JP2024521919A - ネオデグラダー－抗ｃｄ３３抗体コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗ＣＤ３３抗体にコンジュゲートしたネオデグラダーを提供する。また提供されるのは、該コンジュゲートを含む、組成物である。化合物および組成物は、処置を必要とする対象における、疾患または状態、例えば、癌の処置に有用である。

Description

電子的に提供した配列表についての言及
本出願と共にASCIIテキストファイル(Name:4547_017PC02_Seqlisting_ST25；サイズ：４２、７２４バイト；および作成日：２０２２年５月３１日)で電子的に提供した配列表の内容を、引用により全体として本明細書に包含させる。
分野
本発明は、ネオデグラダーが抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分にコンジュゲートしている、ネオデグラダーコンジュゲートを提供する。また提供されるのは、該コンジュゲートを含む、組成物である。該コンジュゲートおよび組成物は、処置を必要とする対象における癌の処置に有用である。
背景
タンパク質分解は、免疫調節性イミド薬物の有効性により治療戦略として実証されている。これらの化合物はセレブロン(ＣＲＢＮ)と結合し、ＣＲＬ４ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼにより介在される基質タンパク質の動員およびユビキチン化を促進する能力を有する。免疫調節性イミドは「分子糊」として作用し、リガーゼとネオ基質の間のタンパク質相互作用を再プログラミングする疎水性パッチとして結合接合面を満たすと考えられる。
これらの化合物が新規癌処置として興奮をもたらしたにも関わらず、現在まで多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)などの血液系腫瘍に使用が限定されている。他の癌タンパク質の分解により機能できる化合物のライブラリーの拡大は、その多くは「アンドラッガブル」と考えられているが、薬物開発の活発な領域である。故に、これら代替癌タンパク質を標的とし、広範な癌を処置できる新規化合物に対する要望は続いている。
概要
小分子ＧＳＰＴ１デグラダーでの急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)患者の処置は臨床応答を駆動することが示されているが、重篤な有害事象(ＡＥ)が付随している。ＡＭＬの患者は、しばしば癌細胞に高レベルのＣＤ３３を有する － ＡＭＬの処置におけるＣＤ３３ターゲティングＡＤＣ、マイロターグの臨床的承認により支持される。本発明は、ＧＳＰＴ１分解ペイロード分子とＣＤ３３ターゲティング抗体の結合が、ＧＳＰＴ１デグラダーの臨床的有効性および忍容性両方を改善できるとの発見に基づく。
第一態様において、本発明は、式(Ｉ)：
〔式中、
ａは１～１０の整数であり；
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
Ｘは－ＮＲ２－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮ(Ｒ２)ｖであり；
ｖは１または２であり；
各Ｒ２は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｎは１～６の整数であり；そして
ｍは２～６の整数であり；
ここで、各基の左側はＬに結合し、右側はＡに結合し；但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
Ｌは開裂可能リンカーまたは開裂不可能リンカーであり；そして
Ｂｍは抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)相補性決定領域(ＣＤＲ)１(ＶＨ－ＣＤＲ１)、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)ＣＤＲ１(ＶＬ－ＣＤＲ１)、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は定常領域を含み、該定常領域は、ゲムツズマブと少なくとも１個のアミノ酸が異なる。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は定常領域に対応するアミノ酸２９７にアラニンを含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２０、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含む。
ある態様において、ａは２～８の整数である。
ある態様において、Ｌは開裂不可能リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｐは１～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌは
である。
ある態様において、ｐは５である。
ある態様において、Ｌは開裂可能リンカーである。ある態様において、開裂可能リンカーはプロテアーゼにより開裂可能である。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は各々独立して存在しないかまたはＬまたはＤ配置の天然に存在するアミノ酸残基であり、但しＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は独立して存在しないかまたはＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシンおよびグリシンからなる群から選択され；但し、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基である。
ある態様において、Ｚ１は存在しないかまたはグリシンであり；Ｚ２は存在しないかまたはＬ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニンおよびグリシンからなる群から選択され；Ｚ３は、Ｌ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択され；そしてＺ４は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される。
ある態様において、Ｌは
である。
ある態様において、ｑは５である。
ある態様において、Ｌは生体内還元性リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は各々独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル、(Ｃ１－Ｃ６)２ＮＣ１－Ｃ６アルキルおよびＣ１－Ｃ６アルキルから選択されるかまたは、２個のジェミナルＲ基は、それらが結合している炭素原子と一体となってシクロブチルまたはシクロプロピル環を形成でき；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌは酸開裂可能リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌはクリック放出リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される。
ある態様において、Ｌはピロホスファターゼ開裂可能リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
である。
ある態様において、Ｌはベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカーである。ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
----は存在しないかまたは結合であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１はハロであり；そして
Ｘは－Ｎ(Ｒ２)ｖ(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
ｖは１であり；
ｍおよびｎは２であり；そして
Ｒ２はメチルである、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１はハロであり；そして
Ｘは－Ｎ(Ｒ２)ｖ(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
ｖは２であり；
ｍおよびｎは２であり；そして
各Ｒ２はメチルである、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１はハロであり；そして
Ｘは－Ｏ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
ｎは２である、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１はハロであり；そして
Ｘは－Ｓ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
ｎは２である、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１は水素であり；そして
Ｘは－ＮＲ２－であり；ここで
Ｒ２はメチルである、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１はハロであり；そして
Ｘは－ＮＲ２－であり；ここで
Ｒ２は水素である、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
Ａはフェニルであり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１は水素であり；そして
Ｘは－Ｃ(ＣＨ３)＝である、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートであって、ここで
ＡはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１は水素であり；そして
Ｘは－Ｎ(Ｒ２)(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
ｎは１であり；
ｍは２であり；そして
Ｒ２はメチルである、
コンジュゲートを提供する。
ある態様において、本発明は、式(Ｖ)：
〔式中、Ｂｍは抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、(ｉ)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ii)配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬ、(iii)配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖、(iv)配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２０、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ｖ)配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＶＬまたは(vi)配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含み得る。
ある態様において、本発明は、式(VI)：
〔式中、Ｂｍは抗ＣＤ３３またはその抗原結合部分である。〕
のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、(ｉ)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ii)配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬ、(iii)配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖、(iv)配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ｖ)配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＶＬまたは(vi)配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含み得る。
ある態様において、本発明は、式(VI)：
〔式中、Ｂｍは抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、(ｉ)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ii)配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬ、(iii)配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖、(iv)配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３、(ｖ)配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＶＬまたは(vi)配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含み得る。
ある態様において、本発明は、ここに提供するコンジュゲートまたは化合物またはその薬学的に許容される塩および１以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、処置を必要とする対象における癌または骨髄異形成症候群を処置する方法であって、該対象に薬学的に許容される量の上記コンジュゲートまたは組成物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法提供する。ある態様において、癌は血液学的／血液癌である。ある態様において、癌は多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン疾患または慢性骨髄増殖性疾患である。ある態様において、癌は急性骨髄性白血病またはリンパ腫である。ある態様において、癌は急性骨髄性白血病である。ある態様において、癌はマイロターグに抵抗性または難治性である。
ある態様において、方法は、該対象にコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩の前、後または同時に薬学的に許容される量のさらなる薬剤を投与することをさらに含む。ある態様において、さらなる薬剤は細胞毒性剤または免疫応答修飾剤である。ある態様において、免疫応答修飾剤はチェックポイント阻害剤である。ある態様において、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤および／またはＬＡＧ－３阻害剤を含む。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を製造する方法であって、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分と式(Ｉ－１)：
〔式中、
ａは１～１０の整数であり；
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｘは－Ｎ(Ｒ２)ｖ－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
ｖは１または２であり；
ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮＲ２であり；
各Ｒ２は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｎは１～６の整数であり；そして
ｍは２～６の整数であり；
ここで、各基の左側はＬ’に結合し、右側はＡに結合し；
但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
Ｌ’は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分にコンジュゲートする開裂可能または開裂不可能リンカー前駆体である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を反応させることを含む、方法を提供する。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１に示す重鎖可変領域および配列番号１に示す軽鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は定常領域を含み、該定常領域は、ゲムツズマブと少なくとも１個のアミノ酸が異なる。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は定常領域に対応するアミノ酸２９７にアラニンを含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２０、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含む。
ある態様において、方法は、さらに式(Ｉ－１)の化合物との反応前に抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を還元することを含む。
ある態様において、ａは２～８の整数である。ある態様において、Ｌ’は開裂不可能リンカー前駆体、開裂可能リンカー前駆体、生体内還元性リンカー前駆体、酸開裂可能リンカー前駆体、クリック放出リンカー前駆体、ピロホスファターゼ開裂可能リンカー前駆体、ベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカー前駆体またはそれらの任意の組み合わせである。
図１は、ＭＶ４１１(ＣＤ３３＋)腫瘍に対する代表的ネオデグラダーコンジュゲートのインビボ活性を示す。Ｘ軸は投与後の日数を示す。Ｙ軸は媒体、３mg／kg ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)、２.８３mg／kg ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉｅ)、２.９９mg／kg ＣＤ３３ＡＢ－化合物(１ｈ)、０.１mg／kgマイロターグ、５０mg／kgベネトクラクスおよび５mg／kg ＣＣ－９０００９を投与後の腫瘍体積(mm３)を示す。
図２は、ＣＤ－３３陽性およびＣＤ３３陰性悪性腫瘍におけるｈｕＭｙ９－６(ＡＢ１)－化合物(Ｉａ)のインビトロ活性を示す。
図３は、ＭＶ４－１１(ＣＤ３３＋)腫瘍に対するＡＢ１ベースのコンジュゲートのインビボ活性を示す。Ｘ軸は投与後の日数を示す。Ｙ軸は媒体、ＡＢ１－化合物(Ｉａ)、ＡＢ１－化合物(Ｉｉ)、ＡＢ１－化合物(Ｉｄ)、ＡＢ１－化合物(Ｉｊ)、ＡＢ１－化合物(Ｉｅ)、ＡＢ１－化合物(Ｉｋ)、マイロターグ、ゲムツズマブ－化合物Ｉ(ａ)およびＣＣ－９０００９を投与後の腫瘍体積(mm３)を示す。
図４は、ゲムツズマブおよびＣＤ３３ＡＢコンジュゲートの安定性を示す。
図５は、ＭＶ４－１１(ＣＤ３３＋)腫瘍に対するゲムツズマブベースのコンジュゲートのインビボ活性を示す。Ｘ軸は投与後の日数を示す。Ｙ軸は媒体、３mg／kg ゲムツズマブ－化合物(Ｉａ)、５mg／kg ゲムツズマブ－化合物(Ｉａ)、３mg／kg ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ) ５mg／kg ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)、３mg／kg ゲムツズマブ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－化合物(Ｉａ)、５mg／kg ゲムツズマブ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－化合物(Ｉａ)、５mg／kg ゲムツズマブ－化合物(Ｉｅ)、２５mg／kgベネトクラクスおよび５０mg／kgベネトクラクスを投与後の腫瘍体積(mm３)を示す。
図６Ａおよび６Ｂは、マイロターグ非感受性ＡＭＬ細胞に対するＡＢ１－化合物(Ｉａ)コンジュゲートのインビトロ活性を示す(ＡＭＬ－１９３(図６Ａ)およびＫａｓｕｍｉ－６(図６Ｂ))。Ｘ軸は濃度を示し、Ｙ軸は処理後の細胞株のパーセント生存能を示す。
詳細な記載
本発明は、式(Ｉ)：
〔式中、
ａは１～１０の整数であり；
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｘは－Ｎ(Ｒ２)ｖ－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮ(Ｒ２)ｖであり；
ｖは１または２であり；
各Ｒ２は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｎは１～６の整数であり；
ｍは２～６の整数であり；
ここで、各基の左側はＬに結合し、右側はＡに結合し；
但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
Ｌは開裂可能リンカーまたは開裂不可能リンカーであり；そして
Ｂｍは抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分、例えば、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３；配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分；または配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖を含む抗ＣＤ３３抗体である。〕
のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩に関する。
本発明はまた、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分に融合した上記化合物、該化合物または該コンジュゲートを含む組成物または該化合物または該コンジュゲートを使用または製造する方法を提供する。
VI. 定義
本記載がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載をとおして示される。
ある物についての単数表現は、その物の１以上をいうことは理解される；例えば、「あるヌクレオチド配列」は、１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、用語「ある」、「１以上」および「少なくとも１個」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。特許請求の範囲は、あらゆる任意的要素を除外して起草され得ることはさらに留意される。すなわち、この記載は、請求要素の限定と関連した「単に」、「のみ」などの排他的用語の使用または負の限定の使用についての先行詞として役立つことが意図される。
さらに、「および／または」は、ここで使用されているとき、他方を伴うまたは伴わない２つの特定した特性または成分の各々の特定の開示として解釈されるべきである。故に、ここでの「Ａおよび／またはＢ」などの句において使用する用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句において使用する用語「および／または」は、次の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
態様がここで用語「含む」を用いて記載されているとき、「からなる」および／または「本質的にからなる」で記載されるその他は類似する態様も提供されることは理解される。
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000は、当業者に本明細書において使用する用語の多くの一般的辞書を提供する。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)において認められた形で示す。数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。値の範囲が記載されているとき、その範囲の記載される上限と下限の間の各整数値およびその各分数も、そのような値の各下位範囲と共に具体的に開示されることは理解される。何らかの範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれるまたは除外されることができ、限度のいずれかが含まれる、どちらもないまたは両方が含まれる各範囲も本発明に含まれる。故に、ここに記載する範囲は、記載する終点を含む、該範囲内の値の全ての省略と理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群の何れかの数値、数値の組み合わせまたは下位範囲を含むと理解される
値が明示されるとき、記載される値とほぼ同じ品質または量である値も本発明の範囲内であることは理解される。組み合わせが開示されるときその組み合わせの要素の各下位の組み合わせも具体的に開示され、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示されるとき、それらの組み合わせも開示される。本発明の何れかの要素が複数の選択肢を有するとして開示されるとき、各選択肢が単一にまたは他の選択肢との任意の組み合わせで除外されるその開示される例も、ここに開示される；本発明の１を超える要素はこのような除外を有し得て、このような除外を有する要素の全組み合わせはここに開示される。
ここで使用する用語「ＤＡＲ」は、各抗体に連結したネオデグラダー－リンカー複合体の平均数である、コンジュゲートの薬物抗体比をいう。ある態様において、ここに記載するコンジュゲートのＤＡＲは１～１０である。ある態様において、ここに記載するコンジュゲートのＤＡＲは１～８である。ある態様において、ここに記載するコンジュゲートのＤＡＲは１.０、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.１、２.２、２.３、２.４、２.５、２.６、２.７、２.８、２.９、３.０、３.１、３.２、３.３、３.４、３.５、３.６、３.７、３.８、３.９、４.０、４.１、４.２、４.３、４.４、４.５、４.６、４.７、４.８、４.９、５.０、５.１、５.２、５.３、５.４、５.５、５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９、８、８.１、８.２、８.３、８.４、８.５、８.６、８.７、８.８、８.９、９.０、９.１、９.２、９.３、９.４、９.５、９.６、９.７、９.８、９.９または１０である。
ここで使用する用語「抗体」は、完全長免疫グロブリン分子または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、興味ある標的の抗原またはその一部と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子もいい、このような標的は、癌細胞または自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含むが、これらに限定されない。ここに開示する免疫グロブリンは免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ)、クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは任意の種に由来し得る。しかしながら、ある態様において、免疫グロブリンはヒト、マウスまたはウサギ起源である
用語「単一ドメイン抗体」は、ナノボディとしても知られ、約１２kDa～約１５kDaの分子量を有する単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。単体抗体は重鎖可変ドメインまたは軽鎖に基づき得る。単一ドメイン抗体の例は、ＶＨＨフラグメントおよびＶＮＡＲフラグメントを含むが、これらに限定されない。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部、一般にその抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’).ｓｕｂ.２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体；癌細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原に免疫特異的に結合するＦａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、上記の何れかのＣＤＲ(相補性決定領域)およびエピトープ結合フラグメント、一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体を含む。
「インタクト抗体」は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異以外同一である集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原性部位に対して指向される。さらに、種々の決定基(エピトープ)に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一決定基に対する。特異性に加えて、モノクローナル抗体他の抗体に汚染されずに合成され得る点で、有利である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴が抗体の実質的に均一の集団から得られたことを示し、何らかの特定の方法による抗体の産生が必要であることは意図されない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体はハイブリドーマ方法により産生されてよくまたは組み換えＤＮＡ方法により産生されてよい。「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリーから単離もされ得る。
ここでのモノクローナル抗体は重および／または軽鎖の一部は特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属し、一方鎖の残りは他の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるかまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを特に含む。ここで興味あるキメラ抗体は非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿など)およびヒト定常領域配列由来の可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
モノクローナル抗体(ＭＡｂ)を産生するために種々の方法が用いられている。単一タイプの抗体を産生するクローン化細胞株をいうハイブリドーマテクノロジーは、マウス(ネズミ)、ハムスター、ラットおよびヒトを含む種々の種の細胞を使用する。ＭＡｂの産生に使用する他の方法は、組み換えＤＮＡ技術を含む遺伝子操作を使用する。これらの技術により産生されたモノクローナル抗体はとりわけ、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む。キメラ抗体は１を超えるタイプの種からのＤＮＡコード化領域を合わせる。例えば、キメラ抗体はマウスからの可変領域およびヒトからの定常領域に由来し得る。ヒト化抗体は非ヒト部分を含んでも、主にヒトからである。キメラ抗体と同様、ヒト化抗体は完全ヒト定常領域を含み得る。しかしキメラ抗体と異なり、可変領域は一部ヒトに由来し得る。ヒト化抗体の非ヒト、合成部分はしばしばマウス抗体のＣＤＲ由来である。いずれにしても、これらの領域は、抗体が特異的抗原を認識し、結合することができるために重要である。診断および短期治療には有用であるが、マウス抗体は有害な免疫原性応答のリスクの増加なしには、ヒトに長期で投与できない。ヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)と称されるこの応答は、ヒト免疫系がマウス抗体を外来と認識し、それを抗原するときに起こる。ＨＡＭＡ応答は毒素ショックまたは死さえ引き起こし得る。
キメラおよびヒト化抗体はＨＡＭＡ応答の可能性を、投与抗体の非ヒト部分を最小化することにより低減する。さらに、キメラおよびヒト化抗体は抗体依存性細胞傷害などの二次的ヒト免疫応答を活性化するさらなる利益を有し得る。
インタクト抗体は抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域)に起因する生物学的活性をいう、１以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御などを含む。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、インタクト抗体は異なる「クラス」に割り当てられ得る。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのインタクト抗体の５つの主要なクラスがあり、それらのいくつかは「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２にさらに分割され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
用語「約」は、ここでは、おおよそ、大まかに、周辺または領域内を意味するために使用する。用語「約」が数値と共に使用されるとき、示す数値の上および下の境界を伸ばすことにより、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、数値を、記載される値の、例えば、１０パーセント上または下(高いまたは低い)の分散で修飾し得る
用語「投与」、「投与する」およびその文法的異形は、本発明のＥＶ(例えば、エクソソーム)などの組成物の、薬学的に許容される経路を介する対象への導入をいう。対象への本発明のＥＶ(例えば、エクソソーム)などの組成物の導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経腸(静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または皮下)、直腸、リンパ内、髄腔内、眼球周囲または局所を含む、任意の適当な経路による。投与は、自己投与および他者による投与を含む。適当な投与経路により、組成物または薬剤が意図する機能を発揮できる。例えば、適当な経路が静脈内であれば、組成物を、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することにより投与する。
ここで使用する用語「抗体」は、天然であれ、一部または全体に合成により産生されたものであれ、免疫グロブリンおよびそのフラグメントを含む。本用語はまた免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質も包含する。「抗体」は、さらに免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域を含むポリペプチドまたは抗原と特異的に結合し、認識するそのフラグメントを含む。用語抗体の使用は完全抗体、ポリクローナル、モノクローナルおよび組み換え抗体、そのフラグメントを含むことを意味し、さらに、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２、Ｆ(ａｂ１)２、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄフラグメントなどの抗体フラグメント、二重特異性抗体および抗体関連ポリペプチドを含む。抗体は所望の生物学的活性または機能を示す限り、二特異的抗体および多特異的抗体を含む。本発明のある態様において、生物学的活性分子は抗体またはその抗原結合フラグメントを含む分子である。
用語「抗体－薬物コンジュゲート」および「ＡＤＣ」は相互交換可能に使用し、治療剤(ここでは薬剤、薬物または活性医薬成分と称することもある)または薬剤に、例えば、共有結合で、結合した抗体をいう。本発明のある態様において、生物学的活性分子は抗体－薬物コンジュゲートである。
ここで使用する用語「おおよそ」は、目的の１以上の値に適用されるとき、記載する参照値に類似する値をいう。ある態様において、用語「おおよそ」は、特に断らない限りまたは文脈から他のことが明らかでない限り、記載する参照値の何れかの方向(大きいまたは小さい)で１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満に入る値の範囲をいう(そのような値が可能な値の１００％を超えるときは例外である)。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。故に、ポリペプチドにおけるあるアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸で置き換えられるとき、置換は保存的と考えられる。他の態様において、アミノ酸のストリングを、側鎖ファミリーメンバーの順番および／または組成が異なる構造的に類似するストリングで保存的に置き換え得る。
ここで使用する用語「保存」は、比較される２以上の配列の同じ位置が変わらない、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基をいう。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列のどこかに現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、より関連する配列で保存されているものである。
ある態様において、２以上の配列は、互いに１００％同一であるならば、「完全に保存」または「同一」と考えられる。ある態様において、２以上の配列は、互いに少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一または少なくとも約９５％同一であるならば、「高度に保存」と考えられる。ある態様において、２以上の配列は、互いに少なくとも約３０％同一、少なくとも約４０％同一、少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一または少なくとも約９５％同一であるならば、「保存」と考えられる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用できまたはその一部、部分、領域または特性に適用できる。
ここで使用する用語「連結」および「コンジュゲート」は相互交換可能に使用され、各々ネオデグラダーおよび抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を含む２以上の部分の共有または非共有結合をいう。ある態様において、連結またはコンジュゲートはリンカーを含み得る。
用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然抗体の少なくとも１個の受容体結合ドメインまたは天然受容体の少なくとも１個のリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％配列同一性を有し、典型的に、そのような受容体またはリガンド結合ドメインと配列が少なくとも約８０％、より典型的に、少なくとも約９０％相同である。アミノ酸配列バリアントは、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置に置換、欠失および／または挿入を有する。アミノ酸は、慣用名、一文字および三文字コードで指定する。
「配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入した後、同一であるアミノ酸配列バリアントにおける残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当分野で周知である。一つのコンピュータープログラムは、１９９１年１２月１０日に、アメリカ合衆国著作権局(Washington, D.C. 20559)にマニュアルと共にファイルされた、Genentech, Inc.作成の「Align 2」である。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、分子が補体存在下で標的を溶解させる能力をいう。補体活性化経路は、補体系第一成分(Ｃ１ｑ)の、同族抗原と複合体化している分子(例えば、抗体)への結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る。
用語「可変」は、可変ドメインのある部分の配列が抗体間で広範に異なり、各特定の抗体のその特定の抗原への結合および特異性に使用される事実をいう。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインをとおして均一に分散されていない。軽鎖および重鎖可変ドメイン両者において超可変領域と称される３セグメントに濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存されている部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と称される。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、ベータシート構造を接続し、ある場合、その一部を形成する３個の超可変領域で接続された、主にベータシート配置を採用する４個のＦＲを含む。各鎖の超可変領域はＦＲにより近位で互いに維持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは直接抗体の抗原への結合に関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)への参加などの種々のエフェクター機能を示す。
用語「超可変領域」は、ここで使用するとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４(Ｌ１)、５０～５６(Ｌ２)および８９～９７(Ｌ３)および重鎖可変ドメインにおける３１～３５(Ｈ１)、５０～６５(Ｈ２)および９５～１０２(Ｈ３); Kabat et al supra)および／または「超可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２(Ｌ１)、５０～５２(Ｌ２)および９１～９６(Ｌ３)および重鎖可変ドメインにおける２６～３２(Ｈ１)、５３～５５(Ｈ２)および９６～１０１(Ｈ３))を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、ここに定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン消化は、各々単一抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２個の同一抗原結合フラグメントおよび名称が容易に結晶化する能力を反映する残存「Ｆｃ」フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２個の抗原結合部位を有し、なお架橋結合抗原できるＦ(ａｂ’)２フラグメントを産生する。
「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、緊密な、非共有結合的会合での１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３個の超可変領域が、ＶＨ－ＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を定義するよう相互作用するのは、この配置においてである。まとめると、６個の超可変領域が抗体の抗原結合特異性に寄与する。しかしながら、単一可変ドメイン(または抗原に特異的な３個の超可変領域のみ含むＦｖの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、完全結合部位より親和性は低い。
Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む数残基が付加されたことによりＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１個の遊離チオール基を有するＦａｂ’の命名である。Ｆ(ａｂ’)２抗体フラグメントは、もともと、間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られる。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と称される２個の明確なタイプの一つに割り当てられ得る。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらドメインは単一ポリペプチド鎖で存在する。Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み得て、それはｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とする。
用語「二重特異性抗体」は、２個の抗原結合部位を有する小抗体フラグメントをいい、そのフラグメントは可変軽ドメイン(ＶＬ)に接続した可変重ドメイン(ＶＨ)を同じポリペプチド鎖(ＶＨ－ＶＬ)に含む。同じ鎖の２個のドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーの使用により、ドメインは他方の鎖の相補性ドメインと対合し、２個の抗原結合部位を作ることを強いられる。
「単離」抗体は同定され、かつその天然環境の成分から分離および／または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。ある態様において、抗体は(１)ローリー法により決定して９５重量％を超えるまたは９９重量％を超える抗体の程度まで、(２)ガス相タンパク質シーケンサーの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までまたは(３)クマシーブルーまたは銀染色の使用により、還元または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで均一まで精製される。単離抗体は組み換え細胞内のインサイチュの抗体を、抗体の天然環境の少なくとも１個の成分が存在しないため、含む。通常、しかしながら、単離抗体は少なくとも１精製工程により調製される
「癌」は、体内の異常細胞の制御されない増殖により特徴づけられる広範な種々の疾患群をいう。未成魚の細胞分裂および増殖は、近隣組織を侵襲し、リンパ系または血流を介して体の遠位部分に転移もし得る悪性腫瘍の形成をもたらす。ここで使用する「癌」は、原発、転移および再発癌をいう。
ここで使用する用語「免疫応答」は、脊椎動物の外来因子に対する生物学的応答をいい、その応答は生物をこれらの因子およびこれらにより引き起こされる疾患から保護する。免疫応答は、侵襲病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性または他の異常細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または脊椎動物身体からの排除をもたらす、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれら細胞の何れかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用により介在される。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞またはＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞などのＴｈ細胞の活性化または阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。ここで使用する用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、相互交換可であり、胸腺により産生または処理されるあらゆるリンパ球をいう。ある態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。ある態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。ある態様において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。
「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌならびにマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類を含むが、これらに限定されない。ある態様において、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」はここでは相互交換可能に使用する。
用語「治療有効量」または「治療的有効投与量」は、所望の生物学的、治療的および／または予防的結果を提供する、薬剤(例えば、ここに開示するネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲート)の量をいう。その結果は、疾患の徴候、症状または原因の１以上の減少、改善、緩和、低減、遅延および／または軽減または生物系の何らかの他の所望の改変であり得る。固形腫瘍について、有効量は、腫瘍を縮小させるおよび／または腫瘍増殖速度を減少させる(例えば腫瘍増殖抑制まで)または他の望まない細胞増殖を予防または遅延する量を含む。ある態様において、有効量は、腫瘍進展の遅延に十分な量である。ある態様において、有効量は、腫瘍再発の予防または遅延に十分な量である。有効量を１回以上で投与し得る。有効量の組成物は、例えば、(ｉ)癌細胞数の減少；(ii)腫瘍サイズの減少；(iii)末梢臓器への癌細胞浸潤をある程度阻害、遅延、減速し、停止できる；(iv)腫瘍転移を阻害(すなわちある程度遅延)し、停止できる；(ｖ)腫瘍増殖の阻害；(vi)腫瘍の発生および／または再発の予防または遅延；および／または(vii)癌に付随する症状の１以上のある程度の軽減をすることができる。
ある態様において、「治療有効量」は、癌の有意な減少または進行固形腫瘍などの癌の進行遅延(退縮)の作用が臨床的に証明されているネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートの量である。治療剤が疾患退縮を促進する能力は、臨床治験中のヒト対象、ヒトの有効性を予測する動物モデル系またはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイなどの、当業者に知られる多様な方法を使用して、評価できる。
ここで使用する用語「標準治療」は、医療専門家によりあるタイプの疾患の適切な処置として認められており、医療従事者により広範に使用される処置をいう。本用語は、次の用語：「最善の方法」、「標準的な医療」および「標準的治療」の何れかと相互交換可能に使用され得る
一例として、「抗癌剤」は対象における癌退縮を促進するまたはさらなる腫瘍増殖を予防する。ある態様において、薬物の治療有効量は、癌を排除する点まで癌退縮を促進する。
処置に関する用語「有効」および「有効性」は、薬理学的有効性および生理学的安全性両方を含む。薬理学的有効性は、薬物が患者における癌退縮を促進する能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベルでの毒性または他の有害生理学的効果(有害効果)のレベルをいう。
ここで使用する用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、１以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは一部減少、阻害、妨害または調節する分子をいう。チェックポイントタンパク質はＴ細胞活性化または機能を制御する。ＣＴＬＡ－４およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；およびＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２などの多数のチェックポイントタンパク質が知られる。Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer 12 (4): 252-64 (2012)。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激または阻害性相互作用を担う。免疫チェックポイントタンパク質は、自己耐容性ならびに生理学的免疫応答の期間および強度を制御および維持する。免疫チェックポイント阻害剤は抗体を含むまたは抗体に由来する。
用語「処置する」または「処置」は、治療処置および予防または予防的手段両方をいい、ここで、目的は癌の進展または拡散などの望まない生理学的変化または障害の予防または減速(低減)である。本発明の目的で、有益または所望の臨床的結果は、検出可能であれ、検出不可能であれ、症状軽減、疾患の程度低減、疾患状態の安定化(すなわち、非悪化)、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和および寛解(部分的であれ完全であれ)を含むが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けないときの余命と比較した生存延長も意味し得る。処置を必要とするものは、すでに該状態または障害を有するものならびに該状態または障害の素因があるものまたは該状態または障害を予防すべきものを含む。
VII. 「ネオデグラダー」
本発明は、式(II)：
〔式中、
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
Ｒ２は－Ｃ(Ｏ)Ｒ３、－Ｎ(Ｒ４)２、－(ＣＨ２)ｎＯＨ、－(ＣＨ２)ｎＳＨ、－(ＣＨ２)ｎＮ(Ｒ４)２、－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＯＨ、－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＳＨおよび－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＮ(Ｒ４)２から選択され；ここで
Ｒ３は水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
各Ｒ４は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｑ’はＯ、ＳまたはＮＲ４であり；
ｎは１～６であり；そして
ｍは２～５であり；
但し、Ｒ２がＮＨ２、－(ＣＨ２)ｎＮＨ２または－(ＣＨ２)ｎＯＨであるとき、Ｒ１はハロである〕
のネオデグラダーまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
ある態様において、本発明は、式(II)の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供し、ここで
Ａはフェニル環またはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
ＵはＮＨであり；
Ｒ１は水素およびハロから選択され；
Ｒ２は－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＮ(Ｒ４)２、－(ＣＨ２)ｎＯＨ、－(ＣＨ２)ｎＳＨ、－Ｎ(Ｒ４)２および－Ｃ(Ｏ)Ｒ３から選択され；ここで
ｍは２であり；
ｎは２であり；
Ｑ’は－Ｏ－であり；
Ｒ３はメチルであり；そして
各Ｒ４は独立して水素およびメチルから選択され；
但し、Ｒ２がＮＨ２または－(ＣＨ２)ｎＯＨであるとき、Ｒ１はハロである。
ここで使用する用語「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に結合するＣ１－Ｃ６アルキル基をいう。
ここで使用する用語「Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル」は、Ｃ１－Ｃ６アルキル基を介して親分子部分に結合するＣ１－Ｃ６アルコキシ基をいう。
ここで使用する用語「Ｃ１－Ｃ６アルキル」は、１～６個の炭素原子を含む、直鎖あｍたは分岐鎖飽和炭化水素由来の基をいう。
ここで使用する用語「Ｃ４－Ｃ１０シクロアルキル」は、４～１０個の炭素原子および０個のヘテロ原子を有する、飽和単環式、炭化水素環系をいう。シクロアルキル基の代表例は、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを含むが、これらに限定されない。７～１０個の原子を含むシクロアルキル基は、単環式または縮合、スピロ環状または架橋二環式構造であり得る。
ここで使用する用語「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩをいう。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは：
からなる群から選択される化合物である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、式(II)のネオデグラダーは
である。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーまたはその薬学的に許容される塩を提供し、ここで、Ａはフェニルであり；ＵはＮＨであり；Ｒ１はハロであり；そしてＲ２は－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＮ(Ｒ４)２であり、ここで、ｍおよびｎは２であり、Ｑ’はＯであり、一方のＲ４は水素であり、他方はメチルである。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、ＡＡはフェニルであり；ＵはＮＨであり；Ｒ１はハロであり；そしてＲ２は－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＮ(Ｒ４)２であり、ここで、ｍおよびｎは２であり、Ｑ’はＯであり、各Ｒ４はメチルである。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、ＡＡはフェニルであり；ＵはＮＨであり：Ｒ１はハロであり；そしてＲ２は－(ＣＨ２)ｎＯＨであり、ここで、ｎは２である。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、Ａはフェニルであり；ＵはＮＨであり：Ｒ１はハロであり；そしてＲ２は－(ＣＨ２)ｎＳＨであり、ここで、ｎは２である。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、Ａはフェニルであり；ＵはＮＨであり；Ｒ１は水素であり；そしてＲ２は－Ｎ(Ｒ４)２であり、ここで、一方のＲ４は水素であり、他方はメチルである。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、Ａはフェニルであり；ＵはＮＨであり；Ｒ１はハロであり；そしてＲ２は－Ｎ(Ｒ４)２であり、ここで、各Ｒ４は水素である。ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、Ａはフェニルであり；Ｒ１は水素であり；そしてＲ２は－Ｃ(Ｏ)Ｒ３であり、ここで、Ｒ３はメチルである。
ある態様において、本発明は、式(II)のネオデグラダーを提供し、ここで、ＡＡはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；ＵはＮＨであり；Ｒ１は水素であり；そしてＲ２は－(ＣＨ２)ｎＱ’(ＣＨ２)ｍＮ(Ｒ４)２であり、ここで、ｍおよびｎは２であり、Ｑ’はＯであり、一方のＲ４は水素であり、他方はメチルである。
ある態様において、ネオデグラダーは、分解のためにタンパク質をターゲティングできるＥ３ユビキチンリガーゼと三成分複合体を形成する分子である。
VIII. ネオデグラダーコンジュゲート
本発明は、１以上のここに開示するネオデグラダーおよびここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分のコンジュゲートを提供する。これらコンジュゲートは、セレブロン(ＣＲＢＮ)に結合し、ＣＲＬ４ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼにより介在される基質タンパク質の動員およびユビキチン化を促進することによりタンパク質を分解することができる。これら薬剤は「分子糊」として作用し、リガーゼとネオ基質のタンパク質相互作用を再プログラミングする疎水性パッチとして結合接合面を満たす。
ある態様において、本発明は、式(Ｉ)
〔式中、
ａは１～１０の整数であり；
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
Ｒ１は水素およびハロから選択され；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｘは－ＮＲ２－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮＲ２であり；
Ｒ２は水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｎは１～６の整数であり；
ｍは２～６の整数であり；
ここで、各基の左側はＬに結合し、右側はＡに結合し；
但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
Ｌは開裂可能リンカーまたは開裂不可能リンカーであり；そして
Ｂｍはここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
ある態様において、ＵはＮＨである。
ある態様において、ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートは、腫瘍細胞株に対してインビトロ抗増殖性活性を有する。ある態様において、ネオデグラダーおよびここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を含むネオデグラダーコンジュゲートは、ネオデグラダー単独またはここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分単独より少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％高いインビトロ抗増殖性活性を有する。ある態様において、ネオデグラダーおよびここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を含むネオデグラダーコンジュゲートは、ネオデグラダー単独またはここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分単独より少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍高いインビトロ抗増殖性活性を有する。
ある態様において、ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートは、ダウディリンパ腫細胞株に対するインビトロ抗増殖性活性、例えば、ネオデグラダー単独または抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分単独と比較して高いダウディリンパ腫細胞株に対する抗増殖性活性を有する。ある態様において、ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートは、ＨＬ－６０急性骨髄性白血病細胞株に対するインビトロ抗増殖性活性、例えば、ネオデグラダー単独または抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分単独と比較して高いＨＬ－６０急性骨髄性白血病細胞株に対する抗増殖性活性を有する。ある態様において、ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートは、ラモス非ホジキンリンパ腫細胞株に対するインビトロ抗増殖性活性、例えば、ネオデグラダー単独または抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分単独と比較して高いラモス非ホジキンリンパ腫細胞株に対する抗増殖性活性を有する。ある態様において、ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートは、ヒト血清存在下で、抗増殖性活性を維持できる。ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートを癌の処置に使用できる。
ある態様において、抗体ネオデグラダーコンジュゲート(ＡｎＤＣ)は１以上のここに開示するネオデグラダーおよびここに開示する抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分のコンジュゲートである。
III.Ａ. リンカー
本発明のネオデグラダーは、リンカーを介して抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分に連結され得る。ここで使用する用語「リンカー」は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分(Ｂｍ)を式(Ｉ)の化合物内の基Ｘに接続できるあらゆる化学部分をいう。
ある態様において、リンカーは、ヘテロ二官能性基を含み得る。本発明において、用語「ヘテロ二官能性基」は、それが一部であるリンカーを抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分の一部であるに連結する化学部分をいう。ヘテロ二官能性基は、化学部分の何れかの端に異なる反応性基を有するとして特徴づけられる。「Ｂｍ」への結合は、化学または酵素コンジュゲーションまたは両者の組み合わせを介して達成され得る。化学コンジュゲーションは、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分の表面上のアクセス可能なアミノ酸残基と、ヘテロ二官能性基の反応ハンドルの制御された反応を含む。化学コンジュゲーションの例は、リシンアミドカップリング、システインカップリングおよび遺伝子操作により組み込まれた非天然アミノ酸を介するカップリング(ここで、所望の反応ハンドルを有する非天然アミノ酸が「Ｂｍ」上に挿入される)を含むが、これらに限定されない。酵素コンジュゲーションにおいて、酵素は、リンカーと抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分上のアクセス可能なアミノ残基のカップリングに介在する。酵素コンジュゲーションの例は、ソルターゼを使用するペプチド転移、微生物トランスグルタミナーゼを使用するペプチド転移およびＮ－グリカン工学を含むが、これらに限定されない。化学コンジュゲーションおよび酵素コンジュゲーションを連続的に使用もできる。例えば、酵素コンジュゲーションを、その後の化学コンジュゲーションで使用する独特の反応ハンドルを「Ｂｍ」上に導入するためにも使用できる。
ある態様において、ヘテロ二官能性基は：
〔式中、
はリンカーの残存部分への結合点であり；そして
はＢｍへの結合点である。〕
から選択される。
ある態様において、リンカー「Ｌ」は開裂不可能である。ここで使用する用語「開裂不可能リンカー」は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分をネオデグラダーに安定な、共有結合的方法で連結でき、「開裂可能リンカー」としてここに定義するカテゴリーに入らないあらゆる化学部分である。故に、開裂不可能リンカーは、酸誘導開裂、光誘導開裂、生体内還元性開裂、ペプチダーゼ誘導開裂、エステラーゼ誘導開裂およびジスルフィド結合開裂に実質的に抵抗性である。「開裂に実質的に抵抗性」は、抗体ネオデグラダーコンジュゲート集団の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９９％のリンカーまたは隣接リンカーの化学結合が、酸、光解離性開裂剤、生体内還元剤、ペプチダーゼ、エステラーゼまたは開裂可能リンカーにおける化学結合(例えば、ジスルフィド結合)を開裂する化学的もしくは生理学的化合物により、上記薬剤の何れかでの処理数時間～数日内の間開裂されないままであることを意味する。ある態様において、リンカーは、ネオデグラダーおよび／または抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が活性のままであり得る条件下、酸誘導開裂、光誘導開裂、生体内還元性開裂、酵素開裂などに感受性ではない。開裂不可能リンカーから産生されるＡＤＣ異化生成物は、抗体からの残存アミノ酸を含む。これらの異化生成物は、由来する標的細胞に独特かつ予想外の性質を発揮し得る。
当業者は、開裂不可能リンカーと開裂可能リンカーを容易に区別できる。
開裂不可能リンカーの例は、ＳＭＣＣ(スクシンイミジル４－(Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサン－１－カルボキシラート)リンカー、スクシンイミドチオエーテルリンカーおよび：
〔式中、
ｐは１～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
などのリンカーを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、リンカーは：
である。ある態様において、ｐは５である。
ある態様において、リンカーは開裂可能であり得る。ある態様において、リンカーは、ネオデグラダーおよび／または抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が活性のままであり得る条件で、酸誘導開裂、光誘導開裂、生体内還元性開裂、酵素開裂などに感受性であり得る。
ある態様において、開裂可能リンカーは酵素により開裂され得る。ある態様において、開裂可能リンカーはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、グリコシダーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ、ピロホスファターゼまたはリパーゼにより開裂され得る。
ある態様において、開裂可能リンカーはプロテアーゼにより開裂され得る。プロテアーゼの例は、カテプシンＢ、ＶＡＧＰテトラペプチドなどを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、開裂可能リンカーはペプチドを含む。ある態様において、ペプチドは、リンカーの開裂部位であり、それにより、リソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの暴露により、薬物の放出が促進される。ペプチドは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤまたはプラスミンプロテアーゼによる酵素開裂のために設計され、最適化され得る。２個のアミノ酸を有するペプチドの例は、アラニン－アラニン(ａｌａ－ａｌａ)、バリン－アラニン(ｖａｌ－ａｌａ)、バリン－シトルリン(ｖｃまたはｖａｌ－ｃｉｔ)、アラニン－フェニルアラニン(ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ)；フェニルアラニン－リシン(ｆｋまたはｐｈｅ－ｌｙｓ)；フェニルアラニン－ホモリシン(ｐｈｅ－ｈｏｍｏｌｙｓ)；およびＮ－メチル－バリン－シトルリン(Ｍｅ－ｖａｌ－ｃｉｔ)を含むが、これらに限定されない。３個のアミノ酸を有するペプチドの例は、グリシン－バリン－シトルリン(ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ)、アスパラギン酸－バリン－シトルリン(ａｓｐ－ｖａｌ－ｃｉｔ)、アラニン－アラニン－アスパラギン(ａｌａ－ａｌａ－ａｓｎ)、アラニン－フェニルアラニン－リシン(ａｌａ－ｐｈｅ－ｌｙｓ)、グリシン－グリシン－フェニルアラニン(ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｐｈｅ)およびグリシン－グリシン－グリシン(ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ)を含むが、これらに限定されない。４個のアミノ酸を有するペプチドの例は、グリシン－グリシン－バリン－シトルリン(ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ)およびグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン(ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｐｈｅ－ｇｌｙ)を含むが、これらに限定されない。上記アミノ酸の組み合わせは、逆の順でも存在し得る(すなわち、ｃｉｔ－ｖａｌ)。
本発明のペプチドは、Ｌ－またはＤ－異性体のアミノ酸残基を含み得る。用語「天然に存在するアミノ酸」は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒをいう。「Ｄ－」は、天然に存在する(「Ｌ－」)アミノ酸の配置とは逆の、「Ｄ」(右旋性)配置を有するアミノ酸を指定する。ここに記載するアミノ酸は商業的に購入するか(Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech)または当分野で既知の方法を使用して合成することができる。
ある態様において、リンカー(「Ｌ」)は、
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は各々独立して存在しないかまたはＬまたはＤ配置の天然に存在するアミノ酸残基であり、但しＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される、プロテアーゼ開裂可能リンカーである。
ある態様において、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は独立して存在しないかまたはＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシンおよびグリシンからなる群から選択され；但し、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基である。
ある態様において、Ｚ１は存在しないかまたはグリシンであり；Ｚ２は存在しないかまたはＬ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニンおよびグリシンから選択され；Ｚ３はＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンから選択され；そしてＺ４はＬ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンから選択される。
ある態様において、Ｌは
である。
ある態様において、ｑは５である。
ある態様において、Ｌはピロホスファターゼ開裂可能リンカーである。
ある態様において、Ｌは：
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
である、ピロホスファターゼ開裂可能リンカーである。
ある態様において、Ｌはベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカーである。
ある態様において、Ｌは：
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
----は存在しないかまたは結合であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択されるベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカーである。
ある態様において、リンカーは生体内還元性である。生体内還元性リンカーは、血漿と異なる細胞内区画における還元能を利用する。腫瘍細胞の細胞質に存在する還元グルタチオンは、正常細胞の細胞質に存在するものの最大１０００倍高く、腫瘍細胞はまた細胞区画における還元に寄与し得る酵素も含む。リンカーは、全身循環中コンジュゲートをインタクトに維持し、高細胞内濃度のグルタチオンにより選択的に開裂され、腫瘍部位で活性薬物を非毒性プロドラッグから放出する。
ある態様において、Ｌは：
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は各々独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル、(Ｃ１－Ｃ６)２ＮＣ１－Ｃ６アルキルおよびＣ１－Ｃ６アルキルから選択されるかまたは、２個のジェミナルＲ基は、それらが結合している炭素原子と一体となってシクロブチルまたはシクロプロピル環を形成でき；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される、生体内還元性リンカーである。
ある態様において、リンカーは酸開裂可能である。酸開裂可能リンカーは、血液循環の中性ｐＨでは安定なままであるが、酸性環境の細胞区画で加水分解され、細胞毒性薬物を放出するよう特異的に設計される。
ある態様において、Ｌは
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される、酸開裂可能リンカーである。
ある態様において、Ｌは、ネオデグラダーの放出がテトラジンまたは関連化合物により、化学的に誘導される、クリック放出リンカーである。
ある態様において、Ｌは、
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点であり；そして
は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
から選択される、クリック放出リンカーである。
III.Ｂ. 抗ＣＤ３３抗体
本発明は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分にコンジュゲートしたネオデグラダーを提供する。
ＣＤ３３は、骨髄およびリンパ系細胞両者で発現される膜貫通受容体である。シアル酸に結合し、故に、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン(ＳＩＧＬＥＣ)ファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、細胞相互作用における介在および免疫細胞の静止状態の維持に役割を有する。結合により、タンパク質の細胞質部分に存在するＣＤ３３の免疫受容体チロシンベースの抑制性モチーフ(ＩＴＩＭ)がリン酸化され、ＳＨＰホスファターゼなどのＳｒｃ相同性２(ＳＨ２)ドメイン含有タンパク質のドッキング部位として作用する。これにより、細胞の食作用を阻害するカスケードがもたらされ得る。構造的に、ＣＤ３３の細胞外部分は２個の免疫グロブリンドメインを含み、細胞内部分はＩＴＩＭを含む。ＣＤ３３の同義語は、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ－３、ｇｐ６７およびｐ６７を含むが、これらに限定されない。
ヒトＣＤ３３のカノニカルアミノ酸配列および既知アイソフォームを表１に示す(UniProtKB- P20138；配列番号１３～１８)。

ＣＤ３３は急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)症例の約９０％で発現され、治療抗体の標的としての有用性が示されている。ＡＭＬ芽球上の高ＣＤ３３発現が、約３０年前に報告された。ＣＤ３３は、ＡＭＬを示す患者の８５～９０％の芽球ならびに正常骨髄前駆細胞および骨髄球で検出された。ＣＤ３３は造血細胞に制限されるが、正常造血幹細胞ではなく、よってＡＭＬ治療の治療として理想的である。
本発明のコンジュゲートのための抗ＣＤ３３抗体はＣＤ３３に特異的に結合できる。ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ３３抗体は高親和性、例えば、１０－６以下、１０－７以下、１０－８以下、１０－９以下、１０－１０以下、１０－１１以下、１０－１２以下、１０－１２Ｍ～１０－７Ｍ、１０－１１Ｍ～１０－７Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－７Ｍまたは１０－９Ｍ～１０－７ＭのＫＤで、ヒトＣＤ３３に結合する。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は重鎖可変領域(ＶＨ)を含み、軽鎖は軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み；ここで、ＶＨはＶＨ相補性決定領域(ＣＤＲ)１(ＶＨ－ＣＤＲ１)、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬはＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３を含み；ここで、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号３に少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤＲは、下表２に示す配列を含む。

ある態様において、抗ＣＤ３３抗体重鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体重鎖は、配列番号９または配列番号１１に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号１０または配列番号１２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号１１に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は各々引用によりここに明示的に包含させる、米国特許５,５８５,０８９、ＵＳ５,６９３,７６２に開示される。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は重鎖可変領域(ＶＨ)を含み、軽鎖は軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み；ここで、ＶＨはＶＨ相補性決定領域(ＣＤＲ)１(ＶＨ－ＣＤＲ１)、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬはＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３を含み；ここで、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号２１に少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤＲは、下表４に示す配列を含む。

ある態様において、抗ＣＤ３３抗体重鎖可変領域は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体軽鎖可変領域は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体重鎖は、配列番号２５に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配を含む。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は２６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

ある態様において、抗ＣＤ３３抗体は配列番号２５に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。用語「ＣＤ３３ＡＢ」は、配列番号２５に示す重鎖および配列番号２６に示す軽鎖を含む。
抗ＣＤ３３抗体は修飾、すなわち、何らかのタイプの分子が共有結合している、アナログおよび誘導体を、そのような共有結合が抗体がその抗原結合免疫特異性を保持することを許容とする限り、含む。例として、しかし、限定するものではないが、抗体の誘導体およびアナログは、例えば、グルコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞性抗体単位への結合または他のタンパク質などにより、さらに修飾されているものを含む。特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下の代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知技術により、多数の化学修飾の何れかを実施し得る。さらに、アナログまたは誘導体は、１以上の非天然アミノ酸を含み得る。
ネオデグラダーコンジュゲートにおける抗ＣＤ３３抗体は、Ｆｃ受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾(例えば、置換、欠失または付加)有する抗体を含み得る。特に、抗体は抗ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するとして同定されているアミノ酸残基に修飾を有する抗体を含む。癌細胞抗原に免疫特異的な抗体は例えば、Genentech(San Francisco, Calif.)から商業的に得ることができまたは例えば、化学合成または組み換え発現技術などの当業者に知られる任意の方法で産生できる。癌細胞抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベースまたは類似のデータベース、刊行物からまたは日常的クローニングおよびシーケンシングにより得ることができる。
ある態様において、ネオデグラダーコンジュゲートの抗体はモノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある態様において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。
IX. 組成物および使用方法
ここに記載するコンジュゲートおよび／または化合物は、薬学的にまたは薬学的に許容される塩の形態であり得る。ある態様において、このような塩は無機または有機な塩はに由来する。
適当な酸付加塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、経皮酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニル－プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩を含む。
適当な塩基付加塩の例は、アンモニウム塩；ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミンなどの有機塩基との塩；およびアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などを含む。
例えば、Bergeは、次のＦＤＡ承認市販塩を挙げる：アニオン酢酸塩、ベシル酸塩(ベンゼンスルホン酸塩)、安息香酸塩、炭酸水素塩、二酒石酸塩、ブロマイド、エデト酸カルシウム(エチレンジアミン四酢酸塩)、カムシル酸塩(カンファースルホン酸塩)、炭酸塩、クロライド、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩(エチレンジアミン四酢酸塩)、エジシル酸塩(１,２－エタンジスルホン酸塩)、エストレート(ラウリル硫酸塩)、エシル酸塩(エタンスルホン酸塩)、フマル酸塩、グルセプト酸塩(グルコヘプトン酸塩)、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート(グリコラミドフェニルアルソン酸塩)、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン(Ｎ,Ｎ’－ジ(デヒドロアビエチル)エチレンジアミン)、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、アイオダイド、イセチオン酸塩(２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩)、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩(メタンスルホン酸塩)、メチルブロマイド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩(２－ナフタレンスルホン酸塩)、硝酸塩、パモ酸塩(エンボナート)、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩(８－クロロテオフィリン酸塩)およびトリエチオジド；有機カチオンベンザチン(Ｎ,Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン)、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(Ｎ－メチルグルカミン)およびプロカイン；および金属カチオンアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛。
Bergeは、さらに次の非ＦＤＡ承認市販(米国外)塩を挙げる：アニオンアジピン酸塩、アルギン酸塩、アミノサリチル酸塩、アンヒドロメチレンクエン酸塩、アレコリン、アスパラギン酸塩、重硫酸塩、ブチルブロマイド、経皮酸塩、ジグルコン酸塩、ジ臭化水素酸塩、二コハク酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヒドロフルオライド、ヨウ化水素酸塩、メチレンビス(サリチル酸塩)、ナパジシル酸塩(１,５－ナフタレンジスルホン酸塩)、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルエチルバルビツール酸塩、ピクリン酸塩、プロピオン酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩；有機カチオンベネタミン(Ｎ－ベンジルフェネチルアミン)、クレミゾール(１－ｐ－クロロベンジル－２－ピロリジン－１’－イルメチルベンゾイミダゾール)、ジエチルアミン、ピペラジンおよびトロメタミン(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)；および金属カチオンバリウムおよびビスマス。
ここに記載するネオデグラダーコンジュゲートを含む医薬組成物は、投与方法により異なり得る適当な担体、添加物および助剤も含み得る。
ある態様において、医薬組成物は、適当な非経腸剤形として製剤化し得る。該製剤は、当分野で知られる種々の方法により製造され得る。医薬組成物は、直接血流、筋肉または直接臓器に投与され得る。非経腸投与の適当な手段は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下を含む。非経腸投与のための適当なデバイスは、針付注射器、無針注射器および点滴技術を含む。
非経腸組成物は、典型的に塩、炭水化物および緩衝剤などの添加物を含み得る水溶液である。しかしながら、組成物はまた無菌非水溶液または無菌パイロジェンフリー水などの適当な媒体と共に使用される乾燥形態としても製剤化され得る。
例えば、凍結乾燥によるなどの無菌条件下の非経腸組成物の製造は、当業者に周知の標準技術を使用して、容易に達成され得る。
非経腸投与用組成物は、即時および／または修飾放出のために製剤化され得る。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化およびプログラム化放出を含む。故に、組成物を、活性剤の修飾放出を提供するインプラントされたデポー剤として投与するための固体、半固体またはチキソトロピック液体として製剤化され得る。
非経腸製剤を、防腐剤などの、しかし、これに限定されない非経腸投与形態で使用される他の適当な薬学的に許容される添加物と混合し得る。
他の態様において、医薬組成物を、錠剤、カプセル剤、散剤、ペレット剤、懸濁液剤、溶液剤、エマルジョン剤などの適当な経口投与形態として製剤化し得る。崩壊剤、希釈剤、キレート剤、結合剤、流動促進剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、抗付着剤などの他の適当な担体が存在し得る
経口投与製剤はまた甘味剤、媒体／湿潤剤、着色剤、風味剤、防腐剤、増粘剤／濃化剤などの他の適当な医薬添加物も含み得る。
ネオデグラダーまたはここに記載するネオデグラダーコンジュゲートを、種々の癌の処置に使用し得る。本発明のあるコンジュゲートは、有効性発現、薬物動態(例えば、吸収、分布、代謝、排泄)、溶解度(例えば、水溶解度)、他の医薬との相互作用(例えば、薬物代謝酵素阻害作用)、安全性(例えば、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、発癌性、中枢毒性)および／または安定性(例えば、化学安定性、酵素に対する安定性)の点で優れている可能性があり、医薬として有用であり得る。
本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートは、疾患、例えば、癌－ 例えば、結腸直腸癌(例えば、結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性結腸直腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌結腸直腸癌、消化器間質腫瘍)、肺癌(例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫)、中皮腫、膵臓癌(例えば、膵臓腺管癌、膵臓内分泌腫瘍)、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃／胃癌(例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌腫)、十二指腸癌、小腸癌、乳癌(例えば、侵襲性腺管癌、非侵襲性腺管癌、炎症性乳癌)、卵巣癌(例えば、卵巣上皮性癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍)、精巣腫瘍、前立腺癌(例えば、ホルモン依存性前立腺癌、非ホルモン依存性前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌)、肝臓癌(例えば、肝細胞癌、原発性肝臓癌、肝外胆管癌)、甲状腺癌(例えば、髄様甲状腺癌腫)、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(例えば、明細胞腎細胞癌)、腎盂および輸尿管移行細胞癌)、子宮癌(例えば、子宮頸癌、子宮体癌、子宮肉腫)、妊娠性絨毛癌、脳腫瘍(例えば、髄芽腫、神経膠腫、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星状細胞腫、汎発性星状細胞腫、未分化星状細胞腫、下垂体腺腫)、網膜芽細胞腫、皮膚癌(例えば、基底細胞腫、悪性黒色腫)、肉腫(例えば、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟組織肉腫、紡錘細胞肉腫)、悪性骨腫瘍、膀胱癌、血液学的／血液癌(例えば、多発性骨髄腫、白血病(例えば、急性骨髄性白血病)、悪性リンパ腫、ホジキン疾患、慢性骨髄増殖性疾患)、原発不明癌の予防または処置用薬剤；癌増殖阻害剤；癌転移阻害剤；アポトーシスプロモーター；前癌病巣処置用薬剤(例えば、骨髄異形成症候群)などの医薬として使用し得る。
ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートは乳癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫または血液学的癌の医薬として使用できる。
さらに、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートを、非薬物療法と同時に使用し得る。正確に言うと、コンジュゲートを、(１)手術、(２)アンギオテンシンIIなどを使用する昇圧療法、(３)遺伝子療法、(４)温熱療法、(５)寒冷療法、(６)レーザー焼灼および(７)放射線療法などの非薬物療法と組み合わせ得る。
例えば、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートを上記手術などの前または後に使用することにより、耐性発現の予防、無進行生存の延長、無疾患生存の延長、癌転移または再発の抑制、寿命の延長などの効果が提供され得る。
さらに、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートでの処置と、(ｉ)種々の感染症の併発に対する抗生物質(例えば、パンスポリンなどのβ－ラクタム系、クラリスロマイシンなどのマクロライド系)投与、(ii)栄養障害改善のための高カロリー点滴、アミノ酸製剤または一般的ビタミン製剤の投与、(iii)疼痛緩和のためのモルヒネ投与、(iv)悪心、嘔吐、摂食障害、下痢、白血球減少症、血小板減少症、ヘモグロビン濃度減少、脱毛、肝障害、腎障害、ＤＩＣ、発熱などの副作用軽減のための薬剤の投与および(ｖ)癌の多剤耐性を抑制するための薬剤投与などの支持療法を組み合わせることが可能である。
ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートを、標準療法、例えば、１以上の治療剤(例えば、抗癌剤および／または免疫調節剤)と組み合わせて使用し得る。従って、ある態様において、ここに開示する腫瘍を処置する方法は、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートと１以上のさらなる治療剤の組み合わせを投与することを含む。ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートを、例えば、免疫経路の複数要素が標的化され得るように、１以上の抗癌剤と組み合わせて使用できる。ある態様において、抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤(すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介するシグナル伝達遮断)を含む。本方法で使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト(例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体)、ＰＤ－１アンタゴニスト(例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体)、ＴＩＭ－３アンタゴニスト(例えば、抗ＴＩＭ－３抗体)またはそれらの組み合わせを含む。組み合わせ処置の包括的および非限定的一覧は、本明細書の組み合わせ処置のセクションに詳細に開示される。
ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートは、対象にさらなる治療剤の投与の前または後に投与される。他の態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートは、対象にさらなる治療剤と同時に投与される。ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートおよびさらなる治療剤は、薬学的に許容される担体中の一組成物として同時に投与され得る。他の態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートおよびさらなる治療剤は、別々の組成物として同時に投与される。
ある態様において、本発明のネオデグラダーまたはネオデグラダーコンジュゲートで処置され得る対象は、ラットまたはマウスなどの非ヒト動物である。ある態様において、処置され得る対象はヒトである。
Ｘ. ネオデグラダーおよび組成物の製造方法
本発明は、ネオデグラダーコンジュゲートを製造する方法であって、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分と式(Ｉ－１)：
〔式中、
ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
Ｘは－ＮＲ２－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮＲ２であり；
Ｒ２は水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｎは１～６の整数であり；
ｍは２～６の整数であり；そして
ここで、各基の左側はＬ’に結合し、右側はＡに結合し；
但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
Ｌ’は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分にコンジュゲートする開裂可能または開裂不可能リンカー前駆体である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を反応させることを含む、方法を提供する。
ここに記載するとおり、リンカー前駆体は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分に接続するヘテロ二官能性基を含む。
ある態様において、Ｌ’は開裂不可能リンカー前駆体である。ある態様において、Ｌ’は
〔式中、
ｐは１～１０の整数であり；そして
はＸへの結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌ’は
である。
ある態様において、ｐは５である。
ある態様において、Ｌ’は開裂可能リンカー前駆体である。
ある態様において、リンカー前駆体はプロテアーゼにより開裂可能である。ある態様において、リンカー前駆体は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は各々独立して存在しないかまたはＬまたはＤ配置の天然に存在するアミノ酸残基であり、但しＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基であり；そして
はＸへの結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は独立して存在しないかまたはＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシンおよびグリシンからなる群から選択され、但し、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個はアミノ酸残基である。
ある態様において、Ｚ１は存在しないかまたはグリシンであり；Ｚ２は存在しないかまたはＬ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニンおよびグリシンからなる群から選択され；Ｚ３は、Ｌ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択され；そしてＺ４は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される。
ある態様において、Ｌ’は
である。
ある態様において、ｑは５である。
ある態様において、Ｌ’は生体内還元性リンカー前駆体である。ある態様において、生体内還元性リンカー前駆体は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は各々独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル、(Ｃ１－Ｃ６)２ＮＣ１－Ｃ６アルキルおよびＣ１－Ｃ６アルキルから選択されるかまたは、２個のジェミナルＲ基は、それらが結合している炭素原子と一体となってシクロブチルまたはシクロプロピル環を形成でき；そして
はＸへの結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌ’は酸開裂可能リンカー前駆体である。ある態様において、Ｌ’は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；そして
はＸへの結合点である。〕
からなる群から選択される。
ある態様において、Ｌ’はクリック放出リンカー前駆体である。ある態様において、Ｌ’は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；そして
はＸへの結合点である。〕
から選択される。
ある態様において、Ｌ’はピロホスファターゼ開裂可能リンカー前駆体である。ある態様において、Ｌ’は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
はＸへの結合点である。〕
である。
ある態様において、Ｌ’はベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカー前駆体である。ある態様において、Ｌ’は
〔式中、
ｑは２～１０の整数であり；
----は存在しないかまたは結合であり；そして
はＸへの結合点である。〕
から選択される。
ある態様において、式(Ｉ－１)の化合物は
から選択される。
ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は式(Ｉ－１)の化合物と反応させる前に前処理される。ある態様において、式(Ｉ－１)の化合物を、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分と反応させる。ある態様において、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を、式(Ｉ－１)の化合物との反応前に鎖間ジスルフィドを還元するために前処理し得る。
一般的合成方法および中間体
本発明の化合物は、本開示および当分野における知識に照らしておよび／または下記スキームおよび合成例を参照して、当業者には製造できる。合成経路例は、下記スキームおよび実施例に示される。次のスキームおよび実施例において用いる可変基(例えば「Ｒ」基)は、本明細書の他の箇所に示すものから独立して解釈されることは理解されるべきである。当業者は、下記スキームおよび実施例が、ここに記載する化合物の製造をどのように説明するかを容易に理解する。
スキームで使用する略語は、一般に当分野で使用される慣例に従う。本明細書および実施例で使用する化学的略語は次のとおり定義する：「ＴＨＦ」はテトラヒドロフラン；「ＤＭＦ」はＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド；「Ｍｅ」はメチル；「Ｂｕ」はブチル；「ＦＡ」はギ酸；「ＰＥ」は石油エーテル；「ＭｅＯＨ」はメタノール；「ＥｔＯＨ」はエタノール；「ＤＣＭ」はジクロロメタン；「ＢＯＣ」または「Ｂｏｃ」「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシド；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチル；「ＯＡｃ」は酢酸エステル；「ｄｐｐｆ」は１,１’－ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン；「ｄｂａ」はジベンジリデンアセトン；「ＣＤＩ」は１,１’－カルボニルジイミダゾール；「ＴＢＡＦ」はテトラブチルアンモニウムフルオライド；「ＴＢＳＣｌ」はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロライド；「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテル；「ＡＣＮ」はアセトニトリル；「ｈ」は時間；「分」は分；「ｒｔ」は室温または保持時間(文脈から判断される)；「ａｑ」は水性、「ｓａｔ」は飽和；「分」は分；「ＨＯＢｔ」は１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物；「ＨＡＴＵ」は１－[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]－１Ｈ－１,２,３－トリアゾロ[４,５－ｂ]ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸またはＮ－[(ジメチルアミノ)－１Ｈ－１,２,３－トリアゾロ－[４,５－ｂ]ピリジン－１－イルメチレン]－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ－オキシド；「ＤＩＥＡ」および「ｉＰｒＮＥｔ２」はジイソプロピルエチルアミン；「Ｅｔ３Ｎ」および「ＴＥＡ」はトリエチルアミン。
スキーム１：化合物(Ｉａ)の製造
実施例１：化合物(Ｉａ)の合成
工程１：化合物２の合成
撹拌中の２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物１、５.００ｇ、２３.１９mmol、１.００当量)のＴＨＦ(７５.００mL)溶液に、ＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(ＴＨＦ中１０Ｍ)(５.８０mL、５８.０mmol、２.５０当量)を０℃で窒素雰囲気下に滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、２時間、７０℃で撹拌した。混合物を、室温に冷却した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：１)により精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(３ｇ、６４％)を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.10-8.05 (m, 1H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.99-3.91 (m, 2H), 3.16-3.09 (m, 2H)
工程２：化合物３の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物２、５.００ｇ、２４.８００mmol、１.００当量)および２－ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル(２９.０mL、１４８.２８mmol、８.００当量)のトルエン(１５０.００mL)溶液に、Ｂｕ４ＮＨＳＯ４(６.７４ｇ、１９.８４mmol、０.８０当量)を添加した。上記混合物に、ＮａＯＨ(Ｈ２Ｏ中５Ｍ)(５００.００mL)を４０分間、０℃で滴下した。得られた混合物を、さらに２時間、２５℃で撹拌した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×５００mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(４００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝４：１)により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸(８ｇ、６５％)を黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.10-8.04 (m, 1H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H), 3.83-3.80 (m, 2H), 3.17-3.14 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)
工程３：化合物４の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチル２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸(化合物３、８.００ｇ、１６.１４mmol、１.００当量、６３.７％)のＤＣＭ(８０.００mL)溶液に、ＴＦＡ(１６.００mL)を室温で滴下した。得られた混合物を、１時間、室温で撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。得られた混合物を、水(５００mL)で希釈した。混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×５００mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。これにより、[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸(６.５ｇ、粗製)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI): 517 (2M-H)-
工程４：化合物５の合成
撹拌中の[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸(化合物４、６.３０ｇ、２１.８４mmol、１.００当量、９０％)およびＨＡＴＵ(１２.４６ｇ、３２.７６mmol、１.５０当量)のＤＭＦ(６５.００mL)溶液に、ＣＨ３ＮＨ２.ＨＣｌ(１.７７ｇ、２６.２１mmol、１.２０当量)およびＤＩＥＡ(１５.２０ｇ、１１７.８mmol、４.００当量)を室温で滴下した。得られた混合物を、２時間、室温で撹拌した。得られた混合物を、水で希釈した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(２×１００mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(５０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)により精製して、２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]－Ｎ－メチルアセトアミド(１０ｇ、純度：５０％、収率：８４％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI): 273.28 (M+H)+
工程５：化合物６の合成
撹拌中の２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]－Ｎ－メチルアセトアミド(化合物５、３.３ｇ、１２.１０mmol、１.００当量)のＴＨＦ(３５.００mL)溶液に、ＢＨ３－ＴＨＦ(ＴＨＦ中１Ｍ)(１２.１０mL、１２.１０mmol、１.００当量)を室温で窒素雰囲気下に滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、２時間、７０℃で撹拌した。ＭｅＯＨで反応をクエンチした。残渣を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６に酸性化した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(２０mL)で抽出した。水相を飽和ＮａＨＣＯ３(飽和、水性)でｐＨ８に塩基性化した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×１００mL)で抽出し、塩水(５０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。これにより、[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル](メチル)アミン(２.５ｇ、８０％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI): 259.26 (M+H)+
工程６：化合物７の合成
撹拌中の[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル](メチル)アミン(化合物６、２.５０ｇ、９.６９mmol、１.００当量)およびＢｏｃ２Ｏ(２.５３ｇ、１１.６mmol、１.２０当量)のＴＨＦ(４０mL)溶液に、ＴＥＡ(１.１７ｇ、１１.６mmol、１.２０当量)を２５℃で滴下した。混合物を、２５℃で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１)により精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(１.７０ｇ、５０％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI): 359.36 (M+H)+
工程７：化合物８の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物７、１.７０ｇ、４.７４mmol、１.００当量)およびＮＨ４Ｃｌ(７５０mg、１４.２mmol、３.００当量)のＥｔＯＨ(８５mL)およびＨ２Ｏ(１７mL)溶液に、２５℃でＦｅ(１.３ｇ、２３.７mmol、５.００当量)を添加した。混合物を、８０℃で２時間撹拌した。混合物を、室温に冷却した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＨ(３×５０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝４：１)により精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(９００mg、５８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI): 329.33 (M+H)+
工程８：化合物９の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物８、５００mg、１.５２mmol、１.００当量)のＴＨＦ(１０mL)溶液に、ジホスゲン(６０１mg、３.０４mmol、２.００当量)を２５℃で滴下した。混合物を、２５℃で１時間撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮し、ＤＭＦ(５mL)に再溶解した。撹拌中の３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、下記のとおり製造、４９９mg、１.８２mmol、１.２０当量)およびＴＥＡ(１.５６ｇ、１５.４５mmol、１０.００当量)のＤＭＦ(２０mL)中の混合物に、２５℃で上記溶液を滴下した。混合物を、２５℃で１時間撹拌した。得られた混合物を、４０mLの氷水で希釈した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×４０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(５×４０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル(２－(２－クロロ－４－(３－((２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソイソインドリン－５－イル)メチル)ウレイド)フェネトキシ)エチル)(メチル)カルバメート(６７０mg、７０％)を白色固体として得た。LCMS: (ESI): 628.63 (M+H)+
工程９：ネオデグラダーＰ１の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物９、６７０mg、１.０７mmol、１当量)のＤＣＭ(１０mL)溶液に、ＴＦＡ(２.５mL)を０℃で滴下した。混合物を、２５℃で１時間撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。粗製生成物を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した：カラム、SunFire C18 OBD Prepカラム、１００μm、１９×２５０mm；移動相、水(０.０５％ＴＦＡ)およびＡＣＮ(５％相Ｂを３０分間以内に６０％まで)；検出器、ＵＶ ２２０nm。集めたフラクションを凍結乾燥して、１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(５００mg、８９％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 528.53 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 7.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 2H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 5.19-5.1 (m, 1H), 4.55-4.41 (m, 4H), 3.75-3.67 (m, 4H), 3.21-3.15 (m,2H), 3.03-3.96 (m, 2H), 2.96-2.84 (m, 1H), 2.83-2.73 (m, 2H), 2.69 (s, 3H), 2.55-2.42 (m, 1H), 2.21-2.12 (m, 1H)
工程１０：化合物(Ｉａ)の合成
撹拌中の１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(ネオデグラダーＰ１、２００mg、０.３８mmol、１.００当量)およびルチジン(８１mg、０.７６mmol、２.００当量)のＤＭＦ(１０mL)中の混合物に、室温でＨＯＢＴ(２６mg、０.１９mmol、０.５０当量)および[４－[(２Ｓ)－５－(カルバモイルアミノ)－２－[(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル]メチル４－ニトロフェニルカーボネート(２７９mg、０.３８mmol、１.００当量)を少しずつ添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下、１２時間、４０℃で撹拌した。反応物を室温に冷却後、水(３０mL)で反応をクエンチした。得られた混合物を、ＤＣＭ(３×３０mL)で抽出した。合わせた有機層を水(２×３０mL)、塩水(３０mL)で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣を逆相カラム(Ｃ１８、移動相Ａ：０.１％ＦＡ水溶液、Ｂ：ＡＣＮ)で精製した。集めたフラクションを、減圧下、濃縮乾固した。粗製生成物(６０mg)を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した(カラム：Xselect CSH OBDカラム３０×１５０mm ５μm、ｎ；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で３３Ｂ～５０Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：５.２７分)。集めたフラクションを凍結乾燥して、[４－[(２Ｓ)－５－(カルバモイルアミノ)－２－[(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル]メチルＮ－[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(２３.８mg、５％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 1126.11 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.12-8.08 (m, 1H),7.85-7.81 (m, 2H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.60-7.58 (m, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.47-7.44 (m, 1H), 7.28-7.25 (m, 2H), 7.18-7.12 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.90 (br s, 1H), 5.97-5.95 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.12-5.05 (m, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.42-4.32 (m, 4H), 4.18-4.15 (m, 1H), 3.56-3.40 (m, 4H), 3.37-3.36 (m, 3H),3.05-2.90 (m, 3H), 2.89-2.85 (m, 5H), 2.72-2.55 (m, 2H), 2.40-2.33 (m, 2H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.00-1.87 (m, 2H), 1.74-1.57 (m, 2H), 1.50-1.42 (m, 5H), 1.22-1.10 (m, 3H), 0.85-0.80 (m, 6H)
スキーム２：化合物(Ｉｂ)の製造
実施例２：化合物(Ｉｂ)の合成
工程１：化合物１１の合成
撹拌中のメチル４－ブロモ－２－(ブロモメチル)ベンゾエート(化合物１０、２０.０ｇ、６４.８mmol、１.００当量)および３－アミノピペリジン－２,６－ジオン塩酸塩(１０.６４ｇ、８３.０mmol、１.２８当量)のＤＭＦ(８０ml)中の混合物に、窒素雰囲気下、２５℃でＴＥＡ(２２.４mL、１６２.２mmol、２.５０当量)を滴下した。混合物を、２５℃で１６時間撹拌した。続いて、Ｈ２Ｏ(６０mL)、ＡｃＯＨ(２３mL)およびＥｔ２Ｏ(６０mL)を連続して２５℃で添加した。混合物を、２５℃で２時間撹拌した。沈殿固体を濾過により集め、Ｅｔ２Ｏ(６０mL)で洗浄した。これにより、３－(５－ブロモ－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル)ピペリジン－２,６－ジオン(９.０ｇ、４２％)を明青色固体として得た。LCMS (ESI): 323.32 (M+H)+
工程２：化合物１２の合成
撹拌中の３－(５－ブロモ－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル)ピペリジン－２,６－ジオン(化合物１１、１.００ｇ、３.０９mmol、１.００当量)およびｄｐｐｆ(５１mg、０.０９３mmol、０.０３当量)のＤＭＦ(８mL)中の混合物に、窒素雰囲気下、２５℃でＺｎ(ＯＡｃ)２(１７０mg、０.９２８mmol、０.３０当量)、Ｚｎ(ＣＮ)２(５４５mg、４.６４mmol、１.５０当量)およびＰｄ２(ｄｂａ)３(２８mg、０.０３１mmol、０.０１当量)を添加した。最終反応混合物を、２時間、１２０℃でマイクロ波照射した。混合物を、室温に冷却し、濾過した。フィルターケーキをＭｅＯＨ(３×３０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、８０ｇ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)に付して、所望の生成物２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－カルボニトリル(４００mg、４７％)を褐色固体として得た。LCMS (ESI): 270 (M+H)+
工程３：ＩＮＴ１の合成
撹拌中の２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－カルボニトリル(化合物１２、３.０ｇ、１１.１４mmol、１.００当量)およびＨＣｌ(１２Ｍ)(３.６mL)のＭｅＯＨ(２５mL)中の混合物に、２５℃でＰｔＯ２(１.２５ｇ、５.５mmol、０.４９当量)を添加した。混合物を、水素バルーンを使用して、水素雰囲気下、室温で１６時間水素化した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＭｅＯＨ(２×３０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。得られた固体をＤＣＭ：ＭｅＯＨ(３：１)(３×３０mL)で洗浄し、乾燥させた。これにより、３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(２.５ｇ、８０％)を灰色固体として得た。LCMS (ESI): 274 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.02 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.4 Hz, 1H),5.16-5.11 (m, 1H), 4.52 (d, J=17.2Hz, 1H), 4.40 (d, J=17.2Hz, 1H), 2.96-2.90 (m, 1H), 2.60-2.54 (m, 1H), 2.43-2.34 (m, 1H), 2.06-1.96 (m, 1H)
工程４：化合物１４の合成
撹拌中の(２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物１３、５.００ｇ、２２.５０mmol、１.００当量)のＴＨＦ(７５mL)溶液に、窒素雰囲気下、０℃でＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(ＴＨＦ中１０Ｍ)(５.６０mL、５６mmol、２.５０当量)を滴下した。混合物を、７０℃で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに適用し、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ(５：１)で溶出して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(４.４４ｇ、８８％)を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.10-8.05 (m, 1H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.99-3.91 (m, 2H), 3.16-3.09 (m, 2H)
工程５：化合物１５の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物１４、４.４４ｇ、２２.０２mmol、１.００当量)およびイミダゾール(４.５０ｇ、６６.０６mmol、３.００当量)のＤＭＦ(５０.００mL)中の混合物に、２５℃でＴＢＳＣｌ(６.９７ｇ、４６.２５mmol、２.１０当量)を添加した。混合物を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を、水(１００mL)で希釈した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×１００mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(３×１００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに適用し、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１０：１)で溶出して、ｔｅｒｔ－ブチル[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]ジメチルシラン(６.６ｇ、９０％)を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.24 (s, 1H), 8.06-8.04 (m, 1H), 7.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.89-3.86 (m, 2H), 3.06-0.04 (m, 2H), 0.85 (s, 9H), 0.04 (s, 6H)
工程６：化合物１６の合成
ｔｅｒｔ－ブチル[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]ジメチルシラン(化合物１５、５.７０ｇ、１８.０５mmol、１.００当量)およびＦｅ(１０.０８ｇ、１８０.４５mmol、１０.００当量)のＥｔＯＨ(１１０mL)／水(５５mL)中の混合物に、ＮＨ４Ｃｌ(９.６５ｇ、１８０.４５mmol、１０当量)を添加した。混合物を、８０℃で２時間撹拌した。混合物を、室温に冷却した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＨ(３×５０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣を水(１００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(５０mL×３)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下蒸発乾固して、４－[２－[(ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル)オキシ]エチル]－３－クロロアニリン(５.２ｇ、粗製)を薄褐色油状物として得た。LCMS (ESI): 286.29 (M+H)+
工程７：化合物１７の合成
４－[２－[(ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル)オキシ]エチル]－３－クロロアニリン(化合物１６、２００.００mg、０.７０mmol、１.００当量)およびＴＥＡ(１４１mg、１.４０mmol、２.００当量)のＤＭＦ(３mL)溶液に、ＣＤＩ(１１３mg、０.７０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１mL)溶液を、窒素下、０℃で滴下した。得られた混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いで上記溶液およびＴＥＡ(１４１mg、１.４０mmol)を、３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、１９２mg、０.７０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２mL)溶液に滴下した。同じ反応を２回繰り返した。得られた混合物を２５℃で１時間撹拌した。反応物を、水(２０mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２０mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水、塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラム(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)で精製して、１－(４－[２－[(ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル)オキシ]エチル]－３－クロロフェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(１７０mg、２１％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 585.59 (M+H)+
工程８：ネオデグラダーＰ３の合成
１－(４－[２－[(ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル)オキシ]エチル]－３－クロロフェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物１７、１７０.００mg、０.２９mmol、１.００当量)のＴＨＦ(２.００mL)溶液に、０℃でＴＢＡＦ(ＴＨＦ中１Ｎ、０.５８mL、０.５８mmol、２.００当量)を添加した。得られた混合物を２５℃で８時間撹拌した。反応物を分取ＴＬＣ(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)で精製して、１４７mgの粗製１－(３－クロロ－４－(２－ヒドロキシエチル)フェニル)－３－((２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソイソインドリン－５－イル)メチル)尿素を白色固体として得た。LCMS (ESI): 471.47 (M+H)+
工程９：化合物１９の合成
２－メチル－２－スルファニルプロパン－１－オール(化合物１８、１.４ｇ、１３.２mmol、１.００当量)および５－ニトロ－２－[(５－ニトロピリジン－２－イル)ジスルファニル]ピリジン(化合物１２０、２.０５ｇ、６.６７mmol、０.５０当量)を、ジクロロメタン(３.５０mL)およびＭｅＯＨ(３.５０mL)の溶媒混合物に添加した。得られた混合物を１５℃撹拌した。次いで二酸化マンガン(２.２９ｇ、２６.２mmol、２当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、１５℃で１５分間撹拌した。ＬＣＭＳトレースは反応の完了を示した。反応物を蒸発乾固し、残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＮＨ４ＨＣＯ３)、３０分間で１０％～１００％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを減圧下濃縮乾固して、２－メチル－２－[(５－ニトロピリジン－２－イル)ジスルファニル]プロパン－１－オール(２.２ｇ、５８％)を黄色固体として得た。LCMS (ESI): 261 (M+H)+
工程１０：化合物２０の合成
２－メチル－２－[(５－ニトロピリジン－２－イル)ジスルファニル]プロパン－１－オール(化合物２０、１.０ｇ、３.８４mmol、１.００当量)の無水ＤＣＭ(３０mL)溶液に、ＭｅＳＯ２Ｎａ(１.５７ｇ、１５.４mmol、４.００当量)およびヨウ素(１.９５ｇ、７.６８mmol、２.００当量)を少しずつ添加した。反応混合物を、４５℃で２４時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をカラムシリカゲルクロマトグラフィー(ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝３：１、Ｒｆ＝０.６０；０～３５％ＥｔＯＡｃの石油エーテル溶液)により精製して、２－(メタンスルホニルスルファニル)－２－メチルプロパン－１－オール(８０mg、１０％)を黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3Cl): δ 3.50 (s, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.16 (br s, 1H), 1.47 (s, 6H)
工程１１：化合物(Ｉｂ)の合成
１－[３－クロロ－４－(２－ヒドロキシエチル)フェニル]－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(ネオデグラダーＰ３、２００.００mg、０.４２mmol、１.００当量)およびＴＥＡ(１２９mg、１.２６mmol、３.００当量)のＤＭＦ(４mL)溶液に、ＣＤＩ(１３８mg、０.８４mmol、２.００当量)のＤＭＦ(１mL)溶液を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、水(５０mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２０mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(２０mL×３)、塩水(２０mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下蒸発乾固して、粗製生成物(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチルイミダゾール－１－カルボキシラート、２００mg)を薄黄色固体として得た。粗製生成物(１００.００mg、０.１８mmol、１.００当量)およびＣｓ２ＣＯ３(１１５mg、０.３５mmol、２.００当量)のＤＭＦ(８mL)溶液に、室温で２－(メタンスルホニルスルファニル)－２－メチルプロパン－１－オール(化合物２０、５９mg、０.３２mmol、１.８０当量)のＤＭＦ(２mL)溶液を滴下した。反応物を１５℃で２２時間撹拌した。反応物を、ＥｔＯＡｃ(５０ml)および氷冷水(１００mL)で希釈した。有機層を濾別した。水相を、ＥｔＯＡｃ(３０mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(３０mL×３)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下蒸発乾固して、粗製生成物(１５０mg)を黄色固体として得た。粗製生成物を分取ＨＰＬＣ(カラム：Xselect CSH OBDカラム３０×１５０mm ５μm；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で３８Ｂ～５８Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：５.１２分)で精製した。集めたフラクションを凍結乾燥して、１－[３－クロロ－４－[２－([[２－(メタンスルホニルスルファニル)－２－メチルプロポキシ]カルボニル]－オキシ)エチル]フェニル]－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(１５.７mg、１１％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 681.68 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.70 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24-7.17 (m, 1H), 6.87-6.84 (m, 1H), 5.76 (s, 2H), 5.13-5.11 (m, 1H), 4.42-4.40 (m, 2H), 4.32-4.28 (m, 4H), 3.54 (s, 3H), 3.00-2.87 (m, 3H), 2.62-2.58 (m, 1H), 2.44-2.34 (m, 1H), 2.01-1.95 (m, 1H), 1.45 (s, 6H)
スキーム３：化合物(Ｉｃ)の製造
実施例３：化合物(Ｉｃ)の合成
工程１：化合物２３の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチル(２－アミノフェニル)(メチル)カルバメート(化合物２２、３００mg、１.３５mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２０mL)溶液に、ＣＤＩ(２１８mg、１.３５mmol、１.００当量)およびＴＥＡ(６８mg、１.３５mmol、１.００当量)を０℃で窒素雰囲気下に滴下した。混合物を、０℃で２時間撹拌した。上記混合物に、３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、３６８mg、１.３５mmol、１.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、一夜、７５℃で撹拌した。次いで反応混合物を、室温に冷却した。得られた混合物を水(３０mL)でクエンチし、ＤＣＭ(３×３０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(３０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１)により精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－Ｎ－メチルカルバメート(３００mg、４２％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 522 (M+H)+
工程２：ネオデグラダーＰ４の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物２３、３００mg、１.００当量)のＤＣＭ(２０mL)溶液に、ＴＦＡ(５mL)を０℃で添加した。混合物を、０℃で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。粗製生成物を次の条件を用いる逆相で精製した(Ｃ１８、移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分)。集めたフラクションを減圧下濃縮して、３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－１－[２－(メチルアミノ)フェニル]尿素(２１０mg、８７％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 422 (M+H)+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 7.69 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.26-7.24 (m, 1H), 6.99-6.93 (m, 1H), 6.76-6.72 (m, 1H), 6.60-6.55 (m, 2H), 5.14-5.08 (m, 1H), 5.00-4.85 (br s, 1H), 4.48-4.28 (m, 4H), 2.92-2.82 (m, 1H), 2.70 (s, 3H), 2.62-2.57 (m, 1H), 2.49-2.41 (m, 1H), 2.02-1.95 (m, 1H)
工程３：化合物(Ｉｃ)の合成
撹拌中の３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－１－[２－(メチルアミノ)フェニル]尿素(Ｐ４、１５０.００mg、０.３６mmol、１.００当量)、２,６－ルチジン(７６mg、０.７１mmol、２.００当量)およびＨＯＢＴ(９６mg、０.７１mmol、２.００当量)のＤＭＦ(３.００mL)中の混合物に、窒素雰囲気下、室温で[４－[(２Ｓ)－５－(カルバモイルアミノ)－２－[(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル]メチル４－ニトロフェニルカーボネート(３９４mg、０.５３mmol、１.５０当量)を添加した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ)で精製して、粗製生成物(６０mg)を白色固体として得た。粗製生成物(６０mg)を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した(カラム：Xselect CSH OBDカラム３０×１５０mm ５μm、ｎ；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で２４Ｂ～４４Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：６.３３；ＲＴ２：)。集めたフラクションを凍結乾燥して、[４－[(２Ｓ)－５－(カルバモイルアミノ)－２－[(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル]メチルＮ－[２－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－Ｎ－メチルカルバメート(１８.１mg、５％)を白色固体として得た。LCMS (ESI): 1020 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 8.19-8.06 (m, 3H), 7.79 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.53-7.41 (m, 5H), 7.20-7.05 (m, 4H), 7.00 (s, 2H), 6.95-6.90 (m, 1H), 5.95 (br s, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.18-4.89 (m, 3H), 4.44-4.20 (m, 5H), 4.19-4.17 (m, 1H), 3.09 (s, 3H), 3.07-2.85 (m, 3H), 2.22-2.02 (m, 2H), 2.00-1.85 (m, 2H), 1.71-1.25 (m, 10H), 1.20-1.12 (m, 3H), 0.84-0.80 (m, 6H)
スキーム４は、どのように化合物(Ｉｄ)をネオデグラダーＰ１から製造したかを示す。
スキーム４：化合物(Ｉｄ)の製造
化合物(Ｉｄ)の合成
撹拌中の１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(Ｐ１、４０.００mg、０.０７６mmol、１.００当量)および２,５－ジオキソピロリジン－１－イル６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサノエート(２５.００mg、０.０８１mmol、１.０７当量)のＤＭＦ(２.００mL)中の混合物に、室温でＤＩＥＡ(２０.００mg、０.１６mmol、２.０４当量)を滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、３時間、室温で撹拌した。得られた混合物を水(３０mL)でクエンチし、ＤＣＭ(３×３０mL)で抽出した。合わせた有機層を水(３０mL)、塩水(３０mL)で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣を次の条件により精製した：カラム：SunFire C18 OBD Prepカラム、１００μm、１９mm×２５０mm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：８.５分間で２５Ｂ～５５Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：８分；集めたフラクションを凍結乾燥して、Ｎ－[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)－Ｎ－メチルヘキサンアミド(化合物(Ｉｄ)、２４mg、４３％)を白色固体として得た。LCMS: (ES, m/s): 721,723 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.41 (d, J = 9.6Hz, 1H), 7.18-7.16 (m, 2H), 7.00 (d, J = 5.6Hz, 2H), 6.85-6.80 (m, 1H), 5.12-5.05 (m, 1H), 4.42-4.33 (m, 5H), 3.39-3.36 (m, 3H), 2.91-2.76 (m, 7H), 2.68-2.52 (m, 1H), 2.48-2.35 (m, 1H), 2.33-2.20 (m, 3H), 2.05-1.95 (m, 1H), 1.48-1.44 (m, 5H), 1.28-1.12 (m, 3H)
スキーム５Ａおよび５Ｂは、どのようにネオデグラダーＰ１と別のトリペプチドリンカーの複合体を製造するかを示す。
スキーム５Ａ：ネオデグラダーＰ１－トリペプチドリンカー複合体の合成
スキーム５Ｂ：ネオデグラダーＰ１－トリペプチドリンカー複合体の合成(続き)
スキーム６Ａおよび６ＢはどのようにネオデグラダーＰ１とβ－グルクロニドリンカーの複合体を製造するかを示す。
スキーム６Ａ：ネオデグラダーＰ１－β－グルクロニドリンカー複合体の合成
工程１：化合物２５の合成
撹拌中の３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－プロパン酸(化合物２４、５.００ｇ、１６.０６mmol、１.００当量)の混合物に、ＳＯＣｌ２(２５mL)を室温で添加した。得られた混合物を１６時間、８０℃で撹拌した。所望の生成物ＬＣＭＳはＬＣＭＳで検出される(ＭｅＯＨを伴う誘導体 ＭＳ＝３２６)。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－(３－クロロ－３－オキソプロピル)カルバメート(化合物２５、７.５ｇ、粗製)を黄色油状物として得た。粗製生成物をさらに精製することなく直接次工程で使用した。１Ｈ－ＮＭＲ分析は、それが所望の生成物であることを示した(ＭｅＯＨを伴う誘導体)。1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.81-7.77 (m, 2H), 7.63-7.59 (m, 2H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.40-7.31 (m, 2H), 5.33 (s, 1H), 4.42 (d, J=3.0 Hz, 2H), 4.24 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.74-3.67 (m, 3H), 3.50 (d, J=3.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J=6.0 Hz, 2H)
工程２：化合物２８の合成
撹拌中の４－ホルミル－２－ニトロフェノール(化合物２７、４.２１ｇ、２５.１９mmol、１.００当量)およびＡｇ２Ｏ(７.００ｇ、３０.２０mmol、１.２０当量)のＡＣＮ(１００mL、１９０.２４mmol、７５.００当量)溶液に、化合物２６(１０.００ｇ、２５.１７mmol、１.００当量)を、Ｎ２雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭ(５０ml×３)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥＡ(ＰＥ：ＥＡ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－(４－ホルミル－２－ニトロフェノキシ)オキサン－２－カルボキシラート(化合物２８、１０.５ｇ、８６％)を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ分析は、それが所望の生成物であることを示した。LCMS (ES, m/z): 484 [M+1]+. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.00 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.13-8.09 (m, 1H), 7.52 (d, J=3.0 Hz, 1H), 5.47-5.29 (m, 4H), 4.37-4.35 (m, 1H), 3.75-3.73 (m, 3H), 2.17-2.06 (m, 9H)
工程３：化合物２９の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－(４－ホルミル－２－ニトロフェノキシ)オキサン－２－カルボキシラート(化合物２８、６.００ｇ、１２.４１mmol、１.００当量)のＭｅＯＨ(５０mL)溶液に、Ｎ２雰囲気下、ＲＴでＮａＢＨ４(０.４７ｇ、１２.４２mmol、１.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、２時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温で、水で反応をクエンチした。得られた物質をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。得られた混合物を減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－(ヒドロキシメチル)－２－ニトロフェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物２９、５.５ｇ、９１％)を固体として得た。LCMS (ES, m/z): 486 [M+H]+
工程４：化合物３０の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－(ヒドロキシメチル)－２－ニトロフェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物２９、５.５０ｇ、１１.３３mmol、１.００当量)のＥＡ(６０mL)中の混合物に、室温でＰｄ／Ｃ(１.１０ｇ、１０％)を少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｈ２雰囲気下、１６時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄し、濾液を減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－アミノ－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３０、４.０ｇ、７７％)を固体として得た。粗製生成物をさらに精製することなく直接次工程で使用した。LCMS (ES, m/z): 456 [M+H]+
工程５：化合物３１の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－アミノ－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３０、１.００ｇ、２.１９mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(０.２０ｇ、２.４０mmol、１.１当量)のＴＨＦ(１０mL)溶液に、化合物２５(０.８７ｇ、２.６２mmol、１.２０当量)を、Ｎ２雰囲気下、０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、６時間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温で、水で反応をクエンチした。得られた混合物を、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥＡ(ＥＡ＝１００％)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－プロパンアミド)－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３１、１.１ｇ、６６％)を明黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 749 [M+H]+
工程６：化合物３３の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３１、１.５０ｇ、２.００mmol、１.００当量)および炭酸ビス(４－ニトロフェニル)(化合物３２、０.６８ｇ、２.２４mmol、１.１２当量)のＤＭＦ(１５mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下、０℃でＤＩＥＡ(０.５２ｇ、４.０１mmol、２.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で１０％～９０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを減圧下濃縮乾固して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－[[(４－ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル]フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３３、１.４ｇ、４８％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 914 [M+H]+
スキーム６Ｂ：ネオデグラダーＰ１－β－グルクロニドリンカー複合体の合成
工程７：化合物３４の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－[[(４－ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル]フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３３、１.００ｇ、１.０９mmol、１.００当量)および１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(ネオデグラダーＰ１、０.５８ｇ、１.０９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１０mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下に、室温でＨＯＢＴ(１.１８ｇ、８.７２mmol、８.００当量)および２,４－ジメチルピリジン(１.０７ｇ、８.７２mmol、８.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、１６時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物をさらなる精製に使用した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で１０％～８０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３４、８００mg、５６％)を固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1302 [M+H]+
工程８：化合物３５の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物３４、８００.００mg、０.６１mmol、１.００当量)のＴＨＦ(８０mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下、室温でＨＣｌ(６Ｎ、８０mL)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、３時間、５０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で０％～８０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを凍結乾燥して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物３５、２３０mg、３２％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1162 [M+H]+
工程９：化合物３６の合成
撹拌中の(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物３５、２３０mg、０.２mmol,１.００当量)のＤＭＦ(２mL)溶液に、ピペリジン(０.４mL)を、窒素雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、１０分間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を次の条件(カラム：XSelect CSH Prep C18 OBDカラム、１９×２５０mm、５μm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：７分間で２０Ｂ～４０Ｂ；２２０nm；ＲＴ １：５.７８分)を用いる分取ＨＰＬＣによるさらなる精製に直接使用して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[２－(３－アミノプロパンアミド)－４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物３６、３５mg,１８％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 940 [M+H]+
工程１０：化合物(Ｉｅ)の合成
撹拌中の(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[２－(３－アミノプロパンアミド)－４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物３６、３０mg、０.０３mmol、１.００当量)のＤＭＦ(３mL)溶液に、ＤＩＥＡ(１３mg、０.１０mmol、３.００当量)および化合物３７(３０mg、０.１０mmol、３.００当量)を、窒素雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、１時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した(カラム：Xselect CSH OBDカラム３０×１５０mm ５μm、移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：１０分間で２１Ｂ～３６Ｂ；２２０nm；ＲＴ １：１１.１５分)。集めたフラクションを凍結乾燥して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル]－(メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－[３－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]プロパンアミド]フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物(Ｉｅ)、１０.５mg、２８％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1133 [M+H]+. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.9 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.92-7.68 (m, 4H), 7.52 (s, 1H), 7.44 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.18-6.99 (m, 7H), 5.76 (s, 1H), 5.20-5.10 (m, 2H), 4.98 (br s, 2H), 4.76-4.74 (m, 1H), 4.42-4.33 (m, 4H), 3.65 (br s, 1H), 3.58-3.54 (m, 5H), 3.35 (d, J=6 Hz, 2H), 2.90-2.83 (m, 7H), 2.57-2.55 (m, 3H), 2.45-2.30 (m, 1H), 2.02-1.98 (m, 4H), 1.48-1.42 (m, 5H), 1.40-1.20 (m, 3H)
スキーム７は、どのようにネオデグラダーＰ６とヒドラジンリンカーの複合体を製造するかを示す。
スキーム７：ネオデグラダーＰ６－ヒドラゾンリンカー複合体の合成
工程１：化合物３８の合成
撹拌中の４－アミノアセトフェノン(化合物３７、１００mg、０.７３mmol、１.００当量)のＴＨＦ(２.００mL)溶液に、ジホスゲン(０.４０mL)を室温で滴下した。得られた混合物を、３０分間、０℃で撹拌した。得られた混合物を減圧下濃縮した。得られた固体をＤＭＦ(１.５０mL)に再溶解した。撹拌溶液に、３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、２００mg、０.７３mmol、１.００当量)のＤＭＦ(３.００mL)およびＴＥＡ(０.５０mL)溶液を室温で滴下した。得られた混合物を、１時間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物に水(５mL)を添加し、ＣＨ２Ｃｌ２(３×１０mL)で抽出した。有機層を減圧下濃縮した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、３５分間で１０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを濃縮乾固して、１－(４－アセチルフェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物３８、８０mg、２５％)を明黄色固体として得た。LCMS: (ES.m/z): 435 [M+1]+
工程２：化合物(Ｉｆ)の合成
１－(４－アセチルフェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物３８、８０.００mg、０.１８mmol、１.００当量)および６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンヒドラジド；トリフルオロ酢酸(７５mg、１.２０当量)のメタノール(５.００mL)中の混合物を、一夜、５０℃で撹拌した。混合物を、室温に冷却した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。沈殿固体を濾過により集め、ＭｅＯＨ(２×５mL)で洗浄した。粗製固体を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：Ｃ１８カラム；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で１０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを、ＤＣＭ(３×５mL)で抽出し、減圧下濃縮した。これにより、３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－１－[４－[(１Ｅ)－１－[[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]ｉ分ｏ]エチル]フェニル]尿素(化合物(Ｉｆ)、４.４mg、３.７％)を灰白色固体として得た。LCMS: (ES.m/z): 642 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.99 (s, 1H), 10.26-10.15 (m, 1H), 8.82 (s, 1H),7.69-7.62 (m, 3H), 7.52-7.43 (m, 4H), 7.01-6.99 (m, 2H), 5.13-5.09 (m, 1H), 4.42-4.33 (m, 4H), 2.98-2.82 (m, 1H), 2.62-2.58 (m, 2H), 2.20-2.12 (m, 2H), 1.58-1.51 (m, 6H), 1.26-1.09 (m, 6H)
スキーム８は、どのようにネオデグラダーＰ２と４級アミンリンカーの複合体を製造するかを示す。
スキーム８：ネオデグラダーＰ２－４級アミンリンカー複合体の合成
工程１：化合物４０の合成
撹拌中のＮ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｓ)－４－(カルバモイルアミノ)－１－[[４－(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル]ブチル]カルバモイル]－２－メチルプロピル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド(化合物３９、１００mg、０.１８mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２mL)溶液に、ＳＯＣｌ２(２０mg、０.１８mmol、１当量)のＤＣＭ(２mL)溶液を、Ｎ２下、０℃で滴下した。得られた混合物を、０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、氷冷水(２０mL)で希釈し、ＤＣＭ(１０mL×３)で抽出し、合わせた有機層を水(１０mL)、塩水(１０mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、Ｎ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｓ)－４－(カルバモイルアミノ)－１－[[４－(クロロメチル)フェニル]－カルバモイル]ブチル]カルバモイル]－２－メチルプロピル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド(化合物４０、８０mg、５３％)の生成物を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 591,593 [M+H]+
工程２：化合物４２の合成
撹拌中の(２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物４１、８.６０ｇ、３９.９mmol、１.００当量)のＴＨＦ(１３０mL)中の混合物に、ＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(１０.００mL、１０５.４mmol、２.６４当量)を０℃で滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、４時間、７０℃で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥＡ＝１：２)は反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物４２、７.７ｇ、９６％)を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.11-8.07 (m, 1H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.15 (t, J = 8.0 Hz, 2H)
工程３：化合物４３の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール、(化合物４２、７.７０ｇ、３８.２mmol、１.００当量)および２－ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル(５７.７４ｇ、２９６.０mmol、７.７５当量)のトルエン(７０mL)中の混合物に、Ｂｕ４ＮＨＳＯ４(１０.３７ｇ、３０.６mmol、０.８０当量)を０℃で少しずつ添加した。上記混合物に、ＮａＯＨ(１５.００ｇ、３７５.０mmol、９.８２当量)のＨ２Ｏ(９０mL)溶液を３０時間、０℃で滴下した。得られた混合物を、さらに４時間、室温で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥＡ＝３：１)は反応の完了を示した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×２００mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(５：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチル２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]アセテート(化合物４３、１２.２ｇ、９１％)を黄色油状物として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.07-8.03 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.83 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.16 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)
工程４：化合物４４の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチル２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]アセテート(化合物４３、１２.２０ｇ、３８.６mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１２０mL)中の混合物に、０℃でＴＦＡ(２０mL)を滴下した。得られた混合物を、４時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮した。これにより、[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸(化合物４４、８.４ｇ、８３％)を黄色固体として得た。LCMS: (ES, m/s): 517 (2M-H)- 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.64 (s, 1H), 8.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.11-8.08 (m, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.74 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2H)
工程５：化合物４５の合成
撹拌中の[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]酢酸、(化合物４４、８.４０ｇ、３２.３５mmol、１.００当量)およびＨＡＴＵ(１９.１９ｇ、５０.４７mmol、１.５６当量)のＤＭＦ(８０mL)中の混合物に、窒素雰囲気下、０℃でＣＨ３ＮＨ２.ＨＣｌ(２.６９ｇ、３９.７９mmol、１.２３当量)およびＤＩＥＡ(１７.３１ｇ、１３３.９３mmol、４.１４当量)を添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、４時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。水／ｉｃｅで反応をクエンチした。得られた混合物を、ＤＣＭ(３×５０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(５０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]－Ｎ－メチルアセトアミド(化合物４５、７.２ｇ、８１％)を黄色油状物として得た。LCMS: (ES, m/s): 273,275 (M+H)+
工程６：化合物４６の合成
撹拌中の２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]－Ｎ－メチルアセトアミド(化合物４５、７.２０ｇ、２６.４０mmol、１.００当量)のＴＨＦ(７０mL)中の混合物に、室温でＢＨ３－ＴＨＦ(ＴＨＦ中１０Ｍ、５２.０mL、５２０.０mmol、２０当量)を滴下した。得られた混合物を、４時間、７０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。ＭｅＯＨで反応をクエンチした。残渣を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６に酸性化した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(２０mL)で抽出した。水相を飽和ＮａＨＣＯ３(飽和、水性)でｐＨ８に塩基性化した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×１００mL)で抽出し、塩水(５０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル](メチル)アミン(化合物４６、５.４ｇ、７９％)を黄色固体として得た。LCMS: (ES, m/s): 259,261 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 1H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.72 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.10 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H)
工程７：化合物４７の合成
撹拌中の[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル](メチル)アミン(化合物４６、４.００ｇ、１５.４６mmol、１.００当量)およびＢｏｃ２Ｏ(３.８０ｇ、１７.４１mmol、１.１３当量)のＴＨＦ(２０.００mL)中の混合物に、室温でＮａＨＣＯ３(４.００ｇ、４７.６１mmol、３.０８当量)のＨ２Ｏ(２０.００mL)溶液を滴下した。得られた混合物を、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×２０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１２：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物４７、４.８ｇ、７７％)を黄色固体として得た。
LCMS: (ES, m/s): 359,361 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.24 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 1H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.05-4.00 (m, 1H), 3.69 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.50 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.07 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.36 (s, 9H)
工程８：化合物４８の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート、(化合物４７、５.６０ｇ、１５.６mmol、１.００当量)のＥｔＯＨ(１１２.００mL)中の混合物に、ＮＨ４Ｃｌ(２.５０ｇ、４６.７４mmol、２.９９当量)のＨ２Ｏ(１２.００mL)溶液およびＦｅ(４.４０ｇ、７８.７９mmol、５.０５当量)を室温で添加した。得られた混合物を、３時間、８０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。得られた混合物を減圧下濃縮した。得られた混合物を、ＤＣＭ(３×３０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(３０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物４８、４.２ｇ、８１％)を黄色油状物として得た。LCMS: (ES, m/s): 329,331 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.46-6.43 (m, 1H), 5.18 (br s, 2H), 3.50-3.45 (m, 4H), 3.29-3.26 (m, 2H), 2.75-2.71 (m, 5H), 1.38 (s, 9H)
工程９：化合物４９の合成
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[２－[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]エチル]－Ｎ－メチルカルバメート(化合物４８、１００mg、０.３０mmol、１.００当量)のＴＨＦ(３mL)溶液に、窒素雰囲気下、０℃でＬｉＡｌＨ４(９２mg、２.４３mmol、８.００当量)のＴＨＦ(２mL)溶液を添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。５反応を平衡して行った。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。次いで１Ｎ ＮａＯＨ(１０mL)で反応をクエンチし、濾過し、減圧下濃縮乾固し、次いで残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを濃縮乾固して、３－クロロ－４－[２－[２－(ジメチルアミノ)エトキシ]エチル]アニリン、４９(１８０mg、４４％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 243,245 [M+H]+
工程１０：化合物５０の合成
３－クロロ－４－[２－[２－(ジメチルアミノ)エトキシ]エチル]アニリン(化合物４９、１４０mg、０.５８mmol、１.００当量)のＴＨＦ(９mL)溶液に、窒素雰囲気下、０℃でジホスゲン(１３７mg、０.６９mmol、１.２０当量)を添加した。得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。次いで反応溶液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＤＭＦ(２mL)に再溶解し、次いで３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(１５８mg、０.５８mmol、１.００当量)およびＴＥＡ(１１７mg、１.１５mmol、２.００当量)のＤＭＦ(４mL)溶液に、窒素雰囲気下滴下した。得られた混合物を、室温で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、メタノールで希釈し、得られた溶液を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、１００mgの生成物を無色固体として得た。粗製生成物を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した：カラム：XBridge Shield RP18 OBDカラム、１９×２５０mm、１０μm；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：７分間で１４％～３２％；２２０nm；ＲＴ１：５.２５分。集めたフラクションを凍結乾燥して、１－(３－クロロ－４－[２－[２－(ジメチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物５０、６０mg、１８％)を無色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 542,544 [M+H]+
工程１１：化合物(Ｉｇ)の合成
Ｎ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｓ)－４－(カルバモイルアミノ)－１－[[４－(クロロメチル)フェニル]－カルバモイル]ブチル]カルバモイル]－２－メチルプロピル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド、(化合物４０、６６mg、０.１１mmol、１.００当量)、１－(３－クロロ－４－[２－[２－(ジメチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物５０、６０mg、０.１１mmol、１.００当量)およびＤＩＥＡ(２９mg、０.２２mmol、２.００当量)のＤＭＦ(１mL)溶液に、ＴＢＡＩ(４mg、０.０１mmol、０.１０当量)を、空気中、室温で添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳトレースは反応の完了を示した。得られた混合物を次の条件を用いる逆相カラムクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、４０分間で５％～４５％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、９０mgの粗製生成物を黄色油状物として得た。次いで粗製生成物を次の条件(カラム：Xselect CSH OBDカラム３０×１５０mm ５μm、ｎ；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で１５Ｂ～３５Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：６.００分)により再精製して、([４－[(２Ｓ)－５－(カルバモイルアミノ)－２－[(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル]メチル)[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル]ジメチルアザニウム化合物(Ｉｇ)(１９mg、１４.８％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1096 [M-FA]+, 549 [1/2 (M-FA)]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.48 (s, 1H), 7.77-7.72 (m, 3H), 7.55 - 7.47 (m, 3H), 7.37-7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 - 7.14 (m, 2H), 6.77 (s, 2H), 5.17-5.13 (q, J = 8, 4Hz, 1H), 4.51 - 4.46 (m, 5H), 4.35 (s, 2H), 4.12 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.79 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.45 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 3.22-3.15 (m, 1H), 3.11-3.05 (m, 1H), 3.00 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.92 (s, 6H), 2.89 - 2.84 (m, 1H), 2.81 - 2.73 (m, 1H), 2.54-2.43 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.21 - 2.12 (m, 1H), 2.10 - 2.02 (m, 1H), 1.95 - 1.82 (m, 1H), 1.78-1.69 (m, 1H), 1.64-1.59 (m, 7H), 1.32-1.25 (m, 2H), 0.98-0.96 (m, 6H)
スキーム９Ａおよび９Ｂは、どのようにネオデグラダーＰ１３とペプチド含有リンカーの複合体を製造するかを示す。
スキーム９Ａ：ネオデグラダーＰ１３－ペプチドリンカー複合体の合成
スキーム９Ｂ：ネオデグラダーＰ１３－ペプチドリンカー複合体の合成
スキーム１０は、式(Ｉｈ)の化合物の合成を示す
スキーム１０：ネオデグラダーＰ１－β－グルクロニドリンカー複合体(化合物(Ｉｈ))の合成
工程１：化合物６３の合成
撹拌中の３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパン酸(化合物６２、５.００ｇ、１６.０６mmol、１.００当量)の混合物に、ＳＯＣｌ２(２５mL)を室温で添加した。得られた混合物を１６時間、８０℃で撹拌した。所望の生成物ＬＣＭＳはＬＣＭＳで検出される(ＭｅＯＨを伴う誘導体 ＭＳ＝３２６)。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－(３－クロロ－３－オキソプロピル)カルバメート(化合物６３、７.５ｇ、粗製)を黄色油状物として得た。粗製生成物をさらに精製することなく次工程で直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ分析は、それが所望の生成物であることを示した(ＭｅＯＨを伴う誘導体)。1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.81-7.77 (m, 2H), 7.63-7.59 (m, 2H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.40-7.31 (m, 2H), 5.33 (s, 1H), 4.42 (d, J=3.0 Hz, 2H), 4.24 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.74-3.67 (m, 3H), 3.50 (d, J=3.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J=6.0 Hz, 2H)
工程２：化合物６６の合成
撹拌中の４－ホルミル－２－ニトロフェノール(化合物６５、４.２１ｇ、２５.１９mmol、１.００当量)およびＡｇ２Ｏ(７.００ｇ、３０.２０mmol、１.２０当量)のＡＣＮ(１００mL、１９０.２４mmol、７５.００当量)溶液に、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｒ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－ブロモオキサン－２－カルボキシラート(化合物６４、１０.００ｇ、２５.１７mmol、１.００当量)を、Ｎ２雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭ(５０mL×３)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥＡ(ＰＥ：ＥＡ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－(４－ホルミル－２－ニトロフェノキシ)オキサン－２－カルボキシラート(化合物６６、１０.５ｇ、８６％)を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ分析は、それが所望の生成物であることを示した。LCMS (ES, m/z): 484 [M+1]+. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.00 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.13-8.09 (m, 1H), 7.52 (d, J=3.0 Hz, 1H), 5.47-5.29 (m, 4H), 4.37-4.35 (m, 1H), 3.75-3.73 (m, 3H), 2.17-2.06 (m, 9H)
工程３：化合物６７の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－(４－ホルミル－２－ニトロフェノキシ)オキサン－２－カルボキシラート(化合物６６、６.００ｇ、１２.４１mmol、１.００当量)のＭｅＯＨ(５０mL)溶液に、Ｎ２雰囲気下、室温でＮａＢＨ４(０.４７ｇ、１２.４２mmol、１.００当量)を添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、２時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温で、水で反応をクエンチした。得られた物質をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。得られた混合物を減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－(ヒドロキシメチル)－２－ニトロフェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート、(化合物６７、５.５ｇ、９１％)を固体として得た。LCMS (ES, m/z): 486 [M+H]+
工程４：化合物６８の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－(ヒドロキシメチル)－２－ニトロフェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物６７、５.５０ｇ、１１.３３mmol、１.００当量)のＥＡ(６０mL)中の混合物に、室温でＰｄ／Ｃ(１.１０ｇ、１０％)を少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｈ２雰囲気下、１６時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄し、濾液を減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－アミノ－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物６８、４.０ｇ、７７％)を固体として得た。粗製生成物をさらに精製することなく直接次工程で使用した。LCMS (ES, m/z): 456 [M+H]+
工程５：化合物７０の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－アミノ－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物６８、１.００ｇ、２.１９mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(０.２０ｇ、２.４０mmol、１.１当量)のＴＨＦ(１０mL)溶液に、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－(３－クロロ－３－オキソプロピル)カルバメート(化合物６９、０.８７ｇ、２.６２mmol、１.２０当量)を、Ｎ２雰囲気下、０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、６時間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温で、水で反応をクエンチした。得られた混合物を、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥＡ(ＥＡ＝１００％)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７０、１.１ｇ、６６％)を明黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 749 [M+H]+
工程６：化合物７２の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７０、１.５０ｇ、２.００mmol、１.００当量)および炭酸ビス(４－ニトロフェニル)(化合物７１、０.６８ｇ、２.２４mmol、１.１２当量)のＤＭＦ(１５mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下に、０℃でＤＩＥＡ(０.５２ｇ、４.０１mmol、２.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で１０％～９０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを減圧下濃縮乾固して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]－アミノ]プロパンアミド)－４－[[(４－ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル]フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７２、１.４ｇ、４８％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 914 [M+H]+
工程７：化合物７３の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)－４－[[(４－ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル]フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７２、１.００ｇ、１.０９mmol、１.００当量)および１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(ネオデグラダーＰ１、０.５８ｇ、１.０９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１０mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下に、室温でＨＯＢＴ(１.１８ｇ、８.７２mmol、８.００当量)および２,４－ジメチルピリジン(１.０７ｇ、８.７２mmol、８.００当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、Ｎ２雰囲気下、１６時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物をさらなる精製に使用した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で１０％～８０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを減圧下濃縮して、メチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７３(８００mg、５６％)を固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1302 [M+H]+
工程８：化合物７４の合成
撹拌中のメチル(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－３,４,５－トリス(アセチルオキシ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]オキサン－２－カルボキシラート(化合物７３(８００.００mg、０.６１mmol、１.００当量)のＴＨＦ(８０mL)中の混合物に、Ｎ２雰囲気下に、室温でＨＣｌ(６Ｎ、８０mL)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、３時間、５０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、４０分間で０％～８０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。集めたフラクションを凍結乾燥して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物７４、２３０mg、３２％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1162 [M+H]+
工程９：化合物７５の合成
撹拌中の(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]－２－(３－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド)フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸、７４(２３０mg、０.２mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２mL)溶液に、ピペリジン(０.４mL)を、窒素雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、１０分間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を次の条件(カラム：XSelect CSH Prep C18 OBDカラム、１９×２５０mm,５μm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：７分間で２０Ｂ～４０Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：５.７８分)を用いる分取ＨＰＬＣで直接さらに精製して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[２－(３－アミノプロパンアミド)－４－[([[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル]オキシ)メチル]フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物７５、３５mg、１８％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 940 [M+H]+
工程１０：化合物(Ｉｈ)の合成
撹拌中の(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－[２－(３－アミノプロパンアミド)－４－[({[２－(２－{２－クロロ－４－[({[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル}カルバモイル)アミノ]フェニル}エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル}オキシ)メチル]フェノキシ]－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物７５、１１０mg、０.１２mmol、１.００当量)およびペンタン二酸ビス(２,５－ジオキソピロリジン－１－イル)(化合物７６、４６mg、０.１４mmol、１.２当量)のＤＭＦ(２.０mL)溶液に、ＤＩＥＡ(３０mg、０.２３mmol、２.０当量)を、窒素雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、１時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を次の条件を用いる分取ＨＰＬＣで精製した(カラム：Kinetex EVO prep C18、３０×１５０、５μm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で２１％Ｂ～４１％Ｂ、４１％Ｂ；波長：２５４nm；ＲＴ１(分)：５.８。集めたフラクションを凍結乾燥して、(２Ｓ,３Ｓ,４Ｓ,５Ｒ,６Ｓ)－６－{４－[({[２－(２－{２－クロロ－４－[({[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル}カルバモイル)アミノ]フェニル}エトキシ)エチル](メチル)カルバモイル}オキシ)メチル]－２－(３－{５－[(２,５－ジオキソピロリジン－１－イル)オキシ]－５－オキソペンタンアミド}プロパンアミド)フェノキシ}－３,４,５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸(化合物(Ｉｈ)、４８mg、３４％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 1151 [M+H]+, 1173 [M+Na]+.1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): 12.80 (br s, 1H), 10.98 (s, 1H), 9.08 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J=8.1 Hz,1H), 7.25-7.00 (m, 4H), 6.82-6.80 (m, 1H), 5.86 (s, 1H), 5.39-5.30 (m, 2H), 5.14-5.07 (m, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.84 (d, J=7.2 Hz,1H), 4.47-4.27 (m, 4H), 3.90 (d, J=9.6 Hz, 1H), 3.56-3.48 (m, 4H), 3.45-3.36 (m, 6H), 2.95-2.80 (m, 8H), 2.75-2.65 (m, 3H), 2.62-2.55 (m, 2H), 2.49-2.35 (m, 1H), 2.21-2.16 (m, 2H), 2.01-1.95 (m, 1H), 1.85-1..80 (m, 2H)
スキーム１１：ネオデグラダーＰ１－リンカー複合体(化合物(Ｉｉ))の合成
工程１：化合物７６の合成
撹拌中の１－(３－クロロ－４－[２－[２－(メチルアミノ)エトキシ]エチル]フェニル)－３－[[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]尿素(化合物Ｐ１、１８０mg、０.３４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(８mL)溶液に、ＴＥＡ(１０４mg、１.０２mmol、３.０当量)および４－(クロロスルホニル)－３－ニトロ安息香酸(１８１mg、０.６８mmol、２.００当量)を、窒素雰囲気下、０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、４時間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物をさらなる精製に使用した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、１０分間で１０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。混合物を凍結乾燥して、４－[[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)スルファモイル]－３－ニトロ安息香酸、(化合物７６、７０mg、２７％)を明黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 757 [M+1]+
工程２化合物(Ｉｉ)の合成
撹拌中の４－[[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)スルファモイル]－３－ニトロ安息香酸、(化合物７６、６０mg、０.０８mmol、１.００当量)のＤＭＦ(６mL)中の混合物に、窒素雰囲気下に、室温でＨＡＴＵ(４５mg、０.１２mmol、１.５当量)、１－(２－アミノエチル)ピロール－２,５－ジオン塩酸塩(化合物７７、１７mg、０.１０mmol、１.２０当量)およびＤＩＥＡ(３１mg、０.２４mmol、３.０当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、４時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。残渣を分取ＨＰＬＣ(カラム：XBridge Prep Phenyl OBDカラム、１９×１５０mm ５μm １３nm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：１０分間で２５Ｂ～４３Ｂ；２２０nm；ＲＴ１：１１.９７分)で精製した。集めたフラクションを凍結乾燥して、４－[[２－(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)エチル](メチル)スルファモイル]－Ｎ－[２－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)エチル]－３－ニトロベンズアミド(化合物(Ｉｉ)、２７mg、３６％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 879,881 [M+H]. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.00 (s, 1H), 9.01 (t, J=6.0 Hz, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.11 (s, 2H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.44 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.21-7.12 (m, 2H), 7.02 (s, 2H), 6.84 (t, J=6.0 Hz, 1H), 5.14-5.08 (m, 1H), 4.48-4.28 (m, 4H), 3.62-3.50 (m, 6H), 3.40-3.28 (m, 2H), 2.95-2.85 (m, 4H), 2.80-2.73 (m, 2H), 2.65-2.60 (s, 1H), 2.41-2.27 (m, 1H), 2.05-1.95 (m, 1H)
スキーム１２：ネオデグラダーＰ１－ＧＧＦＧリンカー複合体(化合物(Ｉｊ))の合成
工程１：化合物７９の合成
撹拌中の(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－アセトアミド)酢酸(化合物７８、１０.００ｇ、２８.２２mmol、１.００当量)およびＰｂ(ＯＡｃ)４(１５.０２ｇ、３３.８６mmol、１.２０当量)のＴＨＦ(３００mL)およびトルエン(１００mL)中の混合物に、ピリジン(２.５９ｇ、３２.７４mmol、１.１６当量)を、窒素雰囲気下、室温で滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、一夜、８０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキを酢酸エチル(２０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチル(２０mL)に溶解し、水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：４)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセトアミド)メチルアセテート(化合物７９、６.５ｇ、５６％)を白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 391 [M+Na]+. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.45 (t, J =7.5Hz, 2H), 7.36 (d, J =7.5Hz, 2H), 7.18 (br s, 1H),5.48 (br s, 1H), 5.28 (d, J =7.2Hz, 2H), 4.48 (d, J =6.6Hz, 2H), 4.26 (t, J =6.6Hz, 1H), 3.93 (d, 5.4Hz, 2H), 2.08 (s, 3H)
工程２：化合物８１の合成
撹拌中の(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]－アミノ]アセトアミド)メチルアセテート、７９(２.００ｇ、５.４３mmol、１.００当量)および２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物３、３.２０ｇ、１５.８５mmol、２.９２当量)のＤＣＭ(４０mL)混合物に、窒素雰囲気下、０℃でＰＰＴＳ(４００mg、１.５９mmol、０.２９当量)を滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、一夜、４５℃で撹拌した。４０％所望の生成物ＬＣＭＳはＬＣＭＳで検出される。混合物を室温に冷却した。水／ｉｃｅで反応をクエンチした。得られた混合物を、ＥｔＯＥｔ(３×２０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(３０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を精製ｂｙシリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：９)で溶出して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]メチル]カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８１、１.７ｇ、５５％)を白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 510,512 [M+H]+. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ 8.58 (t, J=5.1Hz, 1H), 8.22 (dd, J =12, 2.4Hz, 1H), 7.89 (d, J =7.5Hz, 1H), 7.71-7.54 (m, 4H), 7.43-7.29 (m, 4H), 4.56 (d, J =6.9Hz, 2H), 4.30-4.16 (m, 3H), 3.70-3.61 (m, 4H), 3.04 (t, J =6.3Hz, 2H)
工程３：化合物８２の合成
撹拌中の９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]メチル]カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８１、１.６０ｇ、３.１４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５.０mL)中の混合物に、窒素雰囲気下、０℃でピペリジン(１.０mL)を少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、１時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、４０分間で０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。これにより、２－アミノ－Ｎ－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]メチル]アセトアミド(化合物８２、７５０mg、７６％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI, ms) 288 [M+H]+,329 [M+H+ACN]+
工程４：化合物８３の合成
撹拌中の２－アミノ－Ｎ－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]－メチル]アセトアミド(化合物８２、７５０mg、２.６１mmol、１.００当量)およびＢｏｃ２Ｏ(５８０mg、２.６６mmol、１.０２当量)のＤＭＦ(１０.００mL)中の混合物に、ＮａＨＣＯ３(４７７mg、５.６８mmol、２.１８当量)のＨ２Ｏ(１０.００mL)溶液を０℃で滴下した。得られた混合物を、３時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。水(２０mL)の添加により反応をクエンチした。得られた混合物を、ＥｔＯＥｔ(３×２０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]メチル]カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８３、６５０mg、５８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ESI, ms), 388 [M+H]+, 332 [M+H-56]+. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J=2.4Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.46 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.05 (br s, 1H), 5.25 (br s, 1H), 4.73 (d, J=7.2Hz, 2H), 3.81-3.73 (m, 4H), 3.34-3.32 (m, 2H), 3.08 (t, J=6.8Hz, 2H), 1.42 (s, 9H)
工程５：化合物８４の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エトキシ]メチル]－カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８３、６５０mg、１.６８mmol、１.００当量)およびＦｅ(２６０mg、４.６６mmol、２.７８当量)のＥｔＯＨ(９.００mL)中の混合物に、ＮＨ４Ｃｌ(９１０mg、１７.０１mmol、１０.１当量)のＨ２Ｏ(３.００mL)溶液を室温で滴下した。得られた混合物を、４時間、９０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。得られた混合物を減圧下濃縮した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(３×２０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]メチル]－カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８４、５００mg、８３％)を黄色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 358 [M+H]+, 380 [M+Na]+. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.02-6.96(m, 2H), 6.68 (d, J=2.4Hz, 1H), 6.52-6.49 (m, 1H), 5.29 (br s, 1H), 4.74 (d, J =6.9Hz, 2H), 3.80-3.78 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 2H), 2.88 (t, J =7.2Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)
工程６：化合物８６の合成
撹拌中の３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン塩酸塩(化合物８５、３９８mg、１.２８mmol、０.９２当量)およびＣＤＩ(４５０mg、２.７８mmol、１.９９当量)のＤＭＦ(５.００mL)中の混合物に、０℃でＴＥＡ(３００mg、２.９６mmol、２.１２当量)を添加した。得られた混合物を、２時間、室温で撹拌した。上記混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エトキシ]メチル]カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物８４、５００mg、１.４０mmol、１.００当量)およびＤＭＡＰ(５５０mg、４.５０mmol、３.２２当量)を少しずつ添加した。得られた混合物を、さらに一夜、６０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm。これにより、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]カルバモイル]メチル)カルバメート(化合物８６、５５０mg、６０％)を明褐色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 657 [M+H]+, 601 [M+H-56]+,557 [M+H-100]+
工程７：化合物８７の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]カルバモイル]メチル)－カルバメート(化合物８６、５３０mg、０.８０mmol、１.００当量)のＤＣＭ(５.００mL)中の混合物に、０℃でＴＦＡ(１.００mL)を添加した。得られた混合物を、３０分間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮した。これにより、２－アミノ－Ｎ－[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]アセトアミド；トリフルオロ酢酸(化合物８７、(５１０mg、純度：６４％、収率：６０％)を灰白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 557 [M+H-TFA]+
工程８：化合物８９の合成
撹拌中の(２Ｓ)－２－[２－(２－アミノアセトアミド)アセトアミド]－３－フェニルプロパン酸(化合物８８、２.００ｇ、７.１６mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(１.８０ｇ、２１.４１mmol、３.００当量)のＨ２Ｏ(４０.００mL)中の混合物に、Ｂｏｃ２Ｏ(１.８６ｇ、８.５２mmol、１.２０当量)のＤＭＦ(４０.００mL)溶液を０℃で滴下した。得られた混合物を、一夜、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温で、水で反応をクエンチした。得られた混合物を、ＥｔＯＥｔ(３×５０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(５０mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水(０.０５％ＴＦＡ)、３０分間で５％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２２０nm。これにより、(２Ｓ)－２－(２－[２－[(ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)アミノ]アセトアミド]アセトアミド)－３－フェニルプロパン酸(化合物８９、１.８ｇ、６０％)を白色半固体として得た。LCMS (ESI, ms): 380 [M+H]+,324 [M+H-56]+. 1H NMR: (300MHz, DMSO-d6) δ 8.17 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.93 (t, J =5.7Hz, 1H), 7.31-7.20 (m, 5H), 7.00 (t, J =6.0Hz, 1H), 4.46-4.39 (m, 1H),3.78-3.67 (m, 2H), 3.56 (d, J =5.7Hz, 2H), 3.09-3.02 (m, 1H), 2.92-2.73 (m, 1H), 1.39 (s, 9H)
工程９：化合物９０
撹拌中の(２Ｓ)－２－(２－[２－[(ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)アミノ]アセトアミド]－アセトアミド)－３－フェニルプロパン酸(化合物８９、３４０mg、０.９０mmol、１.００当量)およびＨＡＴＵ(３４０mg、０.９０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５.００mL)中の混合物に、ＨＯＢＴ(１０２mg、０.７５mmol、０.８４当量)を、０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、３０分間、０℃で撹拌した。上記混合物に、２－アミノ－Ｎ－[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]アセトアミド；トリフルオロ酢酸(化合物８７、５１１mg、純度：６４％、０.４８mmol、０.５４当量)およびＤＩＥＡ(３４０mg、２.６３mmol、２.９４当量)を０℃で添加した。得られた混合物を、さらに２時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２２０nm。集めたフラクションを減圧下濃縮した。これにより、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[(１Ｓ)－１－[([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]－２－フェニルエチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物９０、２１０mg、４８％)を灰白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 918 [M+H]+, 818 [M+H-100]+.1H NMR: (400MHz, DMSO-d6): δ 10.97 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.50 (t, J=6.4Hz, 1H), 8.31 (t, J=4.4Hz, 1H), 8.15 (d, J =9.6Hz, 1H), 7.910 (t, J =8.0Hz, 1H), 7.68-7.64 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.43 (d, J =9.6Hz, 1H), 7.24-7.12 (m, 7H), 7.00-6.95 (m, 1H), 6.84 (t, J =6.4Hz, 1H), 5.13-5.06 (m, 1H), 4.55-4.27 (m, 7H), 3.72-3.60 (m, 6H), 3.75-3.67 (m, 3H), 3.59-3.49 (m, 5H), 3.07-3.01 (m, 1H), 2.94-2.73 (m, 4H), 2.62-2.54 (m, 1H), 2.40-2.31 (m, 1H), 2.01-1.94 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.35 (s, 9H)
工程１０：化合物９１の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[(１Ｓ)－１－[([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)－メチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]－２－フェニルエチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]－メチル]カルバメート(化合物９０、１４０mg、０.１５mmol、１.００当量)のＤＣＭ(５.００mL)中の混合物に、ＴＦＡ(１.００mL)を０℃で滴下した。得られた混合物を、３０分間、０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を減圧下濃縮した。これにより、(２Ｓ)－２－[２－(２－アミノアセトアミド)アセトアミド]－Ｎ－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]－カルバモイル]メチル)－３－フェニルプロパンアミド；トリフルオロ酢酸(化合物９１、１４０mg、７９％)を灰白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 818 [M+H-TFA]+
工程１１：化合物(Ｉｊ)の合成
撹拌中の(２Ｓ)－２－[２－(２－アミノアセトアミド)アセトアミド]－Ｎ－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－エトキシ)メチル]カルバモイル]メチル)－３－フェニルプロパンアミド；トリフルオロ酢酸(化合物９１、１４０mg、０.１５mmol、１.００当量)およびＤＩＥＡ(７０mg、０.５４mmol、３.６１当量)のＤＭＦ(２.００mL)中の混合物に、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサノエート(化合物９２、７０mg、０.２３mmol、１.５０当量)を０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、２時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を直接次の条件により精製した：カラム：XSelect CSH Prep C18 OBDカラム、１９×２５０mm,５μm；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：７分間で２５Ｂ～５０Ｂ；２５４nm；ＲＴ１：６.３５分；集めたフラクションを凍結乾燥して、粗製生成物を得た。粗製生成物を次の条件により再精製した：カラム：Kinetex EVO C18カラム、３０×１５０,５μm；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で２０Ｂ～４０Ｂ、２２０nm；ＲＴ１：６.７７分；集めたフラクションを凍結乾燥して、Ｎ－[[([[(１Ｓ)－１－[([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エトキシ)メチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]－２－フェニルエチル]カルバモイル]メチル)カルバモイル]メチル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド(化合物(Ｉｋ)、２２.８mg、１４％)を灰白色固体として得た。LCMS (ESI, ms): 1011 [M+H]+. 1H NMR: (400MHz, DMSO-d6): δ 10.95 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.51 (t, J=8.4Hz, 1H), 8.29 (t, J =8.0Hz, 1H), 8.12-8.01 (m, 3H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.42 (d, J =8.0Hz, 1H), 7.23-7.16 (m, 7H), 6.99 (s, 2H), 6.82 (t, J=8.0Hz, 1H), 5.13-5.09 (m, 1H), 4.55-4.28 (m, 7H), 3.72-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.36-3.34 (m, 2H), 3.05-3.00 (m, 1H), 2.94-2.72 (m, 4H), 2.62-2.54 (m, 1H), 2.40-2.32 (m, 1H), 2.12-2.05 (m, 2H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.50-1.38 (m, 4H), 1.19-1.10 (m, 2H)
スキーム１３：ネオデグラダーＰ１４－ＡＡＡリンカー複合体(化合物(Ｉｋ))の合成
工程１：化合物９４の合成
撹拌中の(２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物９３、２４.００ｇ、１１１.３２mmol、１.００当量)のＴＨＦ(２４０.００mL)溶液に、ＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(２８.００mL、２９５.２３mmol、２.６５当量)を、窒素雰囲気下、滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、２時間、７０℃で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１)は反応の完了を示した。室温に冷却後、得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物９４、１８.００ｇ、８０％)を明黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.27 (s, 1H), 8.10-8.07 (m, 1 H), 7.52 (d, J = 3 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 6 Hz, 2H)
工程２：化合物９５の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物９４、５.００ｇ、２４.８０mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１００.００mL)溶液に、ＮＢＳ(６.６２ｇ、１.５０当量)およびＰＰｈ３(９.７６ｇ、３７.２１mmol、１.５０当量)を、Ｎ２下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を一夜、室温で、Ｎ２下に撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(４：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物９５、５.１０ｇ、７２％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.79 4 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2H)
工程３：化合物９６の合成
１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物９５、５.００ｇ、１８.９０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５０.００mL)溶液に、チオ酢酸カリウム(２.１６ｇ、１８.９０mmol、１.００当量)を、窒素雰囲気下、室温で添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、水(６００.００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２０００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(２００.００mL)、塩水(２００.００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物９６、４.５０ｇ、８５％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.20 - 3.05 (m, 4H), 2.34 (s, 3H)
工程４：化合物９７の合成
撹拌中の１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物９６、２.００ｇ、７.７０mmol、１.００当量)のＭｅＯＨ(３００.００mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でＭｅＯＮａ(６.９３mL、３７.３３mmol、５.００当量、３０％ｉｎＭｅＯＨ)を添加した。得られた混合物を０℃で、Ｎ２下、１時間撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応をＡｃＯＨでｐＨ値３～４までクエンチした。得られた混合物を減圧下濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(５０.００mL)で希釈し、濾過した。濾液を分取ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)で精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物９７、１.３５ｇ、７２％)を明黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.0Hz, 2H), 2.85 (dt, J = 8.0, 7.2 Hz, 2H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 1H)
工程５：化合物９９の合成
撹拌中の(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパン酸(化合物９８、２０.００ｇ、６４.２４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２００.００mL)溶液に、空気雰囲気下、室温でＴＳＴＵ(２５.１８ｇ、８３.５２mmol、１.３０当量)およびＤＩＥＡ(１６.６０ｇ、１２８.４８mmol、２.００当量)を添加した。得られた混合物を、１時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(２００.００mL)で希釈し、を、ＥｔＯＡｃ(１００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(１００.００mL)、塩水(１００.００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパノエート(化合物９９、２５.００ｇ、８３％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 431 [M+Na]+
工程６：化合物１００の合成
Ｄ－アラニン(１.０９ｇ、０.０１２mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(３.０９ｇ、０.０４mmol、３.００当量)の水(５０.００mL)溶液に、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパノエート(化合物９９、５.００ｇ、１２.２４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５０.００mL)溶液を添加した。得られた混合物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を２Ｎ ＨＣｌでｐＨ値２～３に調節した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(１００.００mL×３)で抽出し、合わせた有機層を塩水(１００.００mL×３)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、(２Ｒ)－２－[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]－アミノ]プロパンアミド]プロパン酸(化合物１００、４.００ｇ、７１％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 383 [M+H]+
工程７：化合物１０１の合成
グリシン(３.６８ｇ、４８.９７mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(１２.３４ｇ、１４６.８９mmol、３.００当量)の水(２００.００mL)溶液に、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパノエート(化合物９９、２０.００ｇ、４８.９７mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２００.００mL)溶液を添加した。反応物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を２Ｎ ＨＣｌでｐＨ値２～３に調節した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(５００.００mL×３)で抽出し、合わせた有機層を塩水(５００.００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド]酢酸(化合物１０１、１５.００ｇ、７１％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 369 [M+H]+
工程８：化合物１０２の合成
[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド]－酢酸(化合物１０１、５.００ｇ、１３.５７mmol、１.００当量)、Ｐｂ(ＯＡｃ)４(７.２２ｇ、１６.２８mmol、１.２０当量)およびピリジン(１.２９ｇ、１６.３１mmol、１.２０当量)のＴＨＦ(３００.００mL)／トルエン(１００.００mL)溶液を、Ｎ２下、８０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温に冷却後、反応物を濾過した。フィルターケーキをＴＨＦ(１００.００mL)で洗浄した。合わせた有機層を、減圧下、濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド]メチルアセテート(化合物１０２、２.５０ｇ、４５％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 405 [M+Na]+. 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.77 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.10 (s, 1H), 5.24 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.51 - 4.35 (m, 2H), 4.23-4.09 (m, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.39 (d, J = 6.8 Hz, 3H)
工程９：化合物１０３の合成
撹拌中の[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－プロパンアミド]メチルアセテート(化合物１０２、２.２５ｇ、５.８８mmol、１.００当量)および２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物９７、１.２８ｇ、５.８８mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１２０mL)溶液に、Ｎ２下、室温で、ＴＦＡ(０.２７mL、２.３７mmol、０.６２当量)を添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を減圧下濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：４)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０３、３.１０ｇ、９０％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 540 [M+H]+
工程１０：化合物１０４の合成
９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０３、３.１０ｇ、５.７４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１５５.００mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でピペリジン(３１.００mL)を添加した。得られた混合物を０℃で０.５時間、Ｎ２下に撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(６００.００ml)で希釈した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(２００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００.００ml)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、３.００ｇの粗製生成物。粗製生成物を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで再精製して、(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)プロペンアミド、１０４(１.５０ｇ、７８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 318 [M+H]+
工程１１：化合物１０５の合成
(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)－プロペンアミド(化合物１０４、１.５０ｇ、４.７２mmol、１.００当量)のＤＭＦ(７５.００mL)溶液に、ＮａＨＣＯ３(０.５９ｇ、７.０８mmol、１.５０当量)のＨ２Ｏ(１０.００mL)およびＢｏｃ２Ｏ(１.０３ｇ、４.７２mmol、１.００当量)溶液を室温で添加した。反応物を、室温で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(５００.００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００.００mL×３)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０５、(１.８２ｇ、８３)を赤色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 418 [M+H]+, 318 [M+H-100]+
工程１２：化合物１０６の合成
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０５、１.８２ｇ、４.３６mmol、１.００当量)、鉄粉(２.４３ｇ、０.０４mmol、１０.００当量)およびＮＨ４Ｃｌ(２.３３ｇ、０.０４mmol、１０.００当量)のＥｔＯＨ(１００.００mL)／Ｈ２Ｏ(５０.００mL)中のスラリーを、７０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を濾過した。濾液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(５０.００mL)に溶解し、濾過した。濾液を濃縮乾固し、残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]－カルバメート(化合物１０６、１.２０ｇ、６８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 388 [M+H]+
工程１３：化合物１０７
撹拌中の３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、３５２mg、１.２９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５.００mL)溶液に、０℃で、ＣＤＩ(２０９.００mg、１.２９mmol、１当量)およびＴＥＡ(２６０mg、２.５８mmol、２当量)を添加した。得られた混合物を、０℃で２時間撹拌した。次いでｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)－カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０６、５００.００mg、１.２９mmol、１.００当量)およびＤＭＡＰ(４７２mg、３.８７mmol、３.００当量)を添加した。得られた混合物を、６０℃で２４時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温に冷却後、反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバメート(化合物１０７、４５０.００mg,４８％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 687 [M+H]+
工程１４：化合物１０８
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]－メチル]カルバモイル)エチル]カルバメート(化合物１０７、４４０.００mg、０.６４mmol、１.００当量)のＤＣＭ(２２.００mL)溶液に、ＴＦＡ(２.２０mL)を室温で添加した。得られた混合物を、室温で０.５時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を減圧下濃縮乾固して、(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]－メチル]プロパンアミド；トリフルオロ酢酸(化合物１０８、４００.００mg、粗製)を赤色油状物として得た。残渣をさらに精製することなく次工程で使用した。LCMS (ES, m/z): 587 [M+H-TFA]+
工程１５：化合物１０９の合成
溶液 ｏｆ(２Ｒ)－２－[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]－アミノ]プロパンアミド]プロパン酸(２１８mg、０.５７mmol、１.００当量)、ＨＯＢＴ(７７mg、０.５７mmol、１.００当量)およびＨＡＴＵ(２１６mg、０.０１mmol、１.００当量)を、室温で空気中１時間撹拌し、次いで(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]プロパンアミド；トリフルオロ酢酸(化合物１０８、４００mg、０.５７mmol、１.００当量)およびＤＩＥＡ(６６３mg、５.１４mmol、９.００当量)を室温で添加した。反応物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、３０分間で０％～５０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｒ)－１－[[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバモイル]エチル]カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０９、４８０.００mg、７５％)を緑色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 951 [M+H]+
工程１６：化合物１１０
９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｒ)－１－[[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]－エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバモイル]エチル]カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１０９、１１０.００mg)のＤＭＦ(５.００mL)溶液に、０℃でピペリジン(１.００mL)を添加した。得られた混合物を、０℃で０.５時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、４０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４n)で精製して、(２Ｓ)－２－[(２Ｒ)－２－[(２Ｓ)－２－アミノプロパンアミド]プロパンアミド]－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]－フェニル]エチル)スルファニル]メチル]プロペンアミド(化合物１１０、８０.００mg、６０％)を赤色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 729 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.00 (br s, 1H), 8.53 br (s, 1H), 8.24 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.10 (br s, 1H), 7.69 - 7.62 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 7.00 (br s, 1H), 5.11-5.06 (m, 1H), 4.45 - 4.36 (m, 3H), 4.35 - 4.13 (m, 6H), 2.90-2.83 (m, 3H), 2.73-2.71 (m, 2H), 2.05-1.90 (m, 1H), 1.70-1.53 (m, 4H), 1.22-1.17 (m, 6H), 1.14 - 1.05 (m, 3H)
工程１７：化合物(Ｉｋ)の合成
(２Ｓ)－２－[(２Ｒ)－２－[(２Ｓ)－２－アミノプロパンアミド]プロパンアミド]－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]プロペンアミド(化合物１１０、６３.００mg、０.０９mmol、１.００当量)および２,５－ジオキソピロリジン－１－イル６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサノエート(２６mg、０.０９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１.５０mL、１９.３８mmol、２２４.３６当量)溶液に、空気中、室温でＤＩＥＡ(２２.３３mg、０.１７mmol、２.００当量)を添加した。反応物を、室温で１時間撹拌した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム：Kinetex EVO C18カラム、３０×１５０,５μm；移動相Ａ：xater(０.０５％ＴＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：７分間で２３Ｂ～４３Ｂ、２５４nm；ＲＴ１：６.５８)。集めたフラクションを凍結乾燥して、Ｎ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｒ)－１－[[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバモイル]エチル]カルバモイル]エチル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド(化合物(Ｉｋ)、１６.１０mg、２０％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 922,924 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.00 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.44-8.41 (m, 1H), 8.15 (d, J=7.2Hz, 1H), 8.03-8.00 (m, 2H), 7.7-7.65 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J =8.0Hz,1H), 7.22-7.14 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 6.83-6.81 (m, 1H), 5.13-5.08 (m, 1H), 4.48-4.40 (m, 3H), 4.29-4.17 (m, 6H), 2.96-2.85 (m, 3H), 2.75-2.70 (m, 2H), 2.67-2.57 (m, 1H), 2.40-2.33 (m, 1H), 2.09-1.98 (m, 3H), 1.52-1.45 (m, 5H), 1.26-1.16 (m, 12H)
スキーム１４：ネオデグラダーＰ１４－ＧＧＦＧリンカー複合体(化合物(Ｉｌ))の合成
工程１：化合物１１２の合成
撹拌中の(２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物１１１、５.００ｇ、２３.１９mmol、１.００当量)のＴＨＦ(５０mL)溶液に、ＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(５.５０mL、５７.９９mmol、２.５０当量)を、窒素雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、２時間、７０℃で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１)は反応の完了を示した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(２：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物１１２、４.８ｇ、９２％)を明黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.27 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.20 -3.09 (m, 4H)
工程２：化合物１１３の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物１１２、４.８０ｇ、２３.８１mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１００mL)溶液に、ＮＢＳ(６.３６ｇ、３５.７１mmol、１.５０当量)およびＰＰｈ３(９.３７ｇ、３５.７２mmol、１.５０当量)を、空気雰囲気下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を、空気雰囲気下、一夜、室温で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(４：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物１１３、３.９ｇ、５７％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ8.29 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 7.2 Hz, 2H)
工程３：化合物１１４の合成
１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物１１３、３.９０ｇ、１４.７５mmol、１.００当量)のＤＭＦ(３９mL)溶液に、チオ酢酸カリウム(１.６８ｇ、１４.７５mmol、１.００当量)を室温で添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ((ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、水(６００mL)で希釈した。得られた混合物を、ＥＡ(２００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(２００mL)、塩水(２００mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物１１４、３.７ｇ、８５％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.27 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.21 -3.02 (m, 4H), 2.37 (s, 3H)
工程４：化合物１１５の合成
撹拌中の１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物１１４、４.００ｇ、１５.４０mmol、１.００当量)のＭｅＯＨ(６００mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でＭｅＯＮａ(１４.３１mL、７７.００mmol、５.００当量、３０％)を１時間添加した。反応混合物を、０℃で１時間撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥＡ＝１０：１)は反応の完了を示した。ＡｃＯＨで反応をクエンチした。得られた混合物を減圧下濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(１００mL)で希釈し、濾過した。濾液を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物１１５、３ｇ、８０％)を黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.11 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.87 (dt, J = 8.0, 7.2 Hz, 2H), 1.46 (t, J = 8.0Hz, 1H)
工程５：化合物１１７の合成
撹拌中の(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－アセトアミド)酢酸(化合物１１６、１０ｇ、２８.２２mmol、１.００当量)およびＰｂ(ＯＡｃ)４(１５ｇ、３３.８６mmol、１.２０当量)のＴＨＦ(３００mL)およびトルエン(１００mL)中の混合物に、窒素雰囲気下、室温でピリジン(２.５９ｇ、３２.７４mmol、１.１６当量)を滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、一夜、８０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。混合物を室温に冷却した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキをＥＡ(２０mL)で洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。残渣をＥＡ(２０mL)に溶解した。得られた混合物を水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(１：４)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセトアミド)メチルアセテート(化合物１１７、６.５ｇ、５６％)を白色固体として得た。1H NMR (300MHz, CDCl3) δ7.80 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.45 (t, d=7.5Hz, 2H), 7.36 (d, d=7.5Hz, 2H), 7.18 (br s, 1H), 5.48 (br s, 1H), 5.28 (d, J=7.2Hz, 2H), 4.48 (d, J=6.6Hz, 2H), 4.26 (t, J=6.6Hz, 1H), 3.93 (d, 5.4Hz, 2H), 2.08 (s, 3H). LCMS (ESI, ms): 391 [M+Na]+
工程６：化合物１１８の合成
(２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]アセトアミド)メチルアセテート(化合物１１７、３.００ｇ、８.１４mmol、１.００当量)および２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物１１５、１.７７ｇ、８.１３mmol、１.００当量))のＤＣＭ(３００mL)溶液に、ＴＦＡ(０.５６ｇ、４.９１mmol、０.６０当量)を室温で添加した。得られた混合物を、６０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、減圧下、濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝２：３)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]－メチル]カルバメート(化合物１１８、３.７ｇ、６７％)を灰白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 526,528 [M+H]+
工程７：化合物１１９の合成
９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物１１８、３.７０ｇ、７.０３mmol、１.００当量)のＤＭＦ(４０mL)溶液に、０℃でピペリジン(８mL)を添加した。得られた混合物を、０℃で０.５時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を、水(４００mL)で希釈し、ＥＡ(２００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(２００mL)、塩水(２００mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下濃縮乾固した。残渣を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)アセトアミド(化合物１１９、１.０１ｇ、４０％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 304,306 [M+H]+
工程８：化合物１２０の合成
２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)－アセトアミド(化合物１１９、１.００ｇ、３.２９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５０mL)溶液に、室温でＮａＨＣＯ３(０.３３ｇ、３.９２mmol、１.２０当量)の水(１０mL)溶液、Ｂｏｃ２Ｏ(０.７２ｇ、３.３０mmol、１.００当量)を添加した。得られた混合物を、室温で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(５００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：３)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物１２０、８１０mg、５４％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 404,406 [M+H]+, 304,306 [M+H-100]+
工程９：化合物１２１の合成
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物１２０、８００.００mg、１.９８mmol、１.００当量)のＥｔＯＨ(４０)溶液に、室温で鉄粉(１１０６mg、１９.８１mmol、１０.００当量)およびＮＨ４Ｃｌ(１０５９mg、１９.８１mmol、１０.００当量)の水(１０mL)溶液を添加した。得られた混合物を、７０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を濾過した。濾液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(５０.００mL)に溶解し、濾過した。濾液を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)－カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物１２１、６１０mg、７４％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 374,376 [M+H]+, 374,376 [M+H-100]+
工程１０：化合物１２２の合成
３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、２１９mg、０.８０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１０mL)溶液に、ＣＤＩ(１３０mg、０.８０mmol、１.００当量)およびＴＥＡ(８１mg、０.８０mmol、１.００当量)を０℃で空気中添加した。得られた混合物を、室温で２時間撹拌した。次いでｔｅｒｔ－ブチルＮ－[[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)カルバモイル]メチル]カルバメート(化合物１２１、３００mg、０.８０mmol、１.００当量)およびＤＭＡＰ(２９４mg、２.４１mmol、３.００当量)を室温で空気中添加した。得られた混合物を、６０℃で４８時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.０５％ＴＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)メチル]カルバメート(化合物１２２、２７０mg、４９％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 673,675 [M+H]+, 573,575 [M+H-100]+
工程１１：化合物１２３の合成
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)メチル]－カルバメート(化合物１２２、２５０mg、０.３７mmol)の１,４－ジオキサン(１２mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でＨＣｌ(１,４－ジオキサン中４Ｎ、６mL)を添加した。反応物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を減圧下濃縮乾固して、２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]アセトアミド(化合物１２３、２６０mg、粗製)を褐色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 573,575 [M+H-HCl]+
工程１２：化合物１２５の合成
(２Ｓ)－２－[２－(２－アミノアセトアミド)アセトアミド]－３－フェニルプロパン酸(化合物１２４、５００mg、１.７９mmol、１.００当量)および２,５－ジオキソピロリジン－１－イル６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサノエート(５５２mg、１.７９mmol、１.００当量)のＤＭＳＯ(５.００mL)溶液を、室温で、空気中、１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２２０nm)で精製して、(２Ｓ)－２－(２－[２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]アセトアミド]アセトアミド)－３－フェニルプロパン酸(化合物１２５、７６０mg、８３％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 473 [M+H]+
工程１３：化合物(Ｉｌ)の合成
(２Ｓ)－２－(２－[２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]アセトアミド]－アセトアミド)－３－フェニルプロパン酸(化合物１２５、１７５mg、０.３７mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５.００mL)溶液に、ＨＡＴＵ(１４１mg、０.３７mmol、１.００当量)およびＨＯＢＴ(５０mg、０.３７mmol、１.００当量)を室温で空気中添加した。得られた混合物を、室温で１時間撹拌した。次いで２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]－カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]アセトアミド(化合物１２３、２５０mg、０.３７mmol、１.００当量、８５％)およびＤＩＥＡ(２４０mg、１.８５mmol、５.００当量)を添加した。得られた混合物を、室温で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を次の条件(カラム：XSelect CSH Prep C18 OBDカラム、１９×２５０mm,５μm；移動相Ａ：水(０.０５％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：７分間で３０Ｂ～６０Ｂ、２５４nm；ＲＴ１：６.６７分)により精製して、７５mgの粗製生成物を得た。粗製生成物を次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで再精製した：カラム：XBridge Shield RP18 OBDカラム、１９×２５０mm,１０μm；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：２５mL／分；勾配：１０分間で２５Ｂ～４４Ｂ；２５４nm；ＲＴ１：１０.５２分。集めたフラクションを凍結乾燥して、化合物(Ｉｌ)(４１.６mg、１０％)を白色固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ10.99 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.38 (t, J=6.0Hz, 1H), 8.31 (t, J=6.0Hz, 1H), 8.12 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.06 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.01 (t, J=6.0Hz, 1H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.25-7.21 (m, 5H), 7.19-7.14 (m, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.82 (t, J=6.0Hz,1H), 5.13-5.08 (m, 1H), 4.47-4.40 (m, 4H), 4.33-4.29 (m, 3H), 3.76-3.70 (m, 3H), 3.67-3.55 (m, 3H), 3.38-3.36 (m, 2H), 3.06-3.02 (m, 1H), 2.91-2.86 (m,3H), 2.82-2.70 (m, 3H), 2.62-2.57 (m, 1H), 2.50-2.45 (m, 1H), 2.10 (m, 2H), 2.05-1.95 (m ,1H), 1.50-1.44 (m,4H), 1.20-1.16 (m, 2H). LCMS (ES, m/z): 1027,1029 [M+H]+
スキーム１５：ネオデグラダーＰ１４－ＡＡＡリンカー複合体(化合物(Ｉｍ))の合成
工程１：化合物１２７の合成
撹拌中の(２－クロロ－４－ニトロフェニル)酢酸(化合物１２６、２４.００ｇ、１１１.３２mmol、１.００当量)のＴＨＦ(２４０.００mL)溶液に、窒素雰囲気下、ＢＨ３－Ｍｅ２Ｓ(２８.００mL、２９５.２３mmol、２.６５当量)を滴下した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、２時間、７０℃で撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１)は反応の完了を示した。室温に冷却後、得られた混合物を減圧下濃縮した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物１２７、１８.００ｇ、８０％)を明黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CD3Cl) δ8.27 (s, 1H), 8.10-8.07 (m, 1 H), 7.52 (d, J = 3 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 6 Hz, 2H)
工程２：化合物１２８の合成
撹拌中の２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタノール(化合物１２７、５.００ｇ、２４.８０mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１００.００mL)溶液に、ＮＢＳ(６.６２ｇ、１.５０当量)およびＰＰｈ３(９.７６ｇ、３７.２１mmol、１.５０当量)を、Ｎ２下、室温で少しずつ添加した。得られた混合物を一夜、室温でＮ２下撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＰＥ／ＥｔＯＡｃ(４：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物１２８、５.１０ｇ、７２.３１％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.79 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H)
工程３：化合物１２９の合成
１－(２－ブロモエチル)－２－クロロ－４－ニトロベンゼン(化合物１２８、５.００ｇ、１８.９０mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５０.００mL)溶液に、窒素雰囲気下、室温でチオ酢酸カリウム(２.１６ｇ、１８.９１mmol、１.００当量)を添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応物を、水(６００.００mL)で希釈した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(２００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(２００.００mL)、塩水(２００.００mL×３)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物１２９、４.５０ｇ、８５％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.20 - 3.05 (m, 4H), 2.34 (s, 3H)
工程４：化合物１３０の合成
撹拌中の１－[[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]エテノン(化合物１２９、２.００ｇ、７.７０mmol、１.００当量)のＭｅＯＨ(３００.００mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でＭｅＯＮａ(６.９３mL、３７.３３mmol、５.００当量、３０％)を添加した。得られた混合物を０℃でＮ２下、１時間撹拌した。ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)は反応の完了を示した。反応をＡｃＯＨでｐＨ値３～４にクエンチした。得られた混合物を減圧下濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(５０.００mL)で希釈し、濾過した。濾液を分取ＴＬＣ(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１)で精製して、２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物１３０、１.３５ｇ、７２％)を明黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 8.0, 6.8 Hz, 2H), 2.85 (dt, J = 8.0, 7.2 Hz, 2H), 1.43 (t, J= 8.0 Hz, 1H)
工程５：化合物１３２の合成
撹拌中の(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパン酸(化合物１３１、２０.００ｇ、６４.２４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２００.００mL)溶液に、空気雰囲気下、室温でＴＳＴＵ(２５.１８ｇ、８３.５２mmol、１.３０当量)およびＤＩＥＡ(１６.６０ｇ、１２８.４８mmol、２.００当量)を添加した。得られた混合物を、１時間、室温で撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(２００.００mL)で希釈し、得られた混合物を、ＥＴＯＡＣ(１００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を水(１００.００mL)、塩水(１００.００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパノエート(化合物１３２、２５.００ｇ、８３％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 431 [M+Na]+
工程６：化合物１３３の合成
グリシン(３.６８ｇ、４８.９７mmol、１.００当量)およびＮａＨＣＯ３(１２.３４ｇ、１４６.８９mmol、３.００当量)の水(２００.００mL)溶液に、２,５－ジオキソピロリジン－１－イル(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパノエート(化合物１３２、２０.００ｇ、４８.９７mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２００.００mL)溶液を添加した。反応物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を２Ｎ ＨＣｌでｐＨ値２～３に調節した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ(５００.００mL×３)で抽出し、合わせた有機層を塩水(５００.００mL)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド]酢酸(化合物１３３、１５.００ｇ、７１％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 369 [M+H]+
工程７：化合物１３４の合成
[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－プロパンアミド]酢酸(化合物１３３、５.００ｇ、１３.５７mmol、１.００当量)、Ｐｂ(ＯＡｃ)４(７.２２ｇ、１６.２８mmol、１.２０当量)およびピリジン(１.２９ｇ、１６.３１mmol、１.２０当量)のＴＨＦ(３００.００mL)／トルエン(１００.００mL)溶液を、Ｎ２下、８０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温に冷却後、反応物を濾過した。フィルターケーキをＴＨＦ(１００.００mL)で洗浄した。合わせた有機層を、減圧下、濃縮乾固した。残渣を(ＰＥ：ＥＴＯＡＣ＝１：２)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]プロパンアミド]メチルアセテート(化合物１３４、２.５０ｇ、４５％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 405 [M+Na]+. 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.77-7.73 (m, 2H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.10 (s, 1H), 5.24 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.51 - 4.35 (m, 2H), 4.22 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.39 (d, J = 6.8 Hz, 3H)
工程８：化合物１３５の合成
撹拌中の[(２Ｓ)－２－[[(９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ)カルボニル]アミノ]－プロパンアミド]メチルアセテート(化合物１３４、２.２５ｇ、５.８８mmol、１.００当量)および２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エタンチオール(化合物５００、１.２８ｇ、５.８８mmol、１.００当量)のＤＣＭ(１２０mL)溶液に、Ｎ２下、室温でＴＦＡ(０.２７mL、２.３７６mmol、０.６２当量)を添加した。得られた混合物を４０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を減圧下濃縮乾固して、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１３５、３.１０ｇ、９０％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 540,542 [M+H]+
工程９：化合物１３６の合成
９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１３５、３.１０ｇ、５.７４mmol、１.００当量)のＤＭＦ(１５５.００mL)溶液に、Ｎ２下、０℃でピペリジン(３１.００mLを添加した。得られた混合物を０℃で０.５時間、Ｎ２下に撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(６００.００ml)で希釈した。得られた混合物を、ＥＡ(２００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００.００ml)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、３.００ｇの粗製生成物を得た。粗製生成物を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより再精製して、(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)プロペンアミド(化合物１３６、１.５０ｇ、７８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 318,320 [M+H]+
工程１０：化合物１３７の合成
(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)プロペンアミド(化合物１３６、１.５０ｇ、４.７２mmol、１.００当量)のＤＭＦ(７５.００mL)溶液に、ＮａＨＣＯ３(０.５９ｇ、７.０８mmol、１.５０当量)のＨ２Ｏ(１０.００mL)およびＢｏｃ２Ｏ(１.０３ｇ、４.７２mmol、１.００当量)溶液を、室温で空気中添加した。反応物を、室温で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を、水(５００.００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(２００.００mL×３)で抽出した。合わせた有機層を塩水(２００.００mL×３)で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮乾固して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)－カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１３７、１.８２ｇ、８３％)を赤色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 418,420 [M+H]+, 318,320 [M+H-100]+
工程１１：化合物１３８の合成
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(２－クロロ－４－ニトロフェニル)エチル]－スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１３７、１.８２ｇ、４.３６mmol、１.００当量)、鉄粉(２.４３ｇ、０.０４mmol、１０.００当量)およびＮＨ４Ｃｌ(２.３３ｇ、０.０４mmol、１０.００当量)のＥｔＯＨ(１００.００mL)／Ｈ２Ｏ(５０.００mL)中のスラリーを、７０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を濾過した。濾液を、減圧下、濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ(５０.００mL)に溶解し、濾過した。濾液を(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１３：１)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]メチル)カルバモイル]エチル]カルバメート(化合物１３８、１.２０ｇ、６８％)を黄色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 388,390 [M+H]+, 288,290 [M+H-100]+
工程１２：化合物１３９の合成
撹拌中の３－[５－(アミノメチル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－２－イル]ピペリジン－２,６－ジオン(ＩＮＴ１、３５２mg、１.２９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(５.００mL)溶液に、０℃で、ＣＤＩ(２０９.００mg、１.２９mmol、１当量)およびＴＥＡ(２６０mg、２.５８mmol、２当量)を添加した。得られた混合物を、０℃で２時間撹拌した。次いでｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－[([[２－(４－アミノ－２－クロロフェニル)エチル]スルファニル]－メチル)カルバモイル]－エチル]カルバメート(化合物１３８、５００.００mg、１.２９mmol、１.００当量)およびＤＭＡＰ(４７２mg、３.８７mmol、３.００当量)を添加した。得られた混合物を、６０℃で２４時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。室温に冷却後、反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２５４nm)で精製して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバメート(化合物１３９、４５０.００mg、４８％)を黄色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 687, 689 [M+H]+, 587,589 [M+H-100]+
工程１３：化合物１４０の合成
撹拌中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]－メチル]カルバモイル)エチル]カルバメート(化合物１３９、４４０.００mg、０.６４mmol、１.００当量)のＤＣＭ(２２.００mL)溶液に、ＴＦＡ(２.２０mL)を室温で添加した。得られた混合物を、室温で０.５時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応物を減圧下濃縮乾固して、(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]プロパンアミド；トリフルオロ酢酸(化合物１４０、４００.００mg)を赤色油状物として得た。LCMS (ES, m/z): 578, 589 [M+H-TFA]+
工程１４：化合物１４２の合成
Ｌ－バリン(化合物１４１、０.５０ｇ、４.２７mmol、１.００当量)のＤＭＳＯ(１０mL)中のスラリーに２,５－ジオキソピロリジン－１－イル６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサノエート(１.３２ｇ、４.２８mmol、１.００当量)およびＤＩＥＡ(１１０３mg、８.５４mmol、２.００当量)。得られた混合物を、室温で４時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。反応混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィー(カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、ＡＣＮ水溶液(０.１％ＦＡ)、３０分間で０％～６０％勾配；検出器、ＵＶ ２２０nm)で精製して、(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタン酸(化合物１４２、１.２ｇ、７２％)を褐色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 311 [M+H]+
工程１５：化合物(Ｉｍ)の合成
(２Ｓ)－２－[６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド]－３－メチルブタン酸(化合物１４２、５９mg、０.１９mmol、１.００当量)、ＨＯＢＴ(２６mg、０.１９mmol、１.００当量)およびＨＡＴＵ(７２mg、０.１９mmol、１.００当量)のＤＭＦ(２mL)溶液を、室温で、空気中、１時間撹拌した。次いで(２Ｓ)－２－アミノ－Ｎ－[[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]フェニル]エチル)スルファニル]メチル]プロパンアミドトリフルオロ酢酸(化合物１４０、２００mg、０.１９mmol、１.００当量、６６.７０％)およびＤＩＥＡ(１９７mg、１.５２mmol、８.００当量)を室温で添加した。反応混合物を、室温で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応の完了を示した。得られた混合物を、次の条件を用いる逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した：カラム：YMC-Actus Triart C18、３０mm×１５０mm、５μm；移動相Ａ：水(０.１％ＦＡ)、移動相Ｂ：ＡＣＮ；流速：６０mL／分；勾配：１０分間で２８Ｂ～４５Ｂ、２５４nm；ＲＴ１：９.６７分。集めたフラクションを凍結乾燥して、Ｎ－[(１Ｓ)－１－[[(１Ｓ)－１－([[(２－[２－クロロ－４－[([[２－(２,６－ジオキソピペリジン－３－イル)－１－オキソ－３Ｈ－イソインドール－５－イル]メチル]カルバモイル)アミノ]－フェニル]エチル)スルファニル]メチル]カルバモイル)エチル]カルバモイル]－２－メチルプロピル]－６－(２,５－ジオキソピロール－１－イル)ヘキサンアミド(化合物(Ｉｍ)、２７.８mg、１６％)を白色固体として得た。LCMS (ES, m/z): 879,881 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.99 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.47 (t, J=6.0Hz, 1H), 8.03 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.78 (d, J=8.8Hz,1H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.21-7.14 (m, 2 H), 6.99 (s, 2H), 6.82 (t, J=6.0Hz, 1H), 5.13-5.10 (m,1 H), 4.47-4.40 (m, 3H), 4.33-4.29 (m, 3H), 4.24 (t, J=7.2 Hz, 1H), 4.14 (t, J=6.8Hz, 1H), 3.38-3.36 (m, 1H), 2.97-2.90 (m, 1H), 2.86 (t, J=7.6Hz, 2H), 2.73-2.67 (m, 2H), 2.62-2.57 (m, 1H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.20-2.05 (m, 2H), 2.02-1.96 (m, 1H), 1.95-1.88 (m, 1H), 1.48-1.46 (m, 4H), 1.23-1.16 (m, 6H), 0.83-0.78 (m, 6H)
実施例４：ネオデグラダーコンジュゲートの製造および特徴づけ
抗体溶液を３０当量のトリス－(２－カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)で処理し、３７℃で１時間インキュベートして、鎖間ジスルフィドを還元させた。還元抗体を、illustra NAPカラム(GE Healthcare)を使用して、５０mM ＥＰＰＳ、５mM ＥＤＴＡ ｐＨ７.０緩衝液に精製した。
コンジュゲーションを、配列番号９を有する重鎖および配列番号１０を有する軽鎖を含む還元抗ＣＤ３３抗体(「ＣＤ３３ＡＢ」)を、５０mM ＥＰＰＳ、５mM ＥＤＴＡ ｐＨ７.０中、２～５mg／mLで、Ｎ,Ｎ－ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)中の原液としてＤＭＡの最終濃度が１５％(ｖ／ｖ)であるように添加した１２当量のリンカー－ネオデグラダーで処理することにより実施した。得られた反応混合物を一夜、４℃で静置した。得られたネオデグラダーコンジュゲートを、illustra NAPカラム(GE Healthcare)を使用して２０mM コハク酸、８％スクロース、０.０１％Ｔｗｅｅｎ－２０ ｐＨ５.５に精製し、Amicon Ultra遠心濃縮機を５０kD分子量カットオフ(Millipore)で使用して、濃縮した。
濃度およびモノマーを、５μm粒子を用いる７.８×３００mM TSKGel 3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience)を使用して、０.５mg／mLで３０分間流す、４００mM 過塩素酸ナトリウム、５０mM リン酸ナトリウム、５％(ｖ／ｖ)イソプロパノール移動相で定組成的に溶出する、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した。ネオデグラダーコンジュゲートを、２１４nmで検出する、抗体標準曲線から定量した。
薬物対抗体比(ＤＡＲ)を、２.５μm粒子を用いる４.６×３５mm TSKgel Butyl-NPRカラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより決定した。移動相Ａは１.５Ｍ硫酸アンモニウム、２５mM リン酸ナトリウムｐＨ７.０であった。移動相Ｂは２５mM リン酸ナトリウムｐＨ７.０、２５％(ｖ／ｖ)イソプロパノールであった。検体を、流速０.６mL／分で、１２分間の０～１００％Ｂの直線勾配で溶出した。検出は２１４nmであった。
遊離リンカー－ペイロードを、２.５μm粒子を用いる４.６×２５０mm HISEPカラム(Supelco)を使用して、混合モードクロマトグラフィーにより決定した。移動相Ａは１００mM 酢酸アンモニウムであった。移動相Ｂは１００％アセトニトリルであった。検体を、流速０.７mL／分で、２５分間２５～４０％Ｂ、次いで２分間で４０～１００％Ｂの勾配で溶出した。カラム温度は３５℃であった。遊離リンカー－ペイロードを、２５４nmで検出する、外的標準曲線を使用して定量した。
スキーム１６：抗ＣＤ３３抗体－化合物(Ｉｅ)コンジュゲートの製造
スキーム１７：抗ＣＤ３３抗体－化合物(Ｉｈ)コンジュゲートの製造
他のコンジュゲートを、適切な抗体を使用して、類似する様式で製造できる。
実施例５：抗ＣＤ３３抗体－ネオデグラダーコンジュゲートでの急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の処置
抗ＣＤ３３抗体(ＣＤ３３ＡＢ)－ネオデグラダー化合物を、無胸腺ヌードマウス(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu、Charles River)で試験した。１×１０７ＭＶ４１１ヒト急性単球性白血病細胞(ATCC(登録商標) CRL-5991TM)の５０％マトリゲル溶液を、マウスの側腹部に皮下注射した(０.１mL／マウス)。腫瘍が１００～１５０mm３の平均サイズに達したら、マウスに抗ＣＤ３３抗体－ネオデグラダーコンジュゲート、非ターゲティングネオデグラダーコンジュゲートおよび媒体対照を投与した。
ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)、ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉｅ)およびＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉｈ)の原液を媒体で希釈して、０.３、０.２８３および０.２９９mg／mL投与溶液を得て、これは３、２.８３および２.９９mg／kgで、各動物体重により調節して、１０mL／kg(０.２mL／２０ｇマウス)の投与体積となった。この投与戦略により、各試験群で同じ量のペイロードの送達を確実とした。マイロターグを０.９％塩化ナトリウム溶液で０.０１mg／mLに希釈し、これにより、３mg／kgで、１０mL／kg(０.２mL／２０ｇマウス)の投与体積となった。ベネトクラクスを、超音波処理により６０％ＰＧ、３０％ＰＥＧ４００、１０％エタノールからなる溶媒中で製剤化して、５mg／mL投与懸濁液を得て、これにより、１０mL／kgの体積で投与時、５０mg／kgが送達された。ＣＣ－９０００９を遠心分離して、底の粉末を回収し；次いでＮ－メチル－２－ピロリジノン(ＮＭＰ)、ＰＥＧ４００および食塩水を添加し、１個ずつよく混合して、５％ＮＭＰ、４５％ＰＥＧ４００および５０％食塩水中０.５mg／mL投与溶液を得て、これにより、１０mL／kgの体積で投与時、５mg／kgが送達された。
マウスを次のとおり７処置群(Ｎ＝９／群)に分けた：１)媒体；２)ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)(３mg／kg、ｉｖ、ｑｄ×１)；３)ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉｅ)(２.８３mg／kg、ｉｖ、ｑｄ×１)；４)ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉｈ)(２.９９mg／kg、ｉｖ、ｑｄ×１)；５)マイロターグ(０.１mg／kg、ｉｖ、ｑｄ×１)；６)ベネトクラクス(５０mg／kg、ｐｏ、ｑｄ×２１)；７)ＣＣ－９０００９(５mg／kg、ｉｐ、ｂｉｄ×１０)。群１～５の試験品を、体重(０.２００mL／２０ｇマウス)で調節した体積の単回投与(ｑｄ×１)で静脈内(ｉ.ｖ.)投与した。各動物のＢＷに対して調製した１０mL／kg(０.２mL／２０ｇマウス)投与体積で、ベネトクラクスを経口(ｐｏ)投与し、一方ＣＣ－９０００９を腹腔内(ｉｐ)投与した。
腫瘍を週２回カリパスを使用して測定し、各動物を、腫瘍がエンドポイント体積(２,０００mm３)に達するかまたは試験最終日(４５日目)の何れか早い方で、屠殺した。ＭＴＶ(ｎ)は、腫瘍がエンドポイント体積に減少していない、残存動物数(ｎ)における試験最終日の中央腫瘍体積として定義した。
図１に示すとおり、全ネオデグラダーコンジュゲートは、媒体と比較して、経時的にゆっくりした腫瘍増殖をもたらした。
実施例６：ヒト白血病モデルに対するＡＢ１－化合物(Ｉａ)コンジュゲートの活性
インビトロ細胞毒性を、一団のＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病細胞株および一団の非ＡＭＬ ＣＤ３３陰性細胞を使用して測定した。細胞を予定した濃度で９６ウェルプレートに播種し、一夜、３７℃／５ＣＯ２でインキュベーション後、各試験品(ＴＡ)の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を試験品と７２時間インキュベートし、生存能をCellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で検出した。発光値を各細胞株で正規化し、ＩＣ５０をPrizmソフトウェアを使用して計算した。
結果は、化合物ＩａにコンジュゲートしたｈｕＭｙ９－６由来抗体、ＡＢ１(「ＡＢ－－化合物(Ｉａ)」)は、ＣＤ３３陽性ＡＭＬ細胞でＣＣ－８８５(既知ＧＳＰＴ１デグラダー)またはマイロターグと同等な全体的インビトロ有効性を示すことを示した － 数例では有効性が優れた(図２参照)。さらに、ＧＳＰＴ１デグラダーペイロードの標的化ＣＤ３３介在送達の仮説に一致して、ＡＢ１－化合物(Ｉａ)はＣＤ３３陰性細胞モデルで不活性であった。
実施例７：抗体－ネオデグラダーコンジュゲートでの急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の処置
皮下腫瘍モデルＭＶ４－１１ヒト急性骨髄球性白血病細胞(０.１mL中１×１０６細胞)を、雌無胸腺ヌードマウスの右腹側部に皮下接種した。マウスを腫瘍サイズが１５０mm３に達した時に開始する、側部尾静脈への静脈内注射、腹腔内注射、強制経口投与またはそれらの組み合わせの何れかにより試験品で処置した。腫瘍サイズおよびマウス体重を週２回測定した。
インビトロでの観察に一致して、ネオデグラダーＰ１を遊離する数種のＡＢ１ベースのコンジュゲートでのＣＤ３３陽性ＡＭＬモデル腫瘍(ＭＶ４－１１)のインビボ処置は腫瘍退縮をもたらし、ベータ－グルクロニド放出トリガーおよび天然システインコンジュゲーションを含むコンジュゲートで最もロバストな効果がみられた(図３参照)。
実施例８：ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)およびゲムツズマブ－化合物(Ｉａ)コンジュゲートの安定性
抗ＣＤ３３－化合物(Ｉａ)コンジュゲート(約８ＤＡＲ)の安定性アッセイを、ゲムツズマブ、ＩｇＧ１、ＣＤ３３ＡＢおよびＩｇＧ１ Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ「ＬＡＬＡ」Ａｂ形式を使用して、２０mM コハク酸、８％スクロース、０.０１％Ｔｗｅｅｎ－２０ ｐＨ５.５中２.５mg／mLで４０日間にわたり実施し、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)でアッセイした。４℃で、濃度またはモノマーの顕著な変化は何れのコンジュゲートでも観察されなかった(図４)。対照的に、３７℃で、天然ゲムツズマブ－化合物(Ｉａ)ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ１ ＬＡＬＡ主鎖を使用する化合物(Ｉａ)コンジュゲートは、３９日間に顕著な凝集を示した(２０～３９日で１５～２８％に上昇)。しかしながら、ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)(ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ主鎖を使用)は、３７℃で３９日にわたり、８８％を超えてモノマー状態を維持した(図４)。数日間にわたるＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)におけるような高モノマーの維持は、一般に血液循環中の凝集が迅速なクリアランスおよび毒性増加に至り得て、治療指数を狭めるため、ＡＤＣの望ましい性質である。さらに、天然ＳＥＣ－ＭＳ分析により、天然ゲムツズマブ－化合物(Ｉａ)は同じモル当量のペイロード－リンカーで製造したＣＤ３３ＡＢ由来コンジュゲートより遥かに高い非コンジュゲート抗体を示した。一般に、ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)におけるような、ＡＤＣにおける低レベルの非コンジュゲート抗体は、所望の品質特性である。また、ＣＤ３３ＡＢより多くのＴＣＥＰがゲムツズマブの還元に必要であった(４.５対２.５モル当量)。ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ)におけるような、ＡＤＣ製造のために使用する還元剤が少ないことは、商品原価を下げ、精製法を単純化するために望ましい。
実施例９：ヒト白血病モデルに対する抗ＣＤ３３ネオデグラダーコンジュゲートの活性
皮下腫瘍モデルＭＶ４－１１ヒト急性骨髄球性白血病細胞(０.１mL中１×１０６細胞)を、雌無胸腺ヌードマウスの右腹側部に皮下接種した。マウスを、腫瘍サイズが１５０mm３に達した時開始する、側部尾静脈への静脈内注射、腹腔内注射、強制経口投与またはそれらの組み合わせの何れかにより、試験品で処置した。腫瘍サイズおよびマウス体重を週２回測定した。
インビトロでの観察に一致して、ネオデグラダーＰ１を遊離する種々のＣＤ３３ベースのコンジュゲートでのＣＤ３３陽性ＡＭＬモデル腫瘍(ＭＶ４－１１)のインビボ処置は腫瘍退縮をもたらし、最も安定なコンジュゲート(ＣＤ３３ＡＢ－化合物(Ｉａ))がロバストな抗腫瘍有効性を示した(図５)。
実施例１０：マイロターグ非感受性細胞株に対する抗ＣＤ３３ネオデグラダーコンジュゲートの活性
試験品(ＴＡ)の細胞毒性を、マイロターグ非感受性(ＡＭＬ－１９３およびＫａｓｕｍｉ－６)であることが知られる一団のＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病細胞株を使用して測定した。細胞を予定した濃度で９６ウェルプレートに播種し、一夜、３７℃／５ＣＯ２でインキュベーション後、各試験品(ＴＡ)の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を試験品と７２時間インキュベートし、生存能をCellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で検出した。発光値を各細胞株で正規化し、ＩＣ５０をPrizmソフトウェアを使用して計算した。
図６Ａおよび６Ｂに示すとおり、抗ＣＤ３３ネオデグラダーコンジュゲートは、両細胞株に対して良好な活性を有した。
概要および要約セクションではなく、詳細な記載のセクションが、特許請求の範囲の解釈に使用されることが意図されることは認識される。概要および要約セクションは、発明者らにより意図される本発明の１以上の、しかし全てではない例示的態様を示し得て、故に、いかなる方法でも本発明および添付する特許請求の範囲を限定することは意図されない。
本発明は、上に、特定の機能およびその相関の実行を説明する機能的構成要素の助けを借りて記載している。これらの機能的構成要素の境界は、記載の便宜上ここに任意に定義されている。特定の機能およびその関係が適切に実施される限り、他の境界を定義し得る。
具体的態様の上の記載は、本発明の一般的概念から逸脱することなく過度の実験なしに、当分野における技術の範囲内の知識の適用により、他者が容易にこのような具体的態様の種々の適用への修飾および／または適応ができるように、本発明の一般的性を完全に明する。故に、このような適応および修飾は、ここに示す教示および指針に基づき、開示する態様の等価物の意味および範囲内であることが意図される。ここでの表現または用語は、本明細書の用語または表現が教示および指針に照らして当業者に解釈されるべきであるように、限定ではなく、説明を目的とすることは理解されるべきである。
本発明の幅および範囲は上記例示的態様の何れによっても限定されず、次の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されるべきである。

Claims (61)

  1. 式(Ｉ)：
    〔式中、
    ａは１～１０の整数であり；
    ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
    ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
    Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
    Ｘは－ＮＲ２－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
    ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮ(Ｒ２)ｖであり；
    ｖは１または２であり；
    各Ｒ２は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
    ｎは１～６の整数であり；そして
    ｍは２～６の整数であり；
    ここで、各基の左側はＬに結合し、右側はＡに結合し；
    但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
    Ｌは開裂可能リンカーまたは開裂不可能リンカーであり；そして
    Ｂｍは配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)相補性決定領域(ＣＤＲ)１(ＶＨ－ＣＤＲ１)、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)ＣＤＲ１(ＶＬ－ＣＤＲ１)、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
    のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  2. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１のコンジュゲート。
  3. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が定常領域を含み、該定常領域がゲムツズマブと少なくとも１個のアミノ酸が異なる、請求項１または２のコンジュゲート。
  4. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分がＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である、請求項１～３の何れかのコンジュゲート。
  5. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が定常領域に対応するアミノ酸２９７にアラニンを含む、請求項１～４の何れかのコンジュゲート。
  6. 抗ＣＤ３３抗体が配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖を含む、請求項１～５の何れかのコンジュゲート。
  7. ａが２～８の整数である、請求項１～６の何れかのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  8. Ｌが開裂不可能リンカー、請求項１～７の何れかのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  9. Ｌが
    〔式中、
    ｐが１～１０の整数であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    からなる群から選択される、請求項８のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  10. Ｌが
    である、請求項９のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  11. ｐが５である、請求項９または１０のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  12. Ｌが開裂可能リンカーである、請求項１～７の何れかのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  13. 開裂可能リンカーがプロテアーゼにより開裂可能である、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  14. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４が各々独立して存在しないかまたはＬまたはＤ配置の天然に存在するアミノ酸残基であり、但しＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個がアミノ酸残基であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    からなる群から選択される、請求項１２または１３のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  15. Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４が独立して存在しないかまたはＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシンおよびグリシンからなる群から選択され；但し、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４の少なくとも２個がアミノ酸残基であり、請求項１４のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  16. Ｚ１が存在しないかまたはグリシンであり；
    Ｚ２が存在しないかまたはＬ－グルタミン、Ｄ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニンおよびグリシンからなる群から選択され；
    Ｚ３がＬ－バリン、Ｄ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択され；そして
    Ｚ４がＬ－アラニン、Ｄ－アラニン、Ｌ－シトルリン、Ｄ－シトルリン、Ｌ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン、Ｌ－リシン、Ｄ－リシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される、
    請求項１５のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  17. Ｌが
    である、請求項１４のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  18. ｑが５である、請求項１７のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  19. Ｌが生体内還元性リンカーである、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  20. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’が各々独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル、(Ｃ１－Ｃ６)２ＮＣ１－Ｃ６アルキルおよびＣ１－Ｃ６アルキルから選択されるかまたは２個のジェミナルＲ基がそれらが結合している炭素原子と一体となってシクロブチルまたはシクロプロピル環を形成でき；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    からなる群から選択される、請求項１２または１９のコンジュゲート。
  21. Ｌが酸開裂可能リンカーである、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  22. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    からなる群から選択される、請求項１２または２１のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  23. Ｌがクリック放出リンカーである、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  24. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    から選択される、請求項１２または２３のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  25. Ｌがピロホスファターゼ開裂可能リンカーである、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  26. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    である、請求項２５のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  27. Ｌがベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカーである、請求項１２のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  28. Ｌが
    〔式中、
    ｑが２～１０の整数であり；
    ----が存在しないかまたは結合であり；
    がＸへの結合点であり；そして
    が抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分への結合点である。〕
    から選択される、請求項１２または２７のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  29. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１がハロであり；そして
    Ｘが－Ｎ(Ｒ２)ｖ(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
    ｖが１であり；
    ｍおよびｎが２であり；そして
    Ｒ２がメチルである、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  30. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１がハロであり；そして
    Ｘが－Ｎ(Ｒ２)ｖ(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
    ｖが２であり；
    ｍおよびｎが２であり；そして
    各Ｒ２がメチルである、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  31. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１がハロであり；そして
    Ｘが－Ｏ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
    ｎが２である、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  32. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１がハロであり；そして
    Ｘが－Ｓ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
    ｎが２である、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  33. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１が水素であり；そして
    Ｘが－ＮＲ２－であり；ここで
    Ｒ２がメチルである、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  34. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１がハロであり；そして
    Ｘが－ＮＲ２－であり；ここで
    Ｒ２が水素である、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  35. Ａがフェニルであり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１が水素であり；そして
    Ｘが－Ｃ(ＣＨ３)＝である、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  36. ＡＡがＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
    ＵがＮＨであり；
    Ｒ１が水素であり；そして
    Ｘが－Ｎ(Ｒ２)(ＣＨ２)ｍＯ(ＣＨ２)ｎ－であり；ここで
    ｎが１であり；
    ｍが２であり；そして
    Ｒ２がメチルである、
    請求項１～２８の何れかのコンジュゲート。
  37. 式(Ｖ)：
    〔式中、Ｂｍは配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
    のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  38. 式(VI)：
    〔式中、Ｂｍは配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
    のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  39. 式(VII)：
    〔式中、Ｂｍは配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。〕
    のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  40. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が(ｉ)配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬまたは(ii)配列番号９に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３７－３９のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  41. 請求項１～４０の何れかの何れかのコンジュゲートまたは化合物またはその薬学的に許容される塩および１以上の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  42. 処置を必要とする対象における癌を処置する方法であって、該対象に薬学的に許容される量の請求項１～４１の何れかのコンジュゲートまたは組成物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
  43. 癌が血液学的／血液癌である、請求項４２の方法。
  44. 癌が多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン疾患または慢性骨髄増殖性疾患である、請求項４２の方法。
  45. 癌が急性骨髄性白血病またはリンパ腫である、請求項４２の方法。
  46. 癌が急性骨髄性白血病である、請求項４２の方法。
  47. 癌がマイロターグに抵抗性または難治性である、請求項４２～４６の何れかの方法。
  48. 処置を必要とする対象における骨髄異形成症候群を処置する方法であって、該対象に薬学的に許容される量の請求項１～４１の何れかのコンジュゲートまたは組成物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
  49. 該対象に、請求項１～４０の何れかのコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を投与する前、後または同時に薬学的に許容される量のさらなる薬剤を投与することをさらに含む、請求項４２～４８の何れかの方法。
  50. さらなる薬剤が細胞毒性剤または免疫応答修飾剤である、請求項４９の方法。
  51. 免疫応答修飾剤がチェックポイント阻害剤である、請求項５０の方法。
  52. チェックポイント阻害剤がＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤および／またはＬＡＧ－３阻害剤を含む、請求項５１の方法。
  53. 請求項１のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を製造する方法であって、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分と式(Ｉ－１)：
    〔式中、
    ａは１～１０の整数であり；
    ＡはフェニルまたはＣ４－Ｃ１０シクロアルキル環であり；
    Ｒ１は独立して水素およびハロから選択され；
    ＵはＮＨおよびＣＦ２から選択され；
    Ｘは－Ｎ(Ｒ２)ｖ－、＝Ｃ(ＣＨ３)－、－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－および－Ｑ(ＣＨ２)ｍＱ’(ＣＨ２)ｎ－から選択され；ここで
    ｖは１または２であり；
    ＱおよびＱ’は各々独立してＯ、ＳまたはＮＲ２であり；
    各Ｒ２は独立して水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
    ｎは１～６の整数であり；そして
    ｍは２～６の整数であり；
    ここで、各基の左側はＬ’に結合し、右側はＡに結合し；
    但し、ＸがＮＨまたは－Ｑ－(ＣＨ２)ｎ－であるとき、Ｒ１はハロであり；
    Ｌ’は抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分にコンジュゲートする開裂可能または開裂不可能リンカー前駆体であり、ここで、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分は配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。〕
    の化合物またはその薬学的に許容される塩を反応させることを含む、方法。
  54. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項５３の方法。
  55. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が定常領域を含み、該定常領域は、ゲムツズマブと少なくとも１個のアミノ酸が異なる、請求項５３または５４の方法。
  56. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分がＩｇＧ１抗体またはその抗原結合部分である、請求項５３～５５の何れかの方法。
  57. 抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分が定常領域に対応するアミノ酸２９７にアラニンを含む、請求項５３～５６の何れかの方法。
  58. 抗ＣＤ３３抗体が配列番号９に示す重鎖および配列番号１０に示す軽鎖を含む、請求項５３または５７の方法。
  59. 式(Ｉ－１)の化合物と反応させる前に抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分を還元することをさらに含む、請求項５３～５８の何れかの方法。
  60. ａが２～８の整数である、請求項５３～５９の何れかの方法。
  61. Ｌ’が開裂不可能リンカー前駆体、開裂可能リンカー前駆体、生体内還元性リンカー前駆体、酸開裂可能リンカー前駆体、クリック放出リンカー前駆体、ピロホスファターゼ開裂可能リンカー前駆体、ベータ－グルクロニダーゼ開裂可能リンカー前駆体またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５３～６０の何れかの方法。
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