JP2025041218A - Ｌｉｍｃｈ１を含むバイオマーカー - Google Patents

Abstract

【課題】新規バイオマーカー及びその用途の提供。
【解決手段】本発明は、ＬＩＭＣＨ１又はＬＩＭＣＨ１をコードする遺伝子を含む、妊娠高血圧腎症のバイオマーカーに関する。
【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 令和５年８月１７日 第３１回日本胎盤学会学術集会演題採択結果にて発表 令和５年８月２３日 第４３回日本妊娠高血圧学会学術集会演題採択結果にて発表

本発明は広く、ＬＩＭＣＨ１又はそれを標的とする物質、それらの用途、特にＬＩＭＣＨ１を含むバイオマーカー等に関する。

妊娠高血圧腎症（Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）は妊婦の５～１０％が発症する重篤な妊娠合併症であり、母体死亡の主要な原因となっている。世界では毎年５万近くの母体と約５０万の児が妊娠高血圧腎症により命を落としている。

妊娠高血圧腎症の発症により子宮内胎児発育遅延が引き起こされ、また、治療的早期娩出が超低出生体重児・新生児死亡の要因となるため、妊娠高血圧腎症は臨床的に大きな問題となっている。

妊娠高血圧腎症に対しては、降圧剤による対症療法が行われるが、根本的治療は妊娠の終了、すなわち胎児胎盤の娩出に限られる。妊娠高血圧腎症については安全に妊娠が継続できる効果的な治療方法が存在しないことが問題である。

妊娠高血圧腎症の発症を予測する指標として、ｓＦｌｔ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ １）／ＰｌＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が知られている。ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比の意義は確立されており、同比が３８以下の場合、１週間以内のＰＥ発症の可能性は低いとされ、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅが高い、と診断され、ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が高いほど、肺水腫等の重症な合併症を短期間で発症する可能性が高いと報告されている（Ｈａｒａｌｄ Ｚｅｉｓｌｅｒら、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓＦｌｔ－１：ＰｌＧＦ Ｒａｔｉｏ ｉｎ Ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ”、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１６ Ｊａｎ ７；３７４（１）：１３－２２．、Ｓｔｅｆａｎ Ｖｅｒｌｏｈｒｅｎら、“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ”、Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． ２０２２ Ｍａｒ；２７：４２－５０．）

Ｈａｒａｌｄ Ｚｅｉｓｌｅｒら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２０１６ Ｓｔｅｆａｎ Ｖｅｒｌｏｈｒｅｎら、Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ， ２０２２

妊娠高血圧腎症は母児の双方に重篤な合併症を引き起こす妊娠合併症であるが、妊婦を安全な妊娠の継続が可能な状態にしつつ、これを治療する方法は未だ存在しない。

本発明は、妊娠高血圧腎症の診断のための新規指標や治療のための新規標的等を提供することを目的とする。

本発明者は、妊娠高血圧腎症患者に由来する血清中エクソソームの機能解析を通じてＬＩＭＣＨ１を同定し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］
ＬＩＭＣＨ１（ＬＩＭ ａｎｄ ｃａｌｐｏｎｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ １）又はＬＩＭＣＨ１をコードする遺伝子を含む、妊娠高血圧腎症のバイオマーカー。
［２］
妊娠高血圧腎症が早発型又は遅発型である、［１］に記載のバイオマーカー。
［３］
妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象由来の検体を解析する方法であって、当該検体において、ＬＩＭＣＨ１又はそれをコードする遺伝子の有無を決定する工程を含む、方法。
［４］
ＬＩＭＣＨ１が存在している検体は、妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象に由来すると決定される、［３］に記載の方法。
［５］
検体がエクソソームを含む、［４］に記載の方法。
［６］
ＬＩＭＣＨ１がエクソソーム上で発現している、［３］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
エクソソームを含む検体が、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、羊水、胎盤組織、及び細胞から成る群から選択される生物学的材料に由来する、［６］に記載の方法。
［８］
ｓＦｌｔ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ－１）の有無を決定する工程を更に含む、［３］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
ｓＦｌｔ－１が胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）に対する比率として測定される、［８］に記載の方法。
［１０］
妊娠高血圧腎症の治療又は予防のための医薬組成物であって、ＬＩＭＣＨ１又はそれをコードする遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含む、医薬組成物。

本発明者らにより初めて、ＬＩＭＣＨ１が妊娠高血圧腎症の発生機序に関与することが明らかとなった。したがって、本発明によれば、ＬＩＭＣＨ１を指標とする妊娠高血圧腎症の新規診断手法や、ＬＩＭＣＨ１を標的とする妊娠高血圧腎症の新規治療方法の提供が可能となる。

胎盤由来のＬＩＭＣＨ１搭載エクソソームが惹起する血管内皮細胞間接着の破綻は、血管透過性亢進を通して肺水腫や可逆性後頭葉白質脳症と関連している可能性があり、新たな標的となる可能が期待される。

プロテオミクス解析により妊娠高血圧腎症関連エクソソームタンパク質としてＬＩＭＣＨ１を同定する手順の一部（左側）と、ＥＶプロテオミクスデータにおけるノーマライズ後のＬＩＭＣＨ１発現量（右側）とを示す。 ＬＩＭＣＨ１の発現を胎盤免疫組織染色にて検証した結果を示す。 胎盤免疫組織染色の結果を更にＨＡＬＯ ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した結果を示す。青（１）：陰性；黄色（２）：弱陽性；オレンジ（３）：中陽性；赤（４）：強陽性。 染色強度を定量化した結果を示す。 ２０％酸素及び１％酸素（低酸素）下で培養したＪＡＲ細胞におけるＬＩＭＣＨ１発現を経時的に解析した結果を示す。 ＬＩＭＣＨ１過剰発現ＪＡＲ由来エクソソームを添加したＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の細胞増殖能を解析した結果を示す。 ＬＩＭＣＨ１過剰発現ＪＡＲ由来エクソソームを添加したＨＵＶＥＣを用いたＦＩＴＣデキストラン透過性アッセイの結果を示す。 ＬＩＭＣＨ１搭載エクソソームに暴露したＨＵＶＥＣにおけるＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の結果を示す。 ＬＩＭＣＨ１搭載エクソソームに暴露したＨＵＶＥＣのＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）解析の結果を示す。

以下、本発明の実施形態又は実施態様について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

バイオマーカー
第１の実施形態において、本発明は、ＬＩＭおよびカルポニン相同ドメイン含有タンパク質１（ＬＩＭ ａｎｄ ｃａｌｐｏｎｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ １；ＬＩＭＣＨ１）を含む、妊娠高血圧腎症を診断するためのバイオマーカーを提供する。「バイオマーカー」とは、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され、評価される特性を意味し、本明細書では、かかる特性を有するタンパク質、遺伝子等の生体分子を意味する。

一実施態様において、バイオマーカーはＬＩＭＣＨ１から成る。

ＬＩＭＣＨ１は、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ－ＩＩ）活性を制御するアクチンストレスファイバー関連タンパク質として同定された（Ｙｕ－Ｈｕｎｇ Ｌｉｎら、“ＬＩＭＣＨ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｎｏｎｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｓｉｎ－ＩＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”， Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１７ Ａｐｒ １５； ２８（８）： １０５４‐１０６５）。特に断らない限り、ＬＩＭＣＨ１とはタンパク質を意味し、それをコードする遺伝子をＬＩＭＣＨ１遺伝子と称する。

ヒトＬＩＭＣＨ１の例として、配列番号１に示す１０５７アミノ酸から成るタンパク質がある。配列番号１に示すタンパク質をコードする塩基配列は配列番号２に記載のものである。本配列は、我々が過剰発現に使用したｉｓｏｆｏｒｍ ｂであり、他にもバリアントが２１種類存在するが、そのすべてを本発明は網羅する。

ＬＩＭＣＨ１は、妊娠高血圧腎症の診断の指標として、あるいはその標的として使用可能である限り、全長でなくても、その断片、あるいはそれらをコードする核酸、それらに相補的な核酸又はそれらの転写産物であってもよい。

ＬＩＭＣＨ１は、妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象由来の任意の生物学的材料中で検出することができる。生物学的材料は特に限定されないが、その例として、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、羊水、胎盤組織、及び細胞等が挙げられる。ＬＩＭＣＨ１の検出には公知の手段を用いることができる。具体的には、ＬＩＭＣＨ１又はその断片、あるいは複合体を認識する抗体を用いてＥＬＩＳＡ法等の免疫学的手法で検出する方法、試料からＬＩＭＣＨ１又はその断片、あるいは複合体を単離し、直接又は必要に応じ、酵素等で切断し、シーケンサーを利用して検出する方法、質量分析によりＬＩＭＣＨ１又はその断片、あるいは複合体を検出する方法が挙げられる。ＬＩＭＣＨ１断片の測定に関しては、ＬＩＭＣＨ１断片をそれぞれ特異的に認識する抗体によるＥＬＩＳＡ法や、液体クロマトグラフィー質量分析法によって定量測定ができる。

ＬＩＭＣＨ１をコードする核酸を検出する場合、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの転写産物を測定してもよい。これらの測定としては特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、分光光度法、蛍光光度法等が挙げられる。

妊娠高血圧腎症は、妊娠２０週以降に高血圧かつ尿蛋白、もしくは臓器障害により診断される。妊娠高血圧腎症は早発型又は遅発型に大別され、３４週未満の発症が早発型（ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ（Ｅｏ））、３４週以降が遅発型（ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ）とされる。両者の発症機序は互いに異なる可能性が示唆されている。Ｅｏはより重症であり、Ｅｏ関連母体死亡率は正常妊娠の１０倍にも及び、さらに近年、Ｅｏ－ＰＥは増加傾向である。

本明細書で使用する場合、「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖（ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖）のみならず、転写後に細胞内で修飾を受けたＲＮＡ鎖を意味する。転写産物としてのＲＮＡ鎖は広く、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に加え、タンパク質等に翻訳されないノンコーティングＲＮＡ、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を包含する。これらのＲＮＡ鎖は、転写後、細胞内でプロセッシングされたものであってもよい。

本発明においては、対象の疾患を高精度に診断するために、妊娠高血圧腎症を検出するための別の指標を用いることもできる。例えば、ｓＦｌｔ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ－１）又はその断片、あるいはそれらをコードする核酸、それらに相補的な核酸又はそれらの転写産物をＬＩＭＣＨ１と併用して妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象由来の検体を解析することもできる。

ｓＦｌｔ－１は、胎盤形成に関わる血管新生因子ＰｌＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：胎盤増殖因子）の阻害因子であり、これらは妊娠高血圧腎症の病態形成に関与している。ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比はＰＥの発症を予測する指標として公知である。

ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が３８以下の場合、１週間以内のＰＥ発症の可能性は低いとされ、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅが高い、と診断され得る。ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が高いほど、肺水腫等の重症な合併症を短期間で発症する可能性があると診断され得る。

検出用キット
第２の実施形態において、本発明は、ＬＩＭＣＨ１を含む、妊娠高血圧腎症を診断するためのバイオマーカーを検出するためのキットを提供する。

本発明のキットには、バイオマーカーの存在又はその発現量を測定するための試薬を含む。例えば、免疫測定法によりバイオマーカーの発現量を測定する場合には、各マーカーに対する抗体が試薬として使用される。また、必要に応じて、被検者に由来する体液の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体又はその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質などもキットに含めることができる。希釈液としては、生理食塩水や、界面活性剤、緩衝液などに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などが挙げられる。

一実施態様において、ＬＩＭＣＨ１の存在又はその発現量を測定するための試薬は抗ＬＩＭＣＨ１抗体である。

抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように成型した素材に、抗体又はそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。固相化相の形状としてはチューブ、カップ、ビーズ、プレート、スティック等が挙げられ、その素材としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体を固相化する方法としては、物理的方法と化学的方法、あるいはこれらを併用する方法など、公知の方法が挙げられる。

反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と被検動物に由来する体液中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝液、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。

標識された二次抗体又はその抗体断片としては、バイオマーカーがコードに対する抗体を認識する抗体又はその抗体断片に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ等の標識用酵素をラベルしたもの、緩衝液、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質、防腐剤等を混合したものを用いることができる。

標識体の検出用試薬としては、前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する場合には、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミン等の吸光度測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール等の発光基質が挙げられ、アルカリホスファターゼを使用する場合には、４－ニトロフェニルフォスフェート等の吸光度測定用基質、４－メチルウンベリフェリルフォスフェート等の蛍光基質等が挙げられる。

また、ＰＣＲ法によりバイオマーカーの発現量を測定する場合、例えば、バイオマーカーの一部又は全体を特異的に増幅することが可能なプライマーをキットに含めることができる。また、必要に応じて、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、反応緩衝液等を含めてもよい。リアルタイムＰＣＲの場合には、蛍光試薬等も含まれる。

本発明のキットには、使用方法等を示す添付文書を適宜含めることもできる。また、本発明のキットは広く、バイオマーカーの検出に使用される装置等を含んでもよい。

解析方法
第３の実施形態において、本発明は、妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象由来の検体を解析する方法を提供する。本発明の方法は、臨床検査技師がｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患に関する検査情報を評価する際に使用され得る。したがって、本発明の方法は、直接的又は間接的に、医師が妊娠高血圧腎症を適切に診断又は治療するために使用することもできる。

本発明の検出方法は、対象由来の検体において、１又は複数のバイオマーカーを検出又は定量する工程を含む。

一実施態様において、バイオマーカーを検出又は定量する工程は、ＬＩＭＣＨ１又はそれをコードする遺伝子の有無を決定する工程を含む。

本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトや非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、その他の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）を含む、任意の脊椎動物を意味する。実施形態によって、対象はヒト又はヒト以外の動物であってよい。実施形態によって、対象は、妊娠高血圧腎症を発病するリスクのある患者又は既にこのような疾患を発病している患者であってよい。

本明細書で使用する場合、「検体」は、広く、ＬＩＭＣＨ１などの標的を含有すると考えられる生物学的材料を意味する。検体を得るために、任意の細胞、組織又は体液が利用され得る。そのような細胞、組織及び体液は、生検や剖検サンプルなどの組織の切片、組織学の目的のために採取された凍結切片、（全血などの）血液、血漿、血清、赤血球、血小板、痰、便、涙、粘液、唾液、婦人科学的な液体、羊水、尿、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、間質液、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻汁、滑液、帯下液などを含み得る。細胞及び組織は、リンパ液、腹水、尿、腹腔液、脳脊髄液等を含んでもよい。検体は対象由来の生物学的材料を培養したものでもよい。目的に応じて試料から標的タンパク質等の単離や精製が行われることもある。

一実施態様において、検体は細胞外小胞、好ましくはエクソソームを含む。

細胞外小胞やエクソソームは、超遠心分離法、密度勾配超遠心法（ＤＧＵＣ）、共沈殿法、限外ろ過法、イムノアフィニティによる精製法、サイズ排除クロマトグラフィー精製法、マイクロ流体分離技術等の公知の方法により検体から単離される。細胞外小胞やエクソソームを含む検体は、例えば、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、羊水、胎盤組織、及び細胞から成る群から選択される。

一実施態様において、ＬＩＭＣＨ１はエクソソーム上で発現している。

対象から採取された検体は、バイオマーカーの検出を行うに際し、適宜必要とされる前処理を行うことができる。例えば、検体は適宜希釈して用いることが好ましい。希釈に用いる溶液は、バイオマーカーの検出に影響を与えないものであれば特に限定されない。

試料において、バイオマーカーが検出されるか、あるいはその濃度が健常者との比較で高い場合に、対象が妊娠高血圧腎症に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定することができる。

スクリーニング方法
第４の実施形態において、本発明は妊娠高血圧腎症を治療又は予防するための医薬をスクリーニングするための方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＬＩＭＣＨ１又はその断片、あるいはそれらをコードする核酸、それらに相補的な核酸又はそれらの転写産物の発現を阻害する物質を医薬の候補物質として選定する工程を含んでもよい。

本発明のスクリーニング方法により得られた医薬は、所望の効果、特にＬＩＭＣＨ１発現阻害効果、延いては妊娠高血圧腎症を治療又は予防する効果を発揮する限り、その投与経路、投与量、用法、剤形などは特に限定されない。

医薬組成物
第５の実施形態において、本発明は妊娠高血圧腎症の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＬＩＭＣＨ１又はその断片、あるいはそれらをコードする核酸、それらに相補的な核酸又はそれらの転写産物の発現を抑制する物質を有効成分として含む。

医薬組成物は、妊娠高血圧腎症を治療又は予防する効果を発揮する限り、その投与経路、投与量、用法、剤形などは特に限定されない。

一実施態様において、有効成分は抗ＬＩＭＣＨ１抗体である。

以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜被検体とサンプル収集＞
書面によるインフォームドコンセントを提供した女性のうち、２０１４年から２０２２年に当院で分娩した早発型妊娠高血圧腎症（ＰＥ）女性７人のＰＥ発症後の血清と、のちにＰＥを発症しなかった女性９人の妊娠週数をそろえた血清を使用した。血清は３，０００ｒｐｍ（５００ｇ）、４℃、１０分間遠心分離後に上清を回収し、使用するまで－８０℃で保管した。

被検体の情報を表１に示す。

＜細胞外小胞（ＥＶｓ）の単離＞
各サンプル１ｍｌを１０，０００ｇ、４０分、４℃にて遠心分離した。上清にＤ－ＰＢＳを追加し０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ １３ｍｍ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、ＭＬＳ５０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）を用いて、１１０，０００ｇ、４℃、７０分で超遠心分離を行った。

上清を破棄し、Ｄ－ＰＢＳを追加してＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ Ａｌｂｕｍｉｎ／ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ． Ｉｎｃ， ＵＳＡ）を用いてアルブミンやＩｇＧを除去した。さらにＤ－ＰＢＳを追加し、１１０，０００ｇ、４℃、７０分で超遠心分離を追加し、ｓｍａｌｌ ＥＶｓを単離した。

＜ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ＞
Ｓｍａｌｌ ＥＶｓはＥａｓｙＰｅｐ（登録商標⁾Ｍｉｎｉ ＭＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）を用いてペプチド化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに進んだ。

ペプチドの分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏ．， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を組み合わせ、ナノ高性能ＬＣキャピラリーカラム（内径１５０ｍｍ×７５μｍ）（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用してナノエレクトロスプレーイオン源を介してＬＣ－ＭＳで行った。

逆相クロマトグラフィーは、溶媒Ａ（０．１％ギ酸含有２％アセトニトリル）と溶媒Ｂ（０．１％ギ酸含有９５％アセトニトリル）のリニアグラジエント（０分、５％Ｂ；１００分、４０％Ｂ）で、推定流速３００ｎｌ／ｍｉｎで行った。ＭＳ／ＭＳ分析の前に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００から１６００のプリカーサーイオンスキャンを行った。ＭＳ／ＭＳは、四重極を用いた１．６ｍ／ｚの分離幅、規格化衝突エネルギー３５％の高エネルギーＣトラップ解離フラグメンテーション、イオントラップでのラピッドスキャンＭＳ分析を用いて行った。ＭＳ２では電荷状態２～６の前駆体のみがサンプリングされた。動的排除時間は１５秒に設定され、許容誤差は１０ｐｐｍ （ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）に設定した。装置は３秒サイクルのトップスピードモードで実行した。

＜プロテオミクスデータ解析＞
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．４， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）単独、またはＭＡＳＣＯＴ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．７．０， Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）を組み合わせてローデータを処理し、タンパク質を同定した。ペプチドとタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ（２０２１＿０２）データベースを参照し、前駆体質量の許容誤差を１０ｐｐｍ、フラグメントイオン質量の許容誤差を０．８Ｄａとして同定した。固定修飾はシステインのカルバミドメチル化、可変修飾はメチオニンの酸化とした。トリプシンによる２回のミス切断を許容した。

早発型妊娠高血圧腎症（ＰＥ）女性７人と、ＰＥを発症しなかった女性９人との合計１６人のうち、８例以上で検出された３５６タンパク質を対象に解析し、得られた定量値を対数化しＱｕａｎｔｉｌｅ法で補正した。９例以上で検出されなかったタンパク質は除外された。

ＰＥ患者が２群に分かれたため、コントロールとの比較をｃｌｕｓｔｅｒ１とｃｌｕｓｔｅｒ２に分けて施行した。ｃｌｕｓｔｅｒ１とｃｌｕｓｔｅｒ２の間で重複する７６タンパク質をＰＥ関連ＥＶタンパク質として選択した。

ＰＥ関連ＥＶタンパク質として選択されたＰＥ患者血清ＥＶ中で発現が上昇していたタンパク質７６個のうち、２つのＧＥＯデータセット（ＧＳＥ１１４６９１とＧＳＥ１４８２４１：胎盤のＲＮＡ－ｓｅｑ）においてもＰＥ胎盤で発現が上昇していたＬＩＭＣＨ１を選択した（図１左）。ＥＶプロテオミクスデータにおけるノーマライズ後のＬＩＭＣＨ１発現量をコントロールとの比較でグラフに示した（図１右）。

＜免疫組織化学染色＞
ＬＩＭＣＨ１の発現を胎盤免疫組織染色にて検証した。血清プロテオミクス解析の対象となったＰＥ７人の帝王切開時の胎盤と、ＰＥのない人工早産となった５人の帝王切開時の胎盤を対象とした。パラフィン切片を脱パラフィンし、電子レンジを用いて１０ｍＭクエン酸緩衝液にて抗原の賦活化を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素／メタノール３０分でブロックした。１０％ヤギ血清で３０分処理することによりブロッキングし、抗ＬＩＭＣＨ１抗体（ａｂ９６１７８； Ａｂｃａｍ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を１／２００希釈し添加して、４℃で１晩処理した。ＰＢＳで洗浄後、ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｒ）キット（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を用いて処理し、可視化はジアミノベンジジン（ＤＡＢ： Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ）により行い、マイヤーヘマトキシリン溶液（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）で対比染色した。画像解析はＨＡＬＯ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ， Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ， ＮＭ， ＵＳＡ）を用いて施行した。

免疫染色の結果を図２に示す。免疫組織染色の結果は、ＬＩＭＣＨ１が主に細胞性栄養膜細胞（Ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）で発現することを示している。

ＨＡＬＯ ｓｏｆｔｗａｒｅによる解析を図３に示す。青（１）が陰性、黄色（２）が弱陽性、オレンジ（３）が中陽性、赤（４）が強陽性であり、Ｈ－ｓｃｏｒｅは１×弱陽性細胞の割合（％）＋２×中陽性細胞の割合（％）＋３×強陽性細胞の割合（％）で計算した。

染色強度を定量化した結果を図４に示す。ＰＥ胎盤では正常胎盤に比して有意にＨ－ｓｃｏｒｅが高かった（ｐ＜０．０５）。

続いて、絨毛癌培養細胞株であるＪＡＲ細胞におけるＬＩＭＣＨ１発現を確認した。２０％酸素及び１％酸素（低酸素）下に、８時間・２４時間・４８時間・７２時間ＪＡＲ細胞を培養した後、ＲＮＡを抽出し逆転写を行い定量ＰＣＲで内部標準にＧＡＰＤＨをおいて２０％酸素と１％酸素によるＬＩＭＣＨ１発現の変化を調べた。ＱＩＡｚｏｌとｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。結果を図５に示す。ＪＡＲ細胞におけるＬＩＭＣＨ１発現は低酸素により有意に増加していることが明らかとなった（ｐ＜０．０５）。ＰＥ胎盤は低酸素にさらされていることが報告されているため、ＰＥ胎盤におけるＬＩＭＣＨ１発現上昇は、低酸素が関連している可能性が示唆された。

続いて、ＪＡＲにおいてＦＬＡＧ－ＬＩＭＣＨ１もしくはＦＬＡＧタグのみをレトロウイルスを用いて導入し、ＬＩＭＣＨ１恒常的過剰発現株と対照株を作成した。それぞれの細胞株から超遠心法を用いてエクソソームを抽出し、エクソソーム中においてもＬＩＭＣＨ１の過剰発現に成功したことを確認した。ＬＩＭＣＨ１過剰発現ＪＡＲ由来エクソソームを添加したＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の細胞増殖能を検討し、ＦＩＴＣデキストラン透過性アッセイを行った。細胞増殖能はＩｎｃｕｃｙｔｅ ＳＸ５（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により評価した。ＦＩＴＣデキストラン透過性アッセイは、ＨＵＶＥＣを０．４μｍ孔１２ｗｅｌｌ－ｔｒａｎｓｗｅｌｌに播種しコンフルエントに達したところでＥＶを添加し、２４時間後に４０ｋＤａのＦＩＴＣデキストランを添加し、下層のＦＩＴＣのＯＤ値を経時的にプレートリーダーで測定した。

ＬＩＭＣＨ１過剰発現ＪＡＲ由来ＥＶは対照ＥＶに比してＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の細胞増殖能に変化は認めなかったが（図６）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）デキストラン透過性アッセイでは、ＬＩＭＣＨ１搭載ＥＶ添加にて有意に透過性亢進を認めた（ｐ＜０．０１）（図７）。

ＬＩＭＣＨ１搭載ＥＶに暴露したＨＵＶＥＣにおけるＲＮＡ－Ｓｅｑ解析およびＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＨＵＶＥＣをＬＩＭＣＨ１搭載ＥＶもしくは対照ＥＶに２４時間暴露させ、ＱＩＡｚｏｌとｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＲＮＡ－ＳｅｑはＮｏｖａＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により施行した。ＧＳＥＡ解析はＷＥＢサイト（http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）を用いて行った。

その結果、ＬＩＭＣＨ１搭載ＥＶに暴露したＨＵＶＥＣと、対照ＥＶに暴露したＨＵＶＥＣとでは細胞間接着や体液量調節に関連する遺伝子群が有意に変化していた（図８、９）。この結果から、ＬＩＭＣＨ１搭載ＥＶが惹起する血管内皮細胞間接着の破綻は、血管透過性亢進を通して肺水腫や可逆性後頭葉白質脳症などのＰＥ合併症の発症機序となりうると考えられる。

Claims (10)

1. ＬＩＭＣＨ１（ＬＩＭ ａｎｄ ｃａｌｐｏｎｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ １）又はＬＩＭＣＨ１をコードする遺伝子を含む、妊娠高血圧腎症のバイオマーカー。
2. 妊娠高血圧腎症が早発型又は遅発型である、請求項１に記載のバイオマーカー。
3. 妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象由来の検体を解析する方法であって、当該検体において、ＬＩＭＣＨ１又はそれをコードする遺伝子の有無を決定する工程を含む、方法。
4. ＬＩＭＣＨ１が存在している検体は、妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は罹患する可能性がある対象に由来すると決定される、請求項３に記載の方法。
5. 検体がエクソソームを含む、請求項４に記載の方法。
6. ＬＩＭＣＨ１がエクソソーム上で発現している、請求項５に記載の方法。
7. エクソソームを含む検体が、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、羊水、胎盤組織、及び細胞から成る群から選択される生物学的材料に由来する、請求項６に記載の方法。
8. ｓＦｌｔ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ－１）の有無を決定する工程を更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
9. ｓＦｌｔ－１が胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）に対する比率として測定される、請求項８に記載の方法。
10. 妊娠高血圧腎症の治療又は予防のための医薬組成物であって、ＬＩＭＣＨ１又はそれをコードする遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含む、医薬組成物。