JP2024519090A - ウイルスベクター産生系、ウイルスベクター産生のための操作された細胞、およびその使用方法 - Google Patents

ウイルスベクター産生系、ウイルスベクター産生のための操作された細胞、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

ウイルスベクター産生系およびウイルスベクター産生のための操作された細胞が本明細書において記載される。操作された細胞を使用してウイルスベクターを産生する方法も本明細書において記載される。

Description

分野
ウイルスベクター産生系およびウイルスベクター産生のための操作された細胞が本明細書において記載される。操作された細胞を使用してウイルスベクターを産生する方法も本明細書において記載される。
関連出願
本出願は、2021年5月18日に出願された米国仮出願第63/189,771号の35 U.S.C.§119の下での利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書において組み込まれる。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
この出願はEFS-WebからASCIIフォーマットで提出された配列表を含有し、その全体が参照によってここに組み込まれる。2022年5月17日に作成された該ASCIIコピーは、A121070007WO00-SEQ-CRPと名付けられ、サイズは15,679バイトである。
背景
ウイルスベクターは、疾患を治療するために遺伝子ペイロードを標的細胞に送達する有望な治療薬である。ペイロードの一般的な種類は、患者の細胞の対応する遺伝子の欠損または変異を補正するための完全に機能的な目的の遺伝子(GOI)をコードするDNAである。AAVベクターは、大量のウイルスを産生し得る産生細胞株(例として、HEK293由来細胞株)を使用して産生されるが、それらの増殖および産生速度は、細胞の健康および資源割当に影響を及ぼす多くの因子によって影響され得る。
概要
本明細書において、ペイロード分子の発現に対する制御を高めることを可能にするウイルスベクター産生系およびウイルスベクター産生のための操作された細胞が記載される。該システムおよび該操作された細胞を使用する方法も本明細書において記載される。
いくつかの側面では、本開示は、(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上の異種ポリ核酸を含むウイルスベクター産生成分を含む操作された細胞;(b)第1の発現カセットをコードする異種核酸配列であって、第1の発現カセットが、調節RNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む、異種核酸配列;および(c)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸を含むウイルスベクター産生系に関する。
いくつかの態様では、移入ポリ核酸の中央核酸配列は、マルチクローニングサイトをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、中央核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって隣接されているマルチクローニング配列を含む。いくつかの態様では、マルチクローニング配列は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復によって隣接されている。いくつかの態様では、マルチクローニング配列は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって5'末端および3'末端で隣接されている。いくつかの態様では、中央核酸配列は、プロモータを更に含む。
いくつかの態様では、移入ポリ核酸配列の中央核酸配列は、第2の発現カセットを含み、第2の発現カセットは、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つ以上の異なる調節RNAの核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、ウイルスベクター産生成分の遺伝子産物をコードする核酸配列を更に含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセット中の遺伝子産物をコードする核酸配列は、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR;調節RNAをコードする核酸配列を含むイントロン;調節RNAをコードする核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを有する。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカをコードする核酸配列を更に含む。いくつかの態様では、選択可能なマーカは、蛍光タンパク質または抗生物質耐性タンパク質を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセット中の選択可能なマーカをコードする核酸配列は、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR;調節RNAをコードする核酸配列を含むイントロン;調節RNAをコードする核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを有する。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はAAVウイルスベクター産生系であり、ウイルスベクター産生成分は、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、AAV逆位タンデム反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、レンチウイルスベクター産生系であり、ウイルスベクター産生成分は、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、レンチウイルス長末端反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分の1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分の1つ以上の異種ポリ核酸の各々が、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、操作された細胞は、第1の発現カセットをコードする異種核酸配列を更に含む。
いくつかの態様では、操作された細胞は、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する。
いくつかの態様では、上記のウイルスベクター産生系のいずれか1つの調節RNAはshRNAまたはamiRNAである。いくつかの態様では、shRNAをコードする核酸配列は、配列番号2～11のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカをコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'から3'で:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む。いくつかの態様では、イントロンは、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む。
いくつかの態様では、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンは、5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが、3'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む。いくつかの態様では、選択可能なマーカのイントロンは、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する。いくつかの態様では、イントロンは、配列番号12の核酸配列を含む。
いくつかの側面では、上記のウイルスベクター産生系の調節RNAはCas13ガイドRNAである。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つまたはそれを超えるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、Cas13をコードする異種ポリ核酸を更に含む。いくつかの態様では、Cas13はCas13dである。いくつかの態様では、Cas13dは、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、Cas13をコードする異種ポリ核酸は、第1の発現カセットを更に含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む。いくつかの態様では、操作された細胞は、Cas13をコードする異種ポリ核酸を更に含む。
いくつかの側面では、ウイルスベクター産生のための操作された細胞は、
(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;
(b)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;および
(c)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸
を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つ以上の異なるshRNAまたは2つ以上の異なるamiRNAの核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカをコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'から3'で:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む。
いくつかの態様では、イントロンは、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む。いくつかの態様では、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンは、5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが、3'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様では、選択可能なマーカのイントロンは、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する。
いくつかの態様では、イントロンは、配列番号12の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、shRNAをコードする核酸配列は、配列番号2～11のいずれかの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、AAV逆位タンデム反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、レンチウイルス長末端反復である。
いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれは、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
いくつかの態様では、操作された細胞は、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する。
いくつかの側面では、本出願は、ウイルスベクター産生中にshRNAを発現させることを含む、上記の操作された細胞のいずれか1つにおけるウイルスベクター産生中のペイロード分子の発現を減少させる方法を開示する。
いくつかの側面では、本出願は、(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;(b)Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;(c)Cas13をコードする核酸配列;および(d)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含むウイルスベクター産生のための操作された細胞を開示する。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つまたはそれを超えるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む。いくつかの態様では、Cas13はCas13dである。いくつかの態様では、Cas13dは、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットはCas13をコードする核酸配列を更に含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む。いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは2つまたはそれを超える異なるCas13ガイドRNAの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、AAV逆位タンデム反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、レンチウイルス長末端反復である。
いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれは、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
いくつかの態様では、操作された細胞は、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する。
いくつかの側面では、本開示は、ウイルスベクター産生中にCas13およびCas13ガイドRNAを発現させることを含む、本明細書において記載の操作された細胞のいずれか1つにおけるウイルスベクター産生中のペイロード分子の発現を減少させる方法に関する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つ以上を参照することによってよりよく理解され得る本開示の特定の側面を更に実証するために包含される。図面に示されたデータは、決して本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
図1は、AAVペイロード分子(または目的の遺伝子、「GOI」)のshRNA媒介ノックダウンの例示的な概略図を示す。1)RNAは、GOIに対応して転写され、3'UTRにshRNAを有する遺伝子(ここではNeo-TagBFP)にも対応する。shRNA(ループ)は、イントロンドナーおよびアクセプタ部位(アスタリスク)によって隣接されている。GOIは、5'および3'UTRにおけるshRNA標的部位のタンデム反復(影付きのボックス)によって隣接されている。2)shRNA配列がスプライシングされ、shRNAヘアピンを解放する。3)shRNAヘアピンはRNAi機構によってプロセシングされ、ガイド鎖はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる。4)ガイド鎖を有するRISCはGOI mRNAに結合する。5)RISCはGOI mRNAを切断し、および/またはその翻訳を抑制し得る。翻訳に利用可能なGOI mRNAの減少は、GOIタンパク質のレベルの低下をもたらす。 図2A～図2Bは、shRNA発現プラスミドを有する細胞またはshRNA発現プラスミドを欠く細胞におけるペイロード分子(EGFP)ノックダウンの比較を示す。図2Aは、EGFP shRNAの添加の有無にかかわらず、AAVおよびAAV感染力価を収集する前のAAV産生細胞の蛍光画像を示す。図2Bは、AAV力価の定量化を示す。 図3は、5'UTRまたは3'UTRのいずれかにFF5標的部位を含有する免疫グロブリン(IG)-EYFPペイロード分子、FF5標的部位を欠くIG-EYFPペイロード分子、およびFF5標的部位を欠くEGFPペイロード分子の比較を示す。左側は、AAVを産生するために使用されているトランスフェクト細胞内で測定されたEYFPまたはEGFPの蛍光幾何平均である。右側は、形質導入アッセイを使用して測定されたウイルス力価である。FF5 shRNAによるトランスフェクション(青色バー)は、FF5標的部位を有する構築物のAAV産生細胞におけるペイロード分子の顕著な減少をもたらすが、FF5 shRNAがトランスフェクトされていない対照(赤色バー)と比較して同様またはより良好なウイルス力価を依然として生じる。 図4は、AAVペイロード分子(または目的の遺伝子、「GOI」)のCas13媒介ノックダウンの例示的な概略図を示す。ノックダウンシステムは、Cas13d-crRNA複合体によって認識される5'UTR、3'UTRまたは両方の領域に配置された一連の標的配列からなる。
詳細な記載
本開示の発明者らは、ウイルスベクター産生中のウイルスベクターのペイロード分子(すなわち、目的の遺伝子または「GOI」)の発現が、資源をウイルスベクターの産生から遠ざけ、ペイロードのRNAおよびタンパク質の産生に向け得ることを認識した。本発明者らはまた、いくつかのペイロード分子が毒性である場合があり、産生細胞の増殖および生産性に更に影響を及ぼす場合があることを認識した。本明細書において記載されるのは、ウイルスベクター産生中にペイロード分子の発現に対する制御を高めることを可能にするウイルスベクター産生系およびウイルスベクター産生のための操作された細胞である。該操作された細胞を使用する方法も本明細書において記載される。
I.ウイルスベクター産生系
いくつかの側面では、本開示はウイルスベクター産生系に関する。本明細書において記載されるウイルスベクター産生系は、(a)ウイルスベクター産生成分;(b)調節RNAをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;および(c)移入ポリ核酸を集合的に含む1つ以上のポリ核酸を含む。
本明細書において使用される場合、「ウイルスベクター産生成分」という用語は、組換え宿主細胞におけるウイルスベクターの生成に必要な遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を指す。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを包含するいくつかの種類のウイルスベクター(それらの産生に必要な成分を包含する)が以前に記載されている。本明細書において記載のウイルスベクター産生系は、これらの前述のウイルスベクターのいずれかの産生に必要な遺伝子産物をコードするウイルスベクター産生成分を含む場合がある。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、組換え宿主細胞でAAVベクターを生成するのに必要な遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。例示的なAAV遺伝子産物は、Rep52、Rep40、Rep78、Rep68、E2A、E4Orf6、VARNA、VP1、VP2、VP3、AAPおよびMAAPまたはその機能的バリアントを包含する。Rep遺伝子産物(Rep52、Rep40、Rep78およびRep68を含む)は、AAVゲノム複製を伴う。E2A遺伝子産物は、AAV複製中のDNA合成処理能力(processivity)の支援を伴う。E4Orf6遺伝子産物はAAV複製を支持する。VARNA遺伝子産物は、翻訳の調節において役割を果たす。CAP遺伝子産物(VP1、VP2、VP3を含む)は、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする。AAP遺伝子産物は、キャプシドアセンブリにおいて役割を果たす。MAAPは、フレームシフトされたVP1タンパク質であり、その全体が参照により組み込まれるOgden et al.Science 366.6469(2019):1139-1143に記載されているように、ウイルスキャプシドにおいて役割を果たすようである。
本明細書において使用される場合、「機能的バリアント」という用語は、野生型配列と比較して改変された核酸またはアミノ酸配列を含み、野生型遺伝子産物の機能(例として、酵素的、調節、または結合)を果たすことができる遺伝子産物を指す。例えば、Rep52の機能的バリアントは、依然としてAAVゲノム複製において機能することができる。
いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、遺伝子産物:Rep52(またはその機能的バリアント)またはRep40(またはその機能的バリアント);Rep78(またはその機能的バリアント)またはRep68(またはその機能的バリアント);E2A(またはその機能的バリアント);E4Orf6(またはその機能的バリアント);VARNA(またはその機能的バリアント);VP1(またはその機能的バリアント);VP2(またはその機能的バリアント);VP3(またはその機能的バリアント);およびAAP(またはその機能的バリアント)を集合的にコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、遺伝子産物:Rep52(またはその機能的バリアント)、Rep40(またはその機能的バリアント)、Rep78(またはその機能的バリアント)、Rep68(またはその機能的バリアント)、E2A(またはその機能的バリアント)、E4Orf6(またはその機能的バリアント(例として、配列番号23)、VARNA(またはその機能的バリアント)、VP1(またはその機能的バリアント)、VP2(またはその機能的バリアント)、VP3(またはその機能的バリアント)およびAAP(またはその機能的バリアント)を集合的にコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
スプライス部位が除去されたE4Orf6の例示的な機能的バリアント:
atgactacgtccggcgttccatttggcatgacactacgaccaacacgatctcggttgtctcggcgcactccgtacagtagggatcgcctacctccttttgagacagagacccgcgctaccatactggaggatcatccgctgctgcccgaatgtaacactttgacaatgcacaaTgtTTCCtacgtgcgaggtcttccctgcagtgtgggatttacgctgattcaggaatgggttgttccctgggatatggttctgacgcgggaggagcttgtaatcctgaggaagtgtatgcacgtgtgcctgtgttgtgccaacattgatatcatgacgagcatgatgatccatggttacgagtcctgggctctccactgtcattgttccagtcccggttccctgcagtgcatagccggcgggcaggttttggccagctggtttaggatggtggtggatggcgccatgtttaatcagaggtttatatggtaccgggaggtggtgaattacaacatgccaaaagaggtaatgtttatgtccagcgtgtttatgaggggtcgccacttaatctacctgcgcttgtggtatgatggccacgtgggttctgtggtccccgccatgagctttggatacagcgccttgcactgtgggattttgaacaatattgtggtgctgtgctgcagttactgtgctgatttaagtgagatcagggtgcgctgctgtgcccggaggacaaggcgtctcatgctgcgggcggtgcgaatcatcgctgaggagaccactgccatgttgtattcctgcaggacggagcggcggcggcagcagtttattcgcgcgctgctgcagcaccaccgccctatcctgatgcacgattatgactctacccccatgTAGtaa(配列番号23)
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、組換え宿主細胞でレンチウイルスベクターを生成するのに必要な遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。例示的なレンチウイルス遺伝子産物は、VSV-G、Gag-PolおよびRevを包含する。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、遺伝子産物:VSV-G(またはその機能的バリアント)、Gag-Pol(またはその機能的バリアント)およびRev(またはその機能的バリアント)を集合的にコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は(すなわち、ウイルスベクター成分の遺伝子産物は)、単一のポリ核酸上にコードされる。他の態様では、複数のポリ核酸がウイルスベクター成分を集合的に含む(すなわち、ウイルスベクター成分の遺伝子産物の少なくとも2つは、異なるポリ核酸上にコードされている)。例えば、ウイルスベクター成分は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5個のポリ核酸を含む場合がある。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、2、3、4、または5個のポリ核酸を含む。
ウイルスベクター成分に加えて、本明細書において記載のウイルスベクター産生系は、調節RNAをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータの核酸配列を含む第1の発現カセットを含む。
以下に詳述するように(パートIAおよびIB)、例示的な調節RNAは、shRNAおよびCas13ガイドRNAを包含する。
第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む場合がある。例えば、いくつかの態様では、タンデム反復は、調節RNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10コピーを含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、調節RNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、調節RNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを含む。
第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列の2つ以上のタンデム反復を含む場合がある。例えば、いくつかの態様では、第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5個のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、3～4、3～5または4～5のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、調節RNAをコードする核酸配列の2、3、4または5のタンデム反復を含む。
第1の発現カセットは、調節RNA(例として、shRNAクラスターまたは人工miRNAクラスター)をコードする核酸配列のクラスターを含む場合がある。本明細書において使用される場合、クラスターという用語は、物理的に隣接し(すなわち、約10キロベース以内)、同じ向きに転写され、転写単位により分離されない、2つ以上のmiRNAのセット、または参照により全体が組み込まれる、Lai,X.,and J.Vera.”MicroRNA clusters.”Encyclopedia of Systems Biology.New York:Springer(2013)に記載されるように、反対の配向の1つのmiRNAをコードするポリ核酸を指す。例示的なmiRNAクラスターは、miR-30e、miR-30c-1、miR-214、miR-199a-2、miR-215、miR-194-1、miR-217、miR-216、miR-15b、miR-16-2、miR-143、miR-145、miR-25、miR-93、miR-106b、miR-23b、miR-27b、miR-24-1、miR-181a、miR-181b-2、miR-34b;miR-34c、miR-125b-1、let-7a-2、miR-100、miR-16-1、miR-15a、miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-92-1、miR-299、miR-323、miR-329、miR-134、miR-154、miR-133a-1、miR-1-2、miR-99b、let-7e、miR-125a、miR-133a-2、miR-1-1、miR-99a、let-7c、miR-125b-2、miR-98、let-7f-2、miR-105-1、およびmiR-105-2を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様では、クラスターは、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10個を超えるmiRNAをコードする。shRNAクラスターまたは人工miRNAクラスターは、本明細書中に記載されるように、miRNAのヘアピンが、本明細書において記載されるようなshRNAまたは人工miRNAのヘアピンで置き換えられているクラスターを示す(例としてペイロード遺伝子を標的とするshRNAヘアピン)。amiRNAクラスターを産生する方法は当技術分野で周知であり、Bhaskaran,Vivek,et al.Nature protocols 14.12(2019):3538-3553に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。いくつかの態様では、shRNAまたはamiRNAクラスターは、天然に存在しないshRNAまたはamiRNAヘアピンを含む。いくつかの態様では、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターの5'側および3'側の最も隣接している領域は、異なるmiRNAクラスターの隣接領域で置き換えられて、キメラshRNAクラスターまたはキメラamiRNAクラスターを産生する。
第1の発現カセットは、異なる調節RNA(すなわち、異なる核酸配列を有する調節RNA)の核酸配列を含む場合がある。例えば、いくつかの態様では、第1の発現カセットは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10個の異なる調節RNAの核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10個の異なる調節RNAの核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なる調節RNAの核酸配列を含む。
本明細書において記載されるように、核酸コード配列に対するプロモータの位置が、プロモータへの転写活性化因子の結合がコード配列の発現を誘導し得るようなものである場合、プロモータは核酸コード配列に「作動可能に連結されている」。
プロモータは、構成的プロモータ(すなわち、連続的な転写を可能にする調節されていないプロモータ)である場合がある。構成的プロモータの例は当技術分野で公知であり、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、伸長因子1α(EF1α)プロモータ、サル空胞化ウイルス40(SV40)プロモータ、ユビキチン-C(UBC)プロモータ、U6プロモータ、およびホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモータを包含するが、これらに限定されない。例として、Ferreira et al.,Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013 Jul;110(28):11284-89;米国特許出願公開第2014/377861号;Qin,Jane Yuxia,et al.”PloS one 5.5(2010):e10611を参照されたく、その全体が参照により本明細書において組み込まれる。
あるいは、プロモータは、誘導性プロモータ(すなわち、特定の状況下でのみ転写を活性化する)である場合がある。誘導性プロモータは、例えば、化学誘導性プロモータ、温度誘導性プロモータ、または光誘導性プロモータである場合がある。誘導性プロモータの例は当技術分野で公知であり、テトラサイクリン/ドキシサイクリン誘導性プロモータ、クマート誘導性プロモータ、ABA誘導性プロモータ、CRY2-CIB1誘導性プロモータ、DAPG誘導性プロモータ、およびミフェプリストン誘導性プロモータを包含するが、これらに限定されない。例として、Stanton et al.,ACS Synth.Biol.2014 Dec 19;3(12):880-91;Liang et al.,Sci.Signal.2011 Mar 15;4(164):rs2;特許番号:米国特許第7,745,592号;米国特許第7,935,788号を参照されたく、その全体が参照により本明細書において組み込まれる。
いくつかの態様では、第1の発現カセットのプロモータは、CMVプロモータ、EF1αプロモータ、SV40プロモータ、UBCプロモータ、U6プロモータ、またはPGKプロモータなどの構成的プロモータである。
いくつかの態様では、第1の発現カセットのプロモータは、化学的に誘導可能なプロモータ、温度誘導性プロモータ、または光誘導性プロモータなどの誘導性プロモータである。いくつかの態様では、誘導性プロモータは、テトラサイクリン/ドキシサイクリン誘導性プロモータ、クマート誘導性プロモータ、ABA誘導性プロモータ、CRY2-CIB1誘導性プロモータ、DAPG誘導性プロモータ、またはミフェプリストン誘導性プロモータである。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、上記のウイルスベクター産生成分の遺伝子産物をコードする核酸配列を更に含む。例えば、ウイルスベクター産生成分がAAVウイルスベクター成分である態様では、第1の発現カセットは、Rep52、Rep40、Rep78、Rep68、E2A、E4Orf6、VARNA、VP1、VP2、VP3、AAP、またはそれらの組合せをコードする核酸配列を更に含む場合がある。同様に、ウイルスベクター産生成分がレンチウイルスベクター成分である態様では、第1の発現カセットは、VSV-G、Gag-Pol、Rev、またはそれらの組合せをコードする核酸配列を更に含む場合がある。
いくつかの態様では、第1の発現カセットのプロモータは、調節RNAをコードする核酸配列およびウイルスベクター産生成分の遺伝子産物をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結されている。例えば、いくつかの態様では、遺伝子産物をコードする核酸配列は、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR、イントロン、および/または3'UTRを有する。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカをコードする核酸配列を更に含む。本明細書において使用される場合、「選択可能なマーカ」という用語は、細胞内に導入されるかまたは細胞内で発現されると、選択に適した形質を付与するタンパク質を指す。
選択可能なマーカは、蛍光タンパク質である場合がある。蛍光タンパク質の例は、当技術分野で公知である(例として、TagBFP、EBFP2、EGFP、EYFP、mKO2、またはSirius)。例として、米国特許第5,874,304号;特許番号欧州特許第0969284号;米国特許出願公開第2010/167394号を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
代替において、または加えて、選択可能なマーカは、抗生物質耐性タンパク質である場合がある。抗生物質耐性タンパク質の例は、当技術分野で公知である(例として、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ブラストサイジン、またはフレオマイシン選択の促進)。例として、公開番号:国際公開第1997/15668号;公開番号:国際公開第1997/43900号を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、第1の発現カセットのプロモータは、調節RNAをコードする核酸配列および選択可能なマーカをコードする核酸配列の両方に作動可能に連結されている。例えば、いくつかの態様では、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR、イントロンおよび/または3'UTRを有する。
ウイルスベクター成分および第1の発現カセットに加えて、本明細書において記載のウイルスベクター産生系は、移入ポリ核酸を含む。本明細書において記載の移入ポリ核酸は、ウイルス末端反復の核酸配列によって5'末端および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む。本明細書において使用される場合、「ウイルス末端反復」という用語は、宿主細胞ゲノムへのウイルスベクターペイロードのポリ核酸組込みに必要な核酸配列を指す。例示的なウイルス末端反復は、当業者に公知である。
例えば、ウイルスベクター産生成分がAAVウイルスベクター成分である態様では、移入ポリ核酸は、AAV逆位タンデム反復(「ITR」)の核酸配列によって5'末端および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む場合がある。例示的なAAV ITRは、当業者に公知である。
ウイルスベクター産生成分がレンチウイルスベクター成分である態様では、移入ポリ核酸は、レンチウイルス長タンデム反復(LTR)の核酸配列によって5'末端および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む場合がある。例示的なレンチウイルスLRTは、当業者に公知である。
移入ポリ核酸の中心核酸は、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列を含む場合がある。本明細書において記載されるように、標的核酸配列は、宿主細胞の生理学的条件下で調節RNAによって結合することができる(すなわち、調節RNAとハイブリダイズすることができる)場合、調節RNAを「相補する(complement)」。標的核酸配列は、調節RNAの逆相補体である核酸配列を含む場合、調節RNAに対して100％の相補性を有すると言われる。いくつかの態様では、標的核酸配列は、調節RNAに対して少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の相補性を有する。いくつかの態様では、標的核酸配列は、調節RNAに対して85～100％、90～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、または99～100％の相補性を有する。
代替において、または加えて、移入ポリ核酸の中心核酸は、マルチクローニングサイトの核酸配列を含む場合がある。例示的なマルチクローニングサイトは、当業者に公知である。マルチクローニングサイトは、宿主細胞においてウイルスベクターを生成する前に、ペイロード分子(または目的の遺伝子)-またはペイロード分子をコードする発現カセット-を移入ポリ核酸にクローニングするために使用され得る。いくつかの態様では、マルチクローニングサイトの核酸配列は、全てが中央核酸内に含まれる、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって(5'末端、3'末端、または5'末端および3'末端の両方で)隣接されている。例えば、中心核酸は、マルチクローニングサイトにクローニングされた目的の遺伝子に作動可能に連結され得る標的核酸配列(第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する)を含む5'UTR配列および/または3'UTR配列を含む場合がある。いくつかの態様では、中心核酸は、プロモータ(本明細書において記載されるような構成的または誘導的)の核酸配列を更に含む。例えば、いくつかの態様では、移入ポリ核酸は、5'から3'に:(i)ウイルス末端反復の核酸配列;(ii)プロモータの核酸配列;(iii)第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって(3'末端、5'末端、または5'末端および3'末端の両方で)隣接されているマルチクローニングサイトの核酸配列;および(iv)ウイルス末端反復の核酸配列を含む。
代替において、または加えて、移入ポリ核酸の中心核酸は、プロモータ(本明細書において記載されるような構成的または誘導的)と、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列とを含む発現カセットを含む場合があり、これらの両方がペイロード分子をコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの態様では、ペイロード分子をコードする核酸配列は、標的核酸配列を含む5'UTR;標的核酸配列を含むコード配列;標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
中心核酸は、標的核酸配列(すなわち、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する核酸配列)のタンデム反復を含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10コピーを含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピーの標的核酸配列を含む。
中心核酸は、標的核酸配列(すなわち、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する核酸配列)の2つ以上のタンデム反復を含む場合がある。いくつかの態様では、中心核酸は、調節RNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、中心核酸は、調節RNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、3～4、3～5または4～5のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、中心核酸は、調節RNAをコードする核酸配列の2、3、4、または5のタンデム反復を含む。
第1の発現カセットが別個の調節RNA(すなわち、異なる核酸配列を有する調節RNA)を含む態様では、中心核酸は別個の標的核酸配列を含む場合がある。例えば、いくつかの態様では、中心核酸は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10個の異なる標的核酸配列の核酸配列を含む。いくつかの態様では、中心核酸は、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9、または6～10個の異なる標的核酸配列の核酸配列を含む。いくつかの態様では、中心核酸は、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なる標的核酸配列の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書において記載のウイルスベクター産生系は、操作された細胞を含む。操作された細胞は、本明細書において記載のウイルスベクター産生系のいずれかの部分(および部分のいずれかの組合せ)を含む場合がある。
例えば、操作された細胞は、ウイルスベクター産生成分の少なくとも一部を含む場合がある。例えば、上記のように、ウイルスベクター産生成分は複数のポリ核酸を含む場合がある。そのような態様では、操作された細胞は、それぞれが染色体外に位置するかまたは操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる場合がある該複数のポリ核酸の1つ以上を含む。いくつかの態様では、操作された細胞はウイルスベクター産生成分全体を含む。
あるいは、または加えて、操作された細胞は、ウイルス産生系の第1の発現カセットを含む場合がある。
あるいは、または加えて、操作された細胞は、ウイルス産生系の移入ポリ核酸を含む場合がある。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上の異種ポリ核酸を含むウイルスベクター産生成分を含む操作された細胞;(b)第1の発現カセットをコードする異種核酸配列であって、第1の発現カセットが、調節RNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む、異種核酸配列;および(c)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸を含む。
A.shRNA調節RNAを有する産生系。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系の調節RNAはshRNAである。低分子ヘアピンRNA(「shRNA」)は、マイクロRNAを模倣する配列であり、マイクロRNA配列に対して十分な相補性を有するRNA転写物を下方制御する。shRNAは、Pol IIまたはPol IIIプロモータによって転写され、プロセシングされ、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系の調節RNAはamiRNA(人工マイクロRNA)である。人工miRNAは、標的遺伝子(例としてペイロード遺伝子)の下方制御を指示する配列を含むように改変された天然に存在するpri-miRNA配列である。shRNAおよびamiRNAは、ペイロード分子(GOI)コード配列および/またはUTR(5'UTRまたは3'UTR)に相補的であるように設計され得る。特定の標的配列は、例えばペイロード分子のUTR配列に組み込まれ得る。
調節RNAとしてshRNAを有する産生系は、上記の態様(パートI)のいずれかを有する場合がある。調節RNAとしてamiRNAを有する産生系は、上記の態様(パートI)のいずれかを有する場合がある。
いくつかの態様では、shRNAをコードする核酸配列は、配列番号2～11のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、shRNAまたはamiRNAは、配列番号13～22のいずれか1つの配列を標的とする。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカ(本明細書において記載される)をコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'から3'に:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む。
いくつかの態様では、shRNAは、PolIIIプロモータ(例として、U6プロモータ)に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、amiRNAは、PolIIIプロモータ(例として、U6プロモータ)に作動可能に連結されている。
いくつかの態様では、イントロンは、shRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9、または6～10コピーを含む。
いくつかの態様では、イントロンは、shRNAをコードする核酸配列のshRNAクラスターを含む。いくつかの態様では、shRNAクラスターは、shRNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを含む。いくつかの態様では、shRNAクラスターは、shRNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5コピーを含む。いくつかの態様では、shRNAクラスターは、shRNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9、または6～10コピーを含む。
いくつかの態様では、イントロンは、amiRNAをコードする核酸配列のamiRNAクラスターを含む。いくつかの態様では、amiRNAクラスターは、amiRNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを含む。いくつかの態様では、amiRNAクラスターは、amiRNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5コピーを含む。いくつかの態様では、amiRNAクラスターは、amiRNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。
いくつかの態様では、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンは、5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが、3'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む。いくつかの態様では、選択可能なマーカのイントロンは、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は図1に示す通りである。
いくつかの態様では、イントロンは、AGgtaagtNNNNTACTTTAGGACCCTTTTTTTTCCacagGT(配列番号12)の核酸配列を含み、「NNNN」はshRNAの標的化配列を含む。いくつかの態様では、「NNNN」は、配列番号2～11のいずれか1つを含む。
B.Cas13ガイドRNA調節RNAを有する生産系。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系の調節RNAはCas13ガイドRNAである。Cas13は、遺伝子のコードDNA配列を変化させることなく標的mRNAノックダウンを可能にするヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なRNAガイドRNA標的化Casタンパク質である。Cas13は、標的配列を相補するガイドRNAによって標的RNAに誘導される。標的認識は、RNA-RNAハイブリダイゼーションおよび標的RNAの切断をもたらす。ガイドRNAは、ペイロード分子(GOI)コード配列および/またはUTR(5'UTRまたは3'UTR)に相補的であるように設計され得る。特定の標的配列は、例えばペイロード分子のUTR配列に組み込まれ得る。Cas13が使用されて、コードDNA配列を改変することなく、RNA切断によってペイロード分子(「GOI」)タンパク質レベルをノックダウンし得る。Cas13は、転写領域内のいずれかの配列の標的化を可能にするプロトスペーサ隣接配列要件を示さない。
調節RNAとしてCas13ガイドRNAを有する産生系は、上記の態様(パートI)のいずれかを有する場合がある。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つまたはそれを超える異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む。いくつかの態様では、2つまたはそれを超える異なるgRNAは、ネイティブガイドRNAアレイ、リボザイム自己切断ガイドRNAアレイ、Cys4ガイドRNAアレイ、または全体が参照により組み込まれるMcCarty,Nicholas S.,et al.”Nature communications 11.1(2020):1-13に記載されているようなtRNAガイドRNAアレイからなる群から選択されるガイドRNAアレイに含まれる。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、Cas13をコードする異種ポリ核酸を更に含む。例示的なCas13タンパク質は当業者に公知であり、Cas13a、Cas13b、Cas13cおよびCas13dを包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13aをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13bをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13cをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、Cas13dをコードする異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、Cas13は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％のアミノ酸同一性を有する機能的バリアントのアミノ酸配列を含む。本明細書において使用される場合、Cas13タンパク質の文脈における「機能的バリアント」という用語は、野生型Cas13タンパク質と比較して少なくとも50％のエンドヌクレアーゼ活性を有するバリアントを指す。
2つの配列(例として、2つのアミノ酸配列または2つのポリ核酸)間の同一性の程度を決定する方法は、当業者に公知である。1つの例示的な方法は、デフォルトパラメータを有するBasic Local Alignment Search Tool(BLAST(登録商標))ソフトウェア(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)の使用である。
いくつかの態様では、Cas13をコードする異種ポリ核酸は、第1の発現カセットを更に含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、操作された細胞はCas13をコードする異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は図4に示す通りである。
II.ウイルスベクター産生のための操作された細胞
いくつかの側面では、本開示は、ウイルスベクター産生のための操作された細胞に関する。これらの操作された細胞は、上記のウイルスベクター産生系の部分のいずれかの組合せを含む場合がある。ウイルスベクター産生のための例示的な操作された細胞が以下に提供される。
A.shRNA調節RNAを含む操作された細胞。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生のための操作された細胞は、(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;(b)shRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;および(c)ウイルス末端反復の核酸配列が5'および3'末端で隣接する中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるshRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるshRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるshRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるshRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10コピーを含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピーの標的核酸配列を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、shRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、または10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、shRNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9、または6～10コピーを含む。
いくつかの態様では、shRNAをコードする核酸配列は、配列番号2～11のいずれかの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つ以上の異なるshRNAの核酸配列を含む。例えば、いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なるshRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5個の異なるshRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10個の異なるshRNAをコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、選択可能なマーカをコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'から3'で:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む。
いくつかの態様では、イントロンは、shRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。
いくつかの態様では、選択可能なマーカをコードする核酸配列は、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンは、5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが、5'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む。いくつかの態様では、選択可能なマーカのイントロンは、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する。
いくつかの態様では、イントロンは、配列番号12の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、AAV逆位タンデム反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、レンチウイルス長末端反復である。
いくつかの態様では、操作された細胞は、図1に示すウイルスベクター産生系を含む。
いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれは、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
いくつかの態様では、操作された細胞は、HEK293細胞またはHeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する。
B.Cas13ガイドRNA調節RNAを含む操作された細胞。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生のための操作された細胞は、(a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;(b)Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;(c)Cas13をコードする核酸配列;および(d)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2つまたはそれを超えるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む。例えば、いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13aをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13bをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系はCas13cをコードする異種ポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター産生系は、Cas13dをコードする異種ポリ核酸を含む。
いくつかの態様では、Cas13は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％のアミノ酸同一性を有する機能的バリアントのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットはCas13をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様では、ペイロード分子の核酸配列は、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10コピーを含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、標的核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピーの標的核酸配列を含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10コピーを含む場合がある。いくつかの態様では、タンデム反復は、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列の2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10コピーを含む。いくつかの態様では、タンデム反復は、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10コピーを含む。
いくつかの態様では、第1の発現カセットは2つまたはそれを超える異なるCas13ガイドRNAの核酸配列を含む。例えば、いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、第1の発現カセットは、2～3、2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、3～4、3～5、3～6、3～7、3～8、3～9、3～10、4～5、4～6、4～7、4～8、4～9、4～10、5～6、5～7、5～8、5～9、5～10、6～7、6～8、6～9または6～10個の異なるCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、AAV逆位タンデム反復である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター産生成分は、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター成分は、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む。いくつかの態様では、移入ポリ核酸のウイルス末端反復は、レンチウイルス長末端反復である。
いくつかの態様では、操作された細胞は、図4に示すウイルスベクター産生系を含む。
いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの態様では、1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれは、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
いくつかの態様では、操作された細胞は、HEK293細胞またはHeLa細胞に由来する。
III.ウイルスベクター産生中のペイロードの発現を低下させる方法
いくつかの側面では、本開示は、パートIIに記載の操作された細胞を利用するウイルスベクター産生中にペイロードの発現を減少させる方法に関し、ペイロードは(第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する)標的核酸配列を含む。
操作された細胞が調節RNAとしてshRNAを含むいくつかの態様では、ペイロードの発現を減少させる方法は、ウイルスベクター産生中にshRNAを発現させることを含む。
操作された細胞がCas13をコードする核酸配列およびCas13ガイドRNAをコードする核酸配列を含むいくつかの態様では、ペイロードの発現を減少させる方法は、ウイルスベクター産生中にCas13およびCas13ガイドRNAを発現させることを含む。
例
例1.AAVペイロード分子のshRNA媒介ノックダウン。
AAV pHelper、AAV pRepCap、および移入プラスミドが、EGFPに対するshRNA発現プラスミドとともに、または、これなしで、HEK293FT細胞に同時トランスフェクトされた。試験前に、3つの異なるshRNAプラスミドが一緒にプールされた(図1)。トランスフェクションの72時間後、ドライアイスイソプロパノール浴中で3回の凍結融解サイクルによってAAVが回収された。ウイルスストックが、1倍、10倍および100倍に連続希釈され、得られたウイルスストックの10uLは、96ウェルプレートに播種した5e4 HEK293FT細胞に添加することによって形質導入された。形質導入の48時間後、形質導入された細胞は回収され、EGFP陽性細胞のパーセンテージはフローサイトメトリによって決定され、これが使用されて形質導入単位/mL(TU/mL)が計算された。(図2A～図2B)。EGFP shRNAの添加は、EGFP蛍光の有意な減少をもたらし、AAV力価のわずか約1.1倍の減少をもたらした。EGFPは最小の毒性を有し、AAV力価の最小の低下は、shRNAがAAVの産生およびパッケージングに最小限の影響しか及ぼさなかったことを示すので、AAV力価は増加しなかった。異なる免疫グロブリン(IG)-EYFP移入配列(図3)と共に、移入プラスミド上のFF5標的部位と共にFF5 shRNAを使用した場合、同様の結果が得られた。
例2.AAVペイロード分子のCas13媒介ノックダウン。
Cas13dが使用されて、GOIコードDNA配列を改変することなく、RNA切断によってAAVペイロードGOIタンパク質レベルをノックダウンし得る(図4)。Cas13dは、転写領域内のいずれかの配列の標的化を可能にするプロトスペーサ隣接配列要件を示さない。
Cas13(配列番号1)の例示的なアミノ酸配列:
MSPKKKRKVEASIEKKKSFAKGMGVKSTLVSGSKVYMTTFAEGSDARLEKIVEGDSIRSVNEGEAFSAEMADKNAGYKIGNAKFSHPKGYAVVANNPLYTGPVQQDMLGLKETLEKRYFGESADGNDNICIQVIHNILDIEKILAEYITNAAYAVNNISGLDKDIIGFGKFSTVYTYDEFKDPEHHRAAFNNNDKLINAIKAQYDEFDNFLDNPRLGYFGQAFFSKEGRNYIINYGNECYDILALLSGLRHWVVHNNEEESRISRTWLYNLDKNLDNEYISTLNYLYDRITNELTNSFSKNSAANVNYIAETLGINPAEFAEQYFRFSIMKEQKNLGFNITKLREVMLDRKDMSEIRKNHKVFDSIRTKVYTMMDFVIYRYYIEEDAKVAAANKSLPDNEKSLSEKDIFVINLRGSFNDDQKDALYYDEANRIWRKLENIMHNIKEFRGNKTREYKKKDAPRLPRILPAGRDVSAFSKLMYALTMFLDGKEINDLLTTLINKFDNIQSFLKVMPLIGVNAKFVEEYAFFKDSAKIADELRLIKSFARMGEPIADARRAMYIDAIRILGTNLSYDELKALADTFSLDENGNKLKKGKHGMRNFIINNVISNKRFHYLIRYGDPAHLHEIAKNEAVVKFVLGRIADIQKKQGQNGKNQIDRYYETCIGKDKGKSVSEKVDALTKIITGMNYDQFDKKRSVIEDTGRENAEREKFKKIISLYLTVIYHILKNIVNINARYVIGFHCVERDAQLYKEKGYDINLKKLEEKGFSSVTKLCAGIDETAPDKRKDVEKEMAERAKESIDSLESANPKLYANYIKYSDEKKAEEFTRQINREKAKTALNAYLRNTKWNVIIREDLLRIDNKTCTLFRNKAVHLEVARYVHAYINDIAEVNSYFQLYHYIMQRIIMNERYEKSSGKVSEYFDAVNDEKKYNDRLLKLLCVPFGYCIPRFKNLSIEALFDRNEAAKFDKEKKKVSGNSGSGPKKKRKVAAAYPYDVPDYA
他の態様
本明細書に開示された全ての特徴は、いずれかの組合せで組み合わせられる場合がある。本明細書に開示された各特徴は、同一、等価、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられる場合がある。したがって、特に他のことが明記されない限り、開示された各特徴は、等価または類似の特徴の一般的な一連の例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確かめ得、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示を様々な用途および条件に適合させるために本開示の様々な変更および修正を行い得る。したがって、他の態様も特許請求の範囲内である。
等価物
いくつかの本発明の態様を本明細書において記載および例示してきたが、当業者は、本明細書において記載される機能を実行し、ならびに/あるいは結果および/または1つ以上の利点を得るための様々な他の手段および/または構造を容易に想像するものと思われ、そのような変形および/または修正の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される1つまたは複数の特定の用途に依存するものであることを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される特定の発明の態様に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確かめることができるものと思われる。したがって、前述の態様は、単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載および特許請求されたものとは別の方法で実施される場合があることを理解されたい。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される個々の特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法に関する。更に、2つ以上のそのような特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法のいずれかの組合せは、そのような特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に包含される。
本明細書において定義および使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および/または定義された用語の通常の意味を制御すると理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体を網羅する場合がある。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される「および/または」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「1つ以上」と解釈されるべきである。「および/または」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素に関連するか否かにかかわらず、他の要素が任意選択的に存在する場合がある。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「含む(comprising)」等のオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一態様では、Aのみ(B以外の要素を任意選択的に包含する)、別の態様では、Bのみ(A以外の要素を任意選択的に包含する)、更に別の態様では、AおよびBの両方(他の要素を任意選択的に包含する)等を指し得る。
本明細書においておよび特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上で定義された「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および/または」は、包括的であると判断されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも1つを包含するが、2つ以上も包含し、任意選択的に、追加の列挙されていない項目も包含する。「～のうちの1つのみ(only one of)」または「～のうちの正確に1つ(exactly one of)」、または特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる(consisting of)」等の反対のことが明確に示された用語のみが、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に1つの要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される「または」という用語は、特許請求の範囲で使用される場合、「いずれか」、「～のうちの1つ」、「～のうちの1つのみ」、または「～のうちの正確に1つ」、「～から本質的になる」等の排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢(すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」)を示すものとしてのみ判断されるものとし、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される場合、1つ以上の要素のリストに関連して「少なくとも1つ」という語句は、要素のリスト内の要素のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素の少なくとも1つを必ずしも包含せず、要素のリスト内の要素のいずれかの組合せを除外しないことを理解されたい。この定義はまた、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、「少なくとも1つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意選択的に存在する場合があることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または、同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に、「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、一態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してAを指し、Bが存在しない(およびB以外の要素を任意選択的に包含する);別の態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してBを指し、Aが存在しない(およびA以外の要素を任意選択的に包含する);更に別の態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してA、および少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してB(他の要素を任意選択的に包含する)等を指し得る。
また、そうでないことが明確に示されていない限り、2つ以上の工程または行為を包含する本明細書において特許請求されるいずれかの方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」等の全ての移行句は、オープンエンドであり、すなわち、包含するが限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧セクション2111.03に記載されているように、「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句のみが、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。非限定的な移行句(例として、「含む(comprising)」)を使用して本明細書に記載された態様は、代替的な態様では、非限定的な移行句によって記載された特徴「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」としても企図されることを理解されるべきである。例えば、本開示が「AおよびBを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替態様「AおよびBからなる組成物」および「AおよびBから本質的になる組成物」を企図する。

Claims (82)

  1. ウイルスベクター産生系であって、
    (a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上の異種ポリ核酸を含むウイルスベクター産生成分を含む操作された細胞;
    (b)第1の発現カセットをコードする異種核酸配列であって、第1の発現カセットが、調節RNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む、異種核酸配列;および
    (c)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸
    を含む、ウイルスベクター産生系。
  2. 移入ポリ核酸の中央核酸配列が、マルチクローニングサイトをコードする核酸配列を含む、請求項1に記載のウイルスベクター産生系。
  3. 中央核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって隣接されているマルチクローニング配列を含む、請求項2に記載のウイルスベクター産生系。
  4. マルチクローニング配列が、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復によって隣接されている、請求項3に記載のウイルスベクター産生系。
  5. マルチクローニング配列が、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列によって5'末端および3'末端で隣接されている、請求項3または請求項4に記載のウイルスベクター産生系。
  6. 中央核酸配列がプロモータを更に含む、請求項2～5のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  7. 移入ポリ核酸配列の中央核酸配列が、第2の発現カセットを含み、第2の発現カセットが、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、請求項1～6のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  8. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む、請求項7に記載のウイルスベクター産生系。
  9. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされる調節RNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む、請求項7または請求項8に記載のウイルスベクター産生系。
  10. 第1の発現カセットが、調節RNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む、請求項1～9のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  11. 第1の発現カセットが、2つ以上の異なる調節RNAの核酸配列を含む、請求項1～10のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  12. 第1の発現カセットが、ウイルスベクター産生成分の遺伝子産物をコードする核酸配列を更に含む、請求項1～11のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  13. 第1の発現カセット中の遺伝子産物をコードする核酸配列が、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR;調節RNAをコードする核酸配列を含むイントロン;調節RNAをコードする核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを有する、請求項12に記載のウイルスベクター産生系。
  14. 第1の発現カセットが、選択可能なマーカをコードする核酸配列を更に含む、請求項1～13のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  15. 選択可能なマーカが、蛍光タンパク質または抗生物質耐性タンパク質を含む、請求項14に記載のウイルスベクター産生系。
  16. 第1の発現カセット中の選択可能なマーカをコードする核酸配列が、調節RNAをコードする核酸配列を含む5'UTR;調節RNAをコードする核酸配列を含むイントロン;調節RNAをコードする核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを有する、請求項14または請求項15に記載のウイルスベクター産生系。
  17. ウイルスベクター産生系がAAVウイルスベクター産生系であり、ウイルスベクター産生成分が、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項1～16のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  18. ウイルスベクター成分が、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む、請求項17に記載のウイルスベクター産生系。
  19. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がAAV逆位タンデム反復である、請求項17または請求項18に記載のウイルスベクター産生系。
  20. ウイルスベクター産生系がレンチウイルスベクター産生系であり、ウイルスベクター産生成分が、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項1～16のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  21. ウイルスベクター成分が、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む、請求項20に記載のウイルスベクター産生系。
  22. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がレンチウイルス長末端反復である、請求項20または請求項21に記載のウイルスベクター産生系。
  23. ウイルスベクター産生成分の1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項1～22のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  24. ウイルスベクター産生成分の1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項1～23のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  25. 操作された細胞が、第1の発現カセットをコードする異種核酸配列を更に含む、請求項1～24のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  26. 操作された細胞が、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する、請求項1～25のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  27. 調節RNAが、shRNAまたはamiRNAである、請求項1～26のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  28. shRNAをコードする核酸配列が、配列番号2～11のいずれか1つの核酸配列を含む、請求項27に記載のウイルスベクター産生系。
  29. 第1の発現カセットが、選択可能なマーカをコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列が、5'から3'で:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む、請求項27または請求項28に記載のウイルスベクター産生系。
  30. イントロンが、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む、請求項29に記載のウイルスベクター産生系。
  31. 選択可能なマーカをコードする核酸配列が、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが3'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む、請求項29または請求項30に記載のウイルスベクター産生系。
  32. 選択可能なマーカのイントロンが、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する、請求項29～31のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  33. イントロンが配列番号12の核酸配列を含む、請求項28～31のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  34. 調節RNAがCas13ガイドRNAである、請求項1～26のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  35. 第1の発現カセットが、2つ以上のCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む、請求項34に記載のウイルスベクター産生系。
  36. Cas13をコードする異種ポリ核酸を更に含む、請求項34または請求項35に記載のウイルスベクター産生系。
  37. Cas13がCas13dである、請求項36に記載のウイルスベクター産生系。
  38. Cas13dが、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項37に記載のウイルスベクター産生系。
  39. Cas13をコードする異種ポリ核酸が第1の発現カセットを更に含む、請求項36～38のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  40. 第1の発現カセットが、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む、請求項39に記載のウイルスベクター産生系。
  41. 操作された細胞が、Cas13をコードする異種ポリ核酸を更に含む、請求項36～40のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。
  42. (a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;
    (b)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;および
    (c)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸
    を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含む、ウイルスベクター産生のための操作された細胞。
  43. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む、請求項42に記載の操作された細胞。
  44. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされるshRNAまたはamiRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む、請求項42または請求項43に記載の操作された細胞。
  45. 第1の発現カセットが、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む、請求項42～44のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  46. 第1の発現カセットが、2つ以上の異なるshRNAまたは2つ以上の異なるamiRNAの核酸配列を含む、請求項42～45のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  47. 第1の発現カセットが、選択可能なマーカをコードする核酸配列を含み、選択可能なマーカをコードする核酸配列が、5'から3'で:(i)イントロンドナー部位;(ii)shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列;および(iii)イントロンアクセプタ部位を有するイントロンを含む、請求項42～45のいずれか一項に記載の操作されたウイルスベクター産生系。
  48. イントロンが、shRNAまたはamiRNAをコードする核酸配列のタンデム反復、shRNAクラスターまたはamiRNAクラスターを含む、請求項47に記載の操作された細胞。
  49. 選択可能なマーカをコードする核酸配列が、5'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが5'UTRに位置する、5'UTR;3'UTRであって、選択可能なマーカのイントロンが3'UTRに位置する、3'UTR;またはそれらの組合せを含む、請求項47または請求項48に記載の操作された細胞。
  50. 選択可能なマーカのイントロンが、選択可能なマーカをコードする核酸配列のコード領域に位置する、請求項47～49のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  51. イントロンが配列番号12の核酸配列を含む、請求項47～50のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  52. shRNAをコードする核酸配列が、配列番号2～11のいずれかの核酸配列を含む、請求項42～50のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  53. ウイルスベクター産生成分が、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項42～52のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  54. ウイルスベクター成分が、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む、請求項53に記載の操作された細胞。
  55. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がAAV逆位タンデム反復である、請求項53または請求項54に記載の操作された細胞。
  56. ウイルスベクター産生成分が、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項42～52のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  57. ウイルスベクター成分が、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む、請求項56に記載の操作された細胞。
  58. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がレンチウイルス長末端反復である、請求項56または請求項57に記載の操作された細胞。
  59. 1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項42～58のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  60. 1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項42～59のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  61. 操作された細胞が、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する、請求項42～60のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  62. ウイルスベクター産生中にshRNAまたはamiRNAを発現させることを含む、請求項42～60のいずれか一項に記載の操作された細胞におけるウイルスベクター産生中のペイロード分子の発現を減少させる方法。
  63. (a)ウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードするウイルスベクター産生成分;
    (b)Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む第1の発現カセット;
    (c)Cas13をコードする核酸配列;および
    (d)ウイルス末端反復の核酸配列によって5'および3'末端で隣接されている中央核酸配列を含む移入ポリ核酸であって、中央核酸配列が、プロモータおよび第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列の両方に作動可能に連結されたペイロード分子をコードする核酸配列を含む、移入ポリ核酸
    を集合的に含む1つ以上の異種ポリ核酸を含む、ウイルスベクター産生のための操作された細胞。
  64. 第1の発現カセットが、2つ以上のCas13ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された構成的プロモータを含む、請求項63に記載の操作された細胞。
  65. Cas13がCas13dである、請求項63または請求項64に記載の操作された細胞。
  66. Cas13dが、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の操作された細胞。
  67. 第1の発現カセットが、Cas13をコードする核酸配列を更に含む、請求項63～65のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  68. 第1の発現カセットが、Cas13 gRNAをコードする核酸配列およびCas13をコードする核酸配列の両方に作動可能に連結された構成的プロモータの核酸配列を含む、請求項67に記載の操作された細胞。
  69. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む5'UTR;第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列を含む3'UTR;またはそれらの組合せを含む、請求項63～68のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  70. ペイロード分子の核酸配列が、第1の発現カセットによってコードされるCas13ガイドRNAを相補する標的核酸配列のタンデム反復を含む、請求項63～69のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  71. 第1の発現カセットが、Cas13ガイドRNAをコードする核酸配列のタンデム反復を含む、請求項63～70のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  72. 第1の発現カセットが、2つ以上の異なるCas13ガイドRNAの核酸配列を含む、請求項63～71のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  73. ウイルスベクター産生成分が、AAVベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項63～72のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  74. ウイルスベクター成分が、Rep52またはRep40;Rep78またはRep68;E2A;E4Orf6;VARNA;VP1;VP2;VP3;およびAAPの核酸配列を含む、請求項73に記載の操作された細胞。
  75. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がAAV逆位タンデム反復である、請求項73または請求項74に記載の操作された細胞。
  76. ウイルスベクター産生成分が、レンチウイルスベクターの遺伝子産物を集合的にコードする1つ以上のポリ核酸を含む、請求項63～72のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  77. ウイルスベクター成分が、VSV-G、Gag-PolおよびRevの核酸配列を含む、請求項76に記載の操作された細胞。
  78. 移入ポリ核酸のウイルス末端反復がレンチウイルス長末端反復である、請求項76または請求項77に記載の操作された細胞。
  79. 1つ以上の異種ポリ核酸の少なくとも1つが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項63～78のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  80. 1つ以上の異種ポリ核酸のそれぞれが、操作された細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項63～79のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  81. 操作された細胞が、HEK293細胞、HeLa細胞、BHK細胞またはSf9細胞に由来する、請求項63～80のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  82. ウイルスベクター産生中にCas13およびCas13ガイドRNAを発現させることを含む、請求項63～81のいずれか一項に記載の操作された細胞におけるウイルスベクター産生中のペイロード分子の発現を減少させる方法。
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