JP2024519895A - 細胞を修飾する方法 - Google Patents

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Abstract

細胞を修飾する方法であって、前記方法は、トランスフェクション組成物を使用して修飾される細胞をトランスフェクトして、前記細胞が外因性遺伝子を含有および／または発現するようにし、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含み、前記外因性核酸分子の少なくとも一部は、宿主細胞から得られることと、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の部分において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下であることとを含む。【選択図】なし

Description

本出願は、生物医学の分野に関し、具体的には、細胞を修飾する方法に関する。
遺伝子修飾による細胞機能の向上は、細胞治療の治療効果を増加させる重要な手段である。現在、細胞治療の分野では、主にウイルスベクターを使用して細胞にトランスフェクトして、様々な分子の安定的な発現を実現し、それによって細胞治療の目的を達成する。しかしながら、ウイルスベクタートランスフェクションの設計時間が長く、調製工程が複雑で、試験期間が長く、コストが高い。同時に、ヒト宿主へのウイルス配列の導入は、宿主の免疫原性、挿入突然変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の誘発を引き起こし、予測不可能な安全上の危険を引き起こす可能性がある。
細胞治療の目的を達成するために、細胞形質転換または細胞トランスフェクションに非ウイルス系を使用する試みが報告されている。しかしながら、非ウイルス系によって媒介されるトランスフェクション効率が低く、トランスフェクトされた細胞に対して毒性が高く、トランスフェクトされた細胞の生存率に重大な影響を与える。特に、これまでのところ、免疫細胞、幹細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）等（特に初代細胞）の非ウイルストランスフェクションの場合、細胞毒性はさらに悪化し、高い細胞死率および低い増殖率をもたらし、さらにトランスフェクションの効率および生細胞の回収率等は、細胞治療に必要なレベルに達することはできない。既存の非ウイルス法の制限の下で、細胞治療に必要な細胞量を達成するには、インビトロで細胞の長期的指向性増殖を実行する必要がある。インビトロでの長期的指向性増幅では、細胞の表現型および機能が必然的に変化し、トランスフェクトされた細胞の細胞治療効果が大幅に制限される。
従って、上記の問題を改善するために、安全で、トランスフェクション効率が高く、細胞生存率が良好で、臨床治療に十分な細胞を短期間で生産できる非ウイルス細胞修飾法の開発が急務となっている。
本出願は、非ウイルス細胞トランスフェクション法を提供する。現在の非ウイルスプラスミドエレクトロポレーション技術が細胞をトランスフェクトする際の、トランスフェクション効率の低さ、外因性核酸分子の発現量の低さを、新規且つ大幅に改善し、トランスフェクトされた細胞の生存率が低く、増殖率が悪く、臨床細胞治療に必要な量の細胞を短期間に生産できないため、細胞治療に直接使用することは困難である。本出願の発明者らは、驚くべきことに、宿主から抽出したプラスミド中の残留宿主ゲノムＤＮＡが、既存の非ウイルスプラスミドによる細胞のエレクトロポレーションにおける困難の主な理由の一つであることを発見した。発明者らがこれらのプラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を減少させようとしたとき、驚くべきことに、当該最適化されたプラスミドを細胞にトランスフェクトする場合、細胞の増殖能力が大幅に向上し、数日という短期間で臨床治療に必要な数の細胞を生産することができ、外因性核酸分子の発現率も大幅に向上し、トランスフェクトされた細胞は、インビボで標的腫瘍細胞の増殖に対する阻害効果を著しく且つ特異的に増強することができることがわかる。
異なるドナーまたは異なるバッチの細胞をトランスフェクトする際の安定性および再現性は、細胞療法製品の製造において考慮すべき重要な要素である。本出願の発明者らは、トランスフェクト用のプラスミド中の宿主（例えば、微生物）のゲノムＤＮＡが閾値以下になる場合、トランスフェクション中の細胞生存率および発現率への悪影響がある程度軽減されるため、異なるバッチおよび不同ドナーソースからの細胞（例えば、Ｔ細胞）のトランスフェクションの効率が高いだけでなく、再現性および安定性も良好であり、トランスフェクトされた細胞が、インビボで標的腫瘍細胞の増殖を効率的且つ特異的に高い再現性で阻害することもできるため、効果的な細胞治療のために、腫瘍の臨床治療に必要な数の細胞を短期間で生産することが可能になることがわかる。この発明は、細胞をトランスフェクトするための非ウイルスＤＮＡプラスミドの使用を可能にし、細胞治療の分野において大きな適用の見通しを有する。発明者らは、トランスフェクション組成物中の宿主ゲノムＤＮＡを閾値まで減少させると、その細胞毒性も優位に減少することも発見した。本出願に記載の方法は、１）トランスフェクション効率の向上、２）遺伝子編集の編集効率の向上、３）ＤＮＡ相同組換え効率の向上、４）トランスフェクトされた細胞の細胞生存率（例えば、細胞生存率、細胞増殖能力、細胞殺傷能、細胞分泌能、細胞保存（特に凍結保存）能力および／または細胞蘇生能の向上）、細胞治療に必要なインビボでの特異的標的細胞殺傷能の向上、５）臨床治療に必要な数の細胞の迅速な調製、６）トランスフェクション組成物（例えば、ＤＮＡプラスミドを含む）の品質の（調製工程において）制御および／または判断、７）簡単な操作、８）低コスト、９）良好な再現性、１０）高い安全性等の一種または複数種の効果を有する。
一態様において、本出願は、細胞を修飾する方法を提供する。前記方法は、トランスフェクション組成物を使用して修飾される細胞をトランスフェクトして、前記細胞が外因性遺伝子を含有および／または発現するようにし、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含み、前記外因性核酸分子の少なくとも一部は、宿主細胞から得られることと、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の部分において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下であることとを含むことができる。
特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、真核細胞である。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、多能幹細胞（または多能性幹細胞）、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、免疫エフェクター細胞を含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球および／またはマスト細胞を含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、末梢血リンパ球を含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、初代細胞である。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、被験者由来の自己細胞である。
特定の実施形態において、トランスフェクトされた前記修飾される細胞は、活性化された細胞である。特定の実施形態において、前記活性化は、前記修飾される細胞と活性化組成物とを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記修飾される細胞は、免疫細胞を含み、前記活性化組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の実施形態において、前記活性化は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約３日間以内接触させることを含む。特定の実施形態において、前記方法は、前記トランスフェクトされる細胞と前記活性化組成物とを約２日間または２日間以内の期間接触させながら前記トランスフェクションを実施することを含む。
特定の実施形態において、前記トランスフェクトは、前記修飾される細胞をエレクトロポレーションすることを含む。
特定の実施形態において、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子は、プラスミドである。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、環状核酸分子、スーパーコイル核酸分子および／または直鎖状核酸分子を含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、一本鎖核酸分子および／または二本鎖核酸分子を含む。
特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約５μｇ／ｍＬ乃至約３０００μｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬである。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から抽出して取得される。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約３ｋｂである。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約４ｋｂである。
特定の実施形態において、前記宿主は、微生物宿主である。特定の実施形態において、前記宿主は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される。特定の実施形態において、前記宿主は、グラム陰性菌を含む。特定の実施形態において、前記宿主は、大腸菌を含む。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの大きさは、少なくとも約１０ｋｂである。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の約１０％（ｗ／ｗ）以下、例えば約１％（ｗ／ｗ）以下を占める。特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の約９‰（ｗ／ｗ）以下、例えば、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、１‰（ｗ／ｗ）以下を占める。
本出願の方法の特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定される。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡは、前記外因性核酸分子部分に含まれない。
特定の実施形態において、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分は、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が減少するように処理される。
特定の実施形態において、前記方法は、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、当該含有量に応じて、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させるように当該外因性核酸分子部分を処理するかどうかを判断することをさらに含む。
例えば、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の約１０％（ｗ／ｗ）（例えば、約９％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約９‰（ｗ／ｗ）、約８‰（ｗ／ｗ）、約７‰（ｗ／ｗ）、約６‰（ｗ／ｗ）、約５‰（ｗ／ｗ）、約４．５‰（ｗ／ｗ）、約４‰（ｗ／ｗ）、約３．５‰（ｗ／ｗ）、約３‰（ｗ／ｗ）、約２．５‰（ｗ／ｗ）、約２‰（ｗ／ｗ）、約１．５‰（ｗ／ｗ）、約１‰（ｗ／ｗ）、約０．５‰（ｗ／ｗ）、約０．１‰（ｗ／ｗ）、約０．０１‰（ｗ／ｗ）、約０．００１‰（ｗ／ｗ））以上を占める場合、前記処理を実施する。
特定の実施形態において、前記方法は、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１０％（ｗ／ｗ）（例えば、約９％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約９‰（ｗ／ｗ）、約８‰（ｗ／ｗ）、約７‰（ｗ／ｗ）、約６‰（ｗ／ｗ）、約５‰（ｗ／ｗ）、約４．５‰（ｗ／ｗ）、約４‰（ｗ／ｗ）、約３．５‰（ｗ／ｗ）、約３‰（ｗ／ｗ）、約２．５‰（ｗ／ｗ）、約２‰（ｗ／ｗ）、約１．５‰（ｗ／ｗ）、約１‰（ｗ／ｗ）、約０．５‰（ｗ／ｗ）、約０．１‰（ｗ／ｗ）、約０．０１‰（ｗ／ｗ）、約０．００１‰（ｗ／ｗ））またはそれ以上である場合、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が減少するように当該外因性核酸分子部分を処理することをさらに含む。
特定の実施形態において、前記処理は、前記外因性核酸分子部分と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一つまたは複数の試薬とを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記外因性核酸分子部分と前記試薬とを接触させることを含む。
特定の実施形態において、前記外因性遺伝子は、一種または複数種の外因性タンパク質をコードする。特定の実施形態において、前記外因性タンパク質は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよびケモカインからなる群のうちの一種または複数種を含む。
特定の実施形態において、前記ＣＡＲは、腫瘍関連抗原を標的とする標的結合ドメインを含む。特定の実施形態において、前記腫瘍関連抗原は、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２およびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎから選択される。特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。特定の実施形態において、前記ＢｉＴＥは、ＣＤ３結合ドメインを含む。特定の実施形態において、前記ＢｉＴＥは、腫瘍関連抗原結合ドメインをさらに含む。
特定の実施形態において、前記サイトカインは、インターロイキンを含む。特定の実施形態において、前記インターロイキンは、ＩＬ１５、ＩＬ７またはそれらの機能的活性断片を含む。
特定の実施形態において、前記ケモカインは、ＣＣＬ１９またはその機能的活性断片を含む。
特定の実施形態において、前記外因性タンパク質は、ポリタンパク質を含む。特定の実施形態において、前記ポリタンパク質中の二つまたはそれ以上のタンパク質の間には、分解可能部分が含まれる。特定の実施形態において、前記分解可能部分は、２Ａペプチドを含む。特定の実施形態において、前記２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＥ２Ａを含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、一つまたは複数の相同領域をさらに含む。特定の実施形態において、前記相同領域のそれぞれは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子において、前記相同領域は、前記外因性遺伝子の３’末端および／または５’末端に位置する。
特定の実施形態において、前記外因性遺伝子は、前記細胞のゲノムに組み込まれる。
特定の実施形態において、前記外因性遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれた後、その発現は、内因性プロモーターまたは外因性プロモーターによって制御される。
特定の実施形態において、前記相同領域は、前記細胞ゲノムＤＮＡの標的領域と相同である。特定の実施形態において、前記標的領域は、ＴＣＲ－αサブユニット定常（ＴＲＡＣ）遺伝子中に位置されるか、またはＡＡＶＳ－Ｉ部位に位置される。
特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、ウイルスベクターを含まない。
特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を前記細胞ゲノムの特定の位置に組み込ませることができる遺伝子編集システムをさらに含む。特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、部位特異的酵素またはそれをコードする核酸分子を含む。特定の実施形態において、前記部位特異的酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、トランスポザーゼ、インテグラーゼおよびＣａｓタンパク質から選択される。特定の実施形態において、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態において、前記トランスポザーゼは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ、および／またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼを含む。
特定の実施形態において、前記遺伝子編集は、前記細胞中の一つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることをさらに含む。ノックアウトされた前記遺伝子は、ＰＤ－１および／またはＣＤ９５を含むことができる。
特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含む。
例えば、前記遺伝子編集システムは、ノックアウトされる遺伝子を標的とする一種または複数種のガイドＲＮＡを含むことができる。例えば、前記遺伝子編集システムは、前記ＰＤ－１を標的とするガイドＲＮＡを含むことができる。例えば、前記遺伝子編集システムは、前記ＣＤ９５を標的とするガイドＲＮＡを含むことができる。
特定の実施形態において、前記ガイドＲＮＡは、前記細胞ゲノムの標的領域中の核酸配列に相補的である。特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、リボ核タンパク質複合体ＲＮＰを含み、前記ＲＮＰは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡを含む。
別の態様において、本出願は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法を提供し、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含む。
特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、真核細胞である。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、多能性幹細胞、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、免疫エフェクター細胞を含む。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球および／またはマスト細胞を含む。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、末梢血リンパ球を含む。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、初代細胞である。特定の実施形態において、トランスフェクトされる前記細胞は、被験者由来の自己細胞である。
特定の実施形態において、トランスフェクトされた前記修飾される細胞は、活性化された細胞である。特定の実施形態において、前記活性化は、前記修飾される細胞と活性化組成物とを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記細胞は、免疫細胞を含み、前記活性化組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の実施形態において、前記活性化は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約４日間以内接触させることを含む。
特定の実施形態において、前記方法は、前記トランスフェクトされる細胞と前記活性化組成物とを約２日間または２日間以内の期間接触させながら前記トランスフェクションを実施することを含む。
特定の実施形態において、前記トランスフェクトは、前記修飾される細胞をエレクトロポレーションすることを含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、プラスミドである。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、環状核酸分子、スーパーコイル核酸分子および／または直鎖状核酸分子を含む。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含む。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、一本鎖核酸分子および／または二本鎖核酸分子を含む。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約５μｇ／ｍＬ乃至約３０００μｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から抽出して取得される。特定の実施形態において、前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約３ｋｂである。
特定の実施形態において、前記宿主は、微生物宿主である。特定の実施形態において、前記宿主は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される。特定の実施形態において、前記宿主は、グラム陰性菌を含む。特定の実施形態において、前記宿主は、大腸菌を含む。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの大きさは、少なくとも約１０ｋｂである。
特定の実施形態において、前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下である。特定の実施形態において、前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１％（ｗ／ｗ）以下である。特定の実施形態において、前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約９‰（ｗ／ｗ）以下である。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定される。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることは、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種の試薬とを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることは、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子と前記試薬とを接触させることを含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、本出願のいずれかの態様に記載の外因性遺伝子を含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、本出願のいずれかの態様に記載の一つまたは複数の相同領域をさらに含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、ウイルスベクターを含まない。
特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を前記細胞ゲノムの特定の位置に組み込ませることができる遺伝子編集システムをさらに含む。特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
別の態様において、本出願は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法を提供し、前記方法は、前記外因性核酸分子をＤＮａｓｅで処理することを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記外因性核酸分子と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含む。
特定の実施形態において、前記トランスフェクトは、前記細胞をエレクトロポレーションすることを含む。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
特定の実施形態において、前記細胞は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための方法を提供し、前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含む。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。特定の実施形態において、前記宿主は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
特定の実施形態において、前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下である。特定の実施形態において、前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１％（ｗ／ｗ）以下である。特定の実施形態において、前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約９‰（ｗ／ｗ）以下である。特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定される。
特定の実施形態において、前記最適化は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種の試薬とを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記最適化は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と前記試薬とを接触させることを含む。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための方法を提供し、前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分をＤＮａｓｅで処理することを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含む。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物の品質を判断するための方法を提供し、前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、当該含有量に応じて、前記トランスフェクション組成物の品質を判断することを含む。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。特定の実施形態において、前記宿主は、本出願のいずれかの態様に記載されたとおりである。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１０％（ｗ／ｗ）以下である場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断される。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１％（ｗ／ｗ）以下である場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断される。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約９‰（ｗ／ｗ）以下である場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断される。
特定の実施形態において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定される。
特定の実施形態において、本出願に記載の方法は、インビトロ法またはエクスビボ法である。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための、前述の試薬（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび／または塩化セシウム－臭化エチジウム）の用途を提供する。
別の態様において、本出願は、細胞トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）用のキットを提供する。前記キットは、１）本出願のいずれかの態様に記載の宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および２）前記宿主細胞のゲノムＤＮＡを減少または分解できる試薬とを含む。特定の実施形態において、２）の前記試薬は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種を含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記キットは、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む試薬を含む。
別の態様において、本出願は、キットを提供し、前記キットは、１）本出願のいずれかの態様に記載の宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および２）本出願の方法により１）の前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を処理するか、および／または本出願の方法により前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含むトランスフェクション組成物の品質を判断する取扱説明書とを含む。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって処理された外因性核酸分子を含むトランスフェクション組成物を提供する。
別の態様において、本出願は、本出願に記載のトランスフェクション組成物によってトランスフェクトされた細胞を提供する。特定の実施形態において、前記トランスフェクトは、前記細胞をエレクトロポレーションすることを含む。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって修飾された細胞を提供する。
別の態様において、本出願は、細胞集団を提供し、それは、本出願に記載の細胞および／またはその子孫を含む。
別の態様において、本出願は、医薬組成物を提供し、それは、本出願に記載のトランスフェクション組成物、本出願に記載の細胞、および／または本出願に記載の細胞集団を含む。特定の実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む。
別の態様において、本出願は、本出願に記載のトランスフェクション組成物、薬物の調製に使用される、本出願に記載の細胞、本出願に記載の細胞集団、および／または本出願に記載の医薬組成物の用途を提供する。特定の実施形態において、前記薬物は、癌を予防、治療および／または緩和するために使用される。特定の実施形態において、前記薬物は、免疫応答を調節するために使用される。
別の態様において、本出願は、被験者の疾患または病症を予防、治療および／または緩和するための方法を提供し、前記方法は、前記被験者に有効量の本出願に記載のトランスフェクション組成物、本出願に記載の細胞、本出願に記載の細胞集団、および／または本出願に記載の医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、前記疾患または病症は、癌である。特定の実施形態において、前記疾患または病症は、前記被験者における免疫応答に関連する。
当業者は、以下の詳細な説明から、本出願の他の態様および利点を容易に認識することができる。以下の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が理解するように、本出願の内容により、当業者は、本出願が関連する発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態に変化を加えることができる。対応的に、本出願の図面および明細書における説明は、限定的なものではなく単なる例示的なものである。
本出願に言及される発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されたとおりである。以下の詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照することにより、本出願に言及される発明の特徴および利点をよりよく理解することができる。添付図面の簡単な説明は、次のとおりである。
様々なソースからのプラスミドの複数のパラメーターの検出結果を示す。 様々なソースからのプラスミドにおける宿主ゲノムＤＮＡ由来の含有量の測定を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の生存率、細胞増殖能および細胞発現タンパク質能の検出を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の生存率、細胞増殖能および細胞発現タンパク質能の検出を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の生存率、細胞増殖能および細胞発現タンパク質能の検出を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドトを細胞にランスフェクトした後の細胞の生存率および発現タンパク質能（即ち、包括的な発現量）の検出を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の検出の結果を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の検出の結果を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の検出の結果を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲＴのインビトロ腫瘍細胞に対する殺傷能力の検出の結果を示す。 様々な含有量の宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲＴのインビボ非固形腫瘍細胞に対する殺傷能力の検出の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能の結果、ならびに当該プラスミドを用いて調製したＣＡＲＴによる腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能の結果、ならびに当該プラスミドを用いて調製したＣＡＲＴによる腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能の結果、ならびに当該プラスミドを用いて調製したＣＡＲＴによる腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞生存率、細胞増殖能およびタンパク質発現能の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲおよびＢｉＴＥを発現する細胞による腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲおよびＢｉＴＥを発現する細胞の培養上清液による腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲおよびＢｉＴＥを発現する細胞によるインビボでの腫瘍細胞の特異的殺傷の結果を示す。 プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を減少させると、当該プラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞の増殖能および細胞のタンパク質発現能を優位に向上させることができることを示す。 プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を減少させると、当該プラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞の増殖能および細胞のタンパク質発現能を優位に向上させることができることを示す。 プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を減少させると、当該プラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞の増殖能および細胞のタンパク質発現能を優位に向上させることができることを示す。 プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を減少させると、当該プラスミドを細胞にトランスフェクトした後の細胞の生存率、細胞の増殖能および細胞のタンパク質発現能を優位に向上させることができることを示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲおよびＩＬ１５を発現する細胞によるインビボでの腫瘍阻害効果を示す。 外因性遺伝子がＡＡＶＳ－Ｉ部位に組み込まれる場合の、より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲおよびＩＬ１５を発現する細胞によるインビボでの腫瘍阻害効果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドを用いて調製したＣＡＲ、ＩＬ７およびＣＣＬ１９を発現する細胞による、インビボでの腫瘍阻害効果を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで非活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで非活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで非活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで非活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドで活性化Ｔ細胞をトランスフェクトするトランスフェクション効率を示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでＴ細胞をトランスフェクトした後、同時にＣＡＲを発現し、且つＣＤ９５およびＰＤ－１をノックアウトしたＴ細胞が、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができることを示す。 より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでＴ細胞をトランスフェクトした後、同時にＣＡＲを発現し、且つＣＤ９５およびＰＤ－１をノックアウトしたＴ細胞が、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができることを示す。
以下、特定の具体的な実施例により本願発明の実施形態について説明するが、当業者であれば本明細書で開示された内容から本願発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。
用語の定義
本出願において、「トランスフェクション効率」という用語は、一般に、トランスフェクションを受ける細胞に導入される、および／または当該トランスフェクションを受ける細胞によって発現される材料の相対量を指す。本出願において、前記トランスフェクションは、細胞への一種または複数種の材料（例えば、ポリヌクレオチド）の導入を指すことができる。導入された材料は、当該トランスフェクション中の細胞に安定的にまたは一時的に維持される。本出願において、前記トランスフェクション効率は、前記導入された材料の量によって測定されることができる。
本出願において、「デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）」という用語は、一般に、ＤＮＡ骨格上のホスホジエステル結合を切断できる酵素を指す。前記ＤＮａｓｅは、ヌクレアーゼの一種であり得る。前記ＤＮａｓｅは、（例えば、弱アルカリ性条件下で）二本鎖ＤＮＡをデオキシヌクレオチドに消化できる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、環状核酸分子またはスーパーコイル核酸分子またはその断片（例えば、閉じた二本鎖ＤＮＡおよび／またはスーパーコイルＤＮＡ）に対して実質的に不活性であり得る（例えば、それに対して切断できない）。例えば、前記ＤＮａｓｅは、直鎖状の二本鎖ＤＮＡを切断できる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、ＤＮＡエキソヌクレアーゼであり得る。例えば、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼＶであり得る。例えば、前記ＤＮａｓｅは、ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅであり得、例えばＰｌａｓｍｉｄ－ＳａｆｅTM ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅであり得る。
本出願において、「核酸分子またはその断片」という用語は、一般に、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボ核酸および／または前述の両方の修飾形態）またはその断片を指す。前記核酸分子またはその断片は、ヌクレオチドのポリマー形態またはその断片を含むことができる。前記核酸分子またはその断片は、場合によっては「ポリヌクレオチド」と交換的に使用されることができる。前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖、ならびにその合成形態、混合物および／またはポリマーを含むことができる。前記核酸分子またはその断片は、任意のトポロジカル立体構造を含むことができ、例えば一本鎖、二本鎖、二本鎖の一部、三本鎖化、ヘアピン構造、環形および／または南京錠立体構造を含むことができる。前記核酸分子またはその断片中のヌクレオチドは、天然のものであっても、修飾されたものであってもよい。前記核酸分子またはその断片中のヌクレオチドの間は、天然に存在する、および／または非天然に存在するヌクレオチド結合によって一緒に結合されることができる。
本出願において、「外因性核酸分子」という用語は、一般に、生物、組織または細胞の内部で直接生成されない核酸分子を指す。例えば、当該核酸分子は、何らかの形で、生物、組織または細胞の外部から内部に導入される。当該核酸分子の構造、組成または機能は、内因的に発現される対応する核酸分子と同じであっても、異なっていてもよい。例えば、場合によっては、当該外因性核酸分子は、内因的に発現される対応する核酸分子と同じヌクレオチド配列を有することができる。場合によっては、当該外因性核酸分子は、内因的に発現されるいかなる核酸分子とも同一ではない。
本出願において、「トランスフェクション組成物」という用語は、「トランスフェクション混合物」と交換可能に使用され、一般にトランスフェクションに必要な混合物を指す。本出願において、前記トランスフェクション混合物は、導入されることが望ましい一種または複数種の材料（例えば、ポリヌクレオチドまたは外因性核酸分子）を含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、トランスフェクトされる外因性遺伝子をコードする外因性核酸分子を含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、前記核酸分子を含むベクター含むことができる。例えば、前記トランスフェクション混合物は、不純物をさらに含むことができる（場合によっては、前記不純物は、核酸分子またはその断片を含むことができる）。本出願において、前記不純物は、微生物由来の核酸分子またはその断片を含むことができる。前記ベクターによって担持される不純物は、前記ベクターによって担持される不純物を含むことができる（例えば、前記ベクターの骨格に対して同種または異種の核酸分子またはその断片）。
本出願において、「総核酸分子含有量」および「総ＤＮＡ量」という用語は、交換可能に使用され、一般に前記トランスフェクション混合物中のヌクレオチドを有するすべての物質の総物質を指す。例えば、前記ヌクレオチドを有する物質は、前記核酸分子またはその断片および前記材料を含むことができる。
本出願において、「遺伝子編集の編集効率」という用語は、一般に、前記遺伝子編集処理されたすべての核酸分子のうち、遺伝子編集手段により標的位置で切断された核酸分子の割合を指す。前記遺伝子編集の編集効率は、当該標的位置に作用する前記遺伝子編集の能力を反映することができる。
本出願において、「ＤＮＡ相同組換え効率」という用語は、一般に、ＤＮＡ相同組換えに使用された個体の総数に対するＤＮＡ相同組換えを受ける個体（例えば、細胞の数）の割合を指す。前記ＤＮＡ相同組換え効率は、遺伝子シーケンシングおよび対応するタンパク質の発現の検出等の手段によって検証されることができる。
本出願において、「細胞生存率」という用語は、一般に、特定の条件下で細胞が生存および／または生物学的機能（例えば、分裂、増殖、分泌、殺傷、保存および／または蘇生）を実行する能力を指す。場合によっては、前記細胞生存率は、特定の時間および条件における生存細胞と死細胞の総数に対する生存細胞の比率によって測定されることができる。本出願において、細胞生存率は、特定の時間および条件における細胞の総数に対する、特定の生物学的機能および／または活性を有する細胞の比率によって測定されることができる。
本出願において、「宿主」という用語は、一般に、トランスフェクトされる外因性核酸分子を携帯、増幅または生成する生物を指し、例えば微生物または哺乳動物細胞等の宿主細胞を含むことができる。
本出願において、「微生物」という用語は、一般に、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および／または真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）のドメインに属する真核生物および原核生物の微生物種を指す。例えば、前記微生物は、細菌、ウイルス、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジアおよび／またはスピロヘータを含むことができる。本出願において、細菌という用語は、一般に、原核生物界内のすべての門の原核生物を含む、あらゆる種類の原核生物を指す。前記細菌は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストを含むことができる。前記細菌は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含むことができる。「グラム陰性」および「グラム陽性」とは、当技術分野で周知のグラム染色法を使用した染色パターンを指す（例えば、ＦｉｎｅｇｏｌｄおよびＭａｒｔｉｎ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（診断微生物学）、第６版、ＣＶ Ｍｏｓｂｙ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、１３－１５ページ（１９８２）を参照する）。
本出願において、「宿主細胞のゲノムＤＮＡ」という用語は、一般に、宿主細胞のゲノムＤＮＡ分子またはその断片を指す。
本出願において、「宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片」という用語は、「宿主ゲノムＤＮＡ」と交換可能に使用され、一般に、前記微生物のゲノムに由来する核酸分子または核酸分子の断片を指す。宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する情報は、Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｅａｒｔｈ’ｓ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０２０）を参照することができる。
本出願において、「グラム陰性菌」という用語は、一般に、グラム染色で使用される一次染料を保持しないが、対比染色によって染色される細菌を指す。従って、グラム陰性菌は、一般に、グラム染色法では赤く見える。前記グラム陰性菌の細胞壁におけるペプチドグリカンの含有量は、比較的に低く、脂質の含有量は、比較的に高い。例えば、前記グラム陰性菌の細胞壁は、リポ多糖の層を有することができる。例えば、前記グラム陰性菌は、大腸菌、緑膿菌、プロテウス、赤癬菌、肺炎桿菌、ブルセラ菌、インフルエンザ（ヘモフィルス）菌、パラインフルエンザ（ヘモフィルス）菌、カタルリス（モラ）菌、アシネトバクター属、エルシニア、レジオネラニューモフィラ、百日咳菌、パラ百日咳菌、赤癬菌、パスツレラ属、コレラ菌、腸炎菌および／または赤血球菌を含むことができる。
本出願において、「大腸菌」という用語は、一般に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを指す。大腸菌は、腸内細菌科のエシェリヒア属に属する。
本出願において、「一過性トランスフェクト」という用語は、一般に、トランスフェクションによって細胞に侵入した外因性遺伝子が前記細胞自身のゲノムも組み込まれないトランスフェクションの様式を指す。前記一過性トランスフェクションは、外因性遺伝子の短期間（例えば、少なくとも約１日、少なくとも約２日）の迅速な発現を実現することができる。前記一過性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトされた外因性遺伝子は、細胞が成長および／または分裂するにつれて徐々に失われる可能性がある。前記一過性トランスフェクトは、簡単な操作、短い試験期間、高い発現効率、安全性および遺伝子スクリーニングする必要がない等からなる群から選択される利点を有することができる。前記一過性トランスフェクションの操作段階は、当業者に知られている。例えば、前記一過性トランスフェクションは、リポソーム媒介トランスフェクション法によって行うことができる。例えば、前記一過性トランスフェクションは、エレクトロポレーショントランスフェクション法を含むことができる。前記一過性トランスフェクションは、トランスフェクション試薬を使用することができ、例えばＦｕＧＥＮＥ６を使用することができる。
本出願において、「安定トランスフェクション」という用語は、一般に、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外因性核酸分子の導入および組み込みを指す。例えば、前記外因性遺伝子をトランスフェクトされた細胞のゲノムに組み込む。
本出願において、「幹細胞」という用語は、一般に、分化した細胞および組織を形成する可能性を様々な程度に保持しながら、自己複製する能力を有する未分化の細胞を指す。前記幹細胞は、アネルギー性幹細胞、多能性幹細胞または全能性幹細胞であり得る。ここで、前記アネルギー性幹細胞は、分化能力を失った派生幹細胞である。前記全能性幹細胞は、生物全体にみられるすべての細胞組織を形成することができる。例えば、前記全能性幹細胞は、生物全体を形成することができる。
本出願において、「多能幹細胞」という用語は、「多能性幹細胞」と交換可能に使用され、一般に、最終的に完全な生物体にみられる細胞および組織を形成する能力があるが、完全な生物体を形成することはできない幹細胞を指す。例えば、前記多能性幹細胞は、未分化状態を維持し、正常な核型（染色体）を示しながら、インビトロで長期間に増殖するか、または事実上無制限に増殖することができる。前記多能性幹細胞は、適切な条件下で三つの胚葉すべて（外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化する能力を有する可能性がある。例えば、前記多能性幹細胞は、初期胚から分離されたＥＳ細胞および／または胎児の始原生殖細胞から分離されたＥＧ細胞を含むことができる。
本出願において、「間葉系幹細胞」という用語は、一般に、間葉系譜を生じさせることができる細胞を指す。前記間葉系幹細胞は、前記多能性幹細胞に属すると考えることができる。前記間葉系幹細胞は、一種または複数種の間葉系譜の細胞を生じさせることができる。前記間葉系譜の細胞は、異なる組織に由来してもよく、例えば、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、生殖組織（例えば、羊膜、羊水または臍帯組織）、皮膚組織、骨組織および／または歯組織に由来してもよい。
本出願において、「免疫細胞」という用語は、一般に、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。前記免疫細胞は、リンパ球、単球および／または顆粒球、ならびにそれらの前駆体および／または成熟誘導体を含むことができる。前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔｈ細胞、天然殺傷細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞および／または顆粒球を含むことができる。前記免疫細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。前記免疫エフェクター細胞は、免疫応答に関与することができ、例えば免疫エフェクター応答を促進することができる。前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、例えば、α／βＴ細胞およびγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、天然殺傷（ＮＫ）細胞、天然殺傷Ｔ（ＮＴＫ）細胞、マスト細胞および骨髄由来の食細胞を含むことができる。
本出願において、「ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）」という用語は、一般に、機能的に活性ではない線維芽細胞を指す。前記ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）は、線維芽細胞（例えば、組織が損傷した場合に修復プロセスに参加することができる）に変換することができる。前記線維芽細胞（線維芽細胞とも呼ばれる）は、細胞外マトリックスを構成する構造タンパク質を分泌することができる。前記線維芽細胞は、創傷治癒や線維化等の生理学的または病理学的プロセスに密接に関連する可能性がある。
本出願において、「筋細胞」という用語は、一般に、筋肉に由来する細胞または細胞集団を指す。前記筋細胞は、骨格筋、平滑筋（例えば、消化管、膀胱および血管由来）および心筋の細胞および組織に由来することができる。前記筋細胞は、インビトロおよびインビボの筋細胞を含むことができる。前記筋細胞は、筋細胞（例えば、筋管）、分裂および分化筋芽細胞、心筋細胞および心筋芽細胞等の分化および未分化に由来する筋細胞および筋肉組織をさらに含むことができる。
本出願において、「プラスミド」という用語は、一般に、遺伝物質を含む構築物を指す。前記プラスミドは、遺伝物質（例えば、一つまたは複数の核酸配列）を細胞内に送達するように設計することができる。前記プラスミドは、任意の供給源からの一本鎖または二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に由来する自律複製配列を含むことができる。前記プラスミドは、本出願において「ベクター」という用語と交換可能に使用されることができる。前記プラスミドは、異なる構成を有することができ、例えば直鎖状プラスミド、環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドであり得る。前記直鎖状プラスミドは、線状ＤＮＡ分子であってもよい。前記スーパーコイルプラスミドは、完全な構造を維持する２本の核酸鎖を含むことができ（例えば、共有結合環形ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡを含むことができる）、スーパーコイル構造になっている。前記環状プラスミドは、少なくとも一つの核酸鎖について完全な環状構造を維持することができる。前記プラスミドは、細胞のゲノムに組み込まれない場合がある。
本出願において、「マルチクローニング部位」または「ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＭＣＳ」という用語は、一般に、少なくとも一つの制限部位を含む核酸配列を指す。前記マルチクローニング部位は、核酸分子を本出願に記載のベクターに接続することができ、例えば前記制限部位を介して指定された部位への核酸分子の挿入を実現することができる。前記は、制限性エンドヌクレアーゼ識別部位であってもよい。例えば、前記制限性エンドヌクレアーゼは、ＡｃｌＵＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｓｐｌ、ＭＬｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｐｃｉｌ、ＡｇｅＫＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭＬｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂａｅｌ、ＢｓａＸＩ、ＳｐｅＩ、Ｂｓｒｌ、Ｂｍｒｌ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、Ａｌｕｌ、ＳｔｕＩ、Ｓｅａｌ、Ｃｌａｌ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、Ａｓｅｌ、Ｓｗａｌ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍＬｌ、Ｄｒａｌｌｌ、Ａｌｅｌ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩまたはＢｔｓＭｕｔＩであり得る。
本出願において、「外因性プロモーター」という用語は、一般に、それが存在する宿主に由来しないプロモーターを指す。前記外因性プロモーターは、その宿主の細胞（例えば、前記細胞のゲノム）にトランスフェクトおよび／または挿入されることができる。前記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の識別部位であり得る。前記ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの構築を効果的に触媒することができる。前記プロモーターの数は、一つまたは複数であり得る。
本出願において、「遺伝子編集」という用語は、一般に、ゲノム内での核酸の挿入、欠失および／または置換の操作を指す。前記遺伝子編集は、相同性指向修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または単一塩基の変更によって実現することができる。前記遺伝子編集は、当業者によく知られた遺伝子編集ツールを使用することができ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼシステム（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮシステムおよび／またはＣＲＩＳＰＲ技術を使用することができる。
本出願において、「遺伝子編集ノックイン」という用語は、一般に、遺伝子操作プロセス（例えば、ｋｎｏｃｋ－ｉｎとも呼ばれることもある）を指し、当該プロセスは、遺伝子座のＤＮＡ配列情報の１対１の置換または内因性部位内に見つからない配列情報の挿入を含む。前記遺伝子編集ノックインは、遺伝子の相同組換えを使用することができる。例えば、場合によっては、遺伝子の相同組換えを使用すると、外因性機能性遺伝子（ゲノムにはもともと存在しないか、または不活性化された遺伝子）を細胞に導入し、且つゲノム内の相同配列と相同組換えを実行して、それらをゲノムに挿入し、且つ細胞内で発現させることができる。例えば、前記遺伝子編集ノックインは、細胞ゲノムを少なくとも部分的に外因性遺伝子で置換することができる。前記遺伝子編集ノックインは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、部位特異的な「標的ノックイン」を実現することができる。別の例として、前記遺伝子編集ノックインは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ、および／またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ等のトランスポゾンおよびトランスポザーゼシステムを使用することができる。
本出願において、「ドナープラスミド」という用語は、一般に、導入された細胞においてコードされた外因性遺伝子を転写および／または翻訳できるプラスミドを指す。例えば、前記ドナープラスミドは、前記遺伝子編集ノックインに適する可能性がある。例えば、前記ドナープラスミドは、前記外因性遺伝子をコードする核酸分子を含むことができる。前記ドナープラスミドは、前記外因性遺伝子の発現（例えば、転写レベルおよび／または翻訳レベルで生成および／または蓄積が発生する）を調節するためのプロモーター等のエレメントを含んでもよい。前記ドナープラスミドは、真核の発現系に適したプラスミドであり得る。
本出願において、「ノックインされる外因性遺伝子」という用語は、一般に、遺伝子編集ノックインの方法によって導入可能な遺伝子を指す。前記ノックインされる外因性遺伝子は、導入された対象（例えば、細胞、例えば被験者体内）に組み込まれることができる。前記ノックインされる外因性遺伝子は、導入された対象のゲノムに組み込まれることを含むことができる。前記ノックインされる外因性遺伝子は、異なる種に由来する天然の遺伝子であってもよく、改変された遺伝子（例えば、キメラ遺伝子であり得る）であってもよい。
本出願において、「抗体」という用語は、一般に、指定のタンパク質またはペプチドまたはその断片と反応する免疫グロブリンを指す。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むが、これらに限定されない任意のクラスからの抗体、ならびに任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からの抗体であり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えば、ｋａｐｐａ（κ）またはｌａｍｂｄａ（λ）から選択される軽鎖を有することができる。本出願の抗体は、任意の種に由来することができる。
本出願において、「抗原結合断片」という用語は、一般に、抗体分子の一部を指し、当該部分は、アミノ酸残基を含み、当該アミノ酸残基は、抗原と相互作用し、且つ抗原に対する抗体に特異性および親和性を与える。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含むことができるが、これらに限定されない。本出願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般に、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む断片を指し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）をさらに含み、「Ｆａｂ’」という用語は、一般に、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に少量の残基（抗体ヒンジ領域からの一つまたは複数のシステインを含む）を添加することによってＦａｂとは異なる断片を指し、「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、一般に、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された二つのＦａｂ断片を含む抗体断片であるＦａｂ’の二量体を指す。「Ｆｖ」という用語は、一般に、完全な抗原識別および結合部位を含む最小の抗体断片を指す。特定の状況において、当該断片は、密接な非共有結合による一つの重鎖可変領域および一つの軽鎖可変領域の二量体から構成されることができ、「ｄｓＦｖ」という用語は、一般に、単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との間の結合がジスルフィド結合であるジスルフィド結合で安定されたＦｖ断片を指す。「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す。本出願において、「ｓｃＦｖ」という用語は、一般に、抗体の一つの重鎖可変ドメインおよび一つの軽鎖可変ドメインを、柔軟なペプチドリンカーを介して対にすることによって形成される一価分子を指し、このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有することができる。
本出願において、「二重特異性抗体」という用語は、一般に、一種または複数種の抗原上の一つ以上のエピトープを識別する可変領域を有する抗体を指す。二重特異性抗体は、全長抗体、二つまたはそれ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等の抗体断片、共有結合または非共有結合した抗体断片を含むが、これらに限定されない。場合によっては、前記二重特異性抗体は、同じまたは異なる抗原上の二つの種の異なるエピトープを識別することができる。場合によっては、前記二重特異性抗体は、二つの異なる抗原を識別することができる。本出願において、多重特異性抗体は、二重特異性もしくは三特異性抗体、またはそれらの抗原結合断片を含む。
本出願において、「抗原結合ドメイン」という用語は、一般に、標的抗原に結合できるドメインを指す。抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合できる抗体と抗原受容体およびその断片、抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に結合できるドメインであり得、本出願において、前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、Ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ＭＡＧ３、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎおよびＮＹ－ＥＳＯ－１を含むことができるが、これらに限定されない。
本出願において、「キメラ抗原受容体」という用語は、一般に、抗原に結合できる細胞外ドメインおよび少なくとも一つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＣＡＲは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の中心成分であり、それは、抗原（例えば、腫瘍特異抗原および／または腫瘍関連抗原）結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナルドメインを含むことができる。本出願において、前記ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせた抗体の抗原（例えば、ＣＤ１９）特異性に基づくことができる。ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾されたＴ細胞は、標的抗原を発現する悪性細胞を特異的に認識して排除することができる。ＣＡＲおよびＣＡＲ－Ｔ細胞の説明については、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｒ、Ｒｉｖｉ ｀ｅｒｅ Ｉ．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３、３（４）：３８８－３９８、Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ、Ｈｕｄｅｃｅｋ Ｍ、Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ、Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２、２４（５）：６３３－６３９、Ｄｏｔｔｉ Ｇ、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｓ、Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ、Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＫ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４、２５７（１）：１０７－１２６を参照することができる。
本出願において、「ＢｉＴＥ」という用語は、一般に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）を指す。前記ＢｉＴＥは、二つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子であり得、この二つの抗原結合ドメインのうちの一つは、Ｔ細胞抗原に結合し、且つその２番目は、標的細胞の表面に存在する抗原に結合する（Ｗ００５／０６１５４７、Ｂａｅｕｅｒｌｅ、Ｐら（２００８）「ＢｉＴＥ(R)：Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３３：１３７－１４７、またはＢａｒｇｏｕら（２００８）「Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ／’Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９７４－９７７を参照することができる）。
本出願において、「ポリタンパク質」という用語は、一般に、複数のタンパク質分子を含むポリペプチド鎖を指し、前記複数のタンパク質分子は、前記ポリペプチド鎖中にタンデムに存在することができる。前記ポリペプチド鎖において、任意の二つのタンパク質分子間は、任意選択で、分解可能な部分（例えば、２Ａペプチド）によって隔離される。
本出願において、「相同性アーム」という用語は、一般に、相同組換えを通じて、ドナープラスミドにおいてゲノムにノックインされる外因性遺伝子を標的とするのに適したポリヌクレオチドを指す。前記相同組換えは、姉妹染色分体（ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）間または同じ染色体で相同配列を含むＤＮＡ分子間もしくは分子内での組換えを指すことができる。二つの前記相同性アームが存在することができる（例えば、５’相同性アームおよび／または３’相同性アームが存在することができる）。前記相同性アームは、前記ドナープラスミドにノックインされる外因性遺伝子の上流および下流に位置することができる。場合によっては、ゲノム内でノックインされる外因性遺伝子の標的位置は、ヌクレアーゼの作用によって破壊される可能性がある。前記相同性アームは、当該標的位置の切断の両端（即ち、５’および／または３’末端）のＤＮＡ配列と完全に同じであるか、または少なくとも８０％の同一性を有することができる。例えば、前記相同性アームは、標的位置の切断の両端のＤＮＡ配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有することができる。本出願において、前記ドナープラスミドは、５’相同性アームおよび／または３’相同性アームを含むことができる。
本出願において、「細胞生存率」という用語は、一般に、特定の条件下で細胞が生存し続ける能力を指す。前記細胞生存率は、一定期間、その時点で存在する細胞の総数に対する当該条件下で生きている細胞の比率によって測定されることができる。前記細胞生存率は、細胞に対する特定の条件の影響を反映することができる。例えば、前記細胞生存率が高いほど、当該条件は、細胞生存にとってより有利になる。
本出願において、「細胞増殖能」という用語は、一般に、細胞が増殖および／または自己複製する能力を指す。前記細胞増殖能は、一定時間内に細胞増幅によって生成した細胞の総数により測定されることができる。例えば、一定時間内で、細胞の数が増加するほど、前記細胞増殖能が高くなる。前記細胞増殖能は、細胞機能（例えば、増殖）の向上にも反映されることができる。
本出願において、「細胞殺傷能」という用語は、一般に、その標的細胞に対する細胞の殺傷能力を指す。例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の殺傷を媒介し、且つ標的細胞を殺傷することができる。例えば、前記媒介は、免疫エフェクター細胞の標的細胞への局在化（例えば、免疫エフェクター細胞および標的細胞によって発現される分子および／またはエピトープの相互識別による）を含むことができる。前記細胞殺傷能は、一定の時間および条件下で、標的細胞の細胞媒介性殺傷によって引き起こされる死亡した標的細胞の数によって測定されることができる。
本出願において、「細胞分泌能」という用語は、一般に、分泌因子を分泌する細胞の能力を指す。例えば、前記分泌因子は、分泌によって、細胞から離される分子であり得る。前記分泌因子は、外因性遺伝子によってコードされたタンパク質を含むことができる。前記細胞分泌能は、一定時間および条件下で、細胞によって分泌および生成された分泌因子の数によって測定されることができる。
本出願において、「細胞保存能」という用語は、一般に、保管条件下で細胞が生存し、および／または細胞の本来の機能を保持する能力を指す。例えば、前記保存条件は、周囲温度または低温（例えば、非冷蔵温度または冷蔵温度、例えば液体窒素条件下での保管）での長期保管を含むことができる。保存により前記細胞の代謝レベルが低下し、前記細胞が成長状態から一時的に失われる可能性がある。前記細胞は、前記保管後に蘇生することができる。前記細胞保存能は、一定時間および条件下で、前記保存前の細胞の数に対する保存後の細胞の数の比により測定されることができる。
本出願において、「細胞蘇生能」という用語は、一般に、再培養時に成長を再開する細胞の能力を指す。前記再培養とは、液体窒素または－８０℃の冷蔵庫で凍結保存させた細胞を解凍し、再培養することを指すことができる。前記細胞蘇生能は、一定時間および条件下で、前記再培養した細胞の総数に対する、再培養後に成長能力が回復した細胞の数の比率によって測定されることができる。
本出願において、「細胞株」という用語は、一般に、分裂し続けることができる細胞のクローン集団を指す。例えば、前記細胞株は、インビトロで無限の増殖能力を獲得することができる。
本出願において、用語「相補的」という用語は、一般に、ヌクレオチド間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を指し、具体的に互いに水素結合で結合するヌクレオチドを指し、ここで、チミンまたはウラシル残基は、アデニン残基と二つの水素結合との結合で結合し、シトシンおよびグアニン残基は、三つの水素結合で結合する。一般に、核酸は、指定された第２のヌクレオチド配列に対して「パーセント相補性」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、指定された第２のヌクレオチド配列と８０％、９０％または１００％の相補性を有し、配列の１０個のヌクレオチド中の８個、１０個のヌクレオチド中の９個、１０個のヌクレオチド中の１０個は、指定された第２のヌクレオチド配列と相補的であることを表す。例えば、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－５’は、ヌクレオチド配列５’－ＡＧＣＴ－３’に対して１００％相補的である。さらに、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－は、ヌクレオチド配列５’－ＴＴＡＧＣＴＧＧ－３’の一つの領域に対して１００％相補的である。当業者は、二つの相補的ヌクレオチド配列がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことを認識するであろう。
本出願において、「相同性」、「同一性」または「類似性」という用語は、一般に、二つのペプチド間または二つの核酸分子間の配列類似性を指す。「相同領域」という用語は、一般に、標的配列とある程度の相同性を有するドナー分子の領域を指す。相同性は、それぞれの配列内の位置を比較することによって決定されることができる。例えば、配列アラインメントを実行することによって配列間の相同性を決定することができる。比較される配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められる場合、分子は、当該位置で相同である。配列間の相同性程度は、配列が共有するマッチングまたは相同な位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本出願の配列の一つと４０％未満の同一性を有するが、好ましくは２５％未満の同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、別の配列と一定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」または「相同性」を有し、アラインメントの場合、比較される二つの配列で当該割合の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。当該アラインメントおよび相同性または配列同一性の割合は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものの、当技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。
本出願において、「トランスフェクション」という用語は、一般に、生物学的に活性な物質（例えば、核酸、タンパク質、酵素または小分子）を細胞に導入するための方法を指す。核酸は、ＤＮＡ（プラスミドまたはオリゴマーとして送達される）および／またはＲＮＡまたはその組み合わせであり得る。
本出願において、「エレクトロポレーション」という用語は、一般に、細胞に外部電場を印加するトランスフェクション法を指す。特定の実施形態において、使用されたエレクトロポレーション法は、静電エレクトロポレーションである。
文脈上で特に明記しない限り、本出願における「包含」、「有する」および「含む」という用語は、交換可能に使用され、一般に他の成分、要素、数値、段階等も含むことができることを意味する。場合によっては、「包含」は、「である」、「からなる」の場合を含み、例えば、ある組成物が成分「Ａ」を「包含」するという記載されると、当業者は、場合によっては、当該組成物が成分Ａのみからなる可能性があると推測することができる。
本出願において、「約」という用語は、一般に、本出願で言及される指定値または数値範囲の３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内または０．０５％以内を指す。本出願において、前記「約」が二つ以上の数値のうちの最初の地を指す場合、それは、当該一連の各数値に適用される。
発明の詳細な説明
一態様において、本出願は、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）効率を向上させるための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、遺伝子編集（例えば、細胞のインビトロ遺伝子編集）の編集効率を向上させるための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂ大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、ＤＮＡ相同組換え（例えば、インビトロで細胞内で相同組換えを実行する）効率を向上させるための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂ大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション後の細胞の細胞生存率の低下を回避するための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂ大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション混合物を調製するための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂ大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション混合物の品質を判断するための方法を提供し、それは、少なくとも約１０ｋｂ大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）を有する核酸分子またはその断片の含有量がトランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるかどうかを判断する段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション効率を向上させるための方法（例えば、インビトロ法）を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、遺伝子編集の編集効率を向上するための方法（例えば、インビトロ法）を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、ＤＮＡ相同組換え効率を向上させるための方法（例えば、インビトロ法）を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクト後の細胞の細胞生存率を向上させるための方法（例えば、トランスフェクション後の細胞生存率の低下を回避するための方法）を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション混合物を調製するための方法を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるようにする段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション混合物の品質を判断するための方法を提供し、それは、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり得る）を占めるかどうかを判断する段階を含む。前記パーセンテージは、重量パーセンテージｗ／ｗ％であり得る。
一態様において、本出願は、細胞を修飾する方法を提供する。当該方法は、インビトロ法またはエクスビボ法であり得る。前記方法は、トランスフェクション組成物を使用して修飾される細胞をトランスフェクトして、前記細胞が外因性遺伝子を含有および／または発現するようにすることを含むことができ、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含み、少なくとも一部（例えば、少なくとも１ｗ／ｗ％、少なくとも５ｗ／ｗ％、少なくとも１０ｗ／ｗ％、少なくとも１５ｗ／ｗ％、少なくとも２０ｗ／ｗ％、少なくとも２５ｗ／ｗ％、少なくとも３０ｗ／ｗ％、少なくとも３５ｗ／ｗ％、少なくとも４０ｗ／ｗ％、少なくとも４５ｗ／ｗ％、少なくとも５０ｗ／ｗ％、少なくとも５５ｗ／ｗ％、少なくとも６０ｗ／ｗ％、少なくとも６５ｗ／ｗ％、少なくとも７０ｗ／ｗ％、少なくとも７５ｗ／ｗ％、少なくとも８０ｗ／ｗ％、少なくとも８５ｗ／ｗ％、少なくとも９０ｗ／ｗ％、少なくとも９５ｗ／ｗ％、少なくとも９９ｗ／ｗ％、少なくとも１００ｗ／ｗ％）の前記外因性核酸分子は、宿主細胞から取得され、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡは、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法を提供し、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含む。
特定の実施形態において、トランスフェクションに使用された組成物は、前記細胞にトランスフェクトされる外因性核酸分子を含み、少なくとも一部（例えば、少なくとも１ｗ／ｗ％、少なくとも５ｗ／ｗ％、少なくとも１０ｗ／ｗ％、少なくとも１５ｗ／ｗ％、少なくとも２０ｗ／ｗ％、少なくとも２５ｗ／ｗ％、少なくとも３０ｗ／ｗ％、少なくとも３５ｗ／ｗ％、少なくとも４０ｗ／ｗ％、少なくとも４５ｗ／ｗ％、少なくとも５０ｗ／ｗ％、少なくとも５５ｗ／ｗ％、少なくとも６０ｗ／ｗ％、少なくとも６５ｗ／ｗ％、少なくとも７０ｗ／ｗ％、少なくとも７５ｗ／ｗ％、少なくとも８０ｗ／ｗ％、少なくとも８５ｗ／ｗ％、少なくとも９０ｗ／ｗ％、少なくとも９５ｗ／ｗ％、少なくとも９９ｗ／ｗ％、少なくとも１００ｗ／ｗ％）の前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子である（例えば、前記宿主細胞から抽出されて取得したものである）。
特定の実施形態において、前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）である。
別の態様において、本出願は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法を提供し、前記方法は、前記外因性核酸分子をＤＮａｓｅで処理することを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記外因性核酸分子と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含む。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための方法を提供し、前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含む。
特定の実施形態において、前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約９‰以下、約８‰以下、約７‰以下、約６‰以下、約５．５‰以下、約５‰以下、約４．５‰以下、約４‰以下、約３．５‰以下、約３‰以下、約２．５‰以下、約２‰以下、約１．５‰以下、約１‰以下、約０．５‰以下、約０．１‰以下、約０．０１‰以下、約０．００１‰以下またはそれ以下であり、すべて質量％である）である。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための方法を提供し、前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分をＤＮａｓｅで処理することを含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含む。
本出願において、前記デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって処理されていない外因性核酸分子と比較して、当該デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって処理された外因性核酸分子トランスフェクト細胞のトランスフェクション効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１．０％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約１０００％またはそれ以上向上させることができる。
本出願における方法は、インビトロ法またはエクスビボ法であり得る。
本出願において、前記トランスフェクション組成物（外因性核酸分子またはプラスミド）の細胞へのトランスフェクション効率は、以下の方法で判断されることができる。１）トランスフェクトされた細胞において、外因性遺伝子を発現する細胞の比率を測定し、前記トランスフェクション組成物（またはプラスミド）は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含み、および／または２）トランスフェクトされた細胞において、外因性遺伝子を含む細胞の比率を測定し、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含む。
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物を最適化するための、前述の試薬（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび／または塩化セシウム－臭化エチジウム）の用途を提供する。
別の態様において、本出願は、トランスフェクト（例えば、エレクトロポレーション）用のキットを提供する。前記キットは、１）本出願のいずれかの態様に記載の宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および２）宿主細胞のゲノムＤＮＡを減少または分解できる試薬を含む。特定の実施形態において、２）の前記試薬は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種を含む。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、前記キットは、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む試薬を含む。
別の態様において、本出願は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）および一過性トランスフェクトに必要な試薬および／または機器を含む、プラスミドトランスフェクション効率を向上させるためのキットを提供する。本出願において、前記一過性トランスフェクトに必要な試薬は、エレクトロポレーションに必要な試薬を含むことができる。例えば、前記エレクトロポレーションに必要な試薬は、ｄｄＨ２Ｏおよび／またはグリセロールを含むことができる。例えば、前記エレクトロポレーションに必要な機器は、エレクトロポレーション装置、エレクトロポレーションカップおよび／または遠心分離機を含むことができる。
本出願において、前記キットは、前記エレクトロポレーションに必要な形質転換状態の細胞を得るために必要な試薬および／または機器をさらに含むことができる。例えば、前記形質転換状態の細胞は、超低温（例えば、－７０℃）条件下で保存されることができる。本出願において、前記エレクトロポレーションを実行する場合、前記エレクトロポレーション装置の電圧は、約１５００－２５００Ｖであり得る。本出願において、前記エレクトロポレーションを実行するために、前記エレクトロポレーションカップは、超低温条件下で適応されることができる。
本出願において、前記ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡを切断することができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含むことができる。例えば、前記ＤＮａｓｅには、任意のＲＮａｓｅが含まれていない場合がある。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、環状ＤＮＡを切断することができない。特定の実施形態において、前記ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡを切断することができない。
本出願において、前記キットは、緩衝液をさらに含むことができ、前記緩衝液は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含むことができる。例えば、前記緩衝液は、前記ＤＮａｓｅに対応する反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）であり得る。本出願において、前記キットは、ＤＮａｓｅによるＤＮＡの酵素分解に必要な（例えば、ＤＥＰＣによって処理されたもの）脱イオン水をさらに含むことができる。
別の態様において、本出願は、キットを提供し、前記キットは、１）本出願のいずれかの態様に記載の宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および２）取扱説明書を含み、前記取扱説明書は、１）の前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を本出願の方法によって処理すること、および／または前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含むトランスフェクション組成物の品質を本出願の方法によって判断することが記載されている。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって処理された外因性核酸分子を含むトランスフェクション組成物を提供する。
別の態様において、本出願は、本出願に記載のトランスフェクション組成物によってトランスフェクトされた細胞を提供する。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって修飾された細胞を提供する。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の細胞および／またはその子孫を含む、細胞集団を提供する。例えば、前記細胞集団は、少なくとも１０３個（例えば、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個、少なくとも１０１０個またはそれ以上）の前記細胞を含むことができる。
別の態様において、本出願は、本出願に記載のトランスフェクション組成物、本出願に記載の細胞、および／または本出願に記載の細胞集団を含む、医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。前記薬学的に許容されるアジュバントは、例えば生物に有意な刺激を引き起こさず、投与される活性成分（例えば、修飾された細胞または細胞集団）の生物学的活性および性質に有意な悪影響を及ぼさない物質を含む。例えば、前記薬学的に許容されるアジュバントは、希釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、湿潤剤、吸着ベクター、潤滑剤、充填剤および／または崩壊剤を含むことができるが、これらに限定されない。
別の態様において、本出願は、薬物を調製するための、本出願に記載のトランスフェクション組成物、本出願に記載の細胞、本出願に記載の細胞集団、および／または本出願に記載の医薬組成物の用途を提供する。特定の実施形態において、前記薬物は、癌を予防、治療および／または緩和するために使用される。特定の実施形態において、前記薬物は、免疫応答を調節するために使用される。
別の態様において、本出願は、被験者の疾患または病症を予防、治療および／または緩和するための方法を提供し、前記方法は、前記被験者に有効量の本出願に記載のトランスフェクション組成物、本出願に記載の細胞、本出願に記載の細胞集団、および／または本出願に記載の医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、前記疾患または病症は、癌である。特定の実施形態において、前記疾患または病症は、前記被験者における免疫応答に関連する。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞が前記一つまたは複数の外因性遺伝子を含有および／または発現するように、一つまたは複数の外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子を含有および／または発現するように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約３ｋｂ（例えば、少なくとも約３．５ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約４．５ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約５．５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約６．５ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約７．５ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約８．５ｋｂ、少なくとも約９ｋｂまたはそれ以上である）であり、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記ＣＡＲを含有および／または発現するように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記ＣＡＲおよび前記一つまたは複数の第２のタンパク質を含有および／または発現するように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および一つまたは複数の第２のタンパク質（例えば、サイトカイン、抗体および／またはケモカイン）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記ＣＡＲおよび前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含有および／または発現するように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含有および／または発現するように、多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記ＣＡＲ、前記一つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含有および／または発現するように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、一つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、エレクトロポレーション法（例えば、プラスミドエレクトロポレーション法）を提供し、前記方法は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）が前記一つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含有および／または発現するように、一つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞（例えば、Ｔ細胞等の免疫細胞）をエレクトロポレーションすることを含み、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出され、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約３ｋｂ（例えば、少なくとも約３．５ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約４．５ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約５．５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約６．５ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約７．５ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約８．５ｋｂ、少なくとも約９ｋｂまたはそれ以上である）である。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲをコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲおよび一種または複数種のサイトカインおよび／またはケモカインをコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲおよび多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲ、一種または複数種のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
別の態様において、本出願は、一段階エレクトロポレーション法を提供し、前記方法は、前記細胞が前記外因性遺伝子（例えば、当該外因性遺伝子が前記細胞のゲノムにノックインされる）を含有および／または発現し且つ前記細胞ゲノム内の一つまたは複数の内因性遺伝子がノックアウトされるように、外因性遺伝子をコードするプラスミドを含むトランスフェクション組成物で細胞をエレクトロポレーションすることを含み、前記外因性遺伝子は、一種または複数種のサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに多重特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢｉＴＥ）をコードする。特定の実施形態において、前記プラスミドは、宿主細胞から抽出される。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物に含まれる前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、当該トランスフェクション組成物中のプラスミドＤＮＡ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める。
特定の実施形態において、本出願の前記エレクトロポレーション法は、一段階エレクトロポレーション法であり、即ち、１回のエレクトロポレーショントランスフェクション段階で前記外因性遺伝子のノックインおよび／またはノックアウトを完了する。
宿主ゲノムＤＮＡ
本出願の宿主細胞は、ベクターを複製することができるか、またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を含む、原核細胞または真核細胞であり得る。宿主細胞は、外因性核酸分子の受容体として使用されることができ、且つ使用されてきた。
例えば、前記宿主は、微生物宿主であり得る。例えば、前記宿主は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることができる。例えば、前記宿主は、グラム陰性菌を含むことができる。例えば、前記宿主は、大腸菌（例えば、コンピテント大腸菌細胞）を含むことができる。
本出願において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡは、前記外因性核酸分子に含まれない場合がある。
本出願において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定されることができる。
本出願において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ（例えば、本出願の核酸分子またはその断片）の大きさは、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る。例えば、前記核酸分子またはその断片（例えば、本出願の宿主細胞のゲノムＤＮＡ）の大きさは、少なくとも約１０ｋｂであり得る。本出願において、前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子の断片（例えば、本出願の宿主細胞のゲノムＤＮＡ）の大きさは、少なくとも約１０ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）であり得る。
本出願において、前記核酸分子またはその断片は、微生物（例えば、本出願の宿主細胞のゲノムＤＮＡ）に由来することができる。例えば、前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることができる。
本出願において、前記微生物は、グラム陰性菌を含むことができる。例えば、前記微生物は、ベクターの骨格ベクターを調製するのに適した微生物であり得る。例えば、前記微生物は、大腸菌を含むことができる。
本出願において、前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片（例えば、本出願の宿主細胞のゲノムＤＮＡ）の含有量は、トランスフェクション混合物中の宿主細胞に由来する外因性核酸分子（例えば、プラスミド）の含有量の約１０（ｗ／ｗ）％以下、約９（ｗ／ｗ）％以下、約８（ｗ／ｗ）％以下、約７（ｗ／ｗ）％以下、約６（ｗ／ｗ）％以下、約５（ｗ／ｗ）％以下、約４（ｗ／ｗ）％以下、約３（ｗ／ｗ）％以下、約２．５（ｗ／ｗ）％以下、約２（ｗ／ｗ）％以下、約１．５（ｗ／ｗ）％以下、約１（ｗ／ｗ）％以下、約９（ｗ／ｗ）‰以下、約８（ｗ／ｗ）‰以下、約７（ｗ／ｗ）‰以下、約６（ｗ／ｗ）‰以下、約５（ｗ／ｗ）‰以下、約４（ｗ／ｗ）‰以下、約３（ｗ／ｗ）‰以下、約２（ｗ／ｗ）‰以下、約１（ｗ／ｗ）‰以下、約０．１（ｗ／ｗ）‰以下、約０．０１（ｗ／ｗ）‰以下、約０．００１（ｗ／ｗ）‰以下またはそれ以下を占めることができる。例えば、前記少なくとも約４８ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片（例えば、本出願の宿主細胞のゲノムＤＮＡ）の含有量は、トランスフェクション混合物中のプラスミド含有量の約２％以下、トランスフェクション混合物中のプラスミド含有量の約５‰以下、トランスフェクション混合物中のプラスミド含有量の約１‰以下を占めることができる。
トランスフェクション
トランスフェクションは、細胞に核酸を意図的に導入する方法である。特定の実施形態において、トランスフェクションは、非ウイルスであり、これは、プラスミド環境で使用される配列が非ウイルスであり、また外因性核酸分子がウイルスメカニズムを通じて細胞に侵入しないことを意味する。動物細胞のトランスフェクションは、一般に、細胞膜中の一過性細孔または「細孔」を開いて材料の取り込みを可能にすることを含む。トランスフェクションは、当技術分野で知られており、および以下に記載の方法を使用して実行することができる。
本出願において、前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションを含むことができる。例えば、前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含むことができる。例えば、前記トランスフェクトは、前記修飾される細胞をエレクトロポレーションすることを含むことができる。前記エレクトロポレーションは、細胞エレクトロトランスフェクション、または細胞エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を指す場合がある。前記エレクトロポレーションは、強力な瞬間電池の効果を利用して、帯電した物質を一定の透過性を有する細胞膜を通って細胞内に侵入させることができる。前記エレクトロポレーションは、非常に低い細胞毒性を生成することができる。化学的トランスフェクション法および／またはウイルストランスフェクション法と比較して、前記エレクトロポレーションによって生成された細胞毒性は、有意に低下する。前記エレクトロポレーションは、ほぼすべての種類の真核細胞に適用されることができる。前記エレクトロポレーションは、外因性タンパク質の一過性的にまたは安定的に発現に使用されることができる。
本出願において、前記トランスフェクションは、トランスポゾンシステム（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム、またはＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムを含むことができる）のトランスフェクションを含むことができる。
本出願において、前記トランスフェクションは、細胞（例えば、本出願に記載のトランスフェクトされるか、または修飾される細胞）をトランスフェクトすることを含むことができる。本出願において、前記細胞は、真核細胞を含むことができる。前記真核細胞は、植物細胞、真菌細胞および／または動物細胞を含むことができる。ここで、前記動物細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣ等のＴ細胞等の免疫細胞等のヒト細胞）を含むことができる。
本出願において、例えば化学ベースのトランスフェクション法および非化学ベースのトランスフェクション法等、当技術分野で知られている他のトランスフェクション法をさらに含むことができる。化学ベースのトランスフェクション法は、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）および陽イオンポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストロースまたはポリエチレンイミン）の方法を含むことができる。非化学的方法は、細胞押出、超音波穿孔、光学的トランスフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）および流体力学的送達等を含むことができる。例えば遺伝子銃、マグネトフェクション（即ち、磁気補助トランスフェクション）および粒子衝撃等のトランスフェクション法等の粒子ベースの方法をさらに含むことができる。
特定の実施形態において、エレクトロポレーションを使用することによって、一つまたはそれ以上の種の核酸分子の宿主細胞への侵入を促進する。本出願において、「エレクトロポレーション」または「エレクトロローディング（ｅｌｅｃｔｒｏｌｏａｄｉｎｇ）」は、一般に、細胞に電流または電場を印加して、核酸分子の細胞への侵入を促進することを指す。例えば、フローエレクトロポレーション機器を使用して、フローエレクトロポレーションを実行することができる。特定の実施形態において、静電エレクトロポレーション法を使用することができる。
本出願の方法において、エレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞は、約３５％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超えるまたは約９０％を超える（またはそのうちから導き出される任意の範囲）トランスフェクション効率を達成することができる。トランスフェクション効率は、遺伝子生成物を発現する細胞の割合または遺伝子によって発現される生成物の分泌レベルによって測定されることができる。エレクトロポレーションプロセス中およびエレクトロポレーションプロセス後に、細胞は、高い生存率を維持する。生存率は、一般に約４０％またはそれ以上を超える。エレクトロポレーションされた細胞の生存率は、出発時のエレクトロポレーションされていない細胞集団、または対照構築物トランスフェクトされたエレクトロポレーションされた細胞集団の生存率の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上であり得る。
細胞押出は、細胞膜を穏やかに圧迫することによって分子を細胞内に送達するトランスフェクション法である。細胞押出は、細胞内送達のための高スループットのキャリアフリーマイクロ流体プラットフォームである。細胞押出は、外因性材料または電場に依存しない。
超音波穿孔は、高強度の超音波を使用して細胞膜の細孔形成を誘導する。当該細孔形成は、主に超音波造影剤（キャビテーション核の源）の添加によって増強される、気泡キャビテーションと近くの細胞膜との相互作用に起因する。
光学的トランスフェクションは、高度に収束したレーザーを使用して、細胞の原形質膜に小さな（約１μｍの直径）細孔を一過性的に生成する方法である。当該技術において、細胞を一度に一つずつ処理するため、単一細胞の分析に特に適している。
流体力学的送達は、マウスおよびラットで行われているが、より大きい動物における程度は、より低く、１０秒未満で比較的大量の血液を注入する流体力学的注射を使用して、肝臓にプラスミド内のＤＮＡ（トランスポゾンを含む）を送達することができ、当該プロセスを通じてほぼすべてのＤＮＡが肝臓で発現される。
化学ベースのトランスフェクションは、シクロデキストリン、ポリマー、リポソームまたはナノ粒子（化学プロセスまたはウイルスプロセスの有無にかかわらず）等の複数の種類に分類されることができる。例えば、リン酸カルシウム法において、リン酸塩イオンを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液（ＨＥＰＥＳ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨｅＢＳ）を、トランスフェクトされるＤＮＡを含む塩化カルシウム溶液と組み合わせる。両者を組み合わせる場合、正に帯電したカルシウムおよび負に帯電したリン酸塩の微細な沈殿が形成され、その表面にトランスフェクトされるＤＮＡが結合される。次に沈殿物の懸濁液をトランスフェクトされる細胞に添加する（一般に、単層培養した細胞培養物）。細胞は、沈殿物の一部およびこれと一緒にいるＤＮＡを取り込む。他のいくつかの方法は、高度に分岐した有機化合物（いわゆるデンドリマー）を使用してＤＮＡに結合し、且つＤＮＡが細胞に侵入するようにする。非常に効果的な方法は、トランスフェクトされるＤＮＡをリポソームに封入することであり、リポソームは、小さな膜エンベロープであり、ある意味で細胞の構造に似ており、且つ実際に細胞膜と融合して、ＤＮＡを細胞に放出する。真核細胞の場合、細胞の感受性が高いため、陽イオンリポソーム（または混合物）を使用すると、トランスフェクションをより適切に達成する。別の方法は、例えばＤＥＡＥ－デキストロースまたはポリエチレンイミン等の陽イオンポリマーを使用することである。負に帯電したＤＮＡは、ポリ陽イオンに結合し、複合体は、エンドサイトーシス作用を通じて細胞に取り込まれる。
特定の実施形態において、直接的なトランスフェクション法は、遺伝子銃を使用し、ここで、ＤＮＡは、不活性固体（通常は、金である）のナノ粒子にカップリングされ、次にそれを標的細胞の核に直接「撃ち込む」。
マグネトフェクションまたは磁気補助トランスフェクションは、磁力を使用してＤＮＡを標的細胞に送達するトランスフェクション法である。まず、核酸を磁性ナノ粒子と結合する。次に、磁力を印加して核酸粒子複合体を標的細胞に向けて標的細胞に送達し、そこでペイロードを放出する。
ピアストランスフェクションは、細長いナノ構造およびこのようなナノ構造のアレイで細胞をピアシングすることによって実行され、このようなナノ構造は、例えば、プラスミドＤＮＡで官能化されたカーボンナノファイバーまたはシリコンナノワイヤーである。
別の粒子ベースのトランスフェクション法は、粒子衝撃として知られている。通常は微小突起に結合する核酸を高速で膜貫通送達する。
本出願において、前記トランスフェクションは、安定したトランスフェクションを含むことができる。例えば、前記トランスフェクションは、トランスフェクトされた前記細胞に、前記外因性遺伝子によってコードされた外因性タンパク質を安定して発現させることができる。例えば、前記トランスフェクションは、トランスフェクトされた前記細胞のゲノムへの前記外因性遺伝子の組み込みをもたらすことができる。本出願において、前記組み込みは、ゲノムの特定の位置で発生することができる。
トランスフェクトされるまたは修飾される細胞
本出願において、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語のすべては、新たに分離された細胞、エクスビボで培養、活性化または増幅された細胞をさらに含む。これらの用語のすべては、その子孫、即ち、あらゆる子孫も含む。意図的または不注意による突然変異により、各子孫細胞は、同一ではない可能性があることを理解されたい。
本出願において、修飾されるまたはトランスフェクトされる前記細胞は、真核細胞であり得る。例えば、前記細胞は、哺乳動物細胞であり得る。例えば、前記細胞は、ヒト細胞であり得る。
例えば、前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞であり得る。例えば、前記細胞は、多能性幹細胞、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞であり得る。
例えば、前記細胞は、免疫エフェクター細胞であり得る。例えば、前記細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球および／またはマスト細胞であり得る。例えば、前記細胞は、末梢血リンパ球であり得る。
例えば、前記細胞は、初代細胞であり得る。例えば、前記細胞は、被験者由来の自己細胞であり得る。
例えば、前記修飾される細胞は、活性化された細胞であり得る。例えば、前記活性化は、前記修飾される細胞と活性化組成物とを接触させることを含むことができる。
例えば、前記細胞は、免疫細胞（例えば、初代または自己ＰＢＭＣ等の初代または自己Ｔ細胞またはＮＫ細胞等のＰＢＭＣ等のＴ細胞またはＮＫ細胞等の免疫エフェクター細胞）を含むことができ、前記活性化組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体（例えば、前記抗体は、磁気ビーズ上に提供されてもよい）を含むことができる。
Ｔ細胞を活性化するための試薬またはキットも、市販されている。例示的なキットは、抗ビオチン粒子（例えば、ＭＡＣＳｉＢｅａｄまたはＤｙｎａｂｅａｄ）およびヒトＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８に対するビオチン化抗体を含む。ビオチン化抗体をロードした抗ビオチン粒子は、抗原提示細胞を模倣し、且つＰＢＭＣ由来の休止Ｔ細胞および精製されたＴ細胞を活性化するために使用される。培養および培養した１４日目の再活性化によって、Ｔ細胞の増幅を実現する。例えば、Ｔ細胞は、マイトジェン（例えば、ＣｏｎＡ、ＰＨＡおよびＰＷＭ）によって活性化されることもできる。
例えば、前記活性化は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約４日間以内（例えば、約９６時間以内、約９０時間以内、約８５時間以内、約８０時間以内、約７５時間以内、約７２時間以内、約７０時間以内、約６５時間以内、約６０時間以内、約５５時間以内、約５０時間以内、約４８時間以内、約４５時間以内、約４０時間以内、約３６時間以内、約３０時間以内、約２４時間以内、約２０時間以内、約１５時間以内、約１２時間以内、約８時間以内またはそれ以下の時間）接触させることを含むことができる。例えば、前記活性化は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約１０時間乃至約４８時間（例えば、約１２時間乃至約２４時間）接触させることを含む。例えば、前記方法は、前記トランスフェクトされる細胞と前記活性化組成物とを約２日間または２日間以内の期間接触させながら前記トランスフェクションを実施することを含む。
特定の実施形態において、トランスフェクションは、あらゆる原核細胞または真核細胞に対して実行することができる。いくつかの態様において、エレクトロポレーションは、ヒト細胞のトランスフェクションが言及される。別のいくつかの態様において、エレクトロポレーションは、動物細胞のトランスフェクションに言及される。特定の態様において、トランスフェクションは、細胞株またはハイブリッド細胞型のトランスフェクションが言及される。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、癌細胞、腫瘍細胞または不死化細胞である。場合によっては、腫瘍、癌、不死化細胞または細胞株は、誘導され、他の場合によっては、腫瘍、癌、不死化細胞または細胞株は、自然にそれぞれの状態または条件に入る。特定の態様において、細胞または細胞株は、Ａ５４９、Ｂ細胞、Ｂ１６、ＢＨＫ－２１、Ｃ２Ｃ１２、Ｃ６、ＣａＣｏ－２、ＣＡＰ／、ＣＡＰ－Ｔ、ＣＨＯ、ＣＨＯ２、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ－１、Ｃｏｓ－７、ＣＶ－１、樹状細胞、ＤＬＤ－１、胚性幹（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ，ＥＳ）細胞または誘導体、Ｈ１２９９、ＨＥＫ、２９３、２９３Ｔ、２９３ＦＴ、Ｈｅｐ Ｇ２、造血幹細胞、ＨＯＳ、Ｈｕｈ－７、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）またはその誘導体、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、Ｌ５２７８Ｙ、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＣＫ、間葉系細胞、Ｍｉｎ－６、単球、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３Ｌ１、Ｋ５６２、ＮＫ－細胞、ＮＳ０、Ｐａｎｃ－１、ＰＣ１２、ＰＣ－３、末梢血液細胞、形質細胞、初代線維芽細胞、ＲＢＬ、Ｒｅｎｃａ、ＲＬＥ、ＳＦ２１、ＳＦ９、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ＳＫ－ＭＥＳ－１、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、ＳＬ３、ＳＷ４０３、刺激誘発多能性獲得（Ｓｔｉｍｕｌｕｓ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ、ＳＴＡＰ）細胞またはその誘導体ＳＷ４０３、Ｔ－細胞、ＴＨＰ－１、腫瘍細胞、Ｕ２ＯＳ、Ｕ９３７、末梢血リンパ球、増幅Ｔ細胞、造血幹細胞またはＶｅｒｏ細胞であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、前記細胞は、末梢血リンパ球、増幅Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、幹細胞、造血幹細胞または初代細胞である。特定の具体的な実施形態において、前記細胞は、造血幹細胞である。別のいくつかの具体的な実施形態において、前記細胞は、末梢血リンパ球および／または末梢血単核球ＰＢＭＣである。
特定の実施形態において、前記細胞は、当技術分野で知られているトランスフェクションが難しい細胞である。このような細胞は、当技術分野で知られており、例えば、初代細胞、昆虫細胞、ＳＦ９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＨＯ細胞、幹細胞、ゆっくりと分裂する細胞、Ｔ細胞および非分裂細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、骨髄系およびリンパ系前駆細胞を含む造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、卵細胞または精子細胞等の生殖細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、受精胚である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ヒト受精胚である。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション前またはトランスフェクション後に細胞を培養することができる。例えば、トランスフェクション後の選択段階、維持およびクローン選択、初期増幅中、選択段階中、および／または大規模生産段階中で細胞を培養することができる。懸濁細胞および付着細胞を培養する方法は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、市販の細胞培養容器および細胞培地を使用して細胞を培養することができる。例えば、ＡＤＭＥ／ＴＯＸプレート、細胞チャンバースライドおよびカバースリップ、細胞計数デバイス、細胞培養表面、康寧ＨＹＰＥＲ Ｆｌａｓｋ細胞培養容器、コーティングされた培養皿、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｃｒｙｏｗａｒｅ、培養チャンバー、培養皿、ガラス培養フラスコ、プラスチック培養フラスコ、３Ｄ培養フォーマット、培養マルチウェルプレート、培養プレート挿入物、ガラス培養チューブ、プラスチック培養チューブ、積み重ね可能な細胞培養容器、低酸素培養チャンバー、培養皿（Ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）およびボトルキャリア、高速培養容器、スピナーボトルを使用した大規模細胞培養、スピナーフラスコ、３Ｄ細胞培養または細胞培養バッグ等。
本出願において、前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含むことができる。例えば、前記幹細胞は、多能性幹細胞を含むことができる。例えば、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）を含むことができる。前記胚性幹細胞は、三つの原始胚葉（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化することができ、これら三つの胚葉は、最終的に器官および組織を形成することができる。前記多能性幹細胞は、胚盤葉上幹細胞（ＥｐｉＳＣｓ）を含むことができる。前記多能性幹細胞は、転写因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４）のトランスフェクション後の哺乳類成体細胞の（例えば、マウス尾部の皮膚細胞）の脱分化によって形成されることができる、人工多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ）をさらに含むことができる。
本出願において、前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含むことができる。前記造血幹細胞は、血液細胞（例えば、骨髄系の血液細胞およびリンパ系の血液細胞）に分化することができる。前記造血幹細胞は、多分化能および自己複製の特徴を有することができる。前記造血幹細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞に分化されることができる。
前記間葉系幹細胞は、胚発生の初期段階の中胚葉に由来する自己複製能を有し、多方向への分化能を有し、インビトロでの大規模増幅後も依然としてその生物学的特性を維持することができる、成体幹細胞である。前記間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－Ｉクラス抗原を発現することができる。前記間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－ＩＩクラス抗原を発現しないか、または発現量が低い場合がある。前記間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化する能力を有することができ、造血幹細胞の顆粒球、マクロファージおよび巨核球への分化もサポートすることができる。前記間葉系幹細胞は、サイトカインを分泌することができ、例えばＣＳＦ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ｃ－ｋｉｔｌｉｇａｎｄおよび／またはＩＬ－３を分泌することができる。
本出願において、前記免疫細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。例えば、前記免疫エフェクター細胞は、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞）、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞を含むことができる。例えば、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球（例えば、活性化Ｔリンパ球であってもよく、非活性化Ｔリンパ球であってもよい）、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択されることができる。
トランスフェクション組成物
本出願において、前記トランスフェクション混合物は、外因性核酸分子（例えば、プラスミド）を含むことができる。例えば、前記プラスミドは、環状プラスミド、スーパーコイルプラスミドまたは直鎖状プラスミドであり得る。本出願において、前記プラスミド（例えば、直鎖状プラスミド）が（例えば、エキソヌクレアーゼＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ等のエキソヌクレアーゼ等のデオキシリボヌクレアーゼ）処理された後、本出願に記載の少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさを有する核酸分子またはその断片（例えば、宿主ゲノムＤＮＡは、直鎖状核酸分子またはその断片であり得る）の含有量、および／または本出願に記載の宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片（例えば、直鎖状核酸分子またはその断片であり得る）の含有量は、本出願に記載の条件を満たす。本出願において、前記処理は、環状構造を有する核酸分子に影響を及ぼさないことができる。
例えば、本出願に記載のトランスフェクション組成物は、実質的に任意のウイルスベクターを含まなくてもよく、例えば、そのうちのウイルスベクターの含有量は、約２（ｗ／ｗ）％未満、約１（ｗ／ｗ）％未満、約０．９（ｗ／ｗ）％未満、約０．８（ｗ／ｗ）％未満、約０．７（ｗ／ｗ）％未満、約０．６（ｗ／ｗ）％未満、約０．５（ｗ／ｗ）％未満、約０．４（ｗ／ｗ）％未満、約０．３（ｗ／ｗ）％未満、約０．２（ｗ／ｗ）％未満、約０．１（ｗ／ｗ）％未満またはそれ以下である。
本出願において、前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドであり得る。例えば、前記ＤＮＡプラスミドは、二本鎖の閉じたＤＮＡ分子であり得る。例えば、前記ＤＮＡプラスミドは、二本鎖の線状ＤＮＡ分子であり得る。
本出願において、前記プラスミドは、マルチクローニング部位を含むことができる。前記プラスミドは、少なくとも一つの外因性遺伝子をコードすることができる。前記外因性遺伝子は、一種または複数種の抗原結合断片（例えば、抗体）、キメラ抗原受容体、サイトカインおよび／またはケモカインをコードすることができる。前記外因性遺伝子は、任意の一種または複数種の機能性タンパク質をコードすることもできる。例えば、前記機能性タンパク質は、遺伝子欠損に関連する疾患の治療に使用されることができる。例えば、前記機能性タンパク質は、トランスフェクトされた細胞が位置する生物内で欠失および／または突然変異したタンパク質であり得る。例えば、前記機能性タンパク質を発現する外因性遺伝子は、前記ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）（例えば、初代ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ））、筋細胞および／または幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ細胞）にトランスフェクトされることができる。
本出願において、前記外因性遺伝子は、内因性プロモーターによって、外因性プロモーターによって発現されることができる。例えば、前記プラスミドは、前記外因性プロモーターを含むことができる。
本出願において、前記宿主のゲノムＤＮＡ（例えば、少なくとも約１０ｋｂの大きさ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約４５０ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約６００ｋｂ、少なくとも約７００ｋｂ、少なくとも約８００ｋｂ、少なくとも約９００ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約２Ｍｂ、少なくとも約３Ｍｂ、少なくとも約４Ｍｂ、少なくとも約５Ｍｂ、少なくとも約６Ｍｂ、少なくとも約７Ｍｂ、少なくとも約８Ｍｂ、少なくとも約９Ｍｂ、少なくとも約１０Ｍｂ、少なくとも約２０Ｍｂ、少なくとも約５０Ｍｂ、少なくとも約１００Ｍｂ、少なくとも約２００Ｍｂまたはそれ以上であり得る）の核酸分子またはその断片）および前記プラスミドは、異なる核酸分子に存在することができる。例えば、前記宿主のゲノムＤＮＡ（例えば、前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片）は、前記トランスフェクション組成物中に遊離している。例えば、前記宿主のゲノムＤＮＡ（例えば、前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片）は、前記プラスミド中に遊離している。前記遊離は、前記プラスミドに結合していない形態で分離的に存在することができる。
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法によって調製されたトランスフェクション混合物を提供する。
本出願において、前記トランスフェクション混合物は、トランスフェクション効率を有意に向上させることができる。前記トランスフェクション混合物は、トランスフェクトによって引き起こされる細胞毒性を有意に減少させることができる。前記トランスフェクション混合物は、細胞のトランスフェクションに直接使用されることができる。本出願に記載の方法は、前記トランスフェクション混合物の調製、および／または品質チェックのための品質管理標準として使用されることができる。
トランスフェクション組成物の最適化
例えば、前記方法は、前記トランスフェクトの前に前記宿主細胞由来の外因性核酸分子（例えば、プラスミド）を処理して、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が減少するようにすることを含むこともできる。
例えば、前記処理は、前記宿主細胞由来の外因性核酸分子（例えば、プラスミド）と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種の試薬とを接触させることを含む。例えば、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む。例えば、前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞由来の外因性核酸分子（例えば、プラスミド）と前記試薬とを接触させることを含む。
本出願の前記方法は、前記トランスフェクション混合物中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を低下させる段階を含むことができる。本出願において、前記低下は、本出願に記載の方法の要件を満たすために、前記トランスフェクション混合物中の前記宿主ゲノムＤＮＡの含有量を低下させることを指すことができる。
本出願において、前記低下は、前記トランスフェクション混合物の精製を含むことができる。即ち、前記精製を通じて、前記トランスフェクション混合物中の前記核酸分子またはその断片の含有量を低下させて、本出願に記載の方法の要件を満たすことができる。本出願において、前記精製を通じて、前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片を除去するか、および／または前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片を除去することができる。例えば、前記精製は、当業者に周知のＤＮＡを精製する方法を使用して、前記トランスフェクション混合物中の前記核酸分子またはその断片の含有量を低下させることを含むことができる。本出願において、前記精製は、前記プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。本出願において、前記低下は、ＤＮａｓｅ、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される試薬を使用して前記トランスフェクション混合物を精製することを含むことができる。例えば、前記低下は、ＤＮａｓｅを使用することができる。例えば、ＤＮａｓｅを使用して、前記トランスフェクション混合物中の前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、本出願に記載の方法の要件を満たすように、および／または前記宿主（例えば、微生物）のゲノムの核酸分子またはその断片の含有量が本出願に記載の方法の要件を満たすように低下される。例えば、前記ＤＮａｓｅは、前記環状プラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。
本出願において、前記ＤＮａｓｅは、二本鎖ＤＮＡを切断することができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる。
前記ＤＮａｓｅは、本出願に記載のプラスミドのＤＮＡの完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。前記ＤＮａｓｅは、本出願に記載のプラスミド（例えば、前記環状プラスミド）における前記外因性遺伝子の完全性および／または活性に影響を及ぼさないことができる。
本出願において、前記ＤＮａｓｅは、直鎖状（例えば、二本鎖直鎖状）ＤＮＡを（例えば、非特異的に）切断することができる。例えば、前記ＤＮａｓｅは、前記プラスミド（例えば、環状プラスミド）の構造および／または活性に影響を及ぼさないことができる。本出願において、前記ＤＮａｓｅは、デオキシリボヌクレアーゼを含むことができる。本出願において、前記ＤＮａｓｅは、ＤＮＡエキソヌクレアーゼを含むことができる。本出願において、前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを含むことができる。本出願において、前記ＤＮａｓｅは、ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅを含むことができ、例えばＰｌａｓｍｉｄ－ＳａｆｅTM ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅであり得る。
例えば、本出願に記載の方法は、前記ＤＮａｓｅと本出願に記載のプラスミド（またはトランスフェクション組成物）とを接触させることを含むことができる。本出願において、前記接触は、緩衝液の存在下で接触させることを含むことができる（例えば、前記緩衝液は、前記ＤＮａｓｅとともに販売されるキット中の緩衝液であり得る）。本出願において、前記緩衝液は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含むことができる。例えば、前記緩衝液は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含むことができ、且つ他の陽イオンも含まないことを含む。前記緩衝液は、前記ＤＮａｓｅの酵素切断効率を向上させることができる。
本出願の前記方法において、前記ＤＮａｓｅ処理は、前記接触した前記プラスミドを精製する段階を含むことができる。
前記ＤＮａｓｅ処理後、前記外因性遺伝子含有プラスミドを含むトランスフェクション混合物中の少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めることができ、および／または、前記ＤＮａｓｅ処理後、前記外因性遺伝子含有プラスミドを含むトランスフェクション混合物中の宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めることができる。
本出願において、前記ＤＮａｓｅ処理後、前記外因性遺伝子含有プラスミドを含むトランスフェクション混合物中の大きな断片（少なくとも約１０ｋｂの大きさ、例えば少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）および／または宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、本出願に記載の含有量範囲要件を満たすことができる。
本出願において、前記接触は、ＲＮａｓｅとさらに接触させることを含むこともできる。
本出願において、ヌクレアーゼまたはＤＮＡｓｅは、核酸を加水分解する酵素である。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに分類されることができる。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解を触媒する任意の酵素のグループである。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の末端からの単一のヌクレオチドの加水分解を触媒する任意の酵素のグループである。ヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に消化するかによって分類されることもできる。ＤＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼまたはＤＮａｓｅと呼ばれることができるが、ＲＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅと呼ばれることができる。いくつかのヌクレアーゼの一本鎖または二本鎖の核酸配列は、特異性を有する。いくつかの酵素は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方の特性を有する。さらに、いくつかの酵素は、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の両方を消化することができる。
異なるヌクレアーゼにおいて、最適な反応条件は、異なる。考慮すべき要素は、温度、ｐＨ、酵素補因子、塩組成、イオン強度および安定剤を含む。市販可能なヌクレアーゼの供給者（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）は、各種の酵素の最適条件に関する情報を提供する。例えば、インキュベーション温度で測定したほとんどのヌクレアーゼは、ｐＨ７．２乃至ｐＨ８．５の間で使用される。さらに、ほとんどのヌクレアーゼは、３７℃下で最大活性を示し、しかしながら、少数の酵素は、最適な活性を得るためにそれ以上またはそれ以下の温度（例えば、Ｔａｑ Ｉ、６５℃、Ｓｍａ Ｉ、２５℃）を必要とする。ＤＮＡ濃度も、一つの要因となる可能性があり、ＤＮＡ濃度が高いと酵素活性が低下する可能性があり、ＤＮＡ濃度が薄すぎると酵素のＫｍよりも低くなり、酵素活性にも影響を与える可能性があるためである。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅＩ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、緑豆ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮａｓｅＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ（ＬａｍｂｄａＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＲｅｃＪおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む。ＤＮａｓｅＩは、ＤＮＡを非特異的に切断して、５’－リン酸化および３’－ヒドロキシ化末端を有するジヌクレオチド、トリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド生成物を放出するエンドヌクレアーゼである。ＤＮａｓｅＩは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、クロマチンおよびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに作用する。エキソヌクレアーゼＩは、一本鎖ＤＮＡ中の３’から５’方向へのヌクレオチドの除去を触媒する。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二重らせんＤＮＡの３’－ヒドロキシ基末端からの単一ヌクレオチドの段階的除去を触媒する。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、一本鎖ギャップを生成するために、二重らせんＤＮＡの切開にさらに作用する。一本鎖ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して耐性を有する。緑豆ヌクレアーゼは、ＤＮＡ末端から一本鎖伸長を分解する。緑豆ヌクレアーゼも、ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。ヌクレアーゼＢＡＬ３１は、二重らせんＤＮＡの３’末端および５’末端の両方を分解する。ヌクレアーゼＢＡＬ３１は、二重らせんＤＮＡおよびＲＮＡの切開、ギャップおよび一本鎖領域で切断される、高度に特異的な一本鎖エンドヌクレアーゼでもある。ＲＮａｓｅＩは、すべてのＲＮＡジヌクレオチドを切断する一本鎖特異的なＲＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｓ１ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼによって一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを分解して、５’－ホスホリル基－末端の生成物を取得する。二本鎖核酸（ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ）は、非常に高濃度の酵素を除いて、Ｓ１ヌクレアーゼによる分解に耐性を有する。λエキソヌクレアーゼは、二重らせんＤＮＡから５’モノヌクレオチドの除去を触媒する。その好ましい基質は、５’－リン酸化二本鎖ＤＮＡであるが、λエキソヌクレアーゼは、一本鎖および非リン酸化基質も非常に遅い速度で分解する。λエキソヌクレアーゼは、切開またはギャップ部分でＤＮＡ消化を引き起こすことができず、ＲｅｃＪは、ＤＮＡ中の５’から３’へのデオキシヌクレオチド一リン酸の除去を触媒する一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼである。Ｔ７エキソヌクレアーゼは、二重らせんＤＮＡから５’モノヌクレオチドの除去を触媒する。Ｔ７エキソヌクレアーゼは、５’末端または二本鎖ＤＮＡの切開およびギャップからのヌクレオチドの除去を触媒する。
本出願において、前記低下は、ＤＮＡ人工合成部分、本出願に記載のプラスミドおよび本出願に記載のトランスフェクション混合物のＨＰＬＣ検出からなる群から選択される方法を使用することを含むことができる。例えば、プラスミドのヌクレオチド配列に従ってＤＮＡを直接人工的に合成することができ、得られたプラスミドは、当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むことができる。例えば、ＨＰＬＣに従って、本出願に記載のトランスフェクション混合物を検出することができ、ＨＰＬＣの検出結果に応じて、前記プラスミドに対応する特徴ピークを選択し、当該特徴ピークに対応する成分を収集することができ、得られたプラスミドが当該プラスミドのヌクレオチド配列のみを含むようにすることができる。
遺伝子編集システム
本出願において、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を前記細胞ゲノムの特定の位置に組み込ませることができる遺伝子編集システムをさらに含む。例えば、前記遺伝子編集システムは、部位特異的酵素またはそれをコードする核酸分子を含む。例えば、前記部位特異的酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、トランスポザーゼ、インテグラーゼおよびＣａｓタンパク質から選択される。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。例えば、前記遺伝子編集システムは、一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含む。例えば、前記ガイドＲＮＡは、前記細胞ゲノムの標的領域中の核酸配列に相補的である。
例えば、前記遺伝子編集システムノックアウトされる一つまたは複数の遺伝子を標的とする一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含むことができる。
特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、ＰＤ－１を標的とする一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含むことができる。
特定の実施形態において、前記遺伝子編集システムは、ＣＤ９５を標的とする一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含むことができる。
例えば、前記遺伝子編集システムは、リボ核タンパク質複合体ＲＮＰを含み、前記ＲＮＰは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡを含む。
例えば、前記遺伝子編集のシステムおよび方法は、遺伝子編集の目的を達成することができる限り当業者に公知のものであり、特定の方法に限定されない。本出願において、前記遺伝子編集の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択できる。例えば、前記遺伝子編集の方法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。
本出願において、前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックアウトおよび／または遺伝子編集ノックインを含むことができる。例えば、前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックインを含むことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、前記遺伝子編集ノックインを実行することができる。
例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、クラスター化された規則的に間隔を置いた短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲｓ）およびいくつかの機能的に関連したタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｃａｓ）を含むことができる。ここで、前記Ｃａｓタンパク質コード遺伝子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２およびＣｓｎ２を含むことができる。例えば、Ｃａｓ９であり得る。前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）は、ＤＮＡ分子に対する標的化された切断特異性を有することができる。
例えば、前記遺伝子編集ノックインは、Ｃａｓタンパク質を細胞内の特異性ＤＮＡ配列を標的して、ＤＮＡ配列を挿入するプロセスであり得る。前記遺伝子編集ノックインは、前記ドナープラスミドに前記ノックインされる外因性遺伝子とその標的細胞内の特異性ＤＮＡ配列との間の、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）によって媒介した相同組換えプロセスであり得る。
本出願において、前記外因性核酸分子（例えば、プラスミド）は、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能することができる。例えば、前記ドナープラスミドは、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡであり得る。前記ドナープラスミドは、ＨＤＲ修復メカニズムのドナーテンプレートとして機能することができる。
本出願において、前記ドナープラスミドは、ノックインされる外因性遺伝子の核酸分子またはその断片を含むことができる。
本出願の部位特異的酵素は、核酸配列中の特定のヌクレオチドサブユニット間の結合（即ち、ホスホジエステル結合）を切断することができる。具体的な実施形態において、前記部位特異的酵素は、ＲＮＡ上にコードされる。別のいくつかの実施形態において、前記部位特異的酵素は、酵素活性を有するタンパク質、酵素または小分子模倣物である。いくつかの実施形態において、前記部位特異的酵素は、ＤＮＡ上にコードされる。具体的な実施形態において、前記部位特異的酵素は、プラスミドＤＮＡ上にコードされる。いくつかの実施形態において、前記部位特異的酵素およびドナーＤＮＡは、同じプラスミド上にコードされる。
一実施形態において、前記部位特異的酵素は、トランスポザーゼである。前記トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼであり得る。特定の状況において、前記トランスポザーゼは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼであり得る。
例えば、正確に限定したＤＮＡ配列を脊椎動物の染色体に導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾン（例えば、「スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）」トランスポゾンシステム）を使用することができる。スリーピングビューティートランスポゾンシステムは、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＳＢ）トランスポザーゼ、および脊椎動物のゲノムに特定のＤＮＡ配列を挿入するように設計されたトランスポゾンで構成される。ＤＮＡトランスポゾンは、簡単なカットアンドペーストの方法で、一つのＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位に移動する。移調（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、正確なプロセスであり、ここで、限定されたＤＮＡ断片を一つのＤＮＡ分子から切除し、且つ同じまたは異なるＤＮＡ分子またはゲノム内の別の部位に移動させる。ＳＢトランスポザーゼは、トランスポゾンを受容体ＤＮＡ配列のＴＡジヌクレオチド塩基対に挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子の別の位置にあることも、別のＤＮＡ分子（または染色体）にあることもある。哺乳動物（ヒトを含む）のゲノムには、約２億個のＴＡ部位が存在する。トランスポゾンの組み込み中にＴＡ挿入部位を複製する。当該ＴＡ配列の複製は、移調（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特徴であり、メカニズムを解明するためにいくつかの実験で使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内にコードされるか、またはトランスポザーゼは、別の供給源から提供され、その場合、トランスポゾンは、非自律性要素になる。非自律性トランスポゾンは、挿入後に独立して切除および再挿入を続けることができないため、最も有用な遺伝ツールである。ヒトゲノムおよびほかの哺乳動物のゲノムで同定されたすべてのＤＮＡトランスポゾンは、非自律的であり、それらは、トランスポザーゼ遺伝子を含むが、これらの遺伝子は、機能しておらず、且つトランスポゾンを移動させることができるトランスポザーゼを生成できないためである。
本出願において、前記トランスポゾンシステムは、トランスポゾンを含むことができる。前記トランスポゾンは、トランスポザーゼによって核酸に組み込まれることができる核酸分子を含むことができる。トランスポゾンは、トランスポザーゼの存在下でループを形成するのに十分な長さの配列によって結合された二つのトランスポゾン末端（「アーム」とも呼ばれる）を含むことができる。トランスポゾンは、当該トランスポゾンの挿入に使用されるトランスポザーゼに応じて、二本鎖、一本鎖または一本鎖領域および二本鎖領域を含む混合物であり得る。トランスポザーゼは、Ｍｕ、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７および／またはＴｎ１０を含むことができる。トランスポゾンの末端は、二本鎖であり得る。本出願において、前記トランスポゾンは、移調（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）イベントによって二本鎖ＤＮＡに挿入されることもできる。本出願において、前記トランスポゾンは、前記外因性遺伝子と見なすことができる。前記プラスミドは、前記トランスポゾンを含むことができる。前記プラスミドは、移調（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）イベントに必要な核酸分子をさらに含むことができる。例えば、前記トランスポゾンシステムは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（スリーピングビューティー）トランスポゾンシステムを含むことができる。前記スリーピングビューティートランスポゾンシステムは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンスーパーファミリーのメンバーである。例えば、前記トランスポゾンシステムは、Ｐｉｇｇｙ Ｂａｃトランスポゾンシステムを含むことができる。
別の実施形態において、前記部位特異的酵素は、インテグラーゼである。例えば、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、バクテリオファージｐｈｉＣ３１のゲノム内にコードされる配列特異的リコンビナーゼである。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、アタッチメントサイト（ａｔｔ）と呼ばれる二つの３４個の塩基対配列間の組換えを媒介し、一つは、バクテリオファージから得られ、もう一つは、細菌宿主から得られる。当該セリンインテグラーゼは、多くの異なる細胞型（哺乳動物細胞を含む）効率的に機能することが示される。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下で、天然ａｔｔＰ部位に類似した配列を有する部位（擬似ａｔｔＰ部位と呼ばれる）での組換えによって、ａｔｔＢ含有ドナープラスミドを標的ゲノムに一方向に組み込むことができる。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、任意のサイズのプラスミドを単一コピーとして組み込まれることができ、補因子を必要としない。組み込まれた導入遺伝子は、安定的に発現され、且つ遺伝性である。
一実施形態において、前記部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。関連する実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ｃａｓ９であり、且つ組成物は、ガイドＲＮＡをさらに含む。本明細書に記載の方法および組成物とともに使用できる配列特異的ヌクレアーゼシステムの別の例としては、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを含む（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ、Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４８２、３３１－３３８（２０１２）、Ｊｉｎｅｋ、Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６－８２１（２０１２）、Ｍａｌｉ、Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９、８２３－８２６（２０１３）、Ｃｏｎｇ、Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９、８１９－８２３（２０１３））。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復配列、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）システムは、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡ結合および配列特異的標的ＤＮＡの切断を利用する。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９の組み合わせにより、ヌクレアーゼに部位特異性を与える。ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な約２０個のヌクレオチドを含み、当該標的ゲノムＤＮＡ配列は、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ））部位（ＮＮＧ）および定常ＲＮＡ足場領域の上流にある。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）９タンパク質は、ｇＲＮＡ、およびｇＲＮＡ結合標的ＤＮＡに結合し、且つＰＡＭ部位の上流の限定の位置に二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに相同な二つの独立したヌクレアーゼドメインを有し、二つのドメインのいずれかを突然変異させることによって、Ｃａｓ９タンパク質を一本鎖切断を導入するニッキング酵素に変換することができる（Ｃｏｎｇ、Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９、８１９－８２３（２０１３））。本発明の方法および組成物は、Ｃａｓ９の一本鎖または二本鎖誘導型およびほかのＲＮＡ誘導性ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、他の細菌のＣａｓ９様システム）とともに使用できることが特に企図される。
本明細書に記載の方法および組成物の部位特異的ヌクレアーゼは、操作、キメラまたは生物から分離することができる。配列特異的ヌクレアーゼは、配列特異的ヌクレアーゼをコードするＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）で細胞に導入されることができる。
一実施形態において、前記部位特異的酵素は、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ等の部位特異的ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、一般に、ＤＮＡ結合ドメイン（即ち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（即ち、ヌクレアーゼ）を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した任意の核酸配列を識別し且つ結合するように操作されることができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１ １－４１６、Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０－３３８６０、Ｄｏｙｏｎら（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２－７０８、およびＳａｎｔｉａｇｏら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５：５８０９－５８１４を参照する。天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、改変されたジンクフィンガー結合ドメインは、新しい結合特異性を有することができる。改変方法は、合理的な設計および様々なタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、タブレット、トリプレットおよび／またはクアドラプレットのヌクレオチド配列および単一のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、ここで、各タブレット、トリプレットおよび／またはクアドラプレットのヌクレオチド配列は、一つのまたは複数のジンクフィンガーアミノ酸配列と関連付けられ、前記ジンクフィンガーは、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合する。例えば、米国特許Ｎｏ．６，４５３，２４２および６，５３４，２６１を参照し、その開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。一例として、米国特許６，４５３，２４２に記載のアルゴリズムを使用して、予め選択した配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。代替的な方法（例えば、非縮退識別子テーブルを使用した合理的な設計）を使用して、特定の配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計することもできる（Ｓｅｒａら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：７０７４－７０８１）。ＤＮＡ配列内の潜在的な標的部位を同定し、且つジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公的に利用可能なウェブベースのツールは、それぞれｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇおよびｈｔｔｐ：／／ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ，ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／で入手することができる（Ｍａｎｄｅｌｌら（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６－Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒら（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９－Ｗ６０５）。ジンクフィンガー結合ドメインは、長さ約３個のヌクレオチド乃至約２１個のヌクレオチド、または好ましくは長さ約９個乃至約１８個のヌクレオチドのＤＮＡ配列を識別して結合するように設計されることができる。一般に、ジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも三つのジンクフィンガー識別領域（即ち、ジンクフィンガー）を含む。一実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、四つのジンクフィンガー識別領域を含むことができる。別の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、五つのジンクフィンガー識別領域を含むことができる。さらに別の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、六つのジンクフィンガー識別領域を含むことができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適切な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計されることができる。例えば、米国特許Ｎｏ．６，６０７，８８２、６，５３４，２６１および６，４５３，２４２を参照し、その開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナルまたは配列（Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＮＬＳ）を含むことができる。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の核への標的化を促進して、染色体の標的配列に二本鎖切断を導入するアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野で知られている。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１０２５－１０２７を参照する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断ドメインをさらに含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られることができる。切断ドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限性エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照する。
別の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）であり得る。メガヌクレアーゼは、大きな識別部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、即ち、識別部位は、一般に、約１２個の塩基対乃至約４０個の塩基対である。当該要件の結果として、識別部位は、一般に、任意の特定のゲノム内で１回だけ発生する。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５乃至４０個の塩基対の切断部位を識別し、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの四つのファミリーに分類される。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を使用して、その識別配列を修飾することによって、特定の染色体配列を標的とすることができる。
別の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ、ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであり得る。ＴＡＬＥは、植物病原体のザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）由来の転写因子であり、それは、新しいＤＮＡ標的に結合するように簡単に操作されることができる。ＴＡＬＥまたはその切断型は、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）の触媒ドメインに結合して、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを生成することができる。
別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、１－５′ｃｅｌ、ｌ－Ｃｅｕｌ、ｌ－Ｐｓｐｌ、Ｖｌ－Ｓｃｅ、ｌ－ＳｃｅＴＶ、Ｉ－Ｃｓｍｌ、ｌ－Ｐａｎｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌ、ｌ－Ｐｐｏｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ－Ｃｒｅｌ、ｌ－Ｔｅｖｌ、１－ＴｅｖおよびＩ－７ｅｖＩＩＩを含む。その識別配列は、既知である。米国特許Ｎｏ．５，４２０，０３２、米国特許Ｎｏ．６，８３３，２５２、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｏｕ ｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、１ １２５－１ １２７らＪａｓｉｎ（１９９６）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８）ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照する。
特定の実施形態において、前記部位特異的酵素は、改変された（天然に存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ（例えば、ｌ－Ｓｃｅｌ、ｌ－Ｃｅｕｌ、ＶＩ－Ｐｓｐｌ、Ｖｌ－Ｓｃｅ、ｌ－ＳｃｅｌＮ、ｌ－Ｃｓｍｌ、ｌ－Ｐａｎｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌ、ｌ－Ｐｐｏｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ－Ｃｒｅｌ、ｌ－Ｔｅｖｌ、ｌ－ＴｅｖｌｌおよびＩ－７ｅｖＩＩＩ）の識別配列は、既知である。米国特許Ｎｏ．５，４２０，０３２、米国特許Ｎｏ．６，８３３，２５２、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照する。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合されるように改変されることができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、米国特許公開Ｎｏ．２００７０１１７１２８を参照する。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、一つの全体としてヌクレアーゼ背景下で変更されるか（即ち、ヌクレアーゼが相同切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合させることができる。
一実施形態において、前記部位特異的酵素は、ｏｍｅｇａ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９からなる群の、または当該グループから選択される部位特異的ヌクレアーゼである。
例えば、本出願の遺伝子編集システムである。
外因性核酸分子
例えば、前記外因性核酸分子は、プラスミドであり得る。例えば、前記外因性核酸分子は、環状核酸分子、スーパーコイル核酸分子および／または直鎖状核酸分子を含むことができる。例えば、前記外因性核酸分子は、ＤＮＡ分子であり得る。例えば、前記外因性核酸分子は、一本鎖核酸分子および／または二本鎖核酸分子を含むことができる。例えば、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約５μｇ／ｍＬ乃至約３０００μｇ／ｍＬ（例えば、約５μｇ／ｍＬ乃至約２５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ乃至約２０００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ乃至約１５００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ乃至約１０００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ乃至約１２００μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ乃至約１０００μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ乃至約９００μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ乃至約９００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１１０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１３０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ乃至約９５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ乃至約８５０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ乃至約７５０μｇ／ｍＬ、約３５０μｇ／ｍＬ乃至約７００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ乃至約６５０μｇ／ｍＬ、約４５０μｇ／ｍＬ乃至約６００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ乃至約５５０μｇ／ｍＬ等）であり得る。特定の実施形態において、前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬである。
本出願において、前記プラスミドは、環状プラスミドを含むことができる。例えば、前記プラスミドは、前記ＤＮａｓｅ処理による干渉を受けることなく消化されることができる。例えば、前記プラスミドは、環状プラスミド、スーパーコイルプラスミドおよび／または直鎖状プラスミドであり得る。
例えば、前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から抽出して取得されることができる。一般的なプラスミド抽出方法は、当業者によく知られている。
本出願において、前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約１ｋｂ、例えば少なくとも約１．５ｋｂ、少なくとも約２ｋｂ、少なくとも約２．５ｋｂ、少なくとも約３ｋｂ、少なくとも約３．５ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約４．５ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約５．５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約６．５ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約７．５ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約８．５ｋｂ、少なくとも約９ｋｂまたはそれ以上であり得る。
例えば、前記外因性核酸分子は、一つまたは複数の相同領域をさらに含むことができる。例えば、前記相同領域のそれぞれは、少なくとも１０個のヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも３０個のヌクレオチド、少なくとも４０個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも７０個のヌクレオチド、少なくとも８０個のヌクレオチド、少なくとも９０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも１１０個のヌクレオチド、少なくとも１２０個のヌクレオチド、少なくとも１３０個のヌクレオチド、少なくとも１４０個のヌクレオチド、少なくとも１５０個のヌクレオチド、少なくとも１６０個のヌクレオチド、少なくとも１７０個のヌクレオチド、少なくとも１８０個のヌクレオチド、少なくとも１９０個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチドまたはそれ以上）を含むことができる。例えば、前記外因性核酸分子において、前記相同領域は、前記外因性遺伝子の３’末端および／または５’末端に位置することができる。特定の実施形態において、少なくとも一つの前記相同領域は、前記外因性遺伝子の３’末端に位置し、少なくとももう一つの前記相同領域は、前記外因性遺伝子の５’末端に位置する。
例えば、前記外因性遺伝子は、前記細胞のゲノムに組み込まれることができる。例えば、前記外因性遺伝子の発現は、内因性プロモーターまたは外因性プロモーターによって制御されることができる。例えば、前記外因性遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれた後、その発現は、内因性プロモーターまたは外因性プロモーターによって制御されることができる。例えば、前記相同領域は、前記細胞ゲノムＤＮＡの標的領域と相同であり得る。例えば、前記標的領域は、ＴＣＲ－αサブユニット定常遺伝子（ＴＲＡＣ）内に位置することができる。例えば、前記標的領域は、ＡＡＶＳ－Ｉ部位に位置することができる。
例えば、前記外因性遺伝子は、一種または複数種の外因性タンパク質をコードすることができる。例えば、前記外因性タンパク質は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよびケモカインからなる群のうちの一種または複数種を含むことができる。
例えば、前記ＣＡＲは、腫瘍関連抗原を標的とする標的結合ドメインを含むことができる。例えば、前記腫瘍関連抗原は、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２およびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎから選択されることができる。例えば、前記抗体または抗原結合断片は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。例えば、前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）および腫瘍細胞を同時に標的とすることができる。例えば、前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことができる。例えば、前記ＢｉＴＥは、ＣＤ３結合ドメインを含むことができる。例えば、前記ＢｉＴＥは、腫瘍関連抗原結合ドメインをさらに含むことができる。
例えば、前記サイトカインは、インターロイキンを含むことができる。例えば、前記インターロイキンは、ＩＬ１５、ＩＬ１７またはそれらの機能的活性断片を含むことができる。
例えば、前記ケモカインは、ＣＣＬ１９またはその機能的活性断片を含むことができる。
例えば、前記外因性タンパク質は、前記サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ１５、ＩＬ１７またはそれらの機能的活性断片）および前記ケモカイン（例えば、ＣＣＬ１９またはその機能的活性断片）を含むことができる。
例えば、前記外因性タンパク質は、ＣＡＲ（例えば、ＧＰＣ３ ＣＡＲ）、前記サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ１５、ＩＬ１７またはそれらの機能的活性断片）および前記ケモカイン（例えば、ＣＣＬ１９またはその機能的活性断片）を含むことができる。
例えば、前記外因性タンパク質は、ポリタンパク質を含むことができる。例えば、前記ポリタンパク質中の二つまたはそれ以上のタンパク質間には、分解可能部分が含まれることができる。例えば、前記分解可能部分は、２Ａペプチドを含むことができる。例えば、前記２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＥ２Ａを含むことができる。
例えば、本出願において、前記外因性遺伝子は、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／または多重特異性抗体、完全なＩｇ抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）、抗体断片（例えば、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ））、サイトカイン、ケモカイン、キメラ抗原受容体およびＭＨＣ複合体（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｇ）からなる群から選択される一種または複数種のタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
例えば、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲをコードすることができる。例えば、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲおよびサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５またはＩＬ－７）を同時にコードすることができる。例えば、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲ、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５またはＩＬ－７）およびケモカイン（例えば、ＣＣＬ１９）を同時にコードすることができる。例えば、前記外因性遺伝子は、ＣＡＲ－ＢｉＴＥ（またはＣＡＲ－２Ａ－ＢｉＴＥ）をコードすることができる。
本出願において、前記外因性遺伝子は、天然のものであっても、光学的に改変により得られた遺伝子であってもよい。
本出願において、前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含むことができ、前記外因性遺伝子は、トランスフェクトされた前記細胞のゲノムに組み込まれることができる。
本出願において、前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約１０００ｂｐ（例えば、少なくとも約１５００ｂｐ、少なくとも約２０００ｂｐ、少なくとも約２５００ｂｐ、少なくとも約３０００ｂｐ、少なくとも約３５００ｂｐ、少なくとも約４０００ｂｐ、少なくとも約４５００ｂｐ、少なくとも約５０００ｂｐ、少なくとも約５５００ｂｐ、少なくとも約６０００ｂｐ、少なくとも約６５００ｂｐ、少なくとも約７０００ｂｐ、少なくとも約７５００ｂｐ、少なくとも約８０００ｂｐ、少なくとも約８５００ｂｐ、少なくとも約９０００ｂｐ、少なくとも約９５００ｂｐまたはそれ以上であり得る）であり得、ここで、前記外因性遺伝子は、トランスフェクトされた前記細胞のゲノムに組み込まれる。例えば、前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約１０００ｂｐ、少なくとも約３０００ｂｐ、少なくとも約３５００ｂｐであり得る。
特定の実施形態において、前記外因性遺伝子の大きさは、最大約１０ｋｂであり得る。例えば、最大約９９００ｂｐ、最大約９８００ｂｐ、最大約９７００ｂｐ、最大約９６００ｂｐまたはそれ以上であり得る。
場合によっては、前記外因性遺伝子の大きさは、本出願に記載の少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片（例えば、宿主のゲノムＤＮＡ）の大きさと明確に区別することができる。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により、前記外因性遺伝子のバンドの前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片のバンドは、同じレーンの異なる位置にあることが明らかにわかる。場合によっては、前記外因性遺伝子の大きさは、本出願に記載の宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさと明確に区別することができる。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により、前記外因性遺伝子のバンドの前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片のバンドは、同じレーンの異なる位置にあることが明らかにわかる。
本出願において、前記外因性遺伝子は、一つ以上（例えば、一種、二種、三種またはそれ以上）のタンパク質を発現することができる。例えば、前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることができる。例えば、前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のみをコードすることができる。例えば、前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または第２のタンパク質をコードする核酸分子を含むことができ、前記第２のタンパク質は、前記キメラ抗原受容体とは異なる。本出願において、前記第２のタンパク質は、前記キメラ抗原受容体とは異なる任意の一つまたは複数のタンパク質であり得る。
例えば、前記キメラ抗原受容体は、抗原を標的とする少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、前記キメラ抗原受容体は、一つの抗原に特異的に結合することができる。例えば、前記キメラ抗原受容体は、二つの抗原に特異的に結合することができるか、および／または、一つの抗原の少なくとも二つの異なるエピトープに特異的に結合することができる。本出願において、前記抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。前記腫瘍関連抗原は、例えば、乳がん細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、中皮腫、肺がん細胞（例えば、小細胞肺がん細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、中皮腫細胞、肺がん細胞（例えば、小細胞肺がん細胞）、黒色腫細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、結腸直腸がん細胞等の腫瘍細胞の関連する抗原であり得る。癌細胞関連抗原は、非癌細胞によって発現されることもできる。例えば、前記抗原は、ＣＤ１９であり得る。例えば、前記抗原は、ＧＰＣ３であり得る。
場合によっては、前記抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、またはｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）およびそのヒト化変異体、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）およびそのヒト化変異体、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）および「ラクダ化」抗体可変ドメインであり得る。前記抗原結合ドメインは、例えば一本鎖ＴＣＲ（ＶαＶβ含有一本鎖２ドメインＴＣＲ）等のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの識別ドメインであり得る。
本出願において、前記キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインを含むことができる。前記膜貫通ドメインのＮ末端は、前記抗原結合ドメインのＣ末端に直接的にまたは間接的に結合することができる。本出願において、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）の細胞膜へのポリペプチドの挿入のために提供される任意の膜貫通（ＴＭ）構造は、すべて前記膜貫通ドメインに適していることができる。
例えば、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される下記タンパク質に由来する膜貫通ドメインを含むことができる。
場合によっては、前記キメラ抗原受容体は、ヒンジ領域を含むことができる。ここで、前記ヒンジ領域は、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置することができる。前記ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域であり得、前記ヒンジ領域は、受容体由来のヒンジ領域ポリペプチド（例えば、ＣＤ８のヒンジ領域に由来することができる）であり得る。
前記ヒンジ領域の長さは、約４－約５０個のアミノ酸であり得る。例えば、約４－約１０個のアミノ酸、約１０－約１５個のアミノ酸、約１５－約２０個のアミノ酸、約２０－約２５個のアミノ酸、約２５－約３０個のアミノ酸、約３０－約４０個のアミノ酸または約４０－約５０個のアミノ酸であり得る。
前記ヒンジ領域は、少なくとも一つのシステインを含むことができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、当技術分野で知られている可能性があり、例えば、Ｔａｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１６２、およびＨｕｃｋら．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：１７７９を参照する。
本出願において、前記ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、ヒンジ領域は、一つのまたは複数のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失を含むことができる。
本出願において、前記キメラ抗原受容体は、共刺激ドメインを含むことができる。前記共刺激ドメインの長さは、約３０－約７０個のアミノ酸であり得る。前記共刺激ドメインは、受容体のポリペプチドに由来することができる。例えば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であり得る。例えば、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲおよびＨＶＥＭ等のタンパク質に由来する共刺激ドメインを含むことができる。例えば、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳ等のタンパク質に由来する共刺激ドメインを含むことができる。
本出願において、前記キメラ抗原受容体は、リンカーをさらに含むことができる。前記リンカーは、前記膜貫通ドメインと前記共刺激ドメインとの間に位置することができる。前記リンカーは、接続ペプチドであり得る。例えば、前記接続ペプチドは、約６－約４０個のアミノ酸の長さを有することができる。前記接続ペプチドは、柔軟な構造を有するものであれば、任意のアミノ酸配列を有することができる。
本出願において、前記キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８β、ＣＤ４、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ７等のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインを含むことができる。
本出願において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部分を含むことができる。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃε受容体Ｉγ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ζ）およびＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）を含むことができる。
本出願において、前記第２のタンパク質は、サイトカイン、ケモカインおよび抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される少なくとも１種であり得る。本出願において、前記第２のタンパク質は、任意の一種または複数種の機能性タンパク質を含むことができる。例えば、前記機能性タンパク質は、遺伝子欠損に関連する疾患の治療に使用されることができる。例えば、前記機能性タンパク質は、トランスフェクトされた細胞が位置する宿主（ｈｏｓｔ）内で欠失および／または突然変異したタンパク質であり得る。例えば、前記機能性タンパク質を発現する外因性遺伝子は、前記ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）（例えば、初代ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ））、筋細胞および／または幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）にトランスフェクトされることができる。
本出願において、前記サイトカインは、生物学的または細胞の機能またはプロセス（例えば、免疫応答）を媒介および／または調節できる限り、任意の所望のサイトカインであり得る。前記サイトカインは、リンホカイン、モノカインおよび／またはインターロイキンを含むことができる。前記サイトカインは、例えば、Ｓａｕｖe ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８、４６３６－４０（１９９１）、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、４８５３－４８６１（２００３）および米国特許公開Ｎｏ．２００３／０１２４６７８、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２（２０００）、Ｈｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ５３、２５９７－６０２（１９９３）および米国特許Ｎｏ．５，２２９，１０９、米国特許公開Ｎｏ．２００７／００３６７５２、ＷＯ ２００８／００３４４７３、ＷＯ ２００９／０６１８５３に記載されるように、対応する野生型サイトカインのアミノ酸配列に一つまたは複数のアミノ酸突然変異が含まれるサイトカインの変異体をさらに含むことができる。
例えば、前記サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－βからなる群から選択される少なくとも１種であり得る。例えば、前記サイトカインは、ＩＬ－１５を含むことができる。例えば、前記サイトカインは、ＩＬ－７を含むことができる。
本出願において、前記ケモカインは、ＣＣＬ１９、９Ｅ３、ＡＭＣＦ、β－グロブリン、ＥＮＡ－７８、ｅｏｔａｘｉｎ、ｅｏｔａｘｉｎ－２、ＩＰ－ＩＯ、ＫＣ、ＬＩＸ、ｍｉｇ、ＭＧＳＡ、ｍｏｂ－ｌ、ＮＡＰ－２、ＮＡＰ－３、ＮＡＰ－４、ＰＢＳＦ、ＭＧＳＡ、マウスＫＣ、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－１α、ＮＡＰ－２、ＥＮＡ－７８、ＧＣＰ－２、ＡＣＴ－２、ＣＩＯ、ＣＣＦ１８、ＤＣ－ＣＫ１、ＥＬＣ、Ｅｘｏｄｕｓ、ＦＩＣ、ＧＤＣＦ、ＧＤＣＦ－２、ＨＣ－２１、ＨＣＣ－１、１－３０９、ＪＥ、ＬＡＧ－１、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＣＰ－５、ＭＲＰ－２、ＲＡＮＴＥＳＳＤＦ、ＴＡＲＣ、ＡＴＡＣ、Ｌｔｎ、ＳＣＭ－１およびｎｅｕｒｏｔａｃｔｉｎからなる群から選択される少なくとも１種であり得る。
本出願において、前記第２のタンパク質は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むことができる。例えば、前記第２のタンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことができる。例えば、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、少なくとも１種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＴ細胞に特異的に結合することができる。例えば、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞の表面に発現する抗原を特異的に結合することができ、例えば、ＣＤ３受容体であり得る。例えば、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＭＨＣ－非依存性腫瘍関連抗原（ＴＡＡＳ）を特異的に標的とすることができる。
前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、少なくとも一つの抗原結合部分を含むことができ、例えば、少なくとも一つの一本鎖抗体ｓｃＦｖを含むことができる。
本出願において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、ＣＤ３およびＣＤ１９を標的とすることができ、ＣＤ３およびＣＥＡを標的とすることができ、ＣＤ３およびＰＳＭＡを標的とすることができ、またはＥｐＣＭＡおよびＣＤ３を標的とすることができる。例えば、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ３８を標的とすることができる。例えば、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ(R)）、ＭＴ１１１、ＭＴ１１２ＢＡＹ２０２０１１２、ＭＴ１１０ＡＭＧ１１０および／またはＳＡＲ４４２２５７を含むことができる。
本出願において、前記外因性タンパク質がＣＡＲおよびＢｉＴＥを含む場合、前記ＢｉＴＥが標的とする腫瘍関連抗原と前記ＣＡＲが標的とする腫瘍関連抗原とは、同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態において、前記ＢｉＴＥは、前記ＣＡＲと同じエピトープを標的とする。特定の実施形態において、前記ＢｉＴＥは、与前記ＣＡＲと同じ標的を標的とするが、それぞれが当該標的の異なるエピトープを特異的に識別または結合する。特定の実施形態において、前記ＢｉＴＥは、前記ＣＡＲと異なる標的を標的とする。
本出願において、前記外因性遺伝子は、本出願に記載のキメラ抗原受容体および前記サイトカインを発現することができる。本出願において、前記外因性遺伝子は、本出願に記載のキメラ抗原受容体および前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を発現することができる。
本出願において、前記外因性核酸分子（例えば、プラスミド）は、細胞ゲノム中の標的遺伝子と相同な相同性アームを含むことができる。例えば、前記相同性アームは、それぞれトランスフェクトされる細胞のゲノムＤＮＡ中のノックインされる位置の５’末端および／または３’末端の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。例えば、前記相同性アームは、１００－１０００ｂｐの大きさであり得る。例えば、前記相同性アームは、約１５０ｂｐ－１０００ｂｐ、約２００ｂｐ－１０００ｂｐ、約３００ｂｐ－１０００ｂｐ、約４００ｂｐ－１０００ｂｐ、約８００ｂｐ－１０００ｂｐであり得る。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、核酸ベクターの形態であり得る。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を細胞に導入するために挿入して、複製し発現させることができるベクター核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、「異種」であり得、これは、トランスフェクトされる細胞または挿入された核酸配列にとって、当該核酸配列が外来であることを意味する。ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、コスミドおよび人工染色体（例えば、ＹＡＣ）等を含む。当業者は、組換え調製技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等ら、２００１、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９６）によってベクターを構築することができる。ベクターは、細胞をトランスフェクトして、抗体または他の外因性タンパク質を生成するために使用されることができる。
本出願において、前記外因性核酸分子は、例えばプロモーター等の調節配列を含むことができる。プロモーターは、一般に、転写の開始および速度を制御する核酸配列内の領域である。プロモーターは、調節タンパク質および分子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子）に結合できる遺伝子エレメントを含むことができる。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用してもしなくてもよく、前記「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す。
ベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも一つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。従って、特定の実施形態において、ＲＮＡ転写物の生成を終止させる終結シグナルが考慮される。真核システムにおいて、ターミネーター領域は、新しい転写物の部位特異的切断を可能にして、ポリアデニル化部位を露出される特異的ＤＮＡ配列をさらに含むことができる。これは、特殊な内因性ポリメラーゼに、転写物の３’末端に約２００個のＡ残基（ｐｏｌｙＡ）の伸長配列を追加するように、シグナルを送る。当該ｐｏｌｙＡテールを使用で修飾されたＲＮＡ分子は、より安定しており、より効果的に翻訳されるようである。従って、真核生物に言及される別の実施形態において、当該ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことができ、例えば、当該ターミネーターシグナルは、ポリアデニル化メッセージを促進することができる。
本出願の外因性核酸分子は、適切な転写物のポリアデニル化に影響を与えるポリアデニル化シグナルを含むことができる。
特定の実施形態において、前記外因性核酸分子は、複製が開始された特異的核酸配列である、一つのまたは複数の複製出発部位（一般に「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含むことができる。または、宿主細胞が酵母の場合、自律複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＡＲＳ）を含むことができる。
特定の具体的な実施形態において、エレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクトされるトランスフェクション組成物は、非ウイルスである（即ち、任意のウイルス成分を含まない）。非ウイルス法を置換すると、毒性が軽減され、および／または方法の安全性を向上させる。
細胞性能評価
本出願において、前記細胞の生存率は、細胞生存率、細胞増殖能、細胞殺傷能、細胞分泌能、細胞保存能および細胞蘇生能からなる群から選択される使用を含むことができる。
本出願において、前記細胞増殖能は、細胞増殖量によって反映され（例えば、ＦＡＣＳ法によって検出されることができる）、前記細胞生存率は、全細胞に対する生細胞の数の比率によって反映され（例えば、ＦＡＣＳ法によって検出されることができる）、前記細胞分泌能は、細胞によって分泌される外因性遺伝子によってコードされる外因性タンパク質の発現量によって反映され（例えば、フローサイトメトリー、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、抗原－抗体特異的結合反応等の方法によって検出される）、前記細胞殺傷能は、インビトロでの腫瘍細胞に対する細胞の殺傷率によって反映され、インビボでの固形腫瘍の腫瘍体積に対する細胞の影響を反映することができ、インビボでの非固形腫瘍の大きさに対する細胞の影響を反映することができる。本出願において、細胞生存率および／または細胞増殖能は、前記細胞保存能および前記細胞蘇生能を反映することができる。例えば、前記細胞保存能および／または細胞蘇生能は、凍結保存条件下（例えば、液体窒素保存条件下で）および蘇生後（例えば、前記凍結保存条件からの蘇生）の細胞の細胞生存率および／または細胞増殖によって反映されることができる。
品質判断方法
別の態様において、本出願は、トランスフェクション組成物の品質を判断するための方法を提供し、前記方法は、前記トランスフェクション組成物中の宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、当該含有量に応じて、前記トランスフェクション組成物の品質を判断することを含む。例えば、当前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が当該トランスフェクション組成物中の総ＤＮＡ量の約１０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、約９％（ｗ／ｗ）以下、約８％（ｗ／ｗ）以下、約７％（ｗ／ｗ）以下、約６％（ｗ／ｗ）以下、約５％（ｗ／ｗ）以下、約４％（ｗ／ｗ）以下、約３％（ｗ／ｗ）以下、約２％（ｗ／ｗ）以下、約１．５％（ｗ／ｗ）以下、約１％（ｗ／ｗ）以下、約９‰（ｗ／ｗ）以下、約８‰（ｗ／ｗ）以下、約７‰（ｗ／ｗ）以下、約６‰（ｗ／ｗ）以下、約５‰（ｗ／ｗ）以下、約４‰（ｗ／ｗ）以下、約３‰（ｗ／ｗ）以下、約２‰（ｗ／ｗ）以下、約１．５‰（ｗ／ｗ）以下、約１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．５‰（ｗ／ｗ）以下、約０．１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．０１‰（ｗ／ｗ）以下、約０．００１‰（ｗ／ｗ）以下またはそれ以下）を占める場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断される。
従って、本出願に記載の方法は、前記宿主ゲノムＤＮＡ（例えば、少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子またはその断片）の含有量を測定する段階を含むことができる。および／または、本出願に記載の方法は、前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量を測定する段階を含むことができる。
本出願において、前記標準は、本出願のエレクトロポレーション法のための標準、または本出願の方法に従って細胞をトランスフェクト（例えば、エレクトロポレーション）するための標準であり得る。
本出願において、本出願に記載の方法は、前記トランスフェクション混合物中の核酸分子の総含有量を測定するか、またはその中の宿主細胞由来の外因性核酸分子（例えば、プラスミド）の総量を測定する段階を含むことができる。
本出願において、宿主ゲノムＤＮＡの含有量を測定することにより、トランスフェクション前に前記トランスフェクション混合物中の前記宿主ゲノムＤＮＡの含有量を明らかにすることができる。
計算された比率が本出願に記載の方法における比率閾値（例えば、トランスフェクション混合物中のプラスミドの総量の約１（ｗ／ｗ）％以下、例えば約０．９（ｗ／ｗ）％以下、例えば約０．８（ｗ／ｗ）％以下、約０．７（ｗ／ｗ）％以下、約０．６（ｗ／ｗ）％以下、約０．５（ｗ／ｗ）％以下、約０．４（ｗ／ｗ）％以下、約０．３（ｗ／ｗ）％以下、約０．２（ｗ／ｗ）％以下、約０．１（ｗ／ｗ）％以下、約０．０９（ｗ／ｗ）％以下、約０．０８（ｗ／ｗ）％以下またはそれ以下を満たす場合）、前記トランスフェクション混合物は、本出願に記載の方法の技術的効果（例えば、トランスフェクション効率を向上させることができる）を達成したと考えることができ、前記トランスフェクション混合物を細胞トランスフェクションに直接使用することができる。逆に、計算された比率が本出願に記載の方法における比率閾値を満たさない場合、前記トランスフェクション混合物は、本出願に記載の方法の技術的効果を達成していないと考えることができる。つまり、本出願に記載の方法の技術的効果（例えば、トランスフェクション効率を向上させることができる）を達成するために、前記トランスフェクション混合物は、前記トランスフェクション混合物中の前記宿主ゲノムＤＮＡの含有量を低下させる段階を実行する。
本出願において、前記測定は、核酸分子の含有量を測定するための方法を使用することができる。前記測定方法は、核酸分子の含有量を測定するためのリン測定法（即ち、リボ核酸および／またはデオキシリボ核酸中のリン含有量を検出することにより、核酸分子の含有量を算出し、例えば、モリブデン酸アンモニウム等のリン固定製剤を使用することができる）、糖測定法（即ち、リボース中の五炭糖が生成するアルデヒド化合物によって生成された着色化合物を検出し、比色法または分光測光により着色化合物の濃度から核酸分子の含有量を算出する）、紫外線吸収法（即ち、紫外線を吸収する核酸中の塩基の吸収値を検出して、核酸分子の含有量を算出する）、蛍光測光法および／またはｑＰＣＲ法（核酸分子の絶対定量を獲得することができる）を含むことができる。
例えば、前記測定は、ｑＰＣＲ法を使用することができる。本出願において、大腸菌ＤＮＡ定量検出キット（Ｃａｔ＃ ４４５８４３５、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、キットの説明書に記載の方法に従って検出されるプラスミド中の前記少なくとも約１０ｋｂ（例えば、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ、少なくとも約３５ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約４８ｋｂまたはそれ以上）の大きさの核酸分子もしくはその断片の含有量、および／または宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子もしくはその断片の含有量を測定することができる。
トランスフェクトされた細胞または細胞集団
別の態様において、本出願は、本出願に記載の方法を使用して調製した細胞および／または細胞株を提供する。
本出願において、前記細胞および／または細胞株は、有意に向上させたトランスフェクション陽性比率を有することができる（例えば、有意に向上させた遺伝子編集ノックイン陽性比率（例えば、標的細胞の活性化により、ＣＡＲ、抗体、サイトカインおよび／またはケモカインのノックインされた陽性率を向上させることができる）、有意に向上させたＤＮＡ相同組換え効率および／または有意に向上させた細胞生存率を有することもできる）。本出願に記載の細胞株は、複数の継代増殖過程中（例えば、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、少なくとも約２０継代またはそれ以上）で有意に向上させたトランスフェクション陽性比率の能力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション陽性比率は、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％より大きい。外因性遺伝子の陽性比率は、外因性遺伝子が修飾された細胞の数を求め、且つ細胞の総数で割ることによって測定されることができる。例えば、直接ゲノムＤＮＡシーケンシング、ディファレンシャル制限消化（遺伝子編集が制限酵素部位の追加、削除または変更である場合）、ゲル電気泳動、アレイキャピラリー電気泳動、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーション、モレキュラービーコン、制限断片長多型、プライマー伸長、温度勾配ゲル電気泳動等の、当技術分野で知られている方法によって、細胞ゲノムＤＮＡにおける外因性遺伝子の組み込みを決定することができる。
別のいくつかの実施形態において、エレクトロポレーション後の細胞生存率は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％である。細胞生存率は、当技術分野で知られている方法によって測定されることができる。例えば、セルカウンターデバイスによってエレクトロポレーションの前後に細胞をカウントすることができる。別のいくつかの実施形態において、アポトーシスを測定することができる。大量の核酸の導入は、アポトーシスを誘導すると考えられる。本明細書に記載の方法は、当技術分野の他の方法よりもアポトーシスが少ないことが考慮される。特定の実施形態において、エレクトロポレーション後にアポトーシスが現れる細胞の量は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満である。アポトーシスとは、プログラム性細胞死の具体的なプロセスを指し、当技術分野で知られている方法によって測定されることができる。例えば、アポトーシスは、アネキシンＶによって測定されることができる。
本出願において、前記細胞および／または細胞株は、本出願に記載のキメラ抗原受容体ＣＡＲおよび本出願に記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥを同時に発現することができる。
例えば、前記細胞および／または細胞株は、複合型ＣＡＲを発現することができ、例えば、ＣＡＲ－ＢｉＴＥを発現することができる。
本出願において、前記細胞および／または細胞株は、本出願に記載のキメラ抗原受容体ＣＡＲおよび本出願に記載の少なくとも一つのサイトカインを同時に発現することができる。
例えば、前記細胞および／または細胞株は、複合型ＣＡＲを発現することができ、例えば、ＣＡＲ－サイトカイン（例えば、ＣＡＲ－ＩＬ１５）を発現することができる。例えば、ＣＡＲ－サイトカイン－ケモカイン（例えば、ＣＡＲ－ＩＬ７－ＣＣＬ１９）を発現することができる。
本出願において、前記細胞および／または細胞株は、有意に向上させたトランスフェクション陽性比率を有することができる（例えば、有意に向上させた遺伝子編集ノックイン陽性比率（例えば、標的細胞の活性化によりノックインされたＣＡＲの陽性率を向上させることができる）、有意に向上させたＤＮＡ相同組換え効率および／または有意に向上させた細胞生存率をさらに有することができる）。本出願に記載の細胞株は、複数世代の増殖の間（例えば、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、少なくとも約２０継代またはそれ以上）、有意に向上させたトランスフェクション陽性比率の能力を維持することができる。
治療的用途
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成された細胞および細胞株は、細胞のゲノムＤＮＡを編集した後に治療効果を提供する細胞および細胞株である。本明細書に記載の方法によって初代細胞を分離し且つ修飾し、それを治療される対象に再導入するためにエクスビボで使用することができる。適切な初代細胞は、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｍｙｐｈｏｃｙｔｅ、ＰＢＬ）および他の血液細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などであるが、これらに限定されない）。他の適切な初代細胞は、例えば骨髄性またはリンパ性前駆細胞等の前駆細胞を含む。適切な細胞は、例えば、例示として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、筋肉幹細胞および皮膚幹細胞等の幹細胞をさらに含む。例えば、ｉＰＳＣは、既知の遺伝子突然変異関連疾患を患う患者から生体外で取得することができ、当該突然変異は、本明細書に記載の方法を使用して野生型対立遺伝子に修飾することができる。次に修飾されたｉＰＳＣは、ドーパミン作動性ニューロンに分化され且つ患者に再移植されることができる。別のエクスビボ治療適用において、既知の遺伝子突然変異を患う患者から造血幹細胞を分離し、次に遺伝子突然変異を修正するために修飾することができる。次にＨＳＣを治療効果を得るために患者に再投与することができるか、または患者に投与する前に培養物でより成熟した造血液細胞に分化させることができる。
いくつかの実施形態において、修飾されたゲノムＤＮＡ配列および／またはドナーＤＮＡは、疾患関連遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、配列修飾の領域は、疾患関連遺伝子を含む。疾患関連遺伝子は、当技術分野で知られている。
一実施形態において、前記方法は、造血幹細胞（血液細胞とも呼ばれる）または骨髄前駆細胞内のゲノムＤＮＡを修飾することを含む。
本出願の方法を治療に使用できる別の例は、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）の部位特異的組み込みである。「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する改変された受容体を指す。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用される。当該受容体は、様々なソースからの部分で構成されるため、キメラと呼ばれる。これらの分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３ζ膜貫通および細胞内ドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）、ＣＤ２８または４１ＢＢ細胞内ドメイン、またはその組み合わせに融合したモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）の融合体である。このような分子は、その標的のｓｃＦｖによる識別に応答してシグナルの伝達を引き起こす。このような構築物の例は、肝臓がん細胞の表面に特異的に発現されるＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ ３）を識別するＧＰＣ３－ＣＡＲである。Ｔ細胞が当該分子を発現する場合、それらは、ＧＰＣ３を発現する標的細胞（例えば、肝臓がん細胞）を識別して殺傷する。悪性Ｂ細胞を標的とするために、研究者らは、Ｂ系統分子ＣＤ１９に特異的なキメラ免疫受容体を使用して、Ｔ細胞の特異性を方向転換させる。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分は、柔軟なリンカーを介して融合してｓｃＦｖを形成する。当該ｓｃＦｖの前には、シグナルペプチドがあり、最初のタンパク質を小胞体に誘導し、その後の表面発現を行なう（これは、切断される）。柔軟な間隔領域により、抗原結合のためにｓｃＦｖを様々な方法に向けることができる。膜貫通ドメインは、一般に、細胞内に突き出て所望のシグナルを伝達するシグナル伝達細胞内ドメインの元の分子に由来する、一般的な疎水性のαヘリックスである。
人工Ｔ細胞受容体は、いわゆる養子細胞移植と呼ばれる技術を使用する、癌の治療法として研究される。患者からＴ細胞を除去し、且つ修飾して、それらが特定の形態の癌に特異的な受容体を発現するようにする。次に癌細胞を識別し且つ殺傷することができるＴ細胞を患者に再導入する。患者以外のドナー由来のＴ細胞の修飾も、研究されている。
これらの改変されたＣＡＲ Ｔ細胞は、インビトロで増幅されることができ、次に増幅したＣＡＲ Ｔ細胞集団を患者に注入することができる。注入後、Ｔ細胞は、患者の体内で増殖し、改変された受容体の誘導下で、その表面に抗原を有する癌細胞を識別し且つ殺傷する。既存の治療法の多くは、ウイルス感染を介したＣＡＲ導入を伴う。しかしながら、ウイルス感染症を治療中に使用する場合、常に安全性の懸念が伴う。従って、本明細書に記載の方法は、遺伝子治療およびゲノム光学への非ウイルス法である。以前に、免疫細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることは、細胞に重篤な毒性をもたらすため不可能である。本出願的発明者らは、通過細胞トランスフェクション前に、トランスフェクション組成物を処理（例えば、宿主ゲノムＤＮＡの含有量を低下させる）することにより、細胞生存率に影響を与える問題を克服し、高レベルの生存率を維持しながら、長いＤＮＡ（および／または高濃度）の細胞へのトランスフェクションを可能にすることを発見した。本明細書に記載の方法を使用すると、ＣＡＲを免疫細胞の特定の部位に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、自己免疫細胞である。Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ、ＮＫ）細胞におけるＣＡＲの長期発現は、白血病の治療または特定の抗原関連腫瘍の治療に使用されることができる。
特定の態様において、本明細書に記載の方法は、エクスビボ治療のために改良された方法に関する。対象から細胞集団を分離することができ、次に当技術分野で知られている方法および／または本明細書に記載の方法によって細胞を活性化することができ、欠損を修正するか、または標的遺伝子を部位特異的に組み込むような方法で細胞のゲノムＤＮＡを修飾することができる。次に細胞集団を対象に移植して、治療の用途として使用されることができる。場合によっては、分離された細胞集団は、特定のインビトロ操作（例えば、従来のトランスフェクションおよび／またはエレクトロポレーション法）に感受性のある細胞サブ集団を含むことができ、例えば、あるいは細胞サブ集団は、従来のトランスフェクションおよび／またはエレクトロポレーション法またはゲノムＤＮＡ操作に耐性を有することができる。本明細書に記載の方法によるゲノムＤＮＡの修飾により、このような集団における配列修飾の効率が高くなることが考えられる。
さらに、本明細書で使用される方法によって生成された細胞および細胞株は、薬物の開発および／または逆遺伝学の研究に使用されることができる。このような細胞および動物は、特定の突然変異にまたはその配列の修飾に関連する表現型を示すことができ、議論する突然変異または突然変異タンパク質と特異的に相互作用する薬物または病気の動物の疾患の治療に使用できる薬物をスクリーニングするために使用されることができる。これらの細胞株は、特異的突然変異の効果を研究するためのツールをさらに提供することができ、細胞株およびそれに対応する「修飾された」細胞株が「遺伝的に同一の」対照を表すため、疾患特異的突然変異の修復、薬物のスクリーニングおよび発見、ならびに疾患メカニズムの研究に強力なツールを提供する。
本開示の組成物は、インビボ、インビトロまたはエクスビボ投与に使用されることができる。例えば、本開示の組成物は、癌ワクチンとして使用されることができる。本出願において、インビトロ投与という用語は、培養中の細胞を含むがこれらに限定されない、対象から除去された細胞または対象の外部で行われた操作を指す。エクスビボ投与という用語は、インビトロで操作され且つ続いて対象の細胞に投与されることを指す。インビボ投与という用語は、投与を含む、対象内において行われたすべての操作を含む。
本出願の方法は、被験者における特定の癌を免疫接種および／または治療するための方法にさらに関し、このような方法は、ａ）外因性核酸分子およびｂ）遺伝子編集システムを含む本出願のトランスフェクション組成物（即ち、微生物等の宿主は、本出願に限定されたゲノムＤＮＡの含有量、例えば前記トランスフェクション組成物中の総ＤＮＡ量の約２（ｗ／ｗ）％未満を有する）で細胞をトランスフェクトすることと、ここで、外因性核酸分子は、（ｉ）標的ゲノムＤＮＡ領域に相同な核酸配列を含む相同領域、ならびに（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列、および任意選択で一種または複数種の抗体（例えば、ＢｉＴＥ）および／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ１５）を含み、ここで、標的ゲノムＤＮＡ領域でゲノムＤＮＡ配列を特異的に修飾して、ＣＡＲ（抗体および／またはサイトカイン）コード配列を組み込むことと、ならびに患者に細胞を投与することとを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、抗原と接触されている。いくつかの実施形態において、抗原は、被験者における癌細胞によって発現される抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、無細胞である。「無細胞」という用語は、任意の細胞成分を全く含まない組成物を指す。いくつかの実施形態において、抗原は、患者の腫瘍からの抽出物である。いくつかの実施形態において、抗原は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍細胞分解物、アポトーシス性腫瘍細胞、腫瘍関連抗原および腫瘍由来のｍＲＮＡ農地の一種または複数種を含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、抗原提示細胞である。抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および腫瘍細胞（偽抗原提示細胞）を含み、ここで、Ｔ細胞刺激因子（例えば、Ｂ７または４－１ＢＢＬ）等は、例えば遺伝子転移により強制的に発現される。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
免疫細胞の投与経路は、腫瘍内、皮内、皮下、静脈内、リンパ内および腹腔内投与であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍内またはリンパ内である。いくつかの実施形態において、免疫細胞を癌組織またはリンパ節に直接投与する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、抗原または抗原提示細胞と接触した細胞であり得る。例えば、ＡＰＣを患者の癌に特異的な腫瘍抗原とともに培養して、例えばＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞に分化させることができる。このようにして構築されたＴ細胞をがん患者に投与することができる。
ナイーブＴ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ）の由来は、特に限定されず、例えば、脊椎動物由来の末梢血であり得る。使用されるナイーブＴ細胞は、ＰＢＭＣ画分から分離されたＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＴＬの誘導小売りとの観点から、ナイーブＴ細胞は、ＰＢＭＣ画分から分離されずに他の細胞および成分と混合したＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞である。例えば、血清および腫瘍抗原を補充した培地でＰＢＭＣ画分の細胞を培養する場合、ＰＢＭＣは、樹状細胞前駆体に分化される。次に樹状細胞前駆体は、ペプチドに結合し、且つ当該ペプチド／腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞としての樹状細胞に分化される。抗原提示細胞は、ＰＢＭＣ内のＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激して、ＣＴＬに分化する。従って、添加されたペプチドを識別するＣＴＬを得ることができる。このようにして得られたＣＴＬは、分離され、且つ癌ワクチンとして直接使用されることができる。または，癌ワクチンとして使用される前に、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）、抗原提示細胞および腫瘍抗原の存在下でそれらをさらに培養することができる。その投与経路としては、特に限定されず、例としては、皮内、皮下、静脈内および腫瘍内等を含む。
一態様において、本出願は、次のような技術的解決策を提供する。
１．トランスフェクション効率を向上させるための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下になるようにする段階を含む。
２．遺伝子編集の編集効率を向上させるための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下になるようにする段階を含む。
３．ＤＮＡ相同組換え効率を向上させるための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下になるようにする段階を含む。
４．トランスフェクション後の細胞の細胞生存率を向上させるための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下になるようにする段階を含む。
５．トランスフェクション混合物を調製するための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下になるようにする段階を含む。
６．トランスフェクション混合物の品質を判断するための方法であって、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるかどうかを判断する段階を含む。
７．前記核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約５００ｋｂである、当該態様の技術的解決策１－６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策１－７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策１－８のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記核酸分子またはその断片は、微生物に由来する、当該態様の技術的解決策１－９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策１０に記載の方法。
１２．前記微生物は、グラム陰性菌を含む、当該態様の技術的解決策１０－１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．前記微生物は、大腸菌を含む、当該態様の技術的解決策１０－１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物的の核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策１－１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策１－１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションおよび／または安定トランスフェクションを含む、当該態様の技術的解決策１－１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含む、当該態様の技術的解決策１－１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記トランスフェクションは、細胞をトランスフェクトすることを含む、当該態様の技術的解決策１－１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記細胞は、真核細胞を含む、当該態様の技術的解決策４，７－１９のいずれか１項に記載の方法。
２１．前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む、当該態様の技術的解決策４，７－２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記幹細胞は、多能幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策２１に記載の方法。
２３．前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策２１－２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される、当該態様の技術的解決策２１－２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記トランスフェクション混合物は、プラスミドを含む当該態様の技術的解決策１－２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記プラスミドは、環状プラスミド、スーパーコイルプラスミドまたは直鎖状プラスミドである、当該態様の技術的解決策２５に記載の方法。
２７．前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドである、当該態様の技術的解決策２５－２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．前記プラスミドは、マルチクローニング部位を含む、当該態様の技術的解決策２５－２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記プラスミドは、外因性プロモーターを含む、当該態様の技術的解決策２５－２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記少なくとも４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片と前記プラスミドとは、異なる核酸分子中に存在する、当該態様の技術的解決策２５－２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記トランスフェクション混合物中の少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量を低下させる段階を含む、当該態様の技術的解決策１－３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記低下は、前記トランスフェクション混合物を精製することを含む、当該態様の技術的解決策３１に記載の方法。
３３．前記低下は、ＤＮａｓｅ、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される試薬を使用して前記トランスフェクション混合物を精製することを含む、当該態様の技術的解決策３１－３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記低下は、当該態様の技術的解決策２５－３３のいずれか１項に記載のプラスミドのＤＮＡ人工合成からなる群から選択される方法を使用することを含む、当該態様の技術的解決策３１－３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策２，７－３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックアウトおよび／または遺伝子編集ノックインを含む、当該態様の技術的解決策２，７－３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックインを含む、当該態様の技術的解決策２，７－３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能する、当該態様の技術的解決策２５－３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．前記ドナープラスミドは、ノックインされる外因性遺伝子の核酸分子またはその断片を含む、当該態様の技術的解決策３８に記載の方法。
４０．前記外因性遺伝子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする核酸分子を含む、当該態様の技術的解決策３９に記載の方法。
４１．前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含む、当該態様の技術的解決策４０に記載の方法。
４２．前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む、当該態様の技術的解決策４０－４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．前記ドナープラスミドは、ノックインされる前記外因性遺伝子の核酸分子またはその断片の末端に相同な相同性アームを含む、当該態様の技術的解決策３８－４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記相同性アームは、１００－１０００ｂｐの大きさである、当該態様の技術的解決策４３に記載の方法。
４５．前記細胞生存率は、細胞生存率、細胞増殖能、細胞殺傷能、細胞分泌能、細胞保存能および細胞蘇生能からなる群から選択される指標を含む、当該態様の技術的解決策４，７－４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量を測定する段階を含む、当該態様の技術的解決策１－４５のいずれか１項に記載の方法。
４７．前記トランスフェクション混合物中の核酸分子の総含有量を測定する段階を含む、当該態様の技術的解決策１－４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．当該態様の技術的解決策１－４７のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞および／または細胞株。
４９．当該態様の技術的解決策１－４７のいずれか１項に記載の方法によって調製されたトランスフェクション混合物。
５０．トランスフェクション効率を向上させるための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるようにする段階を含む。
５１．遺伝子編集の編集効率を向上させるための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるようにする段階を含む。
５２．ＤＮＡ相同組換え効率を向上させるための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるようにする段階を含む。
５３．トランスフェクション後の細胞の細胞生存率を向上させるための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるようにする段階を含む。
５４．トランスフェクション混合物を調製するための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量が、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占めるようにする段階を含む。
５５．トランスフェクション混合物の品質を判断するための方法であって、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量がトランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の１０％以下を占めるかどうかを判断する段階を含む。
５６．前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策５０－５５のいずれか１項に記載の方法。
５７．前記微生物は、グラム陰性菌を含む、当該態様の技術的解決策５０－５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．前記微生物は、大腸菌を含む、当該態様の技術的解決策５０－５７のいずれか１項に記載の方法。
５９．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約４８ｋｂである、当該態様の技術的解決策５０－５８のいずれか１項に記載の方法。
６０．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約５００ｋｂである、当該態様の技術的解決策５０－５９のいずれか１項に記載の方法。
６１．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策５０－６０のいずれか１項に記載の方法。
６２．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策５０－６１のいずれか１項に記載の方法。
６３．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策５０－６２のいずれか１項に記載の方法。
６４．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物的の核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策５０－６３のいずれか１項に記載の方法。
６５．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策５０－６４のいずれか１項に記載の方法。
６６．前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションおよび／または安定トランスフェクションを含む、当該態様の技術的解決策５０－６５のいずれか１項に記載の方法。
６７．前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含む、当該態様の技術的解決策５０－６６のいずれか１項に記載の方法。
６８．前記トランスフェクションは、細胞をトランスフェクトすることを含む、当該態様の技術的解決策５０－６７のいずれか１項に記載の方法。
６９．前記細胞は、真核細胞を含む、当該態様の技術的解決策５３，５６－６８のいずれか１項に記載の方法。
７０．前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む、当該態様の技術的解決策５３，５６－６９のいずれか１項に記載の方法。
７１．前記幹細胞は、多能幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策７０に記載の方法。
７２．前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策７０－７１のいずれか１項に記載の方法。
７３．前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される、当該態様の技術的解決策７０－７２のいずれか１項に記載の方法。
７４．前記トランスフェクション混合物は、プラスミドを含む、当該態様の技術的解決策５０－７３のいずれか１項に記載の方法。
７５．前記プラスミドは、環状プラスミド、スーパーコイルプラスミドまたは直鎖状プラスミドである、当該態様の技術的解決策７４に記載の方法。
７６．前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドである、当該態様の技術的解決策７４－７５のいずれか１項に記載の方法。
７７．前記プラスミドは、マルチクローニング部位を含む、当該態様の技術的解決策７４－７６のいずれか１項に記載の方法。
７８．前記プラスミドは、外因性プロモーターを含む、当該態様の技術的解決策７４－７７のいずれか１項に記載の方法。
７９．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片と前記プラスミドとは、異なる核酸分子中に存在する、当該態様の技術的解決策５０－７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．前記トランスフェクション混合物中の前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量を低下させる段階を含む、当該態様の技術的解決策５０－７９のいずれか１項に記載の方法。
８１．前記低下は、前記トランスフェクション混合物を精製することを含む、当該態様の技術的解決策８０に記載の方法。
８２．前記低下は、ＤＮａｓｅ、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される試薬を使用して前記トランスフェクション混合物を精製することを含む、当該態様の技術的解決策８０－８１のいずれか１項に記載の方法。
８３．前記低下は、当該態様の技術的解決策７４－８２のいずれか１項に記載のプラスミドのＤＮＡ人工合成からなる群から選択される方法を使用することを含む、当該態様の技術的解決策８０－８２のいずれか１項に記載の方法。
８４．前記遺伝子編集的方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策５１，５６－８３のいずれか１項に記載の方法。
８５．前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックアウトおよび／または遺伝子編集ノックインを含む、当該態様の技術的解決策５１，５６－８４のいずれか１項に記載の方法。
８６．前記遺伝子編集は、遺伝子編集ノックインを含む、当該態様の技術的解決策５１，５６－８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能する、当該態様の技術的解決策７４－８６のいずれか１項に記載の方法。
８８．前記ドナープラスミドは、ノックインされる外因性遺伝子の核酸分子またはその断片を含む、当該態様の技術的解決策８７に記載の方法。
８９．前記外因性遺伝子は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードする核酸分子を含む、当該態様の技術的解決策８８に記載の方法。
９０．前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または抗原結合断片を含む、当該態様の技術的解決策８９に記載の方法。
９１．前記抗体または抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、当該態様の技術的解決策８９－９０のいずれか１項に記載の方法。
９２．前記ドナープラスミドは、ノックインされる外因性遺伝子の核酸分子またはその断片の末端に相同な相同性アームを含む、当該態様の技術的解決策８７－９１のいずれか１項に記載の方法。
９３．前記相同性アームは、１００－１０００ｂｐの大きさである、当該態様の技術的解決策９２に記載の方法。
９４．前記細胞生存率は、細胞生存率、細胞増殖能、細胞殺傷能、細胞分泌能、細胞保存能および細胞蘇生能からなる群から選択される指標を含む、当該態様の技術的解決策５３，５６－９３のいずれか１項に記載の方法。
９５．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量を測定する段階を含む、当該態様の技術的解決策５０－９４のいずれか１項に記載の方法。
９６．前記トランスフェクション混合物中の核酸分子の総含有量を測定する段階を含む、当該態様の技術的解決策５０－９５のいずれか１項に記載の方法。
９７．当該態様の技術的解決策５０－９６のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞および／または細胞株。
９８．当該態様の技術的解決策５０－９７のいずれか１項に記載の方法によって調製されたトランスフェクション混合物。
別の態様において、本出願は、次のような技術的解決策をさらに提供する。
１．プラスミドを使用して細胞に外因性遺伝子をトランスフェクトするための方法であって、前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含み、前記外因性遺伝子は、トランスフェクトされた前記細胞のゲノムに組み込まれる。
２．前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約１０００ｂｐである、当該態様の技術的解決策１に記載の方法。
３．前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約３５００ｂｐである、当該態様の技術的解決策１－２のいずれか１項に記載の方法。
４．前記外因性遺伝子の大きさは、最大約１０ｋｂである、当該態様の技術的解決策１－３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または第２のタンパク質の核酸分子を含み、前記第２のタンパク質は、前記キメラ抗原受容体とは異なる、当該態様の技術的解決策１－４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記キメラ抗原受容体は、抗原を標的とする少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、当該態様の技術的解決策５に記載の方法。
７．前記第２のタンパク質は、サイトカイン、ケモカインおよび抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される少なくとも一種である、当該態様の技術的解決策５－６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記第２のタンパク質は、二重特異性抗体を含む、当該態様の技術的解決策５－７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記第２のタンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む、当該態様の技術的解決策５－８のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記トランスフェクションは、安定トランスフェクションを含む、当該態様の技術的解決策１－９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含む、当該態様の技術的解決策１－１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．前記トランスフェクションは、遺伝子編集手段を使用して遺伝子編集ノックインを実行することを含む、当該態様の技術的解決策１－１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．前記遺伝子編集的方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策１２に記載の方法。
１４．前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能する、当該態様の技術的解決策１２－１３中に記載の方法。
１５．前記プラスミドは、マルチクローニング部位を含む、当該態様の技術的解決策１－１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記プラスミドは、外因性プロモーターを含む、当該態様の技術的解決策１－１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記プラスミドは、前記外因性遺伝子またはその断片の末端に相同な相同性アームを含む、当該態様の技術的解決策１－１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記相同性アームは、１００－１０００ｂｐの大きさである、当該態様の技術的解決策１７に記載の方法。
１９．前記プラスミドは、環状プラスミドを含む、当該態様の技術的解決策１－１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドである、当該態様の技術的解決策１－１９のいずれか１項に記載の方法。
２１．前記細胞は、真核細胞を含む、当該態様の技術的解決策１－２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記細胞は、免疫細胞、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む、当該態様の技術的解決策１－２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される、当該態様の技術的解決策２２に記載の方法。
２４．前記幹細胞は、多能幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策２２－２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策２２－２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策２６に記載の方法。
２８．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物的の核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策２６－２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策２６－２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策２６－２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策２６－３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来する、当該態様の技術的解決策２６－３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策１－３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策１－３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約４８ｋｂである、当該態様の技術的解決策３６に記載の方法。
３８．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策３６－３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策３６－３８のいずれか１項に記載の方法。
４０．前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策３６－３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記微生物は、グラム陰性菌を含む、当該態様の技術的解決策３６－４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記微生物は、大腸菌を含む、当該態様の技術的解決策３６－４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．当該態様の技術的解決策１－４２のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞および／または細胞株。
４４．ＣＡＲおよびＢｉＴＥを同時に発現する、当該態様の技術的解決策４３に記載の細胞および／または細胞株。
４５．ＣＡＲおよび少なくとも一つのサイトカインを同時に発現する、当該態様の技術的解決策４３－４４のいずれか１項に記載の細胞および／または細胞株。
４６．プラスミドを含むトランスフェクション混合物の総核酸分子含有量にたいする少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量の比率を低下させ、複合型ＣＡＲをコードする外因性遺伝子を含む前記プラスミドを使用してトランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率を向上させる際の適用。
４７．プラスミドを含むトランスフェクション混合物の総核酸分子含有量に対する宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量の比率を低下させ、複合型ＣＡＲをコードする外因性遺伝子を含む前記プラスミドを使用してトランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率を向上させる際の適用。
４８．前記複合型ＣＡＲは、ＣＡＲ－ＢｉＴＥ、ＣＡＲ－サイトカイン、および抗原を標的とする少なくとも二つの異なる抗原結合ドメインを含むＣＡＲからなる群から選択される、当該態様の技術的解決策４６－４７のいずれか１項に記載の適用。
別の態様において、本出願は、次のような技術的解決策をさらに提供する。
１．プラスミドトランスフェクト細胞効率を増加させるための方法であって、利用デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって処理された外因性遺伝子を含むプラスミドトで細胞をランスフェクトする段階を含む。
２．前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションおよび／または安定トランスフェクションを含む、当該態様の技術的解決策１に記載の方法。
３．前記トランスフェクションは、エレクトロポレーションを含む、当該態様の技術的解決策１－２のいずれか１項に記載の方法。
４．前記外因性遺伝子は、前記細胞に一時的にトランスフェクトされる、当該態様の技術的解決策１－３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記一時的にトランスフェクトされた後、前記細胞は、前記外因性遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する、当該態様の技術的解決策１－４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記安定トランスフェクションは、トランスポゾンシステムおよび／または遺伝子編集方法を使用することを含む、当該態様の技術的解決策２－５のいずれか１項に記載の方法。
７．前記安定トランスフェクション後、前記外因性遺伝子は、前記細胞のゲノムに組み込まれる、当該態様の技術的解決策２－６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記安定トランスフェクションは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを使用することを含む、当該態様の技術的解決策２－７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記安定トランスフェクション方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡ編集システムＡＤＡＲ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、Ｍｅｇａ－ＴＡＬヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓおよびＭｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策２－８のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記安定トランスフェクトは、遺伝子編集ノックインを含む、当該態様の技術的解決策２－９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記プラスミドは、前記遺伝子編集ノックインにおいてドナープラスミドとして機能する、当該態様の技術的解決策１０に記載の方法。
１２．前記ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ切断することができる、当該態様の技術的解決策１－１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる、当該態様の技術的解決策１－１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記ＤＮａｓｅは、直鎖状の二本鎖ＤＮＡを切断することができる、当該態様の技術的解決策１－１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記ＤＮａｓｅ処理は、前記ＤＮａｓｅと前記プラスミドと接触させる段階を含む、当該態様の技術的解決策１－１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記接触は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む緩衝液環境での接触を含む、当該態様の技術的解決策１５に記載の方法。
１７．前記ＤＮａｓｅ処理は、前記接触した前記プラスミドを精製する段階を含む、当該態様の技術的解決策１－１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記細胞は、真核細胞を含む、当該態様の技術的解決策１－１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含む、当該態様の技術的解決策１－１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記幹細胞は、多能幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策１９に記載の方法。
２１．前記幹細胞は、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含む、当該態様の技術的解決策１９－２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記免疫細胞は、非活性化または活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球およびマスト細胞からなる群から選択される、当該態様の技術的解決策１９－２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記プラスミドは、環状プラスミドを含む、当該態様の技術的解決策１－２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記プラスミドは、ＤＮＡプラスミドである、当該態様の技術的解決策１－２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記プラスミドは、マルチクローニング部位を含む、当該態様の技術的解決策１－２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記プラスミドは、外因性プロモーターを含む、当該態様の技術的解決策１－２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．前記プラスミドは、前記外因性遺伝子またはその断片の末端に相同な相同性アームを含む、当該態様の技術的解決策１－２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．前記相同性アームは、１００－１０００ｂｐの大きさである、当該態様の技術的解決策２７に記載の方法。
２９．前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む、当該態様の技術的解決策１－２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記外因性遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または第２のタンパク質の核酸分子を含み、前記第２のタンパク質は、前記キメラ抗原受容体とは異なる、当該態様の技術的解決策１－２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記第２のタンパク質は、サイトカイン、ケモカインおよび抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される少なくとも一種である、当該態様の技術的解決策３０に記載の方法。
３２．前記第２のタンパク質は、二重特異性抗体を含む、当該態様の技術的解決策３０－３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．前記第２のタンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む、当該態様の技術的解決策３０－３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約１０００ｂｐである、当該態様の技術的解決策１－３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約３５００ｂｐである、当該態様の技術的解決策１－３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．前記外因性遺伝子の大きさは、少なくとも約５０００ｂｐである、当該態様の技術的解決策１－３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．前記外因性遺伝子の大きさは、最大約１０Ｋｂである、当該態様の技術的解決策１－３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策３８に記載の方法。
４０．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物的の核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策３８－３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の含有量は、トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策３８－４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策３８－４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策３８－４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記少なくとも約４８ｋｂの大きさの核酸分子またはその断片は、微生物に由来する、当該態様の技術的解決策３８－４３のいずれか１項に記載の方法。
４５．前記ＤＮａｓｅによって処理された後、前記プラスミドを含むトランスフェクション混合物において、宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１０％以下を占める、当該態様の技術的解決策１－４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約２％以下を占める、当該態様の技術的解決策４５に記載の方法。
４７．宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約５‰以下を占める、当該態様の技術的解決策４５－４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の含有量は、前記トランスフェクション混合物の総核酸分子含有量の約１‰以下を占める、当該態様の技術的解決策４５－４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約４８ｋｂである、当該態様の技術的解決策４５－４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１Ｍｂである、当該態様の技術的解決策４５－４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片の大きさは、少なくとも約１０Ｍｂである、当該態様の技術的解決策４５－５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．前記微生物は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択される、当該態様の技術的解決策４５－５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記微生物は、グラム陰性菌を含む、当該態様の技術的解決策４５－５２のいずれか１項に記載の方法。
５４．前記微生物は、大腸菌を含む、当該態様の技術的解決策４５－５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．当該態様の技術的解決策１－５４のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞および／または細胞株。
５６．一時的にトランスフェクトされた細胞で使用される前記プラスミドの処理におけるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の適用。
５７．プラスミドトランスフェクション効率を向上させるためのキットであって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）および一過性トランスフェクションに必要な試薬および／または機器を含む。
５８．前記一過性トランスフェクションに必要な試薬は、エレクトロポレーションに必要な試薬を含む、当該態様の技術的解決策５７に記載のキット。
５９．前記エレクトロポレーションに必要な試薬は、ｄｄＨ２Ｏおよび／またはグリセロールを含む、当該態様の技術的解決策５８に記載のキット。
６０．前記ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ切断することができる、当該態様の技術的解決策５７－５９のいずれか１項に記載のキット。
６１．前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができる、当該態様の技術的解決策５７－６０のいずれか１項に記載のキット。
６２．前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼを含む、当該態様の技術的解決策５７－６１のいずれか１項に記載のキット。
６３．Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む緩衝液を含む、当該態様の技術的解決策５７－６２のいずれか１項に記載のキット。
いかなる理論によって制限されることを意図するものではなく、以下の実施例は、本出願の様々な技術的解決策を説明するためだけのものであり、本願の発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例１．プラスミド中の宿主のゲノムＤＮＡ含有量の検出
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用して、市販のプラスミド（ここで、異なる購入元によりプラスミドをＡ由来のプラスミドおよびＢ由来のプラスミド）に含まれる宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片（主に大腸菌のゲノムＤＮＡ）を測定する（即ち、宿主のゲノムＤＮＡ）。
さらに、Ａ由来のプラスミドおよびＢ由来のプラスミドに対して、複数のパラメーター（例えば、開環、スーパーコイル、ポリマー、エンドトキシン含有量）を検出し、ここで、開環、スーパーコイル、ポリマーの結果は、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ科学技術株式会社が提供したＨＰＬＣ検出によって得られ、エンドトキシン含有量は、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ科学技術株式会社が提供した検出によって得られる。
測定の結果は、図１に示されたとおりである。図１の結果に示されるように、これらのプラスミドの開環、スーパーコイル、ポリマー、エンドトキシン含有量には、有意な差がないが、これらのプラスミド中の宿主（例えば、微生物）に由来するゲノムＤＮＡの含有量には有意な差がある。
さらに、Ａ由来のプラスミドおよびＢ由来のプラスミド中のＤＮＡをゲル電気泳動により分析する。ここで、プラスミド３優－Ａ、５－Ａ、６－Ａおよび７Ａは、Ａ由来のプラスミドであり、プラスミド３優－Ｂ、５－Ｂ、５Ｂ－２、６Ｂおよび７Ｂは、Ｂ由来のプラスミドである。
結果は、図２に示されたとおりであり、ここで、Ｍは、ｍａｒｋｅｒに対応する電気泳動の状況であり、１－９は、それぞれ異なるプラスミドの電気泳動結果であり（各レーンにプラスミドを加えたＤＮＡ含有量は、１００ｎｇである）、Ｍ１は、当該Ｍａｒｋｅｒ内の各断片の具体的な大きさを示す。
図２の結果は、Ｂ由来のプラスミドの宿主ゲノムＤＮＡが少なく、約４８．５ｋｂを超えるバンドが少ないことを示す。
本出願で使用される各プラスミドの説明は、以下の表に示されたとおりである。
Figure 2024519895000001
Figure 2024519895000002
ここで、前記ＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦＶのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたとおりである。
ここで、前記ＧＰＣ３ ＣＡＲにおいて、ＧＰＣ３を標的とするｓｃＦＶのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたとおりである。
実施例２．より高い細胞トランスフェクション効率を有する宿主ゲノムＤＮＡ含有量が少ないプラスミド
２．１．ＧＦＰの発現
プラスミド５－Ａ（Ａソース）、プラスミド５－Ｂ（Ｂソース、工業グレード）およびプラスミド５－Ｂ－２（実験室グレード）。ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計する（５’ＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端には、それぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾があり、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、南京）。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入する（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。前記ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を後続の細胞修飾のためにリボ核タンパク質ＲＮＰとして調製する。
エレクトロポレーションにより、Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入され、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む）で二日間活性化したヒトＴ細胞に５－Ａ、５－Ｂおよび５－Ｂ－２をそれぞれ導入し、同時に調製したＲＮＰを当該細胞に導入する。ＧＦＰをコードする核酸分子は、当該ヒトＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれており、且つＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現させることができる。
ＦＡＣＳ法により、プラスミド５－Ａ、５－Ｂまたは５－Ｂ－２によってトランスフェクトしたＴ細胞の生存率および細胞増殖量を検出し、前記トランスフェクトした後のＴ細胞のＧＦＰの発現量を検出する。結果は、それぞれ図３Ａ－３Ｃに示されたとおりである。ここで、細胞増殖量は、２０秒ＦＡＣＳで検出された細胞数をカウントすることで得られ、細胞生存率のデータは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の検証検出を通じてＰＩ陰性となったＦＳＣ－ＳＳＣゲートの細胞集団により得られる。ＧＦＰ陽性細胞のゲートは、対照群の生細胞の的陽性率≦１％によって得られる。
図３において、１－４は、それぞれ対照群（１）、５－Ａ（２）、５－Ｂ－２（３）および５－Ｂ（４）の状況を示す。ここで、図３Ａの結果は、より多くの宿主（例えば、微生物）のゲノムに由来する核酸分子またはその断片を含むプラスミド５－Ａと比較して、プラスミド５－Ｂまたは５－Ｂ－２でトランスフェクトした後のＴ細胞の生存率が有意に向上されることを示し、ここで、宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低いほど、トランスフェクトした後のＴ細胞の生存率が高くなる。図３Ｂの結果は、より多くの宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド５－Ａと比較して、プラスミド５－Ｂまたは５－Ｂ－２でトランスフェクトしたＴ細胞の増殖能が有意に向上されることを示し、ここで、宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低いほど、トランスフェクトした後のＴ細胞の増殖能が高くなる。図３Ｃの結果は、より多くの宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド５－Ａと比較して、プラスミド５－Ｂまたは５－Ｂ－２でトランスフェクトしたＴ細胞によって発現されたＧＦＰの発現量が有意に向上されることを示し、ここで、宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低いほど、トランスフェクトした後のＴ細胞によって発現されたＧＦＰの発現量が高くなる。
２．２．ＧＦＰまたはＣＡＲの発現
実施例２．１に記載の方法に従って、エレクトロポレーションによって、プラスミド３優－Ａ、５－Ａ、６－Ａ、７－Ａ、３優－Ｂ、５－Ｂ、５－Ｂ－２、６－Ｂまたは７－Ｂを活性化したＴ細胞にそれぞれトランスフェクトして、外因性遺伝子をトランスフェクトし且つ組み込んだ合計２５種のＴ細胞を得る。
これらのＴ細胞におけるノックインタンパク質の相対包括的な発現量を計算し、ここで、相対包括的な発現量＝トランスフェクトされたＴ細胞生存率（％）×トランスフェクトした後のＴ細胞が発現するノックインタンパク質の発現率（％）。トランスフェクトした後のＴ細胞の生存率は、トランスフェクトした後の１日目の細胞生存率であり、トランスフェクトした後のＴ細胞が発現するノックインタンパク質の発現率は、トランスフェクトした後の４日目の発現率である。ここで、トランスフェクトした後のＴ細胞が発現するＧＦＰの発現率は、ＦＡＣＳによって検出され、トランスフェクトした後のＴ細胞が発現するＣＤ１９ ＣＡＲの発現率は、ＣＤ１９抗体（Ｃａｔ＃１０２、ＢｉｏＳｗａｎ Ｌａｂ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）によって検出される。
結果は、図４に示されたとおりであり、ここで、曲線は、それぞれ、宿主ゲノムＤＮＡ含有量に対する相対包括的な発現量のデータのフィッティング曲線である。結果は、プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低いほど、細胞でトランスフェクトした後Ｔ細胞の細胞生存率および／またはノックインタンパク質の発現率が高くなることを示す。
２．３．ＣＡＲの発現
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端には、それぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
調製したプラスミド３優－Ｂ、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）をＤｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞と混合し且つエレクトロポレーションし、前記ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれており、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現されることができる。
実施例２．１に記載の方法に従って、トランスフェクトした後のＴ細胞の細胞生存率および細胞増殖量を統計し、ＣＤ１９ ＣＡＲに対するトランスフェクトした後のＴ細胞の発現量を検出する。結果は、それぞれ図５Ａ－５Ｃに示されたとおりである。ここで、細胞増殖量は、２０秒ＦＡＣＳで検出された細胞数をカウントすることで得られ、細胞生存率のデータは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の検証検出を通じてＰＩ陰性となったＦＳＣ－ＳＳＣゲートの細胞集団により得られる。その結果は、セルカウンターＮＣ－２００で検証される。ＧＦＰ陽性細胞のゲートは、対照群の生細胞の陽性率≦１％によって得られる。図５Ｃの対照は、任意のプラスミドトランスフェクションのないＴ細胞である。
図５Ａは、エレクトロポレーションご５日目の状況を示し、図５Ａの結果は、より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド（例えば、プラスミド３優－Ｂ）でトランスフェクトしたＴ細胞の生存率が約８０％を超えて優れていることを示す。図５Ｂは、エレクトロポレーション後０－５日目の状況を示し、図５Ｂの結果は、より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞の増殖能が優れていることを示す。図５Ｃは、エレクトロポレーション後２日目の状況を示し、図５Ｃの結果は、より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞が外因性タンパク質を発現する発現量が優れていることを示す（即ち、外因性タンパク質発現の陽性率が高い）。プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低いほど、トランスフェクトした後のＴ細胞の細胞生存率、細胞増殖能をさらに促進し、Ｔ細胞ゲノム中に組み込まれた外因性タンパク質の発現レベルを向上させることがわかる。
実施例３．免疫エフェクター細胞のトランスフェクション後に腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
３．１．インビトロでの腫瘍細胞の特異的殺傷
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端にはそれぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
前述のプラスミド３優－Ｂ、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）をＤｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞と混合し且つエレクトロポレーションし、３優－Ｂ ＣＡＲＴ細胞を得る。
３優－Ｂ ＣＡＲＴ細胞を、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、カタログ番号Ｃａｔ＃ Ｃ３０９９）標識標的細胞Ｎａｌｍ６（番号Ｃｌｏｎｅ Ｇ５、ＣＲＬ３２７３、ＡＴＣＣから購入される）（ヒトＢ型急性リンパ球性白血病細胞）と同時にインキュベートした。インキュベートした後、ＣＡＲＴ細胞による標的細胞の殺傷によって生成された標的細胞の死亡率を統計する。死亡率＝ＮＤ／ＮＬ×１００％。ここで、ＮＬは、ＦＡＣＳ検出中に２０ｓに収集した標的細胞の数であり、ＮＤは、そのうちで死亡した標的細胞の数である。
死亡率の結果は、図６に示されたとおりである。ここで、図６は、標的細胞Ｎａｌｍ６の死亡率の結果を示し、横軸Ｅ：Ｔは、エフェクター細胞（ＣＡＲＴ細胞）と標的細胞（腫瘍細胞）との比率を示す。１－４は、それぞれ、３優－Ｂ ＣＡＲＴ細胞の３４時間の殺傷、３優－Ｂ ＣＡＲＴ細胞の１０時間の殺傷、対照Ｔ細胞の３４時間の殺傷、および対照Ｔ細胞の１０時間の殺傷の状況を示す。ここで、対照は、任意のプラスミドトランスフェクションのないＴ細胞である。
図６の結果は、宿主ゲノムＤＮＡ含有量が低い場合でも、当該プラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞が良好な腫瘍細胞殺傷能を有することを示す。
３．２．インビボでの腫瘍細胞の特異的殺傷
Ｎａｌｍ－６－ｌｕｃ細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）を１×１０６／ｍｌの濃度でＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に静脈内注射し、Ｂ型急性リンパ球性白血病のマウス動物モデルを構築する。
４日後、１００μｌの実施例３．１に記載の３優－Ｂ ＣＡＲＴ細胞および同じ細胞ドナーに由来するＰＢＭＣ細胞を、前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に１×１０８／ｍＬの濃度で注射し、これらのマウスを実験群と呼ばれる。他の治療を一切受けずに、１００μｌの前記ＰＢＭＣ細胞を前記マウス動物モデル中の別の２匹のマウスの尾静脈に１×１０８／ｍＬの濃度のみで注射し、対照群とする。
前記ＣＡＲＴ細胞の静脈内注射後３日目、７日目、１１日目または１４日目に、それそれ実験群のマウスおよび対照群のマウスのインビボ腫瘍に対して蛍光検出（Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を実行する。結果は、図７に示されたとおりである。
図７の結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群の腫瘍がほとんど焼失した（蛍光値が検出されない）ことを示す。宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低い場合、プラスミドのトランスフェクション後、当該ＣＡＲＴ細胞がマウスの体内の腫瘍に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
実施例４．Ｔ細胞のトランスフェクション後に腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端にはそれぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
プラスミド１９－ＢをｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）と混合した後、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞をエレクトロポレーションし、前記ＣＤ１９ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５をコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子にノックインされ、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現されることができる。得られた細胞は、１９－Ｂ Ｔ細胞である。
実施例２．１の方法に従って、プラスミド１９－Ｂのエレクトロポレーション後のＴ細胞の細胞生存率、ＣＡＲの発現量および細胞増殖量を統計するとともに、実施例３の方法に従って、標的細胞Ｎａｌｍ６を殺傷するプラスミド１９－ＢでトランスフェクトしたＴ細胞の死亡率を統計する。結果は、それぞれ図８Ａ－８Ｃに示されたとおりである。ここで、細胞増殖量は、２０秒ＦＡＣＳで検出された細胞数をカウントすることで得られ、細胞生存率的データは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）検証検出を通じてＰＩ陰性となったＦＳＣ－ＳＳＣゲートの細胞集団により得られる。ＣＡＲ陽性細胞のゲートは、対照群の生細胞の陽性率≦１％によって得られる。
図８Ａは、エレクトロポレーション後２日目、５日目および７日目の状況を示し、ここでグループ１のＴ細胞は、プラスミド３優－Ｂでトランスフェクトされ、グループ２のＴ細胞は、プラスミド１９－Ｂでトランスフェクトされる。
図８Ａの結果は、プラスミド１９－Ｂおよびプラスミド３優－Ｂでトランスフェクトした後のＴ細胞の生存率が同等であり、どちらも優れており、且つエレクトロポレーション後７日目に約９０％を超え、同時にプラスミド１９－Ｂもトランスフェクション後にＣＤ１９ ＣＡＲを効果的に発現できるが、発現レベルがプラスミド３優－Ｂの発現レベルよりわずかに低いことを示す。
図８Ｂは、エレクトロポレーション後０日目、３日目、および６日目の状況を示し、図８Ｂの結果は、より少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトした後、Ｔ細胞の増殖能が優れていることを示す。プラスミド１９－Ｂであってもプラスミド３優－Ｂであっても、トランスフェクション後のＴ細胞の増幅倍数は、すべて約１０倍以上に達することができる。
図８Ｃは、エレクトロポレーション後２日目の標的細胞Ｎａｌｍ６の死亡率の結果を示す。横軸Ｅ：Ｔは、エフェクター細胞（ＣＡＲＴ細胞）と標的細胞（腫瘍細胞）との比率を表す。図８Ｃ中の１－４は、それぞれ、１９－Ｂ Ｔ細胞の３４時間の殺傷、１９－Ｂ Ｔ細胞の１０時間の殺傷、対照Ｔ細胞の３４時間の殺傷、および対照Ｔ細胞の１０時間の殺傷の状況を示す。ここで、対照Ｔ細胞は、プラスミドでトランスフェクトされていないＴ細胞である。図８Ｃの結果は、本出願に記載の方法を使用して複合型ＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＩＬ－１５）をトランスフェクトして得られたＣＡＲＴ細胞（即ち、１９－Ｂ Ｔ細胞）が腫瘍細胞を効果的に殺傷する能力を有することを示す。
実施例５．腫瘍細胞を特異的に殺傷するより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞
（１）細胞生存率、細胞増殖能、細胞保存能および細胞蘇生能の検出
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端にはそれぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
前記プラスミド１７－Ｂ、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）をＤｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞と混合し且つエレクトロポレーションし、ＣＤ１９ ＣＡＲ－２Ａ－ＢｉＴＥをコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子にノックインされ、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現できる。１７－Ｂ Ｔ細胞を得る。
結果は、図９Ａ－９Ｃに示されたとおりである。図９Ａは、エレクトロポレーションの６日後、効果対標的比（即ち、１７－Ｂ Ｔ細胞：Ｎａｌｍ６細胞）Ｅ：Ｔ＝２：１の条件下で、１７－Ｂ Ｔ細胞およびＮａｌｍ６細胞が培地中で共培養することを示し、ここで、培地は、Ｘ ｖｉｖｏ－１５、５％ＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。図９Ａの結果は、１７－Ｂ Ｔ細胞がエレクトロポレーション後６日間で大量に自然増幅することができ、同時に６日目から標的細胞活性化を補充した後に、さらに大量に増幅できることを示す。
図９Ｂは、それぞれ凍結保存および蘇生の前後の１７－Ｂ Ｔ細胞の細胞生存率を示す。ここで、１７－Ｂ Ｔ細胞は、エレクトロポレーションの１１日後にＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０で凍結保存される。凍結保存および蘇生の約１時間後、凍結保存および蘇生後の細胞生存率をＮＣ－２００で測定する。結果は、１７－Ｂ Ｔ細胞が凍結保存および蘇生後により高い細胞生存率をさらに有することを示す。
図９Ｃは、異なる時間における１７－Ｂ Ｔ細胞によって発現されるＣＤ１９ ＣＡＲの発現量を示す。図９Ｃの左列および右列は、それぞれ、エレクトロポレーション後６日目（即ち、標的細胞Ｎａｌｍ６細胞で１７－Ｂ Ｔ細胞を活性化する前）、および標的細胞が活性化され後に前記凍結保存し且つ蘇生後の１７－Ｂ Ｔ細胞によって発現されるＣＤ１９ ＣＡＲの発現量を示す。結果は、標的細胞Ｎａｌｍ６細胞の活性化後、１７－Ｂ Ｔ細胞がエレクトロポレーション後に大量に自然増幅した後、再び大量に増幅できることを示す。６日後の標的細胞の活性化によってさらに増幅された後、ＣＡＲ陽性率も有意に向上される。
（２）細胞殺傷能の検出
１７－Ｂ Ｔ細胞をＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、カタログ番号Ｃａｔ＃ Ｃ３０９９）標識標的細胞Ｎａｌｍ６（番号Ｃｌｏｎｅ Ｇ５、ＣＲＬ３２７３、ＡＴＣＣから購入される）（ヒトＢ型急性リンパ球性白血病細胞）と共インキュベートする。インキュベーション後、Ｔ細胞による標的細胞の殺傷によって生成された標的細胞の死亡率を統計する。死亡率＝ＮＤ／ＮＬ×１００％。ここで、ＮＬは、ＦＡＣＳ検出中に２０秒以内に収集した標的細胞の数であり、ＮＤは、死亡した標的細胞の数である。
死亡率の結果は、図１０に示されたとおりである。ここで、図１０は、標的細胞Ｎａｌｍ６の死亡率の結果を示し、横軸Ｅ：Ｔは、エフェクター細胞（１７－Ｂ Ｔ細胞）と標的細胞（腫瘍細胞）との比率を表す。図１０中の１－２は、それぞれ１７－Ｂ Ｔ細胞（１）および対照細胞（２）の殺傷状況を表す。ここで、対照細胞は、任意のプラスミドトランスフェクションのないＴ細胞である。
図１０の結果は、宿主ゲノムＤＮＡの含有量がより低い場合に、当該プラスミドを使用して、良好な腫瘍殺傷能力を有する免疫エフェクター細胞を構築できることを示す。
（３）細胞上清液の殺傷能力の検出
１７－Ｂ Ｔ細胞を、５％ＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＮ－７および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含むＸｖｉｖｏ－１５培地で培養する。細胞濃度は、５×１０５－２×１０６／ｍｌに保つ。細胞を１日間培養した後、遠心分離によって細胞培地上清を回収する。固定効果対標的比を有する対照群細胞および標的細胞Ｎａｌｍ６のインキュベーションでは、１７－Ｂ Ｔ細胞の５０μｌの培養上清を添加するか添加しない。１日後、標的細胞の殺傷率を測定する。
結果は、図１１に示されたとおりである。ここで、１－２は、それぞれ１７－Ｂ Ｔ細胞の上清液および対照の標的細胞殺傷状況を表す。図１１の結果は、１７－Ｂ Ｔ細胞の上清液が良好な腫瘍殺傷能力を有することを示す。
（４）細胞殺傷能の検出
Ｎａｌｍ－６－ｌｕｃ細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）を１×１０６／ｍｌの濃度でＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に静脈内注射し、Ｂ型急性リンパ球性白血病のマウス動物モデルを構築する。
４日後、１００μｌの１７－Ｂ Ｔ細胞および同じ細胞ドナーに由来するＰＢＭＣ細胞を、前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に１×１０８／ｍＬの濃度で注射し、，これらのマウスを実験群と呼ぶ。前記マウス動物モデル中の別の２匹のマウスには、他の治療を一切受けずに、１×１０８／ｍＬの濃度で尾静脈に１００μｌの前記ＰＢＭＣ細胞のみを注射し、対照群とする。
Ｔ細胞の静脈内注射後０日目、３日目、１０日目に、それぞれ実験群のマウスおよび対照群のマウスの体内の腫瘍状況に対して蛍光検出（Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を実行する。結果は、図１２に示されたとおりである。
図１２の結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群の腫瘍がほとんど消失する（蛍光値が検出されない）ことを示す。宿主ゲノムＤＮＡ含有量がより低い場合、当該プラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞がマウスの体内の腫瘍細胞に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
実施例６．トランスフェクション効率を向上できるプラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量の低下
プラスミド３優－ＡにＤＮａｓｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ、カタログ番号Ｅ３１１０Ｋ、Ｌｕｃｉｇｅｎから購入される）を投与する。キットによって提供されるプログラムに従って、ＤＮａｓｅを使用してＤＮＡプラスミドを処理する。５０μｇのプラスミド３優－Ａを、５０μｌのＤＮａｓｅ、２０μｌのＡＴＰおよび５０μｌの反応液を含む総容量５００μｌのシステムに添加する。１時間消化する。次に、消化したプラスミドを酢酸ナトリウムでＤＮＡを沈殿させる方法で回収する。７０％のエタノールですすぎ、遠心分離し、プラスミドを水に懸濁する。消化後、プラスミド中の宿主群ＤＮＡの含有量は、約１５０倍に低下する（即ち、その含有量は、トランスフェクション組成物中の総核酸量の約０．０１８（ｗ／ｗ）％を占める）。
次に、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞に、ＤＮａｓｅ処理なしのプラスミド３優－Ａ（グループＡ）、ＤＮａｓｅを投与したプラスミド３優－Ａ（グループＢ）および陽性対照としてのプラスミド３優－Ｂ（グループＣ）をそれぞれトランスフェクトする。対照群は、グループＤであり、それは、任意のプラスミドトランスフェクションのないＴ細胞である。
実施例３の方法に従って、トランスフェクション後１日目および２日目における上記プラスミドでトランスフェクトした細胞の生存率（図１３Ａ）、細胞によって発現されるＣＡＲの発現量（図１３Ｂ）、細胞数（図１３Ｃ）およびエレクトロポレーション効率（図１３Ｄ）を統計する。
図１３の結果は、ＤＮａｓｅを使用してプラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量を低下させると、当該プラスミドでトランスフェクトした細胞のトランスフェクション効率をさらに向上させることができることを示す。
実施例７．免疫細胞をトランスフェクトした後に腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端にはそれぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
プラスミド３３－Ｂを、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）と混合した後、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞に対してエレクトロポレーションし、前記ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５をコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子にノックインされ、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現されることができる。得られた細胞は、３３－Ｂ Ｔ細胞である。
ＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に１×１０７のＨｅｐＧ－２細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）を皮下注射し、皮下腫瘍マウス動物モデルを構築する。
約１４日後、腫瘍は、約１００ｍｍ３の体積まで成長し、１００μｌの３３－Ｂ Ｔ細胞を１×１０８／ｍＬの濃度で前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に注射し、これらのマウスを実験群と呼ぶ。前記マウス動物モデル中の別の３匹のマウスには、何の治療も受けず、対照群とする。
前記Ｔ細胞の静脈内注射後３５日間、毎週腫瘍体積を測定し、実験群のマウス（ＣＡＲ－１）および対照群のマウスの腫瘍成長状況を検出する。結果は、図１４に示されたとおりである。
対照群のマウスは、約２８日で死亡する。実験群は、腫瘍体積が３５日でゼロになる傾向がある。図１４の結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群の腫瘍がほとんど消失することを示す。プラスミド中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量がより低い場合、当該プラスミドでトランスフェクトしたＴ細胞は、マウス体内の腫瘍細胞に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
実施例８．Ｔ細胞をトランスフェクトした後腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
ヒトＡＡＶＳ－Ｉ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
プラスミド９－Ｂを、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）と混合した後、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞をエレクトロポレーションし、前記ＢｉＴＥをコードする核酸分子は、前記ヒトＡＡＶＳ－Ｉ遺伝子部位にノックインされ、且つ外因性プロモーター（ｈＰＧＫプロモーター）の制御下で発現される。得られた細胞は、９－Ｂ Ｔ細胞である。
Ｎａｌｍ－６－ｌｕｃ細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）を１×１０６／ｍｌの濃度でＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に静脈内注射し、Ｂ型急性リンパ球性白血病のマウス動物モデルを構築する。
４日後、１００μｌの９－Ｂ Ｔ細胞を１×１０８／ｍＬの濃度で前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に注射し、これらのマウスを実験群と呼ぶ。前記マウス動物モデル中の別の３匹のマウスには、何の治療も受けず、対照群とする。
前記Ｔ細胞の静脈内注射後０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目および１７日目に、実験群のマウスおよび対照群のマウスの体内の腫瘍状況に対して蛍光検出（Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を実行する。結果は、図１５に示されたとおりである。
図１５の結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群には腫瘍を有意に抑制する効果があることを示す。宿主ゲノムＤＮＡ含有量がより低い場合、当該プラスミドでトランスフェクトし、且つＡＡＶＳ－Ｉ部位で外因性遺伝子をノックインした免疫エフェクター細胞は、マウス体内の腫瘍細胞に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
実施例９．Ｔ細胞をトランスフェクトした後腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）、当該ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端にはそれぞれ三つのチオ修飾およびオキソメチル修飾がある。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
プラスミド３２－Ｂを、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）と混合した後、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞をエレクトロポレーションし、前記ＧＰＣ３ ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ－７－２Ａ－ＣＣＬ１９をコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子にノックインされ、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現される。得られた細胞は、３２－Ｂ Ｔ細胞である。
１×１０７のＨｅｐＧ－２細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）をＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に皮下注射し、皮下腫瘍マウス動物モデルを構築する。
約１４日後、腫瘍は、約１００ｍｍ３の体積まで成長し、１００μｌの前記３２－Ｂ Ｔ細胞を、１×１０８／ｍＬの濃度で前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に注射し、これらのマウスを実験群と呼ぶ。前記マウス動物モデル中の別の３匹のマウスには何の治療も受けず、対照群とする。
前記Ｔ細胞の静脈内注射後２４日間、毎週腫瘍体積を測定し、実験群のマウス（７／１９ＣＡＲＴ）および対照群のマウスの腫瘍成長状況を検出する。結果は、図１６に示されたとおりである。
図１６の結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群の腫瘍がほとんど消失することを示す。宿主ゲノムＤＮＡ含有量がより低い場合、当該プラスミドでトランスフェクトし、且つヒトＴＲＡＣ部位で外因性遺伝子をノックインしたＴ細胞は、マウス体内の腫瘍細胞に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
実施例１０．Ｔ細胞をトランスフェクトした後非活性化Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞のトランスフェクション効率を増加できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
プラスミド１１－ＡにＤＮａｓｅを投与する（Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ、カタログ番号 Ｅ３１１０Ｋ、Ｌｕｃｉｇｅｎから購入される）。キットによって提供されるプログラムに従って、ＤＮａｓｅを使用してＤＮＡプラスミドを処理する：５０μｇのプラスミド１１－Ａを、５０μｌのＤＮａｓｅ、２０μｌのＡＴＰおよび５０μｌの反応液を含む総容量５００μｌのシステムに添加する。１時間消化する。次に、消化したプラスミドを酢酸ナトリウムでＤＮＡを沈殿させる方法で回収する。７０％エタノールですすぎ、遠心分離し、プラスミドを水に懸濁する。消化後、プラスミド中の宿主群ＤＮＡの含有量が約１０倍低下する（即ち、消化後、その含有量は、トランスフェクション組成物中の総核酸量の約０．３（ｗ／ｗ）％を占める）。
次にＤＮａｓｅ処理なしのプラスミド１１－Ａ（グループＡ）およびＤＮａｓｅを投与したプラスミド１１－Ａ（グループＢ）を使用して、それぞれ活性化処理なしのヒトＴ細胞（図１７Ａ－１７Ｄ）、またはＤｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞（図１８Ａ－１８Ｄ）をトランスフェクトする。
図１７Ａ－１７Ｄおよび図１８Ａ－１８Ｄの結果から、非活性化Ｔ細胞がトランスフェクションに使用されるか（図１７Ａ－１７Ｄ）、活性化Ｔ細胞がトランスフェクションに使用されるか（図１８Ａ－１８Ｄ）に関係なく、トランスフェクション組成物中の宿主ゲノムＤＮＡの含有量が低下すると、トランスフェクション効率、細胞生存率（１７Ａ、１８Ａ）、ＧＦＰの発現量（１７Ｂ、１８Ｂ、１７Ｃ、１８Ｃ）およびＧＦＰ相対包括的な発現量（１７Ｄ、１８Ｄ）を有意に向上させることができることがわかる。
実施例１１．Ｔ細胞をトランスフェクトした後腫瘍細胞を特異的に殺傷できるより少ない宿主ゲノムＤＮＡを含むプラスミド
ＰＤ－１およびＣＤ９５をノックアウトすると、ＣＡＲＴ機能を増加することができる。主流のウイルス法の場合、細胞に感染しながら内因性遺伝子をワンステップでノックアウトするＧＭＰ準拠の方法を設計することが困難である。非ウイルス法によるトランスフェクションについては、以前は、非ウイルストランスフェクション法（例えば、プラスミドトランスフェクション法）を使用して細胞をトランスフェクトする場合のトランスフェクション効率が低いと考えられる。外因性遺伝子をプラスミドでトランスフェクトしながら、一つまたは複数の内因性遺伝子をノックアウトしたい場合、トランスフェクション効率は、すでに低いのであるが、さらに低くなる。
本出願に記載の方法を使用すると、トランスフェクション効率、遺伝子編集の効率および外因性遺伝子の発現量が大幅に向上するため、一回のトランスフェクションによって、外因性遺伝子のノックインおよび複数の内因性遺伝子のノックアウトを同時に達成することができる。
ヒトＴＲＡＣ遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）。ヒトＣＤ９５遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）。ヒトＰＤ－１遺伝子を標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを設計する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され、南京）。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入される（カタログ番号：４０５７２－Ａ０８Ｂ）。
プラスミド１２－Ｂを、上記の適切なｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（ＲＮＰシステムとして調製し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの重量比は、約３：１である）と混合した後、Ｄｙｎａｂｅａｄで２－３日間活性化したヒトＴ細胞をエレクトロポレーションし、前記ＧＰＣ３ ＣＡＲをコードする核酸分子は、前記ヒトＴＲＡＣ遺伝子にノックインされ、且つ当該ＴＲＡＣ遺伝子の内因性プロモーターを介して発現され、ヒトＰＤ－１遺伝子および／またはヒトＣＤ９５遺伝子（即ち、対応するｓｇＲＮＡを添加することによって）をさらに同時にノックアウトすることができる。得られた細胞は、１２－Ｂ Ｔ細胞である。
メーカーによって提供される説明書に従って、ＥｎＧｅｎ(R)突然変異検出キット（ＮＥＢ）を使用して、細胞中の遺伝子編集の状況を検出し、必要とする修飾が加えられた細胞を同定する。簡単に説明すると、前記１２－Ｂ Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによって遺伝子編集の目的領域を増幅する。ここで、ＴＲＡＣ遺伝子の標的領域を増幅するために使用されるプライマー対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（フォワードプライマー）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（リバースプライマー）に示される核酸配列を含む。ＰＤ－１遺伝子の標的領域を増幅するために使用されるプライマー対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３（フォワードプライマー）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（リバースプライマー）に示される核酸配列を含む。ＣＤ９５遺伝子の標的領域を増幅するために使用されるプライマー対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（フォワードプライマー）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７（リバースプライマー）に示される核酸配列を含む。Ｔ７エンドヌクレアーゼを使用して、編集された増幅生成物が存在するかどうかを検出する。結果は、図１９Ａに示されたとおりである。
図１９Ａにおいて、ＴＲＡＣ群は、ＴＲＡＣ部位で遺伝子編集が発生する状況を示し、ＣＤ９５群は、ＣＤ９５部位で遺伝子編集が発生する状況を示し、ＰＤ－１群は、ＰＤ－１部位で遺伝子編集が発生する状況を示す。
レーン１中のＤＮＡは、対照群細胞からのものであり（トランスフェクション組成物が添加されない）、レーン２中のＤＮＡは、プラスミド１２－Ｂ（ＣＡＲ発現＝３７％）でトランスフェクトし、且つＰＤ－１遺伝子をノックアウトした細胞に由来し（即ち、トランスフェクション組成物は、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡをさらに含む）、レーン３中のＤＮＡは、プラスミド１２－Ｂ（ＣＡＲ発現＝４０％）でトランスフェクトし、且つＰＤ－１遺伝子およびＣＤ９５遺伝子をノックアウトした細胞に由来し（即ち、トランスフェクション組成物は、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＣＤ９５を標的とするｓｇＲＮＡをさらに含む）、レーン４中のＤＮＡは、プラスミド１２－Ｂ（ＣＡＲ発現＝４５％）のみでトランスフェクトするが、ＰＤ－１またはＣＤ９５をノックアウトしない細胞に由来する。
これらの結果は、本出願の方法が、ワンステップランスフェクションにより、外因性遺伝子のノックインおよび内因性遺伝子のノックアウトを同時に実現できることを示す。
さらに、プラスミド１２－Ｂでトランスフェクトし、インビボでのＰＤ－１遺伝子およびＣＤ９５遺伝子を同時にノックアウトした１２－Ｂ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力をさらに検証する。
ＮＣＧマウス（江蘇ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈから購入される）に１×１０７のＨｅｐＧ－２細胞（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙから購入され、上海）を皮下注射し、皮下腫瘍マウス動物モデルを構築する。
約１４日後、腫瘍が約１００ｍｍ３の体積まで成長し、１００μｌの前記１２－Ｂ Ｔ細胞を５×１０５／ｍＬの濃度で前記マウス動物モデル中の３匹のマウスの尾静脈に注射し、これらのマウスを実験群と呼ぶ。前記マウス動物モデル中の別の２匹のマウスには何の治療も受けず、対照群とする。
前記Ｔ細胞の静脈内注射後２８日間、毎週腫瘍体積を２回測定し、実験群のマウス（ＫＯ－９５－ＰＤ１－ＣＡＲＴ）および対照群のマウスの腫瘍成長状況を検出する。結果は、図１９Ｂに示されたとおりである。
図１９Ｂの結果は、対照群の腫瘍が急速に成長したのに対し、実験群の腫瘍がほとんど消失することを示す。宿主ゲノムＤＮＡの含有量がより低い場合、該プラスミドでトランスフェクトし、ヒトＴＲＡＣ部位で外因性遺伝子をノックインし、且つＰＤ－１およびＣＤ９５を同時にノックアウトした免疫エフェクター細胞は、マウス体内の腫瘍細胞に対して顕著な殺傷効果を有することがわかる。
前述の詳細な説明は、解釈および例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を制限するものではない。今まで本出願で列挙された実施形態の様々な変形は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内にとどまる。

Claims (161)

  1. 細胞を修飾する方法であって、
    前記方法は、トランスフェクション組成物を使用して修飾される細胞をトランスフェクトして、前記細胞が外因性遺伝子を含有および／または発現するようにし、前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を含む外因性核酸分子を含み、前記外因性核酸分子の少なくとも一部は、宿主細胞から得られることと、前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子の部分において、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下であることとを含むことを特徴とする、前記方法。
  2. 前記修飾される細胞は、真核細胞であることを特徴とする
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記修飾される細胞は、哺乳動物細胞であることを特徴とする
    請求項１－２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記修飾される細胞は、ヒト細胞であることを特徴とする
    請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記修飾される細胞は、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含むことを特徴とする
    請求項１－４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記修飾される細胞は、多能性幹細胞、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含むことを特徴とする
    請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記修飾される細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことを特徴とする
    請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記修飾される細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球および／またはマスト細胞を含むことを特徴とする
    請求項１－７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記修飾される細胞は、末梢血リンパ球を含むことを特徴とする
    請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記修飾される細胞は、初代細胞であることを特徴とする
    請求項１－９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記修飾される細胞は、被験者由来の自己細胞であることを特徴とする
    請求項１－１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. トランスフェクトされた前記修飾される細胞は、活性化された細胞であることを特徴とする
    請求項１－１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記活性化は、前記修飾される細胞と活性化組成物とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１２に記載の方法。
  14. 前記修飾される細胞は、免疫細胞を含み、前記活性化組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とする
    請求項１３に記載の方法。
  15. 前記活性化は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約４日間以内接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１３－１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記方法は、前記修飾される細胞と前記活性化組成物とを約２日間または２日間以内の期間接触させながら前記トランスフェクションを実施することを含むことを特徴とする
    請求項１３－１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記トランスフェクトは、前記修飾される細胞をエレクトロポレーションすることを含むことを特徴とする
    請求項１－１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子は、プラスミドであることを特徴とする
    請求項１－１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記外因性核酸分子は、環状核酸分子、スーパーコイル核酸分子および／または直鎖状核酸分子を含むことを特徴とする
    請求項１－１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記外因性核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含むことを特徴とする
    請求項１－１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記外因性核酸分子は、一本鎖核酸分子および／または二本鎖核酸分子を含むことを特徴とする
    請求項１－２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約５μｇ／ｍＬ乃至約３０００μｇ／ｍＬであることを特徴とする
    請求項１－２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬであることを特徴とする
    請求項１－２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から抽出して取得されることを特徴とする
    請求項１－２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約３ｋｂであることを特徴とする
    請求項１－２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記宿主は、微生物宿主であることを特徴とする
    請求項１－２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記宿主は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることを特徴とする
    請求項１－２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記宿主は、グラム陰性菌を含むことを特徴とする
    請求項１－２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記宿主は、大腸菌を含むことを特徴とする
    請求項１－２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの大きさは、少なくとも約１０ｋｂであることを特徴とする
    請求項１－２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１％（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項１－３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約９‰（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項１－３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする
    請求項１－３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡは、前記外因性核酸分子部分に含まれないことを特徴とする
    請求項１－３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分は、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が減少するように処理され、および／または前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、当該含有量に応じて、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させるように当該外因性核酸分子部分を処理するかどうかを判断することを特徴とする
    請求項１－３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記宿主細胞から得られる前記外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１０％（ｗ／ｗ）またはそれ以上である場合、その中の前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が減少するように当該外因性核酸分子部分を処理することを特徴とする
    請求項３５に記載の方法。
  37. 前記処理は、前記外因性核酸分子部分と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一つまたは複数の試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項３５－３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項３７－３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記トランスフェクション組成物と前記試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項３５－３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記外因性遺伝子は、一種または複数種の外因性タンパク質をコードすることを特徴とする
    請求項１－４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記外因性タンパク質は、抗体または抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカインおよびケモカインからなる群のうちの一種または複数種を含むことを特徴とする
    請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＣＡＲは、腫瘍関連抗原を標的とする標的結合ドメインを含むことを特徴とする
    請求項４２に記載の方法。
  44. 前記腫瘍関連抗原は、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２およびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎから選択されることを特徴とする
    請求項４３に記載の方法。
  45. 前記抗体または抗原結合断片は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含むことを特徴とする
    請求項４２－４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含むことを特徴とする
    請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＢｉＴＥは、ＣＤ３結合ドメインを含むことを特徴とする
    請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ＢｉＴＥは、腫瘍関連抗原結合ドメインをさらに含むことを特徴とする
    請求項４６－４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記サイトカインは、インターロイキンを含むことを特徴とする
    請求項４２－４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記インターロイキンは、ＩＬ１５、ＩＬ７またはそれらの機能的活性断片を含むことを特徴とする
    請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ケモカインは、ＣＣＬ１９またはその機能的活性断片を含むことを特徴とする
    請求項４２－５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記外因性タンパク質は、ポリタンパク質を含むことを特徴とする
    請求項１－５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ポリタンパク質中の二つまたはそれ以上のタンパク質の間には、分解可能部分が含まれることを特徴とする
    請求項５２に記載の方法。
  54. 前記分解可能部分は、２Ａペプチドを含むことを特徴とする
    請求項５３に記載の方法。
  55. 前記２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＥ２Ａを含むことを特徴とする
    請求項５４に記載の方法。
  56. 前記外因性核酸分子は、一つまたは複数の相同領域をさらに含むことを特徴とする
    請求項１－５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記相同領域のそれぞれは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする
    請求項５６に記載の方法。
  58. 前記外因性核酸分子において、前記相同領域は、前記外因性遺伝子の３’末端および／または５’末端に位置することを特徴とする
    請求項５６－５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記外因性遺伝子は、前記細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とする
    請求項１－５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記相同領域は、前記細胞ゲノムＤＮＡの標的領域と相同であることを特徴とする
    請求項５６－５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記標的領域は、ＴＣＲ－αサブユニット定常（ＴＲＡＣ）遺伝子中に位置されるか、またはＡＡＶＳ－Ｉ部位に位置されることを特徴とする
    請求項６０に記載の方法。
  62. 前記トランスフェクション組成物は、ウイルスベクターを含まないことを特徴とする
    請求項１－６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を前記細胞ゲノムの特定の位置に組み込ませることができる遺伝子編集システムをさらに含むことを特徴とする
    請求項１－６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記遺伝子編集システムは、部位特異的酵素またはそれをコードする核酸分子を含むことを特徴とする
    請求項６３に記載の方法。
  65. 前記部位特異的酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、トランスポザーゼ、インテグラーゼおよびＣａｓタンパク質から選択されることを特徴とする
    請求項６４に記載の方法。
  66. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であることを特徴とする
    請求項６５に記載の方法。
  67. 前記トランスポザーゼは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ、および／またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼを含むことを特徴とする
    請求項６５に記載の方法。
  68. 前記遺伝子編集システムは、一種または複数種のガイドＲＮＡをさらに含むことを特徴とする
    請求項６３－６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記ガイドＲＮＡは、前記細胞ゲノムの標的領域中の核酸配列に相補的であることを特徴とする
    請求項６８に記載の方法。
  70. 前記遺伝子編集システムは、リボ核タンパク質複合体ＲＮＰを含み、前記ＲＮＰは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡを含むことを特徴とする
    請求項６８－６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法であって、
    前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含むことを特徴とする、前記方法。
  72. トランスフェクトされる前記細胞は、真核細胞であることを特徴とする
    請求項７１に記載の方法。
  73. トランスフェクトされる前記細胞は、哺乳動物細胞であることを特徴とする
    請求項７１－７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. トランスフェクトされる前記細胞は、ヒト細胞であることを特徴とする
    請求項７１－７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. トランスフェクトされる前記細胞は、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞、ファイブロサイト（ｆｉｂｒｏｃｙｔｅ）および／または筋細胞を含むことを特徴とする
    請求項７１－７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. トランスフェクトされる前記細胞は、多能性幹細胞、造血幹細胞および／または間葉系幹細胞を含むことを特徴とする
    請求項７１－７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. トランスフェクトされる前記細胞は、免疫エフェクター細胞を含むことを特徴とする
    請求項７１－７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. トランスフェクトされる前記細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、顆粒球および／またはマスト細胞を含むことを特徴とする
    請求項７１－７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. トランスフェクトされる前記細胞は、末梢血リンパ球を含むことを特徴とする
    請求項７１－７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. トランスフェクトされる前記細胞は、初代細胞であることを特徴とする
    請求項７１－７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. トランスフェクトされる前記細胞は、被験者由来の自己細胞であることを特徴とする
    請求項７１－８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. トランスフェクトされた前記細胞は、活性化された細胞であることを特徴とする
    請求項７１－８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記活性化は、トランスフェクトされる前記細胞と活性化組成物とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項８２に記載の方法。
  84. トランスフェクトされる前記細胞は、免疫細胞を含み、前記活性化組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とする
    請求項８３に記載の方法。
  85. 前記活性化は、トランスフェクトされる前記細胞と前記活性化組成物とを約４日間以内接触させることを含むことを特徴とする
    請求項８３－８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記方法は、トランスフェクトされる前記細胞と前記活性化組成物とを約２日間または２日間以内の期間接触させながら前記トランスフェクションを実施することを含むことを特徴とする
    請求項８３－８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記トランスフェクトは、前記細胞をエレクトロポレーションすることを含むことを特徴とする
    請求項７１－８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記外因性核酸分子は、プラスミドであることを特徴とする
    請求項７１－８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記外因性核酸分子は、環状核酸分子、スーパーコイル核酸分子および／または直鎖状核酸分子を含むことを特徴とする
    請求項７１－８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記外因性核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含むことを特徴とする
    請求項７１－８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記外因性核酸分子は、一本鎖核酸分子および／または二本鎖核酸分子を含むことを特徴とする
    請求項７１－９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約５μｇ／ｍＬ乃至約３０００μｇ／ｍＬであることを特徴とする
    請求項７１－９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. トランスフェクション組成物における前記外因性核酸分子の濃度は、約２００μｇ／ｍＬ乃至約８００μｇ／ｍＬであることを特徴とする
    請求項７１－９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記外因性核酸分子は、前記宿主細胞から抽出して取得されることを特徴とする
    請求項７１－９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記外因性核酸分子の大きさは、少なくとも約３ｋｂであることを特徴とする
    請求項７１－９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記宿主は、微生物宿主であることを特徴とする
    請求項７１－９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記宿主は、細菌、真菌、放線菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチアおよびスピロヘータからなる群のうちの一種または複数種から選択されることを特徴とする
    請求項７１－９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記宿主は、グラム陰性菌を含むことを特徴とする
    請求項７１－９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 前記宿主は、大腸菌を含むことを特徴とする
    請求項７１－９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの大きさは、少なくとも約１０ｋｂであることを特徴とする
    請求項７１－９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項７１－１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記減少した後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１％（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項７１－１０２のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする
    請求項７１－１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることは、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種の試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項７１－１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項１０４－１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることは、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子と前記試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１０４－１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記外因性核酸分子は、請求項１－７０のいずれか１項に限定された外因性遺伝子を含むことを特徴とする
    請求項７１－１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記外因性核酸分子は、一つまたは複数の請求項５６－７０のいずれか１項に限定された相同領域をさらに含むことを特徴とする
    請求項７１－１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記外因性核酸分子は、ウイルスベクターを含まないことを特徴とする
    請求項７１－１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記トランスフェクション組成物は、前記外因性遺伝子を前記細胞ゲノムの特定の位置に組み込ませることができる遺伝子編集システムをさらに含むことを特徴とする
    請求項１０８－１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記遺伝子編集システムは、請求項６４－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１１１に記載の方法。
  113. 宿主細胞から得られる外因性核酸分子の細胞へのトランスフェクション効率を向上するための方法であって、
    前記方法は、前記外因性核酸分子をＤＮａｓｅで処理することを含むことを特徴とする、前記方法。
  114. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項１１３－１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記外因性核酸分子と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１１３－１１５のいずれか１項に記載の方法。
  117. 前記トランスフェクトは、前記細胞をエレクトロポレーションすることを含むことを特徴とする
    請求項１１３－１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 前記外因性核酸分子は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１１３－１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. トランスフェクトされる前記細胞は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１１３－１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. トランスフェクション組成物を最適化するための方法であって、
    前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を減少させることを含むことを特徴とする、前記方法。
  121. 前記トランスフェクション組成物は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記宿主は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１２０－１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１０％（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項１２０－１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記最適化された後、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、約１％（ｗ／ｗ）以下であることを特徴とする
    請求項１２０－１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする
    請求項１２０－１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記最適化は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種の試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１２０－１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項１２６－１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記最適化は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と前記試薬とを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１２０－１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. トランスフェクション組成物を最適化するための方法であって、
    前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分をＤＮａｓｅで処理することを含むことを特徴とする、前記方法。
  131. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項１３０－１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記処理は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の存在下で前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と前記ＤＮａｓｅとを接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１３０－１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 前記トランスフェクション組成物は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１３０－１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. トランスフェクション組成物の品質を判断するための方法であって、
    前記トランスフェクション組成物は、宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含み、前記方法は、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分における前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量を測定し、当該含有量に応じて、前記トランスフェクション組成物の品質を判断することを含むことを特徴とする、前記方法。
  136. 前記トランスフェクション組成物は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記宿主は、請求項１－７０のいずれか１項に限定されたとおりであることを特徴とする
    請求項１３５－１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１０％（ｗ／ｗ）以下である場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断されることを特徴とする
    請求項１３５－１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量が約１％（ｗ／ｗ）以下である場合、当該トランスフェクション組成物の品質が標準を満たすと判断されることを特徴とする
    請求項１３５－１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. 前記宿主細胞のゲノムＤＮＡの含有量は、ｑＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする
    請求項１３５－１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. トランスフェクション組成物を最適化するための、請求項３７－４０のいずれか１項に限定された試薬の用途。
  142. インビトロ法またはエクスビボ法であることを特徴とする
    請求項１－１４１のいずれか１項に記載の方法。
  143. トランスフェクト用のキットであって、
    １）請求項１－７０のいずれか１項に限定された宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および
    ２）前記宿主細胞のゲノムＤＮＡを減少または分解できる試薬とを含むことを特徴とする、前記キット。
  144. ２）の前記試薬は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＳＤＳ、ＴＸ－１００、ＣＴＡＢおよび塩化セシウム－臭化エチジウムからなる群から選択される一種または複数種を含むことを特徴とする
    請求項１４３に記載のキット。
  145. 前記ＤＮａｓｅは、線状ＤＮＡを非特異的に切断することができることを特徴とする
    請求項１４４に記載のキット。
  146. 前記ＤＮａｓｅは、エキソヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項１４４－１４５のいずれか１項に記載のキット。
  147. それは、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む試薬をさらに含むことを特徴とする
    請求項１４３－１４６のいずれか１項に記載のキット。
  148. キットであって、
    １）請求項１－７０のいずれか１項に限定された宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分と、および
    ２）請求項１１３－１３４のいずれか１項に記載の方法により、１）の前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分が記載されるか、および／または請求項１３５－１４０のいずれか１項に記載の方法により、前記宿主細胞から得られる外因性核酸分子部分を含むトランスフェクション組成物の品質が判断される取扱説明書とを含むことを特徴とする、前記キット。
  149. 請求項１１３－１３４のいずれか１項に記載の方法によって処理された外因性核酸分子を含むトランスフェクション組成物。
  150. 請求項１４９に記載のトランスフェクション組成物によってトランスフェクトされた細胞。
  151. 前記トランスフェクトは、前記細胞をエレクトロポレーションすることを含むことを特徴とする
    請求項１５０に記載の細胞。
  152. 請求項１－７０のいずれか１項に記載の方法によって修飾された細胞。
  153. 細胞集団であって、
    請求項１５０－１５２のいずれか１項に記載の細胞および／またはその子孫を含むことを特徴とする、前記細胞集団。
  154. 医薬組成物であって、
    請求項１４９に記載のトランスフェクション組成物、請求項１５０－１５２のいずれか１項に記載の細胞、および／または請求項１５３に記載の細胞集団を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
  155. 薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことを特徴とする
    請求項１５４に記載の医薬組成物。
  156. 薬物の調製に使用される、請求項１４９に記載のトランスフェクション組成物、請求項１５０－１５２のいずれか１項に記載の細胞、請求項１５３に記載の細胞集団、および／または請求項１５４－１５５のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。
  157. 前記薬物は、癌を予防、治療および／または緩和するために使用されることを特徴とする
    請求項１５６に記載の用途。
  158. 前記薬物は、免疫応答を調節するために使用されることを特徴とする
    請求項１５６－１５７のいずれか１項に記載の用途。
  159. 被験者の疾患または病症を予防、治療および／または緩和するための方法であって、
    前記方法は、前記被験者に有効量の請求項１４９に記載のトランスフェクション組成物、請求項１５０－１５２のいずれか１項に記載の細胞、請求項１５３に記載の細胞集団、および／または請求項１５４－１５５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、前記方法。
  160. 前記疾患または病症は、癌であることを特徴とする
    請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記疾患または病症は、前記被験者における免疫応答に関連することを特徴とする
    請求項１５９－１６０のいずれか１項に記載の方法。
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