JP2024521869A

JP2024521869A - 前立腺癌診断用バイオマーカー及びその使用

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Publication number: JP2024521869A
Application number: JP2023573568A
Authority: JP
Inventors: クワンヨンチェ; ジョンミンキム; テヤンホ
Original assignee: シスバイオジェンカンパニーリミテッド
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2024-06-04
Also published as: KR20230106542A; WO2022250517A1; KR102550113B1; EP4365310A1; KR20220161039A

Abstract

本発明は、前立腺癌診断のためのバイオマーカー及びその使用に関し、より具体的には、特定のｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡ、又はその断片の発現レベルを測定することができる製剤を含む前立腺癌診断用組成物；前記バイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含む前立腺癌診断のための情報を提供する方法；及び前記前立腺癌診断用組成物を含む前立腺癌診断用キットに関する。本発明は、正常組織対比前立腺癌で異常発現する新しいｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの組み合わせを初めて明らかにしたことにより、これをバイオマーカーとして使用することによって、外科的処置なしに非侵襲的な方法で前立腺癌を素早くかつ迅速に診断することができる。特に、本発明の前立腺癌診断用ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡは、対象体の尿から他の遺伝子に比べて比較的に発現量が多く、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じて安定的に分析が可能な利点を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、前立腺癌診断のためのバイオマーカー及びその使用に関し、より具体的には、特定のｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、融合遺伝子（融合遺伝子）のｍＲＮＡ、及び／又はその断片の発現レベルを測定することができる製剤を含む前立腺癌診断用組成物；前記バイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含む前立腺癌診断のための情報を提供する方法；及び前記前立腺癌診断用組成物を含む前立腺癌診断用キットに関するものである。

前立腺は、膀胱のすぐ下、直腸の前方にある栗ほどの大きさの男性生殖器官で、精液の一部を作り出し、保存する役割を果たしている。上は膀胱頸部、つまり膀胱から尿道に移行する部位と隣接して前方の恥骨前立腺靭帯に固定されており、下は泌尿生殖隔膜によって固定されている。前立腺に発生する癌のほとんどは、前立腺細胞から発生する腺癌（腺細胞の癌）である。腫瘍組織の分化度と細胞の特性などによってタイプを区分することができる。

前立腺癌（ＰＣａ）は、世界で最も一般的な泌尿器系腫瘍の１つであり、米国では２０１６年にのみ約１８０，８９０人が前立腺癌と新たに診断され、米国内の全新規腫瘍診断の１０．７％を占め、乳癌と肺癌に続いて３番目に頻繁に発症になる腫瘍である。２００９年から２０１３年までの統計に照らして、全世界１００，０００人の男性のうち１２９．４人が前立腺癌を持っており、前立腺癌の死亡率は２０１６年統計で２６，１２０人に達する。また、前立腺癌は、５０歳以前は一般的な疾患ではないが、５０歳を越えると急激に増加する傾向がある。近年、平均寿命の延長により、国内でも高齢男性の数が急増し、前立腺癌を早期に診断し、転移が発生するなど悪化しないように持続的な管理が必要である。特にヒト前立腺癌は骨に移転する傾向を有するようであり、アンドロゲン依存性状態からアンドロゲン耐性状態に必然的に進行して患者の死亡率を増加させると知られている。さらに、前立腺癌治療を受ける男性の約２５％は病気が再発して追加の治療を必要とする疾患であり現在米国で男性の癌死亡原因のうち第２の原因を占めており（非特許文献１）、これに対する早期診断及び治療が必要な実情である。

前立腺癌診断のための従来技術としては、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）測定及びバイオプシー（biopsy）がある。ＰＳＡ測定は、前立腺癌診断で最もよく使われる方法で、前立腺細胞で作られる特異抗原数値を測定して前立腺癌のリスクを決定する方法である。悪性前立腺癌であるほどＰＳＡ数値は高く、前立腺癌がないほとんどの男性は４ｎｇ／ｍＬ未満の数値を有している。しかし、測定したＰＳＡ数値が前立腺癌の不在にもかかわらず、非常に高いか、あるいはＰＳＡグレーゾーン（ＰＳＡ４ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下）区間に入る場合、バイオプシーが要になる。バイオプシーは、癌が疑われる臓器部分の組織を針で採取し、病理組織学的検査を通じて患者の該当臓器に癌、肉腫などの悪性腫瘍の有無を診断する方法である。このようなバイオプシー検査は、患者の苦痛が大きく、特にＰＳＡグレーゾーンでの前立腺癌診断の正確率は３０％未満である。つまり、約７０％の患者がＰＳＡ測定の限界のために費用がかかり、痛みを伴うリバイオプシーを経験するという欠点がある。

従って、このような不要なリバイオプシーとＰＳＡ測定の限界を克服し置換するために、より高い精度を有する前立腺癌特異的診査法の開発が必要ある。
このような背景下で、本発明は、検査時の苦痛を回避し、費用の負担を軽減するために前立腺癌と診断された患者の尿検体及び非腫瘍対照群尿検体に基づいて、前立腺癌特異的バイオマーカーとして、特定のｍｉＲＮＡの組み合わせとｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又はｍＲＮＡ（特に、融合遺伝子のｍＲＮＡ）の組み合わせを明らかにしており、これらのｍｉＲＮＡの組み合わせ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカーの組み合わせが前立腺癌の診断に有用であることを確認することによって本発明を完成した。

Jemal A et al., CA Cancer J Clin 2010;60:277-300

そこで、本発明の目的は、前立腺癌を効果的に診断することができる組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、バイオマーカーを用いて前立腺癌を効果的に診断するための情報提供方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前記組成物を含む前立腺癌診断用キットを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、前記組成物又はそれを含む前立腺癌診断用キットを用いて前立腺癌を診断する方法を提供することである。

前記のような本発明の目的を達成するために、
本発明は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することができる製剤を含む前立腺癌診断用組成物を提供する。

前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。好ましくは、前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐを含むことができる。

前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐを含み、ここに、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むことができる。

一実施様態において、前記組成物は、ｌｎｃＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡからなる群から選択された少なくとも１つをさらに含むことができ、前記ｌｎｃＲＮＡが、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであってもよく、前記融合遺伝子のｍＲＮＡがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであってもよい。

一実施様態において、前記組成物は、以下の組み合わせの発現レベルを測定することができる製剤を含む前立腺癌診断用組成物であり、組み合わせは、（ａ）ｌｎｃＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、（ｂ）融合遺伝子のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、又は（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡであり、前記ｌｎｃＲＮＡがＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧである、前立腺癌診断用組成物であってもよい。

一実施態様において、前記組成物は、前記ｍｉＲＮＡにそれぞれ特異的に結合するプライマー、プローブ及び／又は抗体を含むことができる。
一実施態様において、前記製剤は、前記ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡにそれぞれ特異的に結合するプライマー、プローブ及び／又は抗体を含むことができる。

また、本発明は、対象体から分離された生物学的試料において前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを測定する工程；及び前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを正常対照群の試料のｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルと比較する工程；を含む、前立腺癌診断のための情報を提供する方法を提供する。

一実施態様において、前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（競合ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）、ｄｄＰＣＲ（droplet digital PCR）、シークエンシング（sequencing）、ＲＮａｓｅ保護分析法（RNase protection method）、ノーザンブロット法（Northern blotting）及び／又は遺伝子チップ分析法によって測定することができる。

一実施態様において、前記発現レベルを測定する工程は、対象体から分離された生物学的試料から前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせを抽出する工程；抽出されたｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせからｃＤＮＡを合成する工程；合成したｃＤＮＡに特異的なプライマー対を用いてｃＤＮＡを増幅する工程；及び増幅されたｃＤＮＡを検出する工程；を含むことができる。

一実施態様において、前記生物学的試料は、組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿及び／又は血清であってもよい。好ましくは、前記生物学的試料は尿であってもよい。

一実施態様において、前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを比較する工程は、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト及び多層パーセプトロンからなる群から選択される機械学習アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましくは、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを比較する工程は、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行うことができる。

また、本発明は、前記前立腺癌診断用組成物を含む、前立腺癌診断用キットを提供する。
さらに、本発明は、前記前立腺癌診断用組成物又はそれを含む前立腺癌診断用キットを用いて前立腺癌を診断する方法を提供する。

本発明は、正常組織に比べて前立腺癌で異常発現する新しいｍｉＲＮＡ組み合わせとｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡ（特に、融合遺伝子のｍＲＮＡ）の組み合わせを初めて明らかにしたことにより、これをバイオマーカーとして使用することによって、外科的処置なしに非侵襲的な方法で前立腺癌を素早くかつ迅速に診断することができる。特に、本発明の前立腺癌診断用ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡは、対象体の尿から他の遺伝子に比べて比較的に発現量が多く、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じて安定的に分析が可能な利点を有する。

ｑＰＣＲを用いた前立腺癌（ＰＣａ）スクリーニングのための機械学習支援多重-マーカー分析の概要を示す。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、標的遺伝子発現の傾向性分析のためのボックスプロット（box plot）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。単一マーカー分析に対する結果を示しており、バイオマーカー性能分析のためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線及びＡＵＣ（曲線下面積）である。ＲＦＥＣＶ（相互検証による再帰的特徴除去）アルゴリズムを適用した結果であり、最適なバイオマーカー組み合わせを示す：（ａ）４つの特徴（feature）を組み合わせると極値（local maximum）が形成される；（ｂ）使用されたバイオマーカーの順位。ＲＦＥＣＶ（相互検証による再帰的特徴除去）アルゴリズムを適用した結果であり、最適なバイオマーカー組み合わせを示す：（ａ）４つの特徴（feature）を組み合わせると極値（local maximum）が形成される；（ｂ）使用されたバイオマーカーの順位。機械学習プロセス及び単一バイオマーカーベースのＭＬ分類器ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）スコアを示す。機械学習プロセス及び単一バイオマーカーベースのＭＬ分類器ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）スコアを示す。機械学習プロセス及び単一バイオマーカーベースのＭＬ分類器ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）スコアを示す。単一バイオマーカーベースの機械学習評価を示す。単一バイオマーカーベースの機械学習評価を示す。単一バイオマーカーベースの機械学習評価を示す。単一バイオマーカーベースの機械学習評価を示す。単一バイオマーカーベースの機械学習評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示すことで、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示すことで、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示すことで、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示すことで、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）の多重バイオマーカーベースのＭＬ分類器評価を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示し、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示し、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示し、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。６つのバイオマーカー組み合わせ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ、ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３）のＭＬ分類器評価及び特徴分析を示し、機械学習支援多重マーカー分析に対する結果を示す。

本発明は、前立腺癌診断のためのバイオマーカーに関する。
本発明で使用される用語「前立腺癌」とは、前立腺に発生する悪性腫瘍であり、「極限性前立腺癌」及び「進行性前立腺癌」を含むが、これらに限定されない。

本発明で使用される用語「診断」とは、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明において、前記診断は、前立腺癌の発症又は進行の有無を確認するものと解釈することができる。

本発明で使用される用語「マーカー」又は「診断マーカー（diagnosis marker）」とは、前立腺癌を有する対象体を正常細胞又は正常対象体と区別して診断することができる物質であり、正常細胞と比較して前立腺癌が発症又は進行した細胞又は対象体において増加又は減少を示すポリペプチド、タンパク質又は核酸（例：ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖タンパク質又は糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などの有機生体分子が含まれるが、これらに限定されない。前立腺癌診断マーカーは、前立腺癌の発症及び進行の指標となり得るので、前立腺癌の発症、疾患の進行及び疾患の診断に使用することができる。

本発明の目的において、本発明の前立腺癌診断マーカーは、正常細胞又は組織の細胞と比較して、前立腺癌細胞において特異的に発現レベルの差を示すｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの断片である。

より具体的に、本発明のｌｎｃＲＮＡ前立腺癌診断マーカーは、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、融合遺伝子のｍＲＮＡ前立腺癌診断マーカーは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであり、ｍｉＲＮＡ前立腺癌診断マーカーは、ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つであり、これらは前立腺癌が発症又は進行した細胞又は対象体で増加又は減少するＲＮＡである。前記マーカーのうち、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ及びＭＡＬＡＴ１は、前立腺癌で発現が増加し、残りは発現が減少する。

一実施形態において、特に前記マーカーは、正常対照群から前立腺癌患者の診断、前立腺癌の進行状態を区別することができる識別力を向上させるために、２つ以上の組み合わせで使用することができる。本発明によるマーカーのうち、これらの用途に最適な効果を示すｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの組み合わせを選択して使用することができ、当業者であれば用途に適した組み合わせを選択することができるであろう。

一実施形態において、前記マーカーｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡの組み合わせは、患者群によるマーカーの相対発現量分析とＲＯＣ曲線のＡＵＣ値による個々のマーカー性能評価によって選択することができる。具体的には、ＡＵＣ値が高いか、既存の参考文献と患者群による傾向性が一致するプライマーを選定し、その後さらに多変量解析を行って選択することができる。バイオマーカーによる個々のデータ分析結果は、図２及び図３に示されている。

一実施形態において、前記マーカーの組み合わせは、パラメータとしてＬＯＯ（Leave-One-Out）及びランダムフォレスト（ＲＦ）を使用した場合、ＲＦＥＣＶ（相互検証による再帰的特徴除去）アルゴリズムを適用した結果であり、極値（local maximum）を形成するように組合わせられる。好ましくは、前記マーカーの組み合わせは、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行われ、ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）値が０．６５以上、ＡＵＣ値が０．７０以上であるもので組合わせることができる。一例として、このような組み合わせは、ｍｉＲＮＡとしてｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐの組み合わせを含むことができ、これらの組み合わせに対するＲＯＣ曲線は図７に開示されている。別一例として、このような組み合わせは、ｌｎｃＲＮＡとしてＰＣＡ３、融合遺伝子のｍＲＮＡとしてＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、及びｍｉＲＮＡとしてｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐの組み合わせを含むことができ、これらの組み合わせに対するＲＯＣ曲線は図９に開示されている。

一実施形態において、前記マーカーの組み合わせは、ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、具体的には、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐであってもよい。

一実施形態において、前記マーカーの組み合わせは、（ａ）ｌｎｃＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、（ｂ）融合遺伝子のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、又は（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡであり、前記ｌｎｃＲＮＡは、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであり、前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

一実施形態において、前記マーカーの組み合わせは、ｌｎｃＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡの組み合わせであり、前記ｌｎｃＲＮＡは、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１であり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであってもよい。

一実施形態において、前記マーカーは、ｍｉＲＮＡであり、前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐからなる群から選択される少なくとも２つである。

一実施形態において、前記マーカーの組み合わせは、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡの組み合わせであり、前記ｌｎｃＲＮＡは、ＰＣＡ３であり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであり、前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐである。

一実施形態において、前記ｌｎｃＲＮＡ及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡに、それぞれ特異的に結合するプライマーは以下のような塩基配列からなっていてもよい（配列番号１～１４）。

一実施形態において、前記ｍｉＲＮＡは、それぞれ以下のような塩基配列からなっていてもよい。

前記配列番号１～１４に記載された塩基配列は、ｌｎｃＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーの塩基配列であり、前記配列番号１９～３５に記載された塩基配列は、ｍｉＲＮＡ自らの塩基配列である。ｍｉＲＮＡに特異的に結合するプローブ又はプライマーは、前記ｍｉＲＮＡ塩基配列を参照して設計することができる。前記プローブ又はプライマーは、前立腺癌の発症又は進行の有無を診断することができる診断マーカーとして活用できるｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡを効果的に検出することができ、プライマーの塩基配列は、診断マーカーとして活用できるｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡを検出するうえで、ある程度の変形が可能である。本技術分野の当業者であれば、このような人工的な変形によって８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性が維持される塩基配列が、本発明で目的とする前立腺癌診断マーカーとして、正常な対象体と前立腺癌疾患を有する対象体間で発現量の差を有意に比較できる限り、本発明の前記塩基配列と均等であることを容易に理解できる。

前記各マーカーのタンパク質は公知のものであり、例えば、前記各マーカーの配列はヒト由来の配列であってもよい。
本発明で使用される用語「生物学的試料」又は「検体」とは、人体や哺乳動物から得られるあらゆる固体又は液体の試料、例えば、特定臓器由来の組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿又は血清試料を含むが、これらに限定されない。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断マーカーが使用される生物学的試料は、前立腺癌組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿および血清からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。好ましくは、本発明の前立腺癌診断マーカーが使用される生物学的試料は、尿である。

別の実施形態おいて、本発明に使用される生物学的試料としては、比較分析のために、前立腺癌の判別が必要な被検者の生物学的試料はもちろん、正常対照群、特定タイプの前立腺癌対照群由来の生物学的試料も使用することができる。

本発明で使用される用語「ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる製剤」とは、試料に含まれた当該ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はこれらの断片の発現の有無を確認する方法に使用される製剤を意味するが、好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ｄｄＰＣＲ（droplet digital PCR）、シークエンシング（sequencing）、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット法及び／又は遺伝子チップ分析法などの方法に使用される標的遺伝子に特異的に結合できるプライマー、プローブ及び／又は抗体を含むことができる。好ましくは、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる製剤であってもよい。

一実施様態において、本発明は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）と定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いてマーカーを検出することができる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応とは、生物学的試料からＲＮＡ、例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡを分離した後、そこからｃＤＮＡを合成し、特定のプライマー、又はプライマー及びプローブの組み合わせを使用して特定の遺伝子を大量に増幅させることをいう。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Real-time PCR）とも知らされたｑＰＣＲは、蛍光物質をＰＣＲ法に応用したものであり、特定のプライマー、又はプライマー及びプローブの組み合わせを使用して反応中に試料内に存在する標的遺伝子の増幅と一緒に蛍光物質の発光（emission）程度をリアルタイムで検出して定量分析し、標的遺伝子の増幅の有無及びその様相を迅速かつ正確に分析できる方法である。多数の標的遺伝子の発現変化を確認し、高速で大量の実験結果をスクリーニングするために主に使用される。このような方法は、例えば（Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6. / Kwang Hyuck Lee, Quatification of DNA as a tumor marker in patients with pancreatic cancer, 韓国消火器学会誌 2005, 46, 226-32）に記載されている。

本発明で使用される用語「プライマー」とは、短いフリー３’末端水酸化基を有する核酸配列で相補的なテンプルレートと塩基対を形成することができ、テンプルレート鎖をコピーするための開始位置として機能をする短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝液及び温度で重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）及び異なる４つのヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。

本発明で使用される用語「プローブ」とは、遺伝子又はｍＲＮＡと特異的に結合する短くても数塩基乃至長くても数百塩基に相当するＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸断片を意味し、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、二本鎖ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で作製することができ、より容易に検出するために標識することができる。

本発明のプライマー又はプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体法、又は他の広く公知された方法を使用して化学的に合成することができる。これらの核酸配列は、当該分野に公知の多くの手段を使用して変形させることもできる。このような変形の非制限的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチドの１つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、非荷電連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメートなど）又は荷電連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエイトなど）への変形が挙げられる。

本発明の実施例では、全体前立腺癌患者の尿検体から本発明のバイオマーカーの発現レベルを測定した。その結果、ＰＣＡ３、ＭＡＬＡＴ１に対するｌｎｃＲＮＡ及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧに対する融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが前立腺肥大症対照群に比べて顕著に上方発現することを示し、これらをマーカーとして選定し、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの場合、ほとんどの前立腺癌患者の尿検体から前立腺肥大症対照群に比べて下方発現されることを確認し、実験したすべてのｍｉＲＮＡバイオマーカーをマーカーとして選定した。

本発明の別の実施例において、前立腺癌診断用バイオマーカーとして活用できるｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの組み合わせを導き出した。前記ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡは、組織学的に前立腺癌と診断された１０１人の患者及び非腫瘍対照群６２人の尿検体をｑＰＣＲにより分析し、合計２０個の遺伝子、すなわち、２個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３、ＭＡＬＡＴ１）、１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）及び１７のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）が選択された。最も好ましくは、これらのうち、非腫瘍対照群と腫瘍群で発現量の差が観測される４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）組み合わせが選択され、１個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）及び４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）組み合わせが選択された。

前記の通りに選別された４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）組み合わせと１個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）及び４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の組み合わせは、その後、前立腺癌（１０１人）及び前立腺肥大症（６２人）患者から得られた合計１６３個の尿検体で検出マーカーとしての有用性が評価された。その結果、本発明の４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）組み合わせの発現レベルを測定する製剤や、本発明の６つのマーカー、すなわちｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）、融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）、及び／又はｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の発現レベルを測定する製剤を利用すれば前立腺癌を効果的に診断できることが分かった。

また、本発明は、前立腺癌診断用組成物又はキットを用いて前立腺癌診断のための情報を提供する方法に関するものである。
具体的には、本発明の前立腺癌診断のための情報を提供する方法は、対象体から分離された生物学的試料における前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを正常対照群の試料のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する工程；を含む。

前記発現レベルを測定する工程でｍｉＲＮＡの発現レベルを測定した後、前記発現レベルを比較する工程でｍｉＲＮＡの発現レベルを正常対照群の試料の当該ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較し、マーカーの発現レベルが有意に増加又は減少する場合、前立腺癌が発症又は進行したと判定することができる。

一実施形態において、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ｄｄＰＣＲ、シークエンシング、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット法及び／又は遺伝子チップ分析法によって測定できるが、これらに限定されない。

一実施形態において、前記発現レベルを測定する工程は、対象体から分離された生物学的試料からｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐ及び／又はｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐを含むｍｉＲＮＡを抽出する工程；抽出されたｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程；合成したｃＤＮＡに特異的なプライマー対を用いてｃＤＮＡを増幅する工程；及び増幅されたｃＤＮＡを検出する工程；を含むことができる。

一実施形態において、前記生物学的試料は、被験者から得られた組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿及び／又は血清であってもよい。好ましくは、前記生物学的試料は、尿である。好ましくは、前記尿は、被験者の前立腺マッサージ又はＤＲＥ（直腸内触診）の前後に採取することができる。

一実施形態において、前記発現レベルを比較する工程は、従来の統計的分析方法を用いて行うことができる。好ましくは、前記アルゴリズムは、ＬＲ（ロジスティック回帰）で行うことができる。ＬＲ（ロジスティック回帰）アルゴリズムを用いて多重バイオマーカーの発現レベルを分析する場合、前立腺癌の診断、予測の精度を向上することができる。アルゴリズムについては後述する。

一実施形態において、前記発現レベルを比較する工程は、機械学習アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましくは、前記アルゴリズムは、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト及び多層パーセプトロンからなる群から選択される。機械学習アルゴリズムを用いて多重バイオマーカーの発現レベルを分析する場合、前立腺癌の診断、予測の精度をさらに向上することができる。アルゴリズムについては、後述する。

前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程は、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行うことができ、ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）値が０．６５以上であり、ＡＵＣ（曲線下面積）値が０．７０以上であってもよい。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断のための情報を提供する方法は、バイオマーカーの分析結果に加え、患者の非蛋白質臨床情報、すなわち、マーカー以外の臨床情報をさらに使用することができる。このような非蛋白質臨床情報は、例えば、患者の年齢、性別、体重、食習慣、体質量、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）、血管造影術、内視鏡的逆行性胆道膵管造影、超音波内視鏡、腫瘍マーカー、及び／又は腹腔鏡検査を含む。

一実施形態において、前記発現レベルを測定する工程は、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、又はそれらの組み合わせの発現レベルを測定する工程をさらに含むことができる。ここで、前記ｌｎｃＲＮＡは、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであってもよい。また、前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、又はそれらの組み合わせの発現レベルを正常対照群の試料のｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ、又はそれらの組み合わせの発現レベルと比較する工程をさらに含むことができる。前記発現レベルを測定する工程でｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はその断片の発現レベルを測定した後、前記発現レベルを比較する工程でｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はその断片の発現レベルを正常対照群の試料の当該ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はその断片の発現レベルと比較して、マーカーの発現レベルが有意に増加又は減少する場合、前立腺癌が発症又は進行したと判定することができる。

一実施形態において、前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ｄｄＰＣＲ、シークエンシング、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット法及び／又は遺伝子チップ分析法によって測定できるが、これらに限定されない。

一実施形態において、前記発現レベルを測定する工程は、対象体から分離された生物学的試料から前記ｍｉＲＮＡと、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１を含むｌｎｃＲＮＡ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧを含む融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせを抽出する工程；抽出されたｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせからｃＤＮＡを合成する工程；合成したｃＤＮＡに特異的なプライマー対を用いてｃＤＮＡを増幅する工程；及び増幅されたｃＤＮＡを検出する工程；を含むことができる。

一実施形態において、前記生物学的試料は、被験者から得られた組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿及び／又は血清であってもよい。好ましくは、前記生物学的試料は、尿である。好ましくは、前記尿は、被験者の前立腺マッサージあるいはＤＲＥ（直腸内触診）の前後に採取することができる。

一実施形態において、前記発現レベルを比較する工程は、従来の統計的分析方法を用いて行うことができる。好ましくは、前記アルゴリズムは、ＬＲ（ロジスティック回帰）で行うことができる。ＬＲ（ロジスティック回帰）アルゴリズムを用いて多重バイオマーカーの発現レベルを分析する場合、前立腺癌の診断、予測の精度を向上することができる。アルゴリズムについては、後述する。

一実施形態において、前記発現レベルを比較する工程は、機械学習アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましくは、前記アルゴリズムは、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト及び多層パーセプトロンからなる群から選択することができる。機械学習アルゴリズムを用いて多重バイオマーカーの発現レベルを分析する場合、前立腺癌の診断、予測の精度をさらに向上することができる。アルゴリズムについては、後述する。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断のための情報を提供する方法は、バイオマーカーの分析結果に加え、患者の非蛋白質臨床情報、すなわち、マーカー以外の臨床情報をさらに使用することができる。このような非蛋白質臨床情報は、例えば、患者の年齢、性別、体重、食習慣、体質量、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）、血管造影術、内視鏡的逆行性胆道膵管造影術、超音波内視鏡、腫瘍マーカー、及び／又は腹腔鏡検査を含む。

前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを比較する工程は、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行うことができ、ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）値が０．６５以上であり、ＡＵＣ（曲線下面積）値が０．７０以上であってもよい。

また、本発明は、前記前立腺癌診断用組成物を含む前立腺癌診断用キットに関するものである。
一実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットは、前立腺癌診断マーカーである、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、被検体を対象として前立腺癌を診断するために使用することができる。前記ｍｉＲＮＡの組み合わせについては、前述した通りであり、前記ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び／又は融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカーは、２つ以上の組み合わせで使用することができ、それらの組み合わせについては、前述した通りである。好ましくは、前記組み合わせは、１個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）の１つ以上及び４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の１つ以上を含むことができる。従って、本発明の前立腺癌診断用キットは、１個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）の１つ以上及び４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の１つ以上を確認するためのポリヌクレオチド、プライマー、プローブ又は抗体だけでなく、分析方法に適した１つ又は複数の他の構成成分の組成物、溶液又は装置を含むことができる。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットは、ＲＴ－ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＲＴ－ＰＣＲキットは、前記遺伝子に特異的な各プライマー対に加えて、試験管又は他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は異なる）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼ及び逆転写酵素などの酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ－水、滅菌数などを含むことができる。また、定量対照群として使用される遺伝子に特異的なプライマー対を含むことができる。

別の実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットは、遺伝子チップ分析法を行うために必要な必須要素を含むことができる。遺伝子チップ分析用キットは、遺伝子又はその断片に該当するｃＤＮＡがプローブとして付着している基板、及び蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、定量対照群遺伝子又はその断片に該当するｃＤＮＡを含むことができる。

別に実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットは、前記バイオマーカー（例えば、ｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）、融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）及びｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ））以外に従来公知の前立腺癌診断バイオマーカー遺伝子発現レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。

このような本発明のバイオマーカーを特異的に認識する物質は、区画となっている容器に個別に分注して存在することができ、これにより、本発明は、本発明のマーカーを特異的に認識できる分子を区画されて含む装置及び／又は機構を提供する。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットは、本発明の１つ以上のバイオマーカーを検出するための試薬、装置及び／又はアルゴリズムが組み込まれた情報処理手段をさらに含み、前記アルゴリズムにより、バイオマーカーの検出結果を前立腺癌の診断と関連付けることができる。前記関連は、前立腺癌の被検者、正常対照群又は特定タイプの前立腺癌を有する患者の前記１つ又は複数のマーカーの発現量を比較して、前記発現量の差に対するパターンを導出するように、前記アルゴリズムを訓練することを含む。

一実施形態において、前記アルゴリズムの訓練は、入力値として与えられるバイオマーカーの発現量を算出値として与えられる診断結果とマッピングするアルゴリズムを構築する工程；前記構築されたアルゴリズムを実行して、前記マーカー発現量と前立腺癌の診断又はその不在をマッピングする工程；及び前記構築実行されたアルゴリズムの入力値及びこれに応じて算出値を変化させながら前記アルゴリズムを実行して、最適なアルゴリズムマッピングアーキテクチャーが実現されるようにする工程；を含み、前記最適なアルゴリズムマッピングは、前記正常対照群又は特定の前立腺癌を有する患者のマーカー発現量と前記前立腺癌の被検者のマーカー発現量との数値を用いて有意な差を明らかにし、これを前立腺癌の診断又は不在に利用するものである。

本発明では、公知のアルゴリズムが使用でき、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト、多層パーセプトロンからなる群から選択されるが、これらに限定されない。

一実施形態において、本発明の前立腺癌診断用キットに用いられる生物学的試料は、前立腺癌組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿及び／又は血清であってもよく、好ましくは尿であり、比較分析のために、前立腺癌の判別が必要な患者由来の試料、正常対照群、又は前立腺癌対照群由来の試料を使用することができる。

また、本発明は、前記前立腺癌診断用組成物又はキットを用いて前立腺癌を診断する方法を提供する。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例
１．材料及び方法
・尿検体の準備
本実験では、ソウル牙山病院から入手した前立腺肥大症患者６２人の尿検体と、前立腺癌患者１０１人の尿検体を利用した。前立腺癌及び前立腺肥大症患者で治療開始前の自己排尿の尿、直腸指診検査直後に排尿した尿及び手術患者の場合、手術当日にカテーテル挿入時に採取した尿を（尿の量は、３０ｍＬ以上になるように尿検体収集）採取し、－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。

・尿検体からｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡ抽出
尿検体からｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡを抽出するために、ＱＩＡＧＥＮ社製（ｃａｔｎｏ．５５１１４）を使用した。５００μＬのプロテイナーゼＫがピペットした５０ｍＬの遠心分離チューブに４ｍＬの尿検体を加え、４ｍＬのバッファーＡＣＬ（必要に応じて担体ＲＮＡ含む）及び１．０ｍＬのバッファーＡＴＬを加え、３０秒間パルスボルテックスして混合した。次いで、６０℃で３０分間培養し、チューブの溶解物に９．０ｍＬのバッファーＡＣＢを加え、１５～３０秒間パルスボルテックスして完全に混合した。その後、溶解物－バッファーＡＣＢ混合物をチューブ内で５分間、氷上で培養し、ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをＱＩＡｖａｃ２４ＰｌｕｓのＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒに挿入し、オープンタイプのＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに２０ｍＬチューブエクステンダーを挿入した。前記溶解物－バッファーＡＣＢ混合物をＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムのチューブエクステンダーに注意して塗布し、真空をオンにした後、すべての溶解物を、カラムを通して完全に吸入した後、真空ポンプを止めた。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに６００μＬのバッファーＡＣＷ１を塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空をオンにした後、すべてのバッファーＡＣＷ１がＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを通して抽出された後、真空ポンプをオフした。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに７５０μＬのバッファーＡＣＷ２を塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空をオンにした後、すべてのバッファーＡＣＷ２がＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを通して抽出された後、真空ポンプをオフした。７５０μＬのエタノール（９６～１００％）をＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空ポンプをオンにした後、すべてのエタノールがスピンカラムを通して抽出された後、真空をオフした。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをきれいな２ｍＬの収集チューブに入れ、３分間最大速度（２０，０００×ｇ、１４，０００ｒｐｍ）で遠心分離した。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをきれいな２ｍＬの収集チューブに入れ、蓋を開け、アセンブリを５６℃で１０分間培養して、膜を完全に乾燥させた。きれいな１．５ｍＬの溶出チューブにＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを置き、前記２ｍＬの収集チューブを廃棄し、２０～１５０μＬのバッファーＡＶＥをＱＩＡａｍｐＭｉｎｉ膜の中央に注意して塗布し、蓋を閉め、室温で３分間培養した。最後に、マイクロ遠心分離機で最大速度（２０，０００×ｇ、１４，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離して、核酸を溶離した。

尿検体からｍｉＲＮＡを抽出するために、ＱＩＡＧＥＮ社製（ｃａｔｎｏ．５５１１４）を利用した。４００μＬのプロテイナーゼＫがピペットした５０ｍＬの遠心分離チューブに３ｍＬの尿検体を加え、３．２ｍＬのバッファーＡＣＬ（担体ＲＮＡなし）及び１．０ｍＬのバッファーＡＴＬを加え、３０秒間パルスボルテックスして混合した。次いで、６０℃で３０分間培養し、チューブの溶解物に９．０ｍＬのバッファーＡＣＢ及び７．０ｍＬのイソプロパノールを加え、１５～３０秒間パルスボルテックスして完全に混合した。その後、溶解物－バッファーＡＣＢ混合物をチューブ内で５分間、氷上で培養し、ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをＱＩＡｖａｃ２４ＰｌｕｓのＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒに挿入し、オープンタイプのＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに２０ｍＬチューブエクステンダーを挿入した。前記溶解物－バッファーＡＣＢ混合物をＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムのチューブエクステンダーに注意して塗布し、真空をオンにした後、すべての溶解物がカラムを通して完全に吸入された後、真空ポンプをオフした。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに６００μＬのバッファーＡＣＷ１を塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空をオンにした後、すべてのバッファーＡＣＷ１がＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを通して抽出された後、真空ポンプをオフした。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに７５０μＬのバッファーＡＣＷ２を塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空をオンにした後、すべてのバッファーＡＣＷ２がＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを通して抽出された後、真空ポンプをオフした。７５０μＬのエタノール（９６～１００％）をＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムに塗布し、カラムの蓋を開けたまま真空ポンプをオンにした後、すべてのエタノールがスピンカラムを通して抽出された後、真空をオフした。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをきれいな２ｍＬの収集チューブに入れ、３分間最大速度（２０，０００×ｇ、１４，０００ｒｐｍ）で遠心分離した。ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムをきれいな２ｍＬの収集チューブに入れ、蓋を開け、アセンブリを５６℃で１０分間培養して、膜を完全に乾燥させた。きれいな１．５ｍＬの溶出チューブにＱＩＡａｍｐＭｉｎｉカラムを置き、前記２ｍＬの収集チューブを廃棄し、２０～１５０μＬのバッファーＡＶＥをＱＩＡａｍｐＭｉｎｉ膜の中央に注意して塗布し、蓋を閉め、室温で３分間培養した。最後に、マイクロ遠心分離機で最大速度（２０，０００×ｇ、１４，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離して、核酸を溶離した。

・尿検体から抽出されたｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成
尿検体から抽出されたｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、ＱＩＡＧＥＮ社製（ｃａｔｎｏ．２３５３１１）を用いた。各テンプレートＲＮＡを氷上で解凍し、ｇＤＮＡＷｉｐｅｏｕｔＢｕｆｆｅｒ、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ＱｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔＲＴＢｕｆｆｅｒ、ＲＴＰｒｉｍｅｒＭｉｘ及びＲＮａｓｅがない水（RNase-free water）を室温（１５～２５℃）で解凍した。下記表１に従ってゲノムＤＮＡ除去反応を氷上で準備し、混合した後、氷上で保管した。以後、４２℃で２分間培養した後、直ぐに氷上に置き、下記表２に従って逆転写マスターミックスを氷上で製造した。逆転写マスターミックスを含む各チューブに、前記テンプレートＲＮＡ（１４μＬ）を加え、４２℃で１５分間培養した後、９５℃で３分間培養して、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を非活性化した。各完了された逆転写反応の分取量をリアルタイムＰＣＲミックスに加えた。

尿検体から抽出されたｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、ＱＩＡＧＥＮ社製（ｃａｔｎｏ．３３９３４０）を用いた。ヌクレアーゼがない水を使用し、各テンプレートＲＮＡサンプルを５ｎｇ／μＬで希釈し、下記表３に従って逆転写反応を氷上で準備し、混合した後、氷上で保管した。４２℃で６０分間培養した後、９５℃で５分間培養し、逆転写酵素を加熱非活性化した後、直ぐに４℃に冷却した。以後、ｍｉＲＮＡＰＣＲアッセイを行った。

・定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
各マーカーの発現を測定するために、ストラタジーンＭＸ３０００Ｐ（Agilent Technologies社製、米国）を使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を３回行った。ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡ定量化のために、以前の工程で合成されたｃＤＮＡはＰＣＲテンプレートとして使用された。増幅及び検出には、ＯＲＡ（登録商標）ｑＰＣＲＧｒｅｅｎＲＯＸＬＭｉｘ、２Ｘ（highQu社製、ドイツ）が使用された。各チューブの最終容積は、ＯＲＡ（登録商標）ｑＰＣＲＧｒｅｅｎＲＯＸＬＭｉｘ、２Ｘ（５．０μＬ）、予め希釈されたｃＤＮＡ（４．０μＬ）、予め混合されたプライマーセット（１μＬ）で構成された１０μＬである。ｌｎｃＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために、ｃＤＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡ用プライマーの濃度は、最終容積で１６０～２００ｎｇ、５００ｎＭであった。ｑＰＣＲ循環条件は以下の通りである：９５℃で１５分間初期変性（denaturation）後、９５℃で１５秒間テンプレート変性及び６０℃で６０秒間延伸（elongation）を５０周期、そして６０～９５℃で１周期の溶融曲線分析を最後に行った。ｍｉＲＮＡ発現レベルを測定するために、ｃＤＮＡの濃度は最終容積で１２～１６ｎｇであった。ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡ（登録商標）ｍｉＲＮＡＰＣＲアッセイ（QIAGEN社製、ドイツ）は、ｍｉＲＮＡ検出のためのプライマーとして使用した。使用前に２２０μＬのヌクレアーゼのない水で予め希釈された。ｑＰＣＲ循環条件は以下の通りである：９５℃で２分間初期変性後、９５℃で１０秒間５０周期のテンプレート変性、５６℃で６０秒間伸張、５６～９５℃で１周期の溶融曲線分析を最後に行った。ｑＰＣＲで測定されたロー工データ（Raw data）は、ＭｘＰｒｏソフトウェアで分析した。すべてのプライマーセットは、以下に示されている。

・単一バイオマーカー分析
ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカーの診断能力を調べるために、１６３個の尿ｃＤＮＡサンプル（６２個の良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）サンプル及び１０１個の前立腺癌（ＰＣａ）サンプル）中の１７個のｍｉＲＮＡと２個のｌｎｃＲＮＡ及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲによって測定した。すべてのバイオマーカーの発現プロファイルを１８ｓ－ｒＲＮＡ及びβ－アクチンで正規化した。良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）と前立腺癌（ＰＣａ）との間の遺伝子発現傾向は図２に示した。ＰＣＡ３、ＭＡＬＡＴ１に対するｌｎｃＲＮＡ及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧに対する融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカーは、前立腺癌と診断された患者において上向き調節を示す。１７個のｍｉＲＮＡに対するすべてのｍｉＲＮＡバイオマーカーは、前立腺癌において下向き調節されることが検出された。具体的に、各バイオマーカーの診断能力をＲＯＣ曲線で評価した。ｌｎｃＲＮＡ及びｍｉＲＮＡにおいて、それぞれ０．７９及び０．８５の最も高いＡＵＣ値が現示された（図３及び表６～８）。

・従来の統計分析方法及び機械学習前のデータ前処理
以前の単一バイオマーカー分析に基づいて、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡに対するバイオマーカーの正規化された発現（－ΔＣｔ）を併合した。正規化された発現（－ΔＣｔ）を併合する前に、データ前処理を行った：まず、同じｌｎｃＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡを標的とするバイオマーカーのうち、ＡＵＣを比較して、ｌｎｃＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡバイオマーカープライマー（ＰＣＡ３_４、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ_Ｒ３及びＭＡＬＡＴ１_６）を選択した。ただし、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合遺伝子の場合、最も高いＡＵＣを示したバイオマーカー（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ６）でＮｏＣＴが頻繁に観測され（５０％以上）、次善（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３、ＮｏＣｔｒａｔｉｏ５％）を選択した。次に、データの不均衡を防止するために、同じバイオマーカーでブランク正規化された発現を最小正規化発現で処理した。満たされたデータセットを機械学習に適用する前に、最小－最大スケーリングが行われた。

・バイオマーカーの選択
前立腺癌／良性前立腺肥大症（ＰＣａ／ＢＰＨ）分類器の性能を改善し、単一バイオマーカーの潜在的動揺（perturbation）に対するロバストネス（robustness）を提供するために、様々な機械学習アルゴリズムによる多重バイオマーカーベースの前立腺癌／良性前立腺肥大症（ＰＣａ／ＢＰＨ）分類器を目指した。より優れた性能を得るために、最適なバイオマーカー組み合わせを見つけるために、ＲＦＥＣＶ（相互検証による再帰的特徴除去）アルゴリズムを適用した。ＲＦＥＣＶのパラメータとして、ＬＯＯ（Leave-One-Out）及びランダムフォレスト（ＲＦ）が使用された。ＬＯＯは、群間の偏向を最小限に抑えるのに適しており、ＲＦはさらなる分析において特徴重要度を提供することができる。ＲＦＥＣＶにより、特徴重要度が低い特徴を除去しながら、特徴の数に応じたモデルの性能を計算することができる。すなわち、ＲＦＥＣＶの結果極値（local maximum）が形成される特徴（feature）の個数を使用する際に最も優れた性能を予想することができる。これらのＲＦＥＣＶの分析の結果、４つの特徴が使用されたときに極値が形成された（図４Ａ－４Ｂ）。選択された４つの特徴は、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐである。特徴重要度の高い４個のｍｉＲＮＡ組み合わせを用いて以降の機械学習ベースの研究を行った。また、選択された４個のｍｉＲＮＡsに、既に広く研究された２つの追加特徴であるＰＣＡ３_４とＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３を含む研究もさらに行った。前記ＰＣＡ３_４及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧも高い特徴重要度を示した。この特徴選択プロセスにより、４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ（４個の特徴組み合わせ）、そして、ここに１個のｌｎｃＲＮＡ及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡを追加した組み合わせ（６個の特徴組み合わせ）が機械学習（ＭＬ）のために選択された。また、このように選択された４個のｍｉＲＮＡ組み合わせ、そして、ここに１個のｌｎｃＲＮＡ及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡを追加した組み合わせが従来の統計分析方法のために使用された。前記方法は、バイオマーカーを選択する方法の例であり、これに限定されない。

・単一バイオマーカーに基づいた機械学習
多重バイオマーカー分析のための制御を提供するために、ＭＬアルゴリズムを用いて単一バイオマーカーベース診断分類器を開発した。まず、最小－最大スケーリングされたデータを訓練データセット（７５％）及びテストデータセット（２５％）にランダム分割した。訓練－テストデータセットの分割後、訓練データセットを用いてＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ＲＦ（ランダムフォレスト）及びＬＲ（ロジスティック回帰）を訓練した（図２）。前立腺癌（ＰＣａ）と良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）との間の数不均衡により３つのアルゴリズムのすべてでクラス加重値補償（class weight compensation）が行われた。訓練データセット学習後、すべてのバイオマーカー及びＭＬアルゴリズムに対してＲＯＣ曲線、ＡＵＣ及びＬＯＯＣＶスコアが生成された（図５Ａ～５Ｃ、図６Ａ～６Ｅ）。

バイオマーカーによって、各機械学習アルゴリズムはＡＵＣ及びＬＯＯＣＶスコアで大きな違いを示した。ＳＶＭ、ＲＦ、ＬＲの順に、平均ＡＵＣは０．７１±０．０８（標準偏差）、０．６６±０．１２、０．８０±０．１０であり、平均ＬＯＯＣＶスコアは０．７２７±０．０６６、０．６５８±０．０８０、０．７１１±０．０７１であった。この結果によると、ＳＶＭ及びＬＲは、ＲＦよりも単一バイオマーカーベースＭＬ分類に適している。しかし、ＡＵＣ及びＬＯＯＣＶスコアの全般的な傾向は、ＭＬアルゴリズムよりもバイオマーカーの影響を大きく受けると考えられる。前記結果は、単一バイオマーカーに基づくため、多重バイオマーカーで同じ分析が適用されたときに、バイオマーカー間の組み合わせシナジーによってより優れた成績が期待される。

・多重バイオマーカーに基づいた機械学習
多重バイオマーカーベースの前立腺癌／良性前立腺肥大症（ＰＣａ／ＢＰＨ）分類器は、性能及びロバストネス（robustness）の改善を目標に作製された。データ前処理及び機械学習アルゴリズム学習は、単一バイオマーカーベース分類器と同じように行われ、前述の目標を達成するために、各バイオマーカーの組み合わせとアルゴリズムごとにＧｒｉｄＳｅａｒｃｈＣＶアルゴリズムによりパラメータ最適化を行った。

機械学習の結果、４個のｍｉＲＮＡ組み合わせの場合、ＳＶＭ、ＲＦ、ＬＲの順に、ＡＵＣは０．９６、０．９９、０．９６であり（図７Ｃ～７Ｅ）、ＬＯＯＣＶスコアは０．８４７、０．８６５、０．８３４であった（図７Ａ）。特徴重要度（Feature importance）の場合、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐが３３．１％、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐが２８．８％、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐが２０．９％、そして、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐが１７．２％であった（図８Ｂ）。ＰＳＡレベル３～１０の患者群を対象とした分析では、ＳＶＭ、ＲＦ、ＬＲの順に、ＡＵＣが０．９４、０．９９、０．９１、ＬＯＯＣＶスコアが０．８８５、０．８９６、０．８５４であった。ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）は、全体ｎ個のサンプルの中から１個のサンプルおみを除外させてｎ－１個のサンプルを訓練セットとするモデリングを通じて、合計ｎ個のモデルを検証する方法であり、これにより、サンプルによるランダム性を除去することができ、予測の精度を高めることができる。

６個のバイオマーカー組み合わせの場合、ＳＶＭ、ＲF、ＬＲの順に、ＡＵＣは０．９６、０．９９、０．９６であり（図９Ｃ～９Ｅ）、ＬＯＯＣＶスコアは０．８６５、０．８７１、０．８３４であった（図９Ａ）。特徴重要度の場合、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐが２０．２％、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐが２０．０％、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐが１８．２％、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐが１５．５％、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合_Ｒ３が１３．３％、そして、ＰＣＡ３_４が１２．８％であった（図１０Ｂ）。特徴重要度の場合、ＲＦＥＣＶで予測されたようにｍｉＲＮＡsが過半数以上の割合（７３．９％）を占めることが分かった。ＰＳＡレベル３～１０の患者群を対象とした分析では、ＳＶＭ、ＲＦ、ＬＲの順に、ＡＵＣが０．９４、１．００、０．９３、ＬＯＯＣＶスコアが０．８６５、０．８９６、０．８４４であることが確認された。

前記結果を総合すると、本研究で提案したｍｉＲＮＡ組み合わせやｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを動員した多重バイオマーカーベース機械学習分類器は、従来のｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子ｍＲＮＡ、ＰＳＡを動員した検査に比べて高い診断性能が期待される。特に、ＲＶ学習の結果、各ｍｉＲＮＡsの重要度が比較的同等であったことから、多重バイオマーカー分類器で観察された大幅の性能向上は特性間の相乗効果に基づいていると考えられる。本研究で提案した多重バイオマーカーベース機械学習分類器は、ＰＳＡテストのグレーゾーン（ＰＳＡレベル３～１０）に該当する患者群も効果的に分類したため、既存の診断法を補完する役割としても広く活用できる。さらに、単純な２進法的分類を越えた確率の提供により、その後の診断及び治療仮定で患者個別化治療に寄与することができる。本多重バイオマーカー分類器は、最新の機械学習技法を利用するため、今後、他のアッセイ及びバイオマーカーと組合わせて多方面に拡張されることが期待される。

・多重バイオマーカーに基づいた従来の統計分析方法
多重バイオマーカーに基づいた機械学習方法とは別に、従来の統計分析方法として多重バイオマーカーベース診断分類器を開発した。多重バイオマーカーに基づいた統計分析方法のデータ前処理、統計分析アルゴリズム、パラメータ、及び評価方法は、単一バイオマーカーに基づいた機械学習の場合と同じである。従来の統計分析方法の１つのＬＲ（ロジスティック回帰）を使用すると、多重バイオマーカーの組み合わせによって値が変わるが、ＡＵＣの最大値は０．９０で、ＬＯＯＣＶスコアの最大値は０．８８である。機械学習による単一バイオマーカー分類器と比較して、ＡＵＣ及びＬＯＯＣＶスコアの大幅な改善が観察された。多重バイオマーカーに基づいた機械学習の場合と同様に、多重バイオマーカーに基づいた従来の統計分析方法を使用する場合、単一バイオマーカーに基づいた機械学習方法と比較して性能及びロバストネスを改善させることができる。バイオマーカーを選定した方法は前記と同様であるが、従来の統計分析方法であるロジスティック回帰では、選択された４個のｍｉＲＮＡ組み合わせと前記４個のｍｉＲＮＡ、１個のｌｎｃＲＮＡ及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡだけでなく、この群で構成できるすべての組み合わせを使用することができる。この群で構成できるすべての多重バイオマーカーの組み合わせを使用して、それぞれのＡＵＣ及びＬＯＯＣＶスコアを比較し、ＡＵＣとＬＯＯＣＶの値によりランク付けし、ＡＵＣとＬＯＯＣＶの順位を加算してその合計が最も低い、つまりその和の順位が最も高い組み合わせから次上位組み合わせを導出して使用することができる。組み合わせを構成する方法又は組み合わせの数は、分類器の性能及びロバストネスの重要度を反映する方法により変わり、最終適用されるバイオマーカーの組み合わせは、順位の高い次上位組み合わせから選択することができるが、これに限定されない。

ロジスティック回帰を通じて前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を区別するためのスコアを計算することができ、スコアを計算する方法は以下のである。
１）このバイオマーカーについて、実験群の最大発現量は１、最小発現量は０で正規化する。

２）これに対する決定関数Ｄ（Ｘ）を計算し、次のように求める。
Ｄ（Ｘ）＝bias＋sum（係数×正規化値）
３）決定関数値をもとに、シグモイド関数Ｆ（Ｘ）を計算して最終スコアを求める。

Ｆ（Ｘ）＝１/（１＋ｅｘｐ（－Ｄ（Ｘ）））
４）最終スコアを閾値０．５を基準に評価し、スコア０．５以上は前立腺癌、０．５未満は前立腺肥大症と判定する。

ロジスティック回帰技法を通じて良い性能を示したバイオマーカーグンの組み合わせと、各バイオマーカーに使用されたバイアス（bias）、係数（coefficient）及び組み合わせによるＡＵＣ及び１つ抜き交差検証値を求めて比較することができる。

・統計分析及び機械学習のための道具
すべての統計的分析は、Ｒ（バージョン４．０．２）及びＰｙｔｈｏｎ（バージョン３．９）で行われた。

（１）データ前処理（データブランク及び正規化）
ローデータ（Raw Data）の前処理は、Ｒ（バージョン４．０．２）のｄｐｌｙｒ、ｒｅｓｈａｐｅ２及びｔｉｄｙｒパッケージを用いて行われた。ローデータのＮｏＣｔ値はブランクとして処理し、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルはβと１８ｓ－ｒＲＮＡの平均で正規化された。正規化は次のように行われ：
正規化発現（－ΔＣｔ）=（Ｃｔ β－アクチン＋Ｃｔ１８ｓ－ｒＲＮＡ）／２－Ｃｔ標的遺伝子
正規化後、ブランク正規化発現は、同じバイオマーカーの最小正規化発現として処理された。

（２）単一マーカー分析
単一マーカー分析は、Ｒ（バージョン４．０．２）のｇｇｐｌｏｔ２及びｐｌｏｔＲＯＣパッケージを用いて行われた。単一マーカー分析のために、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡに対するバイオマーカーの以前に処理された正規化発現（－ΔＣｔ）を使用した。２つの群（良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）と前立腺癌（ＰＣａ））と間の遺伝子発現傾向を確認するために、各バイオマーカーの正規発現（－ΔＣｔ）をボックスプロットで視角化した。また、各バイオマーカーの差等能力（differential ability）を評価するためにＲＯＣ曲線分析を行った。

・機械学習アルゴリズムによる前立腺癌／良性前立腺肥大症（ＰＣａ／ＢＰＨ）分類器の構成
単一バイオマーカー又は多重バイオマーカーに基づいた前立腺癌／良性前立腺肥大症（ＰＣａ／ＢＰＨ）分類器を生成するために、Ｐｙｔｈｏｎ３．８．５を使用する個別化機械学習ソフトウェアをＬｉｎｕｘ上で実行した。ソフトウェアには、ＳｃｉｋｉｔＬｅａｒｎ、ＳｃｉｋｉｔＰｌｏｔ及びＰａｎｄａのようなオープンライブラリが含まれている。サポートベクターマシンの場合、ＳｃｉｋｉｔＬｅａｒｎのＣ－ＳＶＣ（サポートベクトル分類）が使用された。放射基底関数をカーネルとして使用し、クラス間の数の違いを考慮してバランスクラス加重値（Balanced Class Weight）を使用した。ＲＦ（ランダムフォレスト）の場合、ＳｃｉｋｉｔＬｅａｒｎのランダムフォレスト分類器が使用さ、モデルはバランスの取れた（balanced）クラス加重値を有する１００個の意思決定木（decision tree）で構成される。最後に、ロジスティック回帰もＳｃｉｋｉｔＬｅａｒｎから取得し、バランスの取れたクラス加重値を除くすべてのパラメータが基本設定に従った。

機械学習アルゴリズムにｑＰＣＲデータを導入する前に、データ前処理が行われた。まず、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡの量が非常に少ないことを前提に、前述のように、非検出ＣＴ値をバイオマーカーの最小値で埋めた。最少－最大スケーラーは、０と１の間のＣＴ値を正規化するために、満たされたｑＰＣＲデータに適用された。正規化データは、ランダムに訓練データセット（７５％）とテストデータセット（２５％）に分けられた。各機械学習アルゴリズムは、訓練データセットで訓練され、モデル精度、ｆ１スコア、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）、ＡＵＣ、及び確率はテストデータセットを使用して評価された。過適合の問題を確認するために、交差検証も行った。特に、潜在的な群偏向を避けるために、ＬＯＯ（Leave-One-Out）アルゴリズムを適用した。

２．結果
現在まで、前立腺癌特異的バイオマーカーに関する研究がたくさん進行されてきたが、局所前立腺癌の場合、体液でのバイオマーカー検出の感度と特異性は非常に低いことが報告され、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）は、前立腺癌を検出するのに多く使用されているが、癌特異性マーカーではないので、しばしば誤診される場合が発生することになり、正確な検診のために前立腺組生検を施行する場合、患者の苦痛が激しく、費用も多くかかるため、前立腺癌の早期発見のための非侵襲的バイオマーカーが必要な実情であった。

そこで、本発明の前立腺癌ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡマーカーの有用性を検証するために、前立腺肥大症対照群及び前立腺癌でｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び融合遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを比較した結果、図２に示すように、ボックスプロットは、全体前立腺癌の尿検体でｌｎｃＲＮＡ及びｍＲＮＡマーカーの両方が上向き発現され、ｍｉＲＮＡマーカーの両方が下向き発現されたことが示された。

また、ＲＦＥＣＶアルゴリズムを介してランダムフォレスト分析によって導き出された４個のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐ）の組み合わせが特に検出マーカーとして有用であることが立証され、前記４個のｍｉＲＮＡ組み合わせに１個のｌｎｃＲＮＡ（ＰＣＡ３）及び１個の融合遺伝子のｍＲＮＡ（ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ）を追加した組み合わせも検出マーカーとして有用であることが立証された。

以上の本発明の説明は例示的なものであり、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明の技術思想や本質的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解できるであろう。従って、上記で説明した実施例及び実験例は、すべての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解されるべきである。

ｍｉＲＮＡ：ＭｉｃｒｏＲＮＡ
ＰＣａ：前立腺癌
ＢＰＨ：前立腺肥大症
ＰＳＡ：前立腺特異抗原

Claims

ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することができる製剤を含む前立腺癌診断用組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_１２５ｂ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１７_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４１_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｃ_５ｐを含むものである前立腺癌診断用組成物。
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３７５、ｈｓａ_ｍｉＲ_２７ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１４６ａ_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２００ｂ_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_１１８５_２_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_３ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_３０ｂ_５ｐからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むものである請求項１に記載の前立腺癌診断用組成物。
ｌｎｃＲＮＡ及び融合遺伝子のｍＲＮＡからなる群から選択された少なくとも１つをさらに含む前立腺癌診断用組成物であり、
前記ｌｎｃＲＮＡが、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、
前記融合遺伝子のｍＲＮＡが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧである請求項１に記載の前立腺癌診断用組成物。
前記ｌｎｃＲＮＡが、ＰＣＡ３である請求項３に記載の前立腺癌診断用組成物。
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ_ｍｉＲ_２１_５ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_２４_３ｐ、ｈｓａ_ｍｉＲ_３０ａ_５ｐ及びｈｓａ_ｍｉＲ_２２２_３ｐからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むことである請求項１に記載の前立腺癌診断用組成物。
前記製剤は、ｍｉＲＮＡにそれぞれ特異的に結合するプライマー又はプローブを含むことを特徴とする請求項１、２及び５のいずれか１項に記載の前立腺癌診断用組成物。
ｍｉＲＮＡが、以下の表に記載の塩基配列からなることを特徴とする請求項６に記載の前立腺癌の診断用組成物：
前記製剤が、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡにそれぞれ特異的に結合するプライマー又はプローブを含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の前立腺癌診断用組成物。
ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ又は融合遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーが、以下の表に記載の塩基配列からなることを特徴とする請求項８に記載の前立腺癌診断用組成物：
前立腺癌診断のための情報を提供する方法であって、
対象体から分離された生物学的試料における請求項１、２及び５のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを正常対照群の試料のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する工程；
を；含む、方法。
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（競合ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ｄｄＰＣＲ（droplet digital PCR）、シークエンシング（sequencing）、ＲＮａｓｅ保護分析法（Rnase protection method）、ノーザンブロット法（Northern blotting）又は遺伝子チップ分析法によって測定されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記発現レベルを測定する工程は、
対象体から分離された生物学的試料から前記ｍｉＲＮＡを抽出する工程；
抽出されたｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程；
合成したｃＤＮＡに特異的なプライマー対を用いて、ｃＤＮＡを増幅する工程；及び
増幅されたｃＤＮＡを検出する工程；
を含む請求項１０に記載の方法。
前記生物学的試料が、組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿又は血清であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記生物学的試料が、尿であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程が、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト及び多層パーセプトロンからなる群から選択される機械学習アルゴリズムを用いて行われることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程が、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行われ、ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）値が０．６５以上であり、ＡＵＣ（曲線下面積）値が０．７０以上である請求項１０に記載の方法。
前記発現レベルを測定する工程が、
ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現を測定する工程をさらに含み、ここで、前記ｌｎｃＲＮＡが、ＰＣＡ３及びＭＡＬＡＴ１から選択される少なくとも１つであり、前記融合遺伝子のｍＲＮＡが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧであり、
前記発現レベルを比較する工程が、前記ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを正常対照群の試料のｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルと比較する工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（競合ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ｄｄＰＣＲ（droplet digital PCR）、シークエンシング（sequencing）、ＲＮａｓｅ保護分析法（RNase protection method）、ノーザンブロット法（Northern blotting）又は遺伝子チップ分析法によって測定されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
前記発現レベルを測定する工程は、
対象体から分離された生物学的試料において前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせを抽出する工程；
抽出されたｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせからｃＤＮＡを合成する工程；
合成したｃＤＮＡに特異的なプライマー対を用いてｃＤＮＡを増幅する工程；及び
増幅されたｃＤＮＡを検出する工程；
を含む請求項１７に記載の方法。
前記生物学的試料が、組織、細胞、尿、唾液、精液、全血、血漿又は血清であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
前記生物学的試料が、尿であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現を測定する工程は、ＬＲ（ロジスティック回帰）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、ランダムフォレスト及び多層パーセプトロンからなる群から選択される機械学習アルゴリズムを用いて行われることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡ、融合遺伝子のｍＲＮＡ又はそれらの組み合わせの発現レベルを比較する工程が、ＬＲ（ロジスティック回帰）を用いて行われ、ＬＯＯＣＶ（１つ抜き交差検証）値が０．６５以上であり、ＡＵＣ（曲線下面積）値が０．７０以上である請求項１７に記載の方法。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を含む、前立腺癌診断用キット。