JP2024518732A - 生体分子がロードされた細胞外小胞 - Google Patents
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Abstract
治療用細胞外小胞の組成物、ならびに治療用細胞外小胞を産生する方法およびシステムが本明細書に記載される。治療用細胞外小胞を用いて疾患または症状を処置する方法もまた本明細書に記載される。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外マトリックスタンパク質をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって産生される。いくつかの場合、細胞のトランスフェクトすることは、細胞ナノポレーションによって行われる。
Description
相互参照
本出願は、2021年4月23日に出願された米国仮出願第63/179,058号に基づく利益を主張するものであり、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年4月23日に出願された米国仮出願第63/179,058号に基づく利益を主張するものであり、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
細胞外小胞は、多種多様な細胞型によって分泌される。一般に、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞は膜に結合しており、治療用カーゴで負荷され得る。エキソソームは、ほとんどの真核細胞によって分泌される膜結合細胞外小胞の一種である。エキソソーム生合成は、エンドソームの陥入を多胞体内にくびり切って腔内小胞を形成することから始まり得る。多胞体が細胞の原形質膜と融合すると、腔内小胞はエキソソームとして放出され得る。微小小胞は、細胞表面膜から外側に出芽する別の種類の細胞外小胞である。一方、アポトーシス小体は、死細胞残屑から形成される細胞外小胞である。
細胞外小胞は、多種多様な細胞型によって分泌される。一般に、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞は膜に結合しており、治療用カーゴで負荷され得る。エキソソームは、ほとんどの真核細胞によって分泌される膜結合細胞外小胞の一種である。エキソソーム生合成は、エンドソームの陥入を多胞体内にくびり切って腔内小胞を形成することから始まり得る。多胞体が細胞の原形質膜と融合すると、腔内小胞はエキソソームとして放出され得る。微小小胞は、細胞表面膜から外側に出芽する別の種類の細胞外小胞である。一方、アポトーシス小体は、死細胞残屑から形成される細胞外小胞である。
細胞外マトリックス(ECM)は、多くの異なる種類の組織の構造的支持を提供し、体内の特定の細胞プロセスにも影響を及ぼす。皮膚におけるECMの成分には、コラーゲン、弾性繊維、プロテオグリカン、およびグリコサミノグリカンが含まれる。加齢に伴うECMのタンパク質の変化は、いくつかの異なる結果を有し得る。しわおよび弾性の低下は、皮膚老化の典型的な現象であり、真皮における細胞外マトリックス(ECM)(例えば、コラーゲン)の量の漸進的な減少の結果である可能性が高い。老化した皮膚におけるコラーゲンの減少は、コラーゲン産生の減少および/またはコラーゲンの分解の増加に起因し得る。コラーゲンおよび他のECMタンパク質の構造変化も、真皮老化に関与している可能性がある。
血管内皮成長因子(VEGF)は、新しい血管の成長である血管新生を促進するシグナル伝達タンパク質である。VEGFは、血液循環の障害によって細胞および組織の酸素化血液が奪われた場合に、細胞および組織への血液供給を回復させるメカニズムの一部を形成している。
要旨
いくつかの態様では、外因性細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、複数の細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。
いくつかの態様では、外因性細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、複数の細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、450個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、200個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.1~100個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、2000個のEVあたり、1000個のEVあたり、500個のEVあたり、400個のEVあたり、300個のEVあたり、200個のEVあたり、150個のEVあたり、100個のEVあたり、90個のEVあたり、80個のEVあたり、70個のEVあたり、60個のEV、50個のEV、40個のEVあたり、30個のEVあたり、20個のEVあたり、15個のEVあたり、10個のEVあたり、5個のEVあたり、2個のEVあたり、または1個のEVあたり、平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で少なくとも1、2、5、10、50、100、200、300、500、または1000個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で約1~10個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で約1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、30個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外マトリックスタンパク質をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって産生される。いくつかの場合、細胞のトランスフェクトすることは、細胞ナノポレーションによって行われる。いくつかの場合、細胞のトランスフェクトすることは、エレクトロポレーションによって行われる。いくつかの場合、細胞はヒト細胞である。いくつかの場合、細胞は、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、および新生児ヒト真皮線維芽細胞からなる群より選択される線維芽細胞である。いくつかの場合、細胞は接着細胞である。いくつかの場合、細胞はヒト真皮線維芽細胞(例えば、新生児ヒト真皮線維芽細胞)である。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体のうちの少なくともいずれか2つの混合物を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはそれらの任意の組み合わせを介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超える安定化剤および/または1つもしくはそれを超える保存剤を含む。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超えるDNAおよび/またはRNase阻害剤を含む。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超えるDNAse、DNAse阻害剤、RNAseおよび/またはRNAse阻害剤を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×1013個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、1×1014個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×109個の細胞外小胞かつ最大で1×1020個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×101、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106の個の細胞外小胞かつ最大で1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1ngかつ最大で20μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも5ngかつ最大で30μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、真皮細胞を標的とする。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、アミノペプチダーゼN、CD26/DPP4、線維芽細胞活性化タンパク質α、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、以下のmiRNA:hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325、またはhsa-miR-199b-5pのうちの1つまたはそれを超えるものを含まない。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径約50~200nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径約100nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径約75~130nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径が20nm、30nm、50nm、75nm、または100nmを超える。いくつかの場合、細胞外小胞の少なくとも90%は、直径が20nm、30nm、50nm、75nm、または100nmを超える。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径50nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径30nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径20nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径10nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径5nm未満の細胞外小胞を含まない。
いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも少なくとも2倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも少なくとも3倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも約3000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも約2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、同程度の数の天然に存在する細胞外小胞と比較して、以下のマーカー:CD9、CD63、TSG101、またはARF6のうちの少なくとも1つのより高いレベルを発現する。
いくつかの態様では、外因性細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの場合、細胞外小胞はアポトーシス小体である。いくつかの場合、細胞外小胞は微小小胞である。
いくつかの態様では、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を含む容器であって、容器が細胞をさらに含む、容器が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞の比率で容器中に存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞あたり1000、2000、5000、10000、12000、15000、20000、25000、50000、75000、90000、または100000個以下の細胞外小胞の比率で容器中に存在する。
いくつかの態様では、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を含むニードルが本明細書に記載される。いくつかの場合、ニードルはマイクロニードルである。いくつかの場合、ニードルは中実である。いくつかの場合、ニードルはヒドロゲルニードルである。いくつかの場合、ニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、最大で1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を含むシリンジが本明細書に記載される。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、シリンジ内のヒアルロン酸に懸濁される。
いくつかの態様では、複数の細胞外小胞を含むヒドロゲルマイクロニードルが本明細書に記載される。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%、7%、10%、15%、または20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%以下のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、1×1030、1×1030、1×1040、1×1050、1×1060、1×1070、1×1080、1×1090、または1×10100個以下の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×106~1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×1010~1×1014個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×1013~1×1014個の細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、2mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、1mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000μmの長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、100μm以下、200μm以下、300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、1000μm以下、1100μm以下、1200μm以下、1300μm以下、1400μm以下、1500μm以下、1600μm以下、1700μm以下、1800μm以下、1900μm以下または2000μm以下の長さを有する。他の場合では、ヒドロゲルマイクロニードルは、100μm~3000μm、500μm~2500μm、1000μm~2500μm、または1000μm~2000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ヒドロゲルマイクロニードルは、約1000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ヒドロゲルマイクロニードルは、約2000μmの長さを有する。
いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm 700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、または100μm以下の直径を有する基部を有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、または100μmを超える直径を有する基部を有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、1つまたはそれを超えるmRNAカーゴがロードされた細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、複数の細胞外小胞を含むニードルが本明細書に記載され、細胞外小胞は少なくとも1つの細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、複数の細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体のうちのいずれか2つの混合物を含む。
いくつかの場合、ニードルはマイクロニードルである。いくつかの場合、ニードルは中実である。いくつかの場合、ニードルはヒドロゲルニードルであり、必要に応じて、ニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%以下のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、ニードルは、2mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、1mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000μmの長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、100μm以下、200μm以下、300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、1000μm以下、1100μm以下、1200μm以下、1300μm以下、1400μm以下、1500μm以下、1600μm以下、1700μm以下、1800μm以下、1900μm以下、または2000μm以下の長さを有する。他の場合では、ニードルは、100μm~3000μm、500μm~2500μm、1000μm~2500μm、または1000μm~2000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ニードルは、約1000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ニードルは、約2000μmの長さを有する。
いくつかの場合、ニードルは、10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、または100μm以下の直径を有する基部を有する。いくつかの場合、ニードルは、10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、または100μmを超える直径を有する基部を有する。
いくつかの態様では、対象の皮膚症状を処置する方法であって、皮膚症状の処置を必要とする対象に少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを投与し、それによって皮膚症状を処置することを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であるが、I型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)ではない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、皮膚症状は皮膚損傷である。いくつかの場合、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの場合、皮膚症状は創傷である。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、または500μg以下の細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~10μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10ng~10μg、10ng~1μg、50ng~1μg、100ng~1μg、または500ng~1μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約50ngの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAは、少なくとも1つの細胞外小胞(EV)に封入される。いくつかの場合、EVは、以下のmiRNA:hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325、またはhsa-miR-199b-5pのうちの1つまたはそれを超えるものを含まない。
いくつかの場合、少なくとも1つのEVはエキソソームである。いくつかの場合、少なくとも1つのEVは、アポトーシス小体または微小小胞である。いくつかの場合、少なくとも1つのEVは、エキソソーム、微小小胞および/またはアポトーシス小体のうちの少なくとも2つの混合物を含む。
いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす。いくつかの場合、しわの外観の少なくとも10%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから7~14日以内に起こる。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少をもたらす。いくつかの場合、しわの外観の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから7~14日以内に起こる。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以下の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の約70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、しわ面積は、皮膚の処置された部分の顕微鏡写真によって測定され、写真解析ソフトウェアによって定量化される。
いくつかの場合、皮膚症状を処置することは、皮膚損傷を処置することを含み、皮膚損傷を処置することは、皮膚症状を処置した後、少なくとも20日間、30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間、または100日間持続する皮膚損傷の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の減少は、総しわ数の減少、総しわ面積の減少、しわの外観の減少、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたはそれを超えるものである。
いくつかの場合、投与することは、皮下注射によるものである。いくつかの場合、皮下注射は、皮膚損傷または創傷の部位またはその付近で行われる。いくつかの場合、皮下注射は、少なくとも23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10のゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、または20以下のゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10のゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、28のゲージのニードルを用いて行われる。
いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個以下の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に約1×107~1×1017、1×108~1×1016、1×109~1×1015個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に約1×1010~1×1014個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、複数回用量でまたは単回用量として投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回、対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも10、1×102、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、各回最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、各回少なくとも10、1×102、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む。
いくつかの場合、組織は皮下組織である。いくつかの場合、組織は真皮である。Iいくつかの場合、組織は表皮である。いくつかの場合、組織は歯肉である。いくつかの場合、組織は唇である。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも6000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、対象の組織への細胞外マトリックスmRNAの投与後、対象の組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、対象の組織への細胞外マトリックスmRNAの投与後、対象の組織は、200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、または18000pg/ml以下の細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、対象の組織への細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞の投与後、対象の組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、または18000pg/ml以下の細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから約4日以内に、組織は、細胞外マトリックスタンパク質のピーク濃度を有する。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、少なくとも毎日、3日ごと、5日ごと、7日ごと、10日ごと、20日ごと、30日ごと、40日ごと、または50日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約10日ごと、20日ごと、30日ごと、40日ごと、または50日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約30日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約60日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約90日ごとに繰り返される。
いくつかの場合、本方法はさらに、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスmRNAに対応するベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞を産生するための培養培地中で十分な時間にわたってドナー細胞を培養することと、(c)培養培地から細胞外小胞を回収することとによって、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生することを含む。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約8~24時間後に行われる。いくつかの場合、細胞外小胞は、ドナー細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞の比率で存在する。いくつかの場合、細胞外小胞は、ドナー細胞あたり1000、2000、5000、10000、12000、15000、17000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、または50000個以下の細胞外小胞の比率で存在する。いくつかの場合、ドナー細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスmRNAに対応するベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞を産生するための培養培地中で十分な時間にわたってドナー細胞を培養することと、(c)培養培地から細胞外小胞を回収することとを含む、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約8~24時間後に行われる。いくつかの場合、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞は、ドナー細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞のレベルで存在する。いくつかの場合、細胞外小胞は、ドナー細胞あたり1000、2000、5000、10000、12000、15000、17000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、または50000個以下の細胞外小胞の比率で存在する。いくつかの場合、ドナー細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、マイクロニードルデバイスであって、マイクロニードルデバイスは、基材および複数のマイクロニードルを含み、複数のマイクロニードルは基材から突出し、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルが少なくとも1つの細胞外小胞(EV)を含む、マイクロニードルデバイスが本明細書に記載される。
いくつかの場合、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり0.1マイクロニードル~100マイクロニードルである。いくつかの場合、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり少なくとも0.3マイクロニードルである。いくつかの場合、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.59マイクロニードルである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは約10~1000個のマイクロニードルを含み、基材の面積は20~1000mm2である。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは約100個のマイクロニードルを含み、基材の面積は約169mm2である。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも2列に配置し、各列に少なくとも2個のマイクロニードルを配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを10列に配置し、各列に10個のマイクロニードルを配置する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルはヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、円錐形である。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、テーパー形状を有する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、1000μm未満の直径を有する基部を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約100μm~約800μmの直径を有する基部を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約400μmの直径を有する基部を含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、少なくとも100μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、100μm~3000μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、約1000μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのマイクロニードルの長さは、約2000μmである。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は、少なくとも100μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は、約100~2000μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は、約1000μmである。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、少なくとも3×105個のEVを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×108~3×1010個のEVを含む。
いくつかの場合、EVをヒドロゲルに懸濁する。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、EVは、外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、EVは、外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、細胞外小胞(EV)を対象の組織に投与する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを対象の組織に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、少なくとも5、10、15、20、25、または30分後に除去される。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、約10、15、20、または30分後に除去される。
いくつかの場合、EVは、少なくとも1つのmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも1ng、10ng、50ng、100ng、1μg、10μg、または20μgの少なくとも1つのmRNAを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~10μgの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む
いくつかの場合、組織は皮下組織である。いくつかの場合、組織は真皮である。いくつかの場合、組織は表皮である。いくつかの場合、組織は歯肉である。いくつかの場合、組織は唇である。いくつかの場合、対象は哺乳動物である。いくつかの場合、対象はヒトである。いくつかの場合、対象はげっ歯類である。いくつかの場合、対象はサルである。いくつかの場合、対象はウサギである。
いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、6~8週間以内に最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは一定期間にわたって複数回行われ、最大で1×107個、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、または1×1020個、1×1030個の細胞外小胞が投与される。
いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりもEVの破損を少なくする。いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも投与部位での刺激が少なくなる。いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも、組織内のEVのより均一な分布をもたらす。いくつかの場合、従来のマイクロニードルは、中実マイクロニードルまたは中空マイクロニードルである。
いくつかの態様では、皮膚症状の処置を必要とする対象の皮膚症状を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを対象に適用することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、本明細書に開示されるマイクロニードルを対象に投与することを含む。
いくつかの場合、皮膚症状は皮膚損傷である。いくつかの場合、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの場合、皮膚症状は創傷である。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、または10μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、または900μg以下の細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約0.1ng~50μg、1ng~50μg、1ng~30μg、1ng~25μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。
いくつかの場合、本方法は、しわの外観の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%超のコラーゲン線維をもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%高い真皮厚さをもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、または少なくとも90日間の長期効果をもたらす。
いくつかの場合、マイクロニードルデバイスのニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、6~8週間以内に最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは一定期間にわたって複数回行われ、最大で1×107個、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、または1×1020個、1×1030個の細胞外小胞が投与される。
いくつかの態様では、マイクロニードルデバイスを製造する方法であって、本方法が、(a)細胞外小胞(EV)を重合性溶液の第1のバッチと混合することと、(b)(a)からの混合物を少なくとも1つのニードル様形状を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)鋳型に鋳造することとを含む、方法が本明細書に記載される いくつかの場合、(a)の混合は真空下で行われる。
いくつかの場合、本方法はさらに、PDMS鋳型の少なくとも1つのニードル様形状の先端にEVをさらに濃縮することを含む。いくつかの場合、濃縮することは、PDMS鋳型を高くとも10℃の温度に維持することによるものである。いくつかの場合、濃縮することは、PDMS鋳型を約4℃に維持することによるものである。いくつかの場合、濃縮は約2~約6時間持続する。
いくつかの場合、本方法はさらに、重合性溶液の第2のバッチをPDMS鋳型の上に添加することを含む。いくつかの場合、重合性溶液はヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、少なくとも1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、または1:100である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、または1:50以下である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、約1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、または1:40である。
いくつかの場合、EVは、外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、EVは、外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、組織内でI型コラーゲンのヘテロ二量体またはヘテロ三量体を産生する方法であって、本方法は、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を組織に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、ヘテロ二量体またはヘテロ三量体は、少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A1)および少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A2)を含み、Col1A1は、本明細書に開示される複数の細胞外小胞によって外因的に送達される。いくつかの場合、Col1A2は組織に内在する。
いくつかの態様では、400個の細胞外小胞あたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、または350個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり少なくとも1、2、5、10、20、25、30、35、30、50、60、70、90、または100個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり少なくとも1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり最大で1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.001~100、0.01~100、または0.01~50個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.02~50個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。
いくつかの場合、混合物は、外因性VEGF mRNAの1~6個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、前述の混合物は、冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、VEGF mRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中のVEGF mRNAのレベルよりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1ng~200μgのVEGF mRNAを含む。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって血流障害を処置することを含む、対象の血流障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、血流障害を処置することは、血行再建の少なくとも5%の増加をもたらす。いくつかの場合、血行再建における少なくとも5%の増加は、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。
いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射を介して、または冠動脈カテーテルを介して、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの場合、静脈内、筋肉内または皮下注射は、少なくとも14ゲージのゲージを有するニードルを用いて行われる。
いくつかの場合、血流障害は虚血である。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、VEGF mRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015または1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023または1×1024個以下のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×105~1×1020、1×106~1×1019、1×107~1×1018、1×108~1×1017または1×109~1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×1010~1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを単回投与することを含む。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015または1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023または1×1024個以下のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×105~1×1020、1×106~1×1019、1×107~1×1018、1×108~1×1017または1×109~1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×1010~1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを複数回および毎回投与することを含む。
いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、VEGF mRNAを含む細胞外小胞をロードしたマイクロニードルを使用して行われる。
いくつかの場合、マイクロニードルはヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回、対象に投与される。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、(a)トランスフェクションを介してVEGFをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、(c)ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、血流障害の処置を必要とする対象の血流障害を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示される細胞外小胞を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、血流障害は虚血である。
いくつかの態様では、平均で少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、細胞外小胞の混合物であって、混合物は、外因性VEGF mRNAの1~6個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む、細胞外小胞の混合物が記載される。いくつかの実施形態では、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、混合物は、冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって血流障害を処置することを含む、対象の血流障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、血流障害を処置することは、血行再建の少なくとも5%の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、血行再建における少なくとも5%の増加は、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射を介して、または冠動脈カテーテルを介して、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、静脈内、筋肉内または皮下注射は、少なくとも14ゲージのゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの実施形態では、血流障害は虚血である。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、VEGF mRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。
いくつかの態様では、平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、外因性細胞外マトリックスmRNAは、コラーゲン、COL1、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン、XI型コラーゲン、IX型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、X型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVII型コラーゲン、およびXVIIII型コラーゲンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、細胞外小胞の混合物であって、混合物は、外因性細胞外マトリックスmRNAの1~2個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む、細胞外小胞の混合物が記載される。いくつかの実施形態では、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。
いくつかの態様では、対象の皮膚損傷を処置する方法であって、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって対象の皮膚損傷を処置することを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、しわの外観の少なくとも10%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、皮下注射を介して、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、皮下注射は、少なくとも14のゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの実施形態では、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも6000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、トランスフェクションを介してVEGFをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、トランスフェクションを介して細胞外マトリックスタンパク質をコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許または特許出願の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて官庁から提供される。
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。
詳細な説明
本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図される。
本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図される。
概要
本開示は、外因性RNAカーゴ(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、細胞外マトリックスmRNA、コラーゲンmRNA、Col1A mRNA、Col1A1 mRNA)を担持し、様々な皮膚症状および他の障害を処置するために使用することができ、しばしば長期にわたる効果を有する細胞外小胞を提供する。本開示はまた、VEGF mRNAを含有し、血流障害などの障害を処置するために使用することができる細胞外小胞を提供する。本開示はまた、細胞外小胞を対象に送達するために使用することができるニードルおよびマイクロニードルを提供する。本開示はまた、様々なカーゴ(例えば、DNA、RNA、治療薬)を担持するか、または外因性カーゴを担持しない細胞外小胞を含むヒドロゲルニードル(例えば、ヒドロゲルマイクロニードル)を提供する。
本開示は、外因性RNAカーゴ(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、細胞外マトリックスmRNA、コラーゲンmRNA、Col1A mRNA、Col1A1 mRNA)を担持し、様々な皮膚症状および他の障害を処置するために使用することができ、しばしば長期にわたる効果を有する細胞外小胞を提供する。本開示はまた、VEGF mRNAを含有し、血流障害などの障害を処置するために使用することができる細胞外小胞を提供する。本開示はまた、細胞外小胞を対象に送達するために使用することができるニードルおよびマイクロニードルを提供する。本開示はまた、様々なカーゴ(例えば、DNA、RNA、治療薬)を担持するか、または外因性カーゴを担持しない細胞外小胞を含むヒドロゲルニードル(例えば、ヒドロゲルマイクロニードル)を提供する。
本開示はまた、少なくとも1つの細胞外マトリックスタンパク質RNA(例えば、細胞外マトリックス(ECM)mRNA、コラーゲンmRNA、Col1 mRNA、Col1A1 mRNA、ColIV mRNA、エラスチンmRNA)または血管内皮成長因子(VEGF)mRNA(例えば、VEGFA mRNA)などのカーゴを発現および/または担持する1つまたはそれを超える細胞外小胞(例えば、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの混合物)の設計および産生に関する。特定の実施形態では、本開示は、外因性コラーゲンmRNAを含有する細胞外小胞(例えば、エキソソーム)を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、外因性VEGF mRNAを含有する細胞外小胞(例えば、エキソソーム)を提供する。細胞外小胞は、標的化された細胞に送達される治療薬などのペイロードを運ぶように設計することができる。いくつかの場合、細胞外小胞によって送達される治療薬は、治療用化合物(例えば、治療用ポリヌクレオチド、治療用DNA、治療用RNA、治療用mRNA、治療用miRNA、治療用tRNA、治療用rRNA、治療用siRNA、治療用shRNA、治療用SRP RNA、治療用tmRNA、治療用gRNA、または治療用crRNA)を含み得る。いくつかの場合、細胞外小胞によって送達される治療薬は、治療用非コードポリヌクレオチド(例えば、非コードRNA、lncRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、またはscaRNA)、治療用ポリペプチド、治療用化合物または抗癌剤を含み得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、非治療用化合物(例えば、非治療用ポリヌクレオチド)を担持し得る。
本明細書で提供される細胞外小胞は、いくつかの方法およびアプローチによって産生され得る。本明細書で提供される1つのアプローチは、ベクター(例えば、プラスミド、DNA)などの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞に導入することを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは細胞外マトリックスRNA(例えば、コラーゲン)またはVEGF RNA(例えば、VEGFA)をコードする。ベクター(例えば、DNAプラスミド)の導入は、トランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、ナノエレクトロポレーション、リポフェクション、細胞ナノエレクトロポレーション、ウイルス送達、または他の方法を含む様々な方法を介したものであり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は初代細胞(例えば、初代接着細胞)である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株(例えば、ヒト細胞、ヒト線維芽細胞株、ヒト真皮線維芽細胞株、新生児ヒト真皮線維芽細胞株)に由来する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーションの前に遺伝子改変されていない。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーションの前に遺伝子改変されている。いくつかの場合、本開示は、エキソソームの基底分泌が本来であれば低い細胞からでさえ、大量のmRNA転写物を含有する多数のエキソソームを産生する方法を提供する。
少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む、皮膚損傷(例えば、日焼けによる損傷、老化、または他のプロセスによって引き起こされる)を処置する方法が本明細書に記載される。本明細書で提供される方法は、小じわおよび/またはしわの外観を逆転、減少、または軽減するのに特に有用である。いくつかの場合、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される細胞外小胞の投与後少なくとも30、60、または90日間などの期間にわたって皮膚損傷(例えば、しわ、小じわなど)を減少させる。いくつかの場合、本明細書で提供される方法は、創傷治癒のために使用することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチド(例えば、治療用mRNA、miRNAなど)を含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも1つの細胞外小胞ドナー細胞を少なくとも第1のベクター(例えば、プラスミド)でナノエレクトロポレーションすることによって得ることができ、第1のベクターは治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドは細胞外マトリックスRNA(例えば、コラーゲン)を含む。いくつかの場合、第1のベクターを細胞外小胞ドナー細胞で発現させて、治療用ポリヌクレオチドを得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞を回収し、対象に全身(systematically)投与する。いくつかの場合、細胞外小胞を回収し、対象に局所投与する(例えば、皮下注射を介して)。
少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む、血流障害(例えば、虚血)を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチド(例えば、治療用mRNA、miRNAなど)を含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも1つの細胞外小胞ドナー細胞を少なくとも第1のベクター(例えば、プラスミド)でナノエレクトロポレーションすることによって得ることができ、第1のベクターは治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドはVEGF RNA(例えば、VEGFA)を含む。いくつかの場合、第1のベクターを細胞外小胞ドナー細胞で発現させて、治療用ポリヌクレオチドを得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞を回収し、対象に全身投与する。いくつかの場合、細胞外小胞を回収し、対象に局所投与する(例えば、筋肉内注射を介して)。
複数の細胞外小胞を含むヒドロゲルマイクロニードルも本明細書に記載される。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。例えば、いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%、10%、15%、または20%のヒアルロン酸を含む。
複数の細胞外小胞を含むニードルであって、細胞外小胞が少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAまたはVEGF mRNAを含むニードルも本明細書に記載される。複数の細胞外小胞を含むシリンジであって、細胞外小胞が少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAまたはVEGF mRNAを含むシリンジも記載される。
マイクロニードルデバイスが本明細書にさらに記載される。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、基材および複数のマイクロニードルを含み、複数のマイクロニードルは基材から突出し、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルが少なくとも1つのEVを含む。そのようなマイクロニードルデバイスを製造する方法も本明細書に記載される。
細胞外小胞ドナー細胞
細胞外小胞ドナー細胞
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞を産生する細胞外小胞ドナー細胞が本明細書に記載される。細胞外小胞ドナー細胞は、細胞の細胞外小胞の分泌の基底レベルよりも高いレベルで細胞外小胞を分泌するように、または外因性核酸(例えば、外因性コラーゲンRNAもしくはVEGF RNA)を含有する細胞外小胞を分泌するように遺伝子改変もしくは操作することができる任意の細胞であり得る。したがって、細胞外小胞の分泌の基礎レベルが低いかまたは無視できる程度である細胞も、細胞外小胞ドナー細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は有核細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は自己細胞であり得る。そのような場合、細胞外小胞ドナー細胞は、対象から得ることができ、次いで、細胞外小胞ドナー細胞の改変(例えば、ベクターの導入)に続いて、分泌された細胞外小胞を回収し、次いで、同じ対象に投与する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は同種細胞である。そのような場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞によって分泌される細胞外小胞を後に受け取る対象とは遺伝的に異なる供給源から得られる細胞である。多くの場合、同種細胞外小胞ドナー細胞の場合、細胞外小胞ドナー細胞は同じ種であるが、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞を後に受け取る対象とは遺伝的に異なる。
細胞外小胞ドナー細胞は、任意の種類の細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は真核細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞など)である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株、幹細胞、初代細胞、または分化細胞からの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドナー細胞は初代細胞である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)、ヒト胚性線維芽細胞(HEF)、ヒト真皮線維芽細胞(HDF)、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、脱核細胞、神経幹細胞、未成熟樹状細胞、または免疫細胞である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、新生児ヒト初代真皮線維芽細胞である。いくつかの場合、新生児ヒト初代真皮線維芽細胞は、ATCCのPCS-201-010系統である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は初代真皮線維芽細胞である。いくつかの場合、初代真皮線維芽細胞は、ATCCのPCS-201-012系統である。細胞外小胞ドナー細胞は、接着細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は接着細胞である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は懸濁細胞である。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、トランスフェクションによって細胞外小胞ドナー細胞に導入される。少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される生物学的方法、化学的方法、もしくは物理的方法のいずれか1つによって、または任意の他の生物学的方法、化学的方法、もしくは物理的方法によって、細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクトされ得る。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション(例えば、ナノエレクトロポレーション)によって細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクトされる。いくつかの場合、エレクトロポレーションは、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションである。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、ナノチャネルエレクトロポレーションによって細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、遺伝子改変された細胞を含む。遺伝子改変細胞の例としては、人工多能性幹細胞または核酸誘導ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR-Cas)によって遺伝子改変された細胞を挙げることができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は遺伝子改変されていない。例えば、いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション(例えば、ナノエレクトロポレーション)の前に遺伝子改変されていない。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞の染色体に組み込まれる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞の染色体に組み込まれない。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクトされる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクトされる。いくつかの場合、トランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株に由来する細胞である。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドはベクター(例えば、プラスミド)である。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するために複数のベクターによってエレクトロポレーションされ得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するために複数のベクターによってナノエレクトロポレートされ得る。いくつかの場合、複数のベクターは、少なくとも第1のベクター、少なくとも第2のベクター、または任意の追加のベクターを含む。いくつかの場合、第1のベクターおよび第2のベクターを同時に細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレートすることができる。いくつかの場合、第1のベクターおよび第2のベクターを異なる時点で細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、第1のベクターおよび第2のベクターをナノエレクトロポレーションする間の時間差は、少なくとも1分、5分、10分、30分、1時間、5時間、12時間、1日、2日、5日、10日、30日、またはそれよりも長い時間であり得る。
いくつかの場合、第1のベクターは、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチド(例えば、ECMまたはVEGF mRNA)をコードし得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、第1のベクターをナノエレクトロポレートすると、第1のベクターを転写して治療用ポリヌクレオチドを得ることができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、第1のベクターによってコードされる治療用ポリヌクレオチドの封入を含む細胞外小胞またはエキソソームを産生および分泌する。
いくつかの場合、第2のベクターは標的化ポリペプチド(例えば、標的化された細胞への細胞外小胞の標的化および蓄積を増加させることができる細胞特異的標的化ペプチド)をコードし得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、第2のベクターをナノエレクトロポレートすると、第2のベクターを翻訳して標的化ポリペプチドを得ることができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞またはエキソソームを産生し得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞またはエキソソームを分泌し得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、標的化ペプチドと、第1のベクターによってコードされる治療用ポリヌクレオチドとを含む細胞外小胞またはエキソソームを産生および分泌し得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、第1のベクターをナノエレクトロポレートすると、第1のベクターを転写または翻訳して、治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドを得ることができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、第1のベクターによってコードされる治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドを含む細胞外小胞またはエキソソームを産生および分泌し得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、標的化ペプチドと、第1のベクターによってコードされる治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドとを含む細胞外小胞を産生および分泌し得る。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドは、同じ細胞外小胞またはエキソソームに封入することができる。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドは、異なる細胞外小胞またはエキソソームに封入することができる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を定常速度または基底速度で連続的に産生および分泌する。細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の低い基底速度または無視できる速度または産生および分泌を有する細胞を含む、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞は、一般に分泌しないか、または少数の細胞外小胞を分泌する初代細胞もしくは非癌性細胞であり得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度で細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞にヒートショックを行うか、または細胞外小胞ドナー細胞をCa2+イオンと接触させることによって、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、p53-TSAP6シグナル伝達経路などのストレス応答シグナル伝達経路を活性化することによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にエレクトロポレーションすることによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドの細胞外小胞ドナー細胞へのマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にエレクトロポレーション(例えば、ナノチャネルエレクトロポレーション)することによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、エレクトロポレーション(例えば、ナノチャネルエレクトロポレーション)によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞外小胞ドナー細胞の基底速度よりも少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。いくつかの場合、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するためのナノエレクトロポレーション以外の方法によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞の速度よりも少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度で細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞にヒートショックを行うか、または細胞外小胞ドナー細胞をCa2+イオンと接触させることによって、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、p53-TSAP6シグナル伝達経路などのストレス応答シグナル伝達経路を活性化することによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にエレクトロポレーションすることによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドの細胞外小胞ドナー細胞へのマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にエレクトロポレーション(例えば、ナノチャネルエレクトロポレーション)することによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、エレクトロポレーション(例えば、ナノチャネルエレクトロポレーション)によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞外小胞ドナー細胞の基底速度よりも少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。いくつかの場合、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するためのナノエレクトロポレーション以外の方法によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞の速度よりも少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌し得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療薬をコードする。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリペプチドである。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。
細胞外小胞
細胞外小胞
いくつかの場合、細胞外小胞を含む組成物および細胞外小胞を産生する方法が本明細書で提供される。いくつかの場合、細胞外小胞は、任意の膜結合粒子(例えば、脂質二重層を有する小胞)である。多くの場合、本明細書で提供される細胞外小胞は細胞によって分泌される。いくつかの場合、細胞外小胞は、インビトロで産生される任意の膜結合粒子であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される。いくつかの場合、細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポトソーム、オンコソーム、エクソファー、エンベロープウイルス、エキソマー、または非常に大きな細胞外小胞、例えば、大きなオンコソームである。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームである。
いくつかの場合、細胞外小胞は、約10nm~約50,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、10nm~約20nm、約10nm~約30nm、約10nm~約50nm、約10nm~約100nm、約10nm~約200nm、約10nm~約500nm、約10nm~約1,000nm、約10nm~約2,000nm、約10nm~約5,000nm、約10nm~約10,000nm、約10nm~約50,000nm、約20nm~約30nm、約20nm~約50nm、約20nm~約100nm、約20nm~約200nm、約20nm~約500nm、約20nm~約1,000nm、約20nm~約2,000nm、約20nm~約5,000nm、約20nm~約10,000nm、約20nm~約50,000nm、約30nm~約50nm、約30nm~約100nm、約30nm~約200nm、約30nm~約500nm、約30nm~約1,000nm、約30nm~約2,000nm、約30nm~約5,000nm、約30nm~約10,000nm、約30nm~約50,000nm、約50nm~約100nm、約50nm~約200nm、約50nm~約500nm、約50nm~約1,000nm、約50nm~約2,000nm、約50nm~約5,000nm、約50nm~約10,000nm、約50nm~約50,000nm、約100nm~約200nm、約100nm~約500nm、約100nm~約1,000nm、約100nm~約2,000nm、約100nm~約5,000nm、約100nm~約10,000nm、約100nm~約50,000nm、約200nm~約500nm、約200nm~約1,000nm、約200nm~約2,000nm、約200nm~約5,000nm、約200nm~約10,000nm、約200nm~約50,000nm、約500nm~約1,000nm、約500nm~約2,000nm、約500nm~約5,000nm、約500nm~約10,000nm、約500nm~約50,000nm、約1,000nm~約2,000nm、約1,000nm~約5,000nm、約1,000nm~約10,000nm、約1,000nm~約50,000nm、約2,000nm~約5,000nm、約2,000nm~約10,000nm、約2,000nm~約50,000nm、約5,000nm~約10,000nm、約5,000nm~約50,000nm、または約10,000nm~約50,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、約10nm、約20nm、約30nm、約50nm、約100nm、約200nm、約500nm、約1,000nm、約2,000nm、約5,000nm、約10,000nm、または約50,000nmの直径を有する。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも約10nm、約20nm、約30nm、約50nm、約100nm、約200nm、約500nm、約1,000nm、約2,000nm、約5,000nm、または約10,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で約20nm、約30nm、約50nm、約100nm、約200nm、約500nm、約1,000nm、約2,000nm、約5,000nm、約10,000nm、または約50,000nmの直径を有することができる。
細胞外小胞表面タンパク質は、一般に、細胞外小胞に関連するタンパク質である。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質は、細胞外小胞ドナー細胞によって発現され、細胞外ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞の一部として組み込まれ分泌され得る。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質は、細胞外小胞表面タンパク質のN末端、C末端、またはN末端とC末端との両方を含み得る、少なくとも1つの細胞外ドメインを含む。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質は、本明細書に記載される少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされ得る。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり得る。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーには、抗原受容体、抗原提示分子、共受容体、抗原受容体アクセサリー分子、共刺激分子または阻害分子、ナチュラルキラー細胞上の受容体、白血球上の受容体、免疫グロブリン様細胞接着分子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、受容体チロシンキナーゼ、受容体チロシンホスファターゼ、免疫グロブリン結合受容体、細胞骨格、または他のメンバーが含まれ得る。いくつかの場合、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを含む細胞外小胞表面タンパク質は、可変免疫グロブリンドメイン(IgV)または定常免疫グロブリンドメイン(IgC)を含む。いくつかの場合、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを含む細胞外小胞表面タンパク質は、IgVドメインを含む。IgVを含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例としては、分化抗原群タンパク質(例えば、CD2、CD4、CD47、CD80、もしくはCD86)、ミエリン膜接着分子、接合部接着分子(JAM)、チロシン-プロテインキナーゼ受容体、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、またはT細胞抗原受容体を挙げることができる。
いくつかの場合、細胞外小胞は、治療用ポリヌクレオチド以外の成分を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超える保存剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超える安定化剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超えるDNAseを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超えるRNase阻害剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超えるDNAseおよび/またはRNase阻害剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、1つまたはそれを超えるDNAse、DNAse阻害剤、RNAseおよび/またはRNAse阻害剤を含む。
いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の半減期と比較して、循環中の半減期の増加を示す。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期は、標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の半減期と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期は、標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の半減期と比較して、少なくとも1分、2分、3分、4分、5分、10分、15分、30分、60分、90分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間、14日間、21日間、28日間、30日間、またはそれを超えて増加する。
いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、げっ歯類、マウス)の循環中で少なくとも30秒、少なくとも1分、少なくとも2分、少なくとも3分、少なくとも5分、または少なくとも10分の半減期を示す。いくつかの場合、標的化を含む細胞外小胞は、哺乳動物の循環中で5時間未満、2時間未満、1時間未満、または30分未満の半減期を示す。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、異種標的化ドメインを含む。いくつかの場合、異種標的化ドメインは、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。異種標的化ドメインは、標的化された細胞の表面上に発現される細胞表面マーカーを標的化することができる。細胞表面マーカーは、標的化された細胞の表面上に発現される任意の高分子またはタンパク質であり得る。細胞表面マーカーの非限定的な例としては、血管受容体、フィブロネクチン受容体、A2B5、CD44、CD24、ESA、SSEA1、CD133、CD34、CD19、CD38、CD26、CD166、またはCD90が挙げられる。
いくつかの場合、細胞表面マーカーを発現する標的化された細胞における少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の蓄積は、同じ細胞表面マーカーを発現する同じ標的化された細胞における少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積よりも高い。いくつかの場合、細胞表面マーカーを発現する標的化された細胞における少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の蓄積は、同じ細胞表面マーカーを発現する同じ標的化された細胞における標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超える。
いくつかの場合、細胞表面マーカーを発現する標的化された細胞における少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の肝臓および脾臓への蓄積、例えば非標的化された細胞における細胞外小胞の蓄積は、同じ標的化された細胞における少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の肝臓および脾臓への蓄積と比較して減少する。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の肝臓および脾臓への蓄積は、標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の肝臓および脾臓への蓄積と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍減少する。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、少なくとも1つの異種標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ドメインは、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの場合、少なくとも1つの異種標的化ドメインは腫瘍標的化ドメインであり、腫瘍標的化ドメインは癌性細胞を標的とする。いくつかの場合、少なくとも1つの異種標的化ドメインは腫瘍標的化ドメインであり、腫瘍標的化ドメインは非癌性病変細胞を標的とする。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5またはそれを超える異種標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも2つの標的化ドメインは同一であり得る。いくつかの場合、少なくとも2つの標的化ドメインは異なり得る。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を標的化し、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を特定の組織に標的化および誘導する少なくとも1つの組織標的化ドメインを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超える組織標的化ペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも2つの組織標的化ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも2つの組織標的化ペプチドは異なる。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50または100個のアミノ酸を含む。内皮組織または心臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、SIGYPLP、LSIPPKA、FQTPPQL、LTPATAI、CNIWGVVLSWIGVFPEC、NTTTH、VHPKQHR(四量体)、CRKRLDRNCCRTLTVRKC、CLWTVGGGC、QPWLEQAYYSTF、YPHIDSLGHWRR、LLADTTHHRPWT、SAHGTSTGVPWP、VPWMEPAYQRFL、TLPWLEESYWRP、HWRR、CSTSMLKAC、DDTRHWG、CARPAR、CKRAVR、CRSTRANPC、CPKTRRVPC、CSGMARTKC、またはCRPPRが挙げられる。膵臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CRVASVLPC、SWCEPGWCR、LSGTPERSGQAVKVKLKAIP、CHVLWSTRCCVSNPRWKC、またはLSALPRTが挙げられる。腎臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CLPVASC、ELRGD(R/M)AX(W/L)、GV(K/R)GX3(T/S)RDXR、HITSLLSHTTHREPまたはANTPCGPYTHDCPVKRが挙げられる。肺組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CGFELETCCGFECVRQCPERC、QPFMQCLCLIYDASCRNVPPIFNDVYWIAF、VNTANST、CTSGTHPRC、またはSGEWVIKEARGWKHW-VFYSCCPTTPYLDITYHが挙げられる。腸組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、YSGKWGW、LETTCASLCYPSYQCSYTMPHPPVVPPHPMTYSCQY、YPRLLTP、CSQSHPRHC、CSKSSDYQC、CKSTHPLSC、CTGKSCLRVG、SFKPSGLPAQSL、またはCTANSSAQCが挙げられる。脳組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CLSSRLDAC、GHKAKGPRK、HAIYPRH、THRPPMWSPVWP、HLNILSTLWKYRC、CAGALCY、CLEVSRKNC、RPRTRLHTHRNR(D-aa)、ACTTPHAWLCG、GLAHSFSDFARDFV、GYRPVHNIRGHWAPG、TGNYKALHPHNG、CRTIGPSVC、CTSTSAPYC、CSYTSSTMC、CMPRLRGC、TPSYDTYAAELR、RLSSVDSDLSGC、CAQK、またはSGVYKVAYDWQHを挙げることができる。様々な組織を標的とする更なる例示的な組織標的化ドメインとしては、LMLPRAD(副腎を標的とする)、CSCFRDVCC(網膜を標的とする)、CRDVVSVIC(網膜を標的とする)、CVALCREACGEGC(皮膚皮下脈管構造を標的とする)、GLSGGRS(子宮を標的とする)、WYRGRL(軟骨を標的とする)、CPGPEGAGC(乳房脈管構造を標的とする)、SMSIARLVSFLEYR(前立腺を標的とする)、GPEDTSRAPENQQKTGC(皮膚ランゲルハンスを標的とする)、CKGGRAKDC(白色脂肪脈管構造を標的とする)、CARSKNKDC(創傷または損傷組織を標的とする)、CHAQGSAEC(胸腺を標的とする)、LEPRWGFGWWLKLSTHTTESRSMV(耳もしくは蝸牛組織を標的とする)、ACSTEALRHCGGGS(網膜血管を標的とする)、ASSLNIA(筋肉組織を標的とする)、CSTSMLKAC(虚血を標的とする)またはCSTSMLKAC(虚血心筋を標的とする)が挙げられる。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超える細胞透過性ペプチドを含む。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドを含む標的化ポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。いくつかの場合、少なくとも2つの細胞透過性ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも2つの細胞透過性ペプチドは異なる。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸を含む。細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、DSLKSYWYLQKFSWR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、KSKTEYYNAWAVWERNAP、GNGEQREMAVSRLRDCLDRQA、HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、R9GPLGLAGE8、Ac-GAFSWGSLWSGIKNFGSTVKNYG、RLRWR、LGQQQPFPPQQPY、ILGKLLSTAAGLLSNL、TFFYGGSRGKRNNFKTEEY、Ac-LRKLRKRLLRX-Bpg-G、Ac-LRKLRKRLLR、またはMVRRFLVTLRIRRACGPPRVRVが挙げられる。
いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超えるウイルス膜タンパク質またはその断片を含む。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質を含む標的化ポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。いくつかの場合、少なくとも2つのウイルス膜タンパク質は同一である。いくつかの場合、少なくとも2つのウイルス膜タンパク質は異なる。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸を含む。ウイルス膜タンパク質の非限定的な例としては、赤血球凝集素、糖タンパク質41、エンベロープタンパク質、VSV G、HSV01 gB、エボラウイルス糖タンパク質、または融合関連小膜貫通(FAST)タンパク質が含まれる。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの治療薬を含む。いくつかの場合、少なくとも1つの治療薬は細胞外小胞内にある(例えば、封入される)。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリペプチドである。いくつかの場合、治療薬は治療用化合物である。いくつかの場合、治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は複数の治療薬を含み、複数の治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、皮膚標的化ドメインを含む皮膚標的化ポリペプチドである。いくつかの場合、皮膚標的化ドメインを含む皮膚標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の皮膚における蓄積は、皮膚標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較してより高い。いくつかの場合、皮膚における皮膚標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の蓄積は、皮膚標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高い。いくつかの場合、皮膚における皮膚標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞の蓄積は、皮膚標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較して少なくとも100倍高い。
いくつかの場合、皮膚標的化ポリペプチドは、少なくとも1つの皮膚標的化ドメインを含む。いくつかの場合、皮膚標的化ドメインは、皮膚標的化ポリペプチドのN末端にあり得る。いくつかの場合、皮膚標的化ドメインは、皮膚標的化ポリペプチドのC末端にあり得る。いくつかの場合、皮膚標的化ドメインは、皮膚標的化ポリペプチドの任意のペプチド位置にあり得る。いくつかの場合、少なくとも2つの標的化ドメインは、同じ皮膚標的化ポリペプチド上にあり得る。いくつかの場合、同じ皮膚標的化ポリペプチド上の少なくとも2つの標的化ドメインは同じであり得る。いくつかの場合、同じ皮膚標的化ポリペプチド上の少なくとも2つの標的化ドメインは異なり得る。いくつかの場合、標的化ドメインは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を含まない細胞外小胞の半減期と比較して、循環中の半減期の増加を含む。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質によって増加した細胞外小胞の半減期は、少なくとも90分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間、14日間、21日間、28日間、30日間、または細胞外小胞表面タンパク質を含まない細胞外小胞の半減期よりも長い。
いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を含まない細胞外小胞と比較して低下した毒性を有する。そのような場合、細胞外小胞表面タンパク質は標的に特異的に結合し、有意な標的外結合を有しないことが多い。いくつかの場合、毒性は、腫瘍標的化ポリペプチドによって標的化されない細胞に対する毒性を含む。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を含まない細胞外小胞と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、またはそれを超えて低下した毒性を有する。いくつかの場合、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞の低下した毒性は、細胞外小胞表面タンパク質を含まない細胞外小胞と比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、またはそれを超えて低下する。
いくつかの場合、細胞外小胞(例えば、エキソソーム)は、細胞外小胞の投与後に対象によって耐容される。例えば、いくつかの場合、細胞外小胞は免疫応答を誘導しないか、または免疫原性ではない。
治療用ポリヌクレオチド
いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクトされた少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドによって標的化および結合された細胞によって治療用ポリペプチドに翻訳され得るペプチド配列を含む。
いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクトされた少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドによって標的化および結合された細胞によって治療用ポリペプチドに翻訳され得るペプチド配列を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、各細胞外小胞は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000個のコピーまたはそれを超えるコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、各細胞外小胞は、本明細書に記載される治療用mRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000個のコピーまたはそれを超えるコピーを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドを含み、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドは異なる。いくつかの場合、細胞外小胞によって封入された少なくとも2つの異なる治療用ポリヌクレオチドは、異なる比を含む。例えば、2つの異なる治療用ポリヌクレオチドの第1と第2との比は、1:1,000,000、1:500,000、1:100,000、1:50,000、1:10,000、1:5,000、1:1,000、1:500、1:100、1:50、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、または1:1であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、同じ細胞外小胞に封入された少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれを超える治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームであり得る。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、mRNA、rRNA、SRP RNA、tRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、gRNA、aRNA、crRNA、lncRNA、miRNA、ncRNA、piRNA、siRNA、およびshRNAを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドはmRNAを含む。いくつかの場合、mRNAは完全にインタクトまたは実質的にインタクトである。いくつかの場合、mRNAはタンパク質の一部をコードする。いくつかの場合、mRNAは、少なくとも50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、または1,000,000個、またはそれを超えるRNAヌクレオチドを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドはDNAを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードするベクターなどのDNAを含む。治療用ポリヌクレオチドは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質もしくはペプチドまたは血管新生タンパク質もしくはペプチドを含む治療用ポリペプチドをコードすることができるが、これらに限定されない。治療用ポリヌクレオチド(例えば、メッセンジャーRNA治療薬)がコードし得る治療用ポリペプチドの例としては、線維状コラーゲン(例えば、I型、II型、III型、V型、XI型コラーゲン)、FACITコラーゲン(例えば、IX型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIV型コラーゲン)、短鎖コラーゲン(例えば、VIII型コラーゲン、X型コラーゲン)、基底膜コラーゲン(例えば、IV型コラーゲン)、その他のコラーゲン(例えば、VI型、VII型、XIII型、XV型、XVII型、XVIIII型コラーゲン)、エラスチン(ELN)、フィブロネクチン(FN1)、ラミニン(例えば、ラミニン-111、ラミニン-211、ラミニン-121、ラミニン-221、ラミニン-332/ラミニン-3A32、ラミニン-3B32、ラミニン-311/ラミニン-3A11、ラミニン-321/ラミニン-3A21、ラミニン-411、ラミニン-421、ラミニン-511、ラミニン-521、ラミニン-213、ラミニン-423、ラミニン-522、ラミニン-523)もしくはそれらの混合物、またはVEGF(例えば、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、胎盤成長因子(PlGF)もしくはそれらの混合物)が挙げられる。いくつかの場合、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドは、I型コラーゲン(Col1)をコードし得る。いくつかの場合、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドからコードされた治療用ポリペプチドは、I型コラーゲン(Col1)であり得る。いくつかの場合、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドはVEGF(VEGFA)をコードし得る。いくつかの場合、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドからコードされた治療用ポリペプチドはVEGF(VEGFA)であり得る。
COL1A1 mRNAは、本明細書に開示されるEVの産生方法ではEVあたり一定のコピー数で存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、2000個のEVあたり、1000個のEVあたり、500個のEVあたり、400個のEVあたり、300個のEVあたり、200個のEVあたり、150個のEVあたり、100個のEVあたり、90個のEVあたり、80個のEVあたり、70個のEVあたり、60個のEV、50個のEV、40個のEVあたり、30個のEVあたり、20個のEVあたり、15個のEVあたり、10個のEVあたり、5個のEVあたり、2個のEVあたり、または1個のEVあたり、平均で少なくとも1個のコピーのCOL1A1 mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で少なくとも1、2、5、10、50、100、200、300、500、または1000個のコピーのCOL1A1 mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.1~100個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーのCOL1A1 mRNAを含む。
VEGF mRNAは、本明細書に開示されるEVの製造方法ではEVあたり一定のコピー数で存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、2000個のEVあたり、1000個のEVあたり、500個のEVあたり、400個のEVあたり、300個のEVあたり、200個のEVあたり、150個のEVあたり、100個のEVあたり、90個のEVあたり、80個のEVあたり、70個のEVあたり、60個のEV、50個のEV、40個のEVあたり、30個のEVあたり、20個のEVあたり、15個のEVあたり、10個のEVあたり、5個のEVあたり、2個のEVあたり、または1個のEVあたり、平均で少なくとも1個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で少なくとも1、2、5、10、50、100、200、300、500、または1000個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.02~50個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーのVEGF mRNAを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬、mRNA治療薬)のコピー数は、細胞外小胞あたり少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも100,000個、またはそれを超えるコピー数の治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、本明細書に記載される各細胞外小胞またはエキソソームに封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬、mRNA治療薬)のコピー数は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも100,000個、またはそれを超えるコピー数である。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞(例えば、培養容器中のドナー細胞によって分泌された複数のEV)に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬、mRNA治療薬)のコピー数は、細胞外小胞あたり治療用ポリヌクレオチドの平均して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも100,000個、またはそれを超えるコピー数である。いくつかの場合、本明細書に記載される各細胞外小胞またはエキソソームに封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬、mRNA治療薬)のコピー数は、平均して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも100,000個、またはそれを超えるコピー数である。
いくつかの場合、(例えば、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションにより)トランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)のコピー数は、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナーから産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞に直接導入する(例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞に直接トランスフェクトする)ことによって産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。
いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)は、完全または実質的にインタクトであり、封入された治療用ポリヌクレオチドのコピーの少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、またはそれを超えて完全または実質的にインタクトである。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された完全または実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)のパーセンテージは、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された完全または実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)のパーセンテージと比較して増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された完全または実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)の数は、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された完全または実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチドの数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞に封入された完全にインタクトなまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬またはメッセンジャーRNA治療薬)の数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する(例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクトする)ことから産生された細胞外小胞に封入された完全にインタクトなまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチドの数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された核酸または核酸類似体を含む。例示的な修飾された核酸としては、ウラシル-5-イル、ヒポキサンチン-9-イル(I)、2-アミノアデニン-9-イル、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の修飾された核酸、例えば5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2置換プリン、N-6置換プリン、O-6置換プリン、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、5-メチルシトシン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャス(promiscuous)な核酸、サイズ拡大核酸、フッ素化核酸、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6および0-6置換プリン。5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシル、5-プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、6-アゾチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン([5,4-b][l,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、G-クランプ、フェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(2H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられたもの、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、2-ピリドン、アザシトシン、5-ブロモシトシン、ブロモウラシル、5-クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5-フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、5,6-ジヒドロシトシン、5-ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、5-ニトロシトシン、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、および5-ヨードウラシル、2-アミノ-アデニン、6-チオグアニン、2-チオ-チミン、4-チオ-チミン、5-プロピニル-ウラシル、4-チオ-ウラシル、N4-エチルシトシン、7-デアザグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、5-ヒドロキシシトシン、2’-デオキシウリジン、2-アミノ-2’-デオキシアデノシン修飾核酸であって、様々な複素環塩基および様々な糖部分(および糖類似体)を含む核酸が当該技術分野で入手可能であり、いくつかの場合、核酸は、天然に存在する核酸の主要な5塩基成分以外の1つまたはいくつかの複素環塩基を含む。例えば、複素環塩基には、いくつかの場合、ウラシル-5-イル、シトシン-5-イル、アデニン-7-イル、アデニン-8-イル、グアニン-7-イル、グアニン-8-イル、4-アミノピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-3-イル基が含まれ、プリンは、9位を介して核酸の糖部分に、ピリミジンは1位を介して、ピロロピリミジンは7位を介して、ピラゾロピリミジンは1位を介して結合している。
いくつかの場合、ヌクレオチド類似体もリン酸部分で修飾されている。修飾されたリン酸部分には、2つのヌクレオチド間の連結に修飾を有するもの、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート(3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む)、ホスフィネート、ホスホルアミデート(3’-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む)、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノリン酸が含まれるが、これらに限定されない。2つのヌクレオチド間のこれらのリン酸連結または修飾されたリン酸連結は、3’-5’連結または2’-5’連結を介しており、この連結は、3’-5’から5’-3’または2’-5’から5’-2’などの逆極性を含むことが理解される。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
いくつかの場合、修飾された核酸は、修飾された塩基を有するモノリン酸として作製された2’,3’-ジデオキシ-2’,3’-ジデヒドロ-ヌクレオシド5’-置換DNAおよびRNA誘導体または5’-置換モノマーを含む。
いくつかの場合、修飾された核酸は、糖環の5’位および2’位に修飾を含む(例えば5’-CH2-置換2’-O-保護ヌクレオシド)。いくつかの場合、修飾された核酸は、オリゴヌクレオチドに組み込むために調製されたアミド結合ヌクレオシド二量体を含み、二量体(5’~3’)中の3’連結ヌクレオシドは、2’-OCH3および5’-(S)-CH3を含む。修飾された核酸は、2’-置換5’-CH2(またはO)修飾ヌクレオシドを含み得る。修飾された核酸は、5’-メチレンホスホネートDNAおよびRNAモノマーと、二量体とを含み得る。修飾された核酸は、2-’置換を有する5’-ホスホネートモノマーと、他の修飾された5’-ホスホネートモノマーとを含み得る。修飾された核酸は、5’-修飾メチレンホスホネートモノマーを含み得る。修飾された核酸は、5’および/または6’位にヒドロキシル基を含む5’または6’-ホスホネートリボヌクレオシドの類似体を含み得る。修飾された核酸は、5’-ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマーと、5’-リン酸基を有する二量体とを含み得る。修飾された核酸は、6’-ホスホネート基を有するヌクレオシドを含み得、5’位または/および6’位は非置換であるか、またはチオ-tert-ブチル基(SC(CH3)3)(およびその類似体);メチレンアミノ基(CH2NH2)(およびその類似体)またはシアノ基(CN)(およびその類似体)で置換されている。
いくつかの場合、修飾された核酸は、糖部分の修飾も含む。いくつかの場合、核酸は、糖基が修飾されている1つまたはそれを超えるヌクレオシドを含む。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の向上、結合親和性の増加、または何らかの他の有益な生物学的特性を付与し得る。ある特定の場合、核酸は、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学的に修飾されたリボフラノース環の例としては、置換基(5’および/または2’置換基を含む)の付加;2つの環原子を架橋して二環式核酸(BNA)を形成すること;リボシル環酸素原子をS、N(R)、またはC(R1)(R2)(R=H、C1~C12アルキルもしくは保護基)で置き換えること;およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合、修飾された核酸は、修飾された糖または糖類似体を含む。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシルまたはフラノシルの形態であり得る。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは2’-O-アルキルリボースのフラノシドであってもよく、糖は、[α]または[β]アノマー配置のいずれかでそれぞれの複素環塩基に結合することができる。糖修飾には、2’-アルコキシ-RNA類似体、2’-アミノ-RNA類似体、2’-フルオロ-DNA、および2’-アルコキシ-またはアミノ-RNA/DNAキメラが含まれるが、これらに限定されない。例えば、糖修飾は、2’-O-メチル-ウリジンまたは2’-O-メチル-シチジンを含み得る。糖修飾には、2’-O-アルキル置換デオキシリボヌクレオシドおよび2’-O-エチレングリコール様リボヌクレオシドが含まれる。これらの糖または糖類似体、およびそのような糖または類似体が複素環塩基(核酸塩基)に結合しているそれぞれの「ヌクレオシド」の調製は公知である。糖の修飾も行い、他の修飾と組み合わせてもよい。
糖部分に対する修飾には、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾ならびに修飾された修飾が含まれる。糖修飾には、2’位での以下の修飾が含まれるが、これらに限定されない:OH;F;O-、S-、もしくはN-アルキル;O-、S-、もしくはN-アルケニル;O-、S-、もしくはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルであり、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1~C10のアルキルまたはC2~C10のアルケニルおよびアルキニルであり得る。2’糖修飾には、O[(CH2)nO]mCH3,、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2、および-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(nおよびmは、1~約10である)も含まれるが、これらに限定されない。
2位での他の修飾には、C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール、O-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。同様の修飾は、糖の他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上または2’-5’連結オリゴヌクレオチド中の糖の3’位、および5’末端ヌクレオチドの5’位でも行うことができる。修飾された糖には、CH2およびSなどの架橋環酸素に修飾を含有するものも含まれる。ヌクレオチド糖類似体はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。
修飾された糖部分を有する核酸の例としては、5’-ビニル、5’-メチル(RまたはS)、4’-S、2’-F、2’-OCH3、および2’-O(CH2)2OCH3置換基を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。2’位での置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-(C1~C10アルキル)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、およびO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することもでき、各RmおよびRnは、独立して、Hまたは置換もしくは非置換のC1~C10アルキルである。
ある特定の場合、本明細書に記載される核酸は、1つまたはそれを超える二環式核酸を含む。特定のそのような場合、二環式核酸は、4’および2’のリボシル環原子間の架橋を含む。ある特定の場合、本明細書で提供される核酸は、架橋が4’~2’二環式核酸を含む1つまたはそれを超える二環式核酸を含む。そのような4’~2’二環式核酸の例としては、式:4’-(CH2)-O-2’(LNA);4’-(CH2)-S-2’;4’-(CH2)2-O-2’(ENA);4’-CH(CH3)-O-2’および4’-CH(CH2OCH3)-O-2’、ならびにそれらの類似体;4’-C(CH3)(CH3)-O-2’およびその類似体のうちの1つが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の場合、核酸は、連結された核酸を含む。核酸は、任意の核酸間連結を使用して一緒に連結することができる。核酸間連結基の2つの主要なクラスは、リン原子の有無によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエート(P=S)が含まれるが、これらに限定されない。代表的な非リン含有核酸間連結基には、メチレンメチルイミノ(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、チオジエステル(-O-C(O)-S-)、チオノカルバメート(-O-C(O)(NH)-S-);シロキサン(-O-Si(H)2-O-);およびN,N*-ジメチルヒドラジン(-CH2-N(CH3)-N(CH3))が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、キラル原子を有する核酸間連結は、別個のエナンチオマー、例えば、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして、ラセミ混合物として調製することができる。修飾された核酸は、単一の修飾を含有し得る。修飾された核酸は、1つの部分内または異なる部分間に複数の修飾を含有し得る。
核酸に対する骨格リン酸修飾には、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート(架橋または非架橋)、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、およびボラノリン酸が含まれるが、これらに限定されず、任意の組み合わせで使用することができる。他の非リン酸連結も使用することができる。
いくつかの場合、骨格修飾(例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間連結)は、修飾された核酸に免疫調節活性を付与し、かつ/またはインビボでそれらの安定性を増強することができる。
いくつかの場合、リン誘導体(または修飾されたホスホネート基)は、糖または糖類似体部分に結合しており、モノリン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであり得る。
いくつかの場合、骨格修飾は、ホスホジエステル連結をアニオン性、中性またはカチオン性基などの代替部分で置き換えることを含む。そのような修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結;N3’~P5’ホスホルアミダート修飾;ボラノリン酸DNA;プロオリゴヌクレオチド;メチルホスホネートなどの中性ヌクレオシド間連結;アミド連結DNA;メチレン(メチルイミノ)連結;ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結;スルホニル基を含有する骨格;モルホリノオリゴ;ペプチド核酸(PNA);および正に荷電したデオキシリボ核グアニジン(DNG)オリゴ(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry 8:1157-1179)。修飾された核酸は、1つまたはそれを超える修飾、例えば、リン酸連結の組み合わせ、例えばホスホジエステルおよびホスホロチオエート連結の組み合わせを含むキメラまたは混合骨格を含み得る。
リン酸の置換基には、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または1つもしくはそれを超える短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間連結が含まれる。これらには、(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される)モルホリノ連結を有するもの;シロキサン骨格;スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;アルケン含有骨格;スルファメート骨格;メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;ならびにN、O、SおよびCH2の混合成分を有する他のものが含まれる。ヌクレオチドの糖部分とリン酸部分との両方を、例えば、アミド型連結(アミノエチルグリシン)(PNA)によって置き換えられ得ることもヌクレオチド置換体において理解される。米国特許第5,539,082号;同第5,714,331号;および同第5,719,262号は、各々が参照により本明細書に組み込まれるPNA分子の作製および使用方法を教示している。Nielsenら、Science,1991,254,1497-1500を参照のこと。他の種類の分子(コンジュゲート)をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に結合させて、例えば細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結され得る。そのようなコンジュゲートには、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたは1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-S-H-ホスホン酸トリエチルアンモニウム(triethylammonium l-di-O-hexadecyl-rac-glycero-S-H-phosphonat)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの場合、本明細書に記載される少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、天然核酸分子と比較すると、ヌクレアーゼ、例えばリボヌクレアーゼなど、例えばRNase H、デオキシリボヌクレアーゼ、例えばDNase、またはエキソヌクレアーゼ、例えば5’-3’エキソヌクレアーゼおよび3’-5’エキソヌクレアーゼに対して耐性であり得る。いくつかの場合、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、または2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾体、LNA、ENA、PNA、HNA、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、2’-フルオロN3-P5’-ホスホロアミダイト、またはそれらの組み合わせは、ヌクレアーゼ、例えばリボヌクレアーゼなど、例えばRNase H、デオキシリボヌクレアーゼ、例えばDNase、またはエキソヌクレアーゼ、例えば5’-3’エキソヌクレアーゼおよび3’-5’エキソヌクレアーゼに対して耐性である。いくつかの場合、2’-O-メチル修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-アミノプロピル修飾核酸分子はヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-デオキシ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、T-デオキシ-2’-フルオロ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、LNA修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、ENA修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、HNA修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、モルホリノは、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、PNA修飾核酸分子は、ヌクレアーゼに耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、メチルホスホネートヌクレオチド修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、チオールホスホネートヌクレオチド修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、2’-フルオロN3-P5’-ホスホロアミダイトを含む核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性(例えば、RNase H、DNase、5’-3’エキソヌクレアーゼまたは3’-5’エキソヌクレアーゼ耐性)である。いくつかの場合、本明細書に記載される5’コンジュゲートは、5’-3’エキソヌクレアーゼ開裂を阻害する。いくつかの場合、本明細書に記載される3’コンジュゲートは、3’-5’エキソヌクレアーゼ開裂を阻害する。
更なる場合では、本明細書に記載される修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、その安定性を高めるために修飾される。いくつかの実施形態では、核酸分子はRNA(例えば、mRNA)である。いくつかの場合、mRNAは、その安定性を高めるために1つまたはそれを超える修飾によって修飾され得る。いくつかの場合、mRNAは、2’ヒドロキシルの位置で、例えば、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、もしくは2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾によって、またはロックドもしくは架橋リボース配座(例えば、LNAもしくはENA)によって修飾され得る。いくつかの場合、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、2’-O-メチルおよび/または2’-O-メトキシエチルリボースによって修飾される。いくつかの場合、少なくとも1つの修飾されたクレオチドまたはヌクレオチド類似体はまた、その安定性を高めるために、モルホリノ、PNA、HNA、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および/または2’-フルオロN3-P5’-ホスホロアミダイトを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、キラリティが純粋な(または立体的に純粋な)核酸分子である。いくつかの場合、キラリティが純粋な(または立体的に純粋な)核酸分子は、その安定性を高めるように修飾される。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのいずれか1つの少なくとも1つを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって翻訳されて、少なくとも1つの治療用ポリペプチドを得ることができる。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドによってコードされる治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞によって封入され得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、ナノエレクトロポレーションされたベクターによってコードされる治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドの両方を封入することができる。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームであり得る。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用化合物を含むことができる。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用化合物は、本明細書に記載される細胞外小胞表面タンパク質のいずれか1つによって複合体化または固定される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用化合物は細胞外小胞内にある。例示的な治療用化合物としては、がん薬物が挙げられる。本明細書に記載される組成物および方法で使用するための例示的な治療用化合物には、皮膚損傷(例えば、老化または日焼けによる損傷に起因する)および血流障害(例えば、虚血)を処置する治療用化合物が含まれる。
いくつかの態様では、平均で少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、細胞外小胞の混合物であって、混合物は、外因性VEGF mRNAの1~6個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む、細胞外小胞の混合物が記載される。いくつかの実施形態では、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、混合物は、冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって血流障害を処置することを含む、対象の血流障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、血流障害を処置することは、血行再建の少なくとも5%の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、血行再建における少なくとも5%の増加は、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射を介して、または冠動脈カテーテルを介して、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、静脈内、筋肉内または皮下注射は、少なくとも14ゲージのゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの実施形態では、血流障害は虚血である。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、VEGF mRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。
いくつかの態様では、平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、外因性細胞外マトリックスmRNAは、コラーゲン、COL1、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン、XI型コラーゲン、IX型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、X型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVII型コラーゲン、およびXVIIII型コラーゲンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、細胞外小胞の混合物であって、混合物は、外因性細胞外マトリックスmRNAの1~2個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む、細胞外小胞の混合物が記載される。いくつかの実施形態では、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。
いくつかの態様では、対象の皮膚損傷を処置する方法であって、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって対象の皮膚損傷を処置することを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、しわの外観の少なくとも10%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、皮下注射を介して、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、皮下注射は、少なくとも14のゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの実施形態では、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも6000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、トランスフェクションを介してVEGFをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、トランスフェクションを介して細胞外マトリックスタンパク質をコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、外因性細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、複数の細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、450個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、200個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.1~100個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、2000個のEVあたり、1000個のEVあたり、500個のEVあたり、400個のEVあたり、300個のEVあたり、200個のEVあたり、150個のEVあたり、100個のEVあたり、90個のEVあたり、80個のEVあたり、70個のEVあたり、60個のEV、50個のEV、40個のEVあたり、30個のEVあたり、20個のEVあたり、15個のEVあたり、10個のEVあたり、5個のEVあたり、2個のEVあたり、または1個のEVあたり、平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で少なくとも1、2、5、10、50、100、200、300、500、または1000個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で約1~10個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、EVあたり平均で約1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、30個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外マトリックスタンパク質をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって産生される。いくつかの場合、細胞のトランスフェクトすることは、細胞ナノポレーションによって行われる。いくつかの場合、細胞のトランスフェクトすることは、エレクトロポレーションによって行われる。いくつかの場合、細胞はヒト細胞である。いくつかの場合、細胞は、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、および新生児ヒト真皮線維芽細胞からなる群より選択される線維芽細胞である。いくつかの場合、細胞は接着細胞である。いくつかの場合、細胞はヒト真皮線維芽細胞(例えば、新生児ヒト真皮線維芽細胞)である。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体のうちの少なくともいずれか2つの混合物を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはそれらの任意の組み合わせを介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超える安定化剤および/または1つもしくはそれを超える保存剤を含む。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超えるDNAおよび/またはRNase阻害剤を含む。いくつかの場合、製剤は、1つもしくはそれを超えるDNAse、DNAse阻害剤、RNAseおよび/またはRNAse阻害剤を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×1013個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、1×1014個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×109個の細胞外小胞かつ最大で1×1020個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×101、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106の個の細胞外小胞かつ最大で1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1ngかつ最大で20μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも5ngかつ最大で30μgの細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、真皮細胞を標的とする。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、アミノペプチダーゼN、CD26/DPP4、線維芽細胞活性化タンパク質α、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、以下のmiRNA:hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325、またはhsa-miR-199b-5pのうちの1つまたはそれを超えるものを含まない。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径50nm~200nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径約100nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、直径約75~130nmにピークを有するサイズ分布を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径が20nm、30nm、50nm、75nm、または100nmを超える。いくつかの場合、細胞外小胞の少なくとも90%は、直径が20nm、30nm、50nm、75nm、または100nmを超える。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径50nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径30nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径20nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径10nm未満の細胞外小胞を含まない。いくつかの場合、細胞外小胞は、直径5nm未満の細胞外小胞を含まない。
いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも少なくとも2倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも少なくとも3倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも約3000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも約2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、同程度の数の天然に存在する細胞外小胞と比較して、以下のマーカー:CD9、CD63、TSG101、またはARF6のうちの少なくとも1つのより高いレベルを発現する。
いくつかの態様では、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を含む容器であって、容器が細胞をさらに含む、容器が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞の比率で容器中に存在する。
いくつかの態様では、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を含むニードルが本明細書に記載される。いくつかの場合、ニードルはマイクロニードルである。いくつかの場合、ニードルは中実である。いくつかの場合、ニードルはヒドロゲルニードルである。いくつかの場合、ニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、最大で1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を含むシリンジが本明細書に記載される。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、シリンジ内のヒアルロン酸に懸濁される。
いくつかの態様では、複数の細胞外小胞を含むヒドロゲルマイクロニードルが本明細書に記載される。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%、7%、10%、15%、または20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、1×1030、1×1030、1×1040、1×1050、1×1060、1×1070、1×1080、1×1090、または1×10100個以下の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×106~1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×1010~1×1014個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1×1013~1×1014個の細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、2mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、1mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000μmの長さを有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、100μm以下、200μm以下、300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、1000μm以下、1100μm以下、1200μm以下、1300μm以下、1400μm以下、1500μm以下、1600μm以下、1700μm以下、1800μm以下、1900μm以下または2000μm以下の長さを有する。他の場合では、ヒドロゲルマイクロニードルは、100μm~3000μm、500μm~2500μm、1000μm~2500μm、または1000μm~2000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ヒドロゲルマイクロニードルは、約1000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ヒドロゲルマイクロニードルは、約2000μmの長さを有する。
いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、10000μm以下、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm未満、1500μm未満、1000μm未満、900μm未満、800μm未満、700μm未満、600μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、または100μm未満の直径を有する基部を有する。いくつかの場合、ヒドロゲルマイクロニードルは、1つまたはそれを超えるmRNAカーゴがロードされた細胞外小胞を含む。
いくつかの態様では、複数の細胞外小胞を含むニードルが本明細書に記載され、細胞外小胞は少なくとも1つの細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であり、複数の細胞外小胞はI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのエキソソームを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つのアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1つの微小小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体のうちのいずれか2つの混合物を含む。
いくつかの場合、ニードルはマイクロニードルである。いくつかの場合、ニードルは中実である。いくつかの場合、ニードルはヒドロゲルニードルであり、必要に応じて、ニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、ニードルは、2mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、1mm未満の長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000μmの長さを有する。いくつかの場合、ニードルは、100μm以下、200μm以下、300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、1000μm以下、1100μm以下、1200μm以下、1300μm以下、1400μm以下、1500μm以下、1600μm以下、1700μm以下、1800μm以下、1900μm以下、または2000μm以下の長さを有する。他の場合では、ニードルは、100μm~3000μm、500μm~2500μm、1000μm~2500μm、または1000μm~2000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ニードルは、約1000μmの長さを有する。特定の実施形態では、ニードルは、約2000μmの長さを有する。
いくつかの場合、ニードルは、10000μm以下、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm未満、1500μm未満、1000μm未満、900μm未満、800μm未満、700μm未満、600μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、または100μm未満の直径を有する基部を有する。
COL1A1遺伝子は、プロアルファ1(I)鎖と呼ばれるI型コラーゲンの成分を産生する。この鎖は、別のプロアルファ1(I)鎖およびプロアルファ2(I)鎖(COL1A2遺伝子によって産生される)とも結合して、I型プロコラーゲンの分子を作製する。これらの三本鎖のロープ様プロコラーゲン分子は、酵素によってプロセシングされ得る。これらの分子が処理されると、それらは、細胞の周囲の空間で互いに架橋する細長いフィブリルに配列する。架橋は、非常に強い成熟I型コラーゲン線維の形成をもたらす。したがって、いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAの少なくとも1個のコピーが転写され、複数の細胞外小胞に曝露されている細胞内でプロアルファ1(I)鎖にアセンブルされる。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAの少なくとも1個のコピーは転写され、複数の細胞外小胞に曝露されている細胞内でI型プロコラーゲンにさらにアセンブルされる。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり平均で少なくとも10、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、10,000、15,000、30,000、50,000、80,000、100,000、150,000、300,000、500,000、700,000、1,000,000個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり平均で約10、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、10,000、15,000、30,000、50,000、80,000、100,000、150,000、300,000、500,000、700,000、1,000,000個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、本明細書に開示される細胞外小胞はエキソソームである。他の場合では、本明細書に開示される細胞外小胞は微小小胞である。他の場合では、本明細書に開示される細胞外小胞はアポトーシス小体である。他の場合では、本明細書に開示される細胞外小胞は、この段落で言及される任意の2つまたは3つの種類の組み合わせである。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、本明細書に開示される標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むニードルが、本明細書でさらに提供される。平均で少なくとも1個のコピーの内因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むニードルが、本明細書でさらに提供される。平均で少なくとも1個のコピーの内因性細胞外マトリックスmRNAおよび少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むニードルが、本明細書でさらに提供される。
いくつかの場合、ニードルはマイクロニードルである。いくつかの場合、ニードルはヒドロゲルを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。
平均で少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むシリンジが、本明細書でさらに提供される。平均で少なくとも1個のコピーの内因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むシリンジが、本明細書でさらに提供される。平均で少なくとも1個のコピーの内因性細胞外マトリックスmRNAおよび少なくとも1個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む複数の細胞外小胞を含むシリンジが、本明細書でさらに提供される。
いくつかの場合、シリンジは少なくとも34のゲージを有する。いくつかの場合、シリンジのゲージは10未満である。いくつかの場合、シリンジは、34、33、32、31、30、29、28、27、26、26s、25、25s、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10のゲージを有する。
いくつかの場合、シリンジ内の複数の細胞外小胞は、ヒアルロン酸に懸濁されている。
1個のコピーまたは2個のコピーの外因性細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含む、細胞外小胞の混合物が、本明細書でさらに提供される。いくつかの場合、混合物は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、本明細書に開示される混合物は、静脈内経路、筋肉内経路、または皮下経路による注射用に製剤化される。
細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生することが、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスタンパクをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックス mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、(c)ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックス mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書でさらに提供される。
いくつかの場合、ステップ(a)において、トランスフェクションは、図7Aに示されるように、細胞エレクトロポレーションを用いて行われる。いくつかの具体的な場合では、ステップ(a)において、トランスフェクションは、図7Aに示されるシリコンチップの表面にドナー細胞の単一層をプレーティングすることを含み、ベクターまたはプラスミドをドナー細胞にエレクトロポレーションするために、一定のパルスおよび持続時間を有する一定の電圧の電界が印加される。いくつかの更なる具体的な場合では、プレーティングは、前述のように一晩のインキュベーションを要する。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、少なくとも10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V、または1000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、約10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V、または1000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、最大で500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1500V、2000V、5000V、または10,000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルスは、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、または60である。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルスは、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200以下である。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルスは、約5、10、15、20、25、30、40、50、または60である。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルス間の間隔は、少なくとも0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s、または1sである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルス間の間隔は、約0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s、または1sである。
いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間後に行われる。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間後に行われる。
いくつかの態様では、マイクロニードルデバイスを製造する方法であって、本方法が、(a)細胞外小胞(EV)を重合性溶液の第1のバッチと混合することと、(b)(a)からの混合物を少なくとも1つのニードル様形状を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)鋳型に鋳造することとを含む、方法が本明細書に記載される いくつかの場合、(a)の混合は真空下で行われる。
いくつかの場合、本方法はさらに、PDMS鋳型の少なくとも1つのニードル様形状の先端にEVをさらに濃縮することを含む。いくつかの場合、濃縮することは、PDMS鋳型を高くとも10℃の温度に維持することによるものである。いくつかの場合、濃縮することは、PDMS鋳型を約4℃に維持することによるものである。いくつかの場合、濃縮は約2~約6時間持続する。
いくつかの場合、本方法はさらに、重合性溶液の第2のバッチをPDMS鋳型の上に添加することを含む。いくつかの場合、重合性溶液はヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、少なくとも1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、または1:100である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、または1:50以下である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、約1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、または1:40である。
いくつかの場合、EVは、外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、EVは、外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、組織内でI型コラーゲンのヘテロ二量体またはヘテロ三量体を産生する方法であって、本方法は、本明細書に開示される複数の細胞外小胞を組織に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、ヘテロ二量体またはヘテロ三量体は、少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A1)および少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A2)を含み、Col1A1は、本明細書に開示される複数の細胞外小胞によって外因的に送達される。いくつかの場合、Col1A2は組織に内在する。
いくつかの態様では、400個の細胞外小胞あたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む複数の細胞外小胞が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、または350個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり少なくとも1、2、5、10、20、25、30、35、30、50、60、70、90、または100個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり少なくとも1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、細胞外小胞あたり最大で1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、または1000個のコピーのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.001~100、0.01~100、または0.01~50個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約0.02~50個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。
いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。
いくつかの場合、混合物は、外因性VEGF mRNAの1~6個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、混合物は、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む。いくつかの場合、混合物は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、前述の混合物は、冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される。いくつかの場合、VEGF mRNAは、同一量の天然に存在する細胞外小胞中のVEGF mRNAのレベルよりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを含む。いくつかの場合、複数の細胞外小胞は、約1ng~200μgのVEGF mRNAを含む。
細胞外小胞による処置
いくつかの態様では、対象の皮膚症状を処置する方法であって、皮膚症状の処置を必要とする対象に少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを投与し、それによって皮膚症状を処置することを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であるが、I型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)ではない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの態様では、対象の皮膚症状を処置する方法であって、皮膚症状の処置を必要とする対象に少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを投与し、それによって皮膚症状を処置することを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAはコラーゲンをコードする。いくつかの場合、コラーゲンは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはII型コラーゲンである。いくつかの場合、コラーゲンはI型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)である。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A1であるが、I型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)ではない。いくつかの場合、コラーゲンはCol1A2である。いくつかの場合、外因性細胞外マトリックスmRNAは、プロアルファ1(I)鎖をコードするmRNAである。
いくつかの場合、皮膚症状は皮膚損傷である。いくつかの場合、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの場合、皮膚症状は創傷である。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、または500μg以下の細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~10μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10ng~10μg、10ng~1μg、50ng~1μg、100ng~1μg、または500ng~1μgの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約50ngの細胞外マトリックスmRNAを対象に投与することを含む。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAは、少なくとも1つの細胞外小胞(EV)に封入される。いくつかの場合、EVは、以下のmiRNA:hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325、またはhsa-miR-199b-5pのうちの1つまたはそれを超えるものを含まない。
いくつかの場合、少なくとも1つのEVはエキソソームである。いくつかの場合、少なくとも1つのEVは、アポトーシス小体または微小小胞である。いくつかの場合、少なくとも1つのEVは、エキソソーム、微小小胞および/またはアポトーシス小体のうちの少なくとも2つの混合物を含む。
いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす。いくつかの場合、しわの外観の少なくとも10%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから7~14日以内に起こる。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、しわの外観の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少をもたらす。いくつかの場合、しわの外観の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少は、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから7~14日以内に起こる。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、または80%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の約70%、80%、または90%の減少をもたらす。
いくつかの場合、皮膚症状を処置することは、皮膚損傷を処置することを含み、皮膚損傷を処置することは、皮膚症状を処置した後、少なくとも20日間、30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間、または100日間持続する皮膚損傷の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の減少は、総しわ数の減少、総しわ面積の減少、しわの外観の減少、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたはそれを超えるものである。
いくつかの場合、投与することは、皮下注射によるものである。いくつかの場合、皮下注射は、皮膚損傷または創傷の部位またはその付近で行われる。いくつかの場合、皮下注射は、少なくとも14のゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10のゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、28のゲージのニードルを用いて行われる。
いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に約1×107~1×1017、1×108~1×1016、1×109~1×1015個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に約1×1010~1×1014個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、複数回用量でまたは単回用量として投与される。例えば、皮膚症状が処置されるまで、細胞外小胞を対象に複数回投与することができる。他の場合では、単回用量は治療効果を達成するのに十分であり、したがって対象は単回用量の細胞外小胞のみを受け取ることができる。いくつかの場合、皮膚症状に対する治療効果を維持するために、単回用量を後の時期に繰り返す。いくつかの場合、皮膚症状に対する治療効果を維持するために、複数回用量レジメンを後の時期に繰り返す。いくつかの場合、治療効果は経時的に低下する。例えば、治療効果は、少なくとも30日後、少なくとも45日後、少なくとも60日後、少なくとも75日後、少なくとも90日後などに低下し得る。そのような場合、皮膚症状を処置するために、単回用量レジメンまたは複数回用量レジメンを対象に再び投与することができる。いくつかの場合、単回用量は、単回ニードルまたはシリンジなどの単一の容器で投与される。いくつかの場合、単回用量は、マイクロニードルデバイスを使用して投与され、デバイスの複数のマイクロニードルが単回用量を送達する。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスの少なくとも1つのマイクロニードルは、皮膚症状を処置するのに十分な用量の細胞外小胞を含有する。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回、対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも5,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む最大1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも5,000個の細胞外小胞を含む最大1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回、対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025または1×1030個の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも5,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む最大1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも5,000個の細胞外小胞を含む最大1用量で投与され、細胞外小胞の少なくとも一部は少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む。
いくつかの場合、組織は皮下組織である。いくつかの場合、組織は真皮である。Iいくつかの場合、組織は表皮である。いくつかの場合、組織は歯肉である。いくつかの場合、組織は唇である。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも6000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、対象の組織への細胞外マトリックスmRNAの投与後、対象の組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、対象の組織への細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞の投与後、対象の組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから72時間以内に、組織は、少なくとも200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、または5000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから約4日以内に、組織は、細胞外マトリックスタンパク質のピーク濃度を有する。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、少なくとも毎日、3日ごと、5日ごと、7日ごと、10日ごと、20日ごと、30日ごと、40日ごと、または50日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約10日ごと、20日ごと、30日ごと、40日ごと、または50日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約30日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約60日ごとに繰り返される。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約90日ごとに繰り返される。
いくつかの場合、本方法はさらに、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスmRNAに対応するベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞を産生するための培養培地中で十分な時間にわたってドナー細胞を培養することと、(c)培養培地から細胞外小胞を回収することとによって、少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生することを含む。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約8~24時間後に行われる。いくつかの場合、細胞外小胞は、ドナー細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞の比率で存在する。いくつかの場合、ドナー細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書に記載される細胞外小胞を含む治療有効量の組成物または医薬組成物を投与することによって対象の疾患を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、本明細書に記載される少なくとも1つの治療薬を含む。いくつかの場合、治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物またはその組み合わせを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、細胞外マトリックスRNA(例えば、コラーゲンもしくはエラスチン、またはコラーゲンとエラスチンとの混合物)またはVEGF RNA(例えば、VEGFA、またはVEGFの混合物)を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの標的化ポリペプチドと、本明細書に記載される少なくとも1つの治療薬とを含む。いくつかの場合、標的化ポリペプチドは、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせまたは断片を含む異種標的化ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインはそれぞれ、罹患細胞に関連する細胞表面マーカーに結合し、罹患細胞に結合すると、細胞外小胞は少なくとも1つの治療薬を罹患細胞に送達する。
いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みは、標的化ポリペプチドを含まない細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みと比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ポリペプチドを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の取り込みが増加した標的化された細胞は、組織の一部としての細胞(例えば、メラノサイトなどの皮膚細胞)である。
いくつかの場合、本開示に記載される治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を血流障害を有する対象に投与することによって血流障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、VEGF mRNAなどの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて対象における虚血を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、虚血は、脳虚血、虚血性心疾患、心筋虚血、心虚血、重症下肢虚血、腎虚血、急性腸間膜虚血、腸虚血、チアノーゼ、および壊疽からなる群より選択される。いくつかの場合、虚血組織に送達される治療用ポリヌクレオチドは、全長または短縮型タンパク質をコードするmRNAを含む。いくつかの場合、虚血組織に送達される治療用ポリヌクレオチドはVEGFタンパク質をコードする。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドの送達は、虚血組織の血行再建を刺激する。
いくつかの場合、本方法は、VEGF mRNAを含む細胞外小胞の単回用量を対象に投与することを含む。いくつかの場合、単回用量は、少なくとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018個のEVである。いくつかの場合、単回用量は、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023、1×1024、1×1025、1×1030、1×1040、1×1050、または1×1060個以下のEVである。いくつかの場合、単回用量は、約1×1010~1×1016個のEVである。いくつかの場合、単回用量は、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAである。いくつかの場合、単回用量は、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAである。いくつかの場合、単回用量は、約1ng~200μgのVEGF mRNAである。
いくつかの場合、本方法は、VEGF mRNAを含む細胞外小胞の複数回用量を対象に投与することを含む。いくつかの場合、複数回用量は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の頻度で一定期間にわたって投与される。いくつかの場合、複数回用量は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、少なくとも11週間、少なくとも12週間、少なくとも13週間、少なくとも14週間投与される。いくつかの場合、複数回用量の少なくとも1つは、少なくとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018個のEVである。いくつかの場合、複数回用量の少なくとも1つは、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023、1×1024、1×1025、1×1030、1×1040、1×1050、または1×1060個以下のEVである。いくつかの場合、複数回用量の少なくとも1つは、約1×1010~1×1016個のEVである。いくつかの場合、複数回用量の少なくとも1つは、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAである。いくつかの場合、複数回用量の少なくとも1つは、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAである。いくつかの場合、単回用量は、約1ng~200μgのVEGF mRNAである。
いくつかの場合、本開示に記載される治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を対象に投与することによって皮膚損傷を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて対象における日焼けによる損傷または加齢に伴う皮膚損傷を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、皮膚損傷はしわを含む。いくつかの場合、本開示に記載される細胞外小胞によって皮膚に送達される治療用ポリヌクレオチドでしわを処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、皮膚に送達される治療用ポリヌクレオチドは、全長または短縮型タンパク質をコードするmRNAを含む。いくつかの場合、皮膚に送達される治療用ポリヌクレオチドはECMタンパク質をコードする。いくつかの場合、皮膚に送達される治療用ポリヌクレオチドはI型コラーゲンをコードする。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドの送達は、損傷を受けた皮膚におけるしわの外観を低下させる。
いくつかの場合、疾患または症状の処置を必要とする対象に治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を投与することによって疾患または状態を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、例えば、静脈内注射を介して全身投与される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、例えば、筋肉内または皮下注射を介して局所投与される。
いくつかの場合、静脈内、筋肉内、または皮下注射は、皮下注射ニードルを用いて行われる。いくつかの場合、静脈内、筋肉内、または皮下注射は、少なくとも32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、または14のゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、静脈内、筋肉内、または皮下注射は、最大で14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32のゲージを有するニードルを用いて行われる。いくつかの場合、注射は、冠動脈カテーテルまたは冠静脈カテーテルなどの冠状カテーテルを介して行われる。いくつかの場合、注射は大血管カテーテルを介する。いくつかの場合、静脈内、筋肉内、または皮下注射は、28ゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、静脈内、筋肉内、または皮下注射は、14ゲージ以上のニードルを用いて行われる。いくつかの場合、心臓への送達(例えば心筋梗塞を処置するための心臓への送達)は、冠状カテーテル(例えば冠動脈カテーテルまたは冠静脈カテーテル)を介して達成される。いくつかの場合、脳卒中の処置のための送達(例えば虚血性脳卒中の処置のための送達または出血性脳卒中の処置のための送達)は、脳血管の1つの中のカテーテルを介して、または筋肉への直接の開心術注射を介して達成される。いくつかの場合、末梢動脈疾患を処置するための送達は、血管内へのカテーテルまたは筋肉内への直接注射を介して達成される。いくつかの場合、皮膚疾患または障害の処置のための送達(例えば皮膚潰瘍のための送達)は、皮下注射によって達成される。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、注射緩衝液を含む溶液または懸濁液中での注射による投与用に製剤化される。注射緩衝液は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、および/または25mMトレハロースPBSを含み得る。いくつかの場合、用量は、用量あたりに投与される細胞外小胞の数によって測定される。いくつかの場合、用量は、用量あたり約100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000、または1,000,000,000,000,000,000,000個の治療用ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。いくつかの場合、用量は、用量あたり約100~1,000,000,000,000,000,000,000個の治療用ポリペプチドを含む細胞外小胞、または用量あたり約1,000~100,000,000,000,000,000,000、または約10,000~10,000,000,000,000,000,000、または約100,000~1,000,000,000,000,000,000、または約1,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約10,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約100,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約1,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約10,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約100,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約1,000,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約10,000,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000、または約100,000,000,000,000~1,000,000,000,000,000,000個の治療用ポリペプチドを含む細胞外小胞を含む。いくつかの場合、用量は、用量あたりに投与される治療用ポリペプチドの量によって測定される。いくつかの場合、用量は、用量あたり約1ng~500μgの治療用ポリペプチドを含む。いくつかの場合用量は、用量あたり約10ng~100μgの治療用ポリペプチドを含む。いくつかの場合用量は、用量あたり約100ng~100μg、または約1μg~100μg、または約10μg~100μgの治療用ポリペプチドを含む。
いくつかの場合、疾患または症状の処置を必要とする対象に治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を投与することによって疾患または状態を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、毎日(daily)、毎日(every day)、1日おき、週に5日、週に1回、隔週、月に2週間、月に3週間、月に1回、月に2回、月に3回、またはそれよりも多く投与される。治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、2年、3年、またはそれより長い期間にわたって投与することができる。
対象の状態が改善する場合、投与される治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞の用量は、一定期間(「休薬日」)、一時的に減少させるか、または一時的に中断することができる。いくつかの場合、休薬期間の長さは、2日間~1年間の間で変動し、例として、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間、15日間、20日間、28日間、35日間、50日間、70日間、100日間、120日間、150日間、180日間、200日間、250日間、280日間、300日間、320日間、350日間、または365日間が挙げられる。休薬期間中の用量減少は、例として、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%を含めて、10%~100%であり得る。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞を必要とする対象に、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む有効量の細胞外小胞を、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、9週間に1回、10週間に1回、11週間に1回、12週間に1回、13週間に1回、14週間に1回、15週間に1回、16週間に1回、17週間に1回、18週間に1回、19週間に1回、20週間に1回、21週間に1回、22週間に1回、23週間に1回、24週間に1回、25週間に1回、26週間に1回、27週間に1回または28週間に1回投与することができる。
対象の疾患または状態の改善が起こったら、必要に応じて細胞外小胞の維持用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、症状の関数として、改善された疾患、障害または状態が維持されるレベルまで減少させることができる。
いくつかの場合、そのような量に対応する治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞の量は、疾患または状態の重症度、処置を必要とする対象または宿主の正体(例えば、重量)などの因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、例えば、投与される特定の細胞外小胞、投与経路、および処置される対象または宿主を含む事例を取り巻く特定の状況に従って当該技術分野で公知の方法で日常的に決定される。いくつかの場合、所望の用量は、好都合には、単回用量で、または同時に(または短期間にわたって)もしくは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、1日あたり2、3、4またはそれを超える部分用量として提示される。いくつかの場合、所望の用量は、単回用量で投与される。いくつかの場合、比較的高用量の細胞外小胞(例えば、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞)が単回用量で投与される。いくつかの場合、比較的高用量のエキソソーム(例えば、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個のエキソソーム)が単回用量で投与される。
いくつかの場合、投与量は、対象におけるグレード3またはグレード4の有害事象の発生または重症度によって少なくとも部分的に決定することができる。有害事象の非限定的な例としては、低体温症;ショック;徐脈;心室性期外収縮;心筋虚血;失神;出血;心房性不整脈;静脈炎;第2度房室(AV)ブロック;心内膜炎;心外膜液;末梢壊疽;血栓症;冠動脈障害;口内炎;悪心および嘔吐;肝機能検査異常;消化管出血;吐血;血性下痢;胃腸障害;腸穿孔;膵炎;貧血;白血球減少;白血球増加;低カルシウム血症;アルカリホスファターゼ増加;血中尿素窒素(BUN)増加;高尿酸血症;非タンパク質窒素(NPN)増加;呼吸性アシドーシス;傾眠;激越;ニューロパシー;妄想反応;痙攣;大発作;譫妄;喘息、肺水腫;過換気;低酸素症;喀血;低換気;気胸;散瞳;瞳孔障害;腎機能異常;腎不全;急性尿細管壊死;十二指腸潰瘍;腸壊死;心筋炎;上室性頻拍;視神経炎に続発する永久的または一過性な失明;一過性虚血発作;髄膜炎;脳浮腫;心膜炎;アレルギー性間質性腎炎;気管食道瘻;悪性高熱症;心停止;心筋梗塞;肺塞栓;脳卒中;肝不全または腎不全;自殺に至る重篤な鬱状態;肺水腫;呼吸停止;呼吸不全;白血球減少、血小板減少、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)増加、食欲不振、関節痛、背痛、悪寒、下痢、脂質異常症、疲労、発熱、インフルエンザ様症状、低アルブミン血症、リパーゼ増加、注射部位反応、筋肉痛、吐き気、寝汗、掻痒症、発疹、紅斑性発疹、黄斑丘疹、トランスアミナーゼ炎、嘔吐および脱力感が挙げられる。
個々の処置レジメンに関する変数の数は多く、これらの推奨値からかなり逸脱することも珍しくないため、上記の範囲は単なる示唆的なものに過ぎない。そのような投与量は、使用される化合物の活性、処置される疾患または状態、投与様式、個々の対象の要件、処置される疾患または状態の重症度、および実施者の判断に限定されないいくつかの変数に応じて変更される。
いくつかの場合、そのような処置レジメンの毒性および治療有効性は、限定されないが、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定される。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50とED50との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投与量を製剤化する際に使用される。そのような化合物の投与量は、最小の毒性でED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
いくつかの場合、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、少なくとも1回の用量で対象に投与される。いくつかの場合、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で対象に投与される。いくつかの場合、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を少なくとも100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000,1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000、または1,000,000,000,000,000,000,000個含む。
他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、少なくとも3用量/週、少なくとも4用量/週、少なくとも5用量/週、少なくとも6用量/週、少なくとも7用量/週、少なくとも8用量/週、少なくとも9用量/週、または少なくとも10用量/週で本明細書に開示される対象に投与される。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、20用量/週未満、19用量/週未満、18用量/週未満、17用量/週未満、16用量/週未満、15用量/週未満、14用量/週未満、13用量/週未満、12用量/週未満、11用量/週未満、または10用量/週未満で本明細書に開示される対象に投与される。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、1~10回の用量/週、2~9回の用量/週、3~8回の用量/週で本明細書に開示される対象に投与される。
いくつかの場合、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、1用量で対象に投与され、有効量は、少なくとも100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000,100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000、または1,000,000,000,000,000,000,000個の細胞外小胞である。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および任意要素の標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、1用量で対象に投与され、有効量は、少なくとも0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、または1μgのECM mRNAである。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および任意要素の標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、1用量で対象に投与され、有効量は、最大で50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、1μg、900ng、800ng、700ng、600ng、500ng、400ng、300ng、200ng、または100ngのECM mRNAである。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞の有効量が1用量で対象に投与され、有効量は、0.1ng~50μg、0.1ng~30μg、1ng~20μg、1ng~10μg、1ng~1μg、1ng~500ng、1ng~100ng、10ng~10μg、10ng~1μg、10ng~500ng、10ng~100ng、50ng~10μg、50ng~1μg、50ng~500ng、または50ng~100ngである。
他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、複数回用量で対象に投与され、各用量において有効量は、少なくとも100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000,100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000、または1,000,000,000,000,000,000,000個の細胞外小胞である。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および任意要素の標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、複数回用量で対象に投与され、各用量において有効量は、少なくとも0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、または1μgのECM mRNAである。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および任意要素の標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、複数回用量で対象に投与され、各用量において有効量は、最大で50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、1μg、900ng、800ng、700ng、600ng、500ng、400ng、300ng、200ng、または100ngのECM mRNAである。他の場合では、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞の有効量が複数回用量で対象に投与され、各用量において有効量は、0.1ng~50μg、0.1ng~30μg、1ng~20μg、1ng~10μg、1ng~1μg、1ng~500ng、1ng~100ng、10ng~10μg、10ng~1μg、10ng~500ng、10ng~100ng、50ng~10μg、50ng~1μg、50ng~500ng、または50ng~100ngである。有効量の細胞外小胞が複数回投与される場合、投与間の間隔は、少なくとも1日、5日、10日間、15日間、20日間、30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間、100日間、110日間、または120日間である。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。いくつかの具体的な場合では、組織は皮下組織である。いくつかの具体的な場合では、組織は真皮である。
いくつかの場合、対象の皮膚損傷を処置するために、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、有効量は、しわの外観の少なくとも50%の減少を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、しわの外観の少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%の減少を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約1、2、3、4、または5日以内にしわの外観の少なくとも50%の減少を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約6、7、8、9、または10日以内にしわの外観の少なくとも50%の減少を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約14日以内にしわの外観の少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%の減少を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約5日以内にしわの外観の少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%の減少を引き起こすのに十分である。
いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ数の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%をもたらす。いくつかの場合、皮膚損傷の処置は、総しわ面積の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%をもたらす。
いくつかの場合、対象の皮膚損傷を処置するために、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、有効量は、投与から約72時間以内に少なくとも6000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン)の組織濃度を生成するのに十分である。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与してから約4日以内に、組織は、細胞外マトリックスタンパク質のピーク濃度を有する。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、ほぼ毎日、1日ごと、5日ごと、10日ごと、20日ごと、30日ごと、40日ごと、50日ごと、60日ごと、70日ごと、80日ごと、90日ごと、または100日ごとに繰り返される。具体的な場合では、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することは、約30日ごとに繰り返される。
いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、皮下注射を介して、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの具体的な場合では、皮下注射は、皮膚損傷の部位またはその付近で行われる。いくつかの場合、皮下注射は、約32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、または14のゲージのニードルを用いて行われる。いくつかの場合、皮下注射は、少なくとも20、19、18、17、16、15、または14のゲージのニードルを用いて行われる。
いくつかの場合、皮膚損傷は老化によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は日焼けによる損傷によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は自己免疫疾患によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は火傷によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は瘢痕によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は皮膚疾患によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は皮膚弛緩型エーラス・ダンロス症候群によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は表皮水疱症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は偽合指症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は、創傷治癒不良によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は、指および手足の拘縮によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は角化症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は全身性硬化症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は強皮症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷はアトピー性皮膚炎によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は歯周病によって引き起こされる。
いくつかの場合、対象の皮膚損傷を処置する方法は、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生することを含み、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生することは、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスタンパクをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックス mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、(c)ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックス mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む。
いくつかの場合、ステップ(a)において、トランスフェクションは、図7Aに示されるように、細胞エレクトロポレーションを用いて行われる。いくつかの具体的な場合では、ステップ(a)において、トランスフェクションは、図7Aに示されるシリコンチップの表面にドナー細胞の単一層をプレーティングすることを含み、ベクターまたはプラスミドをドナー細胞にエレクトロポレーションするために、一定のパルスおよび持続時間を有する一定の電圧の電界が印加される。いくつかの更なる具体的な場合では、プレーティングは、前述のように一晩のインキュベーションを要する。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、少なくとも10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V、または1000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、約10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V、または1000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界の電圧は、最大で500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1500V、2000V、5000V、または10,000Vである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルスは、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、または60である。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルスは、約5、10、15、20、25、30、40、50、または60である。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルス間の間隔は、少なくとも0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s、または1sである。いくつかの更なる具体的な場合では、電界のパルス間の間隔は、約0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s、または1sである。
いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間後に行われる。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間後に行われる。
いくつかの場合、皮下注射を介して対象の皮膚損傷(例えば、日焼けによる損傷または加齢に伴う)を処置するために、ECM mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞が対象に投与される。
いくつかの場合、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が、少なくとも1回の用量で対象に投与される。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で対象に投与される。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞は、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を少なくとも100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000,1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000、または1,000,000,000,000,000,000,000個含む。
いくつかの場合、対象の血流障害を処置するために、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、有効量は、血行再建および/または血管新生の少なくとも50%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、血行再建および/または血管新生の少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約1、2、3、4、5、6、7、または8日以内に血行再建および/または新生血管形成の少なくとも50%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から約8日以内に血行再建および/または新生血管形成の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、または50%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から8日以内に血行再建および/または新生血管形成の少なくとも5%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から8日以内に血行再建および/または新生血管形成の約5%~10%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から8日以内に血行再建および/または新生血管形成の約5%~15%、または約5%~20%、または約5%~25%、または約5%~30%、または約5%~40%、または約5%~50%、または約5%~60%、または約5%~70%、または約5%~75%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から14日以内に血行再建および/または新生血管形成の少なくとも5%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から14日以内に血行再建および/または新生血管形成の約5%~10%の増加を引き起こすのに十分である。いくつかの場合、有効量は、投与から14日以内に血行再建および/または新生血管形成の約5%~15%、または約5%~20%、または約5%~25%、または約5%~30%、または約5%~40%、または約5%~50%、または約5%~60%、または約5%~70%、または約5%~75%の増加を引き起こすのに十分である。
いくつかの場合、対象の血流障害を処置するために、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む有効量の細胞外小胞が対象に投与される。いくつかの場合、有効量は、投与から約72時間以内に少なくとも6000pg/mlのVEGFタンパク質(例えば、VEGFA)の組織濃度を生成するのに十分である。
いくつかの場合、静脈内または筋肉内注射を介して対象の血流障害(例えば、虚血)を処置するために、VEGF mRNAを含む治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞が対象に投与される。
偽合指症、創傷治癒不良、または指および手足の拘縮のリスクの軽減を必要とする対象において、偽合指症、創傷治癒不良、または指および手足の拘縮のリスクを軽減する方法本明細書でさらに提供され、本方法は、有効量のCOL7A1 mRNAをロードしたEVを対象に投与することを含む。いくつかの場合、対象は、ジストロフィー性表皮水疱症を有する患者である。いくつかの場合、患者は小児患者である。いくつかの場合、投与することは、対象の手および/または足に対するものである。いくつかの場合、有効量のCol7A1 mRNAは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgのCol7A1 mRNAである。いくつかの場合、有効量のCol7A1 mRNAは、少なくとも1つの細胞外小胞に取り入れられる。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つのCol7A1 mRNAを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの細胞外小胞は、本明細書に記載されるニードル、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを介して注射される。
脱毛の予防、緩和、または処置を必要とする対象において、脱毛を予防、緩和、または処置する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、有効量のCol17a1 mRNAを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、対象の罹患頭皮に対するものである。いくつかの場合、有効量のCol17a1 mRNAは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgのCol17a1 mRNAである。いくつかの場合、有効量のCol17a1 mRNAは、1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、または150μg以下のCol17a1 mRNAである。いくつかの場合、有効量のCol17a1 mRNAは、少なくとも1つの細胞外小胞に取り入れられる。いくつかの場合、投与することは、細胞外小胞の投与を必要とする対象に少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、細胞外小胞の少なくとも一部は、少なくとも1つのCol17a1 mRNAを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの細胞外小胞は、本明細書に記載されるニードル、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを介して注射される。
掌蹠角化症の予防、緩和、または処置を必要とする対象において、掌蹠角化症を予防、緩和、または処置する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、有効量の生存ケラチンを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、対象の罹患した皮膚に対するものである。
ケロイド瘢痕の予防、緩和または処置を必要とする対象において、ケロイド瘢痕を予防、緩和または処置する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、TGF-β1、SMAD3およびEPHB2を減少させる有効量の阻害剤を対象に投与することを含む。
対象の唇に注射する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、少なくとも1つのコラーゲンmRNAを含む有効量のEVを対象に投与することを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのコラーゲンmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの場合、有効量のEVは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgのコラーゲンmRNAを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのコラーゲンmRNAを含む有効量のEVは、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、有効量のEVは、本明細書に記載されるニードル、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを介して注射される。
対象の歯肉に注射する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、少なくとも1つのコラーゲンmRNAを含む有効量のEVを対象に投与することを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのコラーゲンmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの場合、有効量のEVは、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgのコラーゲンmRNAを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのコラーゲンmRNAを含む有効量のEVは、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、有効量のEVは、本明細書に記載されるニードル、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを介して注射される。
有効量の任意のカーゴのEVを必要とする対象に、有効量の任意のカーゴのEVを投与する方法が、本明細書でさらに提供される。いくつかの場合、カーゴはマイクロRNA(miRNA)である。いくつかの場合、カーゴは低分子干渉RNA(siRNA)である。いくつかの場合、カーゴはペプチドである。いくつかの場合、カーゴはタンパク質である。いくつかの場合、カーゴは阻害性二本鎖RNA(dsRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、小さいまたは短いヘアピンRNA(shRNA)である。いくつかの場合、カーゴはアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。いくつかの場合、カーゴはpiwi相互作用RNA(piRNA)である。いくつかの場合、カーゴは異種核RNA(hnRNA)である。いくつかの場合、カーゴは核内低分子RNA(snRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、酵素的に調製されたsiRNA(esiRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、上記のカーゴのいずれかの前駆体である。いくつかの場合、カーゴは、上記の2つまたはそれを超えるカーゴの任意の組み合わせである。
マイクロニードルデバイスであって、マイクロニードルデバイスは、基材および複数のマイクロニードルを含み、複数のマイクロニードルは基材から突出し、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルが少なくとも1つの細胞外小胞(EV)を含む、マイクロニードルデバイスが本明細書にさらに記載される。
いくつかの場合、基材は、複数のマイクロニードルが取り付けられている表面を提供する。いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスは、基材と、複数のマイクロニードル以外の他のコンポーネントとを含む。いくつかの具体的な場合では、他のコンポーネントは、皮膚浸透および深さ、ならびに薬物送達および/または分布を改善するために添加される。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルは1つのマイクロニードルを含む。他の場合では、複数のマイクロニードルは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも10000、または少なくとも100000個のマイクロニードルを含む。いくつかの場合、基材の面積は、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200mm2である。いくつかの場合、基材の面積は、1000mm2未満、900mm2未満、800mm2未満、700mm2未満、600mm2未満、500mm2未満、400mm2未満、300mm2未満、200mm2未満である。いくつかの具体的な場合では、基材の面積は約169mm2である。
いくつかの場合、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり少なくとも0.1、少なくとも0.2、少なくとも0.3、少なくとも0.4、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、または少なくとも1マイクロニードルである。他の場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり100マイクロニードル未満、90マイクロニードル未満、80マイクロニードル未満、70マイクロニードル未満、60マイクロニードル未満、50マイクロニードル未満、40マイクロニードル未満、30マイクロニードル未満、20マイクロニードル未満、10マイクロニードル未満、9マイクロニードル未満、8マイクロニードル未満、7マイクロニードル未満、6マイクロニードル未満、5マイクロニードル未満、4マイクロニードル未満、3マイクロニードル未満、2マイクロニードル未満、または1マイクロニードル未満である。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.5マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.51マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.52マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.53マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.54マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.55マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.56マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.57マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.58マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.59マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.6マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.61マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.62マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.63マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.64マイクロニードルである。具体的な場合では、基材上の複数のマイクロニードルの密度は、基材1mm2あたり約0.65マイクロニードルである。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルは、基材上の単一の領域に配置される。他の場合では、複数のマイクロニードルは、基材上の複数の領域に配置される。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは、直線状の列に配置される。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは、円形に配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも2列に配置し、各列に少なくとも2個のマイクロニードルを配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも5列に配置し、各列に少なくとも2個のマイクロニードルを配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも10列に配置し、各列に少なくとも2個のマイクロニードルを配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも2列に配置し、各列に少なくとも5個のマイクロニードルを配置する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルを少なくとも2列に配置し、各列に少なくとも10個のマイクロニードルを配置する。いくつかの具体的な実施形態では、複数のマイクロニードルを10列に配置し、各列に10個のマイクロニードルを配置する。
いくつかの場合、基材は、複数のマイクロニードルと同じ材料で作られる。いくつかの場合、基材は、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせで作られる。他の場合では、基材は、複数のマイクロニードルとは異なる材料で作られる。いくつかの場合、基材は、ポリマー(例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン、またはポリエチレン)ステンレス鋼、合金、チタン、またはそれらの任意の組み合わせで作られる。いくつかの場合、基材は、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも1500、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも4500、または少なくとも5000の厚さである。いくつかの場合、基材は、円形に近い、円の扇形に近い、正方形に近い、長方形に近い、三角形に近い、五角形に近い、平行四辺形に近い、台形に近い、または多角形に近い。いくつかの場合、基材は、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満、1未満、0.9未満、0.8未満、0.7未満、0.6未満、0.5未満、0.4未満、0.3未満、0.2未満、または0.1未満のヤング率を有する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルの各マイクロニードルは、基材に取り付けられた基部を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、標的を穿刺することができる点を有する。具体的な場合では、点は、対象の角質層を穿刺することができる。具体的な場合では、点は、対象の表皮を穿刺することができる。具体的な場合では、点は、対象の真皮を穿刺することができる。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルは中実である。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは中空である。いくつかの場合、中空である複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、少なくとも0.05、少なくとも0.1、少なくとも0.15、少なくとも0.2、少なくとも0.25、少なくとも0.3、少なくとも0.35、少なくとも0.4、少なくとも0.45、少なくとも0.5、少なくとも0.55、少なくとも0.6、少なくとも0.65、少なくとも0.7、少なくとも0.75、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1、少なくとも1.5、少なくとも2、少なくとも2.5、または少なくとも3mmの内径を有する。いくつかの場合、中空である複数のマイクロニードルの最大で1つのマイクロニードルは、最大で0.05、最大で0.1、最大で0.15、最大で0.2、最大で0.25、最大で0.3、最大で0.35、最大で0.4、最大で0.45、最大で0.5、最大で0.55、最大で0.6、最大で0.65、最大で0.7、最大で0.75、最大で0.8、最大で0.9、最大で1、最大で1.5、最大で2、最大で2.5、最大で3mm、最大で4mm、最大で5mm、最大で6mm、最大で7mm、最大で8mm、最大で9mm、または最大で10mmの内径を有する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルはヒドロゲルを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは円錐形状を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは漏斗形状を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルはピラミッド形状を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルはテーパー形状を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、Makvandiら、Nano-Micro Letters volume 13,Article number:93(2021)に開示されているような形状を有する。
本明細書で提供される複数のマイクロニードルは、一般に、特定の長さの基部を有する少なくとも1つのマイクロニードルを有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、2000μm未満、1800μm未満、1500μm未満、1000μm未満、900μm未満、800μm未満、700μm未満、600μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、または100μm未満の直径を有する基部を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、少なくとも2000μm、少なくとも1800μm、少なくとも1500μm、少なくとも1000μm、少なくとも900μm、少なくとも800μm、少なくとも700μm、少なくとも600μm、少なくとも500μm、少なくとも400μm、少なくとも300μm、少なくとも200μm、少なくとも100μm、少なくとも10μm、または少なくとも1μmの直径を有する基部を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約100μm~約1000μm、約200μm~約900μm、約300μm~約800μm、約400μm~約700μm、約500μm~約600μmの直径を有する基部を含む。特定の実施形態では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000μmの直径を有する基部を含む。特定の実施形態では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約400μmの直径を有する基部を含む。
マイクロニードルデバイスの少なくとも1つのマイクロニードルは、特定のサイズの先端半径を有する。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスの少なくとも1つのマイクロニードルの先端半径は、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下である。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000μmである。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、100μm以下、200μm以下、300μm以下、400μm以下、500μm以下、600μm以下、700μm以下、800μm以下、900μm以下、1000μm以下、1100μm以下、1200μm以下、1300μm以下、1400μm以下、1500μm以下、1600μm以下、1700μm以下、1800μm以下、1900μm以下または2000μm以下である。他の場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、100μm~3000μm、500μm~2500μm、1000μm~2500μm、または1000μm~2000μmである。特定の実施形態では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは約1000μmである。特定の実施形態では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは約2000μmである。
複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、貫通させる標的組織の厚さに基づいて調整する必要がある。いくつかの場合、額が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.25~0.5mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.5~0.75mmである。いくつかの場合、眉間が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.25~0.5mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.5~0.75mmである。いくつかの場合、眼領域が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.25mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.25~0.5mmである。いくつかの場合、鼻が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.25mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.5mmである。いくつかの場合、頬骨が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.5mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.5~1.0mmである。いくつかの場合、唇領域が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.25mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも0.25~0.75mmである。いくつかの場合、頬または顎が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.5~1.0mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも1.0~2.0mmである。いくつかの場合、首が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.5~1.0mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも1.0~2.0mmである。いくつかの場合、胸部が標的組織である場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、薄い皮膚では少なくとも0.5~1.0mmであり、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルの長さは、厚い皮膚では少なくとも1.0~2.0mmである。
いくつかの実施形態では、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700μmである。他の実施形態では、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は、約100~2000μm、100~1500μm、100~1000μm、300~2000μm、300~1500μm、300~1000μm、500~2000μm、500~1500μm、500~1000μmである。具体的な場合では、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は約700μmである。他の具体的な場合では、複数のマイクロニードルのマイクロニードル間の中心間距離は約1000μmである。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、より強い内部支持およびより少ない破損をもたらす低アスペクト比を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルは、標的組織内に内容物を均一に分配する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、少なくとも3×102、少なくとも3×103、少なくとも3×104、少なくとも3×105、少なくとも3×106、少なくとも3×107、少なくとも3×108、少なくとも3×109、3×1010、3×1011、3×1012、3×1015、3×1020、または3×1030個のEVを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×102~3×1012、約3×103~3×1012、約3×104~3×1012、約3×105~3×1012、約3×106~3×1012、約3×107~3×1012、約3×106~3×1012、約3×107~3×1012、約3×108~3×1012、約3×109~3×1012、約3×1010~3×1012、または約3×1011~3×1012個のEVを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×102~3×1011、約3×103~3×1011、約3×104~3×1011、約3×105~3×1011、約3×106~3×1011、約3×107~3×1011、約3×106~3×1011、約3×107~3×1011、約3×108~3×1011、約3×109~3×1011、または約3×1010~3×1011個のEVを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×102~3×1010、約3×103~3×1010、約3×104~3×1010、約3×105~3×1010、約3×106~3×1010、約3×107~3×1010、約3×106~3×1010、約3×107~3×1010、約3×108~3×1010、または約3×109~3×1010個のEVを含む。他の場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×102~3×109、約3×103~3×109、約3×104~3×109、約3×105~3×109、約3×106~3×109、約3×107~3×109、約3×106~3×109、約3×107~3×109、または約3×108~3×109個のEVを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約3×102~3×108、約3×103~3×108、約3×104~3×108、約3×105~3×108、約3×106~3×108、約3×107~3×108、約3×106~3×108、または約3×107~3×108個のEVを含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードル中のEVはヒドロゲル中に懸濁している。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、最大で30、20、15、10、または5分で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約30、20、15、10、または5分で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、最大で60、50、または40分で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約60、50、または40分で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、最大で1、3、5、10、15、20、または24時間で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約1、3、5、10、15、20、または24時間で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、最大で1、3、5、7、9、14、21、または30日間で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、約1、3、5、7、9、14、21、または30日間で、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、ある種のタンパク質を含む。いくつかの場合、溶解性ゲルは、動物源由来の化合物を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは合成化合物を含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、組織に曝露したときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、表皮に曝露したときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、真皮に曝露したときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの具体的な例では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、皮下組織に曝露したときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、局所温度を少なくとも1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、または10℃上昇させたときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルは、局所温度を最大で15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、または10℃上昇させたときに、最大で50%、40%、30%、20%、または10%の破断強度保持率を有する。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードル中のEVは細胞外マトリックスmRNAを含む。具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードル中のEVは外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAまたは外因性細胞外マトリックスmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードル中のEVはVEGF mRNAを含む。具体的な場合では、複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードル中のEVは外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、VEGF mRNAまたは外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、マイクロニードルデバイスはsiRNAを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスはmiRNAを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、DNA、プラスミド、または他の核酸を含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まない小分子薬物を含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まない大きな高分子を含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まないインスリンを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まない成長ホルモンを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、ワクチンまたはその有効成分を含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まない受容体アゴニストを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むまたは含まない麻酔剤を含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、EVを含むもしくは含まないタンパク質またはペプチドを含む。
いくつかの場合、複数のマイクロニードルのすべてのマイクロニードルは、本明細書に開示されるEVを含む。他の場合では、複数のマイクロニードルの一部は本明細書に開示されるEVを含み、複数のマイクロニードルの他の部分はEVを含まない。具体的な場合では、複数のマイクロニードルの一部は本明細書に開示されるEVを含み、複数のマイクロニードルの他の部分はEVを含まない異なる物質を含む。いくつかの場合、異なる物質は、麻酔剤、治癒剤、皮膚の症状を改善するための成分、アロエ、またはそれらの任意の組み合わせである。具体的な場合では、麻酔剤は、リドカイン、プラモキシン、フェノール、プリロカイン、ベンゾカイン、ジブカイン、サリチル酸メチル、カプサイシン、酢酸亜鉛、テトラカイン、ヒドロコルチゾン、メントール、またはプリロカインである。具体的な場合では、治癒剤は、ビタミンC、アロエベラ(Aloe vera)からの抽出物、Hippophae rhamnoides(シーバックソーン)からの抽出物、Angelica sinensisからの抽出物、Catharanthus roseus(Vinca rosea)からの抽出物、または緑茶抽出物である。具体的な場合では、皮膚の症状を改善するための成分は、グリセリン、補酵素Q10(CoQ10)、セラミド、セチルステアリルアルコール、ワセリン、スクアレン、乳酸である。
マイクロニードルデバイスを製造する方法であって、本方法が、(a)細胞外小胞(EV)を重合性溶液の第1のバッチと混合するステップと、(b)ステップ(a)からの混合物を少なくとも1つのニードル様形状を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)鋳型に鋳造するステップとを含む、方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの場合、本方法はさらに、ステップ(b)の後にステップ(c)を含み、ステップ(c)は、PDMS鋳型の少なくとも1つのニードル様形状の先端にEVを濃縮することを含む。いくつかの具体的な場合では、濃縮することは、PDMS鋳型を最大で15℃、最大で14℃、最大で13℃、最大で12℃、最大で11℃、最大で10℃、最大で9℃、最大で8℃、最大で7℃、最大で6℃、最大で5℃、最大で4℃、最大で3℃、最大で2℃、最大で1℃、または最大で0℃の温度に維持することによるものである。いくつかの具体的な場合では、濃縮することは、PDMS鋳型を少なくとも6℃、少なくとも5℃、少なくとも4℃、少なくとも3℃、少なくとも2℃、少なくとも1℃、少なくとも0℃、少なくとも-1℃、少なくとも-2℃、少なくとも-3℃、少なくとも-4℃、少なくとも-5℃、少なくとも-6℃、少なくとも-7℃、少なくとも-8℃、または少なくとも-10℃の温度に維持することによるものである。具体的な場合では、濃縮することは、PDMS鋳型を約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃、または約10℃に維持することによるものである。1つの具体的な場合では、濃縮することは、PDMS鋳型を約4℃に維持することによるものである。いくつかの場合、濃度は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10時間持続する。いくつかの場合、濃度は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、または60時間以下持続する。いくつかの場合、濃縮することは、約1~約10、約2~約8、約2~約6、約2~約4、約3~約8、または約3~約6時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約1時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約2時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約3時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約4時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約5時間持続する。いくつかの場合、濃縮は約6時間持続する。
いくつかの場合、本方法はさらに、ステップ(c)の後にステップ(d)を含み、ステップ(d)は、重合性溶液の第2のバッチをPDMS鋳型の上に添加することを含む。
いくつかの場合、重合性溶液はヒドロゲルを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な場合では、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチと同じ組成を有する。いくつかの場合、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチとは異なる組成を有する。
本明細書に開示されるヒドロゲルは、β-(1→4)とβ-(1→3)とのグリコシド結合を介して交互に連結されたD-グルクロン酸およびN-アセチル-D-グルコサミンの二糖単位の繰り返しからなる一定のパーセンテージのヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも35%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、または約35%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチと同じパーセンテージのヒアルロン酸を有する。いくつかの場合、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチとは異なるパーセンテージのヒアルロン酸を有する。いくつかの具体的な場合では、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチからのヒアルロン酸のパーセンテージがより高い。他の具体的な場合では、重合性溶液の第2のバッチは、重合性溶液の第1のバッチよりも低いパーセンテージのヒアルロン酸を有する。
いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、少なくとも1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、または1:100である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、または1:50以下である。いくつかの場合、EVと重合性溶液との最終的な比率は、約1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、または1:100である。具体的な場合では、EVと重合性溶液との最終的な比率は、約1:21、1:22、1:23、1:24、または1:25である。
いくつかの場合、マイクロニードルデバイスの製造方法で使用されるEVは、細胞外マトリックスmRNAを含む。具体的な場合では、マイクロニードルデバイスの製造方法で使用されるEVは、外因性細胞外マトリックスmRNAを含む。いくつかの場合、細胞外マトリックスmRNAまたは外因性細胞外マトリックスmRNAは、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の場合では、マイクロニードルデバイスの製造方法で使用されるEVは、VEGF mRNAを含む。具体的な場合では、マイクロニードルデバイスの製造方法で使用されるEVは、外因性VEGF mRNAを含む。いくつかの場合、VEGF mRNAまたは外因性VEGF mRNAは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
細胞外小胞(EV)の投与を必要とする対象の組織に細胞外小胞(EV)を投与する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを適用することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。
いくつかの実施形態では、適用することは、外部ポンプを必要としない。他の実施形態では、適用することは、予め設定された圧力を有する機械の助けを借りて行われる。いくつかの実施形態では、適用することは、手動で行われる。いくつかの実施形態では、適用することは、組織の特定の部分において手動で、かつ組織の他の部分において予め設定された圧力を有する機械の助けを借りて行われる。
本明細書に開示されるマイクロニードルデバイス中のマイクロニードルはそれ自体で溶解し、EVを組織に放出するので、投与することの最後に、マイクロニードルデバイスは除去される。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60分後に除去される。手順を無菌に保つために、いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを適用する前に組織は消毒される。他の場合では、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを適用した後に組織は消毒される。
いくつかの場合、組織は表皮である。いくつかの場合、組織は真皮である。いくつかの場合、組織は皮下組織である。いくつかの場合、対象はげっ歯類である。他の場合では、対象は哺乳動物である。いくつかの具体的な場合では、対象はモルモットである。いくつかの具体的な場合では、対象はサルである。いくつかの具体的な場合では、対象はモルモットである。いくつかの具体的な場合では、対象はウサギである。いくつかの具体的な場合では、対象はヒトである。
いくつかの場合、投与することは、高投与量のEVで1回行われる。いくつかの具体的な場合では、高投与量のEVは、少なくとも1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020、1025、1030、または1035個のEVである。いくつかの場合、高投与量のEVは、約1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020、1025、1030、または1035個のEVである。他の場合では、投与することは、低投与量のEVで一定期間にわたって複数回行われる。いくつかの具体的な場合では、低投与量のEVは、最大で10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、または1015個のEVである。いくつかの具体的な場合では、投与することは、少なくとも3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、または30日間にわたって複数回行われる。いくつかの具体的な場合では、投与することは、約3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、1.5ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、または6ヶ月間にわたって複数回行われる。いくつかの場合、投与することが一定期間にわたって複数回行われる場合、用量間の間隔は、少なくとも1日間、5日間、10日間、15日間、20日間、30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、または80日間である。
いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを用いてEVを投与する方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりもEVの破損を少なくする。いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを用いてEVを投与する方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも、組織内のEVのより均一な分布をもたらす。いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを用いてEVを投与する方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも投与部位での刺激が少ない。上記の場合、従来のマイクロニードルは、中実または中空のマイクロニードルである。
皮膚損傷の処置を必要とする対象における皮膚損傷を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示される細胞外マトリックスmRNAを含有するマイクロニードルデバイスを適用することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの場合、皮膚損傷は老化によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は日焼けによる損傷によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は自己免疫疾患によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は火傷によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は瘢痕によって引き起こされる。他の場合では、皮膚損傷は皮膚疾患によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は皮膚弛緩型エーラス・ダンロス症候群によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は表皮水疱症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は偽合指症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は、創傷治癒不良によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は、指および手足の拘縮によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は角化症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は全身性硬化症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は強皮症によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷はアトピー性皮膚炎によって引き起こされる。いくつかの具体的な場合では、皮膚損傷は歯周病によって引き起こされる。
いくつかの場合、皮膚損傷を処置する方法は、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす。他の場合では、皮膚損傷を処置する方法は、より多くのコラーゲン線維をもたらす。他の場合では、真皮損傷を処置する方法は、より高い真皮厚さをもたらす。
いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスで皮膚損傷を処置する方法は、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、または少なくとも90日間の長期効果をもたらす。いくつかの場合、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスで皮膚損傷を処置する方法は、約30日間、約40日間、約50日間、約60日間、約70日間、約80日間、または約90日間の長期効果をもたらす。
いくつかの場合、本明細書に記載される皮膚損傷を処置する方法は、本明細書に開示される対象に、12ヶ月あたり少なくとも1回の用量、11ヶ月あたり少なくとも1回の用量、10ヶ月あたり少なくとも1回の用量、9ヶ月あたり少なくとも1回の用量、8ヶ月あたり少なくとも1回の用量、7ヶ月あたり少なくとも1回の用量、6ヶ月あたり少なくとも1回の用量、5ヶ月あたり少なくとも1回の用量、4ヶ月あたり少なくとも1回の用量、3ヶ月あたり少なくとも1回の用量、または2ヶ月あたり少なくとも1回の用量で投与することを含む。他の場合では、本明細書に記載される皮膚損傷を処置する方法は、本明細書に開示される対象に、1週間あたり最大で1回の用量、2週間あたり最大で1回の用量、3週間あたり最大で1回の用量、4週間あたり最大で1回の用量、ひと月あたり最大で1回の用量で投与することを含む。他の場合では、本明細書に記載される皮膚損傷を処置する方法は、本明細書に開示される対象に、ひと月あたり約1回の用量、2ヶ月あたり約1回の用量、または3ヶ月あたり約1回の用量で投与することを含む。
偽合指症、創傷治癒不良、または指および手足の拘縮のリスクの軽減を必要とする対象において、偽合指症、創傷治癒不良、または指および手足の拘縮のリスクを軽減する方法本明細書でさらに提供され、本方法は、有効量のCOL7A1 mRNAをロードしたEVを含有する本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスを用いて対象に投与することを含む。いくつかの場合、対象は、ジストロフィー性表皮水疱症を有する患者である。いくつかの場合、投与することは、対象の手および/または足に対するものである。
掌蹠角化症の予防、緩和、または処置を必要とする対象において、掌蹠角化症を予防、緩和、または処置する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、有効量の生存ケラチンを対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスを使用することを含む。いくつかの場合、投与することは、対象の罹患した皮膚に対するものである。
ケロイド瘢痕の予防、緩和または処置を必要とする対象において、ケロイド瘢痕を予防、緩和または処置する方法が本明細書でさらに提供され、本方法は、TGF-β1、SMAD3およびEPHB2を減少させる有効量の阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスを使用することを含む。
それを必要とする対象に、任意のカーゴのEVを含有する本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスを投与する方法が、本明細書でさらに提供される。いくつかの場合、カーゴはマイクロRNA(miRNA)である。いくつかの場合、カーゴは低分子干渉RNA(siRNA)である。いくつかの場合、カーゴはペプチドである。いくつかの場合、カーゴはタンパク質である。いくつかの場合、カーゴは阻害性二本鎖RNA(dsRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、小さいまたは短いヘアピンRNA(shRNA)である。いくつかの場合、カーゴはアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。いくつかの場合、カーゴはpiwi相互作用RNA(piRNA)である。いくつかの場合、カーゴは異種核RNA(hnRNA)である。いくつかの場合、カーゴは核内低分子RNA(snRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、酵素的に調製されたsiRNA(esiRNA)である。いくつかの場合、カーゴは、上記のカーゴのいずれかの前駆体である。いくつかの場合、カーゴは、上記の2つまたはそれを超えるカーゴの任意の組み合わせである。
血流障害の処置を必要とする対象における皮膚損傷を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるVEGF mRNAを含有するマイクロニードルデバイスを適用することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの具体的な場合では、血流障害は虚血である。
いくつかの態様では、細胞外小胞(EV)を対象の組織に投与する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを対象の組織に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、少なくとも5、10、15、20、25、または30分後に除去される。いくつかの場合、マイクロニードルデバイスは、約10、15、20、または30分後に除去される。
いくつかの場合、EVは、少なくとも1つのmRNAを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも1ng、10ng、50ng、100ng、1μg、10μg、または20μgの少なくとも1つのmRNAを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~10μgの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを対象の組織に投与することを含む
いくつかの場合、組織は皮下組織である。いくつかの場合、組織は真皮である。いくつかの場合、組織は表皮である。いくつかの場合、組織は歯肉である。いくつかの場合、組織は唇である。いくつかの場合、対象は哺乳動物である。いくつかの場合、対象はヒトである。いくつかの場合、対象はげっ歯類である。いくつかの場合、対象はサルである。いくつかの場合、対象はウサギである。
いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、6~8週間以内に最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは一定期間にわたって複数回行われ、最大で1×107個、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、または1×1020個、1×1030個の細胞外小胞が投与される。
いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりもEVの破損を少なくする。いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも投与部位での刺激が少なくなる。いくつかの場合、本方法は、従来のマイクロニードルまたはシリンジでEVを投与するよりも、組織内のEVのより均一な分布をもたらす。いくつかの場合、従来のマイクロニードルは、中実マイクロニードルまたは中空マイクロニードルである。
いくつかの態様では、皮膚症状の処置を必要とする対象の皮膚症状を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示されるニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを対象に適用することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、本明細書に開示されるマイクロニードルを対象に投与することを含む。
いくつかの場合、皮膚症状は皮膚損傷である。いくつかの場合、皮膚損傷は、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる。いくつかの場合、皮膚症状は創傷である。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、または10μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、または900μg以下の細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約0.1ng~50μg、1ng~50μg、1ng~30μg、1ng~25μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1ng~20μgの細胞外マトリックスmRNAを投与することを含む。
いくつかの場合、本方法は、しわの外観の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の減少をもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%超のコラーゲン線維をもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%高い真皮厚さをもたらす。いくつかの場合、本方法は、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、または少なくとも90日間の長期効果をもたらす。
いくつかの場合、マイクロニードルデバイスのニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルはヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、約15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、少なくとも5%のヒアルロン酸かつ最大で30%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で20%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で15%のヒアルロン酸を含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、10%を超えるヒアルロン酸かつ最大で18%のヒアルロン酸を含む。
いくつかの場合、投与することは単回行われ、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは単回行われ、最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、または1×1014個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、または1×1030個の細胞外小胞が投与される。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、毎回最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは複数回行われ、6~8週間以内に最大で1×1013~14個の細胞外小胞を投与する。いくつかの場合、投与することは一定期間にわたって複数回行われ、最大で1×107個、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1017、1×1018、1×1019、または1×1020個、1×1030個の細胞外小胞が投与される。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与し、それによって血流障害を処置することを含む、対象の血流障害を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、血流障害を処置することは、血行再建の少なくとも5%の増加をもたらす。いくつかの場合、血行再建における少なくとも5%の増加は、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与から14日以内に起こる。
いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞の投与することは、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射を介して、または冠動脈カテーテルを介して、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することを含む。いくつかの場合、静脈内、筋肉内または皮下注射は、少なくとも14ゲージのゲージを有するニードルを用いて行われる。
いくつかの場合、血流障害は虚血である。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも1回の用量で投与される。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、VEGF mRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む。いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞は、少なくとも2回の用量で投与される。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015または1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023または1×1024個以下のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×105~1×1020、1×106~1×1019、1×107~1×1018、1×108~1×1017または1×109~1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×1010~1×1016個のEVを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを単回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを単回投与することを含む。
いくつかの場合、投与することは、少なくとも1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015または1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020、1×1021、1×1022、1×1023または1×1024個以下のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×105~1×1020、1×106~1×1019、1×107~1×1018、1×108~1×1017または1×109~1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、約1×1010~1×1016個のEVを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを複数回および毎回投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、または1000μg以下のVEGF mRNAを複数回および毎回投与することを含む。
いくつかの場合、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象に投与することが、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を対象の組織に投与することを含む。いくつかの場合、投与することは、VEGF mRNAを含む細胞外小胞をロードしたマイクロニードルを使用して行われる。
いくつかの場合、マイクロニードルはヒドロゲルを含む。いくつかの場合、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で対象に投与される。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回、対象に投与される。
いくつかの態様では、VEGF mRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、(a)トランスフェクションを介してVEGFをコードするベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入する細胞外小胞の産生のために十分な時間、ドナー細胞をインキュベートすることと、(c)ベクターまたはプラスミドから転写されたVEGF mRNAを封入している細胞外小胞を回収することとを含む方法が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、血流障害の処置を必要とする対象の血流障害を処置する方法であって、本方法は、本明細書に開示される細胞外小胞を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、血流障害は虚血である。
細胞外小胞の産生
細胞外小胞の産生
いくつかの態様では、(a)トランスフェクションを介して細胞外マトリックスmRNAに対応するベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、(b)ベクターまたはプラスミドから転写された少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞を産生するための培養培地中で十分な時間にわたってドナー細胞を培養することと、(c)培養培地から細胞外小胞を回収することとを含む、細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、ステップ(c)において、細胞外小胞の回収は、トランスフェクションの約8~24時間後に行われる。いくつかの場合、ベクターまたはプラスミドから転写された細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞は、ドナー細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞のレベルで存在する。いくつかの場合、ドナー細胞は、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合、治療用ポリペプチド、治療用化合物、癌薬物、標的化ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む細胞外小胞を産生する方法およびシステムが本明細書に記載される。
いくつかの場合、本方法は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内に導入することを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内に導入された少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの標的化ポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの異種標的化ドメインをコードする。
いくつかの場合、少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドが細胞外ドナー細胞に導入され、細胞外小胞ドナー細胞に導入された第1の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドまたは少なくとも1つの治療用ポリペプチドをコードする第1のベクターを含む。いくつかの場合、第2の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの標的化ポリペプチドまたは腫瘍標的化ポリペプチドをコードする第2のベクターを含む。
いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入することができる。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって本明細書に記載される細胞内に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、生物学的、化学的または物理的方法によって細胞内に移入することができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される任意の種類の細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外ドナー細胞は有核細胞であり得る。
目的の異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための生物学的方法は、DNAまたはRNAベクターの使用を含み得る。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を非ヒト哺乳動物細胞内に挿入するための最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、いくつかの場合、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来する。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター(HSV)が挙げられる。いくつかの場合、レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV、MMLV、MuLV、もしくはMLV)またはマウス幹細胞ウイルス(MSCV)ゲノムに由来するベクターなどのガンマ-レトロウイルスベクターが挙げられる。いくつかの場合、レトロウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムに由来するものなどのレンチウイルスベクターも挙げられる。いくつかの場合、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9血清型を含む。いくつかの場合、ウイルスベクターは、2つまたはそれを超えるウイルスからのウイルス部分を含むキメラウイルスベクターである。更なる例では、ウイルスベクターは組換えウイルスベクターである。
異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための化学的方法としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系であって、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含むものを挙げることができる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化されたナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチドの送達など、核酸の最先端の標的化された送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)内への核酸の導入のために、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合している。脂質と会合した核酸は、いくつかの場合、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体化し、脂質を含有する溶液中に分散し、脂質と混合し、脂質と組み合わさり、脂質中に懸濁物として包含され、ミセルに包含されるかもしくはミセルと複合体化し、または他の方法で脂質と会合する。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、いくつかの場合、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造で存在する。あるいは、それらは単に溶液中に散在し、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する場合もある。脂質は、いくつかの場合、天然に存在する脂質または合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に適した脂質は、商業的供給元から入手される。例えば、いくつかの場合、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma社(ミズーリ州セントルイス在)から入手され、いくつかの場合、リン酸ジセチル(「DCP」)は、K&K Laboratories社(ニューヨーク州プレインビュー在)から入手され、コレステロール(「Choi」)は、いくつかの場合、Calbiochem-Behring社から入手され、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、多くの場合、Avanti Polar Lipids,Inc.社(アラバマ州バーミンガム)から入手される。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、多くの場合、約-20℃で保存される。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、多くの場合、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とする。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再編成(self-rearrangement)を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質とを捕捉する。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、いくつかの場合、ミセル構造をとるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する。lipofectamine-核酸複合体も企図される。
異種ポリヌクレオチドを細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃(particle bombardment)、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理または化学的浸透を挙げることができる。エレクトロポレーションとしては、マイクロフルイディクスエレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションが挙げられる。ある特定の場合、細胞外小胞ドナー細胞は、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたは少なくとも1つのベクターは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、基材(substrate)の表面に結合させることができる。いくつかの場合、基材はバイオチップを含む。いくつかの場合、基材の表面は金属材料を含む。いくつかの場合、基材は金属材料を含む。金属材料の非限定的な例としては、アルミニウム(Al)、インジウムスズ酸化物(ITO、In2O3:SnO2)、クロム(Cr)、ガリウムヒ素(GaAs)、金(Au)、モリブデン(Mo)、有機残留物およびフォトレジスト、白金(Pt)、ケイ素(Si)、二酸化ケイ素(SiO2)、シリコンオンインシュレータ(SOI)、窒化ケイ素(Si3N4)タンタル(Ta)、チタン(Ti)、窒化チタン(TiN)、タングステン(W)が挙げられる。いくつかの場合、金属材料を処理またはエッチングしてアレイまたはチャネルを作製することができる。いくつかの場合、金属表面は、リン酸(H3PO4)、酢酸、硝酸(HNO3)、水(H2O)、塩酸(HCl)、(HNO3)、硝酸セリウムアンモニウム((NH4)2Ce(NO3)6、クエン酸(C6H8O7)、過酸化水素(H2O2)、王水、ヨウ素溶液、硫酸(H2SO4)、フッ化水素酸(HF)、水酸化カリウム(KOH)、エチレンジアミンピロカテコール(EDP)、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)、緩衝酸化物、フッ化アンモニウム(NH4F)、SC1、Cl2、CCl4、SiCl4、BCl3、SiCl4、BCl3、CCl2F2、CF4、O2、CF4、SF6、NF3、CHF3、またはそれらの組み合わせで処理またはエッチングすることができる。
いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ABS、ポリアミド、ポリエチレンコポリマー、エポキシ、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、フェノール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンコポリマー、フッ素化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、シリコーン、天然ゴム、ラテックス、ポリウレタン、スチレンブタジエンゴム、フルオロカーボンコポリマーエラストマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアリールエーテルケトン、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、PBT、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリテトラフルオロエチレン、酸化ベリリウムなどのポリマー製の基質の表面に結合させることができる。いくつかの場合、ポリマー製の表面は、半透性であり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm~約10μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm~約0.03μm、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.2μm、約0.01μm~約0.3μm、約0.01μm~約0.4μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約3μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.03μm~約0.05μm、約0.03μm~約0.1μm、約0.03μm~約0.2μm、約0.03μm~約0.3μm、約0.03μm~約0.4μm、約0.03μm~約0.5μm、約0.03μm~約1μm、約0.03μm~約3μm、約0.03μm~約5μm、約0.03μm~約10μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.2μm、約0.05μm~約0.3μm、約0.05μm~約0.4μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約3μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.1μm~約0.2μm、約0.1μm~約0.3μm、約0.1μm~約0.4μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約3μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.2μm~約0.3μm、約0.2μm~約0.4μm、約0.2μm~約0.5μm、約0.2μm~約1μm、約0.2μm~約3μm、約0.2μm~約5μm、約0.2μm~約10μm、約0.3μm~約0.4μm、約0.3μm~約0.5μm、約0.3μm~約1μm、約0.3μm~約3μm、約0.3μm~約5μm、約0.3μm~約10μm、約0.4μm~約0.5μm、約0.4μm~約1μm、約0.4μm~約3μm、約0.4μm~約5μm、約0.4μm~約10μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約3μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約1μm~約3μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、約3μm~約5μm、約3μm~約10μm、または約5μm~約10μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm、約0.03μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.2μm、約0.3μm、約0.4μm、約0.5μm、約1μm、約3μm、または約5μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、または約5μmの間であり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、最大で約0.03μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.2μm、約0.3μm、約0.4μm、約0.5μm、約1μm、約3μm、約5μm、または約10μmの間であり得る。
いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ナノエレクトロポレーション
ナノエレクトロポレーション
いくつかの場合、金属表面またはポリマー表面に成長または付着した細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるバイオチップなどの金属表面またはポリマー表面に成長または付着させることができる。いくつかの場合、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるバイオチップなどの金属表面またはポリマー表面に単層で成長または付着させることができる。いくつかの場合、システムは、上側境界および下側境界を有する流体チャンバを備える。流体チャンバ内に細胞外小胞ドナー細胞を有する基質を配置することにより、上側チャンバおよび下側チャンバが形成される。いくつかの場合、システムはさらに少なくとも1つのナノチャネルを含む。いくつかの場合、ナノチャネルを基質内に埋め込むことができる。いくつかの場合、ナノチャネルは半透性ポリマー基質の細孔を含む。
いくつかの場合、本明細書に記載される異種ポリヌクレオチドで成長または付着させ、ナノエレクトロポレートした細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞(例えば、エキソソーム)のハイスループット産生をもたらし得る。いくつかの場合、エキソソームのそのようなハイスループット産生は、複数の(例えば、1よりも大きい、2よりも大きい、3よりも大きい、5よりも大きい、10よりも大きい、またはそれを超える数の)バイオチップ(例えば、CNPバイオチップ)の使用を含み得る。いくつかの場合、CNPバイオチップは、少なくとも1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、100cm、またはそれを超える幅を含む。いくつかの場合、CNPバイオチップは、少なくとも1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、100cm、またはそれを超える長さを含む。いくつかの場合、バイオチップは1cm×1cmの寸法を含む。いくつかの場合、バイオチップは、1cm×2cm、1cm×3cm、1cm×5cm、1cm×10cm、2cm×1cm、2cm×2cm、2cm×3cm、2cm×5cm、2cm×10cm、3cm×1cm、3cm×2cm、3cm×3cm、3cm×5cm、3cm×10cm、5cm×1cm、5cm×2cm、5cm×3cm、5cm×5cm、5cm×10cm、10cm×1cm、10cm×2cm、10cm×3cm、10cm×5cm、または10cm×10cmの例示的な寸法を含み得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞のナノエレクトロポレーションは、ナノチャネルエレクトロポレーション(CNP)と、それに続く、細胞外小胞を回収するための1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、またはそれよりも長い期間にわたる、非エレクトロポレーション細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞の回収とを含むサイクルを含み得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、CNPの1サイクル、2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクル、6サイクル、7サイクル、8サイクル、9サイクル、10サイクルまたはそれを超えるサイクルの間、細胞外小胞を産生および分泌し得る。
いくつかの場合、分泌された細胞外小胞は生体適合性であり、直径が40~150nmであり、膜貫通および膜固定タンパク質を内因的に発現し得る。これらのタンパク質の存在は、血液循環を延長し得、組織指向性送達を促進し得、封入エキソソーム内容物の細胞取り込みを容易にし得る。いくつかの場合、本明細書で提供される方法は、有意な凝集体の形成を伴わないナノエレクトロポレーションの使用を含み得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞に導入された異種ポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞外小胞に組み込まれ、標的mRNAに結合するペプチド配列をコードしない。
いくつかの場合、ナノチャネルは半透性ポリマー基質の細孔を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm~約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約2μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.01μm~約20μm、約0.01μm~約50μm、約0.01μm~約100μm、約0.01μm~約500μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約2μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.05μm~約20μm、約0.05μm~約50μm、約0.05μm~約100μm、約0.05μm~約500μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約2μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.1μm~約20μm、約0.1μm~約50μm、約0.1μm~約100μm、約0.1μm~約500μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約2μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約0.5μm~約20μm、約0.5μm~約50μm、約0.5μm~約100μm、約0.5μm~約500μm、約1μm~約2μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、約1μm~約20μm、約1μm~約50μm、約1μm~約100μm、約1μm~約500μm、約2μm~約5μm、約2μm~約10μm、約2μm~約20μm、約2μm~約50μm、約2μm~約100μm、約2μm~約500μm、約5μm~約10μm、約5μm~約20μm、約5μm~約50μm、約5μm~約100μm、約5μm~約500μm、約10μm~約20μm、約10μm~約50μm、約10μm~約100μm、約10μm~約500μm、約20μm~約50μm、約20μm~約100μm、約20μm~約500μm、約50μm~約100μm、約50μm~約500μm、または約100μm~約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、約100μm、または約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、または約100μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、約100μm、または約500μmの高さを含む。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは異なり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは、高電界ゾーン(例えば、ナノチャネルの内側)でナノエレクトロポレーションされている分子を加速するのに十分大きくなければならないが、ナノエレクトロポレーションされている大きな分子が短時間の電気パルスですり抜けることを可能にするほど十分小さくなければならない。
いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm~約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm~約0.1nm、約0.01nm~約0.5nm、約0.01nm~約1nm、約0.01nm~約5nm、約0.01nm~約10nm、約0.01nm~約50nm、約0.01nm~約100nm、約0.01nm~約500nm、約0.01nm~約1,000nm、約0.01nm~約5,000nm、約0.01nm~約10,000nm、約0.1nm~約0.5nm、約0.1nm~約1nm、約0.1nm~約5nm、約0.1nm~約10nm、約0.1nm~約50nm、約0.1nm~約100nm、約0.1nm~約500nm、約0.1nm~約1,000nm、約0.1nm~約5,000nm、約0.1nm~約10,000nm、約0.5nm~約1nm、約0.5nm~約5nm、約0.5nm~約10nm、約0.5nm~約50nm、約0.5nm~約100nm、約0.5nm~約500nm、約0.5nm~約1,000nm、約0.5nm~約5,000nm、約0.5nm~約10,000nm、約1nm~約5nm、約1nm~約10nm、約1nm~約50nm、約1nm~約100nm、約1nm~約500nm、約1nm~約1,000nm、約1nm~約5,000nm、約1nm~約10,000nm、約5nm~約10nm、約5nm~約50nm、約5nm~約100nm、約5nm~約500nm、約5nm~約1,000nm、約5nm~約5,000nm、約5nm~約10,000nm、約10nm~約50nm、約10nm~約100nm、約10nm~約500nm、約10nm~約1,000nm、約10nm~約5,000nm、約10nm~約10,000nm、約50nm~約100nm、約50nm~約500nm、約50nm~約1,000nm、約50nm~約5,000nm、約50nm~約10,000nm、約100nm~約500nm、約100nm~約1,000nm、約100nm~約5,000nm、約100nm~約10,000nm、約500nm~約1,000nm、約500nm~約5,000nm、約500nm~約10,000nm、約1,000nm~約5,000nm、約1,000nm~約10,000nm、または約5,000nm~約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm、約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nm、または約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約0.01nm、約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、または約5,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nm、または約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約50nm~約3000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約1000nmまたはわずかにより大きい直径を含む。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は異なり得る。
いくつかの場合、ナノチャネルをナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネルは、ナノチャネル間に間隔を置いてナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm~約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.01μm~約50μm、約0.01μm~約100μm、約0.01μm~約500μm、約0.01μm~約1,000μm、約0.01μm~約5,000μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.05μm~約50μm、約0.05μm~約100μm、約0.05μm~約500μm、約0.05μm~約1,000μm、約0.05μm~約5,000μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.1μm~約50μm、約0.1μm~約100μm、約0.1μm~約500μm、約0.1μm~約1,000μm、約0.1μm~約5,000μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約0.5μm~約50μm、約0.5μm~約100μm、約0.5μm~約500μm、約0.5μm~約1,000μm、約0.5μm~約5,000μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、約1μm~約50μm、約1μm~約100μm、約1μm~約500μm、約1μm~約1,000μm、約1μm~約5,000μm、約5μm~約10μm、約5μm~約50μm、約5μm~約100μm、約5μm~約500μm、約5μm~約1,000μm、約5μm~約5,000μm、約10μm~約50μm、約10μm~約100μm、約10μm~約500μm、約10μm~約1,000μm、約10μm~約5,000μm、約50μm~約100μm、約50μm~約500μm、約50μm~約1,000μm、約50μm~約5,000μm、約100μm~約500μm、約100μm~約1,000μm、約100μm~約5,000μm、約500μm~約1,000μm、約500μm~約5,000μm、または約1,000μm~約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、約1,000μm、または約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、または約1,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、最大で約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、約1,000μm、または約5,000μmであり得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションシステムは、流体チャンバ内に電界を生成するための上部および下部電極層を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約10V~約500Vの電圧を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約10V~約25V、約10V~約50V、約10V~約100V、約10V~約125V、約10V~約150V、約10V~約175V、約10V~約200V、約10V~約225V、約10V~約250V、約10V~約300V、約10V~約500V、約25V~約50V、約25V~約100V、約25V~約125V、約25V~約150V、約25V~約175V、約25V~約200V、約25V~約225V、約25V~約250V、約25V~約300V、約25V~約500V、約50V~約100V、約50V~約125V、約50V~約150V、約50V~約175V、約50V~約200V、約50V~約225V、約50V~約250V、約50V~約300V、約50V~約500V、約100V~約125V、約100V~約150V、約100V~約175V、約100V~約200V、約100V~約225V、約100V~約250V、約100V~約300V、約100V~約500V、約125V~約150V、約125V~約175V、約125V~約200V、約125V~約225V、約125V~約250V、約125V~約300V、約125V~約500V、約150V~約175V、約150V~約200V、約150V~約225V、約150V~約250V、約150V~約300V、約150V~約500V、約175V~約200V、約175V~約225V、約175V~約250V、約175V~約300V、約175V~約500V、約200V~約225V、約200V~約250V、約200V~約300V、約200V~約500V、約225V~約250V、約225V~約300V、約225V~約500V、約250V~約300V、約250V~約500V、または約300V~約500Vである電圧を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約10V、約25V、約50V、約100V、約125V、約150V、約175V、約200V、約225V、約250V、約300V、または約500Vの間の電圧を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約10V、約25V、約50V、約100V、約125V、約150V、約175V、約200V、約225V、約250V、または約300Vの間の電圧を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約25V、約50V、約100V、約125V、約150V、約175V、約200V、約225V、約250V、約300V、または約500Vの間の電圧を含む。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm~約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm~約0.5ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約1ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約5ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約10ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約50ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約100ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約500ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約5ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約10ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約50ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約100ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約500ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約5ボルト/mm、約1ボルト/mm~約10ボルト/mm、約1ボルト/mm~約50ボルト/mm、約1ボルト/mm~約100ボルト/mm、約1ボルト/mm~約500ボルト/mm、約1ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約10ボルト/mm、約5ボルト/mm~約50ボルト/mm、約5ボルト/mm~約100ボルト/mm、約5ボルト/mm~約500ボルト/mm、約5ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約50ボルト/mm、約10ボルト/mm~約100ボルト/mm、約10ボルト/mm~約500ボルト/mm、約10ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約100ボルト/mm、約50ボルト/mm~約500ボルト/mm、約50ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約500ボルト/mm、約100ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、または約10,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、約10,000ボルト/mm、または約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約0.1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、または約10,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、約10,000ボルト/mm、または約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス~約0.05ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約0.1ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約0.1ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、または約1,000ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、約1,000ミリ秒/パルス、または約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約0.01ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、または約1,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、約1,000ミリ秒/パルス、または約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションは、1パルス、2パルス、3パルス、4パルス、5パルス、6パルス、7パルス、8パルス、9パルス、10パルス、11パルス、12パルス、13パルス、14パルス、15パルス、16パルス、17パルス、18パルス、19パルス、20パルスまたはより多くを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞は、遠心分離または超遠心分離によって細胞培養培地から回収および精製され、これにより、細胞外小胞は、細胞外小胞の密度に基づいて他の細胞残屑または分子から精製され得る。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチド(および必要に応じて標的化ポリペプチド)を含む細胞外小胞を産生する方法およびシステムは、細胞内にナノエレクトロポレーションされる複数のベクターなどをナノチャネルにロードすることを含む。いくつかの場合、ベクター以外の分子(例えば、タンパク質、生体分子、化合物など)をナノチャネルにロードして、細胞にナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、上部電極および下部電極によって生成された電界は、細胞内へ、ベクターを加速させる。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために生成された電界が膜の細胞に細孔を作り出して、ベクターのナノエレクトロポレーションを可能にする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞の膜中の細孔は、焦点、例えば、電界が細胞膜と直接接触するナノチャネルの出口で形成され得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、lipofectamineトランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞よりも、少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、またはそれを超える細胞外小胞を産生および分泌し得る。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミンのトランスフェクション、全体的な細胞ストレス応答、飢餓、低酸素、および熱処理など)によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された多数の細胞外小胞と比較して、少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、またはそれを超えて増加した多数の細胞外小胞を産生および分泌し得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞を培養し、温度を上昇させてナノエレクトロポレーションすると、より多くの細胞外小胞を産生および分泌し得る。例えば、37℃で培養しナノエレクトロポレーションした細胞外小胞ドナー細胞は、4℃で培養およびナノエレクトロポレーションした細胞外小胞ドナー細胞よりも多くの細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞の培養およびナノエレクトロポレーション中に4℃より1℃ずつ上昇するごに少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、またはそれを超える細胞外小胞を産生および分泌する。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞が、Ca2+を含む緩衝液中で培養されると、細胞外小胞ドナー細胞はより多くの細胞外小胞を産生および分泌し得る。例えば、ナノエレクトロポレーション後に500nMのCa2+を含む緩衝液中で培養した細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーション後にCa2+を含まない緩衝液中で培養した場合と比較して、より多くの細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞がナノエレクトロポレーション後にCa2+を含まない緩衝液中で培養される場合と比較して、ナノエレクトロポレーション後にCa2+の濃度が増加した緩衝液中で培養されると、少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、またはそれを超える細胞外小胞を産生および分泌する。緩衝液中のCa2+の濃度の増加の例としては、10nm、50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、400nm、500nm、600nm、7000nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、2000nm、2500nm、3000nm、5000nm、10000nm、またはそれを超える濃度のCa2+が挙げられる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、6-kbp Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1)、7-kbp Pou Domain Class 3 Transcription factor 2(Pou3f2またはBrn2)、および9-kbp Myelin Transcription Factor 1 Like(Myt1l)をコードするベクターを含む少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトすると、より多くの細胞外小胞を産生および分泌し得る。細胞外小胞ドナー細胞に6-kbp Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1)、7-kbp Pou Domain Class 3 Transcription factor 2(Pou3f2またはBrn2)、および9-kbp Myelin Transcription Factor 1 Like(Myt1l)をトランスフェクトすることによって、ナノエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞の数は、6-kbp Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1)、7-kbp Pou Domain Class 3 Transcription factor 2(Pou3f2またはBrn2)、および9-kbp Myelin Transcription Factor 1 Like(Myt1l)をトランスフェクトすることなく細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションすることによって産生および分泌された細胞外小胞の数と比較して、少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、またはそれを超えて増加させることができる。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞と比較して、少なくとも50%、1倍、2倍、5倍、100倍、500倍、1000倍、またはそれを超える治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドは、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドよりも、治療用ポリペプチドをコードするためにインタクトである可能性が少なくとも10%高い、20%高い、30%高い、40%高い、50%高い、60%高い、70%高い、80%高い、90%高い、95%高い、99%高いまたはそれよりも高い。
いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞のパーセンテージと比較して、少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の増加したパーセンテージを産生および分泌する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞のパーセンテージは、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞のパーセンテージと比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞のパーセンテージは、1分、10分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、またはそれよりも長い期間にわたって細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の数を測定することによって決定することができる。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む多数の細胞外小胞と比較して、少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチド(例えば、治療用mRNA、治療用miRNA)を含む増加した数の細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む増加した数の細胞外小胞を産生および分泌し、他のトランスフェクション方法(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、増加した数の細胞外小胞を産生および分泌し、500個の細胞外小胞のうち少なくとも1個、200個の細胞外小胞のうち少なくとも1個、100個の細胞外小胞のうち少なくとも1個、50個の細胞外小胞のうち少なくとも1個、25個の細胞外小胞のうち少なくとも1個、または10個の細胞外小胞のうち少なくとも1個が、少なくとも1個のコピーの治療用ポリヌクレオチド(例えば、治療用mRNA、治療用miRNA)を含む。
医薬組成物
いくつかの場合、細胞外小胞を医薬組成物に製剤化することができる。いくつかの場合、細胞外小胞またはエキソソームを含む医薬組成物は、非経口、経口、頬側、直腸、舌下または経皮投与経路を含むがこれらに限定されない複数の投与経路によって対象に投与することができる。いくつかの場合、非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨内注入、腹腔内、または髄腔内投与を含む。いくつかの場合、医薬組成物は局所投与用に製剤化される。他の例では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内、皮下および筋肉内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、筋肉内投与によって対象に投与される。
いくつかの場合、細胞外小胞を医薬組成物に製剤化することができる。いくつかの場合、細胞外小胞またはエキソソームを含む医薬組成物は、非経口、経口、頬側、直腸、舌下または経皮投与経路を含むがこれらに限定されない複数の投与経路によって対象に投与することができる。いくつかの場合、非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨内注入、腹腔内、または髄腔内投与を含む。いくつかの場合、医薬組成物は局所投与用に製剤化される。他の例では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内、皮下および筋肉内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、筋肉内投与によって対象に投与される。
キット/製造物品
ある特定の態様では、本明細書に記載される1つまたはそれを超える方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製造物品が本明細書に開示される。細胞外小胞またはエキソソームを産生するシステムも本明細書に記載される。いくつかの場合、本システムは、細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションして、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞またはエキソソームの産生を刺激するための方法を含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載される1つまたはそれを超える方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製造物品が本明細書に開示される。細胞外小胞またはエキソソームを産生するシステムも本明細書に記載される。いくつかの場合、本システムは、細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションして、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞またはエキソソームの産生を刺激するための方法を含む。
いくつかの場合、キットは、バイアル、チューブなどの1つもしくはそれを超える容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含むことができ、容器の各々は、本明細書に記載される方法で使用される別個の要素の1つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。いくつかの場合、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。キットは、典型的には、内容物および/または使用についての指示を列挙するラベル、および使用についての指示を含む添付文書を含む。指示のセットを含めることもできる。
一実施形態では、ラベルは、容器上にあるか、または容器に付随している。一実施形態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされるときに容器上にあり、ラベルは、容器も保持する容器(receptacle)または担体内に存在するとき、例えば添付文書として容器に付随している。一実施形態では、内容物が特定の治療適用に使用されることを示すためにラベルが使用される。ラベルはまた、本明細書に記載される方法などにおける内容物の使用のための指示を示す。
ある特定の場合、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する1つもしくはそれを超える単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示を伴う。一実施形態では、パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知を伴い、その通知は、ヒトまたは獣医学的投与のための薬物の形態の機関による承認を反映している。そのような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって薬物について承認されたラベル、または承認された製品添付文書である。一実施形態では、適合性医薬担体で製剤化された本明細書で提供される化合物を含有する治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞も調製され、適切な容器に入れられ、適応された症状の処置のために標識される。
いくつかの場合、キットは、本明細書に記載される養子療法、および処置方法を開発するのに有用な製造物品を含む。いくつかの場合、キットは、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞外小胞を製造するための治療用ポリヌクレオチドまたは成分を含む少なくとも1つの細胞外小胞を含む。いくつかの場合、キットは、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのエキソソームを製造するための治療用ポリヌクレオチドまたは成分を含む少なくとも1つのエキソソームを含む。
絶対的または逐次的な用語、例えば、「する」、「しない」、「すべきである」、「すべきでない」、「しなければならない」、「してはならない」、「まず」、「最初に」、「次に」、「続いて」、「前に」、「後に」、「最後に」、および「最終的に」の使用は、本明細書に開示される本実施形態の範囲を限定することを意味するものではなく、例示としてのものである。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」という用語、またはそれらの変形が詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、「備える(comprising)」という用語と同様に包括的であることを意図している。
本明細書で使用される場合、「少なくとも1つ」、「1つまたはそれを超える」、および「および/または」という語句は、動作において接続的および選言的の両方であるオープンエンド表現である。例えば、「A、BおよびCの少なくとも1つ」、「A、B、またはCの少なくとも1つ」、「A、B、およびCのうちの1つまたはそれを超える」、「A、B、またはCのうちの1つまたはそれを超える」および「A、B、および/またはC」の各表現は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBとを一緒に、AとCとを一緒に、BとCとを一緒に、またはAとBとCとを一緒に、を意味する。
本明細書で使用される場合、「または」は、「および」、「または」、または「および/または」を指すことができ、排他的および包括的の両方で使用され得る。例えば、「AまたはB」という用語は、「AまたはB」、「AであるがBではない」、「BであるがAではない」、および「AおよびB」を指すことができる。いくつかの場合、文脈が特定の意味を決めることもある。
本明細書に記載される任意のシステム、方法、ソフトウェアおよびプラットフォームはモジュール式であり、逐次的なステップに限定されない。したがって、「第1」および「第2」などの用語は、必ずしも優先順位、重要性の順序、または行為の順序を意味するものではない。
本明細書で使用される場合、数または数値範囲を指す場合の「約」という用語は、言及される数または数値範囲が実験的変動性内(または統計的実験誤差内)の近似であることを意味し、数または数値範囲は、例えば、記載された数または数値範囲の1%~10%で変化し得る。文脈によって特に指示されない限り、「約」という用語は、記載された数または値の±10%を指す。
「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内であることを意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「およそ」は、所与の値における慣例に従って、1標準偏差以内または1標準偏差を超えることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「およそ」という用語は、特定の値の許容され得る誤差範囲を意味すると仮定されるべきである。
「増加した」、「増加」、または「増加する」という用語は、本明細書では、一般に、静的に有意な量の増加を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「増加した」または「増加する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、基準レベル、標準または対照と比較して少なくとも約10%、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または最大100%(100%を含む)の増加、または10~100%の間の任意の増加を意味する。「増加する」の他の例には、基準レベルと比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍またはそれを超える増加が含まれる。
「減少した」、「減少」、または「減少する」という用語は、本明細書では、一般に、統計的に有意な量の減少を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「減少した」または「減少する」とは、基準レベルと比較して少なくとも10%の減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%または最大100%(100%を含む)の減少(例えば、基準レベルと比較して存在しないレベルまたは検出不能なレベル)、または10~100%の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状の文脈において、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれを超えるものであり得、好ましくは、所与の疾患を有しない個体について正常範囲内として認められるレベルまで低下する。
「患者」または「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、哺乳動物を包含する。哺乳動物の非限定的な例としては、哺乳動物クラスの任意のメンバー:ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物;ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜;ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「細胞」は、一般に、生物学的細胞を指す。細胞は、生存生物の基本的な構造、機能および/または生物学的単位である。細胞は、1つまたはそれを超える細胞を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞、真菌細胞(例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞)、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞(例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など)、脊椎動物由来の細胞(例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物)、または哺乳動物由来の細胞(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど)が挙げられる。細胞は、天然の生物に由来しないときがある(例えば、細胞は、人工細胞と呼ばれることもある、合成的に作製されたものである)。一部の場合には、細胞は、初代細胞である。一部の場合には、細胞は、細胞株に由来し得る。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般に、塩基-糖-リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA))。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸(ATP)、ウリジン三リン酸(UTP)、シトシン三リン酸(CTP)、グアノシン三リン酸(GTP)、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP、またはそれらの誘導体を含み得る。そのような誘導体としては、例えば、[αS]dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATP、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体を指すことができる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例としては、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPを挙げることができるが、これらに限定されない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一本鎖形態、二本鎖形態、または多鎖形態のいずれかの、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは外因性(例えば異種ポリヌクレオチド)である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは細胞にとって内因性である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは無細胞環境に存在し得る。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは遺伝子またはその断片である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはDNAである。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはRNAである。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは、1つまたはそれを超える類似体(例えば、変更された骨格、糖または核酸塩基)を含む。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。類似体のいくつかの非限定的な例としては、5-ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、7-デアザ-GTP、フルオロフォア(例えば、糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン)、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、CpGアイランド、メチル-7-グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ケウオシンおよびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される1つまたは複数の遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、非コードRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、無細胞DNA(cfDNA)および無細胞RNA(cfRNA)を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。いくつかの場合、ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される。
「完全にインタクト」および「実質的にインタクト」とは、本明細書に記載される治療用ポリペプチドに転写および/または翻訳され得る核酸配列を有する本明細書に記載される核酸を指す。完全にインタクトな核酸とは、部分的に分解または断片化されていない完全長核酸配列を指す。例えば、完全にインタクトな核酸は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのいずれか1つなどの全長タンパク質に翻訳され得るメッセンジャーRNAであり得る。一般に、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーRNAは、ポリペプチドに翻訳されることができる。一般に、メッセンジャーRNAは、翻訳に有用であり得るリボソームおよびポリ(A)尾部への結合を補助し得る5’キャップを含む。「実質的にインタクト」という用語は、部分的に分解または断片化され得るが、依然として本明細書に記載される治療用ポリペプチドのいずれか1つに転写および/または翻訳され得る核酸配列を指す。例えば、実質的にインタクトな核酸は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのいずれか1つに翻訳され得る部分的に分解または断片化されたメッセンジャーRNAであり得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリペプチドは、コードするオープンリーディングフレームから翻訳されるか、またはその成熟形態にプロセシングされる完全長ポリペプチドを指し得る。ポリペプチドは、タンパク質の分解断片またはプロセシング断片を指し得、それでもなお特定のタンパク質に固有にまたは同定可能にマッピングされるものである。ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸の単一の線状ポリマー鎖であり得る。ポリペプチドは、例えば、炭水化物の添加、リン酸化などによって修飾することができる。ポリペプチドは、異種ポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「断片」という用語または同等の用語は、タンパク質の全長未満を有し、必要に応じてタンパク質の機能を維持するタンパク質の部位を指すことができる。「同一性パーセント」および「同一性%」は、2つの配列(ヌクレオチドまたはアミノ酸)がアラインメント中の同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は、配列番号YとX%同一である」とは、配列番号Yに対するアミノ酸配列の同一性%を指し、アミノ酸配列中の残基のX%が配列番号Yに開示されている配列の残基と同一であると精緻に表現される。一般に、そのような計算にはコンピュータプログラムが用いられる。配列の対を比較およびアラインメントする例示的なプログラムとしては、ALIGN、FASTA、ギャップBLAST、BLASTP、BLASTN、またはGCGが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、対象の体外で起こる事象を説明するために使用される。「エクスビボ」アッセイは、対象に対して直接行うことができない。むしろ、それは、対象から取得した生物学的試料などの対象とは別の試料に対して行われる。エクスビボは、対象の体外のインタクトな細胞または他の種類の生物学的試料において生じる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、実験試薬を保持するための容器に収容され、その材料が得られる生物学的供給源生物から分離されて起こる事象を説明するために使用される。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞あるいは他の種類の生物学的試料が使用される細胞ベースのアッセイを包含し得る。インビトロアッセイはまた、インタクトな細胞が使用されない無細胞アッセイを包含し得る。
「処置する」または「処置」は、治療的処置、美容的処置、および/または予防的もしくは防止的手段を指すことができ、この目的は、多くの場合、症状または障害の1つもしくはそれを超える症状を予防、低減、または軽減することによって、標的化された症状(例えば、病的状態)または障害を予防または減速(軽減)することである。処置を必要とする者には、既に障害を有する者、ならびに障害を有する傾向がある者、または障害を防止すべき者が含まれる。本明細書で使用される場合、症状または障害は、加齢に関連する症状または障害を含む。治療上の利益は、処置されている症状またはその根底にある障害の根絶または改善を指すことができる。また、治療上の利益は、対象が依然として根底にある障害に罹患する可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、根底にある障害に関連する1つまたはそれを超える生理学的症状の根絶または改善によって達成される。予防的効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させる、防止する、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発症を遅延させる、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を減速させる、停止させる、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。予防的利益、特定の疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の1つまたはそれを超えるものを報告する対象は、この疾患の診断ができなくても、処置を受けることができる。
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一般に、医薬組成物、例えば、本明細書に記載される組成物を含む医薬組成物の量であって、医薬組成物を必要とする対象への投与時に所望の活性をもたらすのに十分な量を指す。本開示の文脈内で、「治療上有効」という用語は、本開示の方法によって処置される障害の少なくとも1つの症状の発現を遅延させ、進行を停止させ、軽減または緩和するのに十分な医薬組成物の量を指す。
本明細書で使用される「治療用細胞外小胞」、「治療用EV」、「治療用エキソソーム」、「治療用微小小胞」、「治療用アポトーシス小体」などの用語は、一般に、症状または障害を処置するために使用され得る細胞外小胞(または、該当する場合、エキソソーム、微小小胞もしくはアポトーシス小体)を指す。これらの用語が使用される文脈に依存して、これらは、時折、加齢に関連する症状または障害を処置するために使用され得る細胞外小胞(またはエキソソーム、微小小胞もしくはアポトーシス小体)を指すことができる。
「薬学的に許容され得る担体」、「薬学的に許容され得る賦形剤」、「生理学的に許容され得る担体」または「生理学的に許容され得る賦形剤」という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容され得る材料、組成物、またはビヒクルを指す。成分は、医薬製剤の他の成分と適合性であるという意味で「薬学的に許容され得る」。それはまた、合理的な利益/リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の組織または器官と接触して使用するのに適し得る。
「医薬組成物」という用語は、希釈剤または担体などの他の化学成分を含む本明細書に開示されるシステムまたはシステムの混合物またはシステムの各成分を含む組成物を指す。医薬組成物は、システムまたはシステムの各成分の対象への投与を容易にすることができる。経口、注射、エアロゾル、非経口、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が当該技術分野に存在する。
「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は、一般に、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞への核酸構築物の導入を指す。いくつかの場合、核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列である。いくつかの場合、核酸分子は非コード配列である。いくつかの場合、トランスフェクション方法は、トランスジェニック動物を作製するために細胞への核酸分子の導入に利用される。そのような技術には、前核マイクロインジェクション、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞、例えば、卵丘細胞もしくは乳腺細胞、または成体、胎児もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、その後の核移植が含まれ得る。
「ナノエレクトロポレーション」または「ナノチャネルエレクトロポレーション」は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドをナノチャネルにロードし、電界を発生させることによって少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞内に促進することによって、ベクターなどの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることを指す。トランスフェクトされる細胞はナノチャネルの開口部に位置し、ここでナノエレクトロポレーションの電界が細胞膜に細孔を作り出して、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入されることを可能にする。本明細書で使用される「ナノチャネル」は、一般に、ナノメートルまたはマイクロメートルのスケールのサイズの開口部を有するチャネルを指す。
本明細書で使用される「プラスミド」は、一般に、非ウイルス発現ベクター、例えば遺伝子および/または遺伝子の発現に必要な調節エレメントをコードする核酸分子を指す。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、一般に、ペイロード核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指す。ペイロード核酸分子は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入され得る。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含むことができ、または宿主細胞遺伝子(例えば、宿主細胞DNA)への組み込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。ベクターの例としては、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターを挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ウイルスベクター」は、一般に、別の核酸を細胞内に輸送することができるウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって担持される1つまたはそれを超える遺伝子によってコードされる1つまたはそれを超えるタンパク質の発現を指示することができる。ウイルスベクターの例としては、ガンマ-レトロウイルス、αレトロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の態様のいずれかのベクターは、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの外因性、内因性または異種の制御配列を含むことができる。
「少なくとも」、「よりも大きい」、「よりも大きいかまたは等しい」という用語または同様の語句が一連の2つ以上の数値の最初の数値の前にある場合は常に、「少なくとも」、「よりも大きい」、「以上」という用語または同様の語句は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、「少なくとも1、2、または3」は、「少なくとも1、少なくとも2、および/または少なくとも3」に相当する。
「わずか」、「未満」、「よりも大きいかまたは等しい」、「以下」、「最大」、または同様の語句が、一連の2つ以上の数値の最後の数値の後にある場合は常に、「わずか」、「未満」、「よりも大きいかまたは等しい」、「以下」、「最大」、または同様の語句は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、「3、2、または1未満」は、「3未満、2未満、および/または1未満」に相当する。
本明細書で使用される場合、「外因性RNA」という用語は、一般に、細胞または細胞外小胞に人工的に導入されたRNAを指す。例えば、外因性RNAを含む細胞外小胞は、外因性mRNAをコードする外因性ベクター(例えば、外因性DNA、DNAプラスミド、または他の外因性ベクター)が、細胞のトランスフェクション(例えば、エレクトロポレーション、ナノポレーション、細胞ナノポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションなどによる方法)または細胞の形質導入(例えば、ウイルス形質導入によって)などによって細胞に導入された後に細胞から産生される細胞外小胞を指すことができる。「外因性RNA」という用語はまた、細胞外小胞または細胞の直接またはバルクトランスフェクションによることを含む、外因性mRNAを細胞外小胞または細胞に導入する他の方法を指すこともできる。同様に、本明細書で使用される場合、「外因性mRNA」という用語は、一般に、細胞または細胞外小胞に人工的に導入されたmRNAを指す。例えば、ある種の外因性mRNA(例えば、外因性細胞外マトリックスmRNA、外因性VEGF mRNAなど)を含む細胞外小胞は、外因性mRNAをコードする外因性ベクター(例えば、外因性DNA、DNAプラスミド、または他の外因性ベクター)が、細胞のトランスフェクション(例えば、エレクトロポレーション、ナノポレーション、細胞ナノポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションなどによる方法)または細胞の形質導入(例えば、ウイルス形質導入によって)などによって細胞に導入された後に細胞から産生される細胞外小胞を指すことができる。「外因性mRNA」という用語はまた、細胞外小胞または細胞の直接またはバルクトランスフェクションによることを含む、外因性mRNAを細胞外小胞または細胞に導入する他の方法を指すこともできる。「外因性」という用語は、siRNA、miRNA、またはDNAなどの他の種類の核酸を修飾するときにも同様に解釈することができる。
本明細書で使用される場合、「ゲージ」という用語は、一般に、本明細書に記載されるニードル、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスの貫通部分の内径と外径との設定された組み合わせを指す。
本明細書で使用される場合、「マイクロニードル」という用語は、一般に、15mm未満の長さ、幅または直径などの少なくとも一次元を有するニードルを指す。
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載される組成物、システム、および方法の実施形態の代表例であり、限定することを決して意味するものではない。
実施例1.細胞ナノポレーション(CNP)生成細胞外小胞
実施例1.細胞ナノポレーション(CNP)生成細胞外小胞
本明細書に記載されるように、細胞を刺激して、mRNA、マイクロRNAおよびshRNAを含む目的のヌクレオチド配列を含有するエキソソームを産生および放出させるための細胞ナノポレーション(CNP)バイオチップ、CNPシステム、およびCNP方法が使用される。このシステムおよび方法により、マウス胚性線維芽細胞(MEF)および樹状細胞(DC)などのソース細胞の単層を、ナノチャネルのアレイを含むチップ表面上で培養することが可能になった(図1)。ナノチャネル(直径約500nm)は、DNAプラスミドを緩衝液から付着細胞にシャトル移動させる一過性の電気パルスの通過を可能にした(図1)。
実施例2.VEGF mRNA細胞外小胞のインビトロ送達
実施例2.VEGF mRNA細胞外小胞のインビトロ送達
VEGFを、細胞ナノポレーション(CNP)およびバルクエレクトロポレーション(BEP)を使用してヒト真皮線維芽細胞(HDF)に最初に送達して、VEGF mRNAを含有するエキソソームを生成した。CNPおよびBEPの両方の調製されたエキソソーム内のVEGF mRNAの量を比較するために、qtr-PCRを使用した。CNPおよびBEPの両方が、VEGF mRNAを含有するエキソソームを産生したが、CNPエキソソーム内のVEGF mRNAの濃度ははるかに高かった。BEPとは異なり、CNPは、大きなmRNAを含有するエキソソームを効率的に産生し、CNP分泌エキソソームは、BEP由来のエキソソームよりも100倍超多いVEGF mRNAを含有していた(図2)。
VEGF mRNA EVの送達能を調べるために、10,000個のヒト真皮線維芽細胞を、1pg~1ngの範囲のGFP標識VEGF mRNA(EV内)または対照EVと共に24時間、または48時間インキュベートした。VEGFタンパク質の翻訳は、対照EV処理細胞と比較して、VEGF mRNA EV処理細胞で48時間後に有意に上方制御された(図3A)。EV曝露後24時間および48時間でのQtr-PCRにより、48時間までにVEGF mRNAが細胞に有意な送達されることが確認された(図3B)。
実施例3.虚血の前臨床モデルにおけるVEGF mRNA EVのインビボ治療有効性
実施例3.虚血の前臨床モデルにおけるVEGF mRNA EVのインビボ治療有効性
後肢虚血(HLI)モデルにおけるVEGF mRNA EVの治療可能性を評価するために、VEGF mRNA EVをHLIマウスに筋肉内注射した。PBS注射と比較して、VEGF mRNA EVは、経時的に有意に改善された血行再建を示した(図4A)。対照足蹠の平均灌流値に対する虚血足蹠の平均灌流値の定量化は、EV送達の2日後に早くも開始して有意に良好な灌流を明らかにし、EV送達の7日後にほぼ完全な再灌流が起こった(図4B)。虚血組織内へのVEGF mRNA EVのインビボ送達をさらに評価するために、VEGF mRNAロードEV注射の48時間後に虚血性脚組織0.20gを回収し、ELISAを使用してVEGFタンパク質発現について分析した。VEGF mRNA EVで処理した組織は、PBS対照処理組織と比較してVEGFタンパク質の濃度が増加したことを示し、VEGF mRNA送達がEV送達の2日後という早い時期にVEGFタンパク質の翻訳をもたらしたことを示した(図4C)。免疫蛍光染色の結果は、VEGF mRNA EV処理がEV送達後48時間までにVEGF発現を増加させることをさらに確認した(図4D)。
実施例4.Col1 mRNA細胞外小胞のインビトロ送達
実施例4.Col1 mRNA細胞外小胞のインビトロ送達
Col1 mRNA EVの送達能を調べるために、10,000個のヒト真皮線維芽細胞を、1pg~1ngの範囲のGFP標識Col1 mRNA(CNP産生EVに含まれる)、Col1 mRNA BEP産生エキソソーム、または対照EVと共に24時間、または48時間インキュベートした。COL1タンパク質の翻訳は、対照EV処理細胞と比較して、Col1 mRNA EV処理細胞において48時間後に有意に上方制御された(図5A)。EV曝露後24時間および48時間でのRT-PCRにより、BEPおよび対照EVの両方と比較して、24または48時間でCol1 mRNA CNP産生EVによる細胞へのCol1 mRNAの有意な送達が確認された(図5Bおよび表1)。
皮膚損傷モデルにおけるCol1 mRNA EVの治療可能性を評価するために、Col1 mRNAを含有する1e11 EVをロードした28ゲージニードルを使用してVEGF mRNA EVをマウスに皮下注射した。一例では、マウスに、光老化処置後に4用量のCol1 mRNA EVを投与した(図6A)。別の例では、マウスに、最初の用量、最初の注射から48時間後の2回目の用量、および96時間後の3回目の用量の3回の用量のCol1 mRNA EVを投与した(図6B)。生理食塩水注射と比較して、Col1 mRNA EVは、経時的に有意に改善された皮膚症状(例えば、しわの外観の減少)を示し(図6A~図6B)、最初の注射から約1週間以内に有意差が観察された。免疫組織化学(図6Cおよび図6E)および免疫蛍光(図6D~6E)染色の結果により、Col1 mRNA EV処理がEV送達後にコラーゲン発現を増加させることが確認された。マッソン・トリクローム染色の結果により、Col1 mRNA EV処理がEV送達後にコラーゲン発現を増加させることがさらに確認された。
実施例6.治療用細胞外小胞の合成方法およびシステム
実施例6.治療用細胞外小胞の合成方法およびシステム
治療用ポリヌクレオチドを封入するための細胞外小胞またはエキソソームを産生するための例示的な方法およびシステムが本明細書に記載される。本方法およびシステムによって産生される細胞外小胞およびエキソソームは、治療的使用のための医薬組成物に製剤化するのに適し得る。
EV産生のための従来の細胞培養
EV産生のための従来の細胞培養
ヒト真皮線維芽細胞正常(HDFn)細胞は、ATCC(ATCC(登録商標)PCS-201-010(商標))から得ることができ、GMP施設での治療用EV(tEV)産生のための細胞クローンを生成するために使用することができる。組織培養フラスコ(Fisherbrand、カタログ番号FB 012937)を使用する従来の細胞培養の場合、HDFn細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを追加補充したダルベッコの最小必須培地(DMEM)中で維持し、5%CO2中37℃でインキュベートする。
ナノポアエレクトロポレーション(NEP)チップを漂白浴で洗浄し、続いてDI水ですすぎ、N2ブロー乾燥する。NEPチップの表面処理は、GMP施設のサポートルームでUV/オゾン洗浄器を使用して行う(任意選択。新しいPDMSスペーサー接着に使用できる)。
洗浄したNEPチップをバイオセーフティキャビネット内に移し、HDFn細胞をNEPチップ上に1チップあたり80,000~100,000個の細胞をプレーティングする。細胞プレーティング後、NEPチップをインキュベーターに移し、NEPチップ中の細胞を一晩培養する。
翌日、顕微鏡下で細胞成長状態をチェックし、細胞がよく付着して広がり、NEPチップ表面上で70%超のコンフルエントに達していることを確認する。NEP処理の前に、NEPチップ中の細胞培養培地を無血清培地(DMEMのみ)と交換する。
再現性のあるNEP処理のために、標的プラスミドの濃度を分光光度計(Thermo Scientific社製NanoDrop 2000c)によってEV検証(QC)室で決定することができる。細胞を、エレクトロポレーションシステム(Bio-Rad社製Gene Pulser Xcell)を使用して、エレクトロポレーションパラメーターを一定にした上でNEPによって処理する。
ベンチスケール(20L未満)のNEP処理後のEV採取のために、細胞を無血清培地中で24時間インキュベートする。パイロットスケール(20L超)では、細胞をiCELLis 500+システムなどの接着細胞バイオリアクター内で24時間インキュベートする。
NEP処理から24時間後に細胞培養馴化培地(CCM)を回収し、細胞培養物をトリプシン処理し、トリパンブルー染色で細胞生存率を分析する。正確な細胞生存率アッセイのために、MTTアッセイは、マイクロプレートリーダー(BioTek社製Synergy(商標)HTX Multi-Mode)を使用した吸光度検出によって使用することができる。
処理されたNEPチップを漂白浴で洗浄し、続いてDI水ですすぎ、N2ブロー乾燥する。このとき、NEPチップは、EV産生運転の次のバッチの準備ができている。
CCMを200×gで5分間遠心分離して細胞および残屑を除去する。細胞を除去したCCMを2000×gで30分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。細胞残屑を除去したCCMを、ペレットを乱すことなく新しいチューブに移す。
NTA/DLS装置ならびにEV単離を使用してEV数およびサイズ分布を測定するために、CCMが4Cで保存される。CCMが4℃で48時間を超えて保存される場合、CCMは凍結され、下流での使用のために-80℃で保存される。
CCMをEV隔離室に戻す前に、サンプリング試料をEV検証に送る。NanoSight NS300は、EV検証で溶液中10nm~2000nmのナノ粒子を特性評価するためにナノ粒子追跡分析(NTA)を利用する。EV検証でのサイズに基づくEV数定量化の更なる分析のために、NTA結果をDLSおよびqNano測定と比較する。
必要に応じて、EVの事前検証のために無菌試験などの他の試験を行うことができる。すべての試験が完了し、基準に合格した場合、合格試料でEV単離を行う。
TFFシステムによるcGMP適合性EV単離
TFFシステムによるcGMP適合性EV単離
タンジェンシャルフロー濾過(TFF)をEV単離に使用して、回収されたCCMから非EV成分を除去し、その後に濃縮することができる。TFFシステムを使用したCCMのEV単離のために、CCMサンプルを0.8μmフィルターで濾過する。50mL未満のCCMからの小規模EV単離では、TFFシステムを設定し、これは、25cm長さの管を備えたMasterflex L/S(登録商標)デジタルドライブポンプ(Digital Drive pump)(Cole-Parmer、EW-77921-65)、50mLコニカル型遠心管、メスおよびオスルアースレッドスタイルバーブ(Female and Male Luer Thread Style Barbs)、ストップコック、および500kDaのTFF中空糸フィルター(Repligen、C02-S500-05-N)からなる。50mLコニカル型遠心管をTFFシステムの50mLコニカル型遠心管のキャップにねじ込む。濾過したCCMサンプルを50mLコニカル型遠心管に添加する。
デジタルドライブポンプを始動させ、次いで、ポンプによる自動圧送によってTFF中空糸フィルターを通して培地を穏やかに循環させる。ポンプを35mL/分の速度に設定する。
サンプルを最初に濾過し、コニカル型遠心管に5mLのCCM(ホールドアップ体積)が残るまで濃縮する。ポンプを停止し、次いでPBSストップコックを開き、洗浄緩衝液をCCMサンプルに添加する。タンパク質汚染物質を完全に除去するために、ポンプを35mL/分で2時間始動し、ダイアフィルトレーションプロセスを2時間行う。ポンプを停止する。PBSストップコックを閉じる。ポンプを35mL/分で再起動し、コニカル型遠心管の残量がゼロになるまでサンプルを濃縮する。ポンプを停止する。精製CCMサンプルを2mLに回収する。
TFF精製EV含有溶液のNTA測定後、NTAデータからのEV濃度が1e11/mL未満である場合、サンプルを10KDaのAmicon Ultra-4遠心フィルターユニット(Millipore社製、カタログ番号UFC801096D)を使用して濃縮する。
必要量(1~4mL)の精製EV溶液を遠心フィルターユニットに移す。エッペンドルフ社性5804(15mL)卓上遠心機を用いて、TFF処理済みCCMサンプルを3000×gで30分間、4℃で遠心分離して、最終容量を80uLにする。
EV数およびサイズ分布の測定ならびにEV検証のために、TFF処理済みCCMサンプルを4℃で保存する。
500mL超のCCMからのより大規模なEV単離のために、Solaris Biotech Solution社のKRONOS卓上自動TFFシステムを使用する。70mL(ホールドアップ体積)のTFF処理済みEV溶液でNTAを測定し、NTAデータからのEV濃度が1e11/mL未満である場合、サンプルを10KDaのAmicon Ultra-15遠心フィルターユニット(Millipore社製、カタログ番号UFC901096)を使用して濃縮する。必要量(4~15mL)の精製EV溶液を遠心フィルターユニットに移す。エッペンドルフ社性5804(50mL)卓上遠心機を用いて、TFF処理済みCCMサンプルを3000×gで30分間、4℃で遠心分離して、最終容量を250uLにする。TFF処理済みCCMが4℃で6時間を超えて保存される場合、CCMは凍結され、下流での使用のために-80℃で保存される。
臨床パイロットスケール(20L超)の場合、単回使用TFFシステムは、Sartorius AG社製CS 1000 Systemを用いて開発することができる。
SECカラムによるcGMP適合性EV単離
SECカラムによるcGMP適合性EV単離
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムを使用して、回収されたCCMからEVを非EV成分から単離した。SECカラムを使用したCCMのEV単離のために、CCMをより高いEV数/mL(1e11/mL超)に濃縮する。
0.5mL未満の凝縮CCMからの小規模EV単離において、SECカラムをホルダーにセットし、qEVカラムを使用前に20mLのPBSで洗浄した。下部キャップを用いて、上部フィルタの上の緩衝液をピペットで取り出す。0.5mLの凝縮CCMをロードし、直ちに底部キャップを取り外して0.5mL画分の回収を開始する。サンプルの最後がちょうどカラムに入るときに更なる緩衝液を添加するが、トップフィルターの上に2mLのみを添加する。必要に応じて、0.5mLずつ連続画分を30回回収する。qEV35カラムを使用する場合、画分8~10を合わせてEV溶液にする。qEV70カラムを使用する場合、画分9~11を合わせてEV溶液にする。
各画分または合わせた画分を、10kDaのMWCOを含むAmicon Ultra-4デバイスを使用して濃縮した。エッペンドルフ社性5804(15mL)卓上遠心機を用いて、SEC処理済みCCMサンプルを3000×gで30分間、4℃で遠心分離して、最終容量を80uLにする。中規模のEV単離のために、qEV100-35カラムを、100mLの回収されたCCMまたはAmicon Ultra-15によって濃縮されたCCMと共に使用することができる。ハイエンドのEV精製のために、TFFおよびSECシステムを一緒に合わせる。
TFF処理済みCCMサンプルは、ハイエンドのダウンストリームアプリケーション用のSECカラムによってさらに精製することができる。ハイエンドのSECでは、qEV10-35(SP7 w/AFC)カラムを自動画分コレクター(AFC)と共に使用することができる。臨床パイロットスケール(20L超)の場合、単回使用液体クロマトグラフィーは、Cytiva(旧GE Healthcare社の一部)のAKTA readyシングルユースシステム(カスタマイズされたレディ充填カラム)で開発することができる。
実施例7.CNPは、COL1A1 mRNAロードEVを大量に生成し、インビトロで首尾よく送達した。
実施例7.CNPは、COL1A1 mRNAロードEVを大量に生成し、インビトロで首尾よく送達した。
コラーゲンIは、真皮細胞外マトリックス中の主要なコラーゲンであり、コラーゲンIアルファI(COL1A1)遺伝子によって部分的にコードされる。ヒトCOL1A1 mRNAロードEVを生成するために、新生児ヒト真皮線維芽細胞(nHDF)の単層をナノポア表面にプレーティングし、細胞をCOL1A1-GFPプラスミドでナノトランスフェクトする細胞ナノポレーション(CNP)技術を採用した(図7Aおよび図7Bを参照のこと)。簡潔には、新生児ヒト初代真皮線維芽細胞(nHDF、PCS-201-010)をATCC社から購入した。nHDFを、10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS;カタログ番号:10099141C Thermo Fisher Scientific)を含有するDMEM(Thermo Fisher Scientific)中で、5%CO2で平衡化した加湿条件にて37℃で培養した。CNPの場合、前述のように一晩のインキュベーションのために、1cm×1cmの3D CNPシリコンチップ表面にnHDFの単層をプレーティングした。GFPタグを有するヒトCOL1A1 cDNA(NM_000088.3)プラスミドを、Sino Biological社(カタログ番号HG11776-ACG)から購入した。PBS緩衝液に予めロードしたプラスミドを、0.1秒間隔で10ms/パルスで10パルスの100V電界を使用してナノチャネルを介して個々の細胞に注入した。最適条件を決定するために、様々なエレクトロポレーション条件を試験した。BEP(Gene Pulser Xcell、Bio-Rad)、20ms、1パルスの250V電界を使用。トランスフェクションのためのPBS中500ng/mlの濃度のpCMV-COL1A1-GFPプラスミド。
EVをトランスフェクションの翌日に培養培地から単離した。簡潔には、細胞を、血清を含有するDMEM培地中で培養した。血清を含む細胞培養培地は、CNPを行う際に除去した。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、CNP後に無血清細胞培養培地中で24時間培養した。EVを細胞培養上清から回収した。簡単に説明すると、細胞培養培地(CCM)を200×gで5分間遠心分離して、2000×gで30分間処理した後に細胞および残屑を除去した。Amicon Ultra-4遠心式フィルターユニット、10kDa(Millipore社、カタログ番号801024)を使用してCCMを濃縮した。EVサンプルを、全エキソソーム単離試薬(Invitrogen社、カタログ番号4478360)を使用して精製した。EV粒径および数は、NanoSight NS300(Malvern社、英国)によって測定した。RNA収率およびサイズ分布を、RNA 6000 Picoキット(Agilent Technologies社、米国カリフォルニア州フォスターシティ)を備えたAgilent 2100 Bioanalyzerを使用して分析した。
CNP処理細胞は、標準的なバルクエレクトロポレーション(BEP)法で処理した細胞または培養物中の未処理nHDFと比較して、細胞あたりのEV数が10倍高いことが分かった(図7Cを参照のこと)。各方法によって産生されたEVは物理的に均一であり、CNP産生EVのナノ粒子追跡分析(NTA)によって決定されるように、サイズ分布は直径約100nmでピークに達した(図7Dを参照のこと)。
ウェスタンブロット実験は、CNP処理群におけるエキソソーム(CD9、CD63、TSG101)および微小小胞(ARF6)バイオマーカーの発現が未処理群よりも有意に高いことを示し、分泌されたEVの増加を確認した(図7Eを参照のこと)。簡潔には、エキソソームを、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete,Roche)を含有するRIPA緩衝液(50mMのTris-HCl pH8、150mMのNaCl、1%Triton(登録商標)X-100、0.1%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1%SDS)に溶解した。すべてのサンプルタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)(MerckMillipore社 NO:IPVH 00010)膜に移し、300mAで90分間電気泳動した。膜をBSAで1時間ブロックし、適切な濃度の一次抗体(1:1000)を添加して4℃で一晩インキュベートした。膜を適切なサイズに切断し、一次抗体とインキュベートし、適切な濃度の二次抗体(1:15,000)と暗所で室温で1時間インキュベートした。膜中のタンパク質バンドをUVP Bio Imaging Systemによって可視化した。以下の抗体を使用した:抗CD63抗体(Abcam社、ab68418)、抗CD9抗体(Cell signaling社、カタログ番号13403S)、抗TSG101(Abcam社、ab125011)、および抗Arf6(Abcam社、ab77581)。速度論的分析はさらに、電圧最適化EV(図7Fを参照のこと-100Vの電圧でEVの最大数が生成された)放出がCNP誘導の8時間後にピークに達し、4時間ごとに上清を回収すると、次の24時間にわたって継続した分泌が認められたことを示した(図7Gを参照のこと)。最後に、RT-qPCRは、CNP分泌EVが、BEP分泌EVよりも200倍超のCOL1A1 mRNAを含有し、非トランスフェクト細胞から分泌されたEVよりも3000倍高いCOL1A1 mRNAを含むことを示した(図7Hを参照のこと)。簡潔には、EV中のヒトCOL1A1 mRNAの発現を、製造業者の推奨プロトコルに従ってRT-qPCRを使用して測定した。簡単に説明すると、精製EVからの全RNAを、RNA精製Miniキット(Norgen Biotek社、カタログ番号55000)およびDNA除去キット(Norgen Biotek社、カタログ番号25720)によって得た。SuperScript(商標)III First-Strand Synthesis System(Invitrogen社)を使用して、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して第一鎖cDNAを合成した。遺伝子の発現は、TB Green(登録商標)Premix Ex TaqTM II(タカラ社、カタログ番号RR820)を使用して測定した。使用したプライマー配列は以下のとおりであった:COL1A1(ヒト)、フォワード:5’-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3’およびリバース:5’-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3’;Gapdh(ヒト)、フォワード:5’-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3’およびリバース:5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’ゲルアガロースのバイオアナライザー評価は、約4000ヌクレオチドで大量の全長転写COL1A1 mRNAを実証した(図7Iを参照のこと)。
インビトロでCOL1A1 mRNA含有EV(COL1A1-EV)の治療可能性を評価するために、COL1A1-EVを線維芽細胞と共に48時間インキュベートした(図7Jを参照のこと)。線維芽細胞の増殖は、COL1A1-EV処理で用量依存的に増加することが観察された(図7Kを参照のこと)。簡潔には、培養培地から血清を除去することによって、60,000 個のnHDF細胞を一晩血清飢餓にした。24時間後、nHDF細胞を10ulの異なる濃度のEV(0、10、20、30μg/mL)で処理した。Cell Counting Kit-8(ab228554、abcam社)を使用して増殖を行った。EVで処理した後、CCK-8試薬を0、24、48時間で各ウェルに添加した。BioTek(BioTek Instruments社、米国バーモント州ウィヌースキ)を使用して460nmでの吸光度を読み取り、記録した。処置後、免疫蛍光顕微鏡下でのCOL1A1とのGFPの共局在化の増加によって証明されるように、COL1A1-EVで処置した線維芽細胞において、COL1A1タンパク質発現の上昇が観察された。対照的に、COL1A1レベルは、非処理群においてGFPの共局在化なしで実質的に低かった(図7Lおよび図7Mを参照のこと)。簡潔には、組織切片を4%パラホルムアルデヒドにより室温で20分間固定処理し、PBS(Vetec社)により各々5分間、3回洗浄し、次いで、組織を0.2%Triton(登録商標)X-100に15分間移し(透過処理)、続いて、BSAにより40分間ブロッキング処理し、ブロッキング処理のための一次抗体(ab34710およびab6556、Abcam社)を4℃で一晩添加した。最後に、二次抗体(ab6939およびab6717、Abcam社)を添加し、室温で60分間置いた。PBSで洗浄した後、核染色のためにDAPI(ThermoFisher社)を添加し、次いで、観察のためにマウントした。EV細胞更新アッセイでは、EVをCNPから回収し、24ウェルプレート中の60,000個のnHDF細胞と共に37℃で4時間インキュベートした後、処理した。インキュベーション後、細胞を冷PBSで3回すすぎ、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した。ImageJ(NIH社)を使用して細胞蛍光強度を分析した。
レシピエント細胞へのmRNA送達の成功は、COL1A1-EVで処理した線維芽細胞における、それぞれqPCRおよびウエスタンブロット分析によって測定されたコラーゲンmRNA発現およびコラーゲンタンパク質レベルの上昇によってさらに確認された(図7N、図7Oおよび図7Pを参照のこと)。簡潔には、目的の組織を(氷上で)解剖した後、組織5mgあたり300μLの氷冷溶解緩衝液を添加し、混合物を電気ホモジナイザーで均質化し、均質化中に追加の300~600μLの溶解緩衝液を添加した。均質化後、混合物を4℃で2時間撹拌し、次いで、16,000×gで20分間、4℃で遠心分離した。次いで、上清を氷上の新しいチューブに回収し、ペレットを廃棄した。24時間および48時間のEVを定量的リアルタイムPCRのために回収し、結果は、48時間で最大に達するCOL1A1 mRNAの増加を示した。さらに、COL1タンパク質の前駆体であるプロコラーゲンIは、COL1A1-EV処理後に有意に増加し、未処理線維芽細胞と比較してEV処理線維芽細胞によるCOL1A1タンパク質合成の改善をさらに示した(図7Qを参照のこと)。簡潔には、細胞培養培地をEV処理細胞から回収した。ヒトI型プロコラーゲン濃度をELISA(ab210966,Abcam社、英国ケンブリッジ)によって測定した。BioTek(BioTek Instruments社、米国バーモント州ウィヌースキ)を使用して450nmでの吸光度を測定した。
さらに、レシピエント細胞において外因的に送達されたCol1A1が内因性Col1A2とコラーゲンを形成するかどうかを調べるために、IHCの共染色を行った。Col1A1およびCol1A2からのシグナルの共局在化が観察されたが、いくつかの他の外因的に送達されたCol1A1シグナルはCol1A2と共局在化しなかった。
以前は、核酸送達に焦点を当てたほとんどの研究は、ペイロードとしてmiRNAおよびsiRNAなどの10~20ヌクレオチド範囲の小分子を封入していたが、mRNAなどのより大きな核酸は、それらをEVにロードすることが困難であるためにほとんど評価されなかった。しかしながら、上記の知見は、CNPが高コピー数のCOL1A1 mRNA(4,000ヌクレオチド超)をEVにロードすることができたことを実証しており、これは挿入後のロード法では達成することができない成果である。また、機能的COL1A1 mRNAがCNPによってEV内に封入され得ること、およびこのCOL1A1-EV送達系がインビトロでCOL1A1タンパク質発現を有意に増加させたことも示されている。
実施例8.COL1A1-EV送達後のCOL1A1 mRNA発現およびタンパク質翻訳のインビボ動態
実施例8.COL1A1-EV送達後のCOL1A1 mRNA発現およびタンパク質翻訳のインビボ動態
インビボでのEV媒介性COL1A1 mRNA送達およびタンパク質形成の動態を理解するために、COL1A1-EVを、インスリンニードル注射器を介してマウスの真皮に皮下送達した。COL1A1 mRNA定量化のためのRNAscopeによる組織学的分析のために、マウスを次の14日間にわたって屠殺した。COL1A1 mRNAは、送達後12時間で局所皮膚組織において有意に上昇することが見出され、注射後24時間および48時間で顕著な減少が観察され、96時間までにベースラインCOL1A1 mRNAレベルに戻った(図8Aおよび図8Bを参照のこと)。簡潔には、10~12週齢のヌードマウスをイソフルランで麻酔し、背側皮膚領域に50uLの3×108個のCNP COL1A1 mRNA EVを注射した。皮膚注射後の所定の時点(0、12、24、48、96時間、7日、10日、14日)で、皮膚を切除し、固定のために4%ホルムアルデヒドに入れた。続いて、切片をパラフィンに包埋し、さらに4um切片に分割した。ヒトCOL1A1 mRNAを検出するためのRNAscope自動インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを行い、すべてのインサイチュハイブリダイゼーション試薬は、HybEZ(商標)II Hybridization System(ACD)を使用して行うACD産物(Advanced Cell Diagnostics社、米国カリフォルニア州ニューアーク)であった。簡単に記載すると、標的回収を、Leica Epitope Retrieval Buffer 2を使用して95℃で15分間行い、続いて、プロテアーゼ処理を42℃で15分間行った。プローブ(RNAscope(登録商標)プローブ-Hs-COL1A1 カタログ番号401891;ACD)を40℃で2時間ハイブリダイズさせ、続いてRNAスコープ増幅し、染色の可視化のためにRNAscope(登録商標)2.5 HD Assay-BROWNキットを使用した。陰性対照としてRNAscope 2.5 LSプローブ-Rn-Ppibを使用した。
COL1A1 mRNAのタンパク質へのインビボ翻訳を、30日間にわたる外植組織の免疫蛍光顕微鏡法によって評価した。GFP+COL1A1+免疫染色された移植片は、注射後12時間もの早期に観察され、送達後4日でピーク蛍光を有していた(図8C、図8D、および図8Eを参照のこと)。GFP+COL1A1+タンパク質移植片は、大部分のCOL1A1 EV由来タンパク質が30日目までに反転する免疫蛍光顕微鏡法によって観察されるように、注射後4日目から30日目まで時間依存的に減少することが観察された。これらの所見は、COL1A1-EV送達がレシピエント組織におけるCOL1A1 mRNA発現の3~4日のパルスをもたらし、タンパク質発現がmRNAターンオーバー後早期にピークに達し、注射後30日目までにベースラインレベル付近まで低下したことを示唆する。
実施例9.コラーゲン枯渇皮膚光老化モデルにおけるCOL1A1-EVのインビボ治療有効性
実施例9.コラーゲン枯渇皮膚光老化モデルにおけるCOL1A1-EVのインビボ治療有効性
真皮コラーゲンを置換するCOL1A1-EVの治療可能性を、UV真皮照射(図9Aを参照のこと)を含む光老化モデルで評価した。無胸腺無毛マウスに8週間にわたってUVB(311nm)を照射すると、コラーゲン枯渇に続発する真皮のしわが形成された。簡潔には、すべての動物実験は、深セン湾研究所または提携研究所の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認された。皮膚光老化モデルを作製するために、雌のヌードマウス(10週齢~12週齢)に、以下のように8週間、1日おきに背部皮膚のUVB照射を行った。マウスを1.5%イソフルランで麻酔し、次いで、UV照射をUVランプ(Philips社,米国ニュージャージー州サマセット群)で送達した:発光スペクトル311nm、1日おきにマウスの背部皮膚上30cmに8週間照射した。UV照射強度は、最小紅斑量(MED)として表され、最初の2週間は1MED(60mJ/cm2)に設定され、実験の第3週には2 MED(120mJ/cm2)に、第4週には3MED(180mJ/cm2)に、そして第5週から第8週には4MED(240 mJ/cm2)に上昇した。総照射UVB体積は約80MEDであった。光老化した皮膚のシリンジベースの処置のために、上記の8週間の照射期間後のヌードマウスを、5つの治療群のうちの1つ(各4匹のマウス)に割り当てた:(a)UVB照射+50μL生理食塩水;(b)UVB照射+0.05%レチノイン酸;(c)UVB照射+32Gハミルトンシリンジで送達した50μLのnHF-EV;(d)UVB照射+50μL(生理食塩水で希釈した3.78×108個の粒子)のnHDF CNP COL1A1-GFP-EVを32Gハミルトンシリンジで送達;および(e)UVB曝露なし(Sham)。皮膚処理を0、4、7、14および21日目に行った。背部皮膚全体を3つの部分に分けて分析した。しわ形成を処置開始後0、4、7、14、21および28日目に追跡し、組織学および皮膚プラスターレプリカ分析のためにすべての動物を28日目に屠殺した(図9Bを参照のこと)。
処置期間にわたる真皮のしわの顕微鏡写真は、非ロードEVおよびレチノイン酸群について、生理食塩水対照群と比較して、28日目までにしわの数および面積の中程度の減少を示した(図9Cを参照のこと)。対照的に、皮下COL1A1-EVで処置した光老化マウスは、処置開始後7日目からしわの数および面積の減少を示し、14日目以降は非照射sham対照で観察されたレベルと同様のレベルまで有意に減少した(図9Dおよび図9Eを参照のこと)。次いで、マウスの背部皮膚に対して処置の最後に皮膚レプリカを行った。SILFLOシリコーンレプリカおよびリングロケーターをClinical&Derm,LLC(米国テキサス州ダラス)から入手した。処置期間の終了時に、マウスの背側(背部)皮膚のレプリカを得た。レプリカを立体顕微鏡法(Olympus SZX 7)によって分析し、対応する画像をImageJ(NIH社)によって分析した。処置開始後28日目に採取した背部皮膚の皮膚プラスターレプリカは、生理食塩水対照、非ロードEV対照、およびレチノイン酸(図9F、図9G、および図9Hを参照のこと)と比較して、光老化した皮膚を処置するためのCOL1A1-EVの有効性を確認した。28日目の皮膚プラスター評価後、動物のサブセットをさらに4週間保持して、しわ減少期間を監視した。真皮のしわは、処置開始後35日目から始まって1週間後の早期に再出現することが見られ、56日目までに真皮のしわは処置前のレベルと統計的に区別できなかった(図9I、図9J、および図9Kを参照のこと)。具体的には、結果は、生理食塩水対照と比較して、7日目に始まり28日目まで続くCOL1A1-EV群の皮膚しわ面積の漸減を示した(***P<0.001)。COL1A1-EVコホートの背側のしわは、処置後49日目に再出現した。COL1A1-EVコホートにおけるしわの定量化は、56日目からの回復を示した。しかしながら、COL1A1-EVを投与された光加齢マウスは、14日目以降、対照非ロードEVおよび局所RA処理マウスと比較して、非照射sham対照において同様のレベルまで有意な効果を示した。
COL1A1 EV送達からの真皮コラーゲン生着を評価するために、処置開始後28日目にすべての群から真皮を切除し、免疫蛍光顕微鏡法ならびにマッソン・トリクローム染色によって評価した。組織学的分析により、COL1A1タンパク質発現が他の群と比較してCOL1A1 EV処置後に有意に回復したことが明らかになった(図9Lおよび図9Mを参照のこと)。マッソン・トリクローム染色により、COL1A1-EVを与えたマウスでは、生理食塩水対照、レチノイン酸、または非ロードEVを与えたマウスよりも高レベルのコラーゲン染色および真皮の厚さが確認された(図9Nおよび図9Oを参照のこと)。
実施例10.タンパク質生着を改善するための新規マイクロニードル(MN)EV mRNA送達システムの設計
実施例10.タンパク質生着を改善するための新規マイクロニードル(MN)EV mRNA送達システムの設計
タンパク質置換の持続時間およびコラーゲン生着の有効性を改善するために、新規ヒアルロン酸マイクロニードル製剤(HA+EV MN)を設計して、EV媒介性mRNA組織送達を改善した。これらのニードルキャビティは、700μmの先端間隔を有する10×10アレイに配置された。MNパッチの調製のために、最初に、ddH2Oを使用して、重合を可能にしたヒアルロン酸粉末(低MWヒアルロン酸10000Da~200000Da)を溶解した。150ulの15重量%HA溶液を50ulのEVと混合し、30分間真空下に保った。混合物をポリジメチルシロキサン(PDMS)鋳型の先端に流し込んだ。ニードル先端でEVを濃縮するために、鋳型を4℃で4時間保持した。最後に、1mLの15重量%HA溶液をマイクロ鋳型にロードし、乾燥させた。乾燥後、更なる使用のためにMNパッチをシリコーン鋳型から取り外した(図10Aを参照のこと)。HA+EV MNパッチの各ニードルを、その基部で400μmの円形直径および1000μmの高さ(図10Bを参照のこと)を有する円錐形状に成形した。EVをロードした10%、15%、または20%HAを含むパッチの機械的強度を、引張試験機(図10Cを参照のこと)で評価した。MNを平坦な金属プレート上に置き、液体窒素を使用してプローブおよび金属プレートを冷却した。直径5mmの先端が平らなステンレス鋼の円筒形プローブ(0.5mm/分の一定速度)を、MN先端に垂直な力で加えた。MNの機械的強度はHAの濃度と共に増加することが分かった。15%HA+EV MNの荷重破断力は、皮膚貫通に必要な最小平均力(0.058N)よりも高いことが確認され、10%HAよりも破損したマイクロニードルが少ないことが示された(図10Dを参照のこと)。
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色により、MNが角質層を通って真皮(516±76μm)に浸透したことが確認された(図10Eを参照のこと)。簡潔には、ヌードマウスの皮膚標本を4%パラホルムアルデヒド溶液中で48時間固定し、パラフィンに包埋し、5μm厚の切片に切片化した。H&E染色のために、サンプルを脱ワックスし、水和し、ヘマトキシリンおよびエオシン色素で染色し、脱水した。EV送達のために、HA+EV MNパッチをマウスの背部皮膚に押し付け、15分後にMNベースを除去した。この期間中、MNは完全に溶解し、目に見える皮膚刺激も投与部位のマーキングもなかった(図10Fを参照のこと)。MNを介して送達されたEVの組織分布をインスリンシリンジによって送達されたEVの組織分布と比較するために、EVをDiI(1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート;Beyotime社、C1036)で標識し、レシピエントマウスの背部皮膚の下に皮下投与し、その後、免疫蛍光顕微鏡法による組織学的評価を行った(図10G、図10H、および図10Iを参照のこと)。組織分布分析により、シリンジニードル注射は、真皮および皮下組織の特定の領域に集塊を有するEVの不均一な送達をもたらしたが、MNによって送達されたEVは真皮および皮下組織により良好に分散されたことが明らかになった。具体的には、diI標識EVをシリンジニードル(図10Hを参照のこと)またはMNパッチ(図10Iを参照のこと)のいずれかによって皮下注射した。HA MNによって送達されたEVの皮下分布は、シリンジニードルによって送達されたものよりも均一であった(図10Kおよび図10Lを参照のこと)。シリンジニードルの剪断応力によって引き起こされるEVへの潜在的な損傷をさらに調べるために、同じ数のEVを採取し、シリンジまたはHA MNのいずれかを備えたPBSを含むブランク細胞培養プレートに注射した。極低温電子顕微鏡法は、主にシリンジニードル条件での液体の流量によって生成される剪断力のために、MN条件がEVの形態および構造をより良好に保存したことを示した(図10Mおよび図10Nを参照のこと)。簡潔には、回収したEVをチューブに懸濁し、パラホルムアルデヒドと共にインキュベートし、次いで、予め調製した銅グリッドにロードし、インキュベートして吸着させた。次に、酢酸ウラニルを銅メッシュ(ウラニルイオンを膜タンパク質および脂質に結合させる重金属染色剤)に添加した。最後に、グリッドを水で洗浄し、乾燥させて、TEM画像化のために過剰な染色を除去した。
改善された組織分布およびEV膜保護が改善されたEV生着をもたらすかどうかを評価するために、マウスに皮下注射されたDiI標識EVの連続インビボ蛍光イメージングを14日間にわたって使用した。蛍光イメージングにより、注射後最初の4日間、シリンジ送達EVとMN送達EVとの間で同様のDiI EVシグナルが確認された。しかしながら、HA+EV MN群は、7日目(36.7+1.5%HA+EV MN対30+4.3%ニードル、P<0.001)および注射後10日目(28.0+1.5%HA+EV MN対8.4+1.3%ニードル、P<0.001)に有意に高い蛍光シグナルを有し、MNパッチの使用が組織におけるEVの長期EV保持を改善したことを示唆した(図10Oおよび図10Pを参照のこと)。簡潔には、MN処置マウスを、0、1、3、7および14日目にインビボイメージングシステム(IVIS、スペクトル、Perkin Elmer社)でイメージングした。パラメーターを以下のように設定した:指定されたRFP画像化時間での露光時間は15秒、励起570nm、発光680nm、2F/停止、および13.6cmの視野であった。RFP蛍光強度の定量分析は、関心領域(ROI)の平均放射効率(光子s-1cm-2 sr-1μW-1)を測定することによって行った。データを0日目の蛍光強度に対して正規化した。
実施例11.コラーゲンのインビボタンパク質置換のためのHA+EV MN送達システムの治療有効性
実施例11.コラーゲンのインビボタンパク質置換のためのHA+EV MN送達システムの治療有効性
COL1A1 mRNA EV送達を送達するための本明細書に開示されるカスタムHA+EV MNパッチの使用が、光加齢マウス(図11Aを参照のこと)の皮膚における改善されたインビボタンパク質置換をもたらし得るかどうかを調べた。無胸腺マウスを再び8週間のUV照射(図9Aを参照のこと)に供し、4つの処理群のうちの1つ(各マウス4匹)に割り当てた:(a)UVB照射+50μL生理食塩水;(b)UVB照射+32Gハミルトンシリンジによって送達された50μL(生理食塩水で希釈した約1010個の粒子)nHDF CNP COL1A1-GFP mRNA EV;(c)UVB照射+HA MNパッチ;(d)UVB照射+CNP COL1A1-GFP mRNA EVと混合した15%HA。すべてのマウスに、処置スケジュールの0日目に50ngのCOL1A1 mRNA(または対照群については同等の体積)の単回用量注射を行った。
注射後、90日目まで、すべてのマウスを背部皮膚のしわの顕微鏡写真によって監視した(図11Bを参照のこと)。処置前のベースラインに戻る前に最大35日間しわ形成を減少させたシリンジニードル注射と比較して、HA+EV MNによるCOL1A1 mRNAの送達は、ベースラインのレベルに戻る前に最大70日間しわ面積および数を実質的に減少させることが見出された(図11Cおよび図11Dを参照のこと)。これらの所見をさらに確認するために、各群からのマウスのサブセットを、背側皮膚および組織学の皮膚レプリカプラスター評価のために30、60、または90日目に屠殺した(図11E、図11F、図11Gを参照のこと)。ニードル注射およびHA+EV MN処理の両方が、処理後30日目までしわの長さおよび深さを減少させた(図11Hおよび図11Iを参照のこと)。しかしながら、HA+EV MNで処置したマウスのみが、最長60日間、しわの長さおよび深さの有意に長期にわたる減少を示した。
試験の30、60、および90日目に採取した皮膚サンプルの組織学的分析により、30日目に、ニードル注射群とHA+EV MN群の両方で、マウスの真皮および皮下組織におけるGFP+COL1A1タンパク質生着の持続的な生着が確認された(図11Jを参照のこと)。しかしながら、60日目に、HA+EV MNを受けたマウスのみが、真皮および皮下組織におけるGFP+COL1A1生着を示した(図11Kを参照のこと)。90日目に採取した皮膚サンプルの免疫蛍光顕微鏡法は、処理群のいずれにおいてもGFPコラーゲン移植片を明らかにせず(図11Lおよび図11Mを参照のこと)、30~60日目に有効な処置を示し、70~90日目から処置前のベースラインに戻るしわ顕微鏡法の所見を裏付けた。
COL1A1タンパク質の免疫組織化学(IHC)染色および真皮組織のマッソン・トリクローム染色により、真皮中のコラーゲンの量が免疫蛍光顕微鏡所見と相関すること、およびすべてのコホートの中で、HA+EV MN群が最も豊富なコラーゲン線維および試験の60日目までの真皮の厚さを有することが確認された(図11Nおよび図11Oを参照のこと)。簡潔には、組織切片を4%パラホルムアルデヒドにおいて20分間固定処理し、PBS(pH7.4)により各々5分間3回洗浄し、その後、電子レンジにおける抗原回復のためのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(pH9.0)抗原回復溶液を含有する回復ボックスに移した。その後、切片を3%過酸化水素溶液中、室温にて暗所で25分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、組織を3%BSAまたは10%正常ウサギ血清で均一に被覆した。室温で30分間ブロッキングした後、一次抗体(ab34710およびab6556、Abcam社)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、一次抗体に対応する二次抗体(HRP標識)を組織切片を覆うように添加し、室温で50分間インキュベートした。DAB発色:スライドをPBS(pH7.4)に入れ、脱色シェーカーで振盪しながら3回、毎回5分洗浄した。切片をわずかに乾燥させた後、新たに調製したDAB発色溶液を円形に滴加した。現像時間を顕微鏡下で制御した。ヘマトキシリン、ヘマトキシリン分化溶液およびヘマトキシリンブルー戻し液を核対比染色のために順次添加した。最後に、ガラススライドを無水エタノールおよびキシレン中に入れて脱水および密封した。マッソン・トリクローム染色のために、パラフィン包埋した皮膚試料をそれぞれブアン液、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン作業溶液、リンモリブデン-リンタングステン酸溶液およびアニリンブルー溶液で染色および脱水した。屠殺日にノギスを用いてマウスの背部皮膚厚さを測定した。
まとめると、これらの知見は、新規のHA+EV MNシステムを介したCOL1A1 mRNAの封入および送達が、シリンジニードル送達の2倍を超える期間にわたって、光老化した皮膚におけるコラーゲンタンパク質置換を延長させることを示した。特に、COL1A1 mRNAをロードしていないEVも、しわの数の適度な減少を達成することができた。
上記の開示は、明確さおよび理解のためにある程度詳細に記載されているが、本開示の理解から当業者には、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることは明らかであろう。例えば、上述したすべての技術および装置は、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれるように個別かつ別個に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
Claims (108)
- 外因性細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、複数の細胞外小胞。
- 前記外因性細胞外マトリックスmRNAがコラーゲンをコードする、請求項1に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項2に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンがII型コラーゲンである、請求項2に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)またはプロアルファ1(I)鎖である、請求項2に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンがCol1A1であり、前記複数の細胞外小胞がI型コラーゲンのアルファ2鎖(Col1A2)を含まない、請求項6に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記コラーゲンがCol1A2である、請求項2に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、450個のEVあたり平均で少なくとも1個のコピーの前記外因性細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、2000個のEVあたり、1000個のEVあたり、500個のEVあたり、400個のEVあたり、300個のEVあたり、200個のEVあたり、150個のEVあたり、100個のEVあたり、90個のEVあたり、80個のEVあたり、70個のEVあたり、60個のEV、50個のEV、40個のEVあたり、30個のEVあたり、20個のEVあたり、15個のEVあたり、10個のEVあたり、5個のEVあたり、2個のEVあたり、または1個のEVあたり、平均で少なくとも1個のコピーの前記外因性細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、細胞外マトリックスタンパク質をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって産生される、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記細胞の前記トランスフェクトすることが、細胞ナノポレーションによって行われる、請求項11に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記細胞がヒト細胞である、先行する2つの請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記細胞が、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、および新生児ヒト真皮線維芽細胞からなる群より選択される線維芽細胞である、先行する3つの請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、少なくとも1つのエキソソームを含む、請求項15に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体のうちの少なくともいずれか2つの混合物を含む、請求項15に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはそれらの任意の組み合わせを介した注射用に製剤化される、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの前記細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、直径50nm~200nmにピークを有するサイズ分布を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記細胞外小胞が、直径が20nm、30nm、50nm、75nm、または100nm超である、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記外因性細胞外マトリックスmRNAが、同一量の天然に存在する細胞外小胞中の前記外因性細胞外マトリックスmRNAのレベルよりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、同程度の数の天然に存在する細胞外小胞と比較して、以下のマーカー:CD9、CD63、TSG101、またはARF6のうちの少なくとも1つのより高いレベルを発現する、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を含む容器であって、前記容器が細胞をさらに含む、容器。
- 前記細胞が、ヒト細胞、ヒト線維細胞、線維芽細胞、真皮線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、成体線維芽細胞、ヒト成体線維芽細胞、新生児線維芽細胞、新生児ヒト線維芽細胞、新生児ヒト真皮線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の容器。
- 前記複数の細胞外小胞が、細胞あたり少なくとも1000、2000、5000、10000、または12000個の細胞外小胞の比率で前記容器中に存在する、先行する2つの請求項のいずれか1項に記載の容器。
- 請求項1から24のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を含む、ニードル。
- 前記ニードルがマイクロニードルである、先行する請求項に記載のニードル。
- 前記ニードルがヒドロゲルニードルである、先行する2つの請求項のいずれか1項に記載のニードル。
- 前記ヒドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項30に記載のニードル。
- 前記ヒドロゲルがヒアルロン酸を含む、請求項31に記載のニードル。
- 前記ヒドロゲルが、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む、請求項32に記載のニードル。
- 請求項1から24のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を含む、シリンジ。
- 前記複数の細胞外小胞がヒアルロン酸に懸濁されている、先行する請求項に記載のシリンジ。
- ヒドロゲルマイクロニードルであって、前記ヒドロゲルマイクロニードルが複数の細胞外小胞を含む、ヒドロゲルマイクロニードル。
- 前記ヒドロゲルが、少なくとも1%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のヒアルロン酸を含む、先行する請求項に記載のヒドロゲルマイクロニードル。
- 前記ヒドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行する2つの請求項のいずれか1項に記載のヒドロゲルマイクロニードル。
- 前記複数の細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のヒドロゲルマイクロニードル。
- 前記ヒドロゲルマイクロニードルが、1つまたはそれを超えるmRNAカーゴがロードされた細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のヒドロゲルマイクロニードル。
- 複数の細胞外小胞を含むニードルであって、前記細胞外小胞が少なくとも1つの細胞外マトリックスメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、ニードル。
- 前記細胞外マトリックスmRNAがコラーゲンをコードする、請求項41に記載のニードル。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項42に記載のニードル。
- 前記コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項43に記載のニードル。
- 前記コラーゲンがII型コラーゲンである、請求項43に記載のニードル。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)またはプロアルファ1(I)鎖である、請求項43に記載のニードル。
- 前記ニードルがヒドロゲルニードルであり、必要に応じて、前記ニードルの少なくとも50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%がヒドロゲルを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のニードル。
- 前記ヒドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項47に記載のニードル。
- 対象の皮膚症状を処置する方法であって、皮膚症状の処置を必要とする対象に少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを投与し、それによって前記皮膚症状を処置することを含む、方法。
- 前記外因性細胞外マトリックスmRNAがコラーゲンをコードする、請求項49に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項51に記載の方法。
- 前記コラーゲンがII型コラーゲンである、請求項51に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲンのアルファ1鎖(Col1A1)またはプロアルファ1(I)鎖である、請求項51に記載の方法。
- 前記コラーゲンがCol1A2である、請求項51に記載の方法。
- 前記皮膚症状が皮膚損傷である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚症状が創傷である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが、少なくとも1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、または50μgの前記細胞外マトリックスmRNAを前記対象に投与することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記EVがエキソソームである、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記EVが、アポトーシス小体または微小小胞である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚損傷を処置することが、しわの外観の少なくとも10%の減少をもたらす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記しわの外観の少なくとも10%の減少が、細胞外マトリックスmRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を前記対象に投与してから7~14日以内に起こる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚損傷を処置することが、総しわ数の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、または80%の減少をもたらす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚損傷を処置することが、総しわ面積の少なくとも70%、80%、または90%の減少をもたらす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚症状を処置することが、皮膚損傷を処置することを含み、前記皮膚損傷を処置することが、前記皮膚症状を処置した後、少なくとも20日間、30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間、または100日間持続する皮膚損傷の減少をもたらす、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 皮膚損傷の前記減少が、総しわ数の減少、総しわ面積の減少、しわの外観の減少、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたはそれを超えるものである、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが皮下注射によるものである、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記皮膚損傷が、老化または日焼けによる損傷によって引き起こされる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが、細胞外小胞の投与を必要とする前記対象に少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、前記細胞外小胞の少なくとも一部は、前記少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが、細胞外小胞の投与を必要とする前記対象に最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を投与することを含み、前記細胞外小胞の少なくとも一部は、前記少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞外小胞が、複数回用量または単回用量で投与される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞外小胞が、少なくとも1日1回、1週間に1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、10週間に1回、12週間に1回、または16週間に1回の間隔で前記対象に投与される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞外小胞が、少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む少なくとも1用量で投与され、前記細胞外小胞の少なくとも一部が、前記少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが、前記少なくとも1つの細胞外マトリックスmRNAを前記対象の組織に投与することを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織が皮下組織である、請求項74に記載の方法。
- 前記組織が真皮である、請求項74に記載の方法。
- 前記対象の組織への前記細胞外マトリックスmRNAの前記投与することの後、前記対象の前記組織が、少なくとも200、300、500、750、または1000pg/mlの細胞外マトリックスタンパク質濃度を有する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞外マトリックスmRNAを含む細胞外小胞を産生する方法であって、
(a)トランスフェクションを介して前記細胞外マトリックスmRNAに対応するベクターまたはプラスミドをドナー細胞に導入することと、
(b)前記ベクターまたは前記プラスミドから転写された前記細胞外マトリックスmRNAを封入する細胞外小胞を産生するための培養培地中で十分な時間にわたって前記ドナー細胞を培養することと、
(c)前記培養培地から前記細胞外小胞を回収することと
を含む、方法。 - マイクロニードルデバイスであって、前記マイクロニードルデバイスが、基材および複数のマイクロニードルを含み、前記複数のマイクロニードルが前記基材から突出し、前記複数のマイクロニードルのうちの少なくとも1つのマイクロニードルが少なくとも1つの細胞外小胞(EV)を含む、マイクロニードルデバイス。
- 前記基材上の前記複数のマイクロニードルの密度が、前記基材1mm2あたり0.1マイクロニードル~100マイクロニードルである、請求項79に記載のマイクロニードルデバイス。
- 前記基材上の前記複数のマイクロニードルの密度が、前記基材1mm2あたり少なくとも0.3マイクロニードルである、請求項80に記載のマイクロニードルデバイス。
- 前記基材上の前記複数のマイクロニードルの密度が、前記基材1mm2あたり約0.59マイクロニードルである、請求項81に記載のマイクロニードルデバイス。
- 前記複数のマイクロニードルが約10~1000個のマイクロニードルを含み、前記基材の面積が20~1000mm2である、請求項79から82のいずれか1項に記載のマイクロニードルデバイス。
- 前記複数のマイクロニードルのうちの前記少なくとも1つのマイクロニードルがヒドロゲルを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロニードルデバイス。
- 前記ヒドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項84に記載のマイクロニードルデバイス。
- 細胞外小胞(EV)を対象の組織に投与する方法であって、前記方法が、先行する請求項のいずれか1項に記載のニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを前記対象の前記組織に投与することを含む、方法。
- 皮膚症状の処置を必要とする対象の皮膚症状を処置する方法であって、前記方法が、先行する請求項のいずれか1項に記載のニードル、シリンジ、ヒドロゲルニードル、マイクロニードル、またはマイクロニードルデバイスを前記対象に適用することを含む、方法。
- マイクロニードルデバイスを製造する方法であって、前記方法が、
(a)細胞外小胞(EV)を重合性溶液の第1のバッチと混合することと、
(b)(a)からの混合物を少なくとも1つのニードル様形状を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)鋳型に鋳造することと
を含む、方法。 - 組織内でI型コラーゲンのヘテロ二量体またはヘテロ三量体を産生する方法であって、前記方法が、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞を前記組織に投与することを含む、方法。
- 前記ヘテロ二量体または前記ヘテロ三量体が、少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A1)および少なくとも1つのI型コラーゲンのアルファ鎖(Col1A2)を含み、前記Col1A1が、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞によって外因的に送達される、先行する請求項に記載の方法。
- 400個の細胞外小胞あたり平均で少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む、複数の細胞外小胞。
- 前記外因性VEGF mRNAが、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、先行する請求項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞外小胞を含む、請求項91または92に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、最大で1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、または350個の細胞外小胞あたり少なくとも1個のコピーの外因性VEGF mRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、少なくとも1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、最大で1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、3×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1020、1×1025、または1×1030個の細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または冠動脈カテーテルを介した注射用に製剤化される、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記VEGF mRNAが、同一量の天然に存在する細胞外小胞中のVEGF mRNAのレベルよりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、または少なくとも2000倍高いレベルで存在する、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 前記複数の細胞外小胞が、少なくとも10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、または200μgのVEGF mRNAを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の複数の細胞外小胞。
- 細胞外小胞の混合物であって、前記混合物が、外因性VEGF mRNAの1~6個のコピーを含む少なくとも2つの細胞外小胞を含み、前記混合物が、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体を含む、細胞外小胞の混合物。
- 対象の血流障害を処置する方法であって、VEGF mRNAを含む少なくとも1つの細胞外小胞を前記対象に投与し、それによって前記血流障害を処置することを含む、方法。
- 前記血流障害を処置することが、血行再建の少なくとも5%の増加をもたらす、請求項101に記載の方法。
- 前記血流障害が虚血である、請求項101または102に記載の方法。
- VEGF mRNAを含む前記少なくとも1つの細胞外小胞が少なくとも1回の用量で投与される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- VEGF mRNAを含む前記少なくとも1つの細胞外小胞が、VEGF mRNAを含む少なくとも1,000個の細胞外小胞を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与することが、VEGF mRNAを含む細胞外小胞がロードされたマイクロニードルを使用して行われる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マイクロニードルがヒドロゲルを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、軟骨チオフラビン、絹タンパク質、マルトース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
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