JP2526074B2 - 液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ― - Google Patents
液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ―Info
- Publication number
- JP2526074B2 JP2526074B2 JP62258858A JP25885887A JP2526074B2 JP 2526074 B2 JP2526074 B2 JP 2526074B2 JP 62258858 A JP62258858 A JP 62258858A JP 25885887 A JP25885887 A JP 25885887A JP 2526074 B2 JP2526074 B2 JP 2526074B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bed reactor
- tube
- vitamin
- liquid chromatography
- reactor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はビタミンＫ類（以下VKと略記する）定量用の
ベッドリアクター、さらに詳しくは液体クロマトグラフ
ィーによるVK、すなわち、ビタミンK1およびK2の定量用
ベッドリアクターの改良に関するものである。
ベッドリアクター、さらに詳しくは液体クロマトグラフ
ィーによるVK、すなわち、ビタミンK1およびK2の定量用
ベッドリアクターの改良に関するものである。
ビタミンK1およびビタミンK2等のVKは、抗出血作用の
ある脂溶性ビタミンであって、血液中の血液凝固酵素ト
ロンビンのもとであるプロトロンビンの生成に関与し、
その正常値を保たせる因子といわれている。従って、生
体中VKが欠乏すると血液の凝固が遅れることは周知のと
おりである。
ある脂溶性ビタミンであって、血液中の血液凝固酵素ト
ロンビンのもとであるプロトロンビンの生成に関与し、
その正常値を保たせる因子といわれている。従って、生
体中VKが欠乏すると血液の凝固が遅れることは周知のと
おりである。
ところで、最近、早期新生児期を過ぎた幼若乳児や抗
菌範囲の広い抗生物質投与中の患者におけるVK欠乏性出
血症に大きな感心が寄せられており、特に幼若乳児にお
けるVK欠乏症は、能内出血による重篤な病態を呈するこ
とからきわめて重大であるとされている。
菌範囲の広い抗生物質投与中の患者におけるVK欠乏性出
血症に大きな感心が寄せられており、特に幼若乳児にお
けるVK欠乏症は、能内出血による重篤な病態を呈するこ
とからきわめて重大であるとされている。
一方、各種ビタミンの中でもVKの動態の解明は特に遅
れており、科学的なデータに基ずくヒトの最少栄養量す
ら正確には決定されていないような状況である。この最
大の理由はVKを特異的、かつ、高感度に測定する方法が
最近まで確立されていなかたことにほかならない。近
年、液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）の急速な発展により分離手段としては
逆相クロマトグラフィーでの高速、高分離が可能となっ
たが、VKの検出、定量法としては一般的に汎用されてい
る紫外線吸収法（UV法）や電気化学的還元法（ECD法）
によっても感度が足りず、生体試料中のVK定量法として
はまだ実用的に満足できるものではない。
れており、科学的なデータに基ずくヒトの最少栄養量す
ら正確には決定されていないような状況である。この最
大の理由はVKを特異的、かつ、高感度に測定する方法が
最近まで確立されていなかたことにほかならない。近
年、液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）の急速な発展により分離手段としては
逆相クロマトグラフィーでの高速、高分離が可能となっ
たが、VKの検出、定量法としては一般的に汎用されてい
る紫外線吸収法（UV法）や電気化学的還元法（ECD法）
によっても感度が足りず、生体試料中のVK定量法として
はまだ実用的に満足できるものではない。
しかしながら、下記に示すとおりキノン型のVK（Ｉ）
を還元してハイドロキノン型（II）に変換すると発螢光
体となるので、最近では専らこの性質を利用して液体ク
ロマトグラフィーによるVK分離液にポストカラム法で化
学的あるいは電気化学的に還元し、これを螢光検出器で
高感度に検出することが行われている。
を還元してハイドロキノン型（II）に変換すると発螢光
体となるので、最近では専らこの性質を利用して液体ク
ロマトグラフィーによるVK分離液にポストカラム法で化
学的あるいは電気化学的に還元し、これを螢光検出器で
高感度に検出することが行われている。
この方法によれば、数ピコグラム（pg）から数十ピコ
グラムのオーダーでVKを検出、定量することができる。
グラムのオーダーでVKを検出、定量することができる。
ところで、かかる液体はクロマトグラフィーによるVK
の定量におけるVKの還元としては、一般に水素化ホウ素
ナトリウム（NaBH4）による化学的な還元法がよく知ら
れている。この方法は液体クロマトグラフィーのカラム
溶出液に0.025％程度のNaBH4のエタノール溶液を混ぜ合
わせ、これを内径:0.6〜0.8mm、長さ:2〜3mのステンレ
ス管に導き（該スレンテス管は通常コイル状に形成され
ている）、該管内において還元反応を行わせてから螢光
検出器に導くものである。
の定量におけるVKの還元としては、一般に水素化ホウ素
ナトリウム（NaBH4）による化学的な還元法がよく知ら
れている。この方法は液体クロマトグラフィーのカラム
溶出液に0.025％程度のNaBH4のエタノール溶液を混ぜ合
わせ、これを内径:0.6〜0.8mm、長さ:2〜3mのステンレ
ス管に導き（該スレンテス管は通常コイル状に形成され
ている）、該管内において還元反応を行わせてから螢光
検出器に導くものである。
かかる方法は一般にポストカラム法としてよく用いら
れてはいるが、コイル、すなわち、前記ステンレス管が
中空で長いので、該管内におけるピークの拡張によるピ
ークの広がりからの感度の低下を免れず、また、反応効
率にも問題があるのである。また、最近になって（イ）
クーロメトリーによる電気化学的還元法、（ロ）ZnCl2
−Zn（塩化亜鉛−亜鉛）リアクターによる還元法および
（ハ）PtO2−H2（酸化白金−水素）系での還元法等も高
感度なVK分析法として報告されているが、上記（イ）は
装置が高価であるばかりでなく電極の消耗も早くて経済
的でないこと、また同（ロ）はその前処理を含めて工程
が繁雑であり、操作性に難点があること、さらに同
（ハ）は水素ガスを使用するので危険性が高く、作業性
に問題があること等、それぞれに欠点がある。
れてはいるが、コイル、すなわち、前記ステンレス管が
中空で長いので、該管内におけるピークの拡張によるピ
ークの広がりからの感度の低下を免れず、また、反応効
率にも問題があるのである。また、最近になって（イ）
クーロメトリーによる電気化学的還元法、（ロ）ZnCl2
−Zn（塩化亜鉛−亜鉛）リアクターによる還元法および
（ハ）PtO2−H2（酸化白金−水素）系での還元法等も高
感度なVK分析法として報告されているが、上記（イ）は
装置が高価であるばかりでなく電極の消耗も早くて経済
的でないこと、また同（ロ）はその前処理を含めて工程
が繁雑であり、操作性に難点があること、さらに同
（ハ）は水素ガスを使用するので危険性が高く、作業性
に問題があること等、それぞれに欠点がある。
〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明はこのような状況に鑑みて案出されたものであ
って、操作性および経済性にも優れた上記従来公知のNa
BH4の還元法によるポストカラム法の改良に関し、当該
法におけるピークの拡散および／または還元反応の低効
率等によるVK検出の低感度を改善し、該感度を飛躍的に
向上させようとするものである。
って、操作性および経済性にも優れた上記従来公知のNa
BH4の還元法によるポストカラム法の改良に関し、当該
法におけるピークの拡散および／または還元反応の低効
率等によるVK検出の低感度を改善し、該感度を飛躍的に
向上させようとするものである。
本発明は上述した問題点を解決するために前記ポスト
カラムたるステンレス管（コイル）を内径３〜6mm、長
さ70〜150mmの筒管とし、該管の内部に孔径100〜200Å
の細孔とアミノプロピル基またはジエチルアミノエチル
基を有する10〜50μｍのガラス細粒からなる多孔性無機
担体を充填したものである。すなわち、本発明によれ
ば、両端が通液的に閉鎖された中空状の金属製またはプ
ラスチック製筒管であって、該筒管の内部に、孔径100
〜200Åの細孔とアミノプロピル基またはジエチルアミ
ノエチル基を有する10〜50μｍのガラス細粒からなる多
孔無機担体を充填したことを特徴とする液体クロマトグ
ラフィーによるビタミンＫ類定量用ベッドリアクターが
提供される。
カラムたるステンレス管（コイル）を内径３〜6mm、長
さ70〜150mmの筒管とし、該管の内部に孔径100〜200Å
の細孔とアミノプロピル基またはジエチルアミノエチル
基を有する10〜50μｍのガラス細粒からなる多孔性無機
担体を充填したものである。すなわち、本発明によれ
ば、両端が通液的に閉鎖された中空状の金属製またはプ
ラスチック製筒管であって、該筒管の内部に、孔径100
〜200Åの細孔とアミノプロピル基またはジエチルアミ
ノエチル基を有する10〜50μｍのガラス細粒からなる多
孔無機担体を充填したことを特徴とする液体クロマトグ
ラフィーによるビタミンＫ類定量用ベッドリアクターが
提供される。
本発明にかかるベッドリアクターによれば、液体クロ
マトグラフィーにより分離されたVKの溶出液が、該ベッ
ドリアクター内において還元剤と共に多孔性無機担体間
を通過し、該リアクター内にあっては両者が常に乱流下
に効率よく接触するので、VKの還元反応がきわめて効率
よく行われる。さらに、本発明ベッドリアクターを構成
する筒管は、その内径が比較的大きくて、長さが比較的
短いので、拡散によるピークの広がりを最小限に抑える
ことができる。従って、本発明ベッドリアクターを用い
ることによってVKの検出感度を従来のコイル状リアクタ
ー使用の場合に比較して数倍から数十倍にも向上させる
ことができる。
マトグラフィーにより分離されたVKの溶出液が、該ベッ
ドリアクター内において還元剤と共に多孔性無機担体間
を通過し、該リアクター内にあっては両者が常に乱流下
に効率よく接触するので、VKの還元反応がきわめて効率
よく行われる。さらに、本発明ベッドリアクターを構成
する筒管は、その内径が比較的大きくて、長さが比較的
短いので、拡散によるピークの広がりを最小限に抑える
ことができる。従って、本発明ベッドリアクターを用い
ることによってVKの検出感度を従来のコイル状リアクタ
ー使用の場合に比較して数倍から数十倍にも向上させる
ことができる。
次に本発明ベッドリアクターを添付図面により具体的
に詳述する。
に詳述する。
本発明ベッドリアクターは第１図に示すとおり両端が
通液的に閉鎖された中空状の筒管１であって、該筒管１
の内部に多孔性無機担体４が充填され、かつ、還元剤
（図示）せずが用時共存されるものである。
通液的に閉鎖された中空状の筒管１であって、該筒管１
の内部に多孔性無機担体４が充填され、かつ、還元剤
（図示）せずが用時共存されるものである。
筒管１はステンレス等の金属管またはテフロン（登録
商標）等のプラスチック等が好適に使用されるが、ガラ
ス管は耐圧性および耐衝撃性の点でやや難点があり好ま
しくない。該筒管１の大きさとしては内径:3〜6mm、長
さ:70〜150mmの範囲が適当である。特に内径4.6mm、長
さ100mmのステンレス管は液体クロマトグラフィー用カ
ラムとしてほぼ標準品的なものであるので、本寸法品の
利用は価格面および入手のし易さ等から有利である。筒
管１の内径が3mm未満の場合は、該筒内部への担体の充
填が困難であるばかりでなく、液体クロマトグラフィー
でのカラム溶出液の該筒管への送入に相当な圧力を要
し、装置への悪影響が懸念されるので好ましくない。ま
た、該筒管１の内径が6mmを越えると該筒管内に充填さ
れるべき多孔性無機担体が不必要に多くなって不経済で
あるばかりでなく、却ってVKの還元反応効率をも低下さ
せるのでこれまた好ましくない。一方、該筒管１の長さ
についても70mm未満の場合には該筒管内でのVKの効率的
還元反応を期待し得ず、また、長さが150mmを越えると
従来のコイル状リアクターにも見られたように拡散によ
るピークの広がりから検出感度の低下を招来する。とこ
ろで、該筒管１の内部には、前述したように使用時にお
いてはVK還元剤と共に多孔性無機担体４がほぼ満杯に充
填されている。VK還元剤としては水素化ホフ素ナトリウ
ム（NaBH4）、水素化ホウ素カリウム（KBH4）、あるい
は水素化ホウ素メチルアンモニウム、同エチルアンモニ
ウムもしくは同ブチルアンモニウム等の水素化ホウ素ア
ルキルアンモニウムから選ばれた１種以上が用いられる
が、価格的には前記水素化ホウ素ナトリウムが最も有利
である。この水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用
いる場合には、このものの0.025％エタノール溶液とし
て使用され、通常VKの液体クロマトグラフィーカラム溶
出液と混ぜ合わされてから当該ベッドリアクター内に導
入される。
商標）等のプラスチック等が好適に使用されるが、ガラ
ス管は耐圧性および耐衝撃性の点でやや難点があり好ま
しくない。該筒管１の大きさとしては内径:3〜6mm、長
さ:70〜150mmの範囲が適当である。特に内径4.6mm、長
さ100mmのステンレス管は液体クロマトグラフィー用カ
ラムとしてほぼ標準品的なものであるので、本寸法品の
利用は価格面および入手のし易さ等から有利である。筒
管１の内径が3mm未満の場合は、該筒内部への担体の充
填が困難であるばかりでなく、液体クロマトグラフィー
でのカラム溶出液の該筒管への送入に相当な圧力を要
し、装置への悪影響が懸念されるので好ましくない。ま
た、該筒管１の内径が6mmを越えると該筒管内に充填さ
れるべき多孔性無機担体が不必要に多くなって不経済で
あるばかりでなく、却ってVKの還元反応効率をも低下さ
せるのでこれまた好ましくない。一方、該筒管１の長さ
についても70mm未満の場合には該筒管内でのVKの効率的
還元反応を期待し得ず、また、長さが150mmを越えると
従来のコイル状リアクターにも見られたように拡散によ
るピークの広がりから検出感度の低下を招来する。とこ
ろで、該筒管１の内部には、前述したように使用時にお
いてはVK還元剤と共に多孔性無機担体４がほぼ満杯に充
填されている。VK還元剤としては水素化ホフ素ナトリウ
ム（NaBH4）、水素化ホウ素カリウム（KBH4）、あるい
は水素化ホウ素メチルアンモニウム、同エチルアンモニ
ウムもしくは同ブチルアンモニウム等の水素化ホウ素ア
ルキルアンモニウムから選ばれた１種以上が用いられる
が、価格的には前記水素化ホウ素ナトリウムが最も有利
である。この水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用
いる場合には、このものの0.025％エタノール溶液とし
て使用され、通常VKの液体クロマトグラフィーカラム溶
出液と混ぜ合わされてから当該ベッドリアクター内に導
入される。
また、前記多孔性無機担体４としては、孔径:100〜20
0Åの細孔を持ち、かつ、粒径が10〜50μｍ（約100〜50
0メッシュ）に調整されたガラス細粒〔Controlled−Por
e Glass（CPG）〕が使用され、特に該ガラス細粒が、そ
の表面にアミノプロピル基またはジエチルアミノエチル
基を化学的に結合された、いわゆる「AP−CPG」または
「DEAE−CPG」タイプとすることが必要である。このタ
イプの担体は理由は必ずしも明らかではないが前記還元
剤を活性化するので、本発明の使用目的上からきわめて
有利である。該AP−CPG、またDEAE−CPG等はカラム充填
剤として市販されており容易に入手可能である。該ガラ
ス細粒の粒径が10μｍ未満の場合にはカラム溶出液の該
リアクター内への送入、また送出に強い圧力を要し、結
果として当該装置への悪影響が懸念される。また、ガラ
ス細粒の粒径が50μｍを越えると、ピークの拡散、該リ
アクター内における反応効率の低下といった不都合を来
すので共に好ましくない。かかる多孔性無機担体４の前
記筒管内への充填は特別な装置を使用することなく、単
なるタッピングによる充填で充分である。
0Åの細孔を持ち、かつ、粒径が10〜50μｍ（約100〜50
0メッシュ）に調整されたガラス細粒〔Controlled−Por
e Glass（CPG）〕が使用され、特に該ガラス細粒が、そ
の表面にアミノプロピル基またはジエチルアミノエチル
基を化学的に結合された、いわゆる「AP−CPG」または
「DEAE−CPG」タイプとすることが必要である。このタ
イプの担体は理由は必ずしも明らかではないが前記還元
剤を活性化するので、本発明の使用目的上からきわめて
有利である。該AP−CPG、またDEAE−CPG等はカラム充填
剤として市販されており容易に入手可能である。該ガラ
ス細粒の粒径が10μｍ未満の場合にはカラム溶出液の該
リアクター内への送入、また送出に強い圧力を要し、結
果として当該装置への悪影響が懸念される。また、ガラ
ス細粒の粒径が50μｍを越えると、ピークの拡散、該リ
アクター内における反応効率の低下といった不都合を来
すので共に好ましくない。かかる多孔性無機担体４の前
記筒管内への充填は特別な装置を使用することなく、単
なるタッピングによる充填で充分である。
前記筒管１の両端部は、例えば焼結フィルター２のよ
うな通夜的に封鎖可能な部材により閉鎖されており、内
部の多孔性無機担体４を保持する。該焼結フィルター２
は前記筒管１の両端部に螺合されたナット状閉鎖部材３
の内部に固着されていて、該筒管１に対して着脱自在に
構成されている。前記閉鎖部材３には、通常図示するよ
うにさらに通液用の接続具５（一点鎖線で示す）が付設
されているが、もとよりこれは本発明装置にとって必須
のものではない。なお、該接続具５を装備する場合に
は、系内配管との接続をワンタッチで行えるものとする
のが有利であることはいうまでもない。
うな通夜的に封鎖可能な部材により閉鎖されており、内
部の多孔性無機担体４を保持する。該焼結フィルター２
は前記筒管１の両端部に螺合されたナット状閉鎖部材３
の内部に固着されていて、該筒管１に対して着脱自在に
構成されている。前記閉鎖部材３には、通常図示するよ
うにさらに通液用の接続具５（一点鎖線で示す）が付設
されているが、もとよりこれは本発明装置にとって必須
のものではない。なお、該接続具５を装備する場合に
は、系内配管との接続をワンタッチで行えるものとする
のが有利であることはいうまでもない。
ところで、本発明ベッドリアクターは前記従来技術に
おけるこの種装置、例えばコイル状リアクターと同一態
様に使用される。すなわち、液体クロマトグラフの後段
（下流）に接続され、該クロマトグラフィーのカラム溶
出液が該ベッドリアクター内に導入されるようにセット
されればよい。第２図はその実施態様の１例をブロック
図で示すものであるが、同図において破線枠で示す装置
Ａが公知の液体クロマトグラフである 本装置においてカラム15からのVK溶出液は紫外線吸収
検出器16を経て本ベットリアクター11内に導入され、該
リアクター11内において還元され、前述したとおり発螢
光体のハイドロキノン型となる。なお、同図においては
還元剤（例えばNaBH4のエタノール溶液〕を別の送出用
ポンプ12で前記VKカラム溶出液に混注する方式を図示し
ているが、該還元剤の作用が本方式に限定されることは
なく、要はVKカラム溶出液が本発明ベッドリアクター11
内において該還元剤と共存し、接触しさえすれば充分で
ある。
おけるこの種装置、例えばコイル状リアクターと同一態
様に使用される。すなわち、液体クロマトグラフの後段
（下流）に接続され、該クロマトグラフィーのカラム溶
出液が該ベッドリアクター内に導入されるようにセット
されればよい。第２図はその実施態様の１例をブロック
図で示すものであるが、同図において破線枠で示す装置
Ａが公知の液体クロマトグラフである 本装置においてカラム15からのVK溶出液は紫外線吸収
検出器16を経て本ベットリアクター11内に導入され、該
リアクター11内において還元され、前述したとおり発螢
光体のハイドロキノン型となる。なお、同図においては
還元剤（例えばNaBH4のエタノール溶液〕を別の送出用
ポンプ12で前記VKカラム溶出液に混注する方式を図示し
ているが、該還元剤の作用が本方式に限定されることは
なく、要はVKカラム溶出液が本発明ベッドリアクター11
内において該還元剤と共存し、接触しさえすれば充分で
ある。
このようにして該ベッドリアクター11内において還元
されたVKは発螢光体となるので、次段の螢光検出器13に
よりこれを検出、定量し、その実測値がレコーダー14に
よって記録されるものである。
されたVKは発螢光体となるので、次段の螢光検出器13に
よりこれを検出、定量し、その実測値がレコーダー14に
よって記録されるものである。
次に、本ベッドリアクターと公知のコイル状リアクタ
ー使用によるVK定量の実験例を記し、本発明ベッドリア
クターの優秀性を明らかにする （１）装 置 高速液体クロマトグラフィーシステムは、ポンプに島
津製作所製IC−6Aにエルマー製のオンラインデガッサー
ERC−3510を接続して使用し、試料注入器としてはウオ
ーターズWISP7108B型オートサンプラー、還元剤の送液
ポンプはEldex A−60−Ｓをサンヨー製SR−55N型冷蔵庫
の中で使用、リアクターとしては内径4.6mm、長さ100mm
のステンレスカラム（本発明品）と内径0.6mm、長さ3mm
のステンレスコイル（従来品）を準備し、前者のステン
レスカラムに各種の充填剤をタッピングで詰めて使用し
た。なお、検出器は日立製作所製Ｆ−1000型螢光検出器
を励起波長320nm、螢光波長430nmで使用した。さらにク
ロマトグラムの記録には島津製作所製Ｃ−R3Aを使用し
た。
ー使用によるVK定量の実験例を記し、本発明ベッドリア
クターの優秀性を明らかにする （１）装 置 高速液体クロマトグラフィーシステムは、ポンプに島
津製作所製IC−6Aにエルマー製のオンラインデガッサー
ERC−3510を接続して使用し、試料注入器としてはウオ
ーターズWISP7108B型オートサンプラー、還元剤の送液
ポンプはEldex A−60−Ｓをサンヨー製SR−55N型冷蔵庫
の中で使用、リアクターとしては内径4.6mm、長さ100mm
のステンレスカラム（本発明品）と内径0.6mm、長さ3mm
のステンレスコイル（従来品）を準備し、前者のステン
レスカラムに各種の充填剤をタッピングで詰めて使用し
た。なお、検出器は日立製作所製Ｆ−1000型螢光検出器
を励起波長320nm、螢光波長430nmで使用した。さらにク
ロマトグラムの記録には島津製作所製Ｃ−R3Aを使用し
た。
（２）試 薬 ビタミンK1とNaBH4は和光純薬製、またビタミンK2は
エーザイ製の「ケイツー注」（商品名）を使用し、KBH4
および各種水素化ホウ素アルキルアンモニウムは東京化
成製、メタノール、エタノールおよびアセトニトリル等
の溶媒は関東化学製のそれぞれ液体クロマトグラフィー
用のものを使用した。
エーザイ製の「ケイツー注」（商品名）を使用し、KBH4
および各種水素化ホウ素アルキルアンモニウムは東京化
成製、メタノール、エタノールおよびアセトニトリル等
の溶媒は関東化学製のそれぞれ液体クロマトグラフィー
用のものを使用した。
リアクターとしての充填剤は、Electro−Nuleonics製
の200〜400メッシュの多孔性ガラス細粒（CPG）、およ
びAP−CPG（アミノプロピル−CPG）、DEAE−CPG（ジエ
チルアミノエチル−CPG）を上記のステンレスカラムに
充填して使用した。なお、上記多孔性ガラス細粒の細孔
径は150Å前後である。また、比較例としてPolyscience
社製の10〜30μｍのガラス細粒（多孔性ではない）も同
時に使用した。高速液体クロマトグラフの分析カラムは
野村化学製のDevelosi150DS−Ｋ（4.6mmI.Dx15cm）を使
用した。
の200〜400メッシュの多孔性ガラス細粒（CPG）、およ
びAP−CPG（アミノプロピル−CPG）、DEAE−CPG（ジエ
チルアミノエチル−CPG）を上記のステンレスカラムに
充填して使用した。なお、上記多孔性ガラス細粒の細孔
径は150Å前後である。また、比較例としてPolyscience
社製の10〜30μｍのガラス細粒（多孔性ではない）も同
時に使用した。高速液体クロマトグラフの分析カラムは
野村化学製のDevelosi150DS−Ｋ（4.6mmI.Dx15cm）を使
用した。
ビタミンK1、ビタミンK2はエタノールで100μg/ml程
度の標準溶液を冷蔵庫に保存しておき、用時エタノール
で適当な濃度に希釈して使用した。さらに、前記還元剤
は使用時0.025％〜0.200％の濃度範囲のエタノール溶液
として使用した。
度の標準溶液を冷蔵庫に保存しておき、用時エタノール
で適当な濃度に希釈して使用した。さらに、前記還元剤
は使用時0.025％〜0.200％の濃度範囲のエタノール溶液
として使用した。
（３）液体クロマトグラフィー条件 移動相はメタノール／アセトニトリル（70/30）およ
びエタノール／水（92.5/7.5）の２つの条件を流速1.0m
l/分で流し、還元剤は送液ポンプ、溶媒瓶とも冷蔵庫内
にセットし、窒素ガスを常時流しながら0.4ml/分で流し
た。この場合の溶出時間は前者の移動相条件でビタミン
K2が9.3分前後、ビタミンK1が18.1前後、そして、後者
の移動相条件でビタミンK2が7.5分前後、ビタミンK1が1
2分前後であった。なお、標準溶液での検出感度の実験
は注入量30μｌで行い、血清等の生体試料の処理液は50
μｌ注入して分析を行った。
びエタノール／水（92.5/7.5）の２つの条件を流速1.0m
l/分で流し、還元剤は送液ポンプ、溶媒瓶とも冷蔵庫内
にセットし、窒素ガスを常時流しながら0.4ml/分で流し
た。この場合の溶出時間は前者の移動相条件でビタミン
K2が9.3分前後、ビタミンK1が18.1前後、そして、後者
の移動相条件でビタミンK2が7.5分前後、ビタミンK1が1
2分前後であった。なお、標準溶液での検出感度の実験
は注入量30μｌで行い、血清等の生体試料の処理液は50
μｌ注入して分析を行った。
（４）結 果 i.各種リアクターによる検出感度の比較 還元剤に0.025％のNaBH4を使用し、各種リアクターで
ビタミンK1を73ng/ml、ビタミンK2を50ng/mlの溶液を30
μl/絶対量にしてビタミンK1が2190pg、ビタミンK2が15
00pg）注入した場合のAP−CPGのVKのピーク高さ（イン
テグレーターのカウント数）を1.00とした場合の各種リ
アクターでの値を表−１示す。また、そのクロマトグラ
ムを第３図に示す。なお、この場合の移動相はメタノー
ル／アセトニトリル（70/30）である。
ビタミンK1を73ng/ml、ビタミンK2を50ng/mlの溶液を30
μl/絶対量にしてビタミンK1が2190pg、ビタミンK2が15
00pg）注入した場合のAP−CPGのVKのピーク高さ（イン
テグレーターのカウント数）を1.00とした場合の各種リ
アクターでの値を表−１示す。また、そのクロマトグラ
ムを第３図に示す。なお、この場合の移動相はメタノー
ル／アセトニトリル（70/30）である。
上記結果からも明らかなように本発明ベッドリアクタ
ー、特にAP−CPGタイプは従来のコイル状リアクターに
比べて約20倍も感度が優れている。単なるCPGタイプで
も５倍程度の感度上昇が得られる。
ー、特にAP−CPGタイプは従来のコイル状リアクターに
比べて約20倍も感度が優れている。単なるCPGタイプで
も５倍程度の感度上昇が得られる。
次いで、移動相にエタノール／水（92.5/7.5）を使用
して同様に測定したところ表−２に示すように上記とほ
ぼ同等の結果を得た。
して同様に測定したところ表−２に示すように上記とほ
ぼ同等の結果を得た。
ii.還元剤の種類による比較 ベッドリアクターの充填剤をAP−CPGとDEAE−CPGと
し、還元剤としてNaBH4、KBH4および合成化学分野にお
ける非水溶媒系還元剤として開発、利用されている各種
水素化ホウ素アルキルアンモニウムをエタノールに溶解
して使用し、それぞれVKの還元効率の比較を行った。表
−３は移動相条件がメタノール／アセトニトリル（70/3
0）の場合であり、表−４はエタノール／水（92.5/7.
5）系の場合の結果である。なお、数値はそれぞれ0.025
％NaBH4の場合のピーク高さのカウントを1.00とした場
合の相対比で示した。
し、還元剤としてNaBH4、KBH4および合成化学分野にお
ける非水溶媒系還元剤として開発、利用されている各種
水素化ホウ素アルキルアンモニウムをエタノールに溶解
して使用し、それぞれVKの還元効率の比較を行った。表
−３は移動相条件がメタノール／アセトニトリル（70/3
0）の場合であり、表−４はエタノール／水（92.5/7.
5）系の場合の結果である。なお、数値はそれぞれ0.025
％NaBH4の場合のピーク高さのカウントを1.00とした場
合の相対比で示した。
なお上表中、 Me4NBH4は水素化ホウ素メチルアンモニウムを Et4は、水素化ホウ素エチルアンモニウムを Bu4NBH4は水素化ホウ素ブチルアンモニウムを それぞれ表わす。
表−３および同４の結果からいずれの移動相条件でも
還元剤の種類による還元効率に大きな差はないことが分
かる。しかしながら、還元剤の使用量とそれらの価格か
らNaBH4が最も有利である。
還元剤の種類による還元効率に大きな差はないことが分
かる。しかしながら、還元剤の使用量とそれらの価格か
らNaBH4が最も有利である。
以上詳述したとおり本発明ベッドリアクターを使用す
れば、液体クロマトグラフィーとの組み合わせによりVK
をきわめて高感度に検出、定量することができる。従っ
て従来特殊な装置、また高価な装置でしか測定すること
ができなかったVKを特異的、かつ、高感度に検出するこ
とができる。以上の結果、きわめて少量の生体試料から
でもVKの正確な定量が可能となり、この分野における本
発明の技術的意義にはきわめて大きいものがある。
れば、液体クロマトグラフィーとの組み合わせによりVK
をきわめて高感度に検出、定量することができる。従っ
て従来特殊な装置、また高価な装置でしか測定すること
ができなかったVKを特異的、かつ、高感度に検出するこ
とができる。以上の結果、きわめて少量の生体試料から
でもVKの正確な定量が可能となり、この分野における本
発明の技術的意義にはきわめて大きいものがある。
第１図は本発明ベッドリアクターを例示した一部切欠縦
断面側面図、第２図は本発明ベッドリアクターを液体ク
ロマトグラフィーに接続したときの使用態様の１例を示
すブロック図、第３図はVKの液体クロマトグラムであ
り、ａ）は従来公知のコイル状リアクターを使用した場
合であり、ｂ）は本発明のベッドリアクターに多孔性無
機担体としてCPGを充填した場合であり、さらにｃ）は
同じくAP−CPGを充填した場合である。 １……筒管、２……焼結フィルター ３……閉鎖部材、４……多孔性無機担体
断面側面図、第２図は本発明ベッドリアクターを液体ク
ロマトグラフィーに接続したときの使用態様の１例を示
すブロック図、第３図はVKの液体クロマトグラムであ
り、ａ）は従来公知のコイル状リアクターを使用した場
合であり、ｂ）は本発明のベッドリアクターに多孔性無
機担体としてCPGを充填した場合であり、さらにｃ）は
同じくAP−CPGを充填した場合である。 １……筒管、２……焼結フィルター ３……閉鎖部材、４……多孔性無機担体
Claims (2)
- 【請求項１】両端が通液的に閉鎖された中空状の金属製
またはプラスチック製筒管であって、該筒管の内部に、
孔径100〜200Åの細孔とアミノプロピル基またはジエチ
ルアミノエチル基を有する10〜50μｍのガラス細粒から
なる多孔性無機担体を充填したことを特徴とする液体ク
ロマトグラフィーによるビタミンＫ類定量用ベッドリア
クター。 - 【請求項２】前記金属性筒管が内径３〜6mm、長さ70〜1
50mmのステンレス管である特許請求の範囲第（１）項記
載のベッドリアクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62258858A JP2526074B2 (ja) | 1987-10-13 | 1987-10-13 | 液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ― |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62258858A JP2526074B2 (ja) | 1987-10-13 | 1987-10-13 | 液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ― |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01100457A JPH01100457A (ja) | 1989-04-18 |
| JP2526074B2 true JP2526074B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=17326012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62258858A Expired - Lifetime JP2526074B2 (ja) | 1987-10-13 | 1987-10-13 | 液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ― |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2526074B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998036271A1 (fr) * | 1997-02-17 | 1998-08-20 | Hitachi, Ltd. | Procede d'analyse chromatographique d'un liquide |
| CN104458990B (zh) * | 2014-12-11 | 2017-01-18 | 江苏艾兰得营养品有限公司 | 一种维生素k2（mk‑7）含量的测定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6415653A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-19 | Shimadzu Corp | Vitamin k analyser |
-
1987
- 1987-10-13 JP JP62258858A patent/JP2526074B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01100457A (ja) | 1989-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5149661A (en) | Fluid analysis with particulate reagent suspension | |
| MacDonald et al. | Flow injection and liquid chromatography detector for amino acids based on a post-column reaction with luminol | |
| JP5081293B2 (ja) | ガス−アシスト抑圧クロマトグラフィー法および装置 | |
| US20090289009A1 (en) | Ion chromatography systems with flow-delay eluent recycle | |
| Cassella et al. | Flow injection determination of cobalt after its sorption onto polyurethane foam loaded with 2-(2-thiazolylazo)-p-cresol (TAC) | |
| Einosuke et al. | A semi-automated measurement of urinary catecholamines using high-speed ion-exchange column chromatography | |
| JP2009509141A (ja) | サンプル前処理を行うと共に単一のポンプを用いるｉｃシステム | |
| US4672042A (en) | Method of and apparatus for chromatographic analysis | |
| Frei et al. | Selective sample handling and detection in high-performance liquid chromatography | |
| Miró et al. | Determination of ultratraces of nitrite by solid-phase preconcentration using a novel flow-through spectrophotometric optrode | |
| Cox et al. | Separation of mixtures of cations by Donnan dialysis | |
| Wheeler et al. | Rapid determination of trace amounts of selenium (IV), nitrite, and nitrate by high-pressure liquid chromatography using 2, 3-diaminonaphthalene | |
| JP2526074B2 (ja) | 液体クロマトグラフィ―によるビタミンｋ類定量用ベッドリアクタ― | |
| Dasgupta | Postcolumn techniques: A critical perspective for ion chromatography | |
| Ramasamy et al. | Repetitive determinations of sulfur dioxide gas in air samples by flow injection and chemical reaction at a gas-liquid interface | |
| Tan et al. | Simultaneous determination of arsenic (III) and arsenic (V) in metallurgical processing media by ion chromatography with electrochemical and conductivity detectors | |
| CN1902483A (zh) | 在样品检测和/或分析之前除去气体的设备和方法 | |
| Trojanowicz et al. | Flow injection sample processing in atomic absorption spectrometry | |
| JP3422219B2 (ja) | セレンの分析方法及びセレンの分析装置 | |
| Dieker et al. | Study of a glassy carbon electrode in amperometric detection using dc, normal and differential pulse techniques | |
| Dou et al. | Determination of inorganic anions by flow injection analysis and high-performance liquid chromatography combined with photolytic-electrochemical detection | |
| Böhme et al. | Trace analysis of bromate and bromide with ion chromatography on coated reversed phase materials | |
| De Jong et al. | Postchromatographic reaction detection | |
| Konishi et al. | High-performance packed glass-lined stainless steel capillary column for microcolumn liquid chromatography | |
| Romanus et al. | Application of adsorptive stripping voltammetry (AdSV) for the analysis of trace metals in brine: Part 2. Development and evaluation of a flow injection system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080531 Year of fee payment: 12 |