタンパク質（これ
をＸ LCＬＡＣＩk1と称する）が遺伝子工学によって製造
された。ＬＡＣＩの作用様式とは異なり、ＸLCＬＡＣＩ
K1によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、Ｘａ依存性
ではない。ワルファリン（これは、このハイブリッドタ
ンパク質のγ−カルボキシル化を抑制する）の存在の下
に増殖させた細胞によって発現されたＸLCＬＡＣＩK1で
は、阻害活性が劇的に減じられる。このことは、このハ
イブリッドタンパク質のＬＡＣＩK1部分単独では、その
阻害活性に関して充分ではないことを示している。
性を直接に阻害する、Ｘ因子のＬ鎖とＬＡＣＩの第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域よりなるハイブリッドタンパク質（これ
をＸ LCＬＡＣＩk1と称する）が遺伝子工学によって製造
された。ＬＡＣＩの作用様式とは異なり、ＸLCＬＡＣＩ
K1によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、Ｘａ依存性
ではない。ワルファリン（これは、このハイブリッドタ
ンパク質のγ−カルボキシル化を抑制する）の存在の下
に増殖させた細胞によって発現されたＸLCＬＡＣＩK1で
は、阻害活性が劇的に減じられる。このことは、このハ
イブリッドタンパク質のＬＡＣＩK1部分単独では、その
阻害活性に関して充分ではないことを示している。
【０００９】ＸLCＬＡＣＩK1を製造するための好ましい
態様において、Ｘ因子のプロリーダー配列（これは、グ
ルタミン酸のγ−カルボキシル化を指示する）をコード
するハイブリッド遺伝子のデザインに、慣用の組換えＤ
ＮＡ方法を使用し、そしてＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ
領域をコードする配列に、Ｌ鎖を融合させた。
態様において、Ｘ因子のプロリーダー配列（これは、グ
ルタミン酸のγ−カルボキシル化を指示する）をコード
するハイブリッド遺伝子のデザインに、慣用の組換えＤ
ＮＡ方法を使用し、そしてＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ
領域をコードする配列に、Ｌ鎖を融合させた。
【００１０】５′−非コード（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ）領
域中の停止コドンの後の最初のメチオニンをアミノ酸＋
１とする従来の番号付けシステムを使用すると、第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域は、オリジナルには、ＬＡＣＩ（４７〜
１１７）で表わされる。この点に関しては、１９８９年
５月３１日付で公開されたヨーロッパ特許出願Ｎｏ．３
１８，４５１およびＷｕｎ等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３，６００１〜６００４頁（１９８８年）を
参照することができる。２７６アミノ酸ＬＡＣＩタンパ
ク質のＮＨ2 末端をアミノ酸＋１とする好ましい番号付
けシステムによれば、第一Ｋｕｎｉｔｚ領域は、ＬＡＣ
Ｉ（１９〜８９）で示すことができる。この点に関して
は、Ｇｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ３３８、５１８
〜５２０頁（１９８９年）を参照することができる。
域中の停止コドンの後の最初のメチオニンをアミノ酸＋
１とする従来の番号付けシステムを使用すると、第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域は、オリジナルには、ＬＡＣＩ（４７〜
１１７）で表わされる。この点に関しては、１９８９年
５月３１日付で公開されたヨーロッパ特許出願Ｎｏ．３
１８，４５１およびＷｕｎ等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３，６００１〜６００４頁（１９８８年）を
参照することができる。２７６アミノ酸ＬＡＣＩタンパ
ク質のＮＨ2 末端をアミノ酸＋１とする好ましい番号付
けシステムによれば、第一Ｋｕｎｉｔｚ領域は、ＬＡＣ
Ｉ（１９〜８９）で示すことができる。この点に関して
は、Ｇｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ３３８、５１８
〜５２０頁（１９８９年）を参照することができる。
【００１１】しかしながら、第一Ｋｕｎｉｔｚ領域の長
さおよび組成、ならびに本明細書において明確にされて
いるハイブリッドタンパク質の生物学的活性に対して、
有害にはまたは不利には作用しない各中間アミノ酸の長
さおよび組成における変化は、本発明の範囲内に包含さ
れるものと認識する。従って、例示態様であるＸＬＣＬ
ＡＣＩＫ１において、このハイブリッドタンパク質中の
第一Ｋｕｎｉｔｚ領域は、そのＣ末端に付加的なＭｅｔ
−Ｈｉｓを有するＬＡＣＩ（１２〜８８）を包含する、
７９のアミノ酸よりなるサブ配列である。
さおよび組成、ならびに本明細書において明確にされて
いるハイブリッドタンパク質の生物学的活性に対して、
有害にはまたは不利には作用しない各中間アミノ酸の長
さおよび組成における変化は、本発明の範囲内に包含さ
れるものと認識する。従って、例示態様であるＸＬＣＬ
ＡＣＩＫ１において、このハイブリッドタンパク質中の
第一Ｋｕｎｉｔｚ領域は、そのＣ末端に付加的なＭｅｔ
−Ｈｉｓを有するＬＡＣＩ（１２〜８８）を包含する、
７９のアミノ酸よりなるサブ配列である。
【００１２】同様に、好ましい態様であるＸLCＬＡＣＩ
K1中の全部で１７１のアミノ酸としてプロリーダー配列
（残基−４０〜−１）およびＬ鎖配列（残基１〜１３
１）を含むハイブリッドタンパク質中のＸ因子のＬ鎖配
列はまた、長さおよび組成に係り変えることができ、あ
るいは各中間アミノ酸はまた、本発明で明確にされてい
るハイブリッドタンパク質の生物学的活性に対して、有
害にはまたは不利には作用しない程度に変えることがで
きる。
K1中の全部で１７１のアミノ酸としてプロリーダー配列
（残基−４０〜−１）およびＬ鎖配列（残基１〜１３
１）を含むハイブリッドタンパク質中のＸ因子のＬ鎖配
列はまた、長さおよび組成に係り変えることができ、あ
るいは各中間アミノ酸はまた、本発明で明確にされてい
るハイブリッドタンパク質の生物学的活性に対して、有
害にはまたは不利には作用しない程度に変えることがで
きる。
【００１３】ＸLCＬＡＣＩK1をコードするハイブリッド
遺伝子のｃＤＮＡ配列は、下記の７８８ｂｐ配列で示さ
れ、この配列は５′−非コード領域および３′−非コー
ド領域の部分を包含している。ヌクレオチドはｃＤＮＡ
配列の上に番号付けされている。このハイブリッドタン
パク質の相当する２５０のアミノ酸はｃＤＮＡ配列の下
に示されている。
遺伝子のｃＤＮＡ配列は、下記の７８８ｂｐ配列で示さ
れ、この配列は５′−非コード領域および３′−非コー
ド領域の部分を包含している。ヌクレオチドはｃＤＮＡ
配列の上に番号付けされている。このハイブリッドタン
パク質の相当する２５０のアミノ酸はｃＤＮＡ配列の下
に示されている。
【００１４】
【化１】
【００１５】本明細書に例示されている好ましい態様に
おいては、このハイブリッド遺伝子を、ウシパピローマ
ウイルス（ＢＰＶ）発現ベクター中に挿入し、この遺伝
子をマウスＣ１２７繊維芽細胞中にトランスフェクショ
ンした。真核細胞中における導入および複製に適する組
換えＤＮＡの製造方法においてＢＰＶを使用すること
は、周知であり、たとえば米国特許第４，４１９，９４
６号を参照することができる。本発明のハイブリッドタ
ンパク質の発現に関して、その他の原核細胞および真核
細胞、たとえばＥ．ｃｏｌｉ細胞またはチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および類似の哺乳動物の細
胞のトランスフェクションに、この新規なハイブリッド
タンパク質を使用できることは明らかである。
おいては、このハイブリッド遺伝子を、ウシパピローマ
ウイルス（ＢＰＶ）発現ベクター中に挿入し、この遺伝
子をマウスＣ１２７繊維芽細胞中にトランスフェクショ
ンした。真核細胞中における導入および複製に適する組
換えＤＮＡの製造方法においてＢＰＶを使用すること
は、周知であり、たとえば米国特許第４，４１９，９４
６号を参照することができる。本発明のハイブリッドタ
ンパク質の発現に関して、その他の原核細胞および真核
細胞、たとえばＥ．ｃｏｌｉ細胞またはチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および類似の哺乳動物の細
胞のトランスフェクションに、この新規なハイブリッド
タンパク質を使用できることは明らかである。
【００１６】慣用で、適当なＢＰＶ発現ベクターの代表
例は、プラスミドｐＭＯＮ１１２３である。このベクタ
ーは、ｐＭＬ２の周知のｐＢＲ３２２誘導体にリゲート
されている１００％ウイルスゲノムに由来し、異種遺伝
子の発現を調整するために、マウスメタロチオネインＩ
プロモーターおよびＳＶ４０Ｌａｔｅ ｐｏｌｙ Ａ付
加部位を使用するものである。ＬＡＣＩの発現における
その使用は、Ｇｉｒａｒｄ等によって、Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ． ５５，３７〜５０頁（１９８９年）に記載
されている。
例は、プラスミドｐＭＯＮ１１２３である。このベクタ
ーは、ｐＭＬ２の周知のｐＢＲ３２２誘導体にリゲート
されている１００％ウイルスゲノムに由来し、異種遺伝
子の発現を調整するために、マウスメタロチオネインＩ
プロモーターおよびＳＶ４０Ｌａｔｅ ｐｏｌｙ Ａ付
加部位を使用するものである。ＬＡＣＩの発現における
その使用は、Ｇｉｒａｒｄ等によって、Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ． ５５，３７〜５０頁（１９８９年）に記載
されている。
【００１７】本明細書は、本発明を構成するものとして
関連する主題を特に指摘し、明確に特許請求している、
特許請求の範囲で完結されているが、本発明は、以下の
本発明の好ましい態様の詳細な説明を添付図面と組合せ
て、さらに充分に理解されるものと信じる。
関連する主題を特に指摘し、明確に特許請求している、
特許請求の範囲で完結されているが、本発明は、以下の
本発明の好ましい態様の詳細な説明を添付図面と組合せ
て、さらに充分に理解されるものと信じる。
【００１８】図１は、ＸLCＬＡＣＩK1で表わされる、本
発明の代表的ハイブリッドタンパク質の模式図である。
Ｘ因子のＬ鎖のレイアウトは、Ｌｅｙｔｕｓ等によるＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５，５０９８〜５１０２頁
（１９８６年）にもとづいている。このハイブリッドタ
ンパク質のＬＡＣＩ−由来部分は斜線で示されており、
そしてＧｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ ３３８，５
１８〜５２０頁（１９８９年）にもとづいている。矢印
は、成熟タンパク質を生成する予想開裂部位を示すもの
である。
発明の代表的ハイブリッドタンパク質の模式図である。
Ｘ因子のＬ鎖のレイアウトは、Ｌｅｙｔｕｓ等によるＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５，５０９８〜５１０２頁
（１９８６年）にもとづいている。このハイブリッドタ
ンパク質のＬＡＣＩ−由来部分は斜線で示されており、
そしてＧｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒｅ ３３８，５
１８〜５２０頁（１９８９年）にもとづいている。矢印
は、成熟タンパク質を生成する予想開裂部位を示すもの
である。
【００１９】図２は、ウエスターンブロットによる本発
明の組換えハイブリッドタンパク質の発現を例示する写
真である。右側には、標準の分子の相対質量が示されて
いる。
明の組換えハイブリッドタンパク質の発現を例示する写
真である。右側には、標準の分子の相対質量が示されて
いる。
【００２０】図３は、精製されたＸLCＬＡＣＩK1（２５
０ｎｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色結果を示す写
真である。還元された試料は１．２５％２−メルカプト
エタノールを含有する。右側に、標準の分子の相対質量
が示されている。
０ｎｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色結果を示す写
真である。還元された試料は１．２５％２−メルカプト
エタノールを含有する。右側に、標準の分子の相対質量
が示されている。
【００２１】図４は、０．１μｇ／ｍｌのＸ因子の存在
下（●）または不存在下（○）における、精製ＬＡＣＩ
によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害を示す、グラフであ
る。
下（●）または不存在下（○）における、精製ＬＡＣＩ
によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害を示す、グラフであ
る。
【００２２】図５は、０．１μｇ／ｍｌのＸ因子の存在
下（●）または不存在下（○）における、硫酸バリウム
溶出ＸLCＬＡＣＩK1によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害を
示すグラフである。
下（●）または不存在下（○）における、硫酸バリウム
溶出ＸLCＬＡＣＩK1によるＶＩＩ（ａ）／ＴＦの阻害を
示すグラフである。
【００２３】図６は、精製ＸLCＬＡＣＩK1（○）および
ＬＡＣＩ（●）によるＴＦ誘発凝血の抑制を示すグラフ
である。
ＬＡＣＩ（●）によるＴＦ誘発凝血の抑制を示すグラフ
である。
【００２４】図７は、ビタミンＫまたはワルファリンを
用いて培養されたＣ１０．１細胞の培地中におけるＸLC
ＬＡＣＩK1の存在をウェスターンブロットによつて例示
する写真である。
用いて培養されたＣ１０．１細胞の培地中におけるＸLC
ＬＡＣＩK1の存在をウェスターンブロットによつて例示
する写真である。
【００２５】図８は、ＬＡＣＩとの阻害複合体およびＸ
LCＬＡＣＩK1との阻害複合体を示す模式図である。欠刻
部は、ＶＩＩ（ａ）およびＸａの活性部位を表わし、そ
して突起部は、ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚ領域を表
わす。四要素からなるＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／
ＴＦ複合体において、Ｘａは、その活性部位でＬＡＣＩ
の第二Ｋｕｎｉｔｚ領域に結合され、そしてＶＩＩ
（ａ）はその活性部位でＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領
域に結合される。Ｘａのｇｌａ領域は、Ｃａ++依存様式
で、ＶＩＩａ／ＴＦ複合体の、現時点で同定されている
或る部位と相互反応する。同様に、ＸLCＬＡＣＩK1ハイ
ブリッドタンパク質は、Ｘａ／ＬＡＣＩ複合体の代わり
になる。
LCＬＡＣＩK1との阻害複合体を示す模式図である。欠刻
部は、ＶＩＩ（ａ）およびＸａの活性部位を表わし、そ
して突起部は、ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚ領域を表
わす。四要素からなるＸａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）／
ＴＦ複合体において、Ｘａは、その活性部位でＬＡＣＩ
の第二Ｋｕｎｉｔｚ領域に結合され、そしてＶＩＩ
（ａ）はその活性部位でＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領
域に結合される。Ｘａのｇｌａ領域は、Ｃａ++依存様式
で、ＶＩＩａ／ＴＦ複合体の、現時点で同定されている
或る部位と相互反応する。同様に、ＸLCＬＡＣＩK1ハイ
ブリッドタンパク質は、Ｘａ／ＬＡＣＩ複合体の代わり
になる。
【００２６】本明細書では、標準生化学命名法を使用
し、ヌクレオチド塩基を、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；およびシトシン（Ｃ）で示
す。相当するヌクレオチドは、たとえばデオキシグアノ
シン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）である。Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列の構造表現に都合が良いものとし
て慣用されているように、一本鎖だけを示すが、この一
本鎖において、一本鎖上のＡはその補体上のＴの意味を
含み、そしてＧはＣの意味を含むものとする。
し、ヌクレオチド塩基を、アデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；およびシトシン（Ｃ）で示
す。相当するヌクレオチドは、たとえばデオキシグアノ
シン−５′−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）である。Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列の構造表現に都合が良いものとし
て慣用されているように、一本鎖だけを示すが、この一
本鎖において、一本鎖上のＡはその補体上のＴの意味を
含み、そしてＧはＣの意味を含むものとする。
【００２７】本明細書において、アミノ酸は次表のとお
りの３文字略語または１文字略語で表わす：
りの３文字略語または１文字略語で表わす：
【００２８】
【表１】 ─────────────────────────────────── 略 語 アミノ酸 ─────────────────────────────────── Ａ Ａｌａ アラニン Ｃ Ｃｙｓ システイン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｋ Ｌｙｓ リジン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｌ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｙ Ｔｙｒ チロシン ──────────────────────────────────
【００２９】本明細書に記載されている、一般に利用で
きる制限エンドヌクレアーゼは、下記の制限配列および
開裂パターン（矢印で示されている）を有する：
きる制限エンドヌクレアーゼは、下記の制限配列および
開裂パターン（矢印で示されている）を有する：
【表２】
【００３０】図１に示されている配列において、γはγ
−カルボキシグルタミン酸を表わし、そしてβはβ−ヒ
ドロキシアスパラギン酸を表わす。
−カルボキシグルタミン酸を表わし、そしてβはβ−ヒ
ドロキシアスパラギン酸を表わす。
【００３１】本発明の好ましい態様においては、ＬＡＣ
Ｉの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域をコードする配列に融合させ
るＸ因子のＬ鎖およびＸ因子のプロプロリーダー配列
（これは、グルタミン酸のγ−カルボキシル化に関係す
る）をコードするハイブリッド遺伝子をデザインする
（図１）。この遺伝子をウシパピローマウイルス発現ベ
クター中に挿入し、マウスＣ１２７繊維芽細胞中にトラ
ンスフェクションする。トランスフェクションされたク
ローン（Ｃ１０．１と称する）によって、培地中で発現
されるハイブリッドタンパク質分子は、ウェスターンブ
ロット分析によって検出した。ＸａのＬ鎖に対するモノ
クローナル抗体およびＬＡＣＩのＮＨ2 −末端配列に対
するポリクローナルＩｇＧフラクションは両方ともに、
分子量（ＭＷ）３０，０００で移動する主要着色物質お
よび分子量２８，０００で弱い着色帯を生じた（図
２）。ＭＷ５２，０００を有する拡散帯がまた、見い出
される。これはオリゴマー状ハイブリッド複合体を示す
が、この物質の同定は明確ではない
Ｉの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域をコードする配列に融合させ
るＸ因子のＬ鎖およびＸ因子のプロプロリーダー配列
（これは、グルタミン酸のγ−カルボキシル化に関係す
る）をコードするハイブリッド遺伝子をデザインする
（図１）。この遺伝子をウシパピローマウイルス発現ベ
クター中に挿入し、マウスＣ１２７繊維芽細胞中にトラ
ンスフェクションする。トランスフェクションされたク
ローン（Ｃ１０．１と称する）によって、培地中で発現
されるハイブリッドタンパク質分子は、ウェスターンブ
ロット分析によって検出した。ＸａのＬ鎖に対するモノ
クローナル抗体およびＬＡＣＩのＮＨ2 −末端配列に対
するポリクローナルＩｇＧフラクションは両方ともに、
分子量（ＭＷ）３０，０００で移動する主要着色物質お
よび分子量２８，０００で弱い着色帯を生じた（図
２）。ＭＷ５２，０００を有する拡散帯がまた、見い出
される。これはオリゴマー状ハイブリッド複合体を示す
が、この物質の同定は明確ではない
【００３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色は、この精
製ハイブリッドタンパク質が、主要な３０，０００ＭＷ
帯と僅かな３１，０００ＭＷ帯および２８，０００ＭＷ
帯とからなることを示した。この着色パターンはまた、
還元性条件の下でも見い出され、これによって、多数の
帯が、単純な交互的ジスルフィッド結合によるものでは
ないことを示している（図３）。
製ハイブリッドタンパク質が、主要な３０，０００ＭＷ
帯と僅かな３１，０００ＭＷ帯および２８，０００ＭＷ
帯とからなることを示した。この着色パターンはまた、
還元性条件の下でも見い出され、これによって、多数の
帯が、単純な交互的ジスルフィッド結合によるものでは
ないことを示している（図３）。
【００３３】発現されたＸLCＬＡＣＩK1分子の、ＶＩＩ
（ａ）／ＴＦ活性に対する阻害能力を評価した。ＶＩＩ
（ａ）／ＴＦ活性は、活性化のペプチドの基質ＩＸ因子
からの活性化ペプチドの放出によって測定した〔Ｇｉｒ
ａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５５，３７〜５
０頁（１９８８年）〕。Ｃ１０．１細胞の条件培地のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの後で、抽出ゲルの一部分を検定する
と、機能的阻害活性が、３０，０００のＭＷを有する免
疫−着色物質（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｉｎｅｄｍａｔｅ
ｒｉａｌ）と関連して移動することが示された。ＭＷ２
８，０００または５２，０００の物質では、阻害活性は
見い出されなかった。従来技術で証明されているように
〔Ｂｒｏｚｅ等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５〜３４３
頁（１９８８年）〕、図４は、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性
のＬＡＣＩによる阻害が、Ｘａ因子の存在に依存するこ
とを示している。これに対して、ＸLCＬＡＣＩK1ハイブ
リッドによるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、Ｘａ依
存性ではない（図５）。
（ａ）／ＴＦ活性に対する阻害能力を評価した。ＶＩＩ
（ａ）／ＴＦ活性は、活性化のペプチドの基質ＩＸ因子
からの活性化ペプチドの放出によって測定した〔Ｇｉｒ
ａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５５，３７〜５
０頁（１９８８年）〕。Ｃ１０．１細胞の条件培地のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの後で、抽出ゲルの一部分を検定する
と、機能的阻害活性が、３０，０００のＭＷを有する免
疫−着色物質（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｉｎｅｄｍａｔｅ
ｒｉａｌ）と関連して移動することが示された。ＭＷ２
８，０００または５２，０００の物質では、阻害活性は
見い出されなかった。従来技術で証明されているように
〔Ｂｒｏｚｅ等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５〜３４３
頁（１９８８年）〕、図４は、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性
のＬＡＣＩによる阻害が、Ｘａ因子の存在に依存するこ
とを示している。これに対して、ＸLCＬＡＣＩK1ハイブ
リッドによるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、Ｘａ依
存性ではない（図５）。
【００３４】プロトロンビンタイムアッセイの（ｐｒｏ
ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ ａｓｓａｙ）の変法で測
定して、正常血漿のＴＦ誘発凝血の抑制活性に関して、
ＸLCＬＡＣＩK1をＬＡＣＩと比較した。図６は、ＸLCＬ
ＡＣＩK1３５ｎｇ／ｍｌによって、５０％の見掛け上の
ＴＦ阻害が生じるのに対し、ＬＡＣＩは、均等な効果を
得るために、２．５μｇ／ｍｌが必要であることを示し
ている。この系におけるＸLCＬＡＣＩK1の大きい相対抑
制活性は、その能力がＶＩＩａ／ＴＦを直接に阻害する
ことを示しており、他方、ＬＡＣＩは、そのＶＩＩａ／
ＴＦに対する阻害を呈示する前に、Ｘａの発現を必要と
することを示しているものと信じられる。さらにまた、
プロトロンビンタイムアッセイによる、ＬＡＣＩの阻害
作用は、少なくとも部分的に、ＬＡＣＩがＸａを直接に
阻害することによるものである。何故ならば、活性化パ
ーシャルトロンボプラスチンタイムアッセイ（ａＰＴ
Ｔ）によって測定して、ＬＡＣＩはまた、同一濃度で、
正常血漿の表面活性化凝血を長引かせるからである。
ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ ａｓｓａｙ）の変法で測
定して、正常血漿のＴＦ誘発凝血の抑制活性に関して、
ＸLCＬＡＣＩK1をＬＡＣＩと比較した。図６は、ＸLCＬ
ＡＣＩK1３５ｎｇ／ｍｌによって、５０％の見掛け上の
ＴＦ阻害が生じるのに対し、ＬＡＣＩは、均等な効果を
得るために、２．５μｇ／ｍｌが必要であることを示し
ている。この系におけるＸLCＬＡＣＩK1の大きい相対抑
制活性は、その能力がＶＩＩａ／ＴＦを直接に阻害する
ことを示しており、他方、ＬＡＣＩは、そのＶＩＩａ／
ＴＦに対する阻害を呈示する前に、Ｘａの発現を必要と
することを示しているものと信じられる。さらにまた、
プロトロンビンタイムアッセイによる、ＬＡＣＩの阻害
作用は、少なくとも部分的に、ＬＡＣＩがＸａを直接に
阻害することによるものである。何故ならば、活性化パ
ーシャルトロンボプラスチンタイムアッセイ（ａＰＴ
Ｔ）によって測定して、ＬＡＣＩはまた、同一濃度で、
正常血漿の表面活性化凝血を長引かせるからである。
【００３５】Ｘ因子のＬ鎖上のグルタミン酸残基のγ−
カルボキシル化は、ワルファリンにより抑制されるビタ
ミンＫ依存性プロセスを必要とする。Ｃ１０．１培養培
地で、ビタミンＫの代りにワルファリンを使用すると、
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性における〜８０倍の減少が
生じる（表１）。一方、この培地中におけるＸLCＬＡＣ
ＩK1の量を減じると、〜２倍の減少を生じるだけである
（図７）。ｇｌａ含有分子を選択的に吸着する硫酸バリ
ウムは〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤａｖｉｅｓによる、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４，４９２８〜４９３４頁
（１９７５年）〕、ビタミンＫの存在の下で増殖させた
Ｃ１０．１細胞によって発現されるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
阻害活性を捕獲する。これは、官能性のＸLCＬＡＣＩK1
がγ−カルボキシル化されることを示している（表
１）。従って、ＸLCＬＡＣＩK1のγ−カルボキシル化は
ＸLCＬＡＣＩK1のＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性に関して
必要不可欠のものと見做され、本発明者は、本発明のハ
イブリッドタンパク質のＬＡＣＩ K1部分だけでは、阻害
活性の発現には不充分であるものと結論した。さらにま
た、Ｘ因子、Ｘａ因子または不活性化Ｘａ因子（ダンシ
ル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニンク
ロロメチルケトンで処理したＸａ）はいずれも、Ｘ LCＬ
ＡＣＩK1ハイブリッド中に見い出されるＸのＬ鎖を含有
しているにもかかわらず、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性
を有していない。これらの結果は、本発明のハイブリッ
ドタンパク質においては、ＸのＬ鎖およびＬＡＣＩK1部
分の両方がＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性に必要であるこ
とを示している。
カルボキシル化は、ワルファリンにより抑制されるビタ
ミンＫ依存性プロセスを必要とする。Ｃ１０．１培養培
地で、ビタミンＫの代りにワルファリンを使用すると、
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性における〜８０倍の減少が
生じる（表１）。一方、この培地中におけるＸLCＬＡＣ
ＩK1の量を減じると、〜２倍の減少を生じるだけである
（図７）。ｇｌａ含有分子を選択的に吸着する硫酸バリ
ウムは〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤａｖｉｅｓによる、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４，４９２８〜４９３４頁
（１９７５年）〕、ビタミンＫの存在の下で増殖させた
Ｃ１０．１細胞によって発現されるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
阻害活性を捕獲する。これは、官能性のＸLCＬＡＣＩK1
がγ−カルボキシル化されることを示している（表
１）。従って、ＸLCＬＡＣＩK1のγ−カルボキシル化は
ＸLCＬＡＣＩK1のＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性に関して
必要不可欠のものと見做され、本発明者は、本発明のハ
イブリッドタンパク質のＬＡＣＩ K1部分だけでは、阻害
活性の発現には不充分であるものと結論した。さらにま
た、Ｘ因子、Ｘａ因子または不活性化Ｘａ因子（ダンシ
ル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニンク
ロロメチルケトンで処理したＸａ）はいずれも、Ｘ LCＬ
ＡＣＩK1ハイブリッド中に見い出されるＸのＬ鎖を含有
しているにもかかわらず、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性
を有していない。これらの結果は、本発明のハイブリッ
ドタンパク質においては、ＸのＬ鎖およびＬＡＣＩK1部
分の両方がＶＩＩ（ａ）／ＴＦ阻害活性に必要であるこ
とを示している。
【００３６】図８には、Ｘａ／ＬＡＣＩ／ＶＩＩ（ａ）
／ＴＦ阻害性複合体の形成およびＸ LCＬＡＣＩK1／ＶＩ
Ｉ（ａ）／ＴＦ阻害性複合体の形成の模式図が示されて
いる。本発明者は、ＶＩＩａ／ＴＦへの結合およびＶＩ
Ｉａ／ＴＦの阻害において、ＸLCＬＡＣＩK1はＸａ／Ｌ
ＡＣＩ複合体を擬装するものと考える。ＬＡＣＩによる
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
触媒活性の産物であるＸａの発現を必要とする新規なフ
ィードバック阻害メカニズムによって生じる。これに対
して、ＸLCＬＡＣＩK1ハイブリッドタンパク質は、ＶＩ
Ｉ（ａ）／ＴＦ活性を直接に阻害する。
／ＴＦ阻害性複合体の形成およびＸ LCＬＡＣＩK1／ＶＩ
Ｉ（ａ）／ＴＦ阻害性複合体の形成の模式図が示されて
いる。本発明者は、ＶＩＩａ／ＴＦへの結合およびＶＩ
Ｉａ／ＴＦの阻害において、ＸLCＬＡＣＩK1はＸａ／Ｌ
ＡＣＩ複合体を擬装するものと考える。ＬＡＣＩによる
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害は、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
触媒活性の産物であるＸａの発現を必要とする新規なフ
ィードバック阻害メカニズムによって生じる。これに対
して、ＸLCＬＡＣＩK1ハイブリッドタンパク質は、ＶＩ
Ｉ（ａ）／ＴＦ活性を直接に阻害する。
【００３７】本発明のハイブリッド血液凝固阻害物質の
投与量は、図６からわかるようにＬＡＣＩ単独より少な
い量でよい。阻害有効量は図６からわかるように、正常
ヒト血漿において約１０〜約１０００ｎｇ／ｍｌであ
る。
投与量は、図６からわかるようにＬＡＣＩ単独より少な
い量でよい。阻害有効量は図６からわかるように、正常
ヒト血漿において約１０〜約１０００ｎｇ／ｍｌであ
る。
【実施例】本発明をさらに詳細に説明するために、下記
の実験室的予備実験を行ない、以下に、図を含んで示さ
れている結果を得た。以下に記載の方法は、図１〜７に
示されている結果と表１に示されている結果とに関する
ものに分けられる。しかしながら、本発明がこれらの特
定の例に制限されないことは明白である。
の実験室的予備実験を行ない、以下に、図を含んで示さ
れている結果を得た。以下に記載の方法は、図１〜７に
示されている結果と表１に示されている結果とに関する
ものに分けられる。しかしながら、本発明がこれらの特
定の例に制限されないことは明白である。
【００３８】例１ 図１： 修飾ＬＡＣＩ ｃＤＮＡ挿入体に対して、特定部位の突
然変異誘発を行ない〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒ
ｅ ３３８、５１８〜５２０頁（１９８９年）〕、ＬＡ
ＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域のコード配列とＬＡＣＩの
第二Ｋｕｎｉｔｚ領域のコード配列との間に、Ｎｓｉ
Ｉ部位を創製した。天然産生のＮｓｉＩ部位は、第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域のコード配列から上流に存在する。Ｎｓ
ｉ Ｉ消化の後に、ＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域を
コードする領域を単離し、ｐＧＥＭＸLCのＮｓｉ Ｉ部
位中にリゲートし、ｐＧＥＭＸLCＬＡＣＩK1を創製し
た。ｐＧＥＭＸLCは市販のプラスミドである、ｐＧＥＭ
（Ｐｒｏｍｅｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から誘導さ
れるものであり、このｐＧＥＭは、コードされたアミノ
酸配列を変えない修飾により天然産生Ｅｃｏ Ｒ１部位
を排除して、ヒトＸ因子をコードするｃＤＮＡ挿入体を
含有するものである（Ａ． Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ Ｌｏｕ
ｉｓ， ＭＯから）。ｐＧＥＭＸLCは、Ａｐａ Ｉ部位
を経て、補体合成オリゴマーに連なるＸ因子のＬ鎖をコ
ードする修飾されている部分ｃＤＮＡを含有している。
この合成オリゴマーは付加的Ｘ因子Ｌ鎖配列をコード
し、その後に第一Ｋｕｎｉｔｚ領域の先駆体であり、そ
して天然産生Ｎｓｉ Ｉを含むＬＡＣＩＮＨ2 末端配列
が連結しており、引続いて２個の停止コドンおよび都合
の良い制限部位パリンドロームが連結している。ｐＧＥ
ＭＸLCＬＡＣＩK1挿入体は、Ｂａｍ ＨＩによって切り
出し、ウシパピローマウイルス発現ベクターｐＭＯＮ１
１２３中にリゲートした。得られたプラスミドｐＭＯＮ
ＸLCＬＡＣＩ1'をｐＳＶ２ｎｅｏとともに使用し、Ｃ１
２７マウス繊維芽細胞を同時トランスフェクションした
〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ５
５，３７〜５０頁（１９８８年）〕。
然変異誘発を行ない〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＮａｔｕｒ
ｅ ３３８、５１８〜５２０頁（１９８９年）〕、ＬＡ
ＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域のコード配列とＬＡＣＩの
第二Ｋｕｎｉｔｚ領域のコード配列との間に、Ｎｓｉ
Ｉ部位を創製した。天然産生のＮｓｉＩ部位は、第一Ｋ
ｕｎｉｔｚ領域のコード配列から上流に存在する。Ｎｓ
ｉ Ｉ消化の後に、ＬＡＣＩの第一Ｋｕｎｉｔｚ領域を
コードする領域を単離し、ｐＧＥＭＸLCのＮｓｉ Ｉ部
位中にリゲートし、ｐＧＥＭＸLCＬＡＣＩK1を創製し
た。ｐＧＥＭＸLCは市販のプラスミドである、ｐＧＥＭ
（Ｐｒｏｍｅｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から誘導さ
れるものであり、このｐＧＥＭは、コードされたアミノ
酸配列を変えない修飾により天然産生Ｅｃｏ Ｒ１部位
を排除して、ヒトＸ因子をコードするｃＤＮＡ挿入体を
含有するものである（Ａ． Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ Ｌｏｕ
ｉｓ， ＭＯから）。ｐＧＥＭＸLCは、Ａｐａ Ｉ部位
を経て、補体合成オリゴマーに連なるＸ因子のＬ鎖をコ
ードする修飾されている部分ｃＤＮＡを含有している。
この合成オリゴマーは付加的Ｘ因子Ｌ鎖配列をコード
し、その後に第一Ｋｕｎｉｔｚ領域の先駆体であり、そ
して天然産生Ｎｓｉ Ｉを含むＬＡＣＩＮＨ2 末端配列
が連結しており、引続いて２個の停止コドンおよび都合
の良い制限部位パリンドロームが連結している。ｐＧＥ
ＭＸLCＬＡＣＩK1挿入体は、Ｂａｍ ＨＩによって切り
出し、ウシパピローマウイルス発現ベクターｐＭＯＮ１
１２３中にリゲートした。得られたプラスミドｐＭＯＮ
ＸLCＬＡＣＩ1'をｐＳＶ２ｎｅｏとともに使用し、Ｃ１
２７マウス繊維芽細胞を同時トランスフェクションした
〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ５
５，３７〜５０頁（１９８８年）〕。
【００３９】図２： トランスフェクションされており、そしてクローン形成
されたセルライン（Ｃ１０．１と称する）および精製Ｌ
ＡＣＩ４０μｇまたはＸ因子６０ｎｇからの５倍濃度
の、血清を含有していない条件培地（２５μｌ）で、１
５％ポリアクリルアミドゲルを用いてウェスターンブロ
ットを行ない、ニトロセルロースに移し、抗−ＬＡＣＩ
（ペプチド）ＩｇＧまたは抗−Ｘモノクローナル抗体で
探り、次いで慣用の方法（Ｇｉｒａｒｄ等によりＴｈｒ
ｏｍｂ． Ｒｅｓ．５５，３７〜５０頁（１９８８年）
に記載されている方法）によって、色測定ができるよう
に展開させた。
されたセルライン（Ｃ１０．１と称する）および精製Ｌ
ＡＣＩ４０μｇまたはＸ因子６０ｎｇからの５倍濃度
の、血清を含有していない条件培地（２５μｌ）で、１
５％ポリアクリルアミドゲルを用いてウェスターンブロ
ットを行ない、ニトロセルロースに移し、抗−ＬＡＣＩ
（ペプチド）ＩｇＧまたは抗−Ｘモノクローナル抗体で
探り、次いで慣用の方法（Ｇｉｒａｒｄ等によりＴｈｒ
ｏｍｂ． Ｒｅｓ．５５，３７〜５０頁（１９８８年）
に記載されている方法）によって、色測定ができるよう
に展開させた。
【００４０】図３： ＸLCＬＡＣＩK1は、硫酸バリウム吸着および溶出によ
り、Ｃ１０．１血清を含有していない条件培地から精製
し〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤａｖｉｅｓによるＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １４，４９２８〜４９３４頁（１９７
５年）〕、引続いて、無水トリプシンアフィゲル親和ク
ロマトグラフィ〔Ｉｓｈｉｉ等によるＭｅｔｈ． Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．９１，３７８〜３８３頁（１９８３年）〕
により、次いでＭｏｎｏ Ｑアニオン交換クロマトグラ
フィ〔１９８７年７月２３日出願の係属中の特許出願Ｓ
ｅｒ． Ｎｏ．０７／ ７７，３６６およびＢｒｏｚｅ
等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５〜３４３頁（１９８８
年）〕により精製した。
り、Ｃ１０．１血清を含有していない条件培地から精製
し〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤａｖｉｅｓによるＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １４，４９２８〜４９３４頁（１９７
５年）〕、引続いて、無水トリプシンアフィゲル親和ク
ロマトグラフィ〔Ｉｓｈｉｉ等によるＭｅｔｈ． Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．９１，３７８〜３８３頁（１９８３年）〕
により、次いでＭｏｎｏ Ｑアニオン交換クロマトグラ
フィ〔１９８７年７月２３日出願の係属中の特許出願Ｓ
ｅｒ． Ｎｏ．０７／ ７７，３６６およびＢｒｏｚｅ
等によるＢｌｏｏｄ７１，３３５〜３４３頁（１９８８
年）〕により精製した。
【００４１】図４および図５： ＬＡＣＩの精製は、Ｂｒｏｚｅ等によりＴｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ． ４８，２５３〜２５９頁（１９８８年）に
記載されたような慣用の方法によって行なった。ＸLCＬ
ＡＣＩK1は、硫酸バリウム吸着〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤ
ａｖｉｅｓによる上記刊行物〕および０．２Ｍクエン酸
ナトリウムによる溶出によって、Ｃ１０．１血清を含有
していない条件培地２００ｍｌから精製した。この調製
物を次いで濃縮し、次いでＴＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に対し
て透析した。最終容積＝１ｍｌ。ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活
性の阻害は、公知の 3Ｈ−ＩＸ活性化ペプチド放出検定
法〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．
５５，３７〜５０頁（１９８８年）〕を使用して評価し
たが、この検定法で使用されているＶＩＩ因子の代り
に、ＶＩＩａを使用した。この置き換えは、若干の検定
において、ＶＩＩをＶＩＩａに活性化するＸ（またはＸ
ａ）が存在していないためである。この検定系にはま
た、ヘパリン（２単位／ｍｌ）を存在させた。この検定
において、ＩＸのＶＩＩ（ａ）／ＴＦによる活性化は、
放射性物質をラベルしたＩＸからのＴＣＡ可溶性三重水
素化活性ペプチドの放出として測定した。ＶＩＩ（ａ）
／ＴＦ阻害活性はＴＣＡ可溶性ｃｐｍの減少をもたら
す。〔ＴＣＡ＝トリクロロ酢酸〕。ナノグラムＬＡＣＩ
等量は、標準ＬＡＣＩ濃度曲線から決定した。
Ｒｅｓ． ４８，２５３〜２５９頁（１９８８年）に
記載されたような慣用の方法によって行なった。ＸLCＬ
ＡＣＩK1は、硫酸バリウム吸着〔ＫｉｓｉｅｌおよびＤ
ａｖｉｅｓによる上記刊行物〕および０．２Ｍクエン酸
ナトリウムによる溶出によって、Ｃ１０．１血清を含有
していない条件培地２００ｍｌから精製した。この調製
物を次いで濃縮し、次いでＴＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に対し
て透析した。最終容積＝１ｍｌ。ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活
性の阻害は、公知の 3Ｈ−ＩＸ活性化ペプチド放出検定
法〔Ｇｉｒａｒｄ等によるＴｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．
５５，３７〜５０頁（１９８８年）〕を使用して評価し
たが、この検定法で使用されているＶＩＩ因子の代り
に、ＶＩＩａを使用した。この置き換えは、若干の検定
において、ＶＩＩをＶＩＩａに活性化するＸ（またはＸ
ａ）が存在していないためである。この検定系にはま
た、ヘパリン（２単位／ｍｌ）を存在させた。この検定
において、ＩＸのＶＩＩ（ａ）／ＴＦによる活性化は、
放射性物質をラベルしたＩＸからのＴＣＡ可溶性三重水
素化活性ペプチドの放出として測定した。ＶＩＩ（ａ）
／ＴＦ阻害活性はＴＣＡ可溶性ｃｐｍの減少をもたら
す。〔ＴＣＡ＝トリクロロ酢酸〕。ナノグラムＬＡＣＩ
等量は、標準ＬＡＣＩ濃度曲線から決定した。
【００４２】図６： ＴＦ誘発凝血は、６０μｌウサギ脳セファリン、６０μ
ｌ粗製ＥＤＴＡ−洗出ＴＦ〔ＢｒｏｚｅおよびＭａｊｅ
ｒｕｓによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，１２４
２〜１２４７頁（１９８０年）〕、１０μｌ試料および
６０μｌ正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇ Ｋｉｎｇ， Ｏｖ
ｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ， ＫＳ）を３７℃でインキュ
ベートすることによって、フィブロメーター（ｆｉｂｒ
ｏｍｅｔｅｒ）（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，
ＭＤ）において、プロトロンビンタイムアッセイ変法に
より測定した。３０秒後に、６０μｌ ＣａＣｌ2 （２
５ｍＭ）を加え、経過時間対凝血形成を測定した。阻害
物質が存在していない場合には、この検定の凝血形成時
間は２９秒であった。ＴＦ濃度対凝血形成時間をグラフ
にした標準曲線（ｌｏｇ−ｌｏｇプロット）を使用し、
この検定における種々の阻害物質濃度での見掛け上のＴ
Ｆ活性を測定した。
ｌ粗製ＥＤＴＡ−洗出ＴＦ〔ＢｒｏｚｅおよびＭａｊｅ
ｒｕｓによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，１２４
２〜１２４７頁（１９８０年）〕、１０μｌ試料および
６０μｌ正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇ Ｋｉｎｇ， Ｏｖ
ｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ， ＫＳ）を３７℃でインキュ
ベートすることによって、フィブロメーター（ｆｉｂｒ
ｏｍｅｔｅｒ）（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，
ＭＤ）において、プロトロンビンタイムアッセイ変法に
より測定した。３０秒後に、６０μｌ ＣａＣｌ2 （２
５ｍＭ）を加え、経過時間対凝血形成を測定した。阻害
物質が存在していない場合には、この検定の凝血形成時
間は２９秒であった。ＴＦ濃度対凝血形成時間をグラフ
にした標準曲線（ｌｏｇ−ｌｏｇプロット）を使用し、
この検定における種々の阻害物質濃度での見掛け上のＴ
Ｆ活性を測定した。
【００４３】表１： この表は、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ抑制活性の発現における
ビタミンＫの効果とワルファリンの効果、ならびにこの
活性の吸着に係る硫酸バリウムの能力を示すものであ
る。 ビタミンＫまたはワルファリンの存在において増殖させ
たＣ１０．１細胞により発現されたＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
阻害活性の比較
ビタミンＫの効果とワルファリンの効果、ならびにこの
活性の吸着に係る硫酸バリウムの能力を示すものであ
る。 ビタミンＫまたはワルファリンの存在において増殖させ
たＣ１０．１細胞により発現されたＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
阻害活性の比較
【表３】 ─────────────────────────────────── 発現された抑制活性 試 料 （ｎｇ ＬＡＣＩ 等量／ｍｌ培地） ビタミンＫ 培地 ５９０ ＢａＳＯ4 非吸着 ３ ＢａＳＯ4 吸着 ４２０ ワルファリン 培地 ７ ＢａＳＯ4 非吸着 １ ＢａＳＯ4 吸着 ０ ───────────────────────────────────
【００４４】某約状態に達した時点で、Ｃ１０．１細胞
発現するＸLCＬＡＣＩK1を、ビタミンＫ（１μｇ／ｍ
ｌ）またはワルファリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有す
る、血清を含有していない条件培地に移した。この培養
培地は０日目、１日目および２日目に取り換え、５日間
増殖させた。各培地１０ｍｌを、上記図３に関して記載
されているとおりに、硫酸バリウムに吸着させ、吸着さ
れたタンパク質を０．２Ｍクエン酸ナトリウムで溶出し
た。硫酸バリウムに吸着され、次いで溶出された物質、
硫酸バリウムに吸着されなかった物質および追加の条件
培地１０ｍｌをそれぞれ、ＴＳ緩衝液中に透析し、次い
で濃縮した；最終容積＝それぞれ、１ｍｌ。試料はＴＢ
ＳＡ緩衝液中に適当に稀釈し、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性
の阻害に関して評価した。ナノグラムＬＡＣＩ等量は、
標準ＬＡＣＩ濃度曲線から決定した。
発現するＸLCＬＡＣＩK1を、ビタミンＫ（１μｇ／ｍ
ｌ）またはワルファリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有す
る、血清を含有していない条件培地に移した。この培養
培地は０日目、１日目および２日目に取り換え、５日間
増殖させた。各培地１０ｍｌを、上記図３に関して記載
されているとおりに、硫酸バリウムに吸着させ、吸着さ
れたタンパク質を０．２Ｍクエン酸ナトリウムで溶出し
た。硫酸バリウムに吸着され、次いで溶出された物質、
硫酸バリウムに吸着されなかった物質および追加の条件
培地１０ｍｌをそれぞれ、ＴＳ緩衝液中に透析し、次い
で濃縮した；最終容積＝それぞれ、１ｍｌ。試料はＴＢ
ＳＡ緩衝液中に適当に稀釈し、ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性
の阻害に関して評価した。ナノグラムＬＡＣＩ等量は、
標準ＬＡＣＩ濃度曲線から決定した。
【００４５】図７： ウエスターンブロットにもとづき、各濃縮培地２０μｌ
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、電気泳動分別し、ニトロ
セルロースに移し、抗−Ｘ−モノクローナル抗体で探
り、次いで抗−マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ
共役結合体で探り、次いで色測定できるように展開させ
た。
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、電気泳動分別し、ニトロ
セルロースに移し、抗−Ｘ−モノクローナル抗体で探
り、次いで抗−マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ
共役結合体で探り、次いで色測定できるように展開させ
た。
【００４６】本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精
神および範囲から逸脱することのない、種々の他の例が
当業者に明白になるであろう。このような他の例はいず
れも、特許請求の範囲内に含まれるものと考えられる。
神および範囲から逸脱することのない、種々の他の例が
当業者に明白になるであろう。このような他の例はいず
れも、特許請求の範囲内に含まれるものと考えられる。
【００４７】
【図１】本発明による、ＸLCＬＡＣＩK1と称される代表
的ハイブリッドタンパク質の模式図。
的ハイブリッドタンパク質の模式図。
【図２】ウエスターンブロットによる、組換えハイブリ
ッドタンパク質の発現を示す写真。
ッドタンパク質の発現を示す写真。
【図３】本発明による精製ＸLCＬＡＣＩK1のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび銀染色結果を示す写真。
ＡＧＥおよび銀染色結果を示す写真。
【図４】Ｘ因子の存在下（●印）または不存在下（○
印）における、精製ＬＡＣＩによるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
活性の阻害を示すグラフ。
印）における、精製ＬＡＣＩによるＶＩＩ（ａ）／ＴＦ
活性の阻害を示すグラフ。
【図５】Ｘ因子の存在下（●印）または不存在下（○
印）における、硫酸バリウム溶出ＸLCＬＡＣＩK1による
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害を示すグラフ。
印）における、硫酸バリウム溶出ＸLCＬＡＣＩK1による
ＶＩＩ（ａ）／ＴＦ活性の阻害を示すグラフ。
【図６】精製ＸLCＬＡＣＩK1（○印）およびＬＡＣＩ
（●印）による、ＴＦ誘発凝血の抑制を示すグラフ。
（●印）による、ＴＦ誘発凝血の抑制を示すグラフ。
【図７】ウエスターンブロットによる、ビタミンＫまた
はワルファリンを含有するＣ１０．１細胞培地中におけ
るＸLCＬＡＣＩK1の存在を示す写真。
はワルファリンを含有するＣ１０．１細胞培地中におけ
るＸLCＬＡＣＩK1の存在を示す写真。
【図８】ＬＡＣＩとの阻害複合体およびＸLCＬＡＣＩK1
との阻害複合体の推定模式図。
との阻害複合体の推定模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 Ｘ因子のＬ鎖に相当する以下のアミノ酸
配列： 【化２】 およびリポタンパク質関連凝固阻害物質の第一Ｋｕｎｉ
ｔｚ領域に相当する以下のアミノ酸配列： 【化３】 を含む一本鎖ハイブリッド血液凝固阻害物質、ただし上
記アミノ酸配列中の１文字略語は、それぞれ以下のよう
に定義するものとする。 【表４】 - 【請求項２】 Ｘ因子のＬ鎖に相当する以下のアミノ酸
配列： 【化４】 およびリポタンパク質関連凝固阻害物質の第一Ｋｕｎｉ
ｔｚ領域に相当する以下のアミノ酸配列： 【化５】 を含む一本鎖ハイブリッド血液凝固阻害物質、ただし上
記アミノ酸配列中の１文字略語は、それぞれ以下のよう
に定義するものとする。 【表５】 - 【請求項３】 Ｘ因子のＬ鎖に相当する以下のアミノ酸
配列： 【化６】 およびリポタンパク質関連凝固阻害物質の第一Ｋｕｎｉ
ｔｚ領域に相当する以下のアミノ酸配列： 【化７】 を含む一本鎖ハイブリッド血液凝固阻害物質、ただし上
記アミノ酸配列中の１文字略語は、それぞれ以下のよう
に定義するものとする。 【表６】 - 【請求項４】 Ｘ因子のＬ鎖に相当する以下のアミノ酸
配列： 【化８】 およびリポタンパク質関連凝固阻害物質の第一Ｋｕｎｉ
ｔｚ領域に相当する以下のアミノ酸配列： 【化９】 を含む一本鎖ハイブリッド血液凝固阻害物質、ただし上
記アミノ酸配列中の１文字略語は、それぞれ以下のよう
に定義するものとする。 【表７】 - 【請求項５】 下記のアミノ酸配列： 【化１０】 を有する請求項３記載の一本鎖ハイブリッド血液凝固阻
害物質、ただし上記アミノ酸配列中の１文字略語は、そ
れぞれ以下のように定義するものとする。 【表８】 - 【請求項６】 下記のアミノ酸配列： 【化１１】 を有する請求項４記載の一本鎖ハイブリッド血液凝固阻
害物質、ただし上記アミノ酸配列中の１文字略語は、そ
れぞれ以下のように定義するものとする。 【表９】 - 【請求項７】 請求項１，２または３に記載のハイブリ
ッド血液凝固阻害物質を含む、ＶＩＩ（ａ）因子／組織
因子直接阻害剤。 - 【請求項８】 請求項１，２または３に記載のハイブリ
ッド血液凝固阻害物質をコードする配列を含むＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47028990A | 1990-01-25 | 1990-01-25 | |
| US470289 | 1990-01-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211000A JPH04211000A (ja) | 1992-08-03 |
| JP2560150B2 true JP2560150B2 (ja) | 1996-12-04 |
Family
ID=23866994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3007256A Expired - Lifetime JP2560150B2 (ja) | 1990-01-25 | 1991-01-24 | Ｘ因子−ｌａｃｉハイブリッドタンパク質 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2560150B2 (ja) |
| AT (1) | ATE135044T1 (ja) |
| CA (1) | CA2034881C (ja) |
| DE (1) | DE69117545T2 (ja) |
| DK (1) | DK0439442T3 (ja) |
| ES (1) | ES2086521T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019877T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5276015A (en) * | 1992-03-18 | 1994-01-04 | Washington University | Method of inhibiting microvascular thrombosis |
| WO1994007528A1 (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-14 | Corvas International, Inc. | Bovine pancreatic trypsin inhibitor derived inhibitors of factor viia-tissue factor complex |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| AU711405B2 (en) * | 1994-10-18 | 1999-10-14 | Dendreon Corporation | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5772629A (en) * | 1995-10-23 | 1998-06-30 | Localmed, Inc. | Localized intravascular delivery of TFPI for inhibition of restenosis in recanalized blood vessels |
| US5910481A (en) * | 1995-11-13 | 1999-06-08 | Immuno Ag | Hybrid proteins with modified activity |
| US5736364A (en) * | 1995-12-04 | 1998-04-07 | Genentech, Inc. | Factor viia inhibitors |
| ES2195025T3 (es) * | 1995-12-01 | 2003-12-01 | Genentech Inc | Proteinas de fusion de un dominio de factor tisular-dominio de kunitz como inhibidores del factor viia. |
| BR9708021A (pt) | 1996-03-11 | 1999-07-27 | Bayer Ag | Proteína substancialmente purificada composição farmacêutica sequência de ácido nucleico isolada vetor de express o de protéina auto-replicante e processos para inibir a atividade de protéinas de serina tratar uma condição e preparar um medicamento de uma proteína |
| EP0927764B1 (de) * | 1997-12-03 | 2004-05-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chimäre Serinproteasen |
| US6159722A (en) | 1997-12-03 | 2000-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chimeric serine proteases |
| CA2405557C (en) * | 2000-04-12 | 2013-09-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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- 1991-01-21 ES ES91870008T patent/ES2086521T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-21 AT AT91870008T patent/ATE135044T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-21 EP EP91870008A patent/EP0439442B1/en not_active Expired - Lifetime
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-
1996
- 1996-05-10 GR GR960401256T patent/GR3019877T3/el unknown
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