JP2024525990A - 単一ドメイン抗体によるブドウ膜炎の抑制 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2021年7月7日に出願された米国仮特許出願第63/219,161号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年7月7日に出願された米国仮特許出願第63/219,161号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供通知
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によるプロジェクト番号Z01#:EY000315-29の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によるプロジェクト番号Z01#:EY000315-29の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2022年7月5日に作成された「配列表」と題されたファイルとして提供され、サイズは2,000バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2022年7月5日に作成された「配列表」と題されたファイルとして提供され、サイズは2,000バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
免疫応答および自己免疫疾患を調節するIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21、IL-23、IL-27およびIL-35などのサイトカインは、ヤヌスキナーゼ(JAK)/STAT経路の活性化を介してそれらの生物学的活性を媒介する。この進化的に保存されたシグナル伝達経路は、4つのヤヌスキナーゼ(Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2)ならびに7員シグナル伝達兼転写因子活性化因子(STAT)ファミリーのタンパク質、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5bおよびSTAT6によって調整される。その同族受容体へのサイトカインの結合は、トランスホスホリル化によって必要なJakタンパク質を活性化し、特異的STATの動員のためのドッキング部位を提供する。受容体複合体に動員されたSTATは、重要なチロシン残基でリン酸化され、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、核に移行し、そこで特定のDNA配列に結合して遺伝子転写を活性化する。したがって、JAK/STAT経路は、細胞膜から核にシグナルを伝達し、特定の遺伝子発現を連結して細胞の挙動を変化させる迅速な膜対核機構を提供する。
STAT3は、哺乳動物細胞において必須かつ非冗長な役割を果たすので、STATタンパク質の中で独特である。マウスにおいて、stat3の遺伝子欠失は、胚致死および出生後3週間以内の死亡をもたらす。STAT3のDNA結合ドメインにおけるドミナントネガティブ変異は、治癒がないジョブス症候群として知られるまれな免疫不全障害の原因である。制御されない増殖、細胞増殖および腫瘍形成をもたらすSTAT3の異常な活性化の役割について多くが知られているが、STAT3はT細胞において広範囲の機能を有し、リンパ球静止を調節する機構ならびにT細胞活性化および生存を制御する機構の収束点として働く。活性化T細胞の増殖を促進するその役割とは対照的に、FoxO1またはFoxO3aプロモーターに結合し、T細胞を静止状態に維持するのに必須の役割を果たすこれらのクラスOフォークヘッド転写因子の発現を上方制御することによって、T細胞を細胞周期のG0期に維持する。さらに、T細胞におけるSTAT3欠損は、FoxO1、FoxO3aの下方制御およびIkBおよびp27Kip1などのFoxO標的遺伝子の著しい減少をもたらし、NF-kB活性化およびIL-2の産生の増強をもたらす。一方、STAT3は、Th17マスター転写因子の活性化、RORγt転写およびその特徴的な炎症促進性サイトカインIL-17の発現に必要である。重要なことに、CD4+T細胞に標的化された欠失を有するマウスは、実験的自己免疫ブドウ膜炎(EAU)および実験的自己免疫脳脊髄炎の発症に対して耐性であり、STAT3がこれらの中枢神経系(CNS)自己免疫疾患および他の自己炎症性疾患の潜在的な治療標的であることを示している。
STAT3は、細胞内タンパク質であるため、薬理学的に容易に標的化されない。STAT3 SH2ドメインまたはJAKもしくはサイトカイン受容体上のキナーゼ阻害部位へのSTAT3の結合を特異的に阻害するために、膜透過性疎水性リポヒリックモチーフにカップリングされたSTAT3模倣ペプチドを送達するためのいくつかの非侵襲的方法が使用されており、様々な程度で成功している。
本発明は、ブドウ膜炎などの症状または疾患を引き起こすSTAT3細胞内成分に対する単一ドメイン抗体(sdAb)、タンパク質およびポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、sdAbをコードする核酸、タンパク質およびポリペプチド、ならびにsdAbを含む組成物を含む。本発明は、予防、治療または診断目的のための組成物、sdAb、タンパク質またはポリペプチドの使用を含む。本発明はまた、本発明のsdAbに向けられたモノクローナル抗体の使用を含む。
本発明は、単一ドメイン抗体(sdAb)を使用して対象のブドウ膜炎を処置する方法であって、sdAbが配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む方法に関する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の態様では、sbAbは、1つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。
別の実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体(sdAb)を使用して対象のブドウ膜炎を予防する方法であって、sdAbが配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む方法に関する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
本発明によって処置されるブドウ膜炎は、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスであり得る。別の態様では、sbAbは、1つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、以下の用語およびその変形は、そのような用語が使用される文脈によって異なる意味が明確に意図されない限り、以下に示される意味を有する。
本明細書で使用される「a」、「an」、および「the」という用語および同様の指示対象は、文脈におけるそれらの使用が特に指示しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子(本発明のsdAbまたはポリペプチドなど)によって、より具体的には抗原結合分子の抗原結合部位によって、認識される抗原上のエピトープを指す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語も互換的に使用され得る。特定の抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に結合することができる、親和性を有する、および/または特異性を有するアミノ酸配列は、抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」、または「向けられる」と言われる。
本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という用語および「含む(comprising)」および「含む(comprises)」などの用語の変形は、他の添加剤、成分、整数または工程を排除することを意図しない。
本明細書に記載されるsdAb、ポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換され、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換として一般に記載することができる、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を含むことができると考えられる。保存的アミノ酸置換は当技術分野で周知である。保存的置換は、以下の群(a)~(e)内の1つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸によって置換される置換である:(a)小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr、ProおよびGly;(b)極性の負に荷電した残基およびそれらの(非荷電)アミド:Asp、Asn、GluおよびGln;(c)極性の正に荷電した残基:His、ArgおよびLys;(d)大きな脂肪族非極性残基:Met、Leu、Ile、ValおよびCys;ならびに(e)芳香族残基:Phe、TyrおよびTrp。他の保存的置換としては、AlaからGlyまたはSerへ;ArgからLysへ;AsnからGlnまたはHisへ;AspからGluへ;CysからSerへ;GlnからAsnへ;GluからAspへ;GlyからAlaまたはProへ;HisからAsnまたはGlnへ;IleからLeuまたはValへ;LeuからIleまたはValへ;LysからArg、GlnまたはGluへ;MetからLeu、TyrまたはIleへ;PheからMet、LeuまたはTyrへ;SerからThrへ;ThrからSerへ;TrpからTyrへ;TyrからTrpへ;および/またはPheからVal、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。
本明細書で使用される「ドメイン」は、一般に、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。
sdAbのアミノ酸配列および構造は、典型的には、「フレームワーク領域1」または「FR1」;「フレームワーク領域2」または「FR2」;「フレームワーク領域3」または「FR3」として;「フレームワーク領域4」または「FR4」とそれぞれと呼ばれる4つのフレームワーク領域または「FR」で構成される。フレームワーク領域は、それぞれ「相補性決定領域1」または「CDR1」、「相補性決定領域2」または「CDR2」、および「相補性決定領域3」または「CDR3」と呼ばれる3つの相補性決定領域または「CDR」によって中断されている。
本明細書で使用される場合、「ヒト化sdAb」という用語は、天然に存在するVHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基が、ヒト由来の従来の4鎖抗体からのVHドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基の1つまたは複数によって置き換えられたsdAbを意味する。これは、当技術分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、sdAbのFRは、ヒト可変FRで置き換えることができる。
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはアミノ酸は、それが通常関連する少なくとも1つの他の成分、例えばその供給源または培地、別の核酸、別のタンパク質/ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子もしくは汚染物質、不純物または微量成分から分離されている。
「哺乳動物」という用語は、哺乳綱に属する個体として定義され、ヒト、家畜および農耕動物、ならびに動物園、スポーツおよびペット動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesの最新版(当該分野の標準参照テキスト)に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、および5%ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質および固定油などの非水性ビヒクルを使用してもよい。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が上で定義した治療剤と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。
「定量的イムノアッセイ」とは、抗体を用いて試料中に存在する抗原の量を測定する任意の手段を指す。定量的イムノアッセイを行うための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、特異的分析物標識および再捕捉アッセイ(SALRA)、液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光活性化セルソーティングなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「溶液」という用語は、溶媒および溶質を含む組成物を指し、真の溶液および懸濁液を含む。溶液の例としては、液体に溶解した固体、液体または気体、および液体に懸濁した微粒子またはミセルが挙げられる。
「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合することができる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および/またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原と抗原結合性タンパク質との解離の平衡定数(KD)によって表される親和性は、抗原決定基と抗原結合性タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、KDの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度が強くなる(あるいは、親和性は、1/KDである親和定数(KA)として表すこともできる)。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特異的抗原に応じて決定することができる。アビディティは、抗原結合分子と抗原との間の結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、任意の公知の方法、例えばスキャッチャード解析および/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイによって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、本発明のsdAbを産生するために使用される遺伝子工学的方法(例えば、クローニングおよび増幅)の使用を指す。
「単一ドメイン抗体」、「sdAb」または「VHH」は、一般に、3つの相補性決定領域によって中断された4つのフレームワーク領域からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質として定義することができる。これは、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4と表される。本発明のsdAbはまた、sdAbアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を含む。典型的には、sdAbはラマなどのラクダ科動物で産生されるが、当技術分野で周知の技術を使用して合成的に生成することもできる。本明細書で使用される場合、天然に存在する重鎖抗体に存在する可変ドメインは、「VHドメイン」と呼ばれる従来の4鎖抗体に存在する重鎖可変ドメインおよび「VLドメイン」と呼ばれる従来の4鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために「VHHドメイン」とも呼ばれ、「VHH」および「sdAb」は本明細書では互換的に使用される。sdAbまたはポリペプチドのアミノ酸残基のナンバリングは、Kabatら(「Sequence of proteins of immunological interest」、US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)によって与えられるVHドメインの一般的なナンバリングに従う。このナンバリングによれば、sdAbのFR1は位置1~30のアミノ酸残基を含み、sdAbのCDR1は位置31~36のアミノ酸残基を含み、sdAbのFR2は位置36~49のアミノ酸を含み、sdAbのCDR2は位置50~65のアミノ酸残基を含み、sdAbのFR3は位置66~94のアミノ酸残基を含み、sdAbのCDR3は位置95~102のアミノ酸残基を含み、sdAbのFR4は位置103~113のアミノ酸残基を含む。
「合成」という用語は、インビトロ化学合成または酵素合成による産生を指す。
本明細書で使用される「標的」という用語は、sdAbによって認識される任意の成分、抗原、または部分を指す。「細胞内標的」という用語は、細胞内に存在する任意の成分、抗原、または部分を指す。「膜貫通標的」は、細胞膜内に位置する成分、抗原、または部分である。「細胞外標的」は、細胞の外側に位置する成分、抗原、または部分を指す。
本明細書で使用される「治療用組成物」は、医薬組成物、遺伝物質、生物製剤、および他の物質などの治療効果を有することを意図した物質を意味する。遺伝物質には、遺伝子ベクター、遺伝子調節エレメント、遺伝子構造エレメント、DNA、RNAなどの直接的または間接的な遺伝子治療効果を有することが意図される物質が含まれる。生物製剤には、治療効果を有することが意図された生体または生体由来の物質が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、疾患または疾患の明白な症候の処置、予防、または管理において治療上の利益を提供する量を指す。治療有効量は、疾患、疾患の症候または疾患の傾向を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、改良する、改善する、または影響を与える目的で、疾患または症状、疾患の症候または疾患の傾向を処置し得る。治療上有効な具体的な量は、通常の医療従事者によって容易に決定することができ、例えば、疾患の種類、患者の病歴および年齢、疾患の病期、ならびに他の治療薬の投与などの当技術分野で公知の要因に応じて変化し得る。
本発明は、細胞内成分に対する単一ドメイン抗体(sdAb)の使用、ならびに疾患を処置または予防するためのsdAbおよびタンパク質をコードするヌクレオチドを含むタンパク質およびポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、sdAbをコードする核酸、タンパク質およびポリペプチド、ならびにsdAbを含む組成物を含む。
SBT-100(配列番号1)(またはVHH13)(配列番号1)と命名された抗STAT3 sdAbのアミノ酸配列を以下に示す:
3つのCDRに下線が引かれている。
3つのCDRに下線が引かれている。
対応する抗STAT3 SBT-100 DNA配列(配列番号2)は以下である:
SBT-100(配列番号1)(配列番号1)は、米国特許第S/N 14922093号に以前に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
STAT3は、細胞の成長、分化および生存を調節する遺伝子の転写を活性化する。T細胞におけるStat3の遺伝子欠失はTh17分化を抑止し、STAT3がTh17媒介疾患の潜在的な治療標的であることを示唆する。しかしながら、STAT3などの細胞内タンパク質の治療標的化に対する主な障害は、STAT3阻害剤を細胞に送達するための効率的な方法の欠如である。この研究では、STAT3特異的重鎖分子の可変(V)領域からなる単一ドメイン抗体(sdAb)またはナノボディ(SBT-100)を使用した。SBT-100(配列番号1)(配列番号1)がヒトおよびマウス細胞に侵入し、STAT3活性化の抑制およびリンパ球増殖を濃度依存的に誘導することが見出された。SBT-100(配列番号1)(配列番号1)がインビボで炎症を抑制するのに有効であるかどうかを調べるために、実験的自己免疫性ブドウ膜炎を、眼自己抗原である光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)での能動免疫によってC57BL/6Jマウスに誘導した。眼底検査、組織学的検査または光干渉断層法による網膜の分析は、SBT-100(配列番号1)(配列番号1)によるマウスの処置が、EAUを媒介する病原性Th17細胞の増殖を阻害することによってブドウ膜炎を抑制することを示した。暗および明順応a波およびb波の網膜電図(ERG)記録は、SBT-100(配列番号1)処置が、未処置マウスにおいてEAUを特徴付ける有意な視覚障害の発症からマウスを保護したことを示した。未処置EAUマウスからの活性化されたIRBP特異的T細胞の養子移入はEAUを誘導したが、EAUは、SBT-100(配列番号1)処置マウスからのIRBP特異的T細胞を受けたマウスでは有意に減弱した。まとめると、これらの結果は、マウスにおけるSBT-100(配列番号1)の有効性を実証し、ヒト自己免疫疾患に対するその治療可能性を示唆する。
SBT-100(配列番号1)は、軽鎖を欠くラクダ免疫グロブリン重鎖可変領域に由来する単一VHHからなるナノボディまたは単一ドメイン抗体(sdAb)である。SBT-100(配列番号1)はリンパ球を透過することができ、初代マウスCD4+リンパ球およびヒトJurkatT細胞のIL-6/STAT3シグナル伝達経路を阻害する。SBT-100(配列番号1)はまた、インビボで有効であることが示され、病原性Th17細胞の増殖を阻害することによってEAUの発症を抑制する。単一の抗原結合タンパク質として、またはより大きなタンパク質もしくはポリペプチド中の抗原結合ドメインとしての単一ドメイン抗体(sdAb)の使用は、従来の抗体または抗体断片の使用を超えるいくつかの重要な利点を提供する。sdAbの利点には、抗原に高い親和性および高い選択性で結合するために単一のドメインのみが必要とされること;sdAbは、単一の遺伝子から発現することができ、翻訳後修飾を必要としないこと;sdAbは、熱、pH、プロテアーゼおよび他の変性剤または変性条件に対して非常に安定であること;sdAbは調製するのに安価であること;sdAbは、従来の抗体にはアクセスできない標的およびエピトープにアクセスすることができることが含まれる。
本発明のsdAbは主に治療的使用を意図しているので、哺乳動物、好ましくはヒトの標的に対するものである。しかしながら、本明細書に記載されるsdAbは、他の種からの標的、例えば霊長類または他の動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ)の1つまたは複数の他の種からの標的と、特に標的に関連する疾患に関連する疾患および障害の動物モデルにおいて交差反応性である可能性がある。
本発明はさらに、sdAb、sdAbをコードする核酸、宿主細胞、本明細書に記載の産物および組成物の用途および使用に関する。そのような産物または組成物は、例えば、疾患を処置または予防するための医薬組成物であり得る。
本発明は、一般に、sdAb、ならびに予防および治療目的に使用することができるそのようなsdAbの1つまたは複数を含むかまたはそれから本質的になるタンパク質またはポリペプチドに関する。
本発明で詳述される方法および組成物は、本明細書に記載される疾患を処置するために使用することができ、本明細書に記載されるかまたは他の方法で公知の任意の投与量および/または製剤、ならびに本明細書に記載されるかまたは他の方法で当業者に公知の任意の投与経路で使用することができる。
本発明のsdAbは、1つまたは複数の化合物と共に使用することができる。1つまたは複数の化合物は、治療応答を増加させ、本発明のsdAbの有効性を増強することができる。さらに、sdAbの有効性は、それをペプチド、ペプチド模倣薬、および他の薬物と組み合わせることによって増加させることができる。
STAT3は、シグナル伝達および転写機能活性化の両方を担うタンパク質のシグナル伝達兼転写因子活性化因子(STAT)ファミリーのメンバーである。STAT3は広く発現され、EGF、IL-6、PDGF、IL-2およびG-CSFなどの様々なサイトカインおよび成長因子に応答して、DNA結合タンパク質としてのチロシンおよび/またはセリン上のリン酸化を介して活性化される。STAT3リン酸化タンパク質は、STATファミリーの他のメンバーとホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し、様々な遺伝子の転写を調節するために核に移行し、その結果、細胞成長、アポトーシス、血管新生、免疫回避、および生存などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。
ブドウ膜炎は、寛解および再発性眼内炎症の反復サイクルを特徴とする潜在的に視力を脅かす眼内炎症性疾患の多様な群であり、視力障害は、患者の生活の質に影響を及ぼすため、公衆衛生上重要である。網膜へのTh17細胞の動員の増加は、ブドウ膜炎の病態生理学に関与しており、現在の治療法には、眼周囲または硝子体内のコルチコステロイドが含まれる。しかしながら、慢性ブドウ膜炎の処置のためのそれらの長期使用は、緑内障などの重篤な副作用の発症に関連し、代替療法を開発するための推進力である。Th17細胞を誘導することができない遺伝子改変マウスは、ブドウ膜炎の発症に対して抵抗性であるので、Th17細胞の分化および拡大に必要なSTAT3経路を標的化することが、ブドウ膜炎を緩和するための潜在的な治療法として提案されている。しかしながら、STAT3経路の標的化に対する主な障害は、それが細胞内タンパク質であり、STAT3特異的抗体がアクセスできないこと、ならびに低分子量STAT3阻害性ペプチドまたは模倣物の予測不可能な薬物動態学的特徴であることである。
2つの同一の重(H)鎖ポリペプチドおよび2つの同一の軽(L)鎖ポリペプチドから組み立てられたヘテロ四量体免疫グロブリンから構成される従来のSTAT3特異的抗体とは対照的に、この研究においてSTAT3シグナル伝達経路を標的とするために使用されるSTAT3特異的ナノボディは、独特の1つの抗原結合ドメインから構成される独特のラクダ様単一ドメイン単量体VHH抗体である。細胞に浸透しない90kDaナノボディとは対照的に、STAT3 VHHは約15kDa(2.5nm)のサイズであり、細胞に浸透することを可能にし、組織に対して毒性ではない。ブドウ膜炎をマウスに誘導し、次いで、マウスをSBT-100(配列番号1)で1日2回処置し、眼底検査、組織学、光干渉断層法および網膜電図検査による眼の分析により、SBT-100(配列番号1)が重度のブドウ膜炎からの保護を与え、EAU中のTh1およびTh17応答の阻害、炎症細胞の拡大および網膜への輸送の低減によって眼炎症を抑制することが明らかになった。結果は、SBT-100(配列番号1)が眼細胞に対して毒性でなく、重度の眼炎症に通常関連する網膜機能の低下を予防したことを示している。ブドウ膜炎の病因におけるT細胞の役割が十分に確立されていることと一致して、結果は、SBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスからの細胞の移入が、完全な疾患を発症した未処置EAUマウスからの細胞の養子移入と比較して、非常に軽度のEAUを誘導したことを示している。まとめると、これらの結果は、SBT-100(配列番号1)免疫療法がヒトのブドウ膜炎の改善に有効であるという示唆的な証拠を提供する。
ブドウ膜炎および多発性硬化症などの中枢神経系(CNS)自己免疫疾患は、血液網膜関門(BRB)、血液脳関門(BBB)、および周皮細胞、血管周囲マクロファージ、堅く結合した内皮細胞、ミュラー/ミクログリアのグリア境界によって構成される神経血管系(NVU)によって維持される脳、脊髄または神経網膜の免疫特権の破壊の結果として生じる。これらの構造は、末梢免疫系からCNS組織を隔離し、グランザイムBを産生するTh17細胞は、BBBまたはBRBの破壊を促進することによってCNS自己免疫疾患を開始する初期事象に関与する。しかしながら、ミクログリア細胞の持続的活性化および他の炎症性細胞の動員は、炎症応答を増幅し、慢性ブドウ膜炎または多発性硬化症に特徴的な病理学を担う。それにもかかわらず、マウスにおいてブドウ膜炎を抑制するためにサイトカインまたは免疫抑制化合物などの生物製剤を使用する介入研究は、疾患改善と病原性Th17細胞の抑制との強い相関を常に示す。その後の研究により、Th17分化および発達に対するSTAT3の必要性が明らかにされたが、他の研究では、STAT3の標的化された欠失がEAEまたはEAUの発達を妨げたことが示された。これらの研究により、Th17細胞を標的とすることが、自己免疫疾患および自己炎症性疾患を抑制および緩和するための実行可能な治療アプローチであるという現在確立されている概念が導かれた。
この試験では、SBT-100(配列番号1)免疫療法は、病原性Th1およびTh17細胞ならびにTreg細胞の増殖に拮抗することによってEAUに対する保護を付与した。Th17細胞は疾患の開始に重要な役割を果たすが、データは、Th17を阻害するように設計された治療薬は部分的にしか有効でないことを示唆している。このデータは、STAT3がT細胞において二重の役割を有することを示す以前の研究と一致している:リンパ球静止クラスOフォークヘッド転写因子の上方制御を介してIL-2産生を阻害することによって、G0期の非活性化T細胞を休止細胞として維持するという重要な役割を果たす。STAT3は静止細胞としてT細胞を維持するが、同族抗原と係合してG1細胞周期に入った後、STAT3はすべての哺乳動物細胞の場合のように細胞増殖を促進することに留意されたい。したがって、STAT3特異的ナノボディは、Th17、Th1、Tregリンパ球、ならびに神経炎症を持続させる炎症性骨髄細胞の抑制を媒介する。
ブドウ膜炎は、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスを含む症候性疾患の群である。それは、米国における重度の視力障害の10%超を占め、抗体による疾患の処置に対する大きな障害は、BRBおよび神経網膜血管単位のためにCNSへの進入を制限するそれらのサイズである。結果は、SBT-100(配列番号1)がBRBを通過し、器官特異的自己免疫眼疾患を処置し、インビボでTH17細胞およびTH1細胞の両方を有意に阻害することができることを示す。さらに、SBT-100(配列番号1)は非毒性であり、脳、脊髄および神経網膜などのCNS組織に容易に入る。
例
例1:SBT-100(配列番号1)は、初代T細胞におけるT細胞増殖およびSTAT3活性化を抑制する
例1:SBT-100(配列番号1)は、初代T細胞におけるT細胞増殖およびSTAT3活性化を抑制する
6~8週齢のC57BL/6JマウスをJackson Laboratory(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)から購入した。動物をNIH/NEI動物施設に収容し、水および固形飼料への無制限のアクセスにより明暗サイクル下で維持した。すべての動物の世話および手順は人道的であり、米国国立衛生研究所動物管理使用委員会のガイドラインに準拠した。
Jurkat細胞、クローンE6-1(ATCC(登録商標)TIB-152(商標))は、ATCC(Gaithersburg,MD)から得た。すべての細胞を、37°Cの加湿インキュベーターにおいて完全RPMI 1640培地(10%の最終濃度になるようにウシ胎児血清(FBS)および1×ペニシリン-ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン(Life Technologies,Grand Island,NY)、5μMの2-メルカプトエタノールを補充)中で培養した。
血漿サイトカインをマルチプレックスELISAによって定量した。血漿を1,000xgで10分間の遠心分離によって分離し、LEGENDplexマウス炎症パネルを製造業者(BioLegend,San Diego,CA)によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をCytoFLEX Flow Cytometer(Beckman Coulter,Indianapolis,IN)で行い、BioLegendのLEGENDplex(商標)データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
以前の研究は、STAT3経路の活性化がT細胞増殖およびTh17分化を調節する一方で、T細胞におけるSTAT3の喪失がCNS自己免疫疾患の発症を妨げることを示している。この研究では、このラクダ由来ナノボディSBT-100がTh17誘導性自己免疫疾患の抑制に有効であるかどうかを調べるために、膜、血液脳関門(BBB)および血液網膜関門(BRB)を貫通する抗体を開発した。SBT-100(配列番号1)は、単一の単量体可変抗体ドメインから構成される単一ドメイン、2.5nm、15kDa抗体であり、従来のFab領域に通常存在する軽鎖および重鎖のCHドメインを欠く。SBT-100(配列番号1)が初代T細胞の細胞質に入り、STAT3シグナル伝達に拮抗することができるかどうかを決定するために、C57BL/6Jマウスの脾臓から細胞を単離し、CD4特異的磁気ビーズを使用してT細胞を選別した。細胞は、FACS分析によってCD4+リンパ球であることが示された。
SBT-100(配列番号1)がSTAT3活性化を阻害できるかどうかを決定するために、細胞を、SBT-100(配列番号1)を含有する培地(100μg/mlまたは50μg/ml)中で3日間抗CD3/CD28により刺激した。図1に見られるように、SBT-100(配列番号1)は、リンパ球およびSTAT3活性化を阻害する。[3H]-チミジン取り込みおよびリンパ球増殖アッセイによる細胞の分析は、T細胞増殖の有意な阻害を明らかにした(図1A)。選別したマウス初代ナイーブCD4+T細胞を、SBT-100(配列番号1)を含有する培地中で抗CD3/CD28で刺激し、3日目に、T細胞増殖を[3H]-チミジン取り込みアッセイによって評価した。
STAT3活性化を評価するために、抗CD3/抗CD28で48時間刺激した後、細胞を洗浄し、0.5% BSAを含有する無血清培地中で2時間飢餓状態にし、IL-6で30分間再刺激した。pSTAT3をウエスタンブロットによって検出した。細胞抽出物(20~40μg/レーン)を還元条件の4~12%グラジエントSDS-PAGEで分画し、マウスSTAT3、pSTAT3またはb-アクチンに特異的な抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)を用いてウエスタンブロット分析を行った。一次抗体は、同じ膜上の2つの標的の検出を可能にするLi-Cor 2色系のための抗マウス-IRDye 680RDおよび抗ウサギ-IRDye 800RD二次抗体を使用して検出した。各ウェスタンブロッティング分析を少なくとも3回繰り返した。
溶解物のウエスタンブロット分析により、SBT-100の非存在下ではIL-6がSTAT3を活性化し(pSTAT3)、一方、SBT-100(配列番号1)の添加はpSTAT3活性化を濃度依存的様式で抑制することが明らかになった(データは示さず)。さらに、SBT-100(配列番号1)の阻害効果は、[3H]-チミジン取り込みおよびリンパ球増殖アッセイによって示されるように、ヒトJurkatT細胞の増殖を抑制した(図1B)。ヒトJurkat T細胞を、SBT-100(配列番号1)を含有する培地中で抗CD3/CD28で72時間刺激し、3日目に、T細胞増殖を[3H]-チミジン取り込みアッセイによって評価した。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(**p<0.01;**p<0.001;****p<0.0001)。
例2:SBT-100(配列番号1)はブドウ膜炎を改善し、眼内炎症中の視力を維持する
実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)を、C57BL/6Jマウスにおいて、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA株(2.5mg/mL)を含む完全フロイントアジュバント(CFA)と200μLエマルジョン(1:1 v/v)中のIRBP651-670-ペプチド(300μg/マウス)を、以前に記載されたように(Oh,H.M.,et.al.,Journal of Biological Chemistry,287,30436-30443(2012)、皮下で能動免疫することにより誘導した。マウスはまた、免疫化と同時に百日咳菌(Bordetella pertussis)毒素(1μg/マウス)の腹腔内注射を受けた。免疫化の-1日目から始まって免疫化後12日目まで、マウスを100μLのPBSまたはSBT-100(配列番号1)のいずれかで1日2回処置した(100μL PBS中、10mg/kg体重)。各研究について、1群あたり8匹のマウスを使用し、年齢および性別を一致させた。
EAUマウスの網膜における浸潤炎症細胞を特徴付けるために、マウスを安楽死させ、記載のようにPBSで灌流した(Ohら、2012)。眼球摘出した眼を培養培地を含むペトリ皿に入れ、角膜縁および水晶体に沿って切断することによって切開顕微鏡下で網膜を単離し、角膜を慎重に除去した。次いで、網膜を剥離し、コラゲナーゼ(1mg/mL)およびDNase(10μg/mL)を含有するRPMI培地に37°Cで2時間移した。組織消化を促進するために、消化組織を30分毎に定期的にピペッティングした。10倍体積の完全培地を添加することによって消化を停止した。次いで、細胞を完全培地で2回洗浄し、Vi-Cell XR細胞生存率分析装置(Beckman Coulter)を使用して細胞を計数した。
臨床疾患を確立し、以前に記載されたように(Ohら、2012)、眼底検査および組織学によってスコア化した。眼底検査は、EAU誘導後10日目~21日目に行った。全身麻酔(ケタミン(1.4mg/マウス)およびキシラジン(0.12mg/マウス)の腹腔内注射)後、1%トロピカミド点眼液(Alcon Inc.,Fort Worth,TX)の局所投与により瞳孔を散大させた。眼底画像は、以前記載されたように(Oh,H.M.et al.,Journal of Immunology,187,3338-3346(2011))、小型げっ歯類用のMicron III網膜撮像顕微鏡(Phoenix Research Labs)またはNikon D90デジタルカメラと連結された改変Karl Storz獣医耳内視鏡を使用してキャプチャした。内視鏡を位置決めし、上、下、外側および内側の視野から見ることによって各眼から少なくとも6つの画像(2つの後中心網膜像、4つの周辺網膜像)を撮影し、各個々の病変を識別し、マッピングし、記録した。網膜炎症の臨床的等級付けシステムは確立された通りであった(Ohら、2012)。
眼を、同軸照明を伴う両眼顕微鏡を使用して疾患重症度について調べた。組織学のための眼を免疫化の20日後に摘出し、10%緩衝ホルマリンで固定し、垂直瞳孔-視神経面で連続切片にした。すべての切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
EAUは、主にT細胞媒介性CNS自己免疫疾患であり、ヒトブドウ膜炎の十分に特徴付けられたマウスモデルである。このマウスモデルを使用して、SBT-100(配列番号1)がこの臓器特異的CNS自己免疫疾患の発症または重症度の抑制に有効であるかどうかを調べた。EAUを、以前に記載されたように(Mattapallil,M.J.et al.Invest Ophthalmol Vis Sci 56,5439-5449(2015))、CFAエマルジョン中のIRBP651-670による免疫化によってC57BL/6Jマウスにおいて誘導した。マウスを、-1日目からEAU誘導後12日目までPBS(未処置群)またはSBT-100(配列番号1)のいずれかで1日2回処置した。EAUモデルでは、ブドウ膜炎は一般に免疫後(p.i)13日目~22日目の間に発症するため、この期間中、眼底検査、組織学、光干渉断層法(OCT)および網膜電図検査(ERG)によって疾患の進行および重症度を監視した。EAU臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに眼内の網膜および脈絡膜浸潤の検出に基づいた。
統計データ分析およびグラフプロットは、実験に応じて、ペアワイズ比較のための両側対応のないスチューデントt検定または多重ペアワイズt検定を用いた一元配置分散分析を使用して、GraphPad Prism 8を使用して行った。データを平均およびSDとして示し、推論の統計学的有意性はp<0.05に基づいた。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;****p<0.0001)。
C57BL/6JマウスをCFA中のIRBPで免疫し、PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置し、EAUの発生を、眼底検査(図2A)、組織学(図2B)、OCT(データは示さず)またはERG(図2C)によって評価した。
ブドウ膜炎の初期徴候は、p.i.14日目までに最初に観察され、その時点とp.i.20日目との間に完全な炎症が観察された。PBS処置網膜の眼底画像は、視神経円板縁のかすみおよび乳頭周囲領域の拡大、中程度のカフ形成を伴う網膜血管炎、ならびに黄白色の網膜および脈絡膜浸潤を特徴とする重度の炎症を示す(データは示さず)。対照的に、SBT-100処置マウスの網膜の眼底画像は、非常に低い臨床スコアを有する比較的軽度のEAUを示した(データは示さず)。臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに網膜および脈絡膜浸潤に基づいた。眼の断面の組織病理学を免疫後20日目に行った。未処置EAU対照マウスでは、炎症細胞浸潤、視神経円板縁のぼやけ、および血管炎によるいくつかのコンフルエントな病変を伴う特徴的な広範な網膜病変があり、これらはすべて、SBT-100(配列番号1)処置マウスでは軽度であったか、または存在しなかった。EAUスコアは、SBT-100(配列番号1)処置群と比較して、PBS処置群で有意に高かった。眼底検査の結果と一致して、PBS処置した20日目の網膜の組織学は、硝子体内への多数の炎症細胞の浸潤、網膜細胞の破壊、および重度のブドウ膜炎の顕著な特徴である網膜内折り畳みの発達を伴う重度のEAUを明らかにした。
OCTは、生きている動物の様々な眼構造の内部微細構造の視覚化を可能にする非侵襲的手順であり、以前に記載されたように実行された(Ohら、2012)。820nmの中心波長広帯域光源(Bioptigen、NC)を備えたスペクトル領域光干渉断層法(SD-OCT)システムを、対照マウスまたはEAUマウスの眼のインビボ非接触イメージングに使用した。マウスを麻酔し、瞳孔を散大させた。次いで、水平または垂直走査を可能にする容易に回転させることができる調整可能なホルダーを使用してマウスを固定化し、各走査を少なくとも2回行い、毎回再調整した。最適な信号強度およびコントラストが達成されるまで、走査の寸法(深さおよび横方向範囲)を調整した。網膜厚は、システムソフトウェアを使用して、同じ眼からの水平走査および垂直走査の両方から得られたすべての画像の網膜中心領域から測定し、平均した。システムソフトウェアで網膜厚を決定するために使用される方法は、記載の通りであった(Gabriele,M.L.et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci 52,2250-2254(2011))。
OCTにより、PBS処置マウスの硝子体および視神経頭における炎症細胞の蓄積が明らかにされたが、SBT-100(配列番号1)を受けたマウスの網膜では明らかにされなかった(図2B)。OCT画像は、視神経周囲の浸潤細胞の蓄積および視神経円板への損傷を示す(データは示さず)。免疫後18日目の明順応(100cd.s/m2)および暗順応(10cd.s/m2)のa波およびb波は、未処置マウスではSBT-100(配列番号1)処置群と比較して有意に低かった。
網膜電図(ERG)は、眼内炎症中の視覚機能の変化を検出するための確立された臨床方法であり、網膜の光刺激に応答した電位の変化に基づく。光適応刺激下のERGは錐体駆動機能を反映し、一方、暗順応b波応答は桿体駆動活性を表す。ERG記録の前に、マウスを一晩暗順応させ、実験を前述のように(Ohら、2012)、暗赤色照明下で行った。ケタミン(1.4mg/マウス)およびキシラジン(0.12mg/マウス)の単回腹腔内注射でマウスを麻酔し、0.5%トロピカミドおよび0.5%フェニレフリン塩酸塩(参天製薬株式会社、大阪、日本)を含有するミドリアシルで瞳孔を散大させた。ERGを、光刺激を生成および制御する網膜電図コンソール(Espion E2;Diagnosys LLC,Lowell,MA)を使用して記録した。暗順応ERGを、7段階で送達される、-4~1 log cd・s/m2の強度でGanzfeldドーム内に送達される単一フラッシュで記録した。10 cd・s/m2のバックグラウンドで明順応ERGを得て、0.3~100 cd・s/m2で6段階で光刺激を開始した。良好な電気的接触を提供し、角膜水分を維持するために、ゴニスコピックプリズム溶液(Alcon Labs,Fort Worth,TX)を使用した。口の中に基準電極(金線)を入れ、尾の付け根に接地電極(皮下ステンレス針)を置いた。信号を差動的に増幅し、1kHzの速度でデジタル化した。主要ERG成分(a波およびb波)の振幅を、自動および手動の方法を用いて測定した(Espionソフトウェア;Diagnosys LLC)。ERG記録の直後に、眼底の画像化を前述のように行った(Oh,H.M.et al,J.Immunology,2011)。
明順応または暗順応条件下でPBS処置マウスの眼において検出された有意に低いa波およびb波振幅は、PBS処置マウスにおける有意な視覚障害を示唆し、一方、SBT処置マウスにおいて検出されたより高いa波およびb波振幅は、ブドウ膜炎中のSBT-100(配列番号1)媒介性の視力の維持と一致する(図2C)。
例3:SBT-100(配列番号1)は、病原性Th1およびTh17細胞を阻害することによってマウスのブドウ膜炎を抑制した
マウスおよびヒトのブドウ膜炎は、主にTh17サブセットのT細胞によって媒介されると考えられており、Th1サブセットはEAUを有するマウスの眼でも増加するが、ブドウ膜炎の病因におけるその役割は依然として議論の余地がある。この試験で観察されたEAUの改善が、Th17および/またはTh1細胞のレベルのSBT-100誘導性低下に由来するかどうかを調べるために、EAUを有するマウスから細胞を単離した。Th17およびTh1細胞の頻度を、SBT-100(配列番号1)処置マウスの眼、排出リンパ節および脾臓において調べた。
EAUを、CFA中のIRBPで免疫化しPBSまたはSBT100で処置したC57BL/6Jマウスにおいて誘導した。排出リンパ節(DLN)および脾臓DLNの単一細胞懸濁液を作製した。脾臓を切開し、40μm細孔セルストレーナーで引き裂くことによって細胞を除去した。RPMI1640培地で洗浄した後、5mLのACK RBC溶解緩衝液(Quality Biological、MD)を用いて赤血球を3分間溶解した。10倍容量の培地を添加することによって溶解を停止した。2回洗浄した後、細胞を再懸濁し、2×106/mLの濃度で播種した。
細胞内サイトカイン検出のために、細胞をPMA(50ng/ml)/イオノマイシン(500ng/ml)で5時間再刺激した。最後の3時間にGolgiPlugを添加し、推奨されるようにBD Biosciences Cytofix/Cytopermキットを使用して細胞内サイトカイン染色を行った(BD Pharmingen,San Diego,CA)。FACS分析を、以前に記載されたように(Ohら、2012)、タンパク質特異的モノクローナル抗体および対応するアイソタイプ対照Ab(BD Pharmingen,San Diego,CA)を使用してMACSQuant分析装置(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)で行った。蛍光色素とコンジュゲートしたmAbで染色した試料に対してFACS分析を行い、各実験を色補正した。死細胞を死細胞排除色素(Fixable Viability Dye eFluor(登録商標)450;eBioscience)で染色した。アイソタイプ対照を使用してゲートを設定した。
炎症誘発性IL-17および/またはIFN-γサイトカインを分泌するCD4+T細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色アッセイによって検出および定量化した。公表された報告と一致して、PBS処置マウスにおけるEAUの発生は、眼、脾臓およびDLNにおけるIL-17発現(Th17)およびIFNγ発現(Th1)細胞の有意な増加を伴ったが、SBT-100(配列番号1)で処置したマウスのこれらの組織におけるTh1およびTh17のはるかに低いパーセンテージが観察された(図3A)。四分円は、IFN-γまたはIL-17を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。網膜、DLNまたは脾臓におけるROR-γT(図3B)またはグランザイムB(図3C)を発現するCD4+T細胞のパーセンテージ(図3D)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスからの選別したCD4+T細胞を、IRBPおよびIL-17Aでインビトロで再刺激し、3日目の培養上清中に分泌されたIFN-γをELISAによって検出した。
これらの結果は、Th17細胞が器官特異的自己免疫疾患の病因に関与していることを暗示する研究と一致している。Th17分化および発達にはROR-γt転写が必要であり、結果は、Th17細胞の減少がこのTh17マスター転写因子のより低いレベルの検出と相関することを示している(図3B)。Th17リンパ球は中枢神経系に輸送され、グランザイムB放出を介して細胞溶解効果を媒介し、グランザイムBを遮断すると、後期/慢性EAEが改善される。SBT-100の治癒効果と一致して、未処置マウスと比較して、SBT-100で処置したマウス(配列番号1)におけるグランザイムBを産生するCD4 T細胞の顕著な減少が観察された(図3C)。
DLN由来の培養CD4 T細胞の上清中のIL-17およびIFN-γの測定は、SBT-100(配列番号1)処置マウスにおけるこれらのサイトカインのレベル低下と一致した(図3D)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスの脾臓由来の細胞を、細胞内サイトカイン染色によって分析した(図3E)。四分円は、Foxp3、CD25および/またはIL-10を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。驚くべきことに、EAUのSBT-100媒介性阻害は、制御性T細胞の増加と関連しないことが見出された(図3E)。
例4:SBT-100(配列番号1)はブドウ膜形成リンパ球の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎を抑制する
養子移入実験を行って、EAUに対するSBT-100(配列番号1)誘導性防御がT細胞におけるSTAT3経路の標的化の直接的な結果であるかどうかを直接調べた。EAUを有する対照マウスまたはSBT-100処置マウスのリンパ節および脾臓から細胞を単離し、細胞をIRBP651-670でエクスビボで再刺激し、3×107個の細胞をナイーブWT C57BL/6Jマウスに養子移入した。疾患の進行を評価し、細胞の移入の12日後に、眼底検査、組織学、OCTおよびERGによってEAUスコアを決定した。PBS処置マウス由来の細胞を受けたマウスでは炎症細胞の有意な浸潤および血管炎が観察されたが、SBT-100(配列番号1)処置マウス由来の細胞を受けたマウスは重度のEAUから保護された(図4A)。網膜の折り畳みおよび細胞浸潤もまた、SBT-100(配列番号1)処置マウスにおいて減少した(図4B)。OCT画像はまた、視神経周囲の浸潤細胞の有意な蓄積および網膜層の歪みを示す(データは示さず)。有意により高い明順応a波およびb波、ならびに暗順応b波の実質的な増加が、未処置マウスからの細胞を受けたマウスと比較して、SBT-100(配列番号1)処置マウスからの細胞を受けたマウスの眼において検出された(図4C)。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。これらの結果は、STAT3経路がブドウ膜炎の改善および視覚機能の維持のための潜在的な治療標的であることを示している。
例5:SBT-100(配列番号1)はブドウ膜炎を媒介する病原性Th1およびTh17細胞の増殖に拮抗した
IRBP/CFAによる能動免疫化によるEAUの誘導と同様に、SBT-100(配列番号1)で処理したT細胞の移入は、対照未処理細胞と比較してEAUの移入において非効率的であった。ELISAによるサイトカイン分泌の検出のために、細胞をIRBP651-670ペプチドで48時間特異的に再刺激し、回収した上清を、製造業者によって推奨されるQuantikine ELISAを使用して定量した。
血漿サイトカインをマルチプレックスELISAによって定量した。血漿を1,000xgで10分間の遠心分離によって分離し、LEGENDplexマウス炎症パネルを製造業者(BioLegend,San Diego,CA)によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をCytoFLEX Flow Cytometer(Beckman Coulter,Indianapolis,IN)で行い、BioLegendのLEGENDplex(商標)データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
四分円は、網膜、DLNまたは脾臓においてIFN-γまたはIL-17を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示し、Th1またはTh17細胞を細胞内サイトカイン染色によって決定した。細胞内サイトカイン染色分析は、SBT-100(配列番号1)で処置したマウスから細胞を受け取ったマウスにおいて病原性Th1およびTh17細胞のレベルの有意な低下を示す(図5A)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスからの選別したCD4+T細胞を、IRBPおよびIL-17Aでインビトロで再刺激し、3日目の培養上清中に分泌されたIFN-γをELISAによって検出した。SBT-100(配列番号1)誘導EAU改善は、それぞれTh1およびTh17の特徴的なサイトカインであるIFN-γおよびIL-17の減少と相関した(図5B)。四分円は、網膜においてROR-gTを発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。いくつかの自己免疫疾患の病因におけるTh17細胞の十分に確立された役割と一致して、Th17マスター転写因子(ROR-γt)を発現するT細胞のパーセンテージは有意に減少した(図5C)。IL17A、IFN-γ、GM-CSF、IL-1αおよびIL-10の血漿レベルはすべて、マルチプレックスELISAによってPBS処置マウスおよびSBT-100処置マウスにおいて検出された。未処置マウスまたはSBT-100処置マウスから細胞を受けたマウスの血清の分析により、SBT-100(配列番号1)処置群からの血清は、IL-17、IFN-γ、IL23、GM-CSFおよびIL-1aを含む炎症促進性サイトカインの有意な減少を有することが明らかになり、SBT-100(配列番号1)処置がEAUを抑制することをさらに示唆する証拠が提供された(図5D)。データは、少なくとも2回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明されているが、他の実施形態も可能である。本方法のために開示された工程は、例えば、限定することを意図するものでも、各工程が本方法に必須であることを示すことを意図するものでもなく、例示的な工程にすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
眼を、同軸照明を伴う両眼顕微鏡を使用して疾患重症度について調べた。組織学のための眼を免疫化の20日後に摘出し、10%緩衝ホルマリンで固定し、垂直瞳孔-視神経面で連続切片にした。すべての切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
EAUは、主にT細胞媒介性CNS自己免疫疾患であり、ヒトブドウ膜炎の十分に特徴付けられたマウスモデルである。このマウスモデルを使用して、SBT-100(配列番号1)がこの臓器特異的CNS自己免疫疾患の発症または重症度の抑制に有効であるかどうかを調べた。EAUを、以前に記載されたように(Mattapallil,M.J.et al.Invest Ophthalmol Vis Sci 56,5439-5449(2015))、CFAエマルジョン中のIRBP651-670による免疫化によってC57BL/6Jマウスにおいて誘導した。マウスを、-1日目からEAU誘導後12日目までPBS(未処置群)またはSBT-100(配列番号1)のいずれかで1日2回処置した。EAUモデルでは、ブドウ膜炎は一般に免疫後(p.i)13日目~22日目の間に発症するため、この期間中、眼底検査、組織学、光干渉断層法(OCT)および網膜電図検査(ERG)によって疾患の進行および重症度を監視した。EAU臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに眼内の網膜および脈絡膜浸潤の検出に基づいた。
統計データ分析およびグラフプロットは、実験に応じて、ペアワイズ比較のための両側対応のないスチューデントt検定または多重ペアワイズt検定を用いた一元配置分散分析を使用して、GraphPad Prism 8を使用して行った。データを平均およびSDとして示し、推論の統計学的有意性はp<0.05に基づいた。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;****p<0.0001)。
C57BL/6JマウスをCFA中のIRBPで免疫し、PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置し、EAUの発生を、眼底検査(図2A)、組織学(図2B)、OCT(データは示さず)またはERG(図2C)によって評価した。
ブドウ膜炎の初期徴候は、p.i.14日目までに最初に観察され、その時点とp.i.20日目との間に完全な炎症が観察された。PBS処置網膜の眼底画像は、視神経円板縁のかすみおよび乳頭周囲領域の拡大、中程度のカフ形成を伴う網膜血管炎、ならびに黄白色の網膜および脈絡膜浸潤を特徴とする重度の炎症を示す(データは示さず)。対照的に、SBT-100処置マウスの網膜の眼底画像は、非常に低い臨床スコアを有する比較的軽度のEAUを示した(データは示さず)。臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに網膜および脈絡膜浸潤に基づいた。眼の断面の組織病理学を免疫後20日目に行った。未処置EAU対照マウスでは、炎症細胞浸潤、視神経円板縁のぼやけ、および血管炎によるいくつかのコンフルエントな病変を伴う特徴的な広範な網膜病変があり、これらはすべて、SBT-100(配列番号1)処置マウスでは軽度であったか、または存在しなかった。EAUスコアは、SBT-100(配列番号1)処置群と比較して、PBS処置群で有意に高かった。眼底検査の結果と一致して、PBS処置した20日目の網膜の組織学は、硝子体内への多数の炎症細胞の浸潤、網膜細胞の破壊、および重度のブドウ膜炎の顕著な特徴である網膜内折り畳みの発達を伴う重度のEAUを明らかにした。
OCTは、生きている動物の様々な眼構造の内部微細構造の視覚化を可能にする非侵襲的手順であり、以前に記載されたように実行された(Ohら、2012)。820nmの中心波長広帯域光源(Bioptigen、NC)を備えたスペクトル領域光干渉断層法(SD-OCT)システムを、対照マウスまたはEAUマウスの眼のインビボ非接触イメージングに使用した。マウスを麻酔し、瞳孔を散大させた。次いで、水平または垂直走査を可能にする容易に回転させることができる調整可能なホルダーを使用してマウスを固定化し、各走査を少なくとも2回行い、毎回再調整した。最適な信号強度およびコントラストが達成されるまで、走査の寸法(深さおよび横方向範囲)を調整した。網膜厚は、システムソフトウェアを使用して、同じ眼からの水平走査および垂直走査の両方から得られたすべての画像の網膜中心領域から測定し、平均した。システムソフトウェアで網膜厚を決定するために使用される方法は、記載の通りであった(Gabriele,M.L.et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci 52,2250-2254(2011))。
OCTにより、PBS処置マウスの硝子体および視神経頭における炎症細胞の蓄積が明らかにされたが、SBT-100(配列番号1)を受けたマウスの網膜では明らかにされなかった(図2B)。OCT画像は、視神経周囲の浸潤細胞の蓄積および視神経円板への損傷を示す(データは示さず)。免疫後18日目の明順応(100cd.s/m2)および暗順応(10cd.s/m2)のa波およびb波は、未処置マウスではSBT-100(配列番号1)処置群と比較して有意に低かった。
網膜電図(ERG)は、眼内炎症中の視覚機能の変化を検出するための確立された臨床方法であり、網膜の光刺激に応答した電位の変化に基づく。光適応刺激下のERGは錐体駆動機能を反映し、一方、暗順応b波応答は桿体駆動活性を表す。ERG記録の前に、マウスを一晩暗順応させ、実験を前述のように(Ohら、2012)、暗赤色照明下で行った。ケタミン(1.4mg/マウス)およびキシラジン(0.12mg/マウス)の単回腹腔内注射でマウスを麻酔し、0.5%トロピカミドおよび0.5%フェニレフリン塩酸塩(参天製薬株式会社、大阪、日本)を含有するミドリアシルで瞳孔を散大させた。ERGを、光刺激を生成および制御する網膜電図コンソール(Espion E2;Diagnosys LLC,Lowell,MA)を使用して記録した。暗順応ERGを、7段階で送達される、-4~1 log cd・s/m2の強度でGanzfeldドーム内に送達される単一フラッシュで記録した。10 cd・s/m2のバックグラウンドで明順応ERGを得て、0.3~100 cd・s/m2で6段階で光刺激を開始した。良好な電気的接触を提供し、角膜水分を維持するために、ゴニスコピックプリズム溶液(Alcon Labs,Fort Worth,TX)を使用した。口の中に基準電極(金線)を入れ、尾の付け根に接地電極(皮下ステンレス針)を置いた。信号を差動的に増幅し、1kHzの速度でデジタル化した。主要ERG成分(a波およびb波)の振幅を、自動および手動の方法を用いて測定した(Espionソフトウェア;Diagnosys LLC)。ERG記録の直後に、眼底の画像化を前述のように行った(Oh,H.M.et al,J.Immunology,2011)。
明順応または暗順応条件下でPBS処置マウスの眼において検出された有意に低いa波およびb波振幅は、PBS処置マウスにおける有意な視覚障害を示唆し、一方、SBT処置マウスにおいて検出されたより高いa波およびb波振幅は、ブドウ膜炎中のSBT-100(配列番号1)媒介性の視力の維持と一致する(図2C)。
例3:SBT-100(配列番号1)は、病原性Th1およびTh17細胞を阻害することによってマウスのブドウ膜炎を抑制した
マウスおよびヒトのブドウ膜炎は、主にTh17サブセットのT細胞によって媒介されると考えられており、Th1サブセットはEAUを有するマウスの眼でも増加するが、ブドウ膜炎の病因におけるその役割は依然として議論の余地がある。この試験で観察されたEAUの改善が、Th17および/またはTh1細胞のレベルのSBT-100誘導性低下に由来するかどうかを調べるために、EAUを有するマウスから細胞を単離した。Th17およびTh1細胞の頻度を、SBT-100(配列番号1)処置マウスの眼、排出リンパ節および脾臓において調べた。
EAUを、CFA中のIRBPで免疫化しPBSまたはSBT100で処置したC57BL/6Jマウスにおいて誘導した。排出リンパ節(DLN)および脾臓DLNの単一細胞懸濁液を作製した。脾臓を切開し、40μm細孔セルストレーナーで引き裂くことによって細胞を除去した。RPMI1640培地で洗浄した後、5mLのACK RBC溶解緩衝液(Quality Biological、MD)を用いて赤血球を3分間溶解した。10倍容量の培地を添加することによって溶解を停止した。2回洗浄した後、細胞を再懸濁し、2×106/mLの濃度で播種した。
細胞内サイトカイン検出のために、細胞をPMA(50ng/ml)/イオノマイシン(500ng/ml)で5時間再刺激した。最後の3時間にGolgiPlugを添加し、推奨されるようにBD Biosciences Cytofix/Cytopermキットを使用して細胞内サイトカイン染色を行った(BD Pharmingen,San Diego,CA)。FACS分析を、以前に記載されたように(Ohら、2012)、タンパク質特異的モノクローナル抗体および対応するアイソタイプ対照Ab(BD Pharmingen,San Diego,CA)を使用してMACSQuant分析装置(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)で行った。蛍光色素とコンジュゲートしたmAbで染色した試料に対してFACS分析を行い、各実験を色補正した。死細胞を死細胞排除色素(Fixable Viability Dye eFluor(登録商標)450;eBioscience)で染色した。アイソタイプ対照を使用してゲートを設定した。
炎症誘発性IL-17および/またはIFN-γサイトカインを分泌するCD4+T細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色アッセイによって検出および定量化した。公表された報告と一致して、PBS処置マウスにおけるEAUの発生は、眼、脾臓およびDLNにおけるIL-17発現(Th17)およびIFNγ発現(Th1)細胞の有意な増加を伴ったが、SBT-100(配列番号1)で処置したマウスのこれらの組織におけるTh1およびTh17のはるかに低いパーセンテージが観察された(図3A)。四分円は、IFN-γまたはIL-17を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。網膜、DLNまたは脾臓におけるROR-γT(図3B)またはグランザイムB(図3C)を発現するCD4+T細胞のパーセンテージ(図3D)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスからの選別したCD4+T細胞を、IRBPおよびIL-17Aでインビトロで再刺激し、3日目の培養上清中に分泌されたIFN-γをELISAによって検出した。
これらの結果は、Th17細胞が器官特異的自己免疫疾患の病因に関与していることを暗示する研究と一致している。Th17分化および発達にはROR-γt転写が必要であり、結果は、Th17細胞の減少がこのTh17マスター転写因子のより低いレベルの検出と相関することを示している(図3B)。Th17リンパ球は中枢神経系に輸送され、グランザイムB放出を介して細胞溶解効果を媒介し、グランザイムBを遮断すると、後期/慢性EAEが改善される。SBT-100の治癒効果と一致して、未処置マウスと比較して、SBT-100で処置したマウス(配列番号1)におけるグランザイムBを産生するCD4 T細胞の顕著な減少が観察された(図3C)。
DLN由来の培養CD4 T細胞の上清中のIL-17およびIFN-γの測定は、SBT-100(配列番号1)処置マウスにおけるこれらのサイトカインのレベル低下と一致した(図3D)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスの脾臓由来の細胞を、細胞内サイトカイン染色によって分析した(図3E)。四分円は、Foxp3、CD25および/またはIL-10を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。驚くべきことに、EAUのSBT-100媒介性阻害は、制御性T細胞の増加と関連しないことが見出された(図3E)。
例4:SBT-100(配列番号1)はブドウ膜形成リンパ球の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎を抑制する
養子移入実験を行って、EAUに対するSBT-100(配列番号1)誘導性防御がT細胞におけるSTAT3経路の標的化の直接的な結果であるかどうかを直接調べた。EAUを有する対照マウスまたはSBT-100処置マウスのリンパ節および脾臓から細胞を単離し、細胞をIRBP651-670でエクスビボで再刺激し、3×107個の細胞をナイーブWT C57BL/6Jマウスに養子移入した。疾患の進行を評価し、細胞の移入の12日後に、眼底検査、組織学、OCTおよびERGによってEAUスコアを決定した。PBS処置マウス由来の細胞を受けたマウスでは炎症細胞の有意な浸潤および血管炎が観察されたが、SBT-100(配列番号1)処置マウス由来の細胞を受けたマウスは重度のEAUから保護された(図4A)。網膜の折り畳みおよび細胞浸潤もまた、SBT-100(配列番号1)処置マウスにおいて減少した(図4B)。OCT画像はまた、視神経周囲の浸潤細胞の有意な蓄積および網膜層の歪みを示す(データは示さず)。有意により高い明順応a波およびb波、ならびに暗順応b波の実質的な増加が、未処置マウスからの細胞を受けたマウスと比較して、SBT-100(配列番号1)処置マウスからの細胞を受けたマウスの眼において検出された(図4C)。データは、少なくとも3回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。これらの結果は、STAT3経路がブドウ膜炎の改善および視覚機能の維持のための潜在的な治療標的であることを示している。
例5:SBT-100(配列番号1)はブドウ膜炎を媒介する病原性Th1およびTh17細胞の増殖に拮抗した
IRBP/CFAによる能動免疫化によるEAUの誘導と同様に、SBT-100(配列番号1)で処理したT細胞の移入は、対照未処理細胞と比較してEAUの移入において非効率的であった。ELISAによるサイトカイン分泌の検出のために、細胞をIRBP651-670ペプチドで48時間特異的に再刺激し、回収した上清を、製造業者によって推奨されるQuantikine ELISAを使用して定量した。
血漿サイトカインをマルチプレックスELISAによって定量した。血漿を1,000xgで10分間の遠心分離によって分離し、LEGENDplexマウス炎症パネルを製造業者(BioLegend,San Diego,CA)によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をCytoFLEX Flow Cytometer(Beckman Coulter,Indianapolis,IN)で行い、BioLegendのLEGENDplex(商標)データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
四分円は、網膜、DLNまたは脾臓においてIFN-γまたはIL-17を発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示し、Th1またはTh17細胞を細胞内サイトカイン染色によって決定した。細胞内サイトカイン染色分析は、SBT-100(配列番号1)で処置したマウスから細胞を受け取ったマウスにおいて病原性Th1およびTh17細胞のレベルの有意な低下を示す(図5A)。PBSまたはSBT-100(配列番号1)で処置したEAUマウスからの選別したCD4+T細胞を、IRBPおよびIL-17Aでインビトロで再刺激し、3日目の培養上清中に分泌されたIFN-γをELISAによって検出した。SBT-100(配列番号1)誘導EAU改善は、それぞれTh1およびTh17の特徴的なサイトカインであるIFN-γおよびIL-17の減少と相関した(図5B)。四分円は、網膜においてROR-gTを発現するCD4+T細胞のパーセンテージを示す。いくつかの自己免疫疾患の病因におけるTh17細胞の十分に確立された役割と一致して、Th17マスター転写因子(ROR-γt)を発現するT細胞のパーセンテージは有意に減少した(図5C)。IL17A、IFN-γ、GM-CSF、IL-1αおよびIL-10の血漿レベルはすべて、マルチプレックスELISAによってPBS処置マウスおよびSBT-100処置マウスにおいて検出された。未処置マウスまたはSBT-100処置マウスから細胞を受けたマウスの血清の分析により、SBT-100(配列番号1)処置群からの血清は、IL-17、IFN-γ、IL23、GM-CSFおよびIL-1aを含む炎症促進性サイトカインの有意な減少を有することが明らかになり、SBT-100(配列番号1)処置がEAUを抑制することをさらに示唆する証拠が提供された(図5D)。データは、少なくとも2回の独立した実験を表し、平均±SEMとして表される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明されているが、他の実施形態も可能である。本方法のために開示された工程は、例えば、限定することを意図するものでも、各工程が本方法に必須であることを示すことを意図するものでもなく、例示的な工程にすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
Claims (10)
- 単一ドメイン抗体(sdAb)を使用して対象のブドウ膜炎を処置する方法であって、前記sdAbが配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記sbAbが1つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記ブドウ膜炎が、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスである、請求項1に記載の方法。
- 単一ドメイン抗体(sdAb)を使用して対象のブドウ膜炎を予防する方法であって、前記sdAbが配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項6に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項6に記載の方法。
- 前記sbAbが1つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項6に記載の方法。
- 前記ブドウ膜炎が、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスである、請求項6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US63/219,161 | 2021-07-07 |
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Publication Number | Publication Date |
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JP2024525990A true JP2024525990A (ja) | 2024-07-12 |
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