JP2024522236A - イソキノリンアルカロイド化合物とその製造方法と使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、下記構造式で示される化合物から選ばれるイソキノアルカロイド化合物及びその製造方法及び応用を提供している。本発明は、このイソキノリンアルカロイド化合物が神経系、心血管系、膵臓中のＩＫカリウム電流とバックグラウンドカリウム電流の阻害剤であることを初めて実証した。特に、Ｋｖ２．１チャンネルとＴＲＳＫチャンネルの阻害剤は、脳卒中、不整脈、心房細動、糖尿病、疼痛、呼吸抑制、抑うつなどの疾患の治療に用いることができる。TIFF2024522236000010.tif31162
Description
本発明は、植物の有効成分の分離分野と医薬保健分野に属し、詳しくは、山椒の有効成分とその分離と使用に関し、特にイソキノリンアルカロイド化合物とその製造方法と使用に関する。
アルカロイドは、山椒属植物の主要な活性物質であり、鎮痛、抗炎症活性を有し、独特のピリピリ感をもたらす特徴成分と考えられている。これらのアルカロイドは、その母核によって、キノリン誘導体系、イソキノリン誘導体系、ベンゾフェナントリジン誘導体系、キノロン誘導体系の４種類に分類され、そのうちイソキノリンアルカロイドは、その有意な薬理活性によって特徴的な成分となる。
電圧制御カリウムイオンチャンネル（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋｖ）は、現在、１２のサブファミリーである、Ｋｖ１．ｘ～Ｋｖ１２．ｘ、約８０のファミリーメンバーを発見した。このうち、Ｋｖ５、Ｋｖ６、Ｋｖ８、Ｋｖ９サブファミリーのメンバーは単独で機能的な通路を形成することができず、サイレントサブユニト（Ｓｉｌｅｎｔ Ｋｖ ｓｕｂｕｎｉｔｓ，ＫｖＳ）と呼ばれる。ＫｖＳチャンネルは、Ｋｖ２．１チャンネルと機能的なヘテロマーチャンネルを形成し、Ｋｖ２．１チャンネルの電流幅、活性化と不活性化電圧、動力学的特徴などを調節することができる。現在の研究によると、Ｋｖ２．１チャンネルは、背根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ、ＤＲＧ）、三叉神経節（Ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ、ＴＲＧ）、膵島、海馬、心血管系などの初代組織と細胞中の遅延整流カリウム電流（Ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔｓ，ＩＫ））を介する主要な分子基礎である考えられ、例えば培養した小径ＤＲＧニューロンでは、Ｋｖ２．１とＫｖ２．１／ＫｖＳチャンネルが約６０%を占めている。一方、Ｋｖ１．ｘとＫｖ３．ｘは、約４０%を占めている（Ｂｏｃｋｓｔｅｉｎｓ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６（６）： Ｃ１２７１－８， ２００９）。
ＩＫカリウム電流とその主要な分子基礎であるＫｖ２．１チャンネルは、人体の正常な生理機能と疾病状態において重要な機能を発揮する。中枢Ｚｎ２＋で誘導される脳卒中後の神経死亡促進経路の中で、ニューロン膜表面のＫｖ２．１の過発現はＫ＋外排出を引き起こし、ニューロンの死亡を悪化させ、Ｋｖ２．１の抑制が神経保護と脳卒中治療の効果を発揮できる（Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２１（１７）：６１０７， ２０２０）。循環器系では、ＩＫ電流が心筋の活動電位の再分極を媒介し、心拍数と血圧の調節に関与する（Ｍａｄｅｊａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８５（４４）： ３３８９８－９０５， ２０１０）。膵島では、上昇した血糖値は、膵島β細胞膜電位の脱分極を刺激し、活性化されたＫｖ２．１チャンネルの過分極膜電位は神経興奮性を低下させ、インスリンの分泌を減少させる。Ｋｖ２．１を抑制することで膵島β細胞の活動電位の時間と幅を増加させ、さらにインスリン分泌を増加させ、血糖値を下げることができる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ６（３）：２２９－３５， ２００７）。ＩＢ４陰性の小径ＤＲＧニューロンは主にＩＫ電流であり、この電流は安静膜電位を過分極し、後過分極電位（Ａｆｔｅｒ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， ＡＨＰ）の幅と時間を増大させ、放電閾値を上昇させ、動作電位時間を延長する（Ｖｙｄｙａｎａｔｈａｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． ９３（６）： ３４０１－９， ２００５）。海馬ニューロンと三叉神経節ニューロンの連続刺激放電中では、Ｋｖ２．１の神経興奮に対する調節作用は刺激スケジュールに依存し、Ｋｖ２．１チャンネルを抑制して前半の発行頻度を高め、後半の発行頻度を抑制する（Ｌｉｕ ＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３４（１４）： ４９９１－５００２， ２０１４）。したがって、Ｋｖ２．１またはＩＫ電流を抑制することは、カプサイシン誘導のような神経興奮性脱感作効果を誘発し、鎮痛効果を発揮する（Ａｒｏｒａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ２２０：１０７７４３， ２０２１）。これらに基づいて、ＩＫ電流またはＫｖ２．１チャンネルを抑制することにより、脳卒中、不整脉、糖尿病、疼痛などの疾患を緩和または治療することができる。
二穴カリウムチャンネル（ｔｗｏ－ｐｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ、Ｋ２Ｐ）は、背景カリウムイオンのリーク電流を介し、細胞の安静膜電位の維持に重要な役割を果たし、調経動作電位の形成と放出を行う。現在、哺乳動物には１５個のＫ２Ｐチャンネルがクローン化され、ＴＷＩＫ、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ、ＴＡＬＫ、ＴＨＩＫ、ＴＲＥＳＫという６つのサブファミリーに分けられている。山椒から分離したα－ヒドロキシサンショオールは、それぞれ二孔カリウムチャンネルＤＲＧとＴＲＧニューロン中のＴＲＳＫ（ＫＣＮＫ１８）とＴＡＳＫ１/ＴＡＳＫ３（ＫＣＮＫ３/ＫＣＮＫ９）チャンネルを抑制し、小径と大径のニューロンの発行を促進し、しびれ感を生じる（Ｂａｕｔｉｓｔａ ＤＭ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１（７）： ７７２－９， ２００８）。また、ＴＲＳＫとＴＡＳＫ１／ＴＡＳＫ３チャンネルの拮抗薬は、心房細動、呼吸抑制と抑うつを治療する作用があると考えられる（Ｍａｔｈｉｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ． ６１： ４０１－４２０， ２０２１）。
山椒からはイソキノリン誘導体などを含む多くの活性成分が分離されているが、これらの活性成分の作用機序は一般的には不明である。この分野では、構造が斬新で、メカニズムがはっきりしており、応用疾患タイプが具体的な活性分子も必要である。
本発明は、初めて山椒から抽出した３つの文献に報告されていないイソキノアルカロイド化合物を発見し、公開した。深く研究した結果、このイソキノリンアルカロイド化合物は、神経系、心血管系、膵臓中のＩＫカリウム電流の阻害剤であり、特にＫｖ２．１チャンネルの阻害剤であることが初めて実証された。また、このイソキノリンアルカロイド化合物は、ＴＲＳＫカリウムチャネルに対しても抑制作用があり、すでに報告されているα－ヒドロキシサンショオールよりも活性が強い。このことから、本発明は典型的な炎症性疼痛動物モデルを用いて、このイソキノリン誘導体は鎮痛の体内活性を有することを実証した。
したがって、本発明の目的は、イソキノリンのアルカロイド化合物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、上記イソキノリンアルカロイド化合物の製造方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、上記イソキノリンアルカロイド化合物の用途を提供することである。
一態様では、本発明は、下記構造式で示される化合物から選ばれるイソキノリンアルカロイド化合物を提供している。
別の態様では、本発明は、上記イソキノリンアルカロイド化合物の製造方法であって、
（１）乾燥山椒を粉砕し、溶媒で浸出し、抽出液を濃縮して山椒濃縮抽出物を得る工程と；
（２）山椒濃縮抽出物を水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールでそれぞれ抽出し、石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相、水相を得る工程と；
（３）酢酸エチル相を、２００～３００メッシュのシリカゲルカラムに石油エーテル－アセトン混合液を溶離液として用いて勾配溶離し、石油エーテル：アセトン体積比がそれぞれ５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、８：１、５：１、２：１、１：１で、順次に６つの留分のＦｒ．１～Ｆｒ：６を得て、そのうち、Ｆｒ．４を逆相シリカゲルＣ１８カラムに水－メタノール混合液を溶離液として勾配溶離を行い、水：メタノールの体積比が１：１、１：２、１：４の順で８つの留分Ｆｒ．４－１～Ｆｒ．４－８を得て；留分Ｆｒ．４－６をＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムに水－メタノール混合液を溶離液として溶離し、そのうち体積分率９０%のメタノール／水で溶離して化合物ＨＪ－６８を得て；体積分率８０%のメタノール／水で溶離してそれぞれＨＪ－６９とＨＪ－７０を得る工程と、
を含む、製造方法を提供している。
を含む、製造方法を提供している。
上記工程（３）において、例えば、６つの留分Ｆｒ．１～Ｆｒ．６は、溶離液を５００ｍＬビーカーで受け取り、一連の溶離液を順次得て、ビーカーあたり５００ｍＬ溶液を蒸発させ、蒸発後サンプルボトルに移し；酢酸エチル相の溶離が終了すると、薄層クロマトグラフィでプレートをスポットし、同じ成分のサンプルを同じ留分に合併することにより、順次に前記６つの留分Ｆｒ．１～Ｆｒ．６を得ることにより製造される。しかしながら、本発明はこれらに限定しない。
上記工程（３）において、例えば、８つの留分Ｆｒ．４－１～Ｆｒ．４－８は、溶離液を５０ｍＬの目盛り付き試験管で受け取り、一連の溶離液を順次得て、試験管あたり５０ｍＬの溶液を蒸発させ、蒸発後サンプルボトルに移し；溶離が終了すると、逆相高速薄層クロマトグラフィープレートでプレートをスポットし、同じ成分のサンプルを同じ留分に合併することにより、順次に前記８つの留分Ｆｒ．４－１～Ｆｒ．４－８を得ることにより製造される。しかしながら、本発明はこれらに限定しない。
山椒から分離して得られた３つの化合物ＨＪ－６８、ＨＪ－６９、ＨＪ－７０はすべてイソキノアルカロイドであり、その構造式は以下の通りである。
本発明の製造方法の工程（１）において、前記溶媒は、水、メタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタンから選択される１種または２種以上の混合溶媒であってもよく、そして、その実例は、アルコール類を含むがこれに限定されるものではなく、例えば、７０%エタノール水溶液、エタノール、７０%メタノール水溶液、メタノール、アセトン、ジクロロメタン、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明の製造方法の工程（１）において、浸出は室温浸漬でも加熱還流抽出でもよい。浸出は１回以上行うことができる。溶媒で室温に３回浸漬抽出し、毎回５～７日間行い、または加熱還流抽出を３回行い、毎回１～２時間で行うことが好ましい。
本発明の製造方法の工程（３）において、好ましくは、化合物ＨＪ－６８の液相分離条件として、メタノール／水＝９０／１０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである。
本発明の製造方法の工程（３）において、好ましくは、化合物ＨＪ－６９の液相分離条件として、メタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである。
本発明の製造方法の工程（３）において、好ましくは、化合物ＨＪ－７０の液相分離条件として、メタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである。
本発明は、上記イソキノリンアルカロイド化合物がＤＲＧニューロンの遅延整流カリウム電流（ＩＫ）を選択的に抑制し、ＤＲＧニューロンのナトリウム電流、瞬時外向カリウム電流）ＩＡ）に有意な作用がないことを初めて明らかにした。
本発明は、さらに、上記イソキノリンアルカロイド化合物がＩＫ電流の主要な分子基礎であるＫｖ２．１カリウムチャネルの拮抗薬として、ＩＫ電流と同等の阻害活性を有することを実証した。
従って、さらに別の態様では、本発明は、遅延整流カリウム電流（ＩＫ）、特にＫｖ２．１チャンネルの拮抗薬の製造における上記イソキノリン化合物の使用を提供する。
具体的には、本発明は、ＩＫ電流、特にＫｖ２．１チャンネルの拮抗薬とする上記イソキノアルカロイド化合物の使用を提供しているので、上記イソキノアルカロイド化合物は、例えば、脳卒中、不整脈、糖尿病、痛みなどの疾患、特に痛みを緩和または治療するための薬物として有用である。
また、本発明では、Ｋ２Ｐ二孔カリウムチャネル、特にＴＲＳＫチャネルの拮抗薬として、上記イソキノアルカロイド化合物が初めて開示されており、本発明により、上記イソキノアルカロイド化合物のＫ２Ｐチャネルに対する阻害活性は、報告されているα－ヒドロキシサンショオールよりも強いことが確認された。
従って、さらに別の態様では、本発明は、Ｋ２Ｐ二孔カリウムチャンネル、特にＴＲＳＫチャンネルの拮抗薬の製造における上記イソキノリン化合物の使用を提供している。
具体的には、本発明は、Ｋ２Ｐ二孔カリウムチャンネル、特にＴＲＳＫチャンネルの拮抗薬とする上記イソキノアルカロイド化合物の使用を提供しているので、上記イソキノアルカロイド化合物は、例えば、心房細動、呼吸抑制および／または抑うつなどの疾患を緩和または治療するための薬物として有用である。
したがって、また別の態様では、本発明は、脳卒中、不整脈、糖尿病、疼痛、心房細動、呼吸抑制および／または抑うつ疾患の治療薬の製造における上記イソキノリン化合物の使用を提供している。
以下、本発明の本質と効果を実施例に基づいてさらに説明するが、この実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
実施例
以下の実施例で使用する実験方法は、特に断りのない限り、通常の方法である。
下記の実施例で使用する材料、試薬などは、特に断りのない限り、商業的なルートから入手することができる。
抽出サンプル：山椒。
浸出、抽出溶媒及び精製化合物を分離する溶媒：エタノール、水、石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノール。
機器：抽出タンク（自作）、東京理化２０Ｌロータリーエバポレーター（東京理化、日本）、Ｒ－２１０ロータリーエバポレーター（ＢＵＣＨＩ社、スイス）、最大流速１０ｍＬの分析高速液体クロマトグラフ（江蘇漢邦科技有限会社）、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ－４００核磁気共鳴装置（Ｂｒｕｋｅｒ社、ドイツ）、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ－Ｑ ＩＩ高分解能質量分析装置（Ｂｒｕｋｅｒ社、ドイツ）、ＩＦＳ１２０ＨＲ ６７０ ＦＴ－ＩＲ赤外分光装置（Ｂｒｕｋｅｒ社、ドイツ）、Ｌａｍｂｄａ ３５紫外可視分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国）。
実施例１：山椒の活性成分の抽出方法
１．１ 乾燥山椒を粉砕し、その質量の１０倍量の７０%エタノールで室温に３回浸漬抽出し、毎回５－７日間で、抽出液を合併してアルコールの味がしないまで濃縮し、山椒濃縮抽出物を得た。
山椒濃縮抽出物を水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールでそれぞれ抽出し、石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相、水相を得た。
酢酸エチル相を、２００～３００メッシュのシリカゲルカラムに石油エーテル－アセトン混合液を溶離液として用いて勾配溶離し（混合液中の石油エーテル：アセトン体積比がそれぞれ５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、８：１、５：１、２：１、１：１）、溶離液を５００ｍＬビーカーで受け取り、ビーカーあたり５００ｍＬ溶液を蒸発させ、蒸発後サンプルボトルに移した。酢酸エチル相の溶離が終了した後、薄層クロマトグラフィでプレートをスポットし、同じ成分のサンプルを同じ留分に合併することにより、合計６つの留分Ｆｒ．１～Ｆｒ．６を得た。
そのうち、Ｆｒ．４を逆相シリカゲルＣ１８カラムに水－メタノール混合液を溶離液として勾配溶離を行い、水：メタノールの体積比がそれぞれ１：１、１：２、１：４であり、最後にメタノールでカラムを流し、溶離液を５０ｍＬの目盛り付き試験管で受け取り、試験管あたり５０ｍＬの溶液を蒸発させ、蒸発後サンプルボトルに移した。溶離が終了した後、逆相高速薄層クロマトグラフィープレートでプレートをスポットし、同じ成分のサンプルを同じ留分に合併することにより、合計８つの留分Ｆｒ．４－１～Ｆｒ．４－８を得た。
留分Ｆｒ．４－６は最大流速１０ｍＬ／ｍｉｎの分析液相、型番はＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８の１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、移動相流速４ｍＬ／ｍｉｎで分離し、化合物ＨＪ－６８（移動相は体積分率９０%のメタノール／水、ピークアウト時間５．４ｍｉｎ）；ＨＪ－６９（移動相は体積分率８０%のメタノール／水で、ピークアウト時間は１０．１ｍｉｎ）；ＨＪ－７０（移動相は体積分率８０%のメタノール／水で、ピークアウト時間は１２．０ｍｉｎ）を得た。
化合物Ｎ－１３－イソブチルルテカルピン（ＨＪ－６８）の実験データは以下の通りである。黄色針状結晶；赤外スペクトルＩＲ（フィルム）νｍａｘ ２９２６， ２５５ ２８５８， １７２８， １６６９， １６３７， １５８７， １４６５， １２９２， １１３０ ｃｍ－１；紫外スペクトルＵＶ（ＣＨ３ＯＨ） λｍａｘ （ｌｏｇ ε） ２１６ （３．０６）， ２３４ （２．９９）， ３２９ （２．９９）， ３４５ （３．０５）， ３６２ （２．９５） ｎｍ；プロトン磁気共鳴１Ｈと炭素磁気共鳴１３Ｃ ＮＭＲが、表１に示し；高分解能質量分析ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ/ｚ ３４４．１７６４ [Ｍ ＋ Ｈ]＋ （Ｃ２２Ｈ２２Ｎ３Ｏに対する計算値， ３４４．１７５７）。
化合物Ｎ－１３－メチルプロピルエーテルルテカルピン（ＨＪ－６９）の実験データは以下の通りである。黄色針状結晶；赤外スペクトルＩＲ（フィルム）νｍａｘ ２９２４， ２８７２， １６６２， １５８５， １５３４， １４６５， １３３２， １２０３， １１１４ ｃｍ－１；紫外スペクトルＵＶ（ＣＨ３ＯＨ） λｍａｘ （ｌｏｇ ε） ２１５ （３．３４）， ２３５ （３．２８）， ３２８ （３．２８）， ３４４ （３．４４）， ３６２ （３．２４） ｎｍ；プロトン磁気共鳴１Ｈと炭素磁気共鳴１３Ｃ ＮＭＲが、表１に示し；高分解能質量分析ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ/ｚ ３８２．１５３０ [Ｍ ＋ Ｎａ]＋ （Ｃ２２Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｎａに対する計算値， ３８２．１５２６）。
化合物Ｎ－１３－ｎ－プロパノールルテカルピン（ＨＪ－７０）の実験データは以下の通りである。黄色針状結晶；赤外スペクトルＩＲ（フィルム）νｍａｘ ３４３０， ２９２５， ２８５７， １７２９， １６６５， １５８６， １４６６， １２９１， １０４８ ｃｍ－１；紫外スペクトルＵＶ（ＣＨ３ＯＨ） λｍａｘ （ｌｏｇ ε） ２１６ （３．３３）， ２３５ （３．２６）， ３２９ （３．２４）， ３４４ （３．２９）， ３６１ （３．１８） ｎｍ；プロトン磁気共鳴１Ｈと炭素磁気共鳴１３Ｃ ＮＭＲが、表１に示し；高分解能質量分析ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ/ｚ ３４６．１５４２ [Ｍ ＋ Ｈ]＋ （Ｃ２１Ｈ２０Ｎ３Ｏ２に対する計算値， ３４６．１５５０）。
実施例２：ＨＪ－７０が背根神経節の動作電位及びカリウムイオンに対する影響
２．１ 背根神経節の分離と培養：４－６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（上海スレイク実験動物有限責任会社）を採取し、背根神経節ニューロン細胞の急性分離を行った。まず、首を切断して処刑し、表面の皮膚を７５%アルコールで消毒処理し、首の皮膚切開口から臀部まで切り、首から腰までの脊柱を切り、余分な筋肉と血塊を取り除き、予冷されたリン酸塩緩衝液ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）に入れ、脊柱を正中線に沿って縦に切り、眼科ピンセットで真ん中の白い脊髄と血塊を取り除き、椎間孔を露出させ、その中の背根神経結節を微細ピンセットで取り出し、その中、腰の大きな結節に対して繊維連結を剥離した。その後、神経節を顕微解剖で切り取って、コラゲナーゼ１ｍｌ（１ｍｇ／ｍＬ）とトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の混合液に加入して１５ｍｉｎ消化を行い、その後、胎牛血清１０%を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ社）を加えて消化停止及び希釈を行い、、繰り返し細胞を吹き飛ばし、７０uMの細胞フィルターで大組織塊を濾し、残りの液体をあらかじめポリリシン（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社）でコーティングされたガラス板に接種し、５%ＣＯ２、３７℃インキュベーターで培養した。
２．２ 背根ニューロンの動作電位とカリウム電流の記録：デジタル・アナログ変換器Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａｘｏｎ ＣＮＳとパッチクランプ増幅器ａｘｏｎｐａｔｃｈ７００ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で全細胞パッチクランプ記録を行い、Ｓｕｔｔｅｒ-Ｐ１０００電極製造装置（Ｓｕｔｔｅｒ社）により手動パッチクランプ実験で使用した硼珪酸ガラス電極を製造し、電極用輸液抵抗は３ＭΩ程度で、灌流速度は約２ｍＬ/ｍｉｎであった。動作電位記録案は、細胞を０ｐＡにクランプし、注射強度を２００ｐＡ、時間５００ｍｓの電流刺激で動作電位誘発放電記録を行った。ニューロンのカリウム電流電気生理実験記録：細胞を－５０ｍＶの電圧にクランプし、－１１０ｍＶ、６００ｍｓに超分極した後、直接４０ｍＶに脱分極して全細胞のカリウム電流（ＩＴｏｔａｌ）を記録し；先に－５０ｍＶまで脱分極し、５０ｍｓを維持し、次に４０ｍＶまで脱分極すると、遅延整流カリウム電流（ＩＫ）を記録した。１０uM ＨＪ－７０の灌流投与で薬効を検出し、陽性対照として５ｍＭ ＴＥＡを投与した。
２．３ 海馬ニューロンの急性分離：予めプロテァーゼ（ｔｙｐｅ ＸＸIII、Ｓｉｇｍａ）９ｍｇを取り、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、上海生工）及びトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）のそれぞれを各５ｍｇ取り、分解液でそれぞれ３ｍｇ/ｍＬと５ｍｇ/ｍＬの酵素と終止液を調製し、３２ ℃の水浴中で酸素を通した。ＳＤラットの１－７日間新生マウス２匹（上海スレイク実験動物有限責任会社）を取り、断頭後、皮質、頭蓋骨を切断し、完全な脳を取り出し、脳の中心線で二つに分け、海馬は大脳側頭葉に位置し、側頭葉皮質をかき分け、海馬回を露出させ、剥離を行った。その後、海馬組織を分解液で少し湿らせ、ブレードで横に薄くスライスし、スライスを消化液に移して８ｍｉｎ消化した後、消化液を捨てて、終止液を入れて酸素を通し１－２時間放置した。海馬の形をとった３－４個の切片を分解液に入れて吹きさらして懸濁液にし、少し大きな組織を沈殿させ、懸濁液を調製した皿に滴下し、数分間静置した後、細胞外液で分解液の半分を交換し、速やかな投与によりニューロン上のカリウム、ナトリウムチャンネルのパッチクランプ実験を行った。
２．４ 海馬ニューロンの初代培養：ＰＢＳで同じ濃度の酵素と終止液を調製し、９０% ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０% ＦＢＳの培地、ニューロン培養液（２%Ｂ－２７＋１%ペニシリンとストレプトマイシンの混合液＋０．５ｍＭ １%ＧｌｕｔａＭＡＸのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ）、酵素と終止液（いずれもＧｉｂｃｏ社から購入）を予め加熱した。２０ uｇ／ｍＬのポリリシンで予め２４ウェルプレートにカバーガラスをコーティングした。すべての操作はバイオセーフティキャビネットで行われた。ＳＤラットの１－３日間新生マウス３匹を取り、上記の方法で海馬を取り出し、これを顕微解剖カッターで切断し、酵素に入れて８ｍｉｎ消化し、２－３ｍｉｎごとに軽く振って消化を均一にした後、酵素液を吸い出し、終止液を加えて終止し、懸濁液になるまで優しく吹きかけ、７０uMフィルターで濾過し、濾液を１１００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離した。上澄み液を捨て、培地５ｍＬを加えて再懸濁し、細胞計数器で計数し、その終濃度を１０５個／ｍＬに調整した。二酸化炭素インキュベーターに入れて培養し、６時間後にニューロン培養液で全液交換を行い、その後３日間ごとに培地を半分交換した。培養１４後、灌流投与によりニューロンの自発放電の電気生理記録を行った。
２．５ 実験結果の分析：Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０．２でデータを処理し、それをＥｘｃｅｌ表にインポートして統計を行い、その後ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍ５ソフトウェアでデータを整理し、有意な差異分析を行った。瞬時外向きカリウム電流は、全細胞カリウム電流から遅延整流カリウム電流を差し引いて得られた。すべての電気生理実験データは、平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表され、データに対する有意な差異の比較はペアｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｐａｉｒｅｄ）を採用し、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１で両グループ間に有意性があり、統計学的意義があることを表した。
その結果、１０uM ＨＪ－７０は培養した海馬ニューロンの自発放電を有意に抑制できることが分かった（図１ＡとＢ）。また、１０uM ＨＪ－７０は背根ニューロン（ＤＲＧ）の動作電位が放電を誘発する頻度を有意に抑制することができた（図ＣとＤ）。そのため、ＨＪ－７０は中枢と末梢ニューロンの興奮性を抑制することができる。
ナトリウム電流とカリウム電流はニューロンの放電を介する典型的な分子基礎であり、ＨＪ－７０がニューロンの電気的興奮性を抑制することを考慮して、発明者はさらにＨＪ－７０がＤＲＧと海馬ニューロン中のカリウム電流とナトリウム電流に対する影響を検出した。図２Ｂと２Ｃに示すように、ＨＪ－７０はＤＲＧ中のＩＫ電流を用量依存的に抑制することができたが、ＩＡ電流に有意な影響はなかった。注目すべくのは、ＨＪ－７０によるＩＫ電流の抑制作用が完全に溶離することができ、ＨＪ－７０によるＩＫ電流の可逆的抑制を示した。ＨＪ－７０による末梢神経系のＤＲＧニューロン活性抑制も可逆的であり、用量依存的に海馬ニューロンＩＫ電流を抑制し、ＩＡ電流には影響しなかった（図３）。
さらにＨＪ－７０が海馬ニューロン中のナトリウム電流に対する影響を検出したところ、１０uMのＨＪ－７０は海馬ニューロン中のナトリウム電流には影響がなく（図３Ａ）、１uMのナトリウムチャンネル選択性阻害剤はナトリウム電流を完全に抑制できることがわかった（図３Ｂ）。
上記をまとめて、ＨＪ－７０用量依存性はニューロン中のＩＫ電流を抑制し、ＩＡカリウム電流とナトリウム電流に影響を与えず、海馬ニューロンとＤＲＧニューロンの電気的興奮性を低下させた。
実施例３：ＨＪ－７０のＫｖ２．１とＴＲＳＫチャンネルの電流への抑制
３．１ 細胞電気生理実験：まず、ＴＲＳＫプラスミド（ジョンズ・ホプキンス大学利民教授恵贈）とＫｖ２．１プラスミド（ジョンズ・ホプキンス大学利民教授恵贈）をそれぞれ緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰプラスミド（上海薬物研究所李佳研究員恵贈）と９：１の割合でＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ社）に共同でトランスフェクションし、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光のある細胞を選んで実験を行い、細胞を－７０ｍＶにクランプし、まず－１３０ｍＶに超分極し、２０ｍＶまでのｒａｍｐ脱分極刺激を与え、１００ｍｓを維持した後、０ｍＶに超分極してカリウムチャンネル電流を記録した。１０uM ＨＪ－７０を灌流投与し、その薬効を検出した。
３．２ 実験結果の分析：現在の研究により、Ｋｖ２．１チャンネルはＩＫ電流を介する主要な分子基礎であることが明らかになった（詳しくは背景紹介部分を参照）。ＨＪ－７０の用量依存性によるＩＫ電流の抑制に鑑み、発明者はＫｖ２．１電流への影響をさらに検出した。図５Ａと図５Ｂに示すように、１０uM ＨＪ－７０はＫｖ２．１チャンネルを介した電流を完全に抑制し、この結果はニューロン内の活性と一致した。また、山椒中のもう一つの有効成分であるα－ヒドロキシサンショオールはニューロン中のＴＲＥＳＫとＴＡＳＫ１／ＴＡＳＫ３チャンネルを抑制し、半数有効用量は約５０uMである。そこで、ＨＪ－７０がＴＲＥＳＫチャネルに対する影響を評価したところ、１０uMのＨＪ－７０はＴＲＳＫチャネル電流をほぼ完全に抑制していることが分かり（図５ＣとＤ）、これにより、ＨＪ－７０はα－ヒドロキシサンショオールよりもＴＲＥＳＫに対する阻害活性が強いことが示唆された。以上の結果から、ＨＪ－７０はＫｖ２．１とＴＲＥＳＫカリウムチャンネルの阻害剤であることが分かった。
実施例４：ＨＪ－７０のホルムアルデヒドによる炎症性疼痛に対する顕著な緩和
４．１ 疼痛モデル実験：１０%ホルムアルデヒド溶液を１０倍に希釈して１%ホルムアルデヒド溶液を調製し、５% ＤＭＳＯ、５% Ｔｗｅｅｎ－８０及び９０%生理食塩水（０．９%ＮａＣｌ溶液）で１００ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇのＨＪ－７０化合物を調製した。実験前３０ｍｉｎはマウス１匹につき０．２ｍＬ／１０ｇの投与量で投与を行い、その後、微量注入針の足底から２０μＬの１%ホルムアルデヒド溶液を注射することでホルマリンモデルを作成し、それぞれ６０ｍｉｎ以内に後爪舐め、後爪振り、爪の持ち上げ回数と、爪舐め、長時間持ち上げた爪の時間を記録した。爪舐めが３点、爪振りが２点、爪上げが１点とし、疼痛行動学的スコアと時間を集計してＨＪ－７０鎮痛活性を判断した。
４．２ 実験結果の分析：電気生理データ処理と同じようにデータの整理と統計を行い、その後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで一要素分散（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で分析したところ、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１は両グループ間に有意差があり、統計学的意義があることを示した
発明者は、ＩＫカリウム電流とバックグラウンドカリウム電流、特に脳卒中、不整脈、糖尿病、疼痛、心房細動、呼吸抑制および／または抑うつ疾患におけるＫｖ２．１とＴＲＥＳＫチャンネルの重要な役割（詳しくは背景紹介部分を参照）を考慮し、ＨＪ－７０の疼痛に対する作用を評価した。ホルマリン誘導マウス疼痛モデルは典型的な炎症性疼痛動物モデルであり、鎮痛薬の発見と研究に広く用いられている。体外実験の結果と一致して、発明者はＨＪ－７０を腹腔内投与することで、用量依存的にマウスの足底にホルマリン注射で誘導される疼痛行動反応を緩和することを発見した（図５Ｄ、Ｅ）。この結果は、ＨＪ－７０が明確な体内活性を有することを示した。
Claims (9)
- 下記構造式で示される化合物から選ばれるイソキノリンのアルカロイド化合物。
- 請求項１に記載のイソキノリンアルカロイド化合物の製造方法であって、
（１）乾燥山椒を粉砕し、溶媒で浸出し、抽出液を濃縮して山椒濃縮抽出物を得る工程と；
（２）山椒濃縮抽出物を水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールでそれぞれ抽出し、石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相、水相を得る工程と；
（３）酢酸エチル相を、２００～３００メッシュのシリカゲルカラムに石油エーテル－アセトン混合液を溶離液として用いて勾配溶離し、石油エーテル：アセトン体積比がそれぞれ５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、８：１、５：１、２：１、１：１で、順次に６つの留分のＦｒ．１～Ｆｒ：６を得て、そのうち、Ｆｒ．４を逆相シリカゲルＣ１８カラムに水－メタノール混合液を溶離液として勾配溶離を行い、水：メタノールの体積比が１：１、１：２、１：４の順で８つの留分Ｆｒ．４－１～Ｆｒ．４－８を得て；留分Ｆｒ．４－６をＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムに水－メタノール混合液を溶離液として溶離し、そのうち体積分率９０%のメタノール／水で溶離して化合物ＨＪ－６８を得て；体積分率８０%のメタノール／水で溶離してそれぞれＨＪ－６９とＨＪ－７０を得る工程と、
を含む、製造方法。
- 請求項２に記載の製造方法であって、
工程（１）において、前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタンから選択される１種または２種以上の混合溶媒であり、好ましくは、体積分率７０%のエタノール水溶液、エタノール、体積分率７０%のメタノール水溶液、メタノール、アセトン、ジクロロメタン、またはこれらの組み合わせから選ばれるものであり、
工程（１）において、浸出が室温浸漬または加熱還流抽出であり、好ましくは、浸出が１回以上行い、さらに好ましくは、溶媒で室温に３回浸漬抽出し、毎回５～７日間で行い、または加熱還流抽出を３回行い、毎回１～２時間で行う、
製造方法。
- 工程（３）において、化合物ＨＪ－６８の液相分離条件として、メタノール／水＝９０／１０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである、請求項２に記載の製造方法。
- 工程（３）において、化合物ＨＪ－６９の液相分離条件として、メタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである、請求項２に記載の製造方法。
- 工程（３）において、化合物ＨＪ－７０の液相分離条件として、メタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）が移動相で、流速が４ｍＬ／ｍｉｎであり；カラムの型番がＭｅｇｒｅｓ Ｃ１８カラムで、カラムの長さ×直径が２５０ｍｍ×２０ｍｍである、請求項２に記載の製造方法。
- 遅延整流カリウム電流（ＩＫ）、特にＫｖ２．１チャンネルの拮抗薬の製造における請求項１に記載のイソキノリン化合物の使用。
- Ｋ２Ｐ二孔カリウムチャンネル、特にＴＲＳＫチャンネルの拮抗薬の製造における請求項１に記載のイソキノリン化合物の使用。
- 脳卒中、不整脈、糖尿病、疼痛、心房細動、呼吸抑制および／または抑うつ疾患の治療薬の製造における請求項１に記載のイソキノリンアルカロイド化合物の使用。
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