CN117597112A - 负载生物分子的细胞外囊泡 - Google Patents

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Abstract

本文描述治疗性细胞外囊泡的组合物以及产生所述治疗性细胞外囊泡的方法和系统。本文还描述用所述治疗性细胞外囊泡治疗疾病或病况的方法。

Description

负载生物分子的细胞外囊泡
交叉引用
本申请要求2021年4月23日提交的美国临时申请号63/179,058的权益，所述申请通过引用并入本文。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度如同明确且单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用并入一般。
背景技术
细胞外囊泡由各种各样的细胞类型分泌。一般来说，细胞外囊泡(例如，外泌体、微囊泡和凋亡小体)是膜结合的，并且可以负载治疗性货物。外泌体是由大多数真核细胞分泌的一种类型的细胞外囊泡。当内体内陷夹入多泡体，形成腔内囊泡时，外泌体生物发生可能开始。如果多泡体与细胞的质膜融合，则腔内囊泡可以作为外泌体而释放。微囊泡是从细胞表面膜向外出芽的另一种类型的细胞外囊泡。另一方面，凋亡小体是由死亡细胞碎片形成的细胞外囊泡。
细胞外基质(ECM)为许多不同类型的组织提供结构支持，并且还影响体内的某些细胞过程。皮肤中ECM的组分包括胶原、弹性纤维、蛋白聚糖和糖胺聚糖。ECM的蛋白质的年龄相关的变化可能具有许多不同的后果。皱纹和弹性降低是皮肤老化的典型现象，并且很可能是真皮中细胞外基质(ECM)(例如，胶原)的量逐渐减少的结果。老化皮肤中胶原的减少可能归因于胶原产生的减少和/或胶原降解的增加。胶原和其他ECM蛋白质的结构变化还可能涉及真皮老化。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种促进血管生成(新血管生长)的信号传导蛋白。当细胞和组织由于血液循环受损而失去含氧血液时，VEGF形成恢复向细胞和组织的血液供应的机制的一部分。
发明内容
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使RNA(mRNA)。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。在一些情况下，胶原为Col1A1，并且多个细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每450个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每200个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每约0.1至100个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV至少1、2、5、10、50、100、200、300、500或1000个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV约1至10个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV约1个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每30个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
在一些情况下，多个细胞外囊泡通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生。在一些情况下，细胞的转染是通过细胞纳米穿孔进行的。在一些情况下，细胞的转染是通过电穿孔进行的。在一些情况下，细胞为人细胞。在一些情况下，细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。在一些情况下，细胞为贴壁细胞。在一些情况下，细胞为人真皮成纤维细胞(例如，人新生儿真皮成纤维细胞)。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括以下中的至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
在一些情况下，多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。在一些情况下，制剂包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种防腐剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种DNA酶和/或RNA酶抑制剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种DNA酶、DNA酶抑制剂、RNA酶和/或RNA酶抑制剂。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1013个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x109个细胞外囊泡并且至多1x1020个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x101、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106个细胞外囊泡并且至多1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至多1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng并且至多20μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少5ng并且至多30μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，靶向多肽靶向真皮细胞。在一些情况下，靶向多肽靶向氨肽酶N、CD26/DPP4、成纤维细胞激活蛋白α或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡不包含以下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325或hsa-miR-199b-5p。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约50-200nm处的大小分布。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约100nm处的大小分布。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约75-130nm处的大小分布。在一些情况下，细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。在一些情况下，至少90％的细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于50nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于30nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于20nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于10nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于5nm的细胞外囊泡。
在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少2倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少3倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的约3000倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的约2000倍。在一些情况下，与可比数量的天然存在的细胞外囊泡相比，多个细胞外囊泡表达较高水平的以下标志物中的至少一个：CD9、CD63、TSG101或ARF6。
在一些方面，本文描述一种细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使RNA(mRNA)。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。在一些情况下，胶原为Col1A1，并且细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，细胞外囊泡为外泌体。在一些情况下，细胞外囊泡为凋亡小体。在一些情况下，细胞外囊泡为微囊泡。
在一些方面，本文描述一种容器，其包括如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中容器还包括细胞。在一些情况下，细胞包括人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡以每个细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在于容器中。在一些情况下，多个细胞外囊泡以不大于每个细胞1000、2000、5000、10000、12000、15000、20000、25000、50000、75000、90000或100000个细胞外囊泡的比率存在于容器中。
在一些方面，本文描述一种针，其包含本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，针为微针。在一些情况下，针为实心的。在一些情况下，针为水凝胶针。在一些情况下，针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至多1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些方面，本文描述一种注射器，其包含本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡悬浮在注射器内的透明质酸中。
在一些方面，本文描述一种水凝胶微针，其中水凝胶微针包含多个细胞外囊泡。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％、7％、10％、15％或20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含不大于1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括不大于1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025、1x1030、1x1030、1x1040、1x1050、1x1060、1x1070、1x1080、1x1090或1x10100个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括约1x106至1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括约1x1010至1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括约1x1013至1x1014个细胞外囊泡。
在一些情况下，水凝胶微针的长度小于2mm。在一些情况下，水凝胶微针的长度小于1mm。在一些情况下，水凝胶微针的长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000μm。在一些情况下，水凝胶微针的长度不大于100、不大于200、不大于300、不大于400、不大于500、不大于600、不大于700、不大于800、不大于900、不大于1000、不大于1100、不大于1200、不大于1300、不大于1400、不大于1500、不大于1600、不大于1700、不大于1800、不大于1900或不大于2000μm。在其他情况下，水凝胶微针的长度为100μm至3000μm、500μm至2500μm、1000μm至2500μm或1000μm至2000μm。在具体的实施方案中，水凝胶微针的长度为约1000μm。在具体的实施方案中，水凝胶微针的长度为约2000μm。
在一些情况下，水凝胶微针具有直径不大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm的基部。在一些情况下，水凝胶微针具有直径大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm的基部。在一些情况下，水凝胶微针包含负载一个或多个mRNA货物的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种针，其包含多个细胞外囊泡，其中细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质信使RNA(mRNA)。在一些情况下，细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，胶原为Col1A1，并且多个细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括以下中的任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
在一些情况下，针为微针。在一些情况下，针为实心的。在一些情况下，针为水凝胶针，并且任选地其中针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含不大于1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，针的长度小于2mm。在一些情况下，针的长度小于1mm。在一些情况下，针的长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000μm。在一些情况下，针的长度不大于100、不大于200、不大于300、不大于400、不大于500、不大于600、不大于700、不大于800、不大于900、不大于1000、不大于1100、不大于1200、不大于1300、不大于1400、不大于1500、不大于1600、不大于1700、不大于1800、不大于1900或不大于2000μm。在其他情况下，针的长度为100μm至3000μm、500μm至2500μm、1000μm至2500μm或1000μm至2000μm。在具体的实施方案中，针的长度为约1000μm。在具体的实施方案中，针的长度为约2000μm。
在一些情况下，针具有直径不大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm的基部。在一些情况下，针具有直径不大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、1800μm、1500μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm的基部。
在一些方面，本文描述一种治疗对象的皮肤病况的方法，其包括向有需要的对象施用至少一个细胞外基质mRNA，从而治疗皮肤病况。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，胶原为Col1A1，但不为I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，皮肤病况为皮肤损伤。在一些情况下，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些情况下，皮肤病况为伤口。
在一些情况下，施用包括向对象施用至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用不大于500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg或500μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用1ng-20μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用1ng-10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用10ng-10μg、10ng-1μg、50ng-1μg、100ng-1μg或500ng-1μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用约50ng细胞外基质mRNA。
在一些情况下，细胞外基质mRNA被包封在至少一个细胞外囊泡(EV)中。在一些情况下，EV不包含以下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325或hsa-miR-199b-5p。
在一些情况下，至少一个EV为外泌体。在一些情况下，至少一个EV为凋亡小体或微囊泡。在一些情况下，至少一个EV包括以下中的至少两个的混合物：外泌体、微囊泡和/或凋亡小体。
在一些情况下，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少10％。在一些情况下，皱纹的出现减少至少10％发生在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的7-14天内。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在一些情况下，皱纹的出现减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％发生在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的7-14天内。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少不大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少约70％、80％或90％。在一些情况下，皱纹面积通过对皮肤的治疗部分进行显微摄影来测量，并且通过摄影分析软件来量化。
在一些情况下，治疗皮肤病况包括治疗皮肤损伤，并且其中治疗皮肤损伤导致在治疗皮肤病况之后持续至少20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天的皮肤损伤减少。在一些情况下，皮肤损伤减少为以下中的一种或多种：总皱纹数减少、总皱纹面积减少、皱纹的出现减少或其任何组合。
在一些情况下，施用是经由皮下注射进行的。在一些情况下，皮下注射在皮肤损伤或伤口部位处或附近进行。在一些情况下，皮下注射使用规格(gauge)为至少23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格不大于34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21或20的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为28的针进行。
在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用不大于1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用约1x107至1x1017、1x108至1x1016、1x109至1x1015个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用约1x1010至1x1014个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。
在一些情况下，细胞外囊泡以多剂量或呈单剂量施用。在一些情况下，细胞外囊泡以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的间隔施用于对象。在一些情况下，细胞外囊泡以至多每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周施用于对象。在一些情况下，施用是单次进行的，并且向对象施用至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且向对象施用至少10、1x102、5x102、1x103、5x103、1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次向对象施用至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次向对象施用至少10、1x102、5x102、1x103、5x103、1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡以至少一个包含至少1,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用至少一个细胞外基质mRNA。
在一些情况下，组织为皮下组织。在一些情况下，组织为真皮。在一些情况下，组织为表皮。在一些情况下，组织为牙龈。在一些情况下，组织为嘴唇。
在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少6000pg/ml。在一些情况下，在向对象的组织施用细胞外基质mRNA之后，对象的组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象的组织施用细胞外基质mRNA之后，对象的组织的细胞外基质蛋白的浓度不大于200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000或18000pg/ml。在一些情况下，在向对象的组织施用包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡之后，对象的组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度不大于200、300、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000或18000pg/ml。在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的约4天内，组织具有峰值浓度的细胞外基质蛋白。
在一些情况下，至少每天、每3天、每5天、每7天、每10天、每20天、每30天、每40天或每50天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每10天、每20天、每30天、每40天或每50天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每30天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每60天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每90天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些情况下，方法还包括通过以下方式产生包含至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡：(a)经由转染，将对应于细胞外基质mRNA的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞在培养基中培养足够量的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)从培养基收集细胞外囊泡。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约8-24h。在一些情况下，细胞外囊泡以每个供体细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在。在一些情况下，细胞外囊泡以不大于每个供体细胞1000、2000、5000、10000、12000、15000、17000、20000、25000、30000、35000、40000、45000或50000个细胞外囊泡的比率存在。在一些情况下，供体细胞为人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
在一些方面，本文描述一种产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：(a)经由转染，将对应于细胞外基质mRNA的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞在培养基中培养足够量的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)从培养基收集细胞外囊泡。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约8-24h。在一些情况下，包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以每个供体细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的水平存在。在一些情况下，细胞外囊泡以不大于每个供体细胞1000、2000、5000、10000、12000、15000、17000、20000、25000、30000、35000、40000、45000或50000个细胞外囊泡的比率存在。在一些情况下，供体细胞为人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
在一些方面，本文描述一种微针装置，该微针装置包括基材和多个微针，其中多个微针从基材突出，并且其中多个微针中的至少一个微针包含至少一个细胞外囊泡(EV)。
在一些方面，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材0.1个微针至100个微针。在一些情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材至少0.3个微针。在一些情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.59个微针。在一些情况下，多个微针包括约10-1000个微针，并且其中基材的面积为20-1000mm2。在一些情况下，多个微针包括约100个微针，并且其中基材的面积为约169mm2。
在一些情况下，多个微针被布置成至少2行并且每行中至少2个微针。在一些情况下，多个微针被布置成10行并且每行10个微针。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的形状为锥形。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有逐渐变细的形状。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径小于1000μm的基部。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径为约100μm至约800μm的基部。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径为约400μm的基部。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的长度为至少100μm。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的长度为100μm至3000μm。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的长度为约1000μm。在一些情况下，多个微针中的微针的长度为约2000μm。
在一些情况下，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为至少100μm。在一些情况下，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为约100至2000μm。在一些情况下，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为约1000μm。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含至少3x105个EV。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x108至3x1010个EV。
在一些情况下，EV悬浮在水凝胶中。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。
在一些情况下，EV包含外源性细胞外基质mRNA。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA包含：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，EV包含外源性VEGF mRNA。在一些情况下，外源性VEGF mRNA包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF或其任何组合。
在一些方面，本文描述一种向对象的组织施用细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括向对象的组织施用本文所公开的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。在一些情况下，该方法包括向对象的组织施用本文所公开的微针装置。在一些情况下，在至少5、10、15、20、25或30分钟之后去除微针装置。在一些情况下，在约10、15、20或30分钟之后去除微针装置。
在一些情况下，EV包含至少一个mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用至少1ng、10ng、50ng、100ng、1μg、10μg或20μg至少一个mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用1ng-10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用1ng-20μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，组织为皮下组织。在一些情况下，组织为真皮。在一些情况下，组织为表皮。在一些情况下，组织为牙龈。在一些情况下，组织为嘴唇。在一些情况下，对象为哺乳动物。在一些情况下，对象为人。在一些情况下，对象为啮齿动物。在一些情况下，对象为猴子。在一些情况下，对象为兔子。
在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且在6-8周内施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是历经一段时间多次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020、1x1030个细胞外囊泡。
在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致EV的破损较少。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致在施用部位处的刺激较小。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致EV在组织中的分布更均匀。在一些情况下，常规的微针为实心微针或中空微针。
在一些方面，本文描述一种治疗有需要的对象的皮肤病况的方法，该方法包括向对象应用本文所公开的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。在一些情况下，该方法包括向对象施用本文所公开的微针。
在一些情况下，皮肤病况为皮肤损伤。在一些情况下，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些情况下，皮肤病况为伤口。
在一些情况下，施用包括施用至少0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg或10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用不大于0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg或900μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用约0.1ng-50μg、1ng-50μg、1ng-30μg、1ng-25μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用约1ng-20μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，该方法导致皱纹的出现减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，该方法产生多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的胶原纤维。在一些情况下，该方法导致真皮厚度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，该方法导致持续至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天或至少90天的延长的效果。
在一些情况下，针、微针或微针装置的微针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且在6-8周内施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是历经一段时间多次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020、1x1030个细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种制造微针装置的方法，其中该方法包括：(a)将细胞外囊泡(EV)与第一批可聚合的溶液混合；以及(b)将来自(a)的混合物浇注至具有至少一个针样形状的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中。在一些情况下，(a)中的混合在真空下进行。
在一些情况下，该方法还包括将EV浓缩在PDMS模具的至少一个针样形状的尖端中。在一些情况下，浓缩是通过将PDMS模具维持在至多10℃的温度进行的。在一些情况下，浓缩是通过将PDMS模具维持在约4℃进行的。在一些情况下，浓缩持续约2至约6小时。
在一些情况下，该方法还包括将第二批可聚合的溶液添加在PDMS模具的顶部。在一些情况下，可聚合的溶液包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为至少1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90或1:100。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率不大于1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为约1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35或1:40。
在一些情况下，EV包含外源性细胞外基质mRNA。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA包含：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，EV包含外源性VEGF mRNA。在一些情况下，外源性VEGF mRNA包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF或其任何组合。
在一些方面，本文描述一种在组织中产生I型胶原的异二聚体或异三聚体的方法，其中该方法包括向组织施用本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，异二聚体或异三聚体包含至少一条I型胶原α链(Col1A1)和至少一条I型胶原α链(Col1A2)，并且其中Col1A1通过本文所公开的多个细胞外囊泡外源性地递送。在一些情况下，Col1A2为组织内源性的。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均每400个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，外源性VEGF mRNA选自VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每至多1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或350个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少1、2、5、10、20、25、30、35、30、50、60、70、90或100个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至多1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每约0.001至100、0.01至100或0.01至50个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每约0.02至50个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
在一些情况下，多个细胞外囊泡被配制用于静脉内注射、肌内注射、皮下注射或经由冠状动脉导管注射。
在一些情况下，混合物包含至少两个包含一个至六个外源性VEGF mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些情况下，所述混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。在一些情况下，所述混合物被配制用于经由冠状动脉导管注射。在一些情况下，VEGF mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中的VEGF mRNA的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μgVEGF mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含约1ng至200μg VEGF mRNA。
在一些方面，本文描述一种治疗对象的血流病症的方法，其包括向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡，从而治疗血流病症。在一些情况下，治疗血流病症导致再血管化增加至少5％。在一些情况下，再血管化增加至少5％发生在施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的14天内。
在一些情况下，施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括经由静脉内、肌内或皮下注射或经由冠状动脉导管向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至少14号的针进行。
在一些情况下，血流病症为缺血。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括至少1,000个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。
在一些情况下，施用包括单次施用至少1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015或1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用不大于1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023或1X1024个EV。在一些情况下，施用包括单次施用约1X105至1X1020、1X106至1X1019、1X107至1X1018、1X108至1X1017或1X109至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，施用包括单次施用不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。
在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用至少1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015或1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用不大于1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023或1X1024个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用约1X105至1X1020、1X106至1X1019、1X107至1X1018、1X108至1X1017或1X109至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。
在一些情况下，其中向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，施用是使用负载包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的微针进行的。
在一些情况下，微针包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
在一些情况下，细胞外囊泡以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的间隔施用于对象。在一些情况下，细胞外囊泡以至多每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次施用于对象。
在一些方面，本文描述一种产生包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：(a)经由转染，将编码VEGF的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡；以及(c)收集包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种治疗有需要的对象的血流病症的方法，该方法包括施用本文所公开的细胞外囊泡。在一些情况下，血流病症为缺血。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些实施方案中，外源性VEGF mRNA选自VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF及其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述细胞外囊泡混合物，其中混合物包含至少两个包含一个至六个外源性VEGF mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由冠状动脉导管注射。
在一些方面，本文描述治疗对象的血流病症的方法，其包括向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡，从而治疗血流病症。在一些实施方案中，治疗血流病症导致再血管化增加至少5％。在一些实施方案中，再血管化增加至少5％发生在施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的14天内。在一些实施方案中，施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括经由静脉内、肌内或皮下注射或经由冠状动脉导管向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至少14号的针进行。在一些实施方案中，血流病症为缺血。在一些实施方案中，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些实施方案中，剂量包含至少1,000个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。在一些实施方案中，向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些实施方案中，外源性细胞外基质mRNA选自：胶原、COL1、I型胶原、II型胶原、III型胶原、V型胶原、XI型胶原、IX型胶原、XII型胶原、XIV型胶原、VIII型胶原、X型胶原、IV型胶原、VI型胶原、VII型胶原、XIII型胶原、XV型胶原、XVII型胶原和XVIIII型胶原。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述细胞外囊泡混合物，其中混合物包含至少两个包含一个至两个外源性细胞外基质mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。
在一些方面，本文描述治疗对象的皮肤损伤的方法，其包括向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡，从而治疗对象的皮肤损伤。在一些实施方案中，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少10％。在一些实施方案中，皱纹的出现减少至少10％发生在施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的14天内。在一些实施方案中，施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括经由皮下注射向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，皮下注射使用规格为至少14的针进行。在一些实施方案中，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些实施方案中，至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些实施方案中，剂量包含至少1,000个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。在一些实施方案中，向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少6000pg/ml。
在一些方面，本文描述产生包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：经由转染将编码VEGF的载体或质粒引入至供体细胞中；将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡；以及收集包封从载体或质粒转录的VEGFmRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：经由转染将编码细胞外基质蛋白的载体或质粒引入至供体细胞中；将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及收集包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
附图说明
本专利申请含有至少一幅以彩色绘制出的附图。在提出请求并支付必要费用后，美国专利商标局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请的副本。
本公开的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对说明性实施方案阐述的具体实施方式和附图，将会获得对本公开的特征和优点的更好的理解。
图1图示了生成大量负载转录的mRNA的细胞外囊泡(EV)的细胞纳米穿孔(“CNP”，本文也称为细胞纳米电穿孔，或“NEP”)。示意性说明了用于靶向核酸递送的CNP生成的EV。示例性CNP系统由纳米通道阵列组成，测量出每个通道的直径为约500nm(上部插图)。
图2图示了通过细胞纳米穿孔(“NEP”)或批量电穿孔(“BEP”)产生的VEGF mRNA负载水平的量化。
图3图示了对用于VEGF mRNA递送的细胞纳米穿孔生成的外泌体的体外研究。图3A显示在体外递送负载VEGF mRNA的EV(“NEP”)之后48小时，人成纤维细胞中VEGF染色的代表性共焦显微镜图像。图3B显示用负载VEGF mRNA的EV处理24或48小时的人成纤维细胞的qPCR。
图4图示了负载VEGF mRNA的CNP生成的外泌体在后肢缺血(HLI)模型中的体内治疗功效。图4A显示体内成像，其显示在将负载VEGF mRNA的EV递送至HLI模型中之后，后肢灌注/再血管化增加。图4B显示在注射负载VEGF mRNA的EV之后的不同时间点，缺血足垫的平均灌注值相比于照足垫的平均灌注值的量化。图4C显示在注射负载VEGF mRNA的EV之后48小时，0.20g缺血腿组织中的VEGF浓度的ELISA量化。图4D显示在注射负载VEGF mRNA的EV之后48小时切除的腓肠肌组织中VEGF染色的代表性共聚焦显微镜图像。
图5图示了对用于I型胶原αI(Col1)mRNA递送的CNP生成的外泌体的体外研究。图5A显示在体外递送负载Col1 mRNA的EV(“NEP”)之后48小时，人成纤维细胞中Col1染色的代表性共焦显微镜图像。图5B显示用通过CNP(“NEP”)和批量电穿孔(“BEP”)产生的负载Col1mRNA的EV处理24或48小时的人成纤维细胞的qPCR。
图6图示了负载Col1 mRNA的CNP生成的外泌体在老化的光老化皮肤模型中的体内治疗功效。图6A显示体内成像，其显示在将负载Col1 mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤病况改善(例如，抗老化增加)。图6B显示体内成像，其显示在将负载Col1mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤病况改善(例如，抗老化增加)。图6C显示在将负载Col1mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤组织的代表性免疫组织化学(IHC)染色。图6D显示在将负载Col1 mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤组织中Col1染色的代表性共聚焦显微镜图像。图6E显示在将负载Col1 mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤组织的代表性IHC染色(左)和Col1染色的共聚焦显微镜图像(右)。图6F显示在将负载Col1 mRNA的EV递送至皮肤光老化模型中之后，皮肤组织的代表性Masson三色染色。
图7图示了CNP生成的负载COL1A1 mRNA的EV以及含有COL1A1 mRNA的EV的成功体外递送。图7A显示用于靶向核酸递送的CNP生成的EV的图示。图7B显示pCMV-COL1A1-GFP的质粒图谱。图7C显示通过以下方式产生的每个细胞的EV数量：在PBS缓冲液中的未处理的人新生儿真皮成纤维细胞(nHDF)作为对照；批量电穿孔(BEP)；或仅具有PBS缓冲液的细胞纳米穿孔(CNP)(对于每个组，n＝3；*P＝0.048，对照相比于BEP；**P＝0.005，对照相比于CNP；##P＝0.002BEP相比于CNP)。图7D显示通过纳米颗粒追踪分析的外泌体表征。图7E显示蛋白质印迹结果，其显示对照组和CNP处理组中EV膜标志物的表达水平的差异。图7F显示在不同的电压条件(0、50、100或150V)下每个细胞的EV数。图7G显示在不同的时间点(0、4、8、12、16、20和24h)CNP诱导的EV释放的动力学分析(n＝3，**P＝0.0071 0V相比于100V；**P＝0.003250V相比于100V；NS，不显著)。图7H显示COL1A1 mRNA的RT-qPCR，其揭示通过CNP产生的外泌体比通过BEP产生的外泌体和对照含有更多量的转录mRNA(对于所有组，n＝3；**P＝0.002，对照相比于BEP；***P<0.001，对照相比于CNP；###P<0.001，BEP相比于CNP)。图7I显示从不具有胎牛血清的2X107个未处理的人新生儿真皮成纤维细胞(nHDF)的上清液提取的总RNA、从使用COL1A1质粒的CNP平台之后的2X107个nHDF的上清液收集的总RNA和0.4ng合成COL1A1 mRNA的电子凝胶图像。图7J显示体外EV负载的mRNA的递送和表达的示意图。图7K显示在0h、24h和48h用不同浓度的CNP EV处理之后nHDF的增殖。图7L显示荧光图像，其显示用CNP生成的含有COL1A1-GFP mRNA的EV和从递送的COL1A1-GFP mRNA翻译的蛋白质处理的血清饥饿的nHDF。比例尺，100μm。图7M显示用COL1A1-EV处理的细胞的荧光强度(对于所有组，n＝3，***P<0.001对照相比于COL1A1 EV)。图7N显示RT-qPCR，其显示在体外递送来自EV的COL1A1 mRNA之后，胶原mRNA转录水平较高(对于所有组，n＝3，***P<0.001对照相比于COL1A1 EV)。图7O显示蛋白质印迹，其显示处理的成纤维细胞中COL1A1蛋白升高(对于所有组，n＝3，**P＝0.001对照相比于COL1A1 EV)。图7P显示24h和48h对照和CNP处理组中COL1A1mRNA的倍数变化(n＝3，**P＝0.0071对照相比于CNP，24h；***P<0.001对照相比于CNP，48h)。图7Q显示从上清液收集并且通过ELISA检测的前胶原I(对于所有组，n＝3，***P<0.001对照相比于COL1A1 EV)。所有数据都来自三个独立实验，并以平均值±s.e.m表示。
图8图示了小鼠皮肤中COL1A1-EV mRNA递送和蛋白质形成的体内动力学。图8A显示在皮下注射COL1A1 EV之后人COL1A1mRNA通过RNAscope的原位杂交，在0h、12h、24h、48h、96h、7天、10天和14天测量。比例尺，100μm。图8B显示通过每个细胞棕色点的平均数量对RNAscope结果的量化。图8C显示通过共定位的GFP和COL1A1蛋白(RFP)的可视化的COL1A1-EV来源蛋白随时间推移的免疫荧光。比例尺，100μm。图8D显示COL1A1-GFP蛋白表达的荧光强度的量化。图8E显示GFP+细胞的量化，其证实COL1A1-EV来源蛋白移植物历经30天以时间依赖性方式减少。所有数据都来自三个独立实验，并以平均值±s.e.m表示。
图9图示了COL1A1-EV mRNA递送在光老化UVB照射的小鼠模型中使真皮皱纹减少。图9A显示UVB诱导的皮肤光老化小鼠模型的示意图。图9B显示COL1A1 EV随时间推移的5次低剂量注射的示意图。28天时收获皮肤组织。图9C显示在用COL1A1 EV、来自nHDF细胞培养基的未负载的EV、局部0.05％视黄酸(RA)或盐水(对于所有组，n＝4)开始治疗之后的第0、4、7、14、21和28天追踪的皱纹形成。假装手术组包括未暴露于UV的雌性裸小鼠。比例尺，5cm。图9D显示用定制软件量化的背侧皮肤皱纹的总数(对于所有组，n＝4，**P＝0.003COL1A1-EV相比于盐水，第7天；***P<0.001COL1A1-EV相比于盐水，第14、21和28天；※P＝0.0189 COL1A1-EV相比于未负载的EV，第7天；※※※P<0.001 COL1A1-EV相比于未负载的EV，第14、21和28天；RA相比于盐水，第21天；/>RA相比于盐水，第28天；#P＝0.014未负载的EV相比于盐水，第21天；##P＝0.002未负载的EV相比于盐水，第28天)。图9E显示背侧皮肤上皱纹面积的量化(对于所有组，n＝4，*P＝0.023COL1A1-EV相比于盐水，第7天；*P＝0.017 COL1A1-EV相比于盐水，第14天；***P<0.001 COL1A1-EV相比于盐水，第21和28天；※P＝0.0205 COL1A1-EV相比于未负载的EV，第7天；※※P＝0.0011COL1A1-EV相比于未负载的EV，第14天；※※※P<0.001COL1A1-EV相比于未负载的EV，第21和28天；/>RA相比于盐水，第28天；#P＝0.027未负载的EV相比于盐水，第28天)。图9F显示背侧皮肤和皮肤复制品的显微镜观察结果。比例尺，5 cm。图9G显示在皮肤复制品上分析的平均皱纹长度(对于所有组，n＝4，##P＝0.002未负载的EV相比于盐水；***P<0.001 COL1A1-EV相比于盐水；※※※P<0.001 COL1A1-EV相比于未负载的EV)。图9H显示皮肤复制品中的平均皱纹深度(对于所有组，n＝4，***P<0.001COL1A1-EV相比于盐水；##P＝0.006未负载的EV相比于盐水；/>P＝0.022 RA相比于盐水；※※※P<0.001 COL1A1-EV相比于未负载的EV)。图9I显示在开始治疗(COL1A1-EV、未负载的EV、0.05％视黄酸[RA]、盐水)之后第0、4、7、14、21、28、35、42、49和56天追踪的皱纹；(对于所有组，n＝4)，比例尺，5cm。未暴露于UV照射的雌性裸小鼠构成假装组。图9J显示总皱纹面积(对于所有组，n＝4，*P＝0.012 COL1A1-EV相比于盐水，第7天；***P<0.001COL1A1-EV相比于盐水，第14、21、28和35天；*P＝0.015 COL1A1-EV相比于盐水，第42天；/>RA相比于盐水，第14天；RA相比于盐水，第21和35天；#P＝0.012未负载的EV相比于盐水，第14天；#P＝0.035未负载的EV相比于盐水，第21天；##P＝0.002未负载的EV相比于盐水，第28天)。图9K显示小鼠背侧皮肤上的皱纹数量。(对于所有组，n＝4；**P＝0.008 COL1A1-EV相比于盐水，第7天；**P＝0.004 COL1A1-EV相比于盐水，第21天；**P＝0.001COL1A1-EV相比于盐水，第35天；***P<0.001 COL1A1-EV相比于盐水，第14、28、42和49天；/>RA相比于盐水，第21天；/>RA相比于盐水，第28天；#P＝0.015未负载的EV相比于盐水，第35天；##P＝0.004未负载的EV相比于盐水，第21天；##P＝0.002未负载的EV相比于盐水，第28天)。图9L显示假装对照组、盐水对照组、RA治疗组、未负载的EV治疗组和COL1A1-EV治疗组中GFP和COL1A1(RFP)蛋白的免疫荧光染色；在治疗开始后的30天，COL1A1-EV治疗的小鼠表现出真皮和皮下组织中的GFP+COL1A1蛋白移植物。比例尺，200μm。图9M显示所有治疗组的COL1A1(RFP)的荧光强度(对于所有组，n＝3，***P<0.001COL1A1-EV相比于盐水；RA相比于盐水；#P＝0.038未负载的EV相比于盐水；※※※P<0.001 COL1A1-EV相比于未负载的EV）。图9N显示所有小鼠组的表皮、真皮和皮下组织的代表性Masson三色染色。比例尺，300μm。图9O显示真皮厚度的量化，其显示COL1A1-EV组中胶原纤维增加（对于所有组，n=3，***P<0.001COL1A1-EV相比于盐水；/>RA相比于盐水；#P=0.018未负载的EV相比于盐水；※※※P<0.001 COL1A1-EV相比于未负载的EV）。
图10图示了针对改善的体内EV分布和滞留的新型微针递送平台的构建。图10A显示微针制造的示意图。图10B显示微针（MN）阵列的显微镜和扫描电子显微镜图像。比例尺，500μm。图10C显示用拉伸试验机评估的HA MN贴片的示意图。图10D显示具有10%、15%或20%HA的HA+EV MN的断裂力。虚线代表插入至皮肤中的微针的应力强度（对于所有组，n=3）。图10E显示小鼠皮肤的苏木精和伊红（H&E）染色的切片，其显示单个MN的穿透。比例尺，200μm。图10F显示压入至皮肤中的HA+EV MN尖端的时间过程；MN在应用的15分钟内溶解。比例尺，200μm。HA+EV MN治疗后的皮肤恢复显示刺激最小。比例尺，5 cm。图10G显示Dil标记的EV的皮肤组织结构，其显示真皮注射后在皮下组织中积聚的高浓度EV（红色）以及通过MN递送的均匀分布的EV。比例尺，100μm。图10H显示针注射之后EV分布的示意图。图10I显示MN注射之后EV分布的示意图。图10J显示通过imageJ软件分析的代表性EV分布。图10K显示通过针注射来注射的EV的荧光追踪。EV用Dil标记。比例尺，100μm。图10L显示通过MN注射来注射的EV的荧光追踪。EV用Dil标记。比例尺，100μm。图10M显示低温电子显微镜图像。图10N显示通过注射器针或MN注射之后破坏的EV的数量的量化（对于所有组，n＝3；*P＝0.0228针注射相比于HA-MN）。比例尺，100nm。图10O显示在递送后第1、2、4、7、10和14天用皮下注射或HA MN贴片递送Dil标记的EV治疗的裸小鼠的体内荧光图像（对于所有组，n＝3）。图10P显示在14天治疗期内荧光强度的量化。将数据归一化为第1天的荧光强度。
图11图示了经由定制微针贴片递送COL1A1-EV mRNA在光老化的小鼠中改善了真皮皱纹的长期治疗并导致皮肤中的长期蛋白质替代。图11A显示通过HA微针释放的COL1A1EV和体内转染模式的示意图。图11B显示单次注射之后4个治疗组的长期(90天)观察结果：(1)盐水对照，(2)通过28G注射器针递送的COL1A1-EV，(3)HA MN对照，以及(4)负载COL1A1的HA+EV MN(对于所有组，n＝4)。比例尺，5 cm。图11C显示皱纹总数的量化(对于所有组，n＝4，*P＝0.014 HA+EV MN相比于盐水，第7天；*P＝0.038HA+EV MN相比于盐水，第14天；*P＝0.012 HA+EV MN相比于盐水，第21天；*P＝0.039 HA+EV MN相比于盐水，第28天；*P＝0.031HA+EV MN相比于盐水，第35天；*P＝0.03 HA+EV MN相比于盐水，第42天；*P＝0.022HA+EV MN相比于盐水，第49天；*P＝0.031HA+EV MN相比于盐水，第56天；**P＝0.008 HA+EVMN相比于盐水，第63天；HA MN相比于盐水，第14天；#P＝0.030针注射相比于盐水，第7天；#P＝0.041针注射相比于盐水，第14天)。图11D显示总背侧皮肤皱纹面积的量化(对于所有组，n＝4，*P＝0.016HA+EV MN相比于盐水，第7天；*P＝0.038 HA+EV MN相比于盐水，第14天；*P＝0.042 HA+EV MN相比于盐水，第28天；*P＝0.026HA+EV MN相比于盐水，第42天；*P＝0.048 HA+EV MN相比于盐水，第49天；#P＝0.033针注射相比于盐水，第7天；#P＝0.031针注射相比于盐水，第14天；#P＝0.042针注射相比于盐水，第21天)。图11E显示第30天背侧皮肤和皮肤复制品的显微镜观察结果。图11F显示第60天背侧皮肤和皮肤复制品的显微镜观察结果。图11G显示第90天背侧皮肤和皮肤复制品的显微镜观察结果。图11H显示平均皱纹长度的量化(对于所有组，n＝4，***P<0.001 HA+EV MN相比于盐水，第30和60天；HA MN相比于盐水，第30天；###P<0.001针注射相比于盐水，第30天)。图11I显示来自皮肤复制品的皱纹平均皱纹深度的量化(对于所有组，n＝4，***P<0.001HA+EV MN相比于盐水，第30和60天；#P＝0.049针注射相比于盐水，第30天；HA MN相比于盐水不显著，第30天)。图11J显示GFP和COL1A1(RFP)的免疫荧光染色，其证明在递送之后长达30天经由28G针注射和经由HA+EV MN来接受COL1A1-EV的小鼠的皮肤中有GFP+COL1A1蛋白移植物。比例尺，200μm。图11K显示在第60天，只有用HA+EV MN治疗的小鼠具有长期GFP阳性COL1A1移植。比例尺，200μm。图11L显示，到递送后第90天为止，在任何小鼠中都没有检测到GFP阳性胶原蛋白的证据。比例尺，200μm。图11M显示GFP和COL1A1(RFP)共定位荧光信号的量化，其证明与经由28G针注射给予COL1A1-EV的小鼠和对照组相比，给予HA+EV MN的小鼠的皮肤中有长期COL1A1-EV来源胶原移植物(对于所有组，n＝3，***P<0.001HA+EV MN相比于针注射，第60天)。图11N显示第30、60和90天的IHC和Masson三色染色。比例尺，200μm。图11O显示通过Masson三色染色对真皮厚度的量化(对于所有组，n＝3，*P＝0.017HA+EV MN相比于盐水，第30天；P＝0.034HA+EV MN相比于盐水，第60天)。
具体实施方式
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应理解，在实践本公开时可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。
概述
本公开提供携带外源性RNA货物(例如，信使RNA(mRNA)、细胞外基质mRNA、胶原mRNA、Col1A mRNA、Col1A1 mRNA)并且可以用于治疗多种皮肤病况和其他病症，通常有长期的效果的细胞外囊泡。本公开还提供含有VEGF mRNA并且可以用于治疗病症(例如，血流病症)的细胞外囊泡。本公开还提供可以用于将细胞外囊泡递送至对象的针和微针。本公开还提供包含携带多种货物(例如，DNA、RNA、治疗剂)或不携带外源性货物的细胞外囊泡的水凝胶针(例如，水凝胶微针)。
本公开还涉及表达和/或携带货物(例如，至少一个细胞外基质蛋白RNA(例如，细胞外基质(ECM)mRNA、胶原mRNA、Col1 mRNA、Col1A1 mRNA、ColIV mRNA、弹性蛋白mRNA)或血管内皮生长因子(VEGF)mRNA(例如，VEGFA mRNA))的一个或多个细胞外囊泡(例如，外泌体、微囊泡、凋亡小体或其混合物)的设计和产生。在某些具体实施方案中，本公开提供含有外源性胶原mRNA的细胞外囊泡(例如，外泌体)。在某些具体实施方案中，本公开提供含有外源性VEGF mRNA的细胞外囊泡(例如，外泌体)。细胞外囊泡可以被设计为携带有效负载，例如待递送至靶向细胞的治疗剂。在一些情况下，通过细胞外囊泡递送的治疗剂可以包括治疗性化合物(例如，治疗性多核苷酸、治疗性DNA、治疗性RNA、治疗性mRNA、治疗性miRNA、治疗性tRNA、治疗性rRNA、治疗性siRNA、治疗性shRNA、治疗性SRP RNA、治疗性tmRNA、治疗性gRNA或治疗性crRNA)。在一些情况下，通过细胞外囊泡递送的治疗剂可以包括治疗性非编码多核苷酸(例如，非编码RNA、lncRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA或scaRNA)、治疗性多肽、治疗性化合物或癌症药物。在一些情况下，细胞外囊泡可以携带非治疗性化合物(例如，非治疗性多核苷酸)。
本文所提供的细胞外囊泡可以通过多种方法和途径产生。本文所提供的一种方法涉及将至少一个异源性多核苷酸例如载体(例如，质粒、DNA)引入至细胞外囊泡供体细胞中，其中至少一个异源性多核苷酸编码细胞外基质RNA(例如，胶原)或VEGF RNA(例如，VEGFA)。载体(例如，DNA质粒)的引入可以经由多种方法，包括转染、磷酸钙转染、电穿孔、纳米电穿孔、脂转染、细胞纳米电穿孔、病毒递送或其他方法。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为原代细胞(例如，原代贴壁细胞)。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞来自细胞系(例如，人细胞、人成纤维细胞系、人真皮成纤维细胞系、人新生儿真皮成纤维细胞系)。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞在纳米电穿孔之前未经过基因修饰。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞在纳米电穿孔之前经过基因修饰。在一些情况下，本公开提供甚至从原本外泌体的基础分泌低的细胞产生大量含有大量mRNA转录物的外泌体的方法。
本文描述治疗皮肤损伤(例如，由阳光损伤、老化或其他过程引起)的方法，其包括向对象施用至少一个细胞外囊泡。本文所提供的方法尤其可用于逆转细纹和/或皱纹、减少细纹和/或皱纹或减少细纹和/或皱纹的出现。在一些情况下，本文所提供的方法在施用本文所提供的细胞外囊泡后的一段时间(例如至少30、60或90天)内减少皮肤损伤(例如，皱纹、细纹等)。在一些情况下，本文所提供的方法可以用于伤口愈合。在一些情况下，细胞外囊泡包含至少一个治疗性多核苷酸(例如，治疗性mRNA、miRNA等)。在一些情况下，包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡可以通过用至少第一载体(例如，质粒)对至少一个细胞外囊泡供体细胞进行纳米电穿孔来获得，其中第一载体编码治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多核苷酸包含细胞外基质RNA(例如，胶原)。在一些情况下，第一载体可以在细胞外囊泡供体细胞中表达以获得治疗性多核苷酸。在一些实施方案中，从细胞外囊泡供体细胞释放的细胞外囊泡包含治疗性多核苷酸。在一些情况下，收集细胞外囊泡并且全身性地施用于对象。在一些情况下，收集细胞外囊泡并且局部施用于对象(例如，经由皮下注射)。
本文描述治疗血流病症(例如，缺血)的方法，其包括向对象施用至少一个细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡包含至少一个治疗性多核苷酸(例如，治疗性mRNA、miRNA等)。在一些情况下，包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡可以通过用至少第一载体(例如，质粒)对至少一个细胞外囊泡供体细胞进行纳米电穿孔来获得，其中第一载体编码治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多核苷酸包含VEGF RNA(例如，VEGFA)。在一些情况下，第一载体可以在细胞外囊泡供体细胞中表达以获得治疗性多核苷酸。在一些实施方案中，从细胞外囊泡供体细胞释放的细胞外囊泡包含治疗性多核苷酸。在一些情况下，收集细胞外囊泡并且全身性地施用于对象。在一些情况下，收集细胞外囊泡并且局部施用于对象(例如，经由肌内注射)。
本文还描述包含多个细胞外囊泡的水凝胶微针。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。例如，在一些情况下，水凝胶包含至少5％、10％、15％或20％透明质酸。
本文还描述包含多个细胞外囊泡的针，其中细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质mRNA或VEGF mRNA。本文还描述包含多个细胞外囊泡的注射器，其中细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质mRNA或VEGF mRNA。
本文还描述微针装置。在一些情况下，微针装置包括基材和多个微针，其中多个微针从基材突出，并且其中多个微针中的至少一个微针包含至少一个EV。本文还描述制造此类微针装置的方法。
细胞外囊泡供体细胞
在一些情况下，本文描述产生本文所述的细胞外囊泡的细胞外囊泡供体细胞。细胞外囊泡供体细胞可以是可以经基因修饰或操作以在高于细胞外囊泡的分泌的细胞基础水平的水平下分泌细胞外囊泡或分泌含有外源性核酸(例如，外源性胶原RNA或VEGF RNA)的细胞外囊泡的任何细胞。因此，细胞外囊泡的分泌的基础水平低或可忽略的细胞也可以是细胞外囊泡供体细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以是有核细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以是自体细胞。在此类情况下，细胞外囊泡供体细胞可以从对象获得；然后，在修饰细胞外囊泡供体细胞(例如，引入载体)之后，收集分泌的细胞外囊泡，然后施用于同一对象。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为同种异体细胞。在此类情况下，细胞外囊泡供体细胞为与后来接受由细胞外囊泡供体细胞分泌的细胞外囊泡的对象在遗传上不同的来源获得的细胞。通常，在同种异体细胞外囊泡供体细胞的情况下，细胞外囊泡供体细胞与后来接受由细胞外囊泡供体细胞产生和分泌的细胞外囊泡的对象属于同一物种，但在遗传上不同。
细胞外囊泡供体细胞可以是任何类型的细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞、非人哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞等)。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为来自细胞系、干细胞、原代细胞或分化细胞的细胞。在一些实施方案中，细胞外囊泡供体细胞为原代细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、人真皮成纤维细胞(HDF)、树突细胞、间充质干细胞、骨髓来源的树突细胞、骨髓来源的基质细胞、脂肪基质细胞、去核细胞、神经干细胞、未成熟树突细胞或免疫细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为人新生儿原代真皮成纤维细胞。在一些情况下，人新生儿原代真皮成纤维细胞为来自ATCC的PCS-201-010系。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为原代真皮成纤维细胞。在一些情况下，原代真皮成纤维细胞为来自ATCC的PCS-201-012系。细胞外囊泡供体细胞可以为贴壁细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为贴壁细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞为悬浮细胞。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞包含至少一个异源性多核苷酸。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸通过转染引入至细胞外囊泡供体细胞中。至少一个异源性多核苷酸可以通过本文所述的生物、化学或物理方法中的任一种，或通过任何其他生物、化学或物理方法来转染至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸通过电穿孔(例如，纳米电穿孔)来转染至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，电穿孔为微通道电穿孔或纳米通道电穿孔。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸通过纳米通道电穿孔来转染至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞包含经基因修饰的细胞。经基因修饰的细胞的示例可以包括诱导的多能干细胞或通过核酸引导的核酸酶(例如，CRISPR-Cas)被基因修饰的细胞。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞未经过基因修饰。例如，在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞在电穿孔(例如，纳米电穿孔)之前未经过基因修饰。在一些情况下，转染至细胞外囊泡供体细胞中的异源性多核苷酸被整合至细胞外囊泡供体细胞的染色体中。在一些情况下，转染至细胞外囊泡供体细胞中的异源性多核苷酸未被整合至细胞外囊泡供体细胞的染色体中。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞用异源性多核苷酸稳定转染。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞用异源性多核苷酸瞬时转染。在一些情况下，转染的细胞外囊泡供体细胞为来源于细胞系的细胞。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸为载体(例如，质粒)。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以通过多个载体进行电穿孔以产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以通过多个载体进行纳米电穿孔以产生和分泌细胞外囊泡。在一些情况下，多个载体包含至少一个第一载体、至少一个第二载体或任何另外的载体。在一些情况下，第一载体和第二载体可以同时被纳米电穿孔至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，第一载体和第二载体可以在不同时间被纳米电穿孔至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，纳米电穿孔第一载体与第二载体之间的时间差可以为至少1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、5小时、12小时、1天、2天、5天、10天、30天或更长时间。
在一些情况下，第一载体可以编码至少一个治疗性多核苷酸(例如，ECM或VEGFmRNA)。在一些情况下，当用第一载体进行纳米电穿孔时，细胞外囊泡供体细胞可以转录第一载体以获得治疗性多核苷酸。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞产生并分泌包含由第一载体编码的治疗性多核苷酸的包封的细胞外囊泡或外泌体。
在一些情况下，第二载体可以编码靶向多肽(例如，可以增加细胞外囊泡对靶细胞的靶向和积聚的细胞特异性靶向肽)。在一些情况下，当用第二载体进行纳米电穿孔时，细胞外囊泡供体细胞可以翻译第二载体以获得靶向多肽。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以产生包含靶向多肽的细胞外囊泡或外泌体。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以分泌并产生包含靶向多肽的细胞外囊泡或外泌体。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌包含靶向肽和由第一载体编码的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡或外泌体。
在一些情况下，当用第一载体进行纳米电穿孔时，细胞外囊泡供体细胞可以转录或翻译第一载体以获得治疗性多核苷酸或治疗性多肽。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌包含由第一载体编码的治疗性多核苷酸或治疗性多肽的细胞外囊泡或外泌体。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌包含靶向肽和由第一载体编码的治疗性多核苷酸或治疗性多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，治疗性多核苷酸和治疗性多肽可以被包封在相同的细胞外囊泡或外泌体中。在一些情况下，治疗性多核苷酸和治疗性多肽可以被包封在不同的细胞外囊泡或外泌体中。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞以稳定或基础速率持续产生并分泌细胞外囊泡。细胞外囊泡供体细胞可以是任何细胞类型，包括细胞外囊泡的产生和分泌速率基础低或可忽略的细胞。例如，细胞外囊泡供体细胞可以为原代细胞或通常不分泌或分泌少量细胞外囊泡的非癌性细胞。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞以基础速率产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，可以刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。例如，可以通过使细胞外囊泡供体细胞热休克或使细胞外囊泡供体细胞与Ca2+离子接触来刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，可以通过激活应激应答信号传导通路例如p53-TSAP6信号传导通路来刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，可以通过将至少一个异源性多核苷酸电穿孔至细胞外囊泡供体细胞中来刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，可以通过将至少一个异源性多核苷酸微通道电穿孔或纳米通道电穿孔至细胞外囊泡供体细胞中来刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，可以通过将至少一个异源性多核苷酸电穿孔(例如，纳米通道电穿孔)至细胞外囊泡供体细胞中来刺激细胞外囊泡供体细胞以在高于基础速率的速率下产生并分泌细胞外囊泡。在一些情况下，通过电穿孔(例如，纳米通道电穿孔)刺激的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌细胞外囊泡的速率可以是细胞外囊泡供体细胞产生并分泌细胞外囊泡的基础速率的至少0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍或更高。在一些情况下，通过纳米通道电穿孔刺激的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌细胞外囊泡的速率可以是通过除电穿孔以外的方法刺激的细胞外囊泡产生并分泌细胞外囊泡的速率的至少0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍或更高。
在一些情况下，转染至细胞外囊泡供体细胞中的异源性多核苷酸编码本文所述的至少一个治疗剂。在一些情况下，治疗剂为治疗性多核苷酸。在一些情况下，治疗剂为治疗性多肽。在一些情况下，用至少一个异源性多核苷酸转染的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，用至少一个异源性多核苷酸转染的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌包含至少一个治疗剂的细胞外囊泡。
细胞外囊泡
在一些情况下，本文提供包含细胞外囊泡的组合物以及产生细胞外囊泡的方法。在一些情况下，细胞外囊泡为任何膜结合的颗粒(例如，具有脂质双层的囊泡)。通常，本文所提供的细胞外囊泡由细胞分泌。在一些情况下，细胞外囊泡为体外产生的膜结合的颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡由用至少一个异源性多核苷酸转染的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌。在一些情况下，细胞外囊泡为外泌体、微囊泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡小体、凋亡体、癌小体(oncosome)、exopher、包膜病毒、外泌颗粒(exomere)或非常大的细胞外囊泡，例如大的癌小体。在一些情况下，细胞外囊泡为外泌体。
在一些情况下，细胞外囊泡的直径可以为约10nm至约50,000nm。在一些情况下，细胞外囊泡的直径可以为约10nm至约20nm、约10nm至约30nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约200nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约2,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约10nm至约50,000nm、约20nm至约30nm、约20nm至约50nm、约20nm至约100nm、约20nm至约200nm、约20nm至约500nm、约20nm至约1,000nm、约20nm至约2,000nm、约20nm至约5,000nm、约20nm至约10,000nm、约20nm至约50,000nm、约30nm至约50nm、约30nm至约100nm、约30nm至约200nm、约30nm至约500nm、约30nm至约1,000nm、约30nm至约2,000nm、约30nm至约5,000nm、约30nm至约10,000nm、约30nm至约50,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约200nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约2,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约50nm至约50,000nm、约100nm至约200nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约2,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约100nm至约50,000nm、约200nm至约500nm、约200nm至约1,000nm、约200nm至约2,000nm、约200nm至约5,000nm、约200nm至约10,000nm、约200nm至约50,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约2,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约500nm至约50,000nm、约1,000nm至约2,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm、约1,000nm至约50,000nm、约2,000nm至约5,000nm、约2,000nm至约10,000nm、约2,000nm至约50,000nm、约5,000nm至约10,000nm、约5,000nm至约50,000nm或约10,000nm至约50,000nm。在一些情况下，细胞外囊泡的直径为约10nm、约20nm、约30nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm、约10,000nm或约50,000nm。在一些情况下，细胞外囊泡的直径可以为至少约10nm、约20nm、约30nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm。在一些情况下，细胞外囊泡的直径可以为至多约20nm、约30nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm、约10,000nm或约50,000nm。
细胞外囊泡表面蛋白通常为与细胞外囊泡缔合的蛋白质。在一些情况下，细胞外囊泡表面蛋白可以由细胞外囊泡供体细胞表达，并且作为由细胞外供体细胞产生并分泌的细胞外囊泡的一部分被整合且分泌。在一些情况下，细胞外囊泡表面蛋白包含至少一个细胞外结构域，其可以包括细胞外囊泡表面蛋白的N末端、C末端或N末端和C末端两者。在一些情况下，细胞外囊泡表面蛋白可以由本文所述的至少一个异源性多核苷酸或载体编码。在一些情况下，细胞外囊泡表面蛋白可以是免疫球蛋白超家族的成员。免疫球蛋白超家族的成员可以包括抗原受体、抗原呈递分子、共受体、抗原受体辅助分子、共刺激或抑制分子、自然杀伤细胞上的受体、白细胞上的受体、免疫球蛋白样细胞黏附分子、细胞因子受体、生长因子受体、受体酪氨酸激酶、受体酪氨酸磷酸酶、免疫球蛋白结合受体、细胞骨架或其他成员。在一些情况下，包含免疫球蛋白超家族成员的细胞外囊泡表面蛋白包含可变免疫球蛋白结构域(IgV)或恒定免疫球蛋白结构域(IgC)。在一些情况下，包含免疫球蛋白超家族成员的细胞外囊泡表面蛋白包含IgV结构域。包含IgV的免疫球蛋白超家族成员的示例可以包括分化簇蛋白(例如，CD2、CD4、CD47、CD80或CD86)、髓磷脂膜黏附分子、连接黏附分子(JAM)、酪氨酸蛋白激酶受体、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)或T细胞抗原受体。
在一些情况下，细胞外囊泡包含除治疗性多核苷酸以外的组分。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种防腐剂。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种稳定剂。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种DNA酶。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种RNA酶抑制剂。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种DNA酶和/或RNA酶抑制剂。在一些情况下，细胞外囊泡包含一种或多种DNA酶、DNA酶抑制剂、RNA酶和/或RNA酶抑制剂。
在一些情况下，与不具有靶向多肽的细胞外囊泡的半衰期相比，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡表现出增加的循环半衰期。在一些情况下，与不具有靶向多肽的细胞外囊泡的半衰期相比，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡的半衰期增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多。在一些情况下，与不具有靶向多肽的细胞外囊泡的半衰期相比，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡的半衰期增加至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、21天、28天、30天或更长时间。
在一些情况下，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在哺乳动物(例如，人、啮齿动物、小鼠)的循环中表现出的半衰期为至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少5分钟或至少10分钟。在一些情况下，包含靶向的细胞外囊泡在哺乳动物的循环中表现出的半衰期小于5小时、小于2小时、小于1小时或小于30分钟。
在一些情况下，靶向多肽包含异源性靶向结构域。在一些情况下，异源性靶向结构域为肿瘤靶向结构域、组织靶向结构域、细胞穿透肽、病毒膜蛋白或其组合。异源性靶向结构域可以靶向在靶细胞的表面上表达的细胞表面标志物。细胞表面标志物可以为在靶细胞的表面上表达的任何大分子或蛋白质。细胞表面标志物的非限制性示例包括血管受体、纤连蛋白受体、A2B5、CD44、CD24、ESA、SSEA1、CD133、CD34、CD19、CD38、CD26、CD166或CD90。
在一些情况下，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在表达细胞表面标志物的靶细胞处的积聚高于不具有至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在表达相同细胞表面标志物的相同靶细胞处的积聚。在一些情况下，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在表达细胞表面标志物的靶细胞处的积聚是不具有靶向多肽的细胞外囊泡在表达相同细胞表面标志物的相同靶细胞处的积聚的至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更高。
在一些情况下，与不具有至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在表达细胞表面标志物的靶细胞处的肝和脾积聚相比，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡在相同靶细胞处的肝和脾积聚(例如，细胞外囊泡在非靶向细胞处的积聚)减少。在一些情况下，与不具有靶向多肽的细胞外囊泡的肝和脾积聚相比，包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡的肝和脾积聚减少至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍。
在一些情况下，靶向多肽包含至少一个异源性靶向结构域。在一些情况下，至少一个异源性靶向结构域为肿瘤靶向结构域、组织靶向结构域、细胞穿透肽、病毒膜蛋白或其组合。在一些情况下，至少一个异源性靶向结构域为肿瘤靶向结构域，其中肿瘤靶向结构域靶向癌性细胞。在一些情况下，至少一个异源性靶向结构域为肿瘤靶向结构域，其中肿瘤靶向结构域靶向非癌性病变细胞。
在一些情况下，靶向多肽包含至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个异源性靶向结构域。在一些情况下，至少两个异源性靶向结构域可以是相同的。在一些情况下，至少两个异源性靶向结构域可以是不同的。
在一些情况下，靶向多肽包含至少一个组织靶向结构域，其使包含靶向多肽的细胞外囊泡靶向并引导至特定组织的细胞。在一些情况下，靶向多肽包含至少两个、三个、四个、五个或更多个组织靶向肽。在一些情况下，至少两个组织靶向肽是相同的。在一些情况下，至少两个组织靶向肽是不同的。在一些情况下，组织靶向肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。靶向内皮或心脏组织的示例性组织靶向结构域包括SIGYPLP、LSIPPKA、FQTPPQL、LTPATAI、CNIWGVVLSWIGVFPEC、NTTTH、VHPKQHR(四聚体)、CRKRLDRNCCRTLTVRKC、CLWTVGGGC、QPWLEQAYYSTF、YPHIDSLGHWRR、LLADTTHHRPWT、SAHGTSTGVPWP、VPWMEPAYQRFL、TLPWLEESYWRP、HWRR、CSTSMLKAC、DDTRHWG、CARPAR、CKRAVR、CRSTRANPC、CPKTRRVPC、CSGMARTKC或CRPPR。靶向胰腺组织的示例性组织靶向结构域包括CRVASVLPC、SWCEPGWCR、LSGTPERSGQAVKVKLKAIP、CHVLWSTRCCVSNPRWKC或LSALPRT。靶向肾组织的示例性组织靶向结构域包括CLPVASC、ELRGD(R/M)AX(W/L)、GV(K/R)GX3(T/S)RDXR、HITSLLSHTTHREP或ANTPCGPYTHDCPVKR。靶向肺组织的示例性组织靶向结构域包括CGFELETCCGFECVRQCPERC、QPFMQCLCLIYDASCRNVPPIFNDVYWIAF、VNTANST、CTSGTHPRC或SGEWVIKEARGWKHW-VFYSCCPTTPYLDITYH。靶向肠组织的示例性组织靶向结构域包括YSGKWGW、LETTCASLCYPSYQCSYTMPHPPVVPPHPMTYSCQY、YPRLLTP、CSQSHPRHC、CSKSSDYQC、CKSTHPLSC、CTGKSCLRVG、SFKPSGLPAQSL或CTANSSAQC。靶向脑组织的示例性组织靶向结构域可以包括CLSSRLDAC、GHKAKGPRK、HAIYPRH、THRPPMWSPVWP、HLNILSTLWKYRC、CAGALCY、CLEVSRKNC、RPRTRLHTHRNR(D-aa)、ACTTPHAWLCG、GLAHSFSDFARDFV、GYRPVHNIRGHWAPG、TGNYKALHPHNG、CRTIGPSVC、CTSTSAPYC、CSYTSSTMC、CMPRLRGC、TPSYDTYAAELR、RLSSVDSDLSGC、CAQK或SGVYKVAYDWQH。靶向各种组织的另外的示例性组织靶向结构域包括LMLPRAD(靶向肾上腺)、CSCFRDVCC(靶向视网膜)、CRDVVSVIC(靶向视网膜)、CVALCREACGEGC(靶向皮肤真皮脉管系统)、GLSGGRS(靶向子宫)、WYRGRL(靶向软骨)、CPPEGAGC(靶向乳房脉管系统)、SMSIARLVSFLEYR(靶向前列腺)、GPEDTSRAPENQQKTGC(靶向皮肤朗格汉斯细胞(Langerhans))、CKGGRAKDC(靶向白色脂肪脉管系统)、CARSKNKDC(靶向伤口或受损组织)、CHAQGSAEC(靶向胸腺)、LEPRWGFGWWLKLSTHTTESRSMV(靶向耳朵或耳蜗组织)、ACSTEALRHCGGGS(靶向视网膜血管)、ASSLNIA(靶向肌肉组织)、CSTSMLKAC(靶向缺血)或CSTSMLKAC(靶向缺血心肌)。
在一些情况下，靶向多肽包含至少两个、三个、四个、五个或更多个细胞穿透肽。在一些情况下，包含细胞穿透肽的靶向多肽增加细胞外囊泡被靶向细胞融合或内吞的速率。在一些情况下，至少两个细胞穿透肽是相同的。在一些情况下，至少两个细胞穿透肽是不同的。在一些情况下，细胞穿透肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。细胞穿透肽的非限制性示例包括DSLKSYWYLQKFSWR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、KSKTEYYNAWAVWERNAP、GNGEQREMAVSRLRDCLDRQA、HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、R9GPLGLAGE8、Ac-GAFSWGSLWSGIKNFGSTVKNYG、RLRWR、LGQQQPFPPQQPY、ILGKLLSTAAGLLSNL、TFFYGGSRGKRNNFKTEEY、Ac-LRKLRKRLLRX-Bpg-G、Ac-LRKLRKRLLR或MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV。
在一些情况下，靶向多肽包含至少两个、三个、四个、五个或更多个病毒膜蛋白或其片段。在一些情况下，包含病毒膜蛋白的靶向多肽增加细胞外囊泡被靶向细胞融合或内吞的速率。在一些情况下，至少两个病毒膜蛋白是相同的。在一些情况下，至少两个病毒膜蛋白是不同的。在一些情况下，病毒膜蛋白包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。病毒膜蛋白的非限制性示例包括血凝素、糖蛋白41、包膜蛋白、VSV G、HSV01 gB、埃博拉病毒糖蛋白或融合相关小跨膜(FAST)蛋白。
在一些情况下，本文所述的细胞外囊泡包含至少一个治疗剂。在一些情况下，至少一个治疗剂在细胞外囊泡内(例如，包封在细胞外囊泡内)。在一些情况下，治疗剂为治疗性多核苷酸。在一些情况下，治疗剂为治疗性多肽。在一些情况下，治疗剂为治疗性化合物。在一些情况下，治疗剂包含治疗性多核苷酸、治疗性多肽、治疗性化合物或其组合。在一些情况下，细胞外囊泡包含多个治疗剂，其中多个治疗剂包含治疗性多核苷酸、治疗性多肽、治疗性化合物或其组合。
在一些情况下，本文所述的细胞外囊泡包含至少一个靶向多肽。在一些情况下，靶向多肽为包含皮肤靶向结构域的皮肤靶向多肽。在一些情况下，与不具有皮肤靶多肽的细胞外囊泡的积聚相比，包含包含皮肤靶向结构域的皮肤靶向多肽的细胞外囊泡在皮肤处的积聚较高。在一些情况下，包含皮肤靶向多肽的细胞外囊泡在皮肤处的积聚是缺乏皮肤靶向多肽的细胞外囊泡的积聚的至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些情况下，包含皮肤靶向多肽的细胞外囊泡在皮肤处的积聚是缺乏皮肤靶向多肽的细胞外囊泡的积聚的至少100倍。
在一些情况下，皮肤靶向多肽包含至少一个皮肤靶向结构域。在一些情况下，皮肤靶向结构域可以在皮肤靶向多肽的N末端。在一些情况下，皮肤靶向结构域可以在皮肤靶向多肽的C末端。在一些情况下，皮肤靶向结构域可以在皮肤靶向多肽的任何肽位置处。在一些情况下，至少两个靶向结构域可以在相同的皮肤靶向多肽上。在一些情况下，相同的皮肤靶向多肽上的至少两个靶向结构域可以是相同的。在一些情况下，相同的皮肤靶向多肽上的至少两个靶向结构域可以是不同的。在一些情况下，靶向结构域包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。
在一些情况下，与不具有细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡的半衰期相比，包含细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡包含增加的在循环中的半衰期。在一些情况下，与缺乏细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡的半衰期相比，通过细胞外囊泡表面蛋白增加的细胞外囊泡的半衰期为至少90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、21天、28天、30天或更长时间。
在一些情况下，与缺乏细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡相比，包含细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡具有降低的毒性。在此类情况下，细胞外囊泡表面蛋白常常特异性结合靶标，并且不具有显著的脱靶结合。在一些情况下，毒性包括对不被肿瘤靶向多肽靶向的细胞的毒性。在一些情况下，与缺乏细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡相比，包含细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡的毒性降低至至多1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100或更低。在一些情况下，与缺乏细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡相比，包含细胞外囊泡表面蛋白的细胞外囊泡的毒性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
在一些情况下，在施用细胞外囊泡(例如，外泌体)之后，细胞外囊泡被对象耐受。例如，在一些情况下，细胞外囊泡不诱导免疫应答，或者不具有免疫原性。
治疗性多核苷酸
在一些情况下，本文描述包含至少一个治疗性多核苷酸的细胞外囊泡。在一些情况下，至少一个治疗性多核苷酸由转染至细胞外囊泡供体细胞中的至少一个异源性多核苷酸或载体编码。在一些情况下，至少一个治疗性多核苷酸包含可以被本文所述的靶向多肽所靶向并结合的细胞翻译成治疗性多肽的肽序列。
在一些情况下，细胞外囊泡包含至少一个治疗性多核苷酸。在一些情况下，每个细胞外囊泡包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或更多个治疗性多核苷酸的拷贝。在一些情况下，每个细胞外囊泡包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或更多个本文所述的治疗性mRNA的拷贝。在一些情况下，细胞外囊泡包含至少两个治疗性多核苷酸。在一些情况下，细胞外囊泡包含至少两个治疗性多核苷酸，其中至少两个治疗性多核苷酸是不同的。在一些情况下，被细胞外囊泡包封的至少两个不同的治疗性多核苷酸包含不同的比率。例如，两个不同的治疗性多核苷酸中的第一个与第二个之间的比率可以为1:1,000,000、1:500,000、1:100,000、1:50,000、1:10,000、1:5,000、1:1,000、1:500、1:100、1:50、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1。在一些情况下，细胞外囊泡包含包封在同一细胞外囊泡中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个治疗性多核苷酸。在一些情况下，细胞外囊泡可以是外泌体。
在一些情况下，治疗性多核苷酸包含mRNA、rRNA、SRP RNA、tRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、gRNA、aRNA、crRNA、lncRNA、miRNA、ncRNA、piRNA、siRNA和shRNA。在一些情况下，治疗性多核苷酸包含mRNA。在一些情况下，mRNA为完全完整的或基本上完整的。在一些情况下，mRNA编码蛋白质的一部分。在一些情况下，mRNA包含至少50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000个RNA核苷酸。在一些情况下，治疗性多核苷酸包含DNA。在一些情况下，治疗性多核苷酸包含DNA，例如编码治疗性多肽或RNA治疗剂的载体。治疗性多核苷酸可以编码治疗性多肽，包括但不限于：细胞外基质(ECM)蛋白或肽或血管生成蛋白或肽。可以通过治疗性多核苷酸(例如，信使RNA治疗剂)编码的治疗性多肽的示例包括纤维状胶原(例如，I、II、III、V、XI型胶原)、FACIT胶原(例如，IX、XII、XIV型胶原)、短链胶原(例如，VIII、X型胶原)、基底膜胶原(例如，IV型胶原)、其他胶原(例如，VI、VII、XIII、XV、XVII、XVIIII型胶原)、弹性蛋白(ELN)、纤连蛋白(FN1)、层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-221、层粘连蛋白-332/层粘连蛋白-3A32、层粘连蛋白-3B32、层粘连蛋白-311/层粘连蛋白-3A11、层粘连蛋白-321/层粘连蛋白-3A21、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-213、层粘连蛋白-423、层粘连蛋白-522、层粘连蛋白-523)或其混合物或VEGF(例如，VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、胎盘生长因子(PlGF)或其混合物)。在一些情况下，本文所述的治疗性多核苷酸可以编码I型胶原(Col1)。在一些情况下，从本文所述的治疗性多核苷酸编码的治疗性多肽可以是I型胶原(Col1)。在一些情况下，本文所述的治疗性多核苷酸可以编码VEGF(VEGFA)。在一些情况下，从本文所述的治疗性多核苷酸编码的治疗性多肽可以是VEGF(VEGFA)。
使用本文所公开的产生EV的方法，COL1A1 mRNA以每个EV某一拷贝数存在。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个COL1A1 mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV至少1、2、5、10、50、100、200、300、500或1000个COL1A1 mRNA的拷贝。在一些情况下，包含平均约每0.1至100个EV至少一个COL1A1 mRNA的拷贝。
使用本文所公开的产生EV的方法，VEGF mRNA以每个EV某一拷贝数存在。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV至少1、2、5、10、50、100、200、300、500或1000个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，包含平均约每0.02至50个EV至少一个VEGF mRNA的拷贝。
在一些情况下，包封在细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂、mRNA治疗剂)的拷贝数为每个细胞外囊泡至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少25、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000或更多个治疗性多核苷酸的拷贝。在一些情况下，包封在本文所述的每个细胞外囊泡或外泌体中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂、mRNA治疗剂)的拷贝数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少25、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000或更多个拷贝。
在一些情况下，包封在多个细胞外囊泡(例如，培养容器内的供体细胞所分泌的多个EV)中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂、mRNA治疗剂)的拷贝数为平均每个细胞外囊泡至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少25、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000或更多个治疗性多核苷酸的拷贝。在一些情况下，包封在本文所述的每个细胞外囊泡或外泌体中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂、mRNA治疗剂)的拷贝数为平均至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少25、至少50、至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000或更多个拷贝。
在一些情况下，与包封在从通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、脂质转染胺转染(lipofectamine transfection)等)转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸的拷贝数相比，包封在从转染(例如，通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔)的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的拷贝数增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。在一些情况下，与包封在通过将治疗性多核苷酸直接引入至细胞外囊泡中(例如，将治疗性多核苷酸直接转染至细胞外囊泡中)所产生的细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸的拷贝数相比，包封在从微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体产生的细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的拷贝数增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。
在一些情况下，包封在从通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)为完全或基本上完整的，其中包封的治疗性多核苷酸的拷贝中的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多为完全完整或基本上完整的。在一些情况下，与包封在从通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的百分比相比，包封在从通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的百分比增加。在一些情况下，与包封在从通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、脂质转染胺转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸的数量相比，包封在从通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔转染的细胞外囊泡供体细胞产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的数量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。在一些情况下，与包封在通过将治疗性多核苷酸直接引入至细胞外囊泡中(例如，将治疗性多核苷酸直接转染至细胞外囊泡中)所产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸的数量相比，包封在从通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔转染的细胞外囊泡供体产生的细胞外囊泡中的完全完整或基本上完整的治疗性多核苷酸(例如，RNA治疗剂或信使RNA治疗剂)的数量增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。
在一些情况下，治疗性多核苷酸包括至少一种修饰的核酸或核酸类似物。示例性修饰的核酸包括但不限于尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)、2-氨基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。某些修饰的核酸，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加双链体形成稳定性的那些、通用核酸、疏水性核酸、混杂核酸、大小扩大的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、三环嘧啶、吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹(G-clamp)、吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶、2-吡啶酮、氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羟基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶、2-氨基-腺嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、2-硫代-胸腺嘧啶、4-硫代-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、5-羟基胞嘧啶、2’-脱氧尿苷、2-氨基-2’-脱氧腺苷。包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的修饰核酸是本领域可获得的，并且在一些情况下，核酸包含除天然存在的核酸的五种主要碱基组分以外的一种或多种杂环碱基。例如，在一些情况下，杂环碱基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤经由9-位连接至核酸的糖部分，嘧啶经由1-位连接，吡咯并嘧啶经由7-位连接，并且吡唑并嘧啶经由1-位连接。
在一些情况下，核苷酸类似物的磷酸酯部分也被修饰。修饰的磷酸酯部分包括但不限于在两个核苷酸之间的键联处具有修饰的那些，并且含有例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯)、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)和硼烷磷酸酯(boranophosphate)。应当理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯或修饰的磷酸酯键联是通过3’-5’键联或2’-5’键联，并且键联含有反转的极性，例如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
在一些情况下，修饰的核酸包括2’,3’-二脱氧-2’,3’-二脱氢核苷、5’-取代的DNA和RNA衍生物或制备成具有修饰的碱基的单磷酸酯的5’-取代单体。
在一些情况下，修饰的核酸包括在糖环的5’-位和2’-位处的修饰，例如，5’-CH2-取代的2’-O-保护的核苷。在一些情况下，修饰的核酸包括被制备用于掺入寡核苷酸中的酰胺连接核苷二聚体，其中二聚体中的3’连接核苷(5’至3’)包含2’-OCH3和5’-(S)-CH3。修饰的核酸可以包括2’-取代的5’-CH2(或O)修饰的核苷。修饰的核酸可以包括5’-亚甲基膦酸酯DNA和RNA单体和二聚体。修饰的核酸可以包括具有2’-取代的5’-膦酸酯单体和其他修饰的5’-膦酸酯单体。修饰的核酸可以包括5’-修饰的亚甲基膦酸酯单体。修饰的核酸可以包括在5’和/或6’-位包含羟基的5’或6’-膦酸酯核糖核苷的类似物。修饰的核酸可以包括5’-膦酸酯脱氧核糖核苷单体和具有5’-磷酸酯基团的二聚体。修饰的核酸可以包括具有6’-膦酸酯基团的核苷，其中5’或/和6’-位未被取代或被硫代叔丁基(SC(CH3)3)(及其类似物)、亚甲基氨基(CH2NH2)(及其类似物)或氰基(CN)(及其类似物)取代。
在一些情况下，修饰的核酸还包括糖部分的修饰。在一些情况下，核酸含有一个或多个糖基已被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可以赋予增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其他有益的生物性质。在某些情况下，核酸包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的示例包括不限于：添加取代基(包括5’和/或2’取代基)；两个环原子桥接以形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)(R＝H、C1-C12烷基或保护基)替代核糖基环氧原子；及其组合。
在一些情况下，修饰的核酸包含修饰的糖或糖类似物。因此，除核糖和脱氧核糖以外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基。糖可以是吡喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可以是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以呈[α]或[β]异头构型连接至相应的杂环碱基。糖修饰包括但不限于2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，糖修饰可以包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修饰包括2’-O-烷基取代的脱氧核糖核苷和2’-O-乙二醇样核糖核苷。这些糖或糖类似物以及相应的“核苷”的制备是已知的，其中此类糖或类似物连接至杂环碱基(核酸碱基)。还可以进行糖修饰并将其与其他修饰组合。
对糖部分的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及修改的修饰。糖修饰包括但不限于在2’位处的以下修饰：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。
在2’位处的其他修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改进寡核苷酸的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其他取代基。类似的修饰还可以在糖上的其他位置处进行，特别是3’末端核苷酸上或2’-5’连接寡核苷酸中的糖的3’位以及5’末端核苷酸的5’位。修饰的糖还包括在桥接环的氧处含有修饰(例如，CH2和S)的那些。核苷酸糖类似物还可以具有糖模拟物(例如，环丁基部分)以替代戊呋喃糖基糖。
具有修饰的糖部分的核酸的示例包括但不限于包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核酸。在2’位处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C1-C1O烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些情况下，本文所述的核酸包括一种或多种双环核酸。在某些此类情况下，双环核酸包含在4’与2’核糖基环原子之间的桥。在某些情况下，本文所提供的核酸包括一种或多种双环核酸，其中桥构成4’至2’双环核酸。此类4’至2’双环核酸的示例包括但不限于下式之一：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’及其类似物；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物。
在某些情况下，核酸包含连接的核酸。核酸可以使用任何核酸间键联连接在一起。核酸间连接基的两个大类通过是否存在磷原子来定义。代表性含磷核酸间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯(P＝S)。代表性非含磷核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰基氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)、硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)和N,N*-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些方面，具有手性原子的核酸间键联可以制备为外消旋混合物，呈单独的对映体，例如，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。修饰的核酸可以含有单个修饰。修饰的核酸可以在一个部分内或在不同的部分之间含有多个修饰。
对核酸的主链磷酸酯修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥接或非桥接)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、二硫代膦酸酯和硼烷磷酸酯，并且可以以任何组合使用。也可以使用其他非磷酸酯键联。
在一些情况下，主链修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键联)可以赋予修饰的核酸免疫调节活性和/或增强其体内稳定性。
在一些情况下，磷衍生物(或修饰的磷酸酯基)连接至糖或糖类似物部分，并且可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
在一些情况下，主链修饰包括用替代的部分例如阴离子、中性或阳离子基团替代磷酸二酯键联。此类修饰的示例包括：阴离子核苷间键联；N3’至P5’氨基磷酸酯修饰；硼烷磷酸酯DNA；前寡核苷酸(prooligonucleotide)；中性核苷间键联，例如甲基膦酸酯；酰胺连接DNA；亚甲基(甲基亚氨基)键联；甲缩醛和硫代甲缩醛键联；含有磺酰基的主链；吗啉代寡核苷酸；肽核酸(PNA)；和带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡核苷酸(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry 8:1157-1179)。修饰的核酸可以包含嵌合或混合主链，其包含一个或多个修饰，例如磷酸酯键联的组合，例如磷酸二酯和硫代磷酸酯键联的组合。
磷酸酯的取代基包括例如短链烷基或环烷基核苷间键联、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键联或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联。这些包括具有以下的那些：吗啉代键联(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链。还应当了解在核苷酸取代基中，核苷酸的糖部分和磷酸部分均可以通过例如酰胺类型键联(氨基乙基甘氨酸)(PNA)被替代。美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262教导如何制备和使用PNA分子，所述专利各自通过引用并入本文。还参见Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500。还有可能将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物以增强例如细胞摄取。缀合物可以化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。此类缀合物包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇基)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或l-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-S-H-膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
在一些情况下，与天然核酸分子相比，本文所述的至少一种修饰的核苷酸或核苷酸类似物可以对核酸酶具有抗性，例如核糖核酸酶(例如，RNA酶H)、脱氧核糖核酸酶(例如，DNA酶)或外切核酸酶(例如，5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶)。在一些情况下，至少一种修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺或其组合对核酸酶具有抗性，例如核糖核酸酶(例如，RNA酶H)、脱氧核糖核酸酶(例如，DNA酶)或外切核酸酶(例如，5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶)。在一些情况下，2’-O-甲基修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-脱氧修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-脱氧-2’-氟修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-ON-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，LNA修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，ENA修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，HNA修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，吗啉代具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，PNA修饰的核酸分子对核酸酶具有抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，甲基膦酸酯核苷酸修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，硫醇膦酸酯核苷酸的修饰的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，包含2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，本文所述的5’缀合物抑制5’-3’外切核酸裂解。在一些情况下，本文所述的3’缀合物抑制3’-5’外切核酸裂解。
在另外的情况下，本文所述的修饰的核苷酸或核苷酸类似物被修饰以增加其稳定性。在一些实施方案中，核酸分子为RNA(例如，mRNA)。在一些情况下，可以通过一个或多个修饰来修饰mRNA以增加其稳定性。在一些情况下，mRNA可以在2’羟基位置处进行修饰，例如通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-0-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰或通过锁定或桥接核糖构象(例如，LNA或ENA)。在一些情况下，至少一个修饰的核苷酸或核苷酸类似物通过2’-O-甲基和/或2’-O-甲氧基乙基核糖进行修饰。在一些情况下，至少一个修饰的核苷酸或核苷酸类似物还包括吗啉代、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和/或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺以增加其稳定性。在一些情况下，至少一个修饰的核苷酸或核苷酸类似物为手性纯的(或立体纯的)核酸分子。在一些情况下，对手性纯的(或立体纯的)核酸分子进行修饰以增加其稳定性。
在一些情况下，本文所述的细胞外囊泡包含本文所述的治疗性多肽中的任一种的至少一个。在一些情况下，至少一个治疗性多肽由转染至细胞外囊泡供体细胞中的至少一个异源性多核苷酸或载体编码。
在一些情况下，治疗性多核苷酸可以通过细胞外囊泡供体细胞翻译以获得至少一个治疗性多肽。在一些情况下，通过治疗性多核苷酸编码的治疗性多肽可以被通过细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的细胞外囊泡包封。在一些情况下，细胞外囊泡可以包封通过纳米电穿孔的载体编码的治疗性多核苷酸和治疗性多肽。在一些情况下，细胞外囊泡可以是外泌体。
在一些情况下，本文所述的细胞外囊泡可以包含至少一个治疗性化合物。在一些情况下，至少一个治疗性化合物通过本文所述的细胞外囊泡表面蛋白中的任一个来复合或锚定。在一些情况下，至少一个治疗性化合物在细胞外囊泡内。在本文所述的组合物和方法中使用的示例性治疗性化合物包括治疗皮肤损伤(例如，由于老化或阳光损伤)和血流病症(例如，缺血)的治疗性化合物。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些实施方案中，外源性VEGF mRNA选自VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF及其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述细胞外囊泡混合物，其中混合物包含至少两个包含一个至六个外源性VEGF mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由冠状动脉导管注射。
在一些方面，本文描述治疗对象的血流病症的方法，其包括向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡，从而治疗血流病症。在一些实施方案中，治疗血流病症导致再血管化增加至少5％。在一些实施方案中，再血管化增加至少5％发生在施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的14天内。在一些实施方案中，施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括经由静脉内、肌内或皮下注射或经由冠状动脉导管向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至少14号的针进行。在一些实施方案中，血流病症为缺血。在一些实施方案中，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些实施方案中，剂量包含至少1,000个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。在一些实施方案中，向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些实施方案中，外源性细胞外基质mRNA选自：胶原、COL1、I型胶原、II型胶原、III型胶原、V型胶原、XI型胶原、IX型胶原、XII型胶原、XIV型胶原、VIII型胶原、X型胶原、IV型胶原、VI型胶原、VII型胶原、XIII型胶原、XV型胶原、XVII型胶原和XVIIII型胶原。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些实施方案中，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述细胞外囊泡混合物，其中混合物包含至少两个包含一个至两个外源性细胞外基质mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些实施方案中，混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。
在一些方面，本文描述治疗对象的皮肤损伤的方法，其包括向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡，从而治疗对象的皮肤损伤。在一些实施方案中，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少10％。在一些实施方案中，皱纹的出现减少至少10％发生在施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的14天内。在一些实施方案中，施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括经由皮下注射向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，皮下注射使用规格为至少14的针进行。在一些实施方案中，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些实施方案中，至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些实施方案中，剂量包含至少1,000个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。在一些实施方案中，向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些实施方案中，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少6000pg/ml。
在一些方面，本文描述产生包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：经由转染将编码VEGF的载体或质粒引入至供体细胞中；将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡；以及收集包封从载体或质粒转录的VEGFmRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：经由转染将编码细胞外基质蛋白的载体或质粒引入至供体细胞中；将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及收集包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使RNA(mRNA)。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，胶原为Col1A1，并且多个细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每450个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每200个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每约0.1至100个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV至少1、2、5、10、50、100、200、300、500或1000个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV约1至10个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个EV约1个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每30个EV至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
在一些情况下，多个细胞外囊泡通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生。在一些情况下，细胞的转染是通过细胞纳米穿孔进行的。在一些情况下，细胞的转染是通过电穿孔进行的。在一些情况下，细胞为人细胞。在一些情况下，细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。在一些情况下，细胞为贴壁细胞。在一些情况下，细胞为人真皮成纤维细胞(例如，人新生儿真皮成纤维细胞)。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括以下中的至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
在一些情况下，多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。在一些情况下，制剂包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种防腐剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种DNA酶和/或RNA酶抑制剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种DNA酶、DNA酶抑制剂、RNA酶和/或RNA酶抑制剂。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1013个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x109个细胞外囊泡并且至多1x1020个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x101、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106个细胞外囊泡并且至多1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至多1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng并且至多20μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少5ng并且至多30μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，靶向多肽靶向真皮细胞。在一些情况下，靶向多肽靶向氨肽酶N、CD26/DPP4、成纤维细胞激活蛋白α或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡不包含以下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325或hsa-miR-199b-5p。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约50nm-200nm处的大小分布。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约100nm处的大小分布。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含直径的峰值在约75-130nm处的大小分布。在一些情况下，细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。在一些情况下，至少90％的细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于50nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于30nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于20nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于10nm的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡不包括直径小于5nm的细胞外囊泡。
在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少2倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少3倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的约3000倍。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中外源性细胞外基质mRNA的水平的约2000倍。在一些情况下，与可比数量的天然存在的细胞外囊泡相比，多个细胞外囊泡表达较高水平的以下标志物中的至少一种：CD9、CD63、TSG101或ARF6。
在一些方面，本文描述一种容器，其包括如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中容器还包括细胞。在一些情况下，细胞包括人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡以每个细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在于容器中。
在一些方面，本文描述一种针，其包含本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，针为微针。在一些情况下，针为实心的。在一些情况下，针为水凝胶针。在一些情况下，针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至多1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些方面，本文描述一种注射器，其包含本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡悬浮在注射器内的透明质酸中。
在一些方面，本文描述一种水凝胶微针，其中水凝胶微针包含多个细胞外囊泡。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％、7％、10％、15％或20％透明质酸。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括不大于1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025、1x1030、1x1030、1x1040、1x1050、1x1060、1x1070、1x1080、1x1090或1x10100个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106至1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1010至1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1013至1x1014个细胞外囊泡。
在一些情况下，水凝胶微针的长度小于2mm。在一些情况下，水凝胶微针的长度小于1mm。在一些情况下，水凝胶微针的长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000μm。在一些情况下，水凝胶微针的长度不大于100、不大于200、不大于300、不大于400、不大于500、不大于600、不大于700、不大于800、不大于900、不大于1000、不大于1100、不大于1200、不大于1300、不大于1400、不大于1500、不大于1600、不大于1700、不大于1800、不大于1900或不大于2000μm。在其他情况下，水凝胶微针的长度为100μm至3000μm、500μm至2500μm、1000μm至2500μm或1000μm至2000μm。在具体的实施方案中，水凝胶微针的长度为约1000μm。在具体的实施方案中，水凝胶微针的长度为约2000μm。
在一些情况下，水凝胶微针具有直径不大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、小于1800μm、小于1500μm、小于1000μm、小于900μm、小于800μm、小于700μm、小于600μm、小于500μm、小于400μm、小于300μm、小于200μm或小于100μm的基部。在一些情况下，水凝胶微针包含负载一个或多个mRNA货物的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种针，其包含多个细胞外囊泡，其中细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质信使RNA(mRNA)。在一些情况下，细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，胶原为Col1A1，并且多个细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括以下中的任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
在一些情况下，针为微针。在一些情况下，针为实心的。在一些情况下，针为水凝胶针，并且任选地其中针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，针的长度小于2mm。在一些情况下，针的长度小于1mm。在一些情况下，针的长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000μm。在一些情况下，针的长度不大于100、不大于200、不大于300、不大于400、不大于500、不大于600、不大于700、不大于800、不大于900、不大于1000、不大于1100、不大于1200、不大于1300、不大于1400、不大于1500、不大于1600、不大于1700、不大于1800、不大于1900或不大于2000μm。在其他情况下，针的长度为100μm至3000μm、500μm至2500μm、1000μm至2500μm或1000μm至2000μm。在具体的实施方案中，针的长度为约1000μm。在具体的实施方案中，针的长度为约2000μm。
在一些情况下，针具有直径不大于10000μm、9000μm、8000μm、7000μm、6000μm、5000μm、4000μm、3000μm、2000μm、小于1800μm、小于1500μm、小于1000μm、小于900μm、小于800μm、小于700μm、小于600μm、小于500μm、小于400μm、小于300μm、小于200μm或小于100μm的基部。
COL1A1基因产生I型胶原组分，称为前α1(I)链。此链与另一条前α1(I)链并且还与一条前α2(I)链(通过COL1A2基因产生)组合，以形成I型原胶原分子。这些三链绳样前胶原分子可以通过酶进行加工。一旦这些分子被加工，它们便将自身排列成长细的原纤维，这些原纤维在细胞周围的空间中彼此交联。交联导致形成非常牢固的成熟I型胶原纤维。因此，在一些情况下，至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝在暴露于多个细胞外囊泡的细胞中被转录并且被组装成前α1(I)链。在一些情况下，至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝在暴露于多个细胞外囊泡的细胞中被转录并且被进一步组装成I型前胶原。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个细胞外囊泡至少10、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、10,000、15,000、30,000、50,000、80,000、100,000、150,000、300,000、500,000、700,000、1,000,000个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个细胞外囊泡约10、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、10,000、15,000、30,000、50,000、80,000、100,000、150,000、300,000、500,000、700,000、1,000,000个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
在一些情况下，本文所公开的细胞外囊泡为外泌体。在其他情况下，本文所公开的细胞外囊泡为微囊泡。在其他情况下，本文所公开的细胞外囊泡为凋亡小体。在其他情况下，本文所公开的细胞外囊泡为本段中提及的任何两种或三种类型的组合。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含如本文所公开的靶向多肽的细胞外囊泡。
本文还提供包含多个细胞外囊泡的针，细胞外囊泡包含平均至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。本文还提供包含多个细胞外囊泡的针，细胞外囊泡包含平均至少一个内源性细胞外基质mRNA的拷贝。本文还提供包含多个细胞外囊泡的针，细胞外囊泡包含平均至少一个内源性细胞外基质mRNA的拷贝和至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
在一些情况下，针为微针。在一些情况下，针包含水凝胶。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸。
本文还提供包含多个细胞外囊泡的注射器，细胞外囊泡包含平均至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。本文还提供包含多个细胞外囊泡的注射器，细胞外囊泡包含平均至少一个内源性细胞外基质mRNA的拷贝。本文还提供包含多个细胞外囊泡的注射器，细胞外囊泡包含平均至少一个内源性细胞外基质mRNA的拷贝和至少一个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
在一些情况下，注射器的规格为至少34。在一些情况下，注射器的规格小于10。在一些情况下，注射器的规格为34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10。
在一些情况下，注射器中的多个细胞外囊泡悬浮在透明质酸中。
本文还提供细胞外囊泡的混合物，其中混合物包含至少两个细胞外囊泡，细胞外囊泡包含一个或两个外源性细胞外基质mRNA的拷贝。在一些情况下，混合物包含外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。
在一些情况下，本文所公开的混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。
本文还提供产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，其中产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括：(a)经由转染，将编码细胞外基质蛋白的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)收集包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些情况下，在步骤(a)中，转染使用细胞电穿孔进行，如图7A中所示。在一些具体的情况下，在步骤(a)中，转染包括将单层供体细胞接种至图7A中所示的硅芯片表面上，并且在一定脉冲和持续时间的情况下施加一定电压的电场，以用于将载体或质粒电穿孔至供体细胞中。在一些进一步的具体的情况下，接种需要过夜温育，如前所述。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为至少10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V或1000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为约10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V或1000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为至多500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1500V、2000V、5000V或10,000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲为至少5、10、15、20、25、30、40、50或60。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲不大于5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲为约5、10、15、20、25、30、40、50或60。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲之间的间隔为至少0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s或1s。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲之间的间隔为约0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s或1s。
在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。
在一些方面，本文描述一种制造微针装置的方法，其中该方法包括：(a)将细胞外囊泡(EV)与第一批可聚合的溶液混合；以及(b)将来自(a)的混合物浇注至具有至少一个针样形状的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中。在一些情况下，(a)中的混合在真空下进行。
在一些情况下，该方法还包括将EV浓缩在PDMS模具的至少一个针样形状的尖端中。在一些情况下，浓缩是通过将PDMS模具维持在至多10℃的温度进行的。在一些情况下，浓缩是通过将PDMS模具维持在约4℃进行的。在一些情况下，浓缩持续约2至约6小时。
在一些情况下，该方法还包括将第二批可聚合的溶液添加在PDMS模具的顶部。在一些情况下，可聚合的溶液包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、和聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为至少1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90或1:100。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率不大于1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为约1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35或1:40。
在一些情况下，EV包含外源性细胞外基质mRNA。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA包含：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，EV包含外源性VEGF mRNA。在一些情况下，外源性VEGF mRNA包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF或其任何组合。
在一些方面，本文描述一种在组织中产生I型胶原的异二聚体或异三聚体的方法，其中该方法包括向组织施用本文所公开的多个细胞外囊泡。在一些情况下，异二聚体或异三聚体包含至少一条I型胶原α链(Col1A1)和至少一条I型胶原α链(Col1A2)，并且其中Col1A1通过本文所公开的多个细胞外囊泡外源性地递送。在一些情况下，Col1A2为组织内源性的。
在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含平均每400个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，外源性VEGF mRNA选自VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每至多1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或350个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少1、2、5、10、20、25、30、35、30、50、60、70、90或100个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至多1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每约0.001至100、0.01至100或0.01至50个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含每约0.02至50个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。
在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
在一些情况下，多个细胞外囊泡被配制用于静脉内注射、肌内注射、皮下注射或经由冠状动脉导管注射。
在一些情况下，混合物包含至少两个包含一个至六个外源性VEGF mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。在一些情况下，所述混合物被配制用于经由静脉内、肌内或皮下途径注射。在一些情况下，所述混合物被配制用于经由冠状动脉导管注射。在一些情况下，VEGF mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中的VEGF mRNA的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μgVEGF mRNA。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含约1ng至200μg VEGF mRNA。
使用细胞外囊泡的治疗
在一些方面，本文描述一种治疗对象的皮肤病况的方法，其包括向有需要的对象施用至少一个细胞外基质mRNA，从而治疗皮肤病况。在一些情况下，外源性细胞外基质mRNA编码胶原。在一些情况下，胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，胶原为I型胶原。在一些情况下，胶原为II型胶原。在一些情况下，胶原为I型胶原α1链(Col1A1)。在一些情况下，胶原为Col1A1，但不为I型胶原α2链(Col1A2)。在一些情况下，胶原为Col1A2。在一些情况下，细胞外基质mRNA为编码前α1(I)链的mRNA。
在一些情况下，皮肤病况为皮肤损伤。在一些情况下，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些情况下，皮肤病况为伤口。
在一些情况下，施用包括向对象施用至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用不大于500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg或500μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用1ng-20μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用1ng-10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用10ng-10μg、10ng-1μg、50ng-1μg、100ng-1μg或500ng-1μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象施用约50ng细胞外基质mRNA。
在一些情况下，细胞外基质mRNA被包封在至少一个细胞外囊泡(EV)中。在一些情况下，EV不包含以下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-5011-5p、hsa-miR-325或hsa-miR-199b-5p。
在一些情况下，至少一个EV为外泌体。在一些情况下，至少一个EV为凋亡小体或微囊泡。在一些情况下，至少一个EV包括以下中的至少两个的混合物：外泌体、微囊泡和/或凋亡小体。
在一些情况下，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少10％。在一些情况下，皱纹的出现减少至少10％发生在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的7-14天内。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在一些情况下，皱纹的出现减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％发生在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的7-14天内。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少至少70％、80％或90％。
在一些情况下，治疗皮肤病况包括治疗皮肤损伤，并且其中治疗皮肤损伤导致在治疗皮肤病况之后持续至少20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天的皮肤损伤减少。在一些情况下，皮肤损伤减少为以下中的一种或多种：总皱纹数减少、总皱纹面积减少、皱纹的出现减少或其任何组合。
在一些情况下，施用是经由皮下注射进行的。在一些情况下，皮下注射在皮肤损伤或伤口部位处或附近进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为至少14的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为34、33、32、31、30、29、28、27、26s、26、25s、25、24、23s、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为28的针进行。
在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用约1x107至1x1017、1x108至1x1016、1x109至1x1015个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用约1x1010至1x1014个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。
在一些情况下，细胞外囊泡以多剂量或呈单剂量施用。例如，可以多次向对象施用细胞外囊泡，直到皮肤病况得到治疗。在其他情况下，单剂量足以实现治疗效果，并且因此对象可以仅接受单剂量的细胞外囊泡。在一些情况下，在稍后的时间段重复单剂量，以维持对皮肤病况的治疗效果。在一些情况下，在稍后的时间段重复多剂量方案，以维持对皮肤病况的治疗效果。在一些情况下，治疗效果随时间推移而减弱。例如，治疗效果可能在至少30天、至少45天、至少60天、至少75天、至少90天等之后减弱。在此类情况下，可以再次向对象施用单剂量方案或多剂量方案以治疗皮肤病况。在一些情况下，单剂量在单个容器中施用，例如单个针或注射器。在一些情况下，单剂量使用微针装置施用，其中装置的多个微针递送单剂量。在一些情况下，微针装置的至少一个微针含有足以治疗皮肤病况的剂量的细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的间隔施用于对象。在一些情况下，细胞外囊泡以至多每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周施用于对象。在一些情况下，施用是单次进行的，并且向对象施用至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且向对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡以至少一个包含至少1,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，细胞外囊泡以至少一个包含至少5,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，细胞外囊泡以至多一个包含至少1,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，细胞外囊泡以至多一个包含至少5,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用至少一个细胞外基质mRNA。
在一些情况下，组织为皮下组织。在一些情况下，组织为真皮。在一些情况下，组织为表皮。在一些情况下，组织为牙龈。在一些情况下，组织为嘴唇。
在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少6000pg/ml。在一些情况下，在向对象的组织施用细胞外基质mRNA之后，对象的组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象的组织施用包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡之后，对象的组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的72小时内，组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750、1000、2000、3000、4000或5000pg/ml。在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的约4天内，组织具有峰值浓度的细胞外基质蛋白。
在一些情况下，至少每天、每3天、每5天、每7天、每10天、每20天、每30天、每40天或每50天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每10天、每20天、每30天、每40天或每50天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每30天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每60天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，约每90天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些情况下，方法还包括通过以下方式产生包含至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡：(a)经由转染，将对应于细胞外基质mRNA的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞在培养基中培养足够量的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)从培养基收集细胞外囊泡。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约8-24h。在一些情况下，细胞外囊泡以每个供体细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在。在一些情况下，供体细胞为人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
本文描述通过施用治疗有效量的包含本文所述的细胞外囊泡的组合物或药物组合物来治疗对象的疾病的方法。在一些情况下，细胞外囊泡包含至少一个本文所述的治疗剂。在一些情况下，治疗剂包含治疗性多核苷酸、治疗性多肽、治疗性化合物或其组合。在一些情况下，治疗性多核苷酸包含细胞外基质RNA(例如，胶原或弹性蛋白或胶原和弹性蛋白的混合物)或VEGF RNA(例如，VEGFA或VEGF的混合物)。
在一些情况下，细胞外囊泡包含本文所述的至少一个靶向多肽和至少一个治疗剂。在一些情况下，靶向多肽包含异源性靶向结构域，异源性靶向结构域包括肿瘤靶向结构域、组织靶向结构域、细胞穿透肽、病毒膜蛋白或其任何组合或片段。在一些情况下，靶向结构域分别结合与患病细胞缔合的细胞表面标志物，其中在与患病细胞结合之后，细胞外囊泡将至少一个治疗剂递送至患病细胞。
在一些情况下，与靶细胞对通过不具有靶向多肽的细胞外囊泡递送的治疗剂的靶向细胞摄取相比，靶细胞对通过包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡递送的治疗剂的摄取增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更高。在一些情况下，对通过包含至少一个靶向多肽的细胞外囊泡递送的治疗剂的摄取增加的靶细胞为作为组织的一部分的细胞(例如皮肤细胞，例如黑素细胞)。
在一些情况下，本文描述通过向患有血流病症的对象施用本公开中描述的包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡来治疗血流病症的方法。在一些情况下，本文描述用包含治疗性多核苷酸(例如，VEGF mRNA)的细胞外囊泡治疗对象的缺血的方法。在一些情况下，缺血选自：脑缺血、缺血性心脏病、心肌缺血、心脏缺血、严重肢体缺血、肾缺血、急性肠系膜缺血、肠缺血、发绀和坏疽。在一些情况下，递送至缺血组织的治疗性多核苷酸包含编码全长或截短蛋白质的mRNA。在一些情况下，递送至缺血组织的治疗性多核苷酸编码VEGF蛋白。在一些情况下，治疗性多核苷酸的递送刺激缺血组织的再血管化。
在一些情况下，该方法包括向对象施用单剂量的包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，单剂量为至少1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018个EV。在一些情况下，单剂量不大于1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023、1X1024、1X1025、1X1030、1X1040、1X1050或1X1060个EV。在一些情况下，单剂量为约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，单剂量为至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，单剂量不大于1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。在一些情况下，单剂量为约1ng至200μg VEGFmRNA。
在一些情况下，该方法包括向对象施用多剂量包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，多剂量以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的频率历经一段时间施用。在一些情况下，多剂量施用至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周。在一些情况下，多剂量中的至少一个为至少1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018个EV。在一些情况下，多剂量中的至少一个不大于1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023、1X1024、1X1025、1X1030、1X1040、1X1050或1X1060个EV。在一些情况下，多剂量中的至少一个为约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，多剂量中的至少一个为至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，多剂量中的至少一个不大于1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。在一些情况下，单剂量为约1ng至200μg VEGF mRNA。
在一些情况下，本文描述通过向对象施用本公开中描述的包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡来治疗皮肤损伤的方法。在一些情况下，本文描述用包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡治疗对象的阳光损伤或年龄相关的皮肤损伤的方法。在一些情况下，皮肤损伤包括长皱纹。在一些情况下，本文描述用通过本公开中描述的细胞外囊泡递送至皮肤的治疗性多核苷酸治疗皱纹的方法。在一些情况下，递送至皮肤的治疗性多核苷酸包含编码全长或截短蛋白质的mRNA。在一些情况下，递送至皮肤的治疗性多核苷酸编码ECM蛋白。在一些情况下，递送至皮肤的治疗性多核苷酸编码I型胶原。在一些情况下，递送治疗性多核苷酸减少受损皮肤中皱纹的出现。
在一些情况下，本文描述通过向有需要的对象施用包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡来治疗疾病或病况的方法。在一些情况下，包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡是全身施用的，例如经由静脉内注射。在一些情况下，包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡是局部施用的，例如经由肌内或皮下注射。
在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用皮下针进行。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至少32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或14的针进行。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至多14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的针进行。在一些情况下，注射经由冠状导管，例如冠状动脉导管或冠状静脉导管。在一些情况下，注射经由大血管导管。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为28的针进行。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为14或更高的针进行。在一些情况下，递送至心脏(例如递送至心脏以治疗心肌梗塞)是经由冠状导管(例如，冠状动脉导管或冠状静脉导管)来实现的。在一些情况下，用于治疗中风的递送(例如用于治疗缺血性中风的递送或用于治疗出血性中风的递送)是经由脑血管之一中的导管或经由直接向肌肉中的开心脏注射(open heartinjection)来实现的。在一些情况下，用于治疗外周动脉疾病的递送是经由导管进入血管或直接注射至肌肉中来实现的。在一些情况下，用于治疗皮肤疾病或病症的递送(例如针对皮肤溃疡的递送)是经由皮下注射来实现的。
在一些情况下，包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡被配制用于经由在包含注射缓冲液的溶液或悬浮液中的注射的施用。注射缓冲液可以包含盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和/或25mM海藻糖PBS。在一些情况下，剂量通过每剂量施用的细胞外囊泡的数量来测量。在一些情况下，剂量包含每剂量约100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000或1,000,000,000,000,000,000,000个包含治疗性多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，剂量包含每剂量约100至1,000,000,000,000,000,000,000个包含治疗性多肽的细胞外囊泡，或者每剂量约1,000至100,000,000,000,000,000,000个、约10,000至10,000,000,000,000,000,000个、约100,000至1,000,000,000,000,000,000个、约1,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约10,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约100,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约1,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约10,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约100,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约1,000,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000个、约10,000,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000个或约100,000,000,000,000至1,000,000,000,000,000,000的包含治疗性多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，剂量通过每剂量施用的治疗性多肽的量来测量。在一些情况下，剂量包含每剂量约1ng至500μg治疗性多肽。在一些情况下，剂量包含每剂量约10ng至100μg治疗性多肽。在一些情况下，剂量包含每剂量约100ng至100μg、约1μg至100μg、约10μg至100μg的治疗性多肽。
在一些情况下，本文描述通过向有需要的对象施用包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡来治疗疾病或病况的方法。在一些情况下，包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡每日施用、每天施用、每隔一天施用、每周施用五天、每周施用一次、每隔一周施用、每月施用两周、每月施用三周、每月施用一次、每月施用两次、每月施用三次或更长周期地施用。包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡可以施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。
在对象的状态改善的情况下，所施用的包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡的剂量可以暂时减少或暂时中止一定时间长度(“药物假期”)。在一些情况下，药物假期的长度在2天至1年之间变化，通过举例的方式，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。药物假期期间的剂量减少可以是10％-100％，通过举例的方式，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些情况下，有效量的包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)可以向有需要的对象每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每4周施用一次、每5周施用一次、每6周施用一次、每7周施用一次、每8周施用一次、每9周施用一次、每10周施用一次、每11周施用一次、每12周施用一次、每13周施用一次、每14周施用一次、每15周施用一次、每16周施用一次、每17周施用一次、每18周施用一次、每19周施用一次、每20周施用一次、每21周施用一次、每22周施用一次、每23周施用一次、每24周施用一次、每25周施用一次、每26周施用一次、每27周施用一次或每28周施用一次。
一旦对象的疾病或病况有所改善，便在必要时施用维持剂量的细胞外囊泡。随后，可以根据症状，将剂量或施用频率或两者降低至保持疾病、病症或病况有所改善的水平。
在一些情况下，对应于这种量的包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡的量根据例如疾病或病况的严重程度、需要治疗的对象或宿主的特性(例如，重量)的因素而变化，但仍然根据病例周围的具体情况(包括例如施用的具体细胞外囊泡、施用途径和正在接受治疗的对象或宿主)以本领域已知的方式常规地确定。在一些情况下，所需剂量方便地以单剂量提供，或呈同时(或在短时间段内)或以适当的间隔(例如，呈每天两次、三次、四次或跟多次亚剂量)施用的分次剂量提供。在一些情况下，所需剂量以单剂量施用。在一些情况下，相对高剂量的细胞外囊泡(例如，至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡)以单剂量施用。在一些情况下，相对高剂量的外泌体(例如，1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个外泌体)以单剂量施用。
在一些情况下，剂量可以至少部分地通过对象的3级或4级不良事件的发生或严重程度来确定。不良事件的非限制性示例包括：体温过低；休克；心动过缓；室性期前收缩；心肌缺血；晕厥；出血；房性心律失常；静脉炎；二度房室传导(AV)阻滞；心内膜炎；心包积液；外周坏疽；血栓形成；冠状动脉病症；口腔炎；恶心和呕吐；肝功能检查异常；胃肠道出血；吐血；血性腹泻；胃肠道病症；肠穿孔；胰腺炎；贫血；白细胞减少；白细胞增多；低钙血症；碱性磷酸酶增加；血尿素氮(BUN)增加；高尿酸血症；非蛋白氮(NPN)增加；呼吸性酸中毒；嗜睡；焦躁；神经病；偏执反应；抽搐；惊厥大发作；谵妄；哮喘；肺水肿；换气过度；缺氧；咯血；换气不足；气胸；瞳孔放大；瞳孔病症；肾功能异常；肾衰竭；急性肾小管坏死；十二指肠溃疡；肠坏死；心肌炎；室上性心动过速；继发于视神经炎的永久性或暂时性失明；短暂性脑缺血发作；脑膜炎；脑水肿；心包炎；变应性间质性肾炎；气管食管瘘；恶性高热；心脏骤停；心肌梗死；肺栓塞；中风；肝或肾衰竭；导致自杀的重度抑郁；肺水肿；呼吸骤停；呼吸衰竭；白细胞减少；血小板减少；丙氨酸氨基转移酶(ALT)增加；厌食；关节痛；背痛；寒战；腹泻；血脂紊乱；疲劳；发烧；流感样症状；低白蛋白血症；脂肪酶增加；注射部位反应；肌痛；恶心；盗汗；瘙痒；皮疹；红斑疹；斑丘疹；转氨酶升高；呕吐；和虚弱。
前述范围仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量的数量很大，并且与这些推荐值的相当大的偏离并不罕见。此类剂量根据多种变量而改变，不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、施用方式、个体对象的要求、正在治疗的疾病或病况的严重性以及从业者的判断。
在一些情况下，通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定此类治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性效果与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且其表示为LD50与ED50之间的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。在配制用于人的一系列剂量中使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化合物的剂量优选处于包括ED50且毒性最小的循环浓度的范围内。剂量根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。
在一些情况下，有效量的包含包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以至少一个剂量施用于对象。在一些情况下，包含包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以至少两个剂量施用于对象。在一些情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡包含至少100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000或1,000,000,000,000,000,000,000个包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡。
在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以每周至少3个剂量、每周至少4个剂量、每周至少5个剂量、每周至少6个剂量、每周至少7个剂量、每周至少8个剂量、每周至少9个剂量或每周至少10个剂量施用于本文所公开的对象。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以每周少于20个剂量、每周少于19个剂量、每周少于18个剂量、每周少于17个剂量、每周少于16个剂量、每周少于15个剂量、每周少于14个剂量、每周少于13个剂量、每周少于12个剂量、每周少于11个剂量或每周少于10个剂量施用于本文所公开的对象。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以每周1至10个剂量、每周2-9个剂量、每周3-8个剂量施用于本文所公开的对象。
在一些情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以一个剂量施用于对象，并且有效剂量为至少100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000或1,000,000,000,000,000,000,000个细胞外囊泡。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以单剂量施用于对象，并且有效量为至少0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1μg ECM mRNA。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以单剂量施用于对象，并且有效量为至多50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、1μg、900ng、800ng、700ng、600ng、500ng、400ng、300ng、200ng或100ngECM mRNA。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以单剂量施用于对象，并且有效量为0.1ng-50μg、0.1ng-30μg、1ng-20μg、1ng-10μg、1ng-1μg、1ng-500ng、1ng-100ng、10ng-10μg、10ng-1μg、10ng-500ng、10ng-100ng、50ng-10μg、50ng-1μg、50ng-500ng或50ng-100ng。
在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以多剂量施用于对象，并且在每个剂量中，有效量为至少100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000或1,000,000,000,000,000,000,000个细胞外囊泡。在其他情况下，有效量的包含有包含ECMmRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以多剂量施用于对象，并且在每个剂量中，有效量为至少0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1μg ECM mRNA。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷以多剂量施用于对象，并且在每个剂量中，有效量为至多50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、1μg、900ng、800ng、700ng、600ng、500ng、400ng、300ng、200ng或100ng ECM mRNA。在其他情况下，有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以多剂量施用于对象，并且在每个剂量中，有效量为0.1ng-50μg、0.1ng-30μg、1ng-20μg、1ng-10μg、1ng-1μg、1ng-500ng、1ng-100ng、10ng-10μg、10ng-1μg、10ng-500ng、10ng-100ng、50ng-10μg、50ng-1μg、50ng-500ng或50ng-100ng。在有效量的细胞外囊泡以多剂量施用的情况下，剂量之间的间隔为至少1天、5天、10天、15天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天或120天。
在一些情况下，向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些具体的情况下，组织为皮下组织。在一些具体的情况下，组织为真皮。
在一些情况下，向对象施用有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以治疗对象的皮肤损伤。在一些情况下，有效量足以使皱纹的出现减少至少50％。在一些情况下，有效量足以使皱纹的出现减少至少10％、20％、30％、40％或50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约1、2、3、4或5天内使皱纹的出现减少至少50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约6、7、8、9或10天内使皱纹的出现减少至少50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约14天内使皱纹的出现减少至少10％、20％、30％、40％或50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约5天内使皱纹的出现减少至少10％、20％、30％、40％或50％。
在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹数减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在一些情况下，治疗皮肤损伤导致总皱纹面积减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
在一些情况下，向对象施用有效量的包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以治疗对象的皮肤损伤。在一些情况下，有效量足以在施用的约72小时内生成至少6000pg/ml的组织浓度的细胞外基质蛋白(例如，胶原)。
在一些情况下，在向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的约4天内，组织具有峰值浓度的细胞外基质蛋白。
在一些情况下，约每天、每隔一天、每5天、每10天、每20天、每30天、每40天、每50天、每60天、每70天、每80天、每90天或每100天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在具体的情况下，约每30天重复向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些情况下，施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括经由皮下注射向对象施用至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。在一些具体的情况下，皮下注射在皮肤损伤部位处或附近进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为约32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或14的针进行。在一些情况下，皮下注射使用规格为至少20、19、18、17、16、15或14的针进行。
在一些情况下，皮肤损伤是由老化引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由阳光损伤引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由自身免疫疾病引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由烧伤引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由疤痕引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由皮肤病引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由皮肤脆裂症埃莱尔-当洛综合征(Ehlers-Danlos syndrome)引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由大疱性表皮松解症引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由假并指(pseudosyndactyly)引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由伤口愈合不良引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由手指/脚趾和肢体挛缩引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由角皮病(keratodermas)引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由全身性硬化症引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由硬皮病引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由特应性皮炎引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由牙周病引起的。
在一些情况下，治疗对象的皮肤损伤的方法还包括产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡，其中产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡包括：(a)经由转染，将编码细胞外基质蛋白的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)收集包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡。
在一些情况下，在步骤(a)中，转染使用细胞电穿孔进行，如图7A中所示。在一些具体的情况下，在步骤(a)中，转染包括将单层供体细胞接种至图7A中所示的硅芯片表面上，并且在一定脉冲和持续时间的情况下施加一定电压的电场，以用于将载体或质粒电穿孔至供体细胞中。在一些进一步的具体的情况下，接种需要过夜温育，如前所述。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为至少10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V或1000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为约10V、50V、100V、150V、200V、250V、300V、500V或1000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的电压为至多500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1500V、2000V、5000V或10,000V。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲为至少5、10、15、20、25、30、40、50或60。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲为约5、10、15、20、25、30、40、50或60。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲之间的间隔为至少0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s或1s。在一些进一步的具体的情况下，电场的脉冲之间的间隔为约0.1s、0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s或1s。
在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24h。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24h。
在一些情况下，将包含有包含ECM mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡施用于对象以经由皮下注射来治疗对象的皮肤损伤(例如，阳光损伤或年龄相关的损伤)。
在一些情况下，有效量的包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以至少一个剂量施用于对象。在一些情况下，包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以至少两个剂量施用于对象。在一些情况下，有效量的包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡包含至少100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000、10,000,000,000,000、100,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000、1,000,000,000,000,000,000、10,000,000,000,000,000,000、100,000,000,000,000,000,000或1,000,000,000,000,000,000,000个包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡。
在一些情况下，向对象施用有效量的包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以治疗对象的血流病症。在一些情况下，有效量足以使再血管化和/或新血管形成增加至少50％。在一些情况下，有效量足以使再血管化和/或新血管形成增加至少10％、20％、30％、40％或50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约1、2、3、4、5、6、7或8天内使再血管化和/或新血管形成增加至少50％。在一些情况下，有效量足以在施用的约8天内使再血管化和/或新血管形成增加至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。在一些情况下，有效量足以在施用的8天内使再血管化和/或新血管形成增加至少5％。在一些情况下，有效量足以在施用的8天内使再血管化和/或新血管形成增加约5％至10％。在一些情况下，有效量足以在施用的8天内使再血管化和/或新血管形成增加约5％至15％、约5％至20％、约5％至25％、约5％至30％、约5％至40％、约5％至50％、约5％至60％、约5％至70％或约5％至75％。在一些情况下，有效量足以在施用的14天内使再血管化和/或新血管形成增加至少5％。在一些情况下，有效量足以在施用的14天内使再血管化和/或新血管形成增加约5％至10％。在一些情况下，有效量足以在施用的14天内使再血管化和/或新血管形成增加约5％至15％、约5％至20％、约5％至25％、约5％至30％、约5％至40％、约5％至50％、约5％至60％、约5％至70％或约5％至75％。
在一些情况下，向对象施用有效量的包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡以治疗对象的血流病症。在一些情况下，有效量足以在施用的约72小时内生成至少6000pg/ml的组织浓度的VEGF蛋白(例如，VEGFA)。
在一些情况下，将包含有包含VEGF mRNA(和任选的靶向多肽)的治疗性多核苷酸的细胞外囊泡经由静脉内或肌内注射来施用于对象以治疗对象的血流病症(例如，缺血)。
本文还提供降低有需要的对象的假并指、伤口愈合不良或手指/脚趾和肢体挛缩的风险的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的负载COL7A1 mRNA的EV。在一些情况下，对象为患有营养不良性大疱性表皮松解症的患者。在一些情况下，患者为儿科患者。在一些情况下，施用向对象的手和/或脚进行。在一些情况下，有效量的Col7A1 mRNA为至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg Col7A1mRNA。在一些情况下，有效量的Col7A1 mRNA适应于至少一个细胞外囊泡中。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个Col7A1mRNA。在一些情况下，最后一个细胞外囊泡经由本文所述的针、水凝胶针、微针或微针装置注射。
本文还提供预防、减轻或治疗有需要的对象的脱发的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的Col17a1 mRNA。在一些情况下，施用向对象的受影响的头皮进行。在一些情况下，有效量的Col17a1mRNA为至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg Col17a1 mRNA。在一些情况下，有效量的Col17a1 mRNA为不大于1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg Col17a1 mRNA。在一些情况下，有效量的Col17a1 mRNA适应于至少一个细胞外囊泡中。在一些情况下，施用包括向有需要的对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且细胞外囊泡的至少一部分包含至少一个Col17a1 mRNA。在一些情况下，最后一个细胞外囊泡经由本文所述的针、水凝胶针、微针或微针装置注射。
本文还提供预防、减轻或治疗有需要的对象的掌跖角皮病的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的可行的角蛋白mRNA。在一些情况下，施用向对象的受影响的皮肤进行。
本文还提供预防、减轻或治疗有需要的对象的瘢痕疙瘩的瘢痕形成的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的减少TGF-β1、SMAD3和EPHB2的抑制剂。
本文还提供在对象的嘴唇中注射的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的包含至少一个胶原mRNA的EV。在一些情况下，至少一个胶原mRNA为I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，有效量的EV包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg胶原mRNA。在一些情况下，包含至少一个胶原mRNA的EV的有效量为至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，有效量的EV经由本文所述的针、水凝胶针、微针或微针装置注射。
本文还提供在对象的牙龈中注射的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的包含至少一个胶原mRNA的EV。在一些情况下，至少一个胶原mRNA为I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在一些情况下，有效量的EV包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg胶原mRNA。在一些情况下，包含至少一个胶原mRNA的EV的有效量为至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，有效量的EV经由本文所述的针、水凝胶针、微针或微针装置注射。
本文还提供向有需要的对象施用有效量的任何货物的EV的方法。在一些情况下，货物为微RNA(miRNA)。在一些情况下，货物为小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下，货物为肽。在一些情况下，货物为蛋白质。在一些情况下，货物为抑制性双链RNA(dsRNA)。在一些情况下，货物为小或短发夹RNA(shRNA)。在一些情况下，货物为反义寡核苷酸(ASO)。在一些情况下，货物为piwi相互作用RNA(piRNA)。在一些情况下，货物为不均一核RNA(hnRNA)。在一些情况下，货物为小核RNA(snRNA)。在一些情况下，货物为酶法制备的siRNA(esiRNA)。在一些情况下，货物为上述货物中任一种的前体。在一些情况下，货物为上述两种或更多种货物的任何组合。
本文还提供微针装置，微针装置包括基材和多个微针，其中多个微针从基材突出，并且其中多个微针中的至少一个微针包含至少一个细胞外囊泡(EV)。
在一些情况下，基材提供附接多个微针的表面。在一些情况下，本文所公开的微针装置除基材和多个微针之外还包括其他组分。在一些具体的情况下，添加其他组分以改善皮肤穿透和深度，以及药物递送和/或分布。
在一些情况下，多个微针包括一个微针。在其他情况下，多个微针包括至少1、至少2、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少10000或至少100000个微针。在一些情况下，基材的面积为至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200mm2。在一些情况下，基材的面积小于1000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200mm2。在一些具体的情况下，基材的面积为约169mm2。
在一些情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9或至少1个微针。在其他情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.5个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.51个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.52个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.53个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.54个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.55个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.56个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.57个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.58个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.59个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.6个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.61个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.62个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.63个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.64个微针。在具体的情况下，基材上多个微针的密度为每平方毫米基材约0.65个微针。
在一些情况下，多个微针被布置在基材上的单个区域中。在其他情况下，多个微针被布置在基材上的多个区域中。在一些情况下，多个微针被布置成线性行。在一些情况下，多个微针被布置成圆圈。在一些情况下，多个微针被布置成至少2行并且每行中至少2个微针。在一些情况下，多个微针被布置成至少5行并且每行中至少2个微针。在一些情况下，多个微针被布置成至少10行并且每行中至少2个微针。在一些情况下，多个微针被布置成至少2行并且每行中至少5个微针。在一些情况下，多个微针被布置成至少2行并且每行中至少10个微针。在一些具体的实施方案中，多个微针被布置成10行并且每行10个微针。
在一些情况下，基材由与多个微针相同的材料制成。在一些情况下，基材由透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合制成。在其他情况下，基材由与多个微针不同的材料制成。在一些情况下，基材由聚合物(例如，聚碳酸酯、聚丙烯或聚乙烯)、不锈钢、合金、钛或其任何组合制成。在一些情况下，基材为至少100、至少500、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500或至少5000厚。在一些情况下，基材为近圆形、近圆环扇形、近正方形、近矩形、近三角形、近五边形、近平行四边形、近梯形或近多边形。在一些情况下，基材的杨氏模量小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2、小于1、小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。
在一些情况下，多个微针中的每个微针都具有附接至基材的基部。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有能够刺穿靶标的尖端。在具体的情况下，尖端能够刺穿对象的角质层。在具体的情况下，尖端能够刺穿对象的表皮。在具体的情况下，尖端能够刺穿对象的真皮。
在一些情况下，多个微针是实心的。在一些情况下，多个微针是中空的。在一些情况下，多个中空微针中的至少一个微针的内径为至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.4、至少0.45、至少0.5、至少0.55、至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.9、至少1、至少1.5、至少2、至少2.5或至少3mm。在一些情况下，多个中空微针中的至多一个微针的内径为至多0.05、至多0.1、至多0.15、至多0.2、至多0.25、至多0.3、至多0.35、至多0.4、至多0.45、至多0.5、至多0.55、至多0.6、至多0.65、至多0.7、至多0.75、至多0.8、至多0.9、至多1、至多1.5、至多2、至多2.5、至多3mm、至多4mm、至多5mm、至多6mm、至多7mm、至多8mm、至多9mm或至多10mm。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含水凝胶。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有锥形的形状。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有漏斗的形状。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有棱锥的形状。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有逐渐变细的形状。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针具有如Makvandi等人Nano-Micro Letters volume 13,Article number:93(2021)中公开的形状。
本文所提供的多个微针通常具有至少一个具有一定长度的基部的微针。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径小于2000μm、小于1800μm、小于1500μm、小于1000μm、小于900μm、小于800μm小于700μm、小于600μm、小于500μm、小于400μm、小于300μm、小于200μm或小于100μm的基部。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径为至少2000μm、至少1800μm、至少1500μm、至少1000μm、至少900μm、至少800μm至少700μm、至少600μm、至少500μm、至少400μm、至少300μm、至少200μm、至少100μm、至少10μm或至少1μm的基部。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括直径为约100μm至约1000μm、约200μm至约900μm、约300μm至约800μm、约400μm至约700μm、约500μm至约600μm的基部。在具体的实施方案中，多个微针中的至少一个微针包括直径为约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μm的基部。在具体的实施方案中，多个微针中的至少一个微针包括直径为约400μm的基部。
微针装置的至少一个微针具有一定大小的尖端半径。在一些情况下，微针装置的至少一个微针的尖端半径不大于4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000μm。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针的长度不大于100、不大于200、不大于300、不大于400、不大于500、不大于600、不大于700、不大于800、不大于900、不大于1000、不大于1100、不大于1200、不大于1300、不大于1400、不大于1500、不大于1600、不大于1700、不大于1800、不大于1900或不大于2000μm。在其他情况下，多个微针中的至少一个微针的长度为100μm至3000μm、500μm至2500μm、1000μm至2500μm或1000μm至2000μm。在具体的实施方案中，多个微针中的至少一个微针的长度为约1000μm。在具体的实施方案中，多个微针中的至少一个微针的长度为约2000μm。
多个微针中的至少一个微针的长度需要基于待刺穿的靶组织的厚度进行调整。在一些情况下，如果前额为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25至0.5mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至0.75mm。在一些情况下，如果眉间为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25至0.5mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至0.75mm。在一些情况下，如果眼部区域为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25至0.5mm。在一些情况下，如果鼻子为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5mm。在一些情况下，如果颧骨为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至1.0mm。在一些情况下，如果嘴唇区域为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.25至0.75mm。在一些情况下，如果脸颊或颏为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至1.0mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少1.0至2.0mm。在一些情况下，如果颈部为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至1.0mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少1.0至2.0mm。在一些情况下，如果胸部为靶组织，则对于薄皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少0.5至1.0mm，并且对于厚皮肤，多个微针中的至少一个微针的长度为至少1.0至2.0mm。
在一些实施方案中，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为至少100、200、300、400、500、600、700μm。在其他实施方案中，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为约100至2000μm、100至1500μm、100至1000μm、300至2000μm、300至1500μm、300至1000μm、500至2000μm、500至1500μm、500至1000μm。在具体的情况下，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为约700μm。在其他具体的情况下，多个微针中的微针之间的中心至中心的距离为约1000μm。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包括低高宽比，从而导致内部支撑更强并且破损更少。在一些情况下，多个微针将内容物均匀地分布在靶组织中。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含至少3x102、至少3x103、至少3x104、至少3x105、至少3x106、至少3x107、至少3x108、至少3x109、3x1010、3x1011、3x1012、3x1015、3x1020或3x1030个EV。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x102至3x1012、约3x103至3x1012、约3x104至3x1012、约3x105至3x1012、约3x106至3x1012、约3x107至3x1012、约3x106至3x1012、约3x107至3x1012、约3x108至3x1012、约3x109至3x1012、约3x1010至3x1012或约3x1011至3x1012个EV。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x102至3x1011、约3x103至3x1011、约3x104至3x1011、约3x105至3x1011、约3x106至3x1011、约3x107至3x1011、约3x106至3x1011、约3x107至3x1011、约3x108至3x1011、约3x109至3x1011或约3x1010至3x1011个EV。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x102至3x1010、约3x103至3x1010、约3x104至3x1010、约3x105至3x1010、约3x106至3x1010、约3x107至3x1010、约3x106至3x1010、约3x107至3x1010、约3x108至3x1010或约3x109至3x1010个EV。在其他情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x102至3x109、约3x103至3x109、约3x104至3x109、约3x105至3x109、约3x106至3x109、约3x107至3x109、约3x106至3x109、约3x107至3x109或约3x108至3x109个EV。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含约3x102至3x108、约3x103至3x108、约3x104至3x108、约3x105至3x108、约3x106至3x108、约3x107至3x108、约3x106至3x108或约3x107至3x108个EV。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针中的EV悬浮在水凝胶中。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针在至多30、20、15、10或5分钟内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在约30、20、15、10或5分钟内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在至多60、50或40分钟内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针在约60、50或40分钟内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在至多1、3、5、10、15、20或24小时内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在约1、3、5、10、15、20或24小时内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在至多1、3、5、7、9、14、21或30天内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，多个微针中的至少一个微针在约1、3、5、7、9、14、21或30天内的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含一种类型的蛋白质。在一些情况下，可溶解的凝胶包含来自动物来源的化合物。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含合成化合物。在一些情况下，多个微针中的至少一个微针包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，当暴露于组织时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，当暴露于表皮时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，当暴露于真皮时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些具体的情况下，当暴露于皮下组织时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。
在一些情况下，当局部温度增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。在一些情况下，当局部温度增加至多15℃、14℃、13℃、12℃、11℃或10℃时，多个微针中的至少一个微针的断裂强度保留率为至多50％、40％、30％、20％或10％。
在一些情况下，多个微针中的至少一个微针中的EV包含细胞外基质mRNA。在具体的情况下，多个微针中的至少一个微针中的EV包含外源性细胞外基质mRNA。在一些情况下，细胞外基质mRNA或外源性细胞外基质mRNA包含：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在其他情况下，多个微针中的至少一个微针中的EV包含VEGF mRNA。在具体的情况下，多个微针中的至少一个微针中的EV包含外源性VEGF mRNA。在一些情况下，VEGF mRNA或外源性VEGF mRNA包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF或其任何组合。
在一些情况下，微针装置包含siRNA。在一些情况下，微针装置包含miRNA。在一些情况下，微针装置包含DNA、质粒或其他核酸。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的小分子药物。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的大分子。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的胰岛素。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的生长激素。在一些情况下，微针装置包含疫苗或其活性成分。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的受体激动剂。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的麻醉剂。在一些情况下，微针装置包含具有或不具有EV的蛋白质或肽。
在一些情况下，多个微针中的所有微针都包含本文所公开的EV。在其他情况下，多个微针的一部分包含本文所公开的EV，而多个微针的其他部分不具有EV。在具体的情况下，多个微针的一部分包含本文所公开的EV，而多个微针的另一部分包含不具有EV的不同物质。在一些情况下，不同物质为麻醉剂、愈合剂、用于改善皮肤病况的成分、芦荟或其任何组合。在具体的情况下，麻醉剂为利多卡因(lidocaine)、普莫卡因(pramoxine)、苯酚、丙胺卡因(prilocaine)、苯佐卡因(benzocaine)、狄布卡因(dibucaine)、水杨酸甲酯、辣椒素(capsaicin)、乙酸锌、丁卡因(tetracaine)、氢化可的松(hydrocortisone)、薄荷醇(menthol)或丙胺卡因。在具体的情况下，愈合剂为维生素C、芦荟提取物、沙棘(Hippophaerhamnoides，sea buckthorn)提取物、当归(Angelica sinensis)提取物、长春花(Catharanthus roseus，Vinca rosea)提取物或绿茶提取物。在具体的情况下，用于改善皮肤病况的成分为甘油、辅酶Q10(CoQ10)、神经酰胺、鲸蜡醇和硬脂醇、凡士林、角鲨烯或乳酸。
本文还提供制造微针装置的方法，其中该方法包括：(a)将细胞外囊泡(EV)与第一批可聚合的溶液混合；以及(b)将来自步骤(a)的混合物浇注至具有至少一个针样形状的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中。在一些情况下，该方法还包括在步骤(b)之后的步骤(c)，其中步骤(c)包括将EV浓缩在PDMS模具的至少一个针样形状的尖端中。在一些具体的情况下，浓缩通过将PDMS模具维持在至多15℃、至多14℃、至多13℃、至多12℃、至多11℃、至多10℃、至多9℃、至多8℃、至多7℃、至多6℃、至多5℃、至多4℃、至多3℃、至多2℃、至多1℃或至多0℃的温度下来进行。在一些具体的情况下，浓缩通过将PDMS模具维持在至少6℃、至少5℃、至少4℃、至少3℃、至少2℃、至少1℃、至少0℃、至少-1℃、至少-2℃、至少-3℃、至少-4℃、至少-5℃、至少-6℃、至少-7℃、至少-8℃或至少-10℃的温度下来进行。在具体的情况下，浓缩通过将PDMS模具维持在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃来进行。在一个具体的情况下，浓缩通过将PDMS模具维持在约4℃来进行。在一些情况下，浓缩持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时。在一些情况下，浓度持续不长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60小时。在一些情况下，浓缩持续约1至约10、约2至约8、约2至约6、约2至约4、约3至约8或约3至约6小时。在一些情况下，浓缩持续约1小时。在一些情况下，浓缩持续约2小时。在一些情况下，浓缩持续约3小时。在一些情况下，浓缩持续约4小时。在一些情况下，浓缩持续约5小时。在一些情况下，浓缩持续约6小时。
在一些情况下，该方法还包括在步骤(c)之后的步骤(d)，其中步骤(d)包括将第二批可聚合的溶液添加至PDMS模具的顶部。
在一些情况下，可聚合的溶液包含水凝胶。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、和聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在具体的情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，第二批可聚合的溶液具有与第一批可聚合的溶液相同的组成。在一些情况下，第二批可聚合的溶液具有与第一批可聚合的溶液不同的组成。
本文所公开的水凝胶包含一定百分比的透明质酸，其由通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的重复二糖单元组成。在一些情况下，水凝胶包含至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％的透明质酸。在一些情况下，第二批可聚合的溶液具有与第一批可聚合的溶液相同百分比的透明质酸。在一些情况下，第二批可聚合的溶液具有与第一批可聚合的溶液不同百分比的透明质酸。在一些具体的情况下，第二批可聚合的溶液具有比第一批可聚合的溶液更高百分比的透明质酸。在其他具体的情况下，第二批可聚合的溶液具有比第一批可聚合的溶液更低百分比的透明质酸。
在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为至少1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90或1:100。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率不大于1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。在一些情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为约1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。在具体的情况下，EV与可聚合的溶液之间的最终比率为约1:21、1:22、1:23、1:24或1:25。
在一些情况下，制造微针装置的方法中使用的EV包含细胞外基质mRNA。在具体的情况下，制造微针装置的方法中使用的EV包含外源性细胞外基质mRNA。在一些情况下，细胞外基质mRNA或外源性细胞外基质mRNA包含：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。在其他情况下，制造微针装置的方法中使用的EV包含VEGFmRNA。在具体的情况下，制造微针装置的方法中使用的EV包含外源性VEGF mRNA。在一些情况下，VEGF mRNA或外源性VEGF mRNA包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF或其任何组合。
本文还提供向有需要的对象的组织施用细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括应用本文所公开的微针装置。
在一些实施方案中，应用不需要外部泵。在其他实施方案中，应用是借助于具有预设压力的机器进行的。在一些实施方案中，应用是手动进行的。在一些实施方案中，应用在组织的某一部分中是手动进行的并且在组织的另一部分中是借助于具有预设压力的机器进行的。
由于本文所公开的微针装置中的微针自身溶解并向组织释放EV，所以在施用结束时，去除微针装置。在一些情况下，在约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之后去除微针装置。为了保持手术无菌，在一些情况下，在应用本文所公开的微针装置之前对组织进行消毒。在其他情况下，在应用本文所公开的微针装置之后对组织进行消毒。
在一些情况下，组织为表皮。在一些情况下，组织为真皮。在一些情况下，组织为皮下组织。在一些情况下，对象为啮齿动物。在其他情况下，对象为哺乳动物。在一些具体的情况下，对象为豚鼠。在一些具体的情况下，对象为猴子。在一些具体的情况下，对象为豚鼠。在一些具体的情况下，对象为兔子。在一些具体的情况下，对象为人。
在一些情况下，施用以高剂量的EV进行一次。在一些具体的情况下，高剂量的EV为至少1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020、1025、1030或1035个EV。在一些情况下，高剂量的EV为约1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020、1025、1030或1035个EV。在其他情况下，施用以低剂量的EV历经一段时间进行多次。在一些具体的情况下，低剂量的EV为至多10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个EV。在一些具体的情况下，施用历经至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天进行多次。在一些具体的情况下，施用历经约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1.5个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月进行多次。在一些情况下，当施用历经一段时间进行多次时，剂量之间的间隔为至少1天、5天、10天、15天、20天、30天、40天、50天、60天、70天或80天。
在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，用本文所公开的微针装置施用EV的方法导致EV的破损较少。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，用本文所公开的微针装置施用EV的方法导致EV在组织中的分布更均匀。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，用本文所公开的微针装置施用EV的方法导致在施用部位处的刺激较小。在上述情况下，常规的微针为实心或中空微针。
本文还提供治疗有需要的对象的皮肤损伤的方法，该方法包括应用本文所公开的含有细胞外基质mRNA的微针装置。在一些情况下，皮肤损伤是由老化引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由阳光损伤引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由自身免疫疾病引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由烧伤引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由疤痕引起的。在其他情况下，皮肤损伤是由皮肤病引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由皮肤脆裂症埃莱尔-当洛综合征引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由大疱性表皮松解症引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由假并指引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由伤口愈合不良引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由手指/脚趾和肢体挛缩引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由角皮病引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由全身性硬化症引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由硬皮病引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由特应性皮炎引起的。在一些具体的情况下，皮肤损伤是由牙周病引起的。
在一些情况下，治疗皮肤损伤的方法导致皱纹的出现减少至少10％。在其他情况下，治疗皮肤损伤的方法导致胶原纤维较多。在其他情况下，治疗皮肤损伤的方法导致真皮厚度较高。
在一些情况下，用本文所公开的微针装置治疗皮肤损伤的方法导致持续至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天或至少90天的延长的效果。在一些情况下，用本文所公开的微针装置治疗皮肤损伤的方法导致持续约30天、约40天、约50天、约60天、约70天、约80天后约90天的延长的效果。
在一些情况下，治疗本文所述的皮肤损伤的方法包括向本文所公开的对象施用每12个月至少1个剂量、每11个月至少1个剂量、每10个月至少1个剂量、每9个月至少1个剂量、每8个月至少1个剂量、每7个月至少1个剂量、每6个月至少1个剂量、每5个月至少1个剂量、每4个月至少1个剂量、每3个月至少1个剂量或每2个月至少1个剂量。在其他情况下，治疗本文所述的皮肤损伤的方法包括向本文所公开的对象施用每周至多1个剂量、每2周至多1个剂量、每3周至多1个剂量、每4周至多1个剂量、每个月至多1个剂量。在其他情况下，治疗本文所述的皮肤损伤的方法包括向本文所公开的对象施用每个月约1个剂量、每2个月约1个剂量或每3个月约1个剂量。
本文还提供降低有需要的对象的假并指、伤口愈合不良或手指/脚趾和肢体挛缩的风险的方法，并且该方法包括向对象施用含有有效量的负载COL7A1 mRNA的EV的本文所述的微针装置。在一些情况下，对象为患有营养不良性大疱性表皮松解症的患者。在一些情况下，施用向对象的手和/或脚进行。
本文还提供预防、减轻或治疗有需要的对象的掌跖角皮病的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的可行的角蛋白mRNA。在一些情况下，施用包括使用本文所述的微针装置。在一些情况下，施用向对象的受影响的皮肤进行。
本文还提供预防、减轻或治疗有需要的对象的瘢痕疙瘩的瘢痕形成的方法，并且该方法包括向对象施用有效量的减少TGF-β1、SMAD3和EPHB2的抑制剂。在一些情况下，施用包括使用本文所述的微针装置。
本文还提供向有需要的对象施用含有任何货物的EV的本文所述的微针装置的方法。在一些情况下，货物为微RNA(miRNA)。在一些情况下，货物为小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下，货物为肽。在一些情况下，货物为蛋白质。在一些情况下，货物为抑制性双链RNA(dsRNA)。在一些情况下，货物为小或短发夹RNA(shRNA)。在一些情况下，货物为反义寡核苷酸(ASO)。在一些情况下，货物为piwi相互作用RNA(piRNA)。在一些情况下，货物为不均一核RNA(hnRNA)。在一些情况下，货物为小核RNA(snRNA)。在一些情况下，货物为酶法制备的siRNA(esiRNA)。在一些情况下，货物为上述货物中任一种的前体。在一些情况下，货物为上述两种或更多种货物的任何组合。
本文还提供治疗有需要的对象的血流病症的方法，该方法包括应用本文所公开的含有VEGF mRNA的微针装置。在一些具体的情况下，血流病症为缺血。
在一些方面，本文描述一种向对象的组织施用细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括向对象的组织施用本文所公开的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。在一些情况下，该方法包括向对象的组织施用本文所公开的微针装置。在一些情况下，在至少5、10、15、20、25或30分钟之后去除微针装置。在一些情况下，在约10、15、20或30分钟之后去除微针装置。
在一些情况下，EV包含至少一个mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用至少1ng、10ng、50ng、100ng、1μg、10μg或20μg至少一个mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用1ng-10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括向对象的组织施用1ng-20μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，组织为皮下组织。在一些情况下，组织为真皮。在一些情况下，组织为表皮。在一些情况下，组织为牙龈。在一些情况下，组织为嘴唇。在一些情况下，对象为哺乳动物。在一些情况下，对象为人。在一些情况下，对象为啮齿动物。在一些情况下，对象为猴子。在一些情况下，对象为兔子。
在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且在6-8周内施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是历经一段时间多次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020、1x1030个细胞外囊泡。
在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致EV的破损较少。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致在施用部位处的刺激较小。在一些情况下，与施用在常规的微针或注射器中的EV相比，该方法导致EV在组织中的分布更均匀。在一些情况下，常规的微针为实心微针或中空微针。
在一些方面，本文描述一种治疗有需要的对象的皮肤病况的方法，该方法包括向对象应用本文所公开的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。在一些情况下，该方法包括向对象施用本文所公开的微针。
在一些情况下，皮肤病况为皮肤损伤。在一些情况下，皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。在一些情况下，皮肤病况为伤口。
在一些情况下，施用包括施用至少0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg或10μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用不大于0.1ng、1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg或900μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用约0.1ng-50μg、1ng-50μg、1ng-30μg、1ng-25μg细胞外基质mRNA。在一些情况下，施用包括施用约1ng-20μg细胞外基质mRNA。
在一些情况下，该方法导致皱纹的出现减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，该方法产生多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的胶原纤维。在一些情况下，该方法导致真皮厚度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，该方法导致持续至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天或至少90天的延长的效果。
在一些情况下，针、微针或微针装置的微针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含约15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含至少5％透明质酸并且至多30％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多20％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多15％透明质酸。在一些情况下，水凝胶包含大于10％透明质酸并且至多18％透明质酸。
在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是单次进行的，并且施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019、1x1020或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且每次施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是多次进行的，并且在6-8周内施用至多1x1013-14个细胞外囊泡。在一些情况下，施用是历经一段时间多次进行的，并且施用至多1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020、1x1030个细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种治疗对象的血流病症的方法，其包括向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡，从而治疗血流病症。在一些情况下，治疗血流病症导致再血管化增加至少5％。在一些情况下，再血管化增加至少5％发生在施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的14天内。
在一些情况下，施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括经由静脉内、肌内或皮下注射或经由冠状动脉导管向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，静脉内、肌内或皮下注射使用规格为至少14号的针进行。
在一些情况下，血流病症为缺血。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括至少1,000个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少两个剂量施用。
在一些情况下，施用包括单次施用至少1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015或1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用不大于1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023或1X1024个EV。在一些情况下，施用包括单次施用约1X105至1X1020、1X106至1X1019、1X107至1X1018、1X108至1X1017或1X109至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括单次施用至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，施用包括单次施用不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。
在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用至少1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015或1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用不大于1X105、1X106、1X107、1X108、1X109、1X1010、1X1011、1X1012、1X1013、1X1014、1X1015、1X1016、1X1017、1X1018、1X1019、1X1020、1X1021、1X1022、1X1023或1X1024个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用约1X105至1X1020、1X106至1X1019、1X107至1X1018、1X108至1X1017或1X109至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用约1X1010至1X1016个EV。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。在一些情况下，施用包括多次施用，并且每次施用不大于10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1000μg VEGF mRNA。
在一些情况下，其中向对象施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括向对象的组织施用至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。在一些情况下，施用是使用负载包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的微针进行的。
在一些情况下，微针包含水凝胶。在一些情况下，水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
在一些情况下，细胞外囊泡以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的间隔施用于对象。在一些情况下，细胞外囊泡以至多每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周施用于对象。
在一些方面，本文描述一种产生包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：(a)经由转染，将编码VEGF的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞温育足够的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡；以及(c)收集包封从载体或质粒转录的VEGF mRNA的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述一种治疗有需要的对象的血流病症的方法，该方法包括施用本文所公开的细胞外囊泡。在一些情况下，血流病症为缺血。
细胞外囊泡的产生
在一些方面，本文描述一种产生包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，其包括：(a)经由转染，将对应于细胞外基质mRNA的载体或质粒引入至供体细胞中；(b)将供体细胞在培养基中培养足够量的时间，以便产生包封从载体或质粒转录的至少一个细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及(c)从培养基收集细胞外囊泡。在一些情况下，在步骤(c)中，收集细胞外囊泡发生在转染之后约8-24h。在一些情况下，包封从载体或质粒转录的细胞外基质mRNA的细胞外囊泡以每个供体细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的水平存在。在一些情况下，供体细胞为人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
在一些情况下，本文描述产生包含治疗性多肽、治疗性化合物、癌症药物、靶向多肽或其组合的细胞外囊泡的方法和系统。
在一些情况下，该方法包括将至少一个异源性多核苷酸引入至细胞外囊泡供体细胞中。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸为载体。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸至少包含本文所述的治疗性多核苷酸。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸编码至少一个本文所述的治疗性多核苷酸。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸编码至少一个本文所述的治疗性多肽。在一些情况下，引入至细胞外囊泡供体细胞中的至少一个异源性多核苷酸编码至少一个本文所述的靶向多肽。在一些情况下，至少一个异源性多核苷酸编码至少一个异源性靶向结构域。
在一些情况下，将至少两个异源性多核苷酸引入至细胞外供体细胞中，其中引入至细胞外囊泡供体细胞中的第一异源性多核苷酸包含编码至少一个治疗性多核苷酸或至少一个治疗性多肽的第一载体。在一些情况下，第二异源性多核苷酸包含编码至少一个靶向多肽或肿瘤靶向多肽的第二载体。
在一些情况下，异源性多核苷酸可以经由使用表达载体来引入至细胞中。在表达载体的情况下，载体可以通过本领域中的任何方法容易地引入至本文所述的细胞中。例如，表达载体可以通过生物、化学或物理方法转移至细胞中。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以为本文描述的任何类型的细胞。在一些情况下，细胞外供体细胞可以是有核细胞。
用于将感兴趣的异源性多核苷酸引入至细胞中的生物学方法可以包括使用DNA或RNA载体。病毒载体，并且尤其逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入至非人哺乳动物细胞中的最广泛使用的方法。在一些情况下，其他病毒载体来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。示例性病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、痘病毒载体、细小病毒载体、杆状病毒载体、麻疹病毒载体或单纯疱疹病毒载体(HSV)。在一些情况下，逆转录病毒载体包括γ-逆转录病毒载体，例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV、MMLV、MuLV或MLV)或鼠干细胞病毒(MSCV)基因组的载体。在一些情况下，逆转录病毒载体还包括慢病毒载体，例如来源于人免疫缺陷病毒(HIV)基因组的那些。在一些情况下，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些情况下，病毒载体为嵌合病毒载体，其包含来自两种或更多种病毒的病毒部分。在另外的情况下，病毒载体为重组病毒载体。
用于将异源性多核苷酸引入至细胞中的化学方法可以包括胶体分散系统(例如，大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒)和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统为脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物为脂质体。为了将核酸引入至宿主细胞中(体外、离体或体内)，考虑使用脂质制剂。在另一方面，核酸与脂质缔合。在一些情况下，与脂质缔合的核酸被包封在脂质体的含水内部中，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，呈悬浮液含于脂质中，含于胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任何具体结构。例如，在一些情况下，它们存在于双层结构中，呈胶束存在或在具有“塌陷”结构的情况下存在。替代地，它们只是散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，在一些情况下，它们为天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适于使用的脂质从商业来源获得。例如，在一些情况下，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)从Sigma,St.Louis,Mo.获得；在一些情况下，磷酸双十六烷基酯(“DCP”)从K&KLaboratories(Plainview,N.Y.)获得；在一些情况下，胆固醇(“Choi”)从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液常常储存在约-20℃下。因为氯仿比甲醇更易于蒸发，所以将氯仿用作溶剂。“脂质体”为通用术语，其涵盖多种单一和多层的脂质媒介物，该脂质媒介物通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成。脂质体常常被表征为具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部含水介质。多层脂质体具有通过含水介质分开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前进行自我重排，并且将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间。然而，与正常囊泡结构相比在溶液中具有不同结构的组合物也涵盖在内。例如，在一些情况下，脂质呈现胶束结构或仅仅呈非均一的脂质分子聚集体而存在。lipofectamine-核酸复合物也考虑在内。
用于将异源性多核苷酸引入至细胞中的物理方法可以包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔、微针阵列、纳米针阵列、超声处理或化学渗透。电穿孔包括微流体电穿孔、微通道电穿孔或纳米通道电穿孔。在某些情况下，通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔，用至少一个异源性多核苷酸转染细胞外囊泡供体细胞。在一些情况下，微通道电穿孔或纳米通道电穿孔包括使用微孔图案化的硅圆片、纳米孔图案化的硅圆片、径迹蚀刻膜、陶瓷微孔膜、陶瓷纳米孔膜、其他多孔材料或其组合。在一些情况下，将至少一个异源性多核苷酸或至少一个载体经由位于生物芯片上的纳米通道纳米电穿孔至细胞外囊泡供体细胞中。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以生长并且附接在基材的表面上。在一些情况下，基材包括生物芯片。在一些情况下，基材的表面包含金属材料。在一些情况下，基材包含金属材料。金属材料的非限制性示例包括铝(Al)、氧化铟锡(ITO，In2O3:SnO2)、铬(Cr)、砷化镓(GaAs)、金(Au)、钼(Mo)、有机残余物和光致抗蚀剂、铂(Pt)、硅(Si)、二氧化硅(SiO2)、绝缘体上的硅(SOI)、氮化硅(Si3N4)、钽(Ta)、钛(Ti)、氮化钛(TiN)、钨(W)。在一些情况下，可以对金属材料进行处理或蚀刻以产生阵列或通道。在一些情况下，金属表面可以用磷酸(H3PO4)、乙酸、硝酸(HNO3)、水(H2O)、盐酸(HCl)、(HNO3)、硝酸铈铵((NH4)2Ce(NO3)6)、柠檬酸(C6H8O7)、过氧化氢(H2O2)、王水、碘溶液、硫酸(H2SO4)、氢氟酸(HF)、氢氧化钾(KOH)、乙二胺焦儿茶酚(EDP)、四甲基氢氧化铵(TMAH)、缓冲氧化物、氟化铵(NH4F)、SC1、Cl2、CCl4、SiCl4、BCl3、SiCl4、BCl3、CCl2F2、CF4、O2、CF4、SF6、NF3、CHF3或其组合。
在一些情况下，可以用气体或等离子体处理金属表面以增加亲水性。在一些情况下，可以用气体或等离子体处理金属表面以增加疏水性。用于增加金属表面的亲水性或疏水性的示例性气体或等离子体包括氧、氮、氨、氩、氯、氟、溴、碘、砹、氢或其组合。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以生长并且附接至由聚合物制成的基材的表面，该聚合物例如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、ABS、聚酰胺、聚乙烯共聚物、环氧树脂、聚酯、聚氯乙烯、酚醛树脂、聚四氟乙烯、聚乙烯共聚物、氟化乙烯丙烯、聚乙二烯、聚硅氧烷、天然橡胶、乳胶、聚氨酯、丁苯橡胶、氟碳共聚物弹性体、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚芳酰胺、聚芳醚酮、聚缩醛、聚苯醚、PBT、聚砜、聚醚砜、聚芳基砜、聚苯硫醚、聚四氟乙烯、氧化铍等。在一些情况下，由聚合物制成的表面可以是半渗透的。在一些实施方案中，半渗透聚合物表面的孔径可以为约0.01μm至约10μm。在一些实施方案中，半渗透聚合物表面的孔径可以为约0.01μm至约0.03μm、约0.01μm至约0.05μm、约0.01μm至约0.1μm、约0.01μm至约0.2μm、约0.01μm至约0.3μm、约0.01μm至约0.4μm、约0.01μm至约0.5μm、约0.01μm至约1μm、约0.01μm至约3μm、约0.01μm至约5μm、约0.01μm至约10μm、约0.03μm至约0.05μm、约0.03μm至约0.1μm、约0.03μm至约0.2μm、约0.03μm至约0.3μm、约0.03μm至约0.4μm、约0.03μm至约0.5μm、约0.03μm至约1μm、约0.03μm至约3μm、约0.03μm至约5μm、约0.03μm至约10μm、约0.05μm至约0.1μm、约0.05μm至约0.2μm、约0.05μm至约0.3μm、约0.05μm至约0.4μm、约0.05μm至约0.5μm、约0.05μm至约1μm、约0.05μm至约3μm、约0.05μm至约5μm、约0.05μm至约10μm、约0.1μm至约0.2μm、约0.1μm至约0.3μm、约0.1μm至约0.4μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约1μm、约0.1μm至约3μm、约0.1μm至约5μm、约0.1μm至约10μm、约0.2μm至约0.3μm、约0.2μm至约0.4μm、约0.2μm至约0.5μm、约0.2μm至约1μm、约0.2μm至约3μm、约0.2μm至约5μm、约0.2μm至约10μm、约0.3μm至约0.4μm、约0.3μm至约0.5μm、约0.3μm至约1μm、约0.3μm至约3μm、约0.3μm至约5μm、约0.3μm至约10μm、约0.4μm至约0.5μm、约0.4μm至约1μm、约0.4μm至约3μm、约0.4μm至约5μm、约0.4μm至约10μm、约0.5μm至约1μm、约0.5μm至约3μm、约0.5μm至约5μm、约0.5μm至约10μm、约1μm至约3μm、约1μm至约5μm、约1μm至约10μm、约3μm至约5μm、约3μm至约10μm或约5μm至约10μm。在一些实施方案中，半渗透聚合物表面的孔径可以为约0.01μm、约0.03μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约1μm、约3μm、约5μm或约10μm。在一些实施方案中，半渗透聚合物表面的孔径可以为至少约0.01μm、约0.03μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约1μm、约3μm或约5μm。在一些实施方案中，半渗透聚合物表面的孔径可以为至多约0.03μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约1μm、约3μm、约5μm或约10μm。
在一些情况下，可以用气体或等离子体处理聚合物的表面以增加亲水性。在一些情况下，可以用气体或等离子体处理聚合物的表面以增加疏水性。用于增加金属表面的亲水性或疏水性的示例性气体或等离子体包括氧、氮、氨、氩、氯、氟、溴、碘、砹、氢或其组合。
纳米电穿孔
在一些情况下，生长或附接至金属或聚合物表面的细胞外囊泡供体细胞可以通过如本文所述的纳米电穿孔系统进行纳米电穿孔。在一些情况下，通过本文所述的纳米电穿孔系统进行纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞可以生长或附接至金属或聚合物表面，例如本文所述的生物芯片。在一些情况下，通过本文所述的纳米电穿孔系统进行纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞可以呈单层生长或附接至金属或聚合物表面，例如本文所述的生物芯片。在一些情况下，系统包括具有上部边界和下部边界的流体室。将具有细胞外囊泡供体细胞的基材放置在流体室中形成上部室和下部室。在一些情况下，该系统还包括至少一个纳米通道。在一些情况下，纳米通道可以嵌入在基材内。
在一些情况下，生长或附接至金属或聚合物表面并用本文所述的异源性多核苷酸纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞可以导致细胞外囊泡(例如外泌体)的高通量产生。在一些情况下，外泌体的此类高通量产生可以涉及使用多个(例如，大于1个、大于2个、大于3个、大于5个、大于10个或额外数量)生物芯片(例如，CNP生物芯片)。在一些情况下，CNP生物芯片的宽度为至少1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、100cm或更大。在一些情况下，CNP生物芯片的长度为至少1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、100cm或更大。在一些情况下，生物芯片的尺寸为1cm x 1cm。在一些情况下，生物芯片的示例性尺寸可以为1cm x 2cm、1cm x 3cm、1cm x 5cm、1cm x 10cm、2cm x 1cm、2cm x 2cm、2cm x 3cm、2cm x 5cm、2cm x 10cm、3cm x 1cm、3cm x 2cm、3cm x 3cm、3cm x 5cm、3cm x10cm、5cm x 1cm、5cm x 2cm、5cm x 3cm、5cm x 5cm、5cm x 10cm、10cm x 1cm、10cm x2cm、10cm x 3cm、10cm x 5cm或10cm x 10cm。
在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞的纳米电穿孔可以包括循环，循环包括纳米通道电穿孔(CNP)，之后收集通过非电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生和分泌的细胞外囊泡，持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、1周或更长时间，以便收集细胞外囊泡。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌细胞外囊泡，持续1个循环、2个循环、3个循环、4个循环、5个循环、6个循环、7个循环、8个循环、9个循环、10个循环或更多个循环的CNP。
在一些情况下，分泌的细胞外囊泡具有生物相容性，经测量直径为40～150nm，并且可能内在地表达跨膜蛋白和膜锚定蛋白。这些蛋白质的存在可能延长血液循环，可能促进组织定向递送，并且可能促进细胞摄取包封的外泌体内容物。在一些情况下，本文所提供的方法可以涉及使用纳米电穿孔而不形成显著的聚集体。在一些情况下，引入至细胞外囊泡供体细胞中的异源性多核苷酸或载体不编码掺入细胞外囊泡中并且结合靶mRNA的肽序列。
在一些情况下，纳米通道包括半渗透聚合物基材的孔。在一些实施方案中，纳米通道的高度为约0.01μm至约500μm。在一些实施方案中，纳米通道的高度为约0.01μm至约0.05μm、约0.01μm至约0.1μm、约0.01μm至约0.5μm、约0.01μm至约1μm、约0.01μm至约2μm、约0.01μm至约5μm、约0.01μm至约10μm、约0.01μm至约20μm、约0.01μm至约50μm、约0.01μm至约100μm、约0.01μm至约500μm、约0.05μm至约0.1μm、约0.05μm至约0.5μm、约0.05μm至约1μm、约0.05μm至约2μm、约0.05μm至约5μm、约0.05μm至约10μm、约0.05μm至约20μm、约0.05μm至约50μm、约0.05μm至约100μm、约0.05μm至约500μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约1μm、约0.1μm至约2μm、约0.1μm至约5μm、约0.1μm至约10μm、约0.1μm至约20μm、约0.1μm至约50μm、约0.1μm至约100μm、约0.1μm至约500μm、约0.5μm至约1μm、约0.5μm至约2μm、约0.5μm至约5μm、约0.5μm至约10μm、约0.5μm至约20μm、约0.5μm至约50μm、约0.5μm至约100μm、约0.5μm至约500μm、约1μm至约2μm、约1μm至约5μm、约1μm至约10μm、约1μm至约20μm、约1μm至约50μm、约1μm至约100μm、约1μm至约500μm、约2μm至约5μm、约2μm至约10μm、约2μm至约20μm、约2μm至约50μm、约2μm至约100μm、约2μm至约500μm、约5μm至约10μm、约5μm至约20μm、约5μm至约50μm、约5μm至约100μm、约5μm至约500μm、约10μm至约20μm、约10μm至约50μm、约10μm至约100μm、约10μm至约500μm、约20μm至约50μm、约20μm至约100μm、约20μm至约500μm、约50μm至约100μm、约50μm至约500μm或约100μm至约500μm。在一些实施方案中，纳米通道的高度为约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约2μm、约5μm、约10μm、约20μm、约50μm、约100μm或约500μm。在一些实施方案中，纳米通道的高度为至少约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约2μm、约5μm、约10μm、约20μm、约50μm或约100μm。在一些实施方案中，纳米通道的高度为至多约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约2μm、约5μm、约10μm、约20μm、约50μm、约100μm或约500μm。在一些情况下，纳米通道的高度可以是相同的。在一些情况下，纳米通道的高度可以是不同的。在一些情况下，纳米通道的高度应该足够大以加速在高电场区域(例如，纳米通道内部)中被纳米电穿孔的分子，但也应该足够小足以使被纳米电穿孔的大分子在短暂的电脉冲中钻过去。
在一些实施方案中，纳米通道的直径为约0.01nm至约10,000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为约0.01nm至约0.1nm、约0.01nm至约0.5nm、约0.01nm至约1nm、约0.01nm至约5nm、约0.01nm至约10nm、约0.01nm至约50nm、约0.01nm至约100nm、约0.01nm至约500nm、约0.01nm至约1,000nm、约0.01nm至约5,000nm、约0.01nm至约10,000nm、约0.1nm至约0.5nm、约0.1nm至约1nm、约0.1nm至约5nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约50nm、约0.1nm至约100nm、约0.1nm至约500nm、约0.1nm至约1,000nm、约0.1nm至约5,000nm、约0.1nm至约10,000nm、约0.5nm至约1nm、约0.5nm至约5nm、约0.5nm至约10nm、约0.5nm至约50nm、约0.5nm至约100nm、约0.5nm至约500nm、约0.5nm至约1,000nm、约0.5nm至约5,000nm、约0.5nm至约10,000nm、约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约50nm、约1nm至约100nm、约1nm至约500nm、约1nm至约1,000nm、约1nm至约5,000nm、约1nm至约10,000nm、约5nm至约10nm、约5nm至约50nm、约5nm至约100nm、约5nm至约500nm、约5nm至约1,000nm、约5nm至约5,000nm、约5nm至约10,000nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm或约5,000nm至约10,000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为约0.01nm、约0.1nm、约0.5nm、约1nm、约5nm、约10nm、约50nm、约100nm、约500nm、约1,000nm、约5,000nm或约10,000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为至少约0.01nm、约0.1nm、约0.5nm、约1nm、约5nm、约10nm、约50nm、约100nm、约500nm、约1,000nm或约5,000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为至多约0.1nm、约0.5nm、约1nm、约5nm、约10nm、约50nm、约100nm、约500nm、约1,000nm、约5,000nm或约10,000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为约50nm至约3000nm。在一些实施方案中，纳米通道的直径为1000nm或稍大。在一些情况下，纳米通道的直径可以是相同的。在一些情况下，纳米通道的直径可以是不同的。
在一些情况下，纳米通道可以排列成纳米通道阵列。在一些情况下，纳米通道可以排列成纳米通道阵列，纳米通道之间具有间距。在一些情况下，纳米通道之间的间距可以为约0.01μm至约5,000μm。在一些情况下，纳米通道之间的间距可以为约0.01μm至约0.05μm、约0.01μm至约0.1μm、约0.01μm至约0.5μm、约0.01μm至约1μm、约0.01μm至约5μm、约0.01μm至约10μm、约0.01μm至约50μm、约0.01μm至约100μm、约0.01μm至约500μm、约0.01μm至约1,000μm、约0.01μm至约5,000μm、约0.05μm至约0.1μm、约0.05μm至约0.5μm、约0.05μm至约1μm、约0.05μm至约5μm、约0.05μm至约10μm、约0.05μm至约50μm、约0.05μm至约100μm、约0.05μm至约500μm、约0.05μm至约1,000μm、约0.05μm至约5,000μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约1μm、约0.1μm至约5μm、约0.1μm至约10μm、约0.1μm至约50μm、约0.1μm至约100μm、约0.1μm至约500μm、约0.1μm至约1,000μm、约0.1μm至约5,000μm、约0.5μm至约1μm、约0.5μm至约5μm、约0.5μm至约10μm、约0.5μm至约50μm、约0.5μm至约100μm、约0.5μm至约500μm、约0.5μm至约1,000μm、约0.5μm至约5,000μm、约1μm至约5μm、约1μm至约10μm、约1μm至约50μm、约1μm至约100μm、约1μm至约500μm、约1μm至约1,000μm、约1μm至约5,000μm、约5μm至约10μm、约5μm至约50μm、约5μm至约100μm、约5μm至约500μm、约5μm至约1,000μm、约5μm至约5,000μm、约10μm至约50μm、约10μm至约100μm、约10μm至约500μm、约10μm至约1,000μm、约10μm至约5,000μm、约50μm至约100μm、约50μm至约500μm、约50μm至约1,000μm、约50μm至约5,000μm、约100μm至约500μm、约100μm至约1,000μm、约100μm至约5,000μm、约500μm至约1,000μm、约500μm至约5,000μm或约1,000μm至约5,000μm。在一些情况下，纳米通道之间的间距可以为约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约500μm、约1,000μm或约5,000μm。在一些情况下，纳米通道之间的间距可以为至少约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约500μm或约1,000μm。在一些情况下，纳米通道之间的间距可以为至多约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约500μm、约1,000μm或约5,000μm。
在一些情况下，纳米电穿孔系统包括上部电极层和下部电极层以用于在流体室内生成电场。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电压为约10V至约500V。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电压为约10V至约25V、约10V至约50V、约10V至约100V、约10V至约125V、约10V至约150V、约10V至约175V、约10V至约200V、约10V至约225V、约10V至约250V、约10V至约300V、约10V至约500V、约25V至约50V、约25V至约100V、约25V至约125V、约25V至约150V、约25V至约175V、约25V至约200V、约25V至约225V、约25V至约250V、约25V至约300V、约25V至约500V、约50V至约100V、约50V至约125V、约50V至约150V、约50V至约175V、约50V至约200V、约50V至约225V、约50V至约250V、约50V至约300V、约50V至约500V、约100V至约125V、约100V至约150V、约100V至约175V、约100V至约200V、约100V至约225V、约100V至约250V、约100V至约300V、约100V至约500V、约125V至约150V、约125V至约175V、约125V至约200V、约125V至约225V、约125V至约250V、约125V至约300V、约125V至约500V、约150V至约175V、约150V至约200V、约150V至约225V、约150V至约250V、约150V至约300V、约150V至约500V、约175V至约200V、约175V至约225V、约175V至约250V、约175V至约300V、约175V至约500V、约200V至约225V、约200V至约250V、约200V至约300V、约200V至约500V、约225V至约250V、约225V至约300V、约225V至约500V、约250V至约300V、约250V至约500V或约300V至约500V。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电压为约10V、约25V、约50V、约100V、约125V、约150V、约175V、约200V、约225V、约250V、约300V或约500V。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电压为至少约10V、约25V、约50V、约100V、约125V、约150V、约175V、约200V、约225V、约250V或约300V。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电压为至多约25V、约50V、约100V、约125V、约150V、约175V、约200V、约225V、约250V、约300V或约500V。
在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电场强度为约0.1伏特/mm至约50,000伏特/mm。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电场强度为约0.1伏特/mm至约0.5伏特/mm、约0.1伏特/mm至约1伏特/mm、约0.1伏特/mm至约5伏特/mm、约0.1伏特/mm至约10伏特/mm、约0.1伏特/mm至约50伏特/mm、约0.1伏特/mm至约100伏特/mm、约0.1伏特/mm至约500伏特/mm、约0.1伏特/mm至约1,000伏特/mm、约0.1伏特/mm至约5,000伏特/mm、约0.1伏特/mm至约10,000伏特/mm、约0.1伏特/mm至约50,000伏特/mm、约0.5伏特/mm至约1伏特/mm、约0.5伏特/mm至约5伏特/mm、约0.5伏特/mm至约10伏特/mm、约0.5伏特/mm至约50伏特/mm、约0.5伏特/mm至约100伏特/mm、约0.5伏特/mm至约500伏特/mm、约0.5伏特/mm至约1,000伏特/mm、约0.5伏特/mm至约5,000伏特/mm、约0.5伏特/mm至约10,000伏特/mm、约0.5伏特/mm至约50,000伏特/mm、约1伏特/mm至约5伏特/mm、约1伏特/mm至约10伏特/mm、约1伏特/mm至约50伏特/mm、约1伏特/mm至约100伏特/mm、约1伏特/mm至约500伏特/mm、约1伏特/mm至约1,000伏特/mm、约1伏特/mm至约5,000伏特/mm、约1伏特/mm至约10,000伏特/mm、约1伏特/mm至约50,000伏特/mm、约5伏特/mm至约10伏特/mm、约5伏特/mm至约50伏特/mm、约5伏特/mm至约100伏特/mm、约5伏特/mm至约500伏特/mm、约5伏特/mm至约1,000伏特/mm、约5伏特/mm至约5,000伏特/mm、约5伏特/mm至约10,000伏特/mm、约5伏特/mm至约50,000伏特/mm、约10伏特/mm至约50伏特/mm、约10伏特/mm至约100伏特/mm、约10伏特/mm至约500伏特/mm、约10伏特/mm至约1,000伏特/mm、约10伏特/mm至约5,000伏特/mm、约10伏特/mm至约10,000伏特/mm、约10伏特/mm至约50,000伏特/mm、约50伏特/mm至约100伏特/mm、约50伏特/mm至约500伏特/mm、约50伏特/mm至约1,000伏特/mm、约50伏特/mm至约5,000伏特/mm、约50伏特/mm至约10,000伏特/mm、约50伏特/mm至约50,000伏特/mm、约100伏特/mm至约500伏特/mm、约100伏特/mm至约1,000伏特/mm、约100伏特/mm至约5,000伏特/mm、约100伏特/mm至约10,000伏特/mm、约100伏特/mm至约50,000伏特/mm、约500伏特/mm至约1,000伏特/mm、约500伏特/mm至约5,000伏特/mm、约500伏特/mm至约10,000伏特/mm、约500伏特/mm至约50,000伏特/mm、约1,000伏特/mm至约5,000伏特/mm、约1,000伏特/mm至约10,000伏特/mm、约1,000伏特/mm至约50,000伏特/mm、约5,000伏特/mm至约10,000伏特/mm、约5,000伏特/mm至约50,000伏特/mm或约10,000伏特/mm至约50,000伏特/mm。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电场强度为约0.1伏特/mm、约0.5伏特/mm、约1伏特/mm、约5伏特/mm、约10伏特/mm、约50伏特/mm、约100伏特/mm、约500伏特/mm、约1,000伏特/mm、约5,000伏特/mm、约10,000伏特/mm或约50,000伏特/mm。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电场强度为至少约0.1伏特/mm、约0.5伏特/mm、约1伏特/mm、约5伏特/mm、约10伏特/mm、约50伏特/mm、约100伏特/mm、约500伏特/mm、约1,000伏特/mm、约5,000伏特/mm或约10,000伏特/mm。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场的电场强度为至多约0.5伏特/mm、约1伏特/mm、约5伏特/mm、约10伏特/mm、约50伏特/mm、约100伏特/mm、约500伏特/mm、约1,000伏特/mm、约5,000伏特/mm、约10,000伏特/mm或约50,000伏特/mm。
在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场包括脉冲持续时间为约0.01毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲的多个脉冲。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场包含脉冲持续时间为约0.01毫秒/脉冲至约0.05毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约0.1毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约0.5毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约1毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约5毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约0.01毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约0.1毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约0.5毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约1毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约5毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约0.5毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约1毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约5毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约1毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约5毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约5毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约10毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲至约50毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲至约100毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲至约500毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲、约500毫秒/脉冲至约1,000毫秒/脉冲、约500毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲或约1,000毫秒/脉冲至约5,000毫秒/脉冲的多个脉冲。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场包含脉冲时间为约0.01毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲、约500毫秒/脉冲、约1,000毫秒/脉冲或约5,000毫秒/脉冲的多个脉冲。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场包含脉冲时间为至少约0.01毫秒/脉冲、约0.05毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲、约500毫秒/脉冲或约1,000毫秒/脉冲的多个脉冲。在一些情况下，纳米电穿孔的通过电极生成的电场包含脉冲时间为至多约0.05毫秒/脉冲、约0.1毫秒/脉冲、约0.5毫秒/脉冲、约1毫秒/脉冲、约5毫秒/脉冲、约10毫秒/脉冲、约50毫秒/脉冲、约100毫秒/脉冲、约500毫秒/脉冲、约1,000毫秒/脉冲或约5,000毫秒/脉冲的多个脉冲。在一些情况下，纳米电穿孔包含1个脉冲、2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲、10个脉冲、11个脉冲、12个脉冲、13个脉冲、14个脉冲、15个脉冲、16个脉冲、17个脉冲、18个脉冲、19个脉冲、20个脉冲或更多。
在一些情况下，通过离心或超速离心从细胞培养基中收集并纯化通过细胞外囊泡供体细胞产生和分泌的细胞外囊泡，离心或超速离心可以允许基于细胞外囊泡的密度将细胞外囊泡从其他细胞碎片或分子纯化出来。
在一些情况下，产生包含治疗性多核苷酸(和任选的靶向多肽)的细胞外囊泡的方法和系统包括将待纳米电穿孔至细胞中的多个载体负载纳米通道中。在一些情况下，可以将除载体之外的分子(例如，蛋白质、生物分子、化合物等)负载到纳米通道中以纳米电穿孔至细胞中。在一些情况下，由上部电极和下部电极生成的电场加速载体进入细胞。在一些情况下，针对纳米电穿孔生成的电场在膜的细胞中产生孔以允许载体的纳米电穿孔。在一些情况下，细胞外囊泡供体细胞的膜中的孔可以形成在焦点处，例如电场直接接触细胞膜的纳米通道的出口处。
在一些情况下，与通过非纳米电穿孔(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞相比，纳米电穿孔的胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌至少10％、50％、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍或更多细胞外囊泡。在一些情况下，纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌与通过非纳米电穿孔(例如，常规批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染、全局细胞应激应答、饥饿、缺氧和热处理等)刺激的细胞外囊泡供体细胞所产生和分泌的细胞外囊泡的数量相比，增加至少10％、50％、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍或更多的数量的细胞外囊泡。
在一些情况下，当在升高的温度下培养和纳米电穿孔细胞外囊泡供体细胞时，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌更多的细胞外囊泡。例如，与在4℃下培养并纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞相比，在37℃下培养并纳米电穿孔的细胞外囊泡产生并分泌更多细胞外囊泡。在一些情况下，在培养并纳米电穿孔细胞外囊泡供体细胞期间，每高于4℃升高1℃，细胞外囊泡供体细胞便产生并分泌至少10％、50％、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍或更多的细胞外囊泡。
在一些情况下，当在包含Ca2+的缓冲液中培养细胞外囊泡供体细胞时，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌更多的细胞外囊泡。例如，与在纳米电穿孔之后在不包含Ca2+的缓冲液中培养的细胞外囊泡供体细胞相比，在纳米电穿孔之后在包含500nM Ca2+的缓冲液中培养的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌更多细胞外囊泡。在一些情况下，与在纳米电穿孔之后在不包含Ca2+的缓冲液中培养的细胞外囊泡供体细胞相比，当在纳米电穿孔之后在包含增加的浓度的Ca2+的缓冲液中培养时，细胞外囊泡供体细胞产生并分泌至少10％、50％、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍或更多的细胞外囊泡。缓冲液中增加的浓度的Ca2+的示例包括10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、7000nM、800nM、900nM、1000nM、1100nM、1200nM、1300nM、1400nM、1500nM、2000nM、2500nM、3000nM、5000nM、10000nM或更高浓度的Ca2+。
在一些情况下，当用包含编码6-kbp Achaete-Scute复合物样-1(Ascl1)、7-kbpPou结构域3类转录因子2(Pou3f2或Brn2)和9-kbp髓磷脂转录因子1样(Myt1l)的载体的至少一个异源性多核苷酸转染细胞外囊泡供体细胞时，细胞外囊泡供体细胞可以产生并分泌更多细胞外囊泡。与通过纳米电穿孔未用6-kbp Achaete-Scute复合物样-1(Ascl1)、7-kbpPou结构域3类转录因子2(Pou3f2或Brn2)和9-kbp髓磷脂转录因子1样(Myt1l)转染的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的细胞外囊泡的数量相比，通过用6-kbp Achaete-Scute复合物样-1(Ascl1)、7-kbp Pou结构域3类转录因子2(Pou3f2或Brn2)和9-kbp髓磷脂转录因子1样(Myt1l)转染细胞外囊泡供体细胞，通过电穿孔所刺激的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的细胞外囊泡的数量可以增加至少10％、50％、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍或更多倍。
在一些情况下，与通过非纳米电穿孔转染的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的细胞外囊泡相比，通过电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的细胞外囊泡包含至少50％、1倍、2倍、5倍、100倍、500倍、1000倍或更多治疗性多核苷酸。在一些情况下，与通过非纳米电穿孔转染的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的细胞外囊泡包封的治疗性多核苷酸相比，通过纳米电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的细胞外囊泡包封的治疗性多核苷酸可能至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多为完整的，以便编码治疗性多肽。
在一些情况下，与通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的百分比相比，微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌增加百分比的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡。在一些情况下，与通过其他转染方法转染的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的百分比相比，通过微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的百分比增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。在一些情况下，包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的百分比可以通过历经1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或更长的时间跨度的跨度，测量细胞外囊泡供体细胞产生并分泌的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的数量来确定。在一些情况下，与通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡的数量相比，微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌增加数量的包含至少一个治疗性多核苷酸(例如，治疗性mRNA、治疗性miRNA)拷贝的细胞外囊泡。在一些情况下，与通过其他转染方法(例如，常规的批量电穿孔、基因枪、lipofectamine转染等)转染的细胞外囊泡供体细胞所产生并分泌的细胞外囊泡相比，微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌增加数量的包含至少一个治疗性多核苷酸拷贝的细胞外囊泡，增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍或更多。在一些情况下，微通道电穿孔或纳米通道电穿孔的细胞外囊泡供体细胞产生并分泌增加数量的细胞外囊泡，其中500个细胞外囊泡中的至少1个、200个细胞外囊泡中的至少1个、100个细胞外囊泡中的至少1个、50个细胞外囊泡中的至少1个、25个细胞外囊泡中的至少1个或10个细胞外囊泡中的至少1个包含至少1个治疗性多核苷酸(例如，治疗性mRNA、治疗性miRNA)拷贝。
药物组合物
在一些情况下，细胞外囊泡可以配制成药物组合物。在一些情况下，包含细胞外囊泡或外泌体的药物组合物可以通过多种施用途径施用于对象，包括但不限于肠胃外、口服、经颊、直肠、舌下或经皮施用途径。在一些情况下，肠胃外施用包括静脉内、皮下、肌内、脑内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、玻璃体内、骨内输注、腹膜内或鞘内施用。在一些情况下，药物组合物被配制用于局部施用。在其他情况下，药物组合物被配制用于全身施用。在一些情况下，本文所述的药物组合物和制剂通过静脉内、皮下和肌内施用来施用于对象。在一些情况下，本文所述的药物组合物和制剂通过静脉内施用来施用于对象。在一些情况下，本文所述的药物组合物和制剂通过施用来施用于对象。在一些情况下，本文所述的药物组合物和制剂通过肌内施用来施用于对象。
试剂盒/制品
在某些方面，本文公开与本文所述的一种或多种方法和组合物一起使用的试剂盒和制品。本文还描述制造细胞外囊泡或外泌体的系统。在一些情况下，该系统包括对细胞外囊泡供体细胞进行纳米电穿孔以刺激包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡或外泌体的产生的方法。
在一些情况下，试剂盒可以包括载体、包装或容器，它们被分隔开以容纳一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包括待在本文所述的方法中使用的单独元件之一。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。在一些情况下，容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签，以及具有使用说明的包装插页。还可以包括一套说明书。
在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于也容纳容器的器皿或载体内时，标签与容器相关联，例如作为包装插页。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于具体的治疗应用。标签还指示例如在本文所述的方法中使用内容物的方向。
在某些情况下，包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡可以存在于含有一个或多个含有本文所提供的化合物的单位剂型的包装或分配器装置中。包装例如含有金属或塑料箔，例如泡罩包装。在一个实施方案中，包装或分配器装置随附有施用说明。在一个实施方案中，包装或分配器还随附有规定药物制剂的制造、使用或销售的呈由政府机构指定的形式的与容器相关联的通知，该通知反映该机构批准的用于人或兽医施用的药物的形式。例如，该通知是由美国食品与药品管理局批准用于药物的标签或已批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备含有本文所提供的化合物的包含治疗性多肽的细胞外囊泡，其被配制于相容的药物载体中，将该细胞外囊泡放置于适当的容器中，并且贴有针对指示病况的治疗的标签。
在一些情况下，试剂盒包括可用于开发过继性疗法和本文所述的治疗方法的制品。在一些情况下，试剂盒包括至少一个包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡或制造至少一个包含治疗性多核苷酸的细胞外囊泡的组分。在一些情况下，试剂盒包括至少一个包含治疗性多核苷酸的外泌体或制造至少一个包含治疗性多核苷酸的外泌体的组分。
使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应”、“不应”、“必须”、“不得”、“首先”、“最初”、“接下来”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”，并不意味着限制本文公开的本实施方案的范围，而是作为示例性的。
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”旨在还包括复数形式。此外，在术语“包括”、“具有”或其变体在具体实施方式和/或权利要求书中使用的程度上，此类术语旨在以与术语“包含”相似的方式是包含性的。
如本文所用，短语“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是开放式表达，在操作中既是连接词，也是反意连接词。例如，表达“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”中的每一个表示单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起或A、B和C一起。
如本文所用，“或”可以是指“和”、“或”或“和/或”，并且可以排外性地和包容性地使用。例如，术语“A或B”可以是指“A或B”、“A但不是B”、“B但不是A”以及“A和B”。在一些情况下，上下文可以决定特定的含义。
本文所述的任何系统、方法、软件和平台都是模块化的，不限于顺序步骤。因此，术语，例如“第一”和“第二”并不一定意味着优先级、重要性顺序或行为顺序。
如本文所用，当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且该数字或数值范围可以例如在所陈述的数字或数值范围的1％至10％之间变化。除非上下文另外指明，否则术语“约”是指所陈述的数字或值的±10％。
术语“大约”意指由本领域普通技术人员测定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于该值的测量或测定方式，例如，测量系统的限制性。例如，根据给定值的实践，“大约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则应假定术语“大约”意指特定值的可接受的误差范围。
术语“增加的”或“增加”在本文中通常意指增加统计上显著的量。在一些情况下，术语“增加的”或“增加”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或高达且包括100％增加或10％-100％之间的任何增加。“增加”的其他示例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。
术语“降低的”或“降低”在本文中通常意指降低统计上显著的量。在一些情况下，术语“降低的”或“降低”意指与参考水平相比降低至少10％，例如与参考水平相比降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或高达且包括100％降低(例如，与参考水平相比不存在的水平或不可检测的水平)或10％-100％之间的任何降低。在标志物或症状的语境下，这些术语意味着这种水平在统计上显著降低。例如，降低可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选下降至被认为是在没有给定疾病的个体的正常范围内的水平。
术语“患者”或“对象”可在本文中互换使用，并且涵盖哺乳动物。哺乳动物的非限制性示例包括哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。
如本文所用，“细胞”通常是指生物细胞。细胞是活生物体的基本结构、功能和/或生物单元。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性示例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞或来自哺乳动物(例如，猪、奶牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞。有时，细胞不是源自天然生物体(例如，细胞是合成的，有时称为人工细胞)。在一些情况下，细胞为原代细胞。在一些情况下，细胞来源于细胞系。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸包括合成核苷酸。核苷酸包括合成核苷酸类似物。核苷酸为核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)和脱氧核糖核苷三磷酸，例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及赋予含有它们的核酸分子以核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用，术语核苷酸可以是指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性示例可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸抑或其类似物，无论是呈单链、双链抑或多链形式。在一些情况下，多核苷酸是外源性的(例如，异源性多核苷酸)。在一些情况下，多核苷酸对于细胞来说是内源性的。在一些情况下，多核苷酸可以存在于无细胞环境中。在一些情况下，多核苷酸为基因或其片段。在一些情况下，多核苷酸为DNA。在一些情况下，多核苷酸为RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。在一些情况下，多核苷酸包含一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。如果存在的话，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。类似物的一些非限制性示例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性示例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析所定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、非编码RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、无细胞的多核苷酸包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)、核酸探针和引物。在一些情况下，核苷酸的序列被非核苷酸组分中断。
“完全完整”和“基本上完整”是指本文所述的核酸具有可以转录和/或翻译成本文所述的治疗性多肽的核酸序列。完全完整的核酸是指未部分降解或片段化的全长核酸序列。例如，完全完整的核酸可以是可以翻译成全长蛋白质(例如，本文所述的治疗性多肽中任一个)的信使RNA。一般而言，完全完整或基本上完整的信使RNA能够被翻译成多肽。一般而言，信使RNA包含可以协助结合核糖体的5’帽和可用于翻译的poly(A)尾。术语“基本上完整”是指可以被部分降解或片段化，但仍然可以转录和/或翻译成本文所述的治疗性多肽中任一个的核酸序列。例如，基本上完整的核酸可以是部分降解或片段化的信使RNA，其可以被翻译成本文所述的治疗性多肽中任一个。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以在本文中可互换地用于指氨基酸的聚合物。多肽可以指如从编码开放阅读框翻译或者如加工成其成熟形式的全长多肽。多肽可以指蛋白质的降解片段或加工片段，其仍然独特地或可识别地映射至特定蛋白质。多肽可以是通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键键合在一起的氨基酸的单个线性聚合物链。多肽可以例如通过添加碳水化合物、磷酸化等来修饰。多肽可以是异源性多肽。
如本文所用，术语“片段”或等效术语可以指具有小于蛋白质全长并任选地维持蛋白质功能的蛋白质位置。“百分比同一性”和“％同一性”是指两个序列(核苷酸或氨基酸)在比对中的相同位置处具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与SEQ ID NO:Y具有X％同一性”是指氨基酸序列与SEQ ID NO:Y的％同一性，并且被阐述为氨基酸序列中X％的残基与SEQ ID NO:Y中公开的序列的残基相同。通常，采用计算机程序进行此类计算。比较并比对序列对的示例性程序包括ALIGN、FASTA、gapped BLAST、BLASTP、BLASTN或GCG。
如本文所用，术语“体内”用于描述在对象体内发生的事件。
如本文所用，术语“离体”用于描述在对象体外发生的事件。不可以直接对对象进行“离体”测定。相反，它是对与对象分开的样品(例如从对象获得的生物样品)进行的。离体用于描述在对象体外的完整细胞或其他类型的生物样品中发生的事件。
如本文所用，术语“体外”用于描述在容器中发生的事件，该容器用于盛装实验室试剂，使得它从获得材料的活生物来源生物体分离。体外测定可以涵盖采用活细胞或死细胞或其他生物材料的基于细胞的测定。体外测定还可以涵盖不采用完整细胞的无细胞测定。
“治疗”或“处理”可以指治疗性治疗、美容性治疗和/或预防或防治性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)靶病况(例如，病理性病况)或病症，通常通过预防、减少或减轻病况或病症的一种或多种症状来实现。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些，以及倾向于患有病症的那些，或待预防病症的那些。如本文所用，病况或病症包括与老化相关联的病况或病症。治疗性益处可以指根除或改善正在进行治疗的症状或基础病症。另外，治疗益处是通过与基础病症相关联的一种或多种生理症状的根除或改善以使得在对象中观察到改善而实现，尽管对象仍可能被基础病症折磨。预防性效果可以包括延缓、防止或消除疾病或病症的出现，延缓或消除疾病或病症的症状发作，减缓、终止或逆转疾病或病症的进展，或其任何组合。预防性益处，可以对有发生特定疾病风险的对象或对报告疾病的一种或多种生理症状的对象(即使可能还未作出此疾病的诊断)进行治疗。
如在本文中可互换使用，术语“有效量”和“治疗有效量”通常是指足以在施用于有需要的对象之后产生所需活性的药物组合物(例如，包含本文所述的组合物的药物组合物)的量。在本公开的上下文中，术语“治疗有效”是指足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的表现、阻止其进展、减轻或缓解该病症的至少一种症状的药物组合物的量。
如本文所用，术语“治疗性细胞外囊泡”、“治疗性EV”、“治疗性外泌体”、“治疗性微囊泡”、“治疗性凋亡小体”等通常指可以用于治疗病况或病症的细胞外囊泡(或者在适用的情况下，外泌体、微囊泡或凋亡小体)。根据使用这些术语的上下文，它们有时可能指可以用于治疗与老化相关联的病况或疾病的细胞外囊泡(或外泌体、微囊泡或凋亡小体)。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。组分在可与药物配制品的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”。它还可以适用于与人和非人哺乳动物的组织或器官接触，而不产生过度的毒性、刺激、变应性应答、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比率相当。
术语“药物组合物”是指包含本文所公开的系统的每种组分与其他化学组分(例如，稀释剂或载体)的系统或系统或组合物的混合物。药物组合物可以促进系统或系统的组分向对象的施用。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气溶胶、肠胃外和表面施用。
术语“转染”或“转染的”通常是指通过基于非病毒或基于病毒的方法将核酸构建体引入细胞中。在一些情况下，核酸分子是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。在一些情况下，核酸分子是非编码序列。在一些情况下，转染方法用于将核酸分子引入细胞中以产生转基因动物。此类技术可以包括原核显微注射、向种系中的逆转录病毒介导的基因转移、向胚胎干细胞中的基因靶向、胚胎电穿孔、精子介导的基因转移以及体细胞(例如，卵丘细胞或乳腺细胞，或成人、胎儿或胚胎干细胞)的体外转化然后进行核移植。
“纳米电穿孔”或“纳米通道电穿孔”是指通过将至少一个异源性多核苷酸(例如，载体)负载至纳米通道中并且通过生成电场使至少一个异源性多核苷酸加速进入细胞中来用至少一个异源性多核苷酸转染细胞。待转染的细胞位于纳米通道的开口处，其中纳米电穿孔的电场在细胞膜中产生孔以允许将至少一个异源性多核苷酸引入至细胞中。如本文所用，“纳米通道”通常是指具有纳米或微米级大小的开口的通道。
如本文所用，“质粒”通常是指非病毒表达载体，例如编码基因和/或基因表达所必需的调控元件的核酸分子。如本文所用，术语“载体”通常是指能够转移或转运有效负载核酸分子的核酸分子。有效负载核酸分子通常可以连接(例如插入)至载体核酸分子。载体可以包括指导细胞中的自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合至宿主细胞基因(例如，宿主细胞DNA)中的序列。载体的示例可以包括但不限于质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、黏粒、细菌人工染色体和病毒载体。如本文所用，“病毒载体”通常是指能够将另一个核酸转运至细胞中的病毒来源的核酸。当存在于适当的环境中时，病毒载体能够指导由载体携带的一个或多个基因编码的一种或多种蛋白质的表达。病毒载体的示例包括但不限于γ-逆转录病毒、α-逆转录病毒、泡沫病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。本公开的任何方面的载体可以包含外源性、内源性或异源性控制序列，例如启动子和/或增强子。
每当术语“至少”、“大于”、“大于或等于”或类似短语在一系列两个或更多个数值中的第一数值之前时，术语“至少”、“大于”、“大于或等于”或类似短语适用于此系列数值中的每个数值。例如，“至少1、2或3”相当于“至少1、至少2和/或至少3”。
每当术语“不超过”、“小于”、“小于或等于”、“不大于”、“至多”或类似短语在一系列两个或更多个数值中的第一数值之前时，术语“不超过”、“小于”、“小于或等于”、“不大于”、“至多”或类似短语适用于此系列数值中的每个数值。例如，“小于3、2或1”相当于“小于3、小于2和/或小于1”。
如本文所用，术语“外源性RNA”通常是指人工引入至细胞或细胞外囊泡中的RNA。例如，包含外源性RNA的细胞外囊泡可以指在例如通过细胞转染(例如，通过电穿孔、纳米穿孔、细胞纳米穿孔、磷酸钙转染、脂转染等)或细胞转导(例如，通过病毒转导)将编码外源性mRNA的外源性载体(例如，外源性DNA、DNA质粒或其他外源性载体)引入至细胞之后从细胞产生的细胞外囊泡。术语“外源性RNA”还可以指将外源性mRNA引入至细胞外囊泡或细胞中的其他方法，包括通过直接或批量转染细胞外囊泡或细胞。类似地，如本文所用，术语“外源性mRNA”通常是指人工引入至细胞或细胞外囊泡中的mRNA。例如，包含某一类型的外源性mRNA(例如，外源性细胞外基质mRNA、外源性VEGF mRNA等)的细胞外囊泡可以指在例如通过细胞转染(例如，通过电穿孔、纳米穿孔、细胞纳米穿孔、磷酸钙转染、脂转染等)或细胞转导(例如，通过病毒转导)将编码外源性mRNA的外源性载体(例如，外源性DNA、DNA质粒或其他外源性载体)引入至细胞之后从细胞产生的细胞外囊泡。术语“外源性mRNA”还可以指将外源性mRNA引入至细胞外囊泡或细胞中的其他方法，包括通过直接或批量转染细胞外囊泡或细胞。当修饰其他类型的核酸(例如，siRNA、miRNA或DNA)时，术语“外源性”可以进行类似解释。
如本文所用，术语“规格”通常是指本文所述的针、水凝胶针、微针或微针装置的穿透部分的内径和外径的设定组合。
如本文所用，术语“微针”通常是指具有至少一个尺寸(例如，长度、宽度或直径)小于15mm的针。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的组合物、系统和方法的实施方案，并且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.细胞纳米穿孔(CNP)生成的细胞外囊泡
如本文所述，使用刺激细胞产生并释放含有感兴趣的核苷酸序列(包括mRNA、微RNA和shRNA)的外泌体的细胞纳米穿孔(CNP)生物芯片、CNP系统和CNP方法。该系统和方法允许在含有纳米通道阵列的芯片表面上培养单层源细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和树突细胞(DC)(图1)。纳米通道(直径约500nm)使瞬时电脉冲能够通过，将DNA质粒从缓冲液运送至附接的细胞中(图1)。
实施例2.VEGF mRNA细胞外囊泡的体外递送
首先使用细胞纳米穿孔(CNP)和批量电穿孔(BEP)将VEGF递送至人真皮成纤维细胞(HDF)中以生成含有VEGF mRNA的外泌体。为了比较CNP和BEP制备的外泌体内VEGF mRNA的量，使用了qtr.-PCR。尽管CNP和BEP都产生含有VEGF mRNA的外泌体，但CNP外泌体内VEGFmRNA的浓度高得多。与BEP不同，CNP有效地产生含有大mRNA的外泌体，其中CNP分泌的外泌体含有来自BEP的外泌体>100倍的VEGF mRNA(图2)。
为了研究VEGF mRNA EV的递送潜力，将10,000个人真皮成纤维细胞与范围为1pg至1ng的GFP标记的VEGF mRNA(在EV中)或对照EV一起温育24或48小时。与对照EV处理的细胞相比，48小时之后，VEGF mRNA EV处理的细胞中VEGF蛋白的翻译显著上调(图3A)。EV暴露之后24小时和48小时的qtr.-PCR证实到48小时为止VEGF mRNA显著递送至细胞(图3B)。
实施例3.VEGF mRNA EV在临床前缺血模型中的体内治疗功效
为了评估VEGF mRNA EV在后肢缺血(HLI)模型中的治疗潜力，将VEGF mRNA EV肌内注射至HLI小鼠中。与PBS注射相比，随时间推移，VEGF mRNA EV表现出显著改善的再血管化(图4A)。缺血足垫的平均灌注值相对于对照足垫的平均灌注值的量化显示早在EV递送之后两天开始便有显著更好的灌注，几乎完全再灌注发生在EV递送之后7天(图4B)。为了进一步评估VEGF mRNA EV在缺血组织内的体内递送，在注射负载VEGF mRNA的EV之后48小时收集0.20g缺血腿组织，并且使用ELISA分析其VEGF蛋白表达。与PBS对照治疗的组织相比，用VEGF mRNA EV治疗的组织表现出VEGF蛋白浓度增加，指示VEGF mRNA递送早在EV递送之后两天便导致VEGF蛋白的翻译(图4C)。免疫荧光染色结果进一步证实，到EV递送之后48小时，VEGF mRNA EV治疗增加了VEGF表达(图4D)。
实施例4.Col1 mRNA细胞外囊泡的体外递送
为了研究Col1 mRNA EV的递送潜力，将10,000个人真皮成纤维细胞与范围为1pg至1ng的GFP标记的Col1 mRNA(含于CNP产生的EV中)、Col1 mRNA BEP产生的外泌体或对照EV一起温育24或48小时。与对照EV处理的细胞相比，48小时之后，Col1 mRNA EV处理的细胞中COL1蛋白的翻译显著上调(图5A)。EV暴露之后24小时和48小时的RT-PCR证实，与BEP和对照EV相比，在24或48小时，Col1 mRNA CNP产生的EV将Col1 mRNA显著递送至细胞(图5B和表1)。
表1.用负载Col1a mRNA的EV处理24h/48h的人成纤维细胞的qPCR。
实施例5.Col1 mRNA EV在临床前光老化模型中的体内治疗功效
为了评估Col1 mRNA EV在皮肤损伤模型中的治疗潜力，使用负载含有Col1 mRNA的1e11 EV的28号针将VEGF mRNA EV皮下注射至小鼠中。在一个示例中，在光老化处理之后，小鼠接受四个剂量的Col1 mRNA EV(图6A)。在另一示例中，小鼠接受三个剂量的Col1mRNA EV：第一剂；第一次注射之后48小时的第二剂；以及在96小时的第三剂(图6B)。与盐水注射相比，Col1 mRNA EV表现出随时间推移显著改善的皮肤病况(例如，皱纹的出现减少)(图6A-图6B)，在第一次注射的约一周内观察到显著差异。免疫组织化学(图6C和图6E)和免疫荧光(图6D-图6E)染色结果证实，Col1 mRNA EV治疗在EV递送之后增加了胶原表达。Masson三色染色结果进一步证实，Col1 mRNA EV治疗在EV递送之后增加了胶原表达。
实施例6.合成治疗性细胞外囊泡的方法和系统
本文描述用于产生用于包封治疗性多核苷酸的细胞外囊泡或外泌体的示例性方法和系统。通过本方法和系统产生的细胞外囊泡和外泌体可以适于配制成用于治疗用途的药物组合物。
用于EV产生的常规细胞培养
人真皮成纤维细胞正常(HDFn)细胞可以从ATCC(PCS-201-010TM)获得，并且用于生成用于在GMP设施处的治疗性EV(tEV)生产的细胞克隆。对于使用组织培养瓶(Fisherbrand，目录号FB012937)的常规细胞培养，将HDFn细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素/链霉素的杜尔贝科最小必需培养基(DMEM)中，并且在37C下于5％CO2中温育。
在漂白剂浴中清洁纳米孔电穿孔(NEP)芯片，之后进行DI水冲洗以及N2吹干。在GMP设施的支持室使用UV/Ozone清洁器对NEP芯片进行表面处理(任选地，可以用于新的PDMS间隔物黏合)。
将清洁的NEP芯片转移至生物安全柜内，并且将HDFn细胞接种在NEP芯片上，每个芯片80,000-100,000个细胞。细胞接种之后，将NEP芯片转移至温育箱并且在NEP芯片中培养细胞过夜。
第二天，在显微镜下检查细胞生长状况，并且确保细胞贴壁且蔓延良好并且在NEP芯片表面上达到>70％的汇合度。在NEP处理之前，将NEP芯片中的细胞培养基替换为无血清培养基(仅DMEM)。
对于可再现的NEP处理，可以在EV验证(QC)室通过分光光度计(来自ThermoScientific的NanoDrop 2000c)确定靶质粒的浓度。通过NEP，使用电穿孔系统(来自Bio-Rad的Gene Pulser Xcell)，以一致的电穿孔参数处理细胞。
对于实验室规模(<20L)的NEP处理之后的EV收获，将细胞在无血清培养基中温育24小时。对于中试规模(>20L)，将细胞在贴壁细胞生物反应器(例如，iCELLis 500+系统)中温育24小时。
NEP处理之后24小时收集细胞培养条件培养基(CCM)，并且将细胞培养物胰蛋白酶化并用台盼蓝染色分析其细胞活力。对于准确的细胞活力测定，可以通过吸光度检测，使用酶标仪(来自BioTek的SynergyTM HTX Multi-Mode)来使用MTT测定。
在漂白剂浴中清洁经处理的NEP芯片，之后进行DI水冲洗以及N2吹干。NEP芯片现已准备好用于下一批EV产生。
在200×g下离心CCM，持续5分钟，以去除细胞和碎片。在2000×g下离心去除细胞的CCM，持续30分钟，以去除细胞碎片。将去除细胞碎片的CCM转移至新管中，而不扰乱沉淀物。
将CCM储存在4℃下，以便于使用NTA/DLS设备测量EV数量和大小以及进行EV分离。如果CCM在4℃下储存超过48小时，则将CCM在-80℃下冷冻并储存，以供下游使用。
在将CCM释放至EV分离室之前，将取样试样发送至EV验证。NanoSight NS300利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)以在EV验证中表征溶液中10nm-2000nm的纳米颗粒。将NTA结果与DLS和qNano测量结果进行比较，以便在EV验证中进一步分析基于大小的EV数量的量化。
如果需要的话，可以进行例如无菌测试的其他测试，以用于EV的预验证。如果所有测试均已完成并通过标准，则使用通过的试样处理EV分离。通过TFF系统的cGMP相容EV分离
可以在EV分离中使用切向流过滤(TFF)，以从收集的CCM去除非EV组分并且用于后续浓缩。对于使用TFF系统对CCM的EV分离，使用0.8μm过滤器过滤CCM样品。在与小于50mLCCM的小规模EV分离中，设置TFF系统，其由具有25-cm长管道的数字驱动泵(Cole-Parmer，EW-77921-65)、50mL锥形离心管、凹和凸鲁尔螺纹型倒钩、旋塞和500kDa TFF中空纤维过滤器(Repligen，C02-S500-05-N)组成。将50mL锥形离心管拧入TFF系统中的50mL锥形离心管的盖子中。将经过滤的CCM样品添加至50mL锥形离心管中。
启动数字驱动泵，然后通过使用泵进行自动泵送来将培养基轻轻地循环通过TFF中空纤维过滤器。泵的速度设定为35mL/min。
首先将样品过滤并浓缩，直到锥形离心管中留下5mL CCM(滞留体积)。停止泵，然后打开PBS旋塞，以将洗涤缓冲液添加至CCM样品中。以35mL/min重新启动泵，进行渗滤过程2小时，以完全去除蛋白质污染物。停止泵。关闭PBS旋塞。以35mL/min重新启动泵以浓缩样品，直至锥形离心管中剩余的体积为零。停止泵。回收2mL纯化的CCM样品。
在NTA测量含有TFF纯化的EV的溶液之后，如果来自NTA数据的EV浓度小于1e11/mL，则使用10KDa的Amicon Ultra-4离心过滤器单元(来自Millipore，目录号UFC801096D)浓缩样品。
将所需体积(1-4mL)纯化的EV溶液转移至离心过滤器单元。使用Eppendorf 5804(15mL)台式离心机在4℃下以3000×g将TFF处理的CCM样品离心30分钟，以使最终体积为80uL。
将TFF处理的CCM样品在4℃下存储，以用于测量EV数量和大小分布以及EV验证。
对于从超过500mL CCM进行更大规模EV分离，使用来自Solaris BiotechSolution的KRONOS的台式自动TFF系统。使用70mL(滞留体积)TFF处理的EV溶液进行NTA测量，如果来自NTA数据的EV浓度小于1e11/mL，则使用10KDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元(来自Millipore，目录号UFC901096)浓缩样品。将所需体积(4-15mL)纯化的EV溶液转移至离心过滤器单元。使用Eppendorf5804(50mL)台式离心机在4℃下以3000×g将TFF处理的CCM样品离心30分钟，以使最终体积为250uL。如果TFF处理的CCM在4℃下储存超过6小时，则将CCM在-80℃下冷冻并储存，以供下游使用。
对于临床中试规模(>20L)，可以使用来自Sartorius AG的CS1000系统开发一次性TFF系统。
通过SEC柱的cGMP相容EV分离
尺寸排阻色谱法(SEC)柱已用于从收集的CCM中将EV与非EV组分分离。对于使用SEC色谱柱对CCM的EV分离，将CCM浓缩至每毫升更高的EV数量(>1e11/mL)。
在从少于0.5mL的浓缩的CCM进行小规模的EV分离中，将SEC柱放置于保持器中，并且在使用之前，用20mL PBS洗涤qEV柱。使用底盖，将上部过滤器上方的缓冲液移出。装载0.5ml浓缩的CCM，并立即取下底盖，开始收集0.5mL级分(fraction)。当最后的样品刚刚进入柱时添加更多缓冲液，但在上部过滤器上方添加不超过2mL。如果需要的话，收集30个连续级分，每个级分0.5mL。如果使用qEV35柱，则将级分8至10合并至EV溶液中。如果使用qEV70柱，则将级分9至11合并至EV溶液中。
使用Amicon Ultra-4装置，以10kDa MWCO浓缩每个级分或合并的级分。使用Eppendorf 5804(15mL)台式离心机在4℃下以3000×g将SEC处理的CCM样品离心30分钟，以使最终体积为80uL。对于中等规模的EV分离，qEV100-35柱可以与100mL收集的CCM或通过Amicon Ultra-15浓缩的CCM一起使用。对于高端EV纯化，将TFF和SEC系统组合在一起。
TFF处理的CCM样品可以通过SEC柱进一步纯化，以用于高端下游应用。对于高端SEC，qEV10-35(SP7 w/AFC)柱可以与自动级分收集器(AFC)一起使用。对于临床中试规模(>20L)，可以使用来自Cytiva(曾经是GE Healthcare的一部分)的现成一次性系统(定制的现成填充柱)开发一次性液相色谱。
实施例7.CNP生成的大量负载COL1A1 mRNA的EV并且在体外成功递送
胶原I为真皮细胞外基质中的主要胶原，并且部分通过胶原IαI(COL1A1)基因编码。为了生成负载人COL1A1 mRNA的EV，采用了细胞纳米穿孔(CNP)技术，该技术涉及将单层人新生儿真皮成纤维细胞(nHDF)铺板在纳米孔表面上，并且用COL1A1-GFP质粒纳米转染细胞(参见图7A和图7B)。简而言之，人新生儿原代真皮成纤维细胞(nHDF，PCS-201-010)购自ATCC。nHDF在含有10％热灭活胎牛血清(FBS；目录号：10099141C Thermo FisherScientific)的DMEM(Thermo Fisher Scientific)中在37℃下于用5％CO2平衡的潮湿条件中培养。对于CNP，将单层nHDF接种在1cm×1cm 3D CNP硅芯片表面上，以进行过夜温育，如前所述。具有GFP标签的人COL1A1 cDNA(NM_000088.3)质粒购自Sino Biological(目录号HG11776-ACG)。使用100V电场和10个脉冲(每个脉冲10ms，间隔0.1s)，将预加载在PBS缓冲液中的质粒经由纳米通道注射至单个细胞中。测试了各种电穿孔条件以确定最佳条件。BEP(Gene Pulser Xcell，Bio-Rad)，使用250V电场，20ms，1个脉冲。pCMV-COL1A1-GFP质粒在PBS中的浓度为500ng ml-1，用于转染。
转染之后第二天从培养基中分离出EV。简而言之，将细胞培养在含有血清的DMEM培养基中。进行CNP时去除含有血清的细胞培养基。在CNP之后，然后将细胞用PBS洗涤3次，并且在无血清细胞培养基中培养24h。从细胞培养上清液中收集EV。简而言之，将细胞培养基(CCM)以200×g离心5分钟以去除细胞，然后以2000×g离心30分钟以去除碎片。AmiconUltra-4离心过滤器单元，10kDa(Millipore，目录号801024)用于浓缩CCM。使用总外泌体分离试剂(Invitrogen，目录号4478360)纯化EV样品。EV颗粒大小和数量通过NanoSightNS300(Malvern，UK)测量。使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Pico试剂盒(AgilentTechnologies，Foster City，CA，USA)分析RNA产量和大小分布。
与用标准批量电穿孔(BEP)方法处理的细胞或培养中的未处理nHDF相比，发现CNP处理的细胞的每个细胞的EV数量高10倍(参见图7C)。通过每种方法产生的EV是物理上均匀的，在直径约100nm处大小分布达到峰值，如通过针对CNP产生的EV的纳米颗粒跟踪分析(NTA)所确定(参见图7D)。
蛋白质印迹实验显示，CNP处理组中外泌体(CD9、CD63、TSG101)和微囊泡(ARF6)生物标志物的表达显著高于未处理组，证实了分泌的EV的增加(参见图7E)。简而言之，将外泌体在含有蛋白酶抑制剂混合物(Complete，Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH8，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS)中裂解。将所有样品蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)(MerckMillipore NO:IPVH00010)膜并且在300mA下电泳90分钟。将膜用BSA封闭1小时，并且添加适当浓度的一抗(1:1000)，以用于在4℃下温育过夜。将膜切割成适当大小，并且与一抗一起温育，并且在室温下于黑暗中与适当浓度的二抗(1:15,000)一起温育1小时。膜中的蛋白质谱带通过UVP Bio成像系统进行可视化。使用了以下抗体：抗CD63抗体(Abcam，ab68418)、抗CD9抗体(Cell Signaling，目录号13403S)、抗TSG101(Abcam，ab125011)和抗Arf6(Abcam，ab77581)。动力学分析进一步显示，电压优化的EV(参见图7F，其中在100V电压下生成最大数量的EV)释放在CNP诱导之后8h达到峰值，当每4小时收集上清液时，在接下来的24h内都注意到持续的分泌(参见图7G)。最后，RT-qPCR显示，CNP分泌的EV所含有的COL1A1 mRNA是BEP分泌的EV的超过200倍，并且其所含有的COL1A1 mRNA是从非转染细胞分泌的EV的3000倍(参见图7H)。简而言之，按照制造商推荐的方案，使用RT-qPCR测量EV中人COL1A1 mRNA的表达。简而言之，通过RNA纯化微型试剂盒(Norgen Biotek，目录号55000)和DNA去除试剂盒(Norgen Biotek，目录号25720)获得纯化EV的总RNA。使用SuperScriptTMIII第一链合成系统(Invitrogen)以随机六聚体为引物合成第一链cDNA。使用TBPremix Ex TaqTMII(Takara，目录号RR820)测量基因表达。所用的引物序列如下：COL1A1(人)，正向5’-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3’和反向5’-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3’；Gapdh(人)，正向5’-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3’和反向5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’。凝胶琼脂糖的生物分析仪评估表明在约4000个核苷酸下有大量全长转录的COL1A1 mRNA(参见图7I)。
为了评估含有COL1A1 mRNA的EV(COL1A1-EV)的体外治疗潜力，将COL1A1-EV与成纤维细胞一起温育48h(参见图7J)。观察到成纤维细胞的增殖随着COL1A1-EV处理以剂量依赖性方式增加(参见图7K)。简而言之，通过从培养基中去除血清，对60,000个nHDF细胞进行血清饥饿过夜。24h之后，将nHDF细胞用10ul不同浓度的EV(0、10、20、30μg/mL)处理。使用细胞计数试剂盒-8(ab228554，abcam)进行增殖。用EV处理之后，在0、24、48小时向每个孔中添加CCK-8试剂。使用BioTek(BioTek Instruments，Winooski，VT，USA)读取并记录在460nm处的吸光度。处理之后，在用COL1A1-EV处理的成纤维细胞中观察到COL1A1蛋白表达升高，如通过在免疫荧光显微镜下GFP与COL1A1的共定位增加所证实。相比之下，在未处理组中，在没有GFP的共定位的情况下，COL1A1水平显著降低(参见图7L和图7M)。简而言之，将组织切片在室温下用4％多聚甲醛固定20min，并且用PBS(Vetec)洗涤3次，每次5min。然后将组织转移至0.2％Triton X-100中，持续15分钟(透化)，之后用BSA封闭40分钟，并且添加一抗(ab34710和ab6556，Abcam)以用于在4℃下封闭过夜。最后，添加二抗(ab6939和ab6717，Abcam)并将其在室温下放置60分钟。用PBS洗涤之后，添加DAPI(ThermoFisher)以进行核染色，然后封片以便观察。在EV细胞更新测定中，从CNP收集EV，并且将其与60,000个nHDF细胞在24孔板中在37℃下温育4h，之后进行处理。温育之后，将细胞用冷PBS冲洗三次并且在4％多聚甲醛溶液中固定。使用ImageJ(NIH)分析细胞荧光强度。
通过分别经由在用COL1A1-EV处理的成纤维细胞中的qPCR和印迹分析所测量的胶原mRNA表达和胶原蛋白质水平升高进一步证实了mRNA成功递送至受体细胞中(参见图7N、图7O和图7P)。简而言之，在解剖(在冰上)感兴趣的组织之后，添加每5mg组织300μL冰冷的裂解缓冲液，并且用电匀化器匀化混合物，在匀化期间添加另外300-600μL裂解缓冲液。匀化之后，将混合物在4℃下搅拌2h，然后在4℃下以16,000x g离心20min。然后在冰上将上清液收集在新管中，并且丢弃沉淀物。收集24和48h的EV以进行定量实时PCR，并且结果显示COL1A1 mRNA增加，在48h达到最大值。此外，前胶原I(COL1蛋白前体)在COL1A1-EV处理之后显著增加，进一步指示与未处理的成纤维细胞相比，EV处理的成纤维细胞的COL1A1蛋白合成得到改善(参见图7Q)。简而言之，从EV处理的细胞收集细胞培养基。通过ELISA(ab210966，Abcam，Cambridge，UK)测量人I型前胶原浓度。使用BioTek(BioTekInstruments，Winooski，VT，USA)测量在450nm处的吸光度。
此外，为了研究外源性递送的Col1A1是否与受体细胞中的内源性Col1A2形成胶原，进行了IHC共染色。观察到来自Col1A1的信号和Col1A2的共定位，而一些其他外源性递送的Col1A1信号并未与Col1A2共定位。
先前，大多数聚焦于核酸递送的研究都将在10-20个核苷酸范围内的小分子(例如miRNA和siRNA)包封为有效负载，而较大的核酸(例如mRNA)由于难于将它们负载至EV中而很少进行评估。然而，上述研究结果展示，CNP能够将高拷贝数的COL1A1 mRNA(超过4,000个核苷酸)负载至EV中，这是插入后负载方法无法实现的特点。还显示，功能性COL1A1 mRNA可以通过CNP被包封在EV内，并且此COL1A1-EV递送系统在体外显著增加了COL1A1蛋白表达。
实施例8.COL1A1-EV递送之后COL1A1 mRNA表达和蛋白质翻译的体内动力学
为了理解体内EV介导的COL1A1 mRNA递送和蛋白质形成的动力学，将COL1A1-EV经由胰岛素针式注射器皮下递送至小鼠真皮中。在接下来的14天内处死小鼠，以便通过RNAscope进行组织学分析，以用于COL1A1 mRNA量化。发现递送之后12h，局部皮肤组织中的COL1A1 mRNA显著升高，注射之后24h和48h观察到显著降低，并且到96h为止恢复至基线COL1A1 mRNA水平(参见图8A和图8B)。简而言之，用异氟烷麻醉10-12周裸小鼠，并且在背侧皮肤区域注射50uL 3×108个CNP COL1A1 mRNA EV。在皮肤注射之后的预定时间点(0、12、24、48、96h、7d、10d、14d)，切除皮肤并放入4％甲醛中固定。随后，将薄片包埋在石蜡中并进一步分切成4-um薄片。进行RNAscope自动化原位杂交测定以用于检测人COL1A1 mRNA，并且所有原位杂交试剂均为ACD产品(Advanced Cell Diagnostics，Newark，CA，USA)，使用HybEZTMII杂交系统(ACD)进行。简而言之，使用Leica表位修复缓冲液2在95℃下进行靶标修复，持续15min，之后在42℃下进行蛋白酶处理，持续15min。将探针(Probe-Hs-COL1A1目录号401891；ACD)在40℃下杂交2h，之后进行RNAscope扩增，并且将2.5HD Assay-BROWN试剂盒用于染色的可视化。RNAscope 2.5LS探针-Rn-Ppib用作阴性对照。
通过历经30天时间对外植组织的免疫荧光显微镜法评估COL1A1 mRNA向蛋白质的体内翻译。早在注射之后12h便观察到GFP+COL1A1+免疫染色的移植物，在递送之后4天有峰值荧光(参见图8C、图8D和图8E)。如通过免疫荧光显微镜所观察，观察到GFP+COL1A1+蛋白移植物在注射之后第4天至第30天以时间依赖性方式减少，到第30天为止大多数COL1A1 EV来源的蛋白质发生翻转。这些发现表明，COL1A1-EV递送导致受体组织中COL1A1 mRNA表达的3至4天脉冲，在mRNA发生翻转之后早期蛋白表达便达到峰值，并且在注射后第30天降低至接近基线水平。
实施例9.COL1A1-EV在胶原缺陷皮肤光老化模型中的体内治疗功效
在涉及UV皮肤照射的光老化模型中，评估COL1A1-EV替代真皮胶原的治疗潜力(参见图9A)。将无胸腺无毛小鼠历经8周时间用UVB(311nm)照射，导致继发于胶原耗尽的真皮皱纹的形成。简而言之，所有动物工作都得到深圳湾实验室(Shenzhen Bay Laboratory)或合作实验室的实验动物使用与管理委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)的批准。为了得到皮肤光老化模型，如下每隔一天一次对雌性裸小鼠(10-12周龄)进行背侧皮肤的UVB照射，持续8周。将小鼠用1.5％异氟烷麻醉，然后用UV灯(Philips，Somerset，NJ，USA)进行UV照射：发射光谱311nm，位于小鼠背侧皮肤上方30cm处，每隔一天一次，持续8周。将UV照射强度(表示为最小红斑剂量(MED))在实验的前2周期间设定为1MED(60mJ/cm2)，并且在第三周升高至2MED(120mJ/cm2)，在第四周升高至3MED(180mJ/cm2)，并且在第五周至第八周升高至4MED(240mJ/cm2)。总照射的UVB量为大约80MED。对于基于注射器的对光老化皮肤的治疗，在上文所述的8周照射期之后，将裸鼠分配至5个治疗组中的1个(每组4只小鼠)：(a)UVB照射+50μL盐水；(b)UVB照射+0.05％视黄酸；(c)UVB照射+使用32G Hamilton注射器递送的50μL nHDF-EV；(d)UVB照射+使用32G Hamilton注射器递送的50μL(稀释在盐水中的3.78×108个颗粒)nHDF CNP COL1A1-GFP-EV；以及(e)没有UVB暴露(假装)。在第0、4、7、14和21天进行皮肤治疗。将整个背部皮肤分为三个待分析的部分。在治疗开始之后的第0、4、7、14、21和28天跟踪皱纹形成，并且在第28天处死所有动物以进行组织学和皮肤石膏复制品分析(参见图9B)。
在治疗期内的真皮皮肤皱纹的显微摄影术显示，相对于盐水对照组，到第28天为止，未负载的EV和视黄酸组的皱纹数和面积略有减少(参见图9C)。相比之下，用皮下COL1A1-EV治疗的光老化的小鼠在治疗开始之后第7天开始表现出皱纹数和面积的减少，从第14天起显著减少，达到与未照射的假装对照中观察到的水平类似的水平(参见图9D和图9E)。然后在治疗结束时在小鼠背部皮肤上进行皮肤复制。SILFLO聚硅氧烷复制品和环定位器购自Clinical&Derm,LLC(Dallas，TX，USA)。在治疗期结束时获得小鼠背部(背侧)皮肤的复制品。通过立体显微镜(Olympus SZX7)分析复制品，并且通过ImageJ(NIH)分析对应的图像。在治疗开始之后的第28天取得的背侧皮肤的皮肤石膏复制品证实了COL1A1-EV与盐水对照、未负载的EV对照和视黄酸相比对于治疗光老化的皮肤的有效性(参见图9F、图9G和图9H)。在第28天的皮肤石膏评估之后，将动物的子集再保留4周，以监测皱纹减少的持续时间。早在1周后，在治疗开始之后的第35天开始，看到真皮皱纹重新出现，并且到第56天，真皮皱纹与治疗前的水平在统计学上无法区分。(参见图9I、图9J和图9K)。具体而言，结果指示，与盐水对照相比，COL1A1-EV组的皮肤皱纹面积从第7天开始逐渐减少，并且持续到第28天(***P<0.001)。COL1A1-EV群组中的背侧皱纹在治疗之后第49天开始重新出现。COL1A1-EV群组中皱纹的量化指示从第56天起恢复。然而，与对照未负载的EV和局部RA治疗的小鼠相比，接受COL1A1-EV的光老化的小鼠从第14天起表现出显著的效果，达到与未照射的假装对照组类似的水平。
为了评估COL1A1 EV递送的真皮胶原移植，在治疗开始之后的第28天从所有组切除皮肤，并且通过免疫荧光显微镜法以及Masson三色染色进行评估。组织学分析显示，相对于其他组，COL1A1 EV治疗之后COL1A1蛋白表达显著恢复(参见图9L和图9M)。Masson三色染色证实，与给予盐水对照、视黄酸或未负载的EV的小鼠相比，给予COL1A1-EV的小鼠的胶原染色和真皮厚度的水平更高(参见图9N和图9O)。
实施例10.针对蛋白质移植改善的新型微针(MN)EV mRNA递送系统的设计
为了改善蛋白质替代的持续时间和胶原移植的有效性，设计了新型透明质酸微针制剂(HA+EV MN)以改善EV介导的mRNA组织递送。这些针腔以10x 10阵列布置，具有700μm的尖端-尖端间距。对于制备MN贴片，首先，使用ddH2O溶解透明质酸粉末(低MW透明质酸10000Da-20万Da)，从而允许聚合。将150ul 15重量％HA溶液与50ul EV混合，并且在真空下保持30分钟。将混合物浇注至聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具的尖端中。为了将EV浓缩在针的尖端处，将模具在4℃下保持4h。最后，将1mL 15重量％HA溶液加载至微模具上并晾干。干燥之后，将MN贴片从聚硅氧烷模具上取下以供进一步使用。(参见图10A)。HA+EV MN贴片的每个针都被模制成锥形，其基部的圆直径为400μm，并且高度为1000μm(参见图10B)。使用拉伸试验机评估负载EV的具有10％、15％或20％HA的贴片的机械强度(参见图10C)。将MN放置在平坦的金属板上，并且使用液氮冷却探针和金属板。将直径为5mm的平头不锈钢圆柱形探针(以0.5mm min-1的恒定速度)向MN尖端施加垂直的力。发现MN的机械强度随着HA浓度的增加而增加。15％HA+EV MN的负荷断裂力被证实高于皮肤穿透所需的最小平均力(0.058N)，并且显示破坏的针比10％HA少(参见图10D)。
苏木精和伊红(H&E)染色证实，MN穿透角质层进入真皮(516±76μm)(参见图10E)。简而言之，将裸小鼠的皮肤试样在4％多聚甲醛溶液中固定48小时，并且包埋在石蜡中，且切成5μm厚的切片。对于H&E染色，将样品脱蜡、水合、用苏木精和伊红染料染色并脱水。对于EV递送，将HA+EV MN贴片压入至小鼠的背侧皮肤中，并且在15分钟之后去除MN基部。在此期间，MN完全溶解，在施用部位处没有明显的皮肤刺激或记号(参见图10F)。为了比较经由MN递送的EV的组织分布与经由胰岛素注射器递送的EV的组织分布，将EV用DiI(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐；Beyotime，C1036)标记并且在受体小鼠的背侧皮肤下方皮下施用，随后通过免疫荧光显微镜法进行组织学评估(参见图10G、图10H和图10I)。组织分布分析显示，注射器针注射导致EV递送不均匀，在真皮和皮下组织的特定区域团聚，而通过MN递送的EV更好地分散在真皮和皮下组织中。具体来说，diI标记的EV通过注射器针(参见图10H)或通过MN贴片(参见图10I)皮下注射。通过HA MN递送的EV的皮下分布比通过注射器针递送更均匀(参见图10K和图10L)。为了进一步探讨注射器针的剪切应力对EV造成的任何潜在损害，取相同数量的EV，并且使用注射器或HA MN将其注射至具有PBS的空白细胞培养板上。低温电子显微镜显示，MN条件更好地保持了EV的形态和结构(参见图10M和图10N)，这主要是因为注射器针条件中的液体的流率速产生了剪切力。简而言之，将收集的EV悬浮在管中并与多聚甲醛一起温育，然后加载至预先制备的铜网格上并温育以允许吸附。接下来，将乙酸铀酰添加至铜网片(乙酸铀酰是将铀酰离子与膜蛋白和脂质结合的重金属染色剂)。最后，用水洗涤网格并干燥以去除过量染色剂，以便进行TEM成像。
为了评估组织分布和EV膜保护改善是否导致EV移植改善，历经14天时间采用了对皮下注射于小鼠体内的DiI标记的EV的连续体内荧光成像。荧光成像证实，在注射之后的前4天内，注射器递送的EV与MN递送的EV之间的DiI EV信号类似。然而，HA+EV MN组在注射之后的第7天(36.7+1.5％HA+EV MN相比于30+4.3％针，P<0.001)和第10天(28.0+1.5％HA+EV相比于8.4+1.3％针，P<0.001)具有显著更高的荧光信号，表明使用MN贴片改善了组织中EV的长期EV保留(参见图10O和图10P)。简而言之，在第0、1、3、7和14天用体内成像系统(IVIS、Spectrum、Perkin Elmer)对MN治疗的小鼠进行成像。参数设定如下：在指定的RFP成像次数中，曝光时间为15s，激发波长为570nm，发射波长为680nm，2F/stop，视场为13.6cm。通过测量感兴趣的区域(ROI)中的平均放射效率(光子s-1cm-2sr-1μW-1)来进行RFP荧光强度的定量分析。将数据归一化为第0天的荧光强度。
实施例11.HA+EV MN递送系统对于体内蛋白质替代胶原的治疗功效
研究了为了递送COL1A1 mRNA EV使用本文所公开的定制HA+EV MN贴片是否可以导致光老化的小鼠皮肤中体内蛋白质替代改善(参见图11A)。再次对无胸腺小鼠进行8周UV照射(参见图9A)并且将其分配至4个治疗组中的1个(每组4只小鼠)：(a)UVB照射+50μL盐水；(b)UVB照射+通过32G Hamilton注射器递送的50μL(约1010个颗粒，稀释于盐水中)nHDFCNP COL1A1-GFP mRNA EV；(c)UVB照射+HA MN贴片；以及(d)UVB照射+15％HA与CNPCOL1A1-GFP mRNA EV的混合物。在治疗时间线的第0天，所有小鼠都给予单剂量注射50ngCOL1A1 mRNA(或用于对照组的等效体积)。
注射之后，经由对背侧皮肤皱纹的显微摄影监测所有小鼠，持续至第90天(参见图11B)。相对于减少皱纹形成至多35天，之后返回至治疗前基线的注射器针注射，发现通过HA+EV MN递送COL1A1mRNA显著减少皱纹面积和数量长达70天，之后返回至基线水平(参见图11C和图11D)。为了进一步证实这些发现，在第30、60或90天处死每组的小鼠子集，以用于对背侧皮肤和组织结构进行皮肤仿品石膏评估(参见图11E、图11F和图11G)。针注射和HA+EVMN治疗均减少皱纹长度和深度至治疗后第30天(参见图11H和图11I)。然而，只有用HA+EVMN治疗的小鼠显示皱纹长度和深度显著、持久的减少，长达60天。
在研究的第30、60和90天取得的皮肤样品的组织学分析证实，第30天，在针注射组和HA+EV MN组中，小鼠的真皮和皮下组织中的GFP+COL1A1蛋白移植有持久移植(参见图11J)。然而，在第60天，只有接受HA+EV MN的小鼠在真皮和皮下组织中显示GFP+COL1A1移植(参见图11K)。对第90天取得的皮肤样品的免疫荧光显微镜显示，在任何治疗组中都没有GFP胶原移植物(参见图11L和图11M)，支持皱纹显微镜的实验结果，证明在第30-60天治疗有效，并且第70-90天返回至治疗前基线。
对COL1A1蛋白的免疫组织化学(IHC)染色和对皮肤组织的Masson三色染色证实，真皮中胶原的量与免疫荧光显微镜的实验结果相关，并且在所有群组中，HA+EV MN组直至研究的第60天都具有最丰富的胶原纤维和最大的真皮厚度(参见图11N和图11O)。简而言之，将组织切片在4％多聚甲醛中固定20min，用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟，然后转移至含有乙二胺四乙酸(EDTA)(pH9.0)抗原修复溶液的修复盒中，以便在微波烘箱中进行抗原修复。随后，将切片在室温下于3％过氧化氢溶液中避光温育25min。用PBS洗涤之后，用3％BSA或10％正常兔血清均匀覆盖组织。在室温下封闭30min之后，添加一抗(ab34710和ab6556，Abcam)并在4℃下温育过夜。然后，添加对应于一抗的二抗(HRP标记)以覆盖组织切片，并在室温下温育50min。DAB显色：将载玻片放置于PBS(PH7.4)中并在脱色摇动器上摇动洗涤3次，每次5分钟。切片稍干之后，在圆圈内滴加新鲜配制的DAB显色溶液。在显微镜下控制显影时间。依次添加苏木精、苏木精分化液、苏木精返蓝液进行核复染。最后，将载玻片放置于无水乙醇和二甲苯中以便脱水并密封。对于Masson三色染色，将石蜡包埋的皮肤试样分别用Bouin溶液、Weigert铁苏木精工作液、磷钼-磷钨酸溶液和苯胺蓝溶液染色并脱水。在处死当天用卡尺测量小鼠的背侧皮肤厚度。
总而言之，这些发现指示，经由新型HA+EV MN系统包封并递送COL1A1 mRNA延长了光老化的皮肤中的胶原蛋白替代，其持续时间是注射器针递送的超过两倍。值得注意的是，未负载COL1A1mRNA的EV也能够实现皱纹数量的适度减少。
虽然前述公开已经出于清楚和理解的目的进行详细描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开可以清楚地看到，可以在不脱离本公开真实范围的情况下对形式和细节进行各种改变。例如，上文所述的所有技术和装置可以呈各种组合的形式使用。本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献都出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单个的出版物、专利、专利申请和/或其他文献被单个且单独地指示出于所有目的通过引用并入。

Claims (108)

1.多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使RNA(mRNA)。
2.如权利要求1所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mRNA编码胶原。
3.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。
4.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为I型胶原。
5.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为II型胶原。
6.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为I型胶原α1链(Col1A1)或前α1(I)链。
7.如权利要求6所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为Col1A1，并且所述多个细胞外囊泡不包含I型胶原α2链(Col1A2)。
8.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为Col1A2。
9.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每450个EV至少一个所述外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
10.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个所述外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
11.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生所述多个细胞外囊泡。
12.如权利要求11所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞的所述转染通过细胞纳米穿孔进行。
13.如前两项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为人细胞。
14.如前三项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。
15.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。
16.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。
17.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括以下中至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
18.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。
19.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
20.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg所述细胞外基质mRNA。
21.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含直径的峰值在50nm-200nm处的大小分布。
22.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。
23.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中所述外源性细胞外基质mRNA的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。
24.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中与可比数量的天然存在的细胞外囊泡相比，所述多个细胞外囊泡表达较高水平的以下标志物中的至少一个：CD9、CD63、TSG101或ARF6。
25.一种容器，其包含如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述容器还包括细胞。
26.如前述权利要求中任一项所述的容器，其中所述细胞包括人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
27.如前两项权利要求中任一项所述的容器，其中所述多个细胞外囊泡以每个细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在于所述容器中。
28.一种针，其包含如权利要求1至24中任一项所述的多个细胞外囊泡。
29.如前一项权利要求所述的针，其中所述针为微针。
30.如前两项权利要求中任一项所述的针，其中所述针为水凝胶针。
31.如权利要求30所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
32.如权利要求31所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸。
33.如权利要求32所述的针，其中所述水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。
34.一种注射器，其包括如权利要求1至24中任一项所述的多个细胞外囊泡。
35.如前一项权利要求所述的注射器，其中所述多个细胞外囊泡悬浮在透明质酸中。
36.一种水凝胶微针，其中所述水凝胶微针包含多个细胞外囊泡。
37.如前一项权利要求所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。
38.如前两项权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
39.如前述权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。
40.如前述权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶微针包含负载一个或多个mRNA货物的细胞外囊泡。
41.一种针，其包含多个细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质信使RNA(mRNA)。
42.如权利要求41所述的针，其中所述细胞外基质mRNA编码胶原。
43.如权利要求42所述的针，其中所述胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。
44.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为I型胶原。
45.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为II型胶原。
46.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为I型胶原α1链(Col1A1)或前α1(I)链。
47.如前述权利要求中任一项所述的针，其中所述针为水凝胶针，并且任选地其中所述针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。
48.如权利要求47所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
49.一种治疗对象的皮肤病况的方法，其包括向有需要的对象施用至少一个细胞外基质mRNA，从而治疗所述皮肤病况。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述外源性细胞外基质mRNA编码胶原。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为I型胶原。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为II型胶原。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为I型胶原α1链(Col1A1)或前α1(I)链。
55.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为Col1A2。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤病况为皮肤损伤。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤病况为伤口。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括向所述对象施用至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg所述细胞外基质mRNA。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述EV为外泌体。
60.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述EV为凋亡小体或微囊泡。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗所述皮肤损伤导致皱纹的出现减少至少10％。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皱纹的出现减少至少10％发生在向所述对象施用所述至少一个包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的7-14天内。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗所述皮肤损伤导致总皱纹数减少至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗所述皮肤损伤导致总皱纹面积减少至少70％、80％或90％。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗所述皮肤病况包括治疗皮肤损伤，并且其中所述治疗所述皮肤损伤导致在所述治疗所述皮肤病况之后持续至少20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天的皮肤损伤减少。
66.如前一权利要求所述的方法，其中所述皮肤损伤减少为以下中的一种或多种：总皱纹数减少、总皱纹面积减少、皱纹的出现减少或其任何组合。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是经由皮下注射进行的。
68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤损伤是由老化或阳光损伤引起的。
69.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括向所述有需要的对象施用至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且所述细胞外囊泡的至少一部分包含所述至少一个细胞外基质mRNA。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括向所述有需要的对象施用至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡，并且所述细胞外囊泡的至少一部分包含所述至少一个细胞外基质mRNA。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡以多剂量或呈单剂量施用。
72.如前述权利要求所述的方法，其中所述细胞外囊泡以至少每天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次或每16周一次的间隔施用于所述对象。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述细胞外囊泡以至少一个包含至少1,000个细胞外囊泡的剂量施用，其中所述细胞外囊泡的至少一部分包含所述至少一个细胞外基质mRNA。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括向所述对象的组织施用所述至少一个细胞外基质mRNA。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述组织为皮下组织。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述组织为真皮。
77.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在向所述对象的组织施用所述细胞外基质mRNA之后，所述对象的所述组织的细胞外基质蛋白的浓度为至少200、300、500、750或1000pg/ml。
78.一种生产包含细胞外基质mRNA的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
(a)经由转染，将对应于所述细胞外基质mRNA的载体或质粒引入至供体细胞中；
(b)将所述供体细胞在培养基中培养足够量的时间，以便产生包封从所述载体或所述质粒转录的所述细胞外基质mRNA的细胞外囊泡；以及
(c)从所述培养基收集所述细胞外囊泡。
79.一种微针装置，所述微针装置包括基材和多个微针，其中所述多个微针从所述基材突出，并且其中所述多个微针中的至少一个微针包含至少一个细胞外囊泡(EV)。
80.如权利要求79所述的微针装置，其中所述基材上所述多个微针的密度为每平方毫米所述基材0.1个微针至100个微针。
81.如权利要求80所述的微针装置，其中所述基材上所述多个微针的密度为每平方毫米所述基材至少0.3个微针。
82.如权利要求81所述的微针装置，其中所述基材上所述多个微针的密度为每平方毫米所述基材约0.59个微针。
83.如权利要求79至82中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含约10-1000个微针，并且其中所述基材的面积为20-1000mm2。
84.如前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针中的所述至少一个微针包含水凝胶。
85.如权利要求84所述的微针装置，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
86.一种向对象的组织施用细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括向所述对象的所述组织施用如前述权利要求中任一项所述的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。
87.一种治疗有需要的对象的皮肤病况的方法，所述方法包括向所述对象应用如前述权利要求中任一项所述的针、注射器、水凝胶针、微针或微针装置。
88.一种制造微针装置的方法，其中所述方法包括：
(a)将细胞外囊泡(EV)与第一批可聚合的溶液混合；以及
(b)将来自(a)的混合物浇注至具有至少一个针样形状的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中。
89.一种在组织中产生I型胶原的异二聚体或异三聚体的方法，其中所述方法包括向所述组织施用如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡。
90.如前一项权利要求所述的方法，其中所述异二聚体或所述异三聚体包含至少一条I型胶原α链(Col1A1)和至少一条I型胶原α链(Col1A2)，并且其中所述Col1A1通过如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡外源性地递送。
91.多个细胞外囊泡，其包含平均每400个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。
92.如前一项权利要求所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性VEGF mRNA选自VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF及其任何组合。
93.如权利要求91或92所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体或其任何组合。
94.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含每至多1、5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或350个细胞外囊泡至少一个外源性VEGF mRNA的拷贝。
95.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
96.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
97.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡被配制用于静脉内注射、肌内注射、皮下注射或经由冠状动脉导管注射。
98.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述VEGF mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中VEGF mRNA的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。
99.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含至少10pg、50pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、100ng、500ng、1000ng、10μg、50μg、100μg、150μg或200μg VEGF mRNA。
100.一种细胞外囊泡混合物，其中所述混合物包含至少两个包含一个至六个外源性VEGF mRNA的拷贝的细胞外囊泡，并且其中所述混合物包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。
101.一种治疗对象的血流病症的方法，其包括向所述对象施用至少一个包含VEGFmRNA的细胞外囊泡，从而治疗所述血流病症。
102.如权利要求101所述的方法，其中治疗所述血流病症导致再血管化增加至少5％。
103.如权利要求101或102所述的方法，其中所述血流病症为缺血。
104.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡以至少一个剂量施用。
105.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡包括至少1,000个包含VEGF mRNA的细胞外囊泡。
106.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是使用负载包含VEGF mRNA的细胞外囊泡的微针进行的。
107.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微针包含水凝胶。
108.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
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