JP2024517774A - 細胞周期ｒｎａに関する方法及び組成物 - Google Patents

細胞周期ｒｎａに関する方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、特定の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）‐Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）またはその阻害剤に関する、がんの治療を、それを必要とする対象において行う組成物及び方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／１８０，７５６号に対する優先権を主張するものであり、その全内容が本明細書に組み込まれる。
本技術は、特定の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）－Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）に関する方法及び組成物に関する。
政府の利益
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金ＣＡ１９７６９７及びＣＡ２１１３０４に基づいて政府の支援により為されたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月１８日頃に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＢＩＤ－０１１ＰＣ＿１１０３０４－５０１１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは約１９，７３２バイトである。
機能性非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、エピジェネティックマーク、例えばＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、ヌクレオソームの位置決め、及びヒストン変異体のヌクレオソームへの組み込みによって形作られるクロマチン構造の必須構成要素である。このような重要性にもかかわらず、ｎｃＲＮＡの生物学については多くの疑問が残されている。
異常なエピジェネティックな特色は、がん及びその他の遺伝性疾患などの有害な状態に関連している。しかしながら、不活性なエピジェネティックマークに対する活性なエピジェネティックマーク、及びそれらが有害な状態にどのように影響を与えるのかについては、ほとんど知られていない。
効果的な療法を可能にするために必要なのは、ｎｃＲＮＡ及びエピジェネティックな調節についてのより完全な理解である。
したがって、本開示は、複数の態様において、がんの治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）の阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含み、がんが、エピジェネティックな調節不全によって特徴付けられる方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、がんの発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含み、対象が、エピジェネティックな調節不全を含む前がん状態によって特徴付けられる方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、がんまたは前がん細胞における活性なヒストンマークの形成をリセットするための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、遺伝的疾患または障害によって特徴付けられる細胞において未病状態に関連する複製起点複合体を回復させるための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む方法を提供する。
上記の態様のいずれかにおいて、阻害剤は、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、遺伝子の上方制御である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、遺伝子の下方制御である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、未処理の状態と比較したときの１つ以上の遺伝子のレベルの回復である。いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子は、がん遺伝子またはがん原遺伝子である。いくつかの実施形態において、遺伝子はｍｙｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ｍｙｃ遺伝子は、ｃ‐ＭＹＣ（ＭＹＣ）、ｌ‐ｍｙｃ（ＭＹＣＬ）、及びｎ‐ｍｙｃ（ＭＹＣＮ）から選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、人工複製起点複合体を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製の方向を制御する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、（ｉ）複製の有害な方向の進行を遅らせるかもしくは複製の有害な方向を防止し、複製の反対方向を活性化し、及び／または（ｉｉ）トリヌクレオチドリピートの部位を調節し、場合によりトリヌクレオチドリピートのサイズを低減させるかもしくは発現を逆転させる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤がトリプレット病（「ＴＲＤ」）を治療または予防する。いくつかの実施形態において、ＴＲＤは、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ‐Ｅ症候群、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症、運動障害、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、または自閉症である。いくつかの実施形態において、ＴＲＤは、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病及び／または非ポリグルタミン病である。いくつかの実施形態において、ポリグルタミン病は、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症またはケネディ病）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、またはＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）である。いくつかの実施形態において、非ポリグルタミン病は、ＦＸＳ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、及び早発卵巣不全（ＰＯＦ）である。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤は、トリヌクレオチドリピートの拡大を逆転させることによってＴＲＤを治療または予防する。
いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートは、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、及びＧＡＡから選択される。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲに関連するエピジェネティックマークの活性を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、エピジェネティックマークの形成及び／または再利用を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、遺伝子の活性化を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、遺伝子の活性化を引き起こす。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びヌクレオソームリモデリングのうちの１つ以上を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲによって制御される病原性ヌクレオチド拡大の調節を引き起こす。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲと１つ以上のヒストンまたはヒストン関連タンパク質との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４タンパク質、またはそれらの変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ２Ａ．Ｚまたはその変異体、及びＨ３．３またはその変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ＴＩＰ６０またはその変異体である。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲとＯＲＣの１つ以上の構成成分との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ＯＲＣの１つ以上の構成成分は、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、及びＯＲＣ５、またはそれらの変異体のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、１つ以上のエピジェネティックマークの調節不全である。
いくつかの実施形態において、１つ以上のエピジェネティックマークのエピジェネティックな調節不全は、未病状態と比較したときの付加的なエピジェネティックマークの活性化、及び／または未病状態と比較したときのエピジェネティックマークの不活性化を含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、改変された複製起点である。いくつかの実施形態において、改変された複製起点は、未病状態と比較したときの付加的な複製起点の活性化、及び／または未病状態と比較したときの複製起点の不活性化を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、エピジェネティックな調節不全に関連するがんに罹患している。
いくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、がんは血液癌である。
いくつかの実施形態において、がんは、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫、肝癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓もしくは腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、子宮もしくは子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む）、ならびに他の癌腫及び肉腫、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫に関連する異常な血管増殖、及びメグズ症候群のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２００ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、１つ以上のステムループ様構造を含む。
いくつかの実施形態において、阻害剤は小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は核酸である。いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲの一部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。
いくつかの実施形態において、阻害剤の１つ以上のヌクレオチドは化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、化学的修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アルキル‐ＲＮＡ単位、２’‐ＯＭｅ‐ＲＮＡ単位、２’‐アミノ‐ＤＮＡ単位、２’‐フルオロ‐ＤＮＡ単位、ペプチド核酸（ＰＮＡ）単位、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）単位、ＩＮＡ単位、及び２’‐Ｏ‐（２－メトキシエチル）‐ＲＮＡ（２’ＭＯＥ ＲＮＡ）単位から選択される。
いくつかの実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲの発現及び／または活性を調節する。
いくつかの実施形態において、対象由来の細胞は、生物学的試料に由来する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、生検材料、組織、または体液を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍細胞、培養細胞、幹細胞、及び分化細胞のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、１つ以上のエピジェネティック薬を投与するか、または細胞を１つ以上のエピジェネティック薬と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティック薬は、アザシチジン、エシタビン、ゼブラリン、パノビノスタット、ベリノスタット、ダシノスタット、キシノスタット、テフィノスタット、アセジナリン、エンチノスタット、モセチノスタット、チダミド、酪酸、ピバネクス、フェニル酪酸、及びバルプロ酸から場合により選択される、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、エピジェネティック薬は、ボリノスタット、ロミデプシン、トリコスタチンＡ、及びトラポキシンＡから場合により選択される、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
複数の態様において、本開示は、エピジェネティック調節剤を作製する方法であって、（ａ）エピジェネティック調節剤を、以下によって特定すること：（ｉ）該薬剤が、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用するかどうかを決定すること；（ｉｉ）該薬剤を、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用する能力に基づいてエピジェネティック調節するとして分類すること；及び（ｂ）エピジェネティックな調節不全に関連するがんまたはエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害の治療または予防から選択される療法における使用のために該薬剤を製剤化すること、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、該薬剤は、ＳＰＥＡＲに関連するエピジェネティックマークの活性を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、該薬剤は、エピジェネティックマークの形成及び／または再利用を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、該薬剤は、遺伝子の活性化を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、該薬剤は、遺伝子の活性化を引き起こす。いくつかの実施形態において、該薬剤は、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びヌクレオソームリモデリングのうちの１つ以上を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化である。いくつかの実施形態において、該薬剤は、ＳＰＥＡＲによって制御される病原性ヌクレオチド拡大の調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、該薬剤は、ＳＰＥＡＲと１つ以上のヒストンまたはヒストン関連タンパク質との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４タンパク質、またはそれらの変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ２Ａ．Ｚまたはその変異体、及びＨ３．３またはその変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ＴＩＰ６０またはその変異体である。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、１つ以上のエピジェネティックマークの調節不全である。いくつかの実施形態において、１つ以上のエピジェネティックマークのエピジェネティックな調節不全は、未病状態と比較したときの付加的なエピジェネティックマークの活性化、及び／または未病状態と比較したときのエピジェネティックマークの不活性化を含む。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、改変された複製起点である。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２００ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、１つ以上のステムループ様構造を含む。
いくつかの実施形態において、該薬剤は小分子を含む。いくつかの実施形態において、小分子は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。
いくつかの実施形態において、該薬剤は核酸を含む。いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲの一部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。
いくつかの実施形態において、該薬剤の１つ以上のヌクレオチドは化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、化学的修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アルキル‐ＲＮＡ単位、２’‐ＯＭｅ‐ＲＮＡ単位、２’‐アミノ‐ＤＮＡ単位、２’‐フルオロ‐ＤＮＡ単位、ペプチド核酸（ＰＮＡ）単位、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）単位、ＩＮＡ単位、及び２’‐Ｏ‐（２－メトキシエチル）‐ＲＮＡ（２’ＭＯＥ ＲＮＡ）単位から選択される。
いくつかの実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、該薬剤は、ＳＰＥＡＲの発現及び／または活性を調節することが可能である。
複数の態様において、本開示は、エピジェネティック調節療法に対する対象の応答を評価するための方法であって、対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することを含み、（ｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが低減していることが、療法に対する応答を示し、及び／または（ｉｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが増加しているかもしくは実質的に変化していないことが、療法に対して応答がないかもしくは乏しいことを示す方法を提供する。
複数の態様において、本開示は、エピジェネティック調節療法に対する対象の応答の可能性を予測するための方法であって、対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することを含み、（ｉ）ＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが高いことが、療法に対する応答の可能性の高さを示し、及び／または（ｉｉ）ＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが低いことが、療法に対する応答の可能性の低さを示す、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２００ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、１つ以上のステムループ様構造を含む。
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、生検材料、組織、または体液を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍細胞、培養細胞、幹細胞、及び分化細胞のうちの１つ以上を含む。
本開示の１つ以上の実施例の詳細は、以降の説明において記述される。本開示の他の特徴または利点は、以下の図面、いくつかの実施例の詳細な説明、及びまた添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。本開示の詳細は、以降の不随の説明に記述される。本明細書に記載のものと同様または等価な方法及び材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料がここに記載される。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、別途文脈が明示的に示さない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
ＣＥＢＰＡ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを特徴付けるグラフ及び画像を示す。上側パネルは、ＣＥＢＰＡ遺伝子座の図を示す。下側パネル：ダブルチミジンブロックからリリースされた直後のコード（ｍＲＮＡ）、ｅｃＣＥＢＰＡ（ＤＮＭＴ１－相互作用）、及びＵｐＴｒ（ＳＰＥＡＲ）転写物のレベルを示す。ＣＥＢＰＡ ＳＰＥＡＲ（ＵｐＴｒ）の誘導は、ｅｃＣＥＢＰＡ及びＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡの発現に先行し、それらの発現を上回った（ｑＲＴ‐ＰＣＲ；バーは平均±ｓ．ｄ．を示す）。 ＣＥＢＰＡ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを特徴付けるグラフを示す。新生ＲＮＡ（ｎａｓＲＮＡ）のゲノムワイドなアライメントを示すグラフである。ＳＰＥＡＲ特異的ピークがＨＬ‐６０全ＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリーにおいて特定された転写エレメントと重なっていることを示す二元のベン図である。 ＣＥＢＰＡ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを特徴付けるグラフを示す。ＳＰＥＡＲのレベルとそれらのそれぞれのコード遺伝子の転写状態との相関を示すグラフである。バイオリン図は、グローバルな遺伝子発現レベル（ＨＬ‐６０全ＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリー）に従って４つの別個の群にランク付けした（非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８；高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８；中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４、低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）ＳＰＥＡＲ発現（ＨＬ‐６０ ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリー）の分布を示す。異なるＳＰＥＡＲ発現群間の統計的有意差は、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定によってコンピュータ処理した（＊＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１）。 ＣＥＢＰＡ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを特徴付けるグラフを示す。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座のスナップショットを示す画像である。別の遺伝子座の例として図８ＤのＰＵ．１参照。 ＣＥＢＰＡ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを特徴付けるグラフ及び画像を示す。ダブルチミジンブロックからリリースされた直後のｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのレベルを示す図及びグラフである。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの誘導は、ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡに先行し、過剰発現した（ｑＲＴ‐ＰＣＲ；バーは平均±ｓ．ｄ．を示す）。 ＳＰＥＡＲとＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との相互作用のグラフを示す。抗Ｈ２Ａ．Ｚ、抗ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及び抗ＴＩＰ６０抗体で免疫沈降させたｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを示すグラフである（ｑＲＴ‐ＰＣＲ、バーは平均＋／－ｓ．ｄ．を示す）。 ＳＰＥＡＲとＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との相互作用のグラフを示す。ゲノム全体のコーディング領域の境界でのａｃＨ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０のエンリッチメントについてのＲＩＰ‐Ｓｅｑピーク強度ヒストグラムを示すグラフである。アライメントされたＲＩＰ‐Ｓｅｑタグの密度は、塩基対当たりで正規化され、ゲノム内の全ての遺伝子で平均化される。 ＳＰＥＡＲとＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との相互作用のグラフを示す。ＳＰＥＡＲを産生する遺伝子座がＴＩＰ６０／Ｈ２Ａ．Ｚ（２０％）及びＴＩＰ６０／ａｃＨ２Ａ．Ｚ（３２％）データセットと重なることを示すグラフである。ベン図は、全ＳＰＥＡＲと、Ｈ２Ａ．Ｚ（上側パネル）、ａｃＨ２Ａ．Ｚ（下側パネル）、及びＴＩＰ６０が有意にエンリッチされたその対応する遺伝子座のピークとの重なりを示す。４つ全てのＳＰＥＡＲ発現群からの遺伝子（淡黄色の円）は、Ｈ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚ（緑色の円）、ＴＩＰ６０（青色の円）、データセットと交差する。Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０のピークと個々のＳＰＥＡＲ発現群との重なりを示すベン図は、図９Ｂ及び図９Ｃに示す。 ＳＰＥＡＲとＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との相互作用のグラフを示す。活性遺伝子のＴＳＳの境界での、グローバルな遺伝子発現（ＨＬ‐６０、全ＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリー）、ＳＰＥＡＲ発現（ＨＬ‐６０、ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリー）、及びａｃＨ２Ａ．Ｚピーク強度の間の相関の散布図を示す。遺伝子のＴＳＳの境界でのａｃＨ２Ａ．Ｚのピークの強度及び数が、各ＳＰＥＡＲ発現群内の遺伝子の発現に対してプロットされる（非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８、高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８、中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４、低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）。 ＳＰＥＡＲ共通結合モチーフを特定する画像を示す。Ａは、ＳＰＥＡＲモチーフ発見パイプラインの概略的フローチャートを示す。Ｂは、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ内の共通結合モチーフ「９」（ＲＮＡオリゴヌクレオチドＲＭ９Ａ）、無関係なＲＮＡオリゴヌクレオチドＵＲ１、ＵＲ２、及びＵＲ３、ならびに対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す。 ＳＰＥＡＲ共通結合モチーフを特定するグラフを示す。Ｃは、ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のＲＩＰ‐Ｓｅｑが重なるピーク領域におけるＲＭ９Ａモチーフの分布を示す。配列ロゴ、有意性、及びエンリッチメント率（％）が示される。Ｄは、左側パネルでは、特定されたＲＭ９Ａ結合モチーフを持つｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲがヒストンＨ２Ａ．Ｚと複合体を形成することを示す。右側パネルでは、同じであるが、Ｈ２Ａ．ＺのＮ末端配列からのアセチル化ペプチドを使用している。 ＳＰＥＡＲ共通結合モチーフを特定するグラフを示す。Ｅは、特定されたＲＭ９Ａ結合モチーフを持つｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲは、ＴＩＰ６０タンパク質と複合体を形成するが、上流のＲＮＡ及びＤＮＡモチーフはそうではないことを示す。ＲＮＡプローブ及びＤＮＡプローブは両方とも同じモル濃度で使用した。これは、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドのカウント／分が２倍になることに相当する。Ｆは、特定された結合モチーフを持つｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲが、一次配列要件に加えて、ステムループ構造に折り畳まれなければならないことを示す画像である。ＲＮＡ二次構造は、ＲＮＡｆｏｌｄで予測した。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示す画像である。ダブルチミジンブロックによるＨＬ‐６０細胞の同調、それに続くＲＮＡポリメラーゼ阻害剤での処理を示す概略図である。ブロックからのリリース時に、細胞を０．０５％ＤＭＳＯ（対照）；ＡｃｔＤ、０．８μΜ；及びＤＲＢ、２００μΜで処理した。細胞には、下流のＣｌｉｃｋ‐ｉＴ変換のためにＥＵ類似体も加えた。２時間後、細胞をＦｉｃｏｌｌで処理し、架橋されたクロマチン及びＲＮＡを収集した。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示すグラフである。転写阻害剤ＤＲＢ（淡青色）及びＡｃｔＤ（淡赤色）で処理した細胞ならびにＤＭＳＯ処理した対照（緑色）から得られた、遺伝子発現とａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ強度との相関を強調する、散乱分布グラフを示す。上側のサブプロットには、遺伝子発現とは無関係の、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑタグカウントの密度を示す。右端のサブプロットには、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑタグカウントとは無関係の、遺伝子発現プロファイルの密度を示す。これらのデータは、ａｃＨ２Ａ．Ｚと遺伝子発現との間の因果関係を含意している。何故なら、転写阻害剤で処置すると、ａｃＨ２Ａ．Ｚシグナルの有意な低減、及び密度プロファイルの値の低い方へのシフトを引き起こすからである。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示すグラフである。ＤＲＢ及びＡｃｔＤでの処理後の、遺伝子のＴＳＳ遺伝子座周辺（±２ｋｂ）のＨ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナルのエンリッチメントの比較を示す。エンリッチメントは、全ての遺伝子のＴＳＳ周辺の曲線下の面積として計算し、双曲線逆正弦関数を使用して変換した。これによって、ＤＲＢ及びＡｃｔＤ試料に対する対照（ＤＭＳＯ）試料のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ占有率をＤＲＢ及びＡｃｔＤ試料に対して比較することが可能になった。それを、色勾配を有する散布図として示す。これらの散布図では、各ドットが個々のＴＳＳを表す。高濃度のＴＳＳを有する領域は赤色で現れ、その一方で青色はＴＳＳが存在しないことを表す。プロット上のスケールが異なるのは、Ｈ２Ａ．Ｚ抗体及びａｃＨ２Ａ．Ｚ抗体に固有の抗体特性が異なることを示している。エンリッチメントの変化が示されている。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示すグラフである。上側及び中央パネルは、ｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１遺伝子座のａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑのスナップショットであり、転写阻害剤の添加後に、全Ｈ２Ａ．Ｚと比較して、ａｃＨ２Ａ．Ｚのピークが大きく減少したことを実証している。完全なスナップショットは、図１０Ｄ及び図１０Ｅに示す。下側パネルは、ＭＹＢ遺伝子座を示す。これは、ＭＹＢ ＳＰＥＡＲがＡｃｔＤ及びＤＲＢの作用を免れたために、転写阻害剤の添加後にａｃＨ２Ａ．Ｚのピークの低減を示さない。完全なスナップショットは、図１０Ｄ及び図１０Ｅに示す。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座についてのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの結果のＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲ検証を示す。双方向矢印は、ｑＲＴ‐ＰＣＲアンプリコンの位置を示す。（ｑＲＴ‐ＰＣＲ、バーは平均±ｓ．ｄ．を示す）。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、連結遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をどのようにもたらすのかを示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１ ＳＰＥＡＲのＤＲＢ誘導下方制御が、ｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１遺伝子のＴＳＳでのＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０の占有率の減少をもたらすことを示す。ＨＬ‐６０細胞をリリースしてＳ期にし、ＤＲＢで２時間処理した（上記の通り）。培地にＥｄＵ ＤＮＡ類似体を補充して、新生ＤＮＡを収集できるようにした。クロマチンを収集して、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、ＴＩＰ６０、及びＩｇＧに対する抗体を用いてＣｈＩＰアッセイを行った。新生ＤＮＡを免疫沈降されたクロマチンから単離した（詳細については以降の「方法」及び図８Ａ参照）。単離した新生ＤＮＡを、ｑＰＣＲによって分析した（ｑＰＣＲ、バーは平均±ｓ．ｄ．を示す）。 ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御が、どのようにｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をもたらすかについてのグラフを示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのｓｉＲＮＡ媒介下方制御（約７５％）が、どのようにｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡの約７０％の下方制御をもたらすかを示すグラフである（ｑＲＴ‐ＰＣＲ、バーは平均±ｓ．ｄ．を示す）。 ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御が、どのようにｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をもたらすかについてのグラフを示す。左側パネルでは、ａｃＨ２Ａ．Ｚピークの減少を実証する、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座でのａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの結果のスナップショットを示す。右側パネルでは、ＰＵ．１遺伝子座は、ａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の有意な変化を示さなかった（陰性対照）。完全なスナップショットは、図１０Ｆ及び図１０Ｇに示す。 ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御が、どのようにｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率の減少をもたらすかについてのグラフを示す。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座についてのＲＮＡ干渉のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの結果のＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲ検証を示す。双方向矢印は、ｑＲＴ‐ＰＣＲアンプリコンの位置を示す。ｑＲＴ‐ＰＣＲ、バーは平均＋／－ｓ．ｄ．を示す。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺ経路を介してそれらが連結するｍＲＮＡの発現を制御するかを示すグラフである。ＴＩＰ６０／ＨＡＴ阻害剤に対する全ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡ及びＳＰＥＡＲの応答を示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡはＭＧ１４９及びＴＨ１８３４によって下方制御されるが、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲは影響を受けない。ＨＬ‐６０細胞をダブルチミジンブロックからリリースし、ＭＧ１４９（２００μΜ）及びＴＨ１８３４（５００μΜ）で２時間処理した。対照（モック）処理は、それぞれＤＭＳＯ（０．０５％）または水を補充した。ｑＲＴ‐ＰＣＲ及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲを使用して、ＳＰＥＡＲ及びｍＲＮＡを定量化した。バーは平均±ｓ．ｄ．を示す。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺ経路を介してそれらが連結するｍＲＮＡの発現を制御するかを示す画像である。実験デザインの概要を示す概略図である。ＨＬ‐６０細胞をリリースしてＳ期にし、ＤＭＳＯ／ＤＲＢで２時間処理した（図４Ａに記載の通り）。２時間後、ＤＲＢ処理した細胞を洗浄し、ＴＩＰ６０阻害剤の有り無しでさらに２時間インキュベートした。培地にＥｕ ＲＮＡ及びＥｄＵ ＤＮＡ類似体を補充して、新生ＲＮＡ／ＤＮＡを収集できるようにした。クロマチンを収集して、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、ＴＩＰ６０、及びＩｇＧに対する抗体を用いてＣｈＩＰアッセイを行った。新生ＤＮＡ及びＲＮＡを免疫沈降されたクロマチン及び全ＲＮＡからそれぞれ単離した（詳細については以降の「方法」及び図８Ａ参照）。単離された新生ＤＮＡ及びＲＮＡを、それぞれｑＰＣＲ及びｑＲＴ‐ＰＣＲ／鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺ経路を介してそれらが連結するｍＲＮＡの発現を制御するかを示すグラフである。ＴＩＰ６０／ＨＡＴ阻害剤に対する新生ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ及びｍＲＮＡの異なる応答のグラフを示す：ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡは下方制御されるが、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲは影響を受けない。定量化は、ｑＲＴ‐ＰＣＲ（ｍＲＮＡの場合）及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲ（ＳＰＥＡＲの場合）によって行った。バーは平均±ｓ．ｄ．を示す。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺ経路を介してそれらが連結するｍＲＮＡの発現を制御するかを示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座についての新生ＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲのグラフ（Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０に対する抗体を使用し、ＩｇＧ対照を有する）を示す。これらの実験によって、以下が実証される：（ｉ）ＤＲＢ処理すると（ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲが下方制御される）、ａｃＨ２Ａ．Ｚ（中央パネル）及びＴＩＰ６０（ＲＨパネル）が喪失し、Ｈ２Ａ．Ｚ（ＬＨパネル）が部分的に喪失する；（ｉｉ）ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを回復させると（ＤＲＢの逆転後）、Ｈ２Ａ．Ｚ、ＡＣ２Ｈ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０が再出現する；ならびに（ｉｉｉ）ＭＧ１４９及びＴＨ１８３４によってＴＩＰ６０の活性を阻害すると、ａｃＨ２Ａ．Ｚの回復は防止されるが、ＴＩＰ６０及びＨ２Ａ．Ｚの分布の回復はわずかな影響しか受けない。ｑＰＣＲによる定量化。バーは平均±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝２）。 ヒストンＨ２Ａ．Ｚ上で活性化しているエピジェネティックなアセチル化マークの確立についての非限定的なモデルを示す画像である（理論に縛られることを望むものではない）。初期Ｓ期の間、ＳＰＥＡＲは、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ及びアセチルトランスフェラーゼＴＩＰ６０の両方と相互作用する。Ｈ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０が物理的に近接すると、局所有効タンパク質濃度が高くなり、それはＨ２Ａ．Ｚのアセチル化及びヌクレオソーム内での標準的なＨ２Ａ形態との交換に有利に作用する。この活性なクロマチンコンフォメーションでは、ＲＮＡＰＩＩ複合体がその部位に結合し、遺伝子発現が開始される。 Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。ダブルチミジンブロックによるＨＬ‐６０細胞の同調を示す概略図である。ダブルチミジンブロックからのリリース時に、下流のＣｌｉｃｋ‐ｉＴ変換のために細胞にＥＵ類似体を加えた。１時間後に、全ＲＮＡ及び核ＲＮＡを収集した。ＲＮＡを製造業者の推奨に従って処理し、ＲＮＡ‐ｓｅｑライブラリーを生成し、シーケンシングし、分析した。 Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定するグラフを示す。４つの異なる発現群（非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８；高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８；中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４；低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）に属する遺伝子の遺伝子座におけるＳＰＥＡＲ発現のエンリッチメントプロットを示す。遺伝子をＨＬ‐６０の全ＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリーに従って４つの異なる発現群に分類し、ＨＬ‐６０のｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリーに従って測定したＳＰＥＡＲ発現を使用して、上流制御領域、遺伝子本体、及び非コード下流領域を網羅する領域におけるリードカウントエンリッチメントを計算した。 Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定するグラフを示す。４つの異なる発現群（非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８；高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８；中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４；低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）に属する遺伝子におけるＳＰＥＡＲ発現のエンリッチメントヒートマップを示す。ゲノム全体にわたる個々の遺伝子について、上流制御領域、遺伝子本体、及び下流非コード領域におけるＳＰＥＡＲ発現をプロットし、各遺伝子の遺伝子座内の異なるゲノム領域の相対的な位置的エンリッチメントを示す。 Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定するグラフを示す。それぞれのＳＰＥＡＲを示す、ＰＵ．１遺伝子の遺伝子座のスナップショットを示す。 Ｅは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座の転写物の図である。縦矢印はＴＳＳ及びＴＥＳを示し、破線矢印はプライマー伸長実験におけるプライマーの位置を示す。Ｆは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定するグラフを示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのコピー数を示すグラフである（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。 Ｇは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。プライマー伸長実験を示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲについてのプライマー伸長反応のラジオオートグラフを示しており；遺伝子座ＣＥＢＰＡ、ＣＴＣＦ、及びＰＵ．１に対応するＳＰＥＡＲについてのラジオオートグラフは示していない。黒い矢印は、最長の伸長産物を示す。破線の矢印は伸長反応の「強い停止」を示す（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。Ｈは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。５’３’Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（「ＲＡＣＥ」）を示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの「最長」アイソフォームは次の通りである：ＴＳＳがｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡのＴＳＳに対して－２１６０ｎｔにあり、ＴＥＳがｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡのＴＳＳに対して－３８ｎｔにある（濃い矢印で示されるヌクレオチド位置）。「より短い」アイソフォームのＴＳＳ及びＴＥＳは破線の矢印で示される（詳細については以降の「方法」参照）。 Ｇは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。プライマー伸長実験を示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲについてのプライマー伸長反応のラジオオートグラフを示しており；遺伝子座ＣＥＢＰＡ、ＣＴＣＦ、及びＰＵ．１に対応するＳＰＥＡＲについてのラジオオートグラフは示していない。黒い矢印は、最長の伸長産物を示す。破線の矢印は伸長反応の「強い停止」を示す（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。Ｈは、Ｓ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）を特定する画像を示す。５’３’Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（「ＲＡＣＥ」）を示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの「最長」アイソフォームは次の通りである：ＴＳＳがｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡのＴＳＳに対して－２１６０ｎｔにあり、ＴＥＳがｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡのＴＳＳに対して－３８ｎｔにある（濃い矢印で示されるヌクレオチド位置）。「より短い」アイソフォームのＴＳＳ及びＴＥＳは破線の矢印で示される（詳細については以降の「方法」参照）。 ＳＰＥＡＲ‐Ｈ２Ａ．Ｚ‐ａｃＨ２Ａ．Ｚ‐ＴＩＰ６０の相互作用を示す画像である。ビオチン化ＳＰＥＡＲプローブの生成及びＳＰＥＡＲ含有ＲＮＡ‐タンパク質複合体（ＳＰＥＡＲ‐ＲＮＰ）をプルダウンするために使用されるプロトコルを表す図である。収集された可溶性ＳＰＥＡＲ‐ＲＮＰを５％ＰＡＧＥで分離し、質量分析に供した（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。 ＳＰＥＡＲ‐Ｈ２Ａ．Ｚ‐ａｃＨ２Ａ．Ｚ‐ＴＩＰ６０の相互作用を示すグラフである。Ｈ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のＲＩＰ‐Ｓｅｑの分析を示すグラフである。プロモーター領域に有意なＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０ピークを含有する遺伝子セットと個々のＳＰＥＡＲ発現群との重なりのベン図である（各グラフの上側の円）。４つの発現群（Ａ群‐非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８、Ｂ群‐高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８、Ｃ群‐中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４：Ｄ群‐低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）に層別化した遺伝子データセットを、Ｈ２Ａ．Ｚマーク（右下側の円）、ＴＩＰ６０（左下側の円）、またはＴＩＰ６０及びＨ２Ａ．Ｚの両方のマークを有する遺伝子セットと交差させた。（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。 ＳＰＥＡＲ‐Ｈ２Ａ．Ｚ‐ａｃＨ２Ａ．Ｚ‐ＴＩＰ６０の相互作用を示すグラフである。ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のＲＩＰ‐Ｓｅｑの分析を示すグラフである。プロモーター領域に有意なａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０ピークを含有する遺伝子セットと個々のＳＰＥＡＲ発現群との重なりのベン図である（各グラフの上側の円）。４つの発現群（Ａ群‐非常に高い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＞８、Ｂ群‐高い：４＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜８、Ｃ群‐中程度：２＜ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜４：Ｄ群‐低い：ｌｏｇ２ＲＰＫＭ＜２）に層別化した遺伝子データセットを、ａｃＨ２Ａ．Ｚマーク（右下側の円）、ＴＩＰ６０（左下側の円）、またはＴＩＰ６０及びａｃＨ２Ａ．Ｚの両方のマークを有する遺伝子セットと交差させた。（実験の詳細は以降の「方法」で利用可能である）。 ＳＰＥＡＲの下方制御がそれぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示す画像である。ダブルチミジンブロックによるＨＬ‐６０細胞の同調、それに続くＲＮＡポリメラーゼ阻害剤での処理を示すパイロット実験の概略図である。ダブルチミジンブロックからのリリース時に、細胞を、ＤＭＳＯ；アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ；ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ阻害剤）、０．８μΜ；及び５，６‐ジクロロベンズイミダゾール１‐β‐Ｄ‐リボフラノシド阻害剤（ＤＲＢ；ＲＮＡＰＩＩ阻害剤）、２００μΜで処理した。細胞には、下流のＣｌｉｃｋ‐ｉＴ変換のために類似体ＥＵ及び／またはＥｄＵも加えた。異なる時点で細胞を収集し、全タンパク質をウエスタンブロット分析に供した。示しているのは、２時間の処理後に単離されたタンパク質でのブロットである。これらの実験から、Ｈ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０の全体的なグローバルな含有量は薬物処理によって影響を受けなかったことが明らかになった。 ＳＰＥＡＲの下方制御がそれぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ＤＲＢ及びＡｃｔＤ処理時のゲノムワイドな転写阻害を示す。図は、対照（ＤＭＳＯ）、ならびに転写阻害剤ＤＲＢ及びＡｃｔＤで処理した細胞における遺伝子発現の分布についてのバイオリン図を示す。遺伝子発現分布を比較すると、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定において、ＤＲＢ処理では対照に対する有意差が示され、ＡｃｔＤ処理では対照に対する大きな有意差が示される（ｐ＜０．０５）。分布間での遺伝子発現低減率は、ＤＲＢ／ＤＭＳＯ＝０，４５、及びＡｃｔＤ／ＤＭＳＯ＝０，２１である。ＤＲＢ及びＡｃｔＤ処理では、平均遺伝子発現低減は、それぞれ５５％及び７９％であった。 ＳＰＥＡＲの下方制御がそれぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ＤＲＢ及びＡｃｔＤ処理時の個々のＳＰＥＡＲ阻害を示す。ｃ‐ＭＹＣ、ＰＵ．１、及びＭＹＢ ＳＰＥＡＲに及ぼすＤＲＢ及びＡｃｔＤの作用のｑＲＴ‐ＰＣＲ定量化。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示す。ＤＲＢ及びＡｃｔＤ処理時の非修飾Ｈ２Ａ．ＺピークのＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの完全なスナップショットを示す。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示す。ＤＲＢ及びＡｃｔＤ処理時に、ａｃＨ２Ａ．Ｚピークの減少を実証する遺伝子の遺伝子座（遺伝子：ｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１）及びａｃＨ２Ａ．Ｚピークが変わらない遺伝子の遺伝子座（遺伝子：ＭＹＢ）のａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの完全なスナップショットを示す。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御が、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率を減少させ、Ｈ２Ａ．Ｚの占有率は減少させないことを示す。標的化（ｃ‐ＭＹＣ）遺伝子の遺伝子座及び非標的化（ＰＵ．１）遺伝子の遺伝子座のＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの完全なスナップショットを示しており、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのｓｉＲＮＡ誘導下方制御後にＨ２Ａ．Ｚピークが変化しないことを実証している。 ＳＰＥＡＲのグローバルな下方制御が、それぞれの遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率をどのように減少させるかを示すグラフである。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御が、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率を減少させ、Ｈ２Ａ．Ｚの占有率は減少させないことを示す。標的化（ｃ‐ＭＹＣ）遺伝子の遺伝子座のａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの完全なスナップショットを示しており、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのｓｉＲＮＡ誘導下方制御後にａｃＨ２Ａ．Ｚピークの減少を示しているが、非標的化遺伝子の遺伝子座（ＰＵ．１）では作用は観察されない。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御するのかを示す画像及びグラフである。２時間の処理後に単離されたタンパク質でのブロットのグラフである。ダブルチミジンブロックからのリリース時に、細胞を、ＤＭＳＯ；ＭＧ１４９、１００または２００μΜのいずれか；及びＴＨ１８３４、２５０または５００μΜで処理した。異なる時点で細胞を収集し、全タンパク質をウエスタンブロット分析に供した。ａｃＨ２Ａ．Ｚの低減は、２００μΜのＭＧ１４９及び５００μΜのＴＨ１８３４で観察された。バンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪを使用して得た；ａｃＨ２Ａ．Ｚのレベルは、Ｈ２Ａ．Ｚのレベルで正規化した。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御するのかを示す画像及びグラフである。ｃ‐ＭＹＣ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの下方制御（ＤＲＢ処理後）が、どのようにａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のエンリッチメントの喪失（「ＤＲＢ」バー）（中央及び右側パネル）、ならびにｃ‐ＭＹＣ及びｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの回復（ＤＲＢ逆転後）をもたらすのかを示している。ｑＲＴ‐ＰＣＲ及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲ；バーは平均＋／－ｓ．ｄ．を示す。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御するのかを示すグラフである。遺伝子砂漠の遺伝子座についての新生ＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲを示すグラフであり、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０についてのエンリッチメントのレベルの変化がないことを示している。ｑＰＣＲ、バーは平均＋／ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝２）。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御するのかを示すグラフである。ＴＩＰ６０／ＨＡＴ阻害剤に対する全ＰＵ．１ ＳＰＥＡＲ及びｍＲＮＡの異なる応答を示すグラフである：ＰＵ．１ ｍＲＮＡは下方制御されるが、ＰＵ．１ ＳＰＥＡＲは影響を受けない。ｑＲＴ‐ＰＣＲ及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲ；バーは平均＋／－ｓ．ｄ．を示す。 ＳＰＥＡＲが、どのようにＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御するのかを示すグラフである。ＰＵ．１遺伝子座についての新生ＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲを示しており、以下が実証される：（ｉ）ＰＵ．１ ＳＰＥＡＲを下方制御すると（ＤＲＢ処理後）、ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のエンリッチメントが喪失する（「ＤＲＢ」バー）（中央及び右側パネル）；（ｉｉ）ＰＵ．１ ＳＰＥＡＲを回復させると（ＤＲＢの逆転後）、ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のエンリッチメントが再出現する（「ＤＲＢ ＲＥＶ」バー）（中央及び右側パネル）；（ｉｉｉ）ＴＩＰ６０／ＨＡＴ活性を阻害すると（ＭＧ１４９及びＴＨ１８３４処理後）、ＴＩＰ６０エンリッチメントの回復に影響を及ぼすことなく、ａｃＨ２Ａ．Ｚエンリッチメントの回復が防止される（ＴＨ１８３４及びＭＧ１４９バー）（中央及び右側パネル）；ｑＰＣＲ、バーは平均＋／ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝２）。 ＳＰＥＡＲ様転写の誘導がどのようにトリヌクレオチドリピートのサイズに影響を及ぼすかを示す画像である。Ａにおいて、（理論に拘束されることを望むものではないが）非限定的な例として、試料＃１は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の対象から単離された線維芽細胞からＭｙｏＤ生成した「筋細胞」のモデルを指し、これは、理論に拘束されることを望むものではないが、ＤＭＰＫ遺伝子座内で双方向転写の誘導をもたらす。試料＃２は、ＤＭ１対象から単離された未処理の繊維芽細胞を指す。Ｂ及びＣは、どのようにゲノムＤＮＡを試料＃１及び試料２から抽出し、ＰＣＲを行ったかを示す。プライマー対はＣＴＧｎリピート領域を挟む。Ｃは、ＰＣＲバンドの解釈を示す。試料＃２は、野生型ＤＭＰＫ対立遺伝子が１５０ヌクレオチド（ｎｔ）のバンド（黒点／黒矢印）を生成し、突然変異体ＤＭＰＫ対立遺伝子が４５０ｎｔのバンド（赤点／赤矢印）を生成する様子を示している。試料＃１では、試料＃２に見られるような同様のバンドが存在するが、突然変異ＤＭＰＫ対立遺伝子が約８００ｎｔ（拡大された突然変異対立遺伝子；青色矢印）及び約３５０ｎｔ（縮小された突然変異対立遺伝子；紫色矢印）のバンドを生成するため、４５０ｎｔに追加のバンドが存在する。Ｄは、Ｃに示されるＣＴＧｎを持つＰＣＲバンドのサンガー・シーケンシングを示す。
本開示以前には、活性遺伝子の遺伝子制御領域にエピジェネティック修飾が確立される機構は不明なままであった。本開示は、とりわけ、主要なエピジェネティックマークであるアセチル化形態の置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚの確立が、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域でコードされる細胞周期特異的な長鎖非コードＲＮＡによって制御されることを実証する。ＳＰＥＡＲ（Ｓ Ｐｈａｓｅ ＥＡｒｌｙ ＲＮＡ（Ｓ期初期ＲＮＡ））と呼ばれるこれらの転写物は初期Ｓ期に誘導され、それらの発現は、それらがその制御作用を及ぼす下流遺伝子の発現に先行する。ＳＰＥＡＲは、置換ヒストンとヒストンアセチルトランスフェラーゼＴＩＰ６０とを引き合わせることによって、アセチル化形態のヒストンＨ２Ａ．Ｚの修飾及び積み込みのための準備を整える。本明細書に開示されるように、この広範な二方式の相互作用によって、エピジェネティックマーク及び細胞特異的なエピジェネティックプロファイルの確立のための新規なＲＮＡ媒介機構が構成され、クロマチン上のエピジェネティックマークの正確さ及び持続性についての統一的な機構的説明がもたらされる。
本開示は、がんの治療を、それを必要とする対象において行うことに関連する組成物及び方法の発見に部分的に基づいており、それは、（ｉ）有効量の１つ以上のＳ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）の阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、がんは、エピジェネティックな調節不全によって特徴付けられる。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるのは、がんの発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含み、対象が、エピジェネティックな調節不全を含む前がん状態によって特徴付けられる方法である。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるのは、エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む方法である。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるのは、エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む方法である。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるのは、がんまたは前がん細胞における活性なヒストンマークの形成をリセットするための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む方法である。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるのは、遺伝的疾患または障害によって特徴付けられる細胞において未病状態に関連する複製起点複合体を回復させるための方法であって、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む方法である。例えば、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲ、または１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すると、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルを回復させることによって、複製起点複合体の複製能力を回復させることによって、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ３．３、またはそれらの変異体）を再出現させることによって、遺伝性疾患または障害によって特徴付けられる細胞における未病状態に関連する複製起点複合体を回復させる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製起点複合体を回復させる。いくつかの実施形態において、本方法は、対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲまたは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含み、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲを投与することによって、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ３．３、またはそれらの変異体）を再出現させることによって、複製起点複合体を回復させる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製起点複合体を回復させるか、または人口複製起点複合体を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製の方向を制御する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、（ｉ）複製の有害な方向の進行を遅らせるかもしくは複製の有害な方向を防止し、複製の反対方向を活性化し、及び／または（ｉｉ）トリヌクレオチドリピートの部位を調節し、場合によりトリヌクレオチドリピートのサイズを低減させるかもしくは発現を逆転させる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、複製及び修復の間に生じるトリヌクレオチドリピート（「ＴＮＲ」、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、及びＧＡＡが含まれる）の拡大を逆転させることによって、トリプレット病（「ＴＲＤ」；例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症、運動障害、自閉症）を治療または予防する。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質に対する抗体を用いるＣｈＩＰアッセイ、ならびにＰＣＲ及びｑＲＴ‐ＰＣＲは、遺伝性疾患または障害によって特徴付けられる細胞における未病状態に関連する複製起点複合体の回復を検出する（例えば、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルの測定及び定量化、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質の再出現による）。いくつかの実施形態において、ｑＲＴ‐ＰＣＲ及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲアッセイは、遺伝性疾患または障害によって特徴付けられる細胞における未病状態に関連する複製起点複合体の回復を検出する（例えば、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルの測定及び定量化、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質の再出現による）。
いくつかの実施形態において、初期Ｓ期の間に、主要な「活性な」エピジェネティックマークの形成が、活発に転写される遺伝子のプロモーターに隣接してコードされる「ＳＰＥＡＲ」と呼ばれる細胞周期特異的非コードＲＮＡ（「ｎｃＲＮＡ」）の作用によって駆動される。いくつかの実施形態において、局所的に誘導されるＳＰＥＡＲは、置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚ及び核内因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＴＩＰ６０に結合し、置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚの積み込み／アセチル化をもたらす。この活性なクロマチンコンフォメーションでは、ＲＮＡＰＩＩ複合体がその部位に結合し、遺伝子発現が開始される。
様々な実施形態において、シーケンシングアッセイは、活発に転写される遺伝子のプロモーターに隣接してコードされるＳＰＥＡＲを特定する。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲを特定するために、高スループットシーケンシングアッセイにおいて新生ＲＮＡを捕捉し、シーケンシングして（例えば、ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑ）、例えば、ＲＮＡ‐Ｓｅｑリードをゲノムにマッピングするか、またはリードをコンティグにｄｅ ｎｏｖｏでアセンブルし、続いてコンティグをトランスクリプトームにマッピングすることによって転写物を特定する。ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑでは、細胞を最初に同調させ、Ｓ期へのリリース時に１時間標識する。次いで収集したＲＮＡをクリックケミストリーによってビオチン化し、続いてストレプトアビジンビーズで単離し、ディープシーケンシングしてｎａｓＲＮＡライブラリーを生成する。ＳＰＥＡＲは、遺伝子発現レベルをコード遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）に近い転写物と相関させることによって特定される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、遺伝子発現のエピジェネティックな制御の変化または改変である。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、細胞のＤＮＡへのエピジェネティックマーク（例えば、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化などのヒストン修飾）の変化または改変である。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、遺伝子の発現またはサイレンシングをもたらす。いくつかの実施形態において、エピジェネティックマークは、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択されるヒストン修飾である。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化である。
遺伝子発現の２つの要素には、典型的には、ＤＮＡメチル化及びクロマチン修飾が含まれる。ＤＮＡメチル化は、シトシン塩基の５炭素へのメチル基の付加によって遺伝子活性を下方制御する可逆的なプロセスであるが、クロマチン修飾はいくつかの機構によって実施され、関連遺伝子の上方制御または下方制御のいずれかをもたらす。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化の変化を評価するために、ＤＮＡメチル化の変化をアッセイするためのバイサルファイト修飾またはバイサルファイトシーケンシング（例えば、ＤＮＡシーケンシング、一塩基プライマー伸長、及び／またはメチル化感受性プライマー（ＭＳＰ）の使用による）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、がんにおけるエピジェネティックな調節不全についてアッセイするために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを使用してエピジェネティックな変化、ならびにヒストンのエピジェネティック修飾の作用について評価する（例えば、ネイティブＣｈＩＰ（ｎＣｈＩＰ）、リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＣｈＩＰ）、ＤＮＡメチル化ＣｈＩＰ（ＣｈＩＰ‐ＭＳＰ）。いくつかの実施形態において、ＣｈＩＰアッセイは、ＣｈＩＰシーケンシング（ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ）であり、これは、ＤＮＡ結合タンパク質、ヒストン修飾、またはヌクレオソームを含めたエピジェネティックマークを特定するために、ＣｈＩＰとＤＮＡシーケシングとを組み合わせたものである。いくつかの実施形態において、ＣｈＩＰアッセイは、エピジェネティックマーク及び遺伝子発現レベルを特定するために、ｎａｓＣｈＩＰ及び／またはＲＮＡｉと組み合わされる。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、ＤＮアーゼＩ高感受性法を使用して評価される。ＤＮアーゼＩ高感受性部位は、典型的には、プロモーター領域内またはその周囲に位置し、それによって転写活性対不活性クロマチンのマッピングが可能になる。様々な実施形態において、ＤＮＡメチル化及びクロマチン修飾は、例えば、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；３８（２）：１７９－１８３、またはＧｕｌ，Ｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｇｅｎｅｔ ９，４１（２０１７）（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなアッセイを使用して評価される。
本明細書に開示されるように、ヒストンは、がんにおいて改変されている。例えば、がん細胞は一般に、リジン１６のアセチル化及びリジン２０のメチル化の喪失を示す。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、正常細胞または健常細胞と比較した、がん細胞または前がん細胞における、ＣｈＩＰアッセイからのヒストンアセチル化及びメチル化の遺伝子座での局所的変化またはゲノムのグローバルな変化である。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、がんを特徴付ける。いくつかの実施形態において、ＣｈＩＰアッセイ（例えば、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ）からのヒストンアセチル化及びメチル化の変化は、対象におけるがんの治療のアウトカムを予測するために、またはエピジェネティック調節療法に対する対象の応答の可能性を予測するために使用される。
いくつかの実施形態において、がんからのゲノム配列におけるエピジェネティックな調節不全を評価するためのＣｈＩＰアッセイが本明細書に開示される。ＣｈＩＰアッセイは、典型的には、（１）分析しようとするクロマチンの細胞からの単離；（２）抗体を使用したクロマチンの免疫沈降；及び（３）ＤＮＡ分析を含むプロセスを指す。ＣｈＩＰアッセイでは、生細胞内でＤＮＡをパッケージするＤＮＡ‐タンパク質複合体の断片（すなわち、クロマチン）を、各生細胞を特徴付ける特異的なＤＮＡ‐タンパク質相互作用を保持するように調製する。これらのクロマチン（すなわち、タンパク質‐ＤＮＡ複合体）断片を、次いで問題とするタンパク質に対する抗体を使用して免疫沈降させることができる。次いで単離されたクロマチン画分を処理してＤＮＡ構成成分及びタンパク質構成成分を分離することができ、次いで特定のタンパク質（すなわち、免疫沈降に使用される抗体が向けられたタンパク質）に関連して単離されたＤＮＡ断片の同一性を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または規定された配列のＤＮＡ断片の特定に使用される他の技術によって決定することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈＩＰアッセイは、関心対象の任意の細胞型のゲノムの任意の遺伝子または領域の任意の種類のエピジェネティック修飾をアッセイするために使用される。試料中のＤＮＡの修飾によって引き起こされ得るエピジェネティックマークの例として、ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、及びＤＮＡメチル化が挙げられる。いくつかの実施形態において、エピジェネティックマークは、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択されるヒストン修飾である。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化である。
したがって、例えば、免疫沈降工程で使用される抗体は、転写因子などの非ヒストンタンパク質または他のＤＮＡ結合タンパク質に免疫特異的であってもよい。例えば、抗体は、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４、ならびにそれらの様々な翻訳後修飾されたアイソフォーム及び変異体（例えばＨ２Ａ．Ｚ）のいずれかに免疫特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４タンパク質、またはそれらの変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、Ｈ２Ａ．Ｚまたはその変異体、及びＨ３．３またはその変異体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒストンアセチラーゼもしくはデアセチラーゼまたはＤＮＡメチルトランスフェラーゼなど、クロマチンの修飾に関与する酵素に対して免疫特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ＴＩＰ６０またはその変異体である。さらに、ヒストンは、規定された酵素によって、例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ＡＤＰ‐リボシル化、ＳＵＭＯ化、及びユビキチン化によって、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後修飾されていてもよい。したがって、抗体は、これらの翻訳後修飾のいずれかに免疫特異的であってもよい。
免疫沈降工程に続いて、本方法は一般に、単離されたタンパク質／ＤＮＡ画分からＤＮＡを精製する工程を含む。これは、例えば、フェノール‐クロロホルム抽出の標準的技法によって、または当業者に公知の任意の他の精製方法によって達成されてもよい。
精製工程に続いて、タンパク質に関連して単離されたＤＮＡ断片をＰＣＲによって分析する。例えば、分析工程は、ＰＣＲ中にある長さの核酸の増幅をもたらすことになる適切なプライマーの使用を含んでもよい。当業者であれば、本発明による方法を適用して、特異的ＰＣＲプライマーが調製された、ゲノムの任意の遺伝子または任意の領域のエピジェネティック修飾を分析することができることを理解するであろう。例えば、ＣｈＩＰアッセイは、ホルムアルデヒドを使用してＤＮＡとタンパク質とを架橋し、続いてＤＮＡ‐タンパク質複合体を免疫沈降させる。架橋を逆転させた後、回収されたＤＮＡを、次いで例えばＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによって分析して、特定のタンパク質に結合するＤＮＡの量を測定することができる。いくつかの実施形態において、ＣｈＩＰアッセイは、分析用クロマチンを調製するために、ホルムアルデヒドの代わりに小球菌ヌクレアーゼ消化を使用する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化の変化を評価するために、ＤＮＡメチル化の変化をアッセイするためのバイサルファイト修飾またはバイサルファイトシーケンシングが本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、ＤＮアーゼＩ高感受性法を使用して評価される。ＤＮアーゼＩ高感受性部位は、典型的には、プロモーター領域内またはその周囲に位置し、それによって転写活性対不活性クロマチンのマッピングが可能になる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化におけるエピジェネティックな調節不全は、ＤＮＡのバイサルファイト修飾によって評価される。バイサルファイト修飾は、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、これは次いでＰＣＲによるＤＮＡ増幅中にチミンに変換されるのに対して、メチル化シトシンはバイサルファイト修飾から保護される。いくつかの実施形態において、バイサルファイトシーケンシングを使用してバイサルファイト処理されたＤＮＡを分析し、包括的な「メチローム」（例えば、ゲノムにおけるメチル化ＤＮＡのパターン）マップを生成する。本明細書に開示されるように、バイサルファイト修飾ＤＮＡのシーケンシング分析によって、特定のシトシンのメチル化状態が明らかになる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバイサルファイト修飾とＣｈＩＰアッセイとを組み合わせることによって、１つの生物学的試料からメチル化状態及びクロマチン構造を評価することが可能になる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含むことによって、対象におけるエピジェネティックな調節不全によって特徴付けられるがんを治療し、及び／または対象におけるエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害を治療する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含むことによって、がんの発症または進行を予防し、ここで、対象は、エピジェネティックな調節不全を含む前がん状態によって特徴付けられる。
非限定的な例として、対象におけるがんの発症の予防、存在、及び／または進行の評価は、Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｄｅｓ／Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ（ＴＮＭ）分類システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２）、またはＷｈｉｔｍｏｒｅ－Ｊｅｗｅｔｔ病期分類システム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に従って評価することができる。典型的には、がんは、身体検査、血液検査、及び医用画像の組み合わせを使用して病期分類される。腫瘍組織が生検または手術によって得られるならば、顕微鏡下での組織の検査も病理学的病期分類を提供し得る。いくつかの実施形態において、がんの病期または悪性度は、がんの予後を決定し、適切なエピジェネティック修飾療法を選択する上で医師を支援する。
いくつかの実施形態において、がんの発症または進行の予防は、全病期分類を使用して評価され、非限定的な例は次の通りである：ステージＩのがんは、身体の一部、典型的には小さな領域に限局している；ステージＩＩのがんは、局所的に進行しており、ステージＩＩＩのがんと同様に、近くの組織またはリンパ節中に増殖している。がんがステージＩＩまたはステージＩＩＩのどちらに指定されるかは、がんの特定の種類に依存し得る。ステージＩＩ及びＩＩＩの具体的な基準は、診断によって異なる場合がある。ステージＩＶのがんは、多くの場合、転移しているか、または他の臓器もしくは全身に広がっている。がんの発症または進行は、当業者に利用可能な従来の方法、例えば、身体検査、血液検査、及び画像スキャン（例えば、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、超音波など）を使用して評価することができる。
本明細書に開示されるように、投与すること、または治療／療法を投与することは、対象が、がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害、またはそれらの症状の進展または進行の低減、減少、減弱、逓減、安定化、寛解、抑制、阻害、もしくは停止などの有益効果を受ける治療／療法を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、それを必要とする対象におけるエピジェネティックな調節不全によって特徴付けられるがんの発症もしくは進行、及び／またはエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害の発症もしくは進行を防止する。
いくつかの実施形態において、対象が受ける治療／療法、またはがん及び／または遺伝性疾患もしくは障害の発症の予防は、以下の効果のうちの少なくとも１つ以上をもたらす：（１）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害、及び／またはそれらに関連する症状の重症度の低減または改善；（２）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害に関連する症状の持続期間の短縮；（３）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害に関連する症状の再発の予防；（４）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害、及び／またはそれらに関連する症状の退行；（５）対象の入院の低減；（６）入院の長さの短縮；（７）対象の生存率の増加；（８）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害及び／またはそれらに関連する症状の進行の阻害；（９）他の療法の治療効果の増強または向上；（１０）がん細胞集団及び／または遺伝性疾患もしくは障害に関連する細胞集団の低減または排除；（１１）腫瘍または新生物の増殖の低減；（１２）腫瘍サイズの減少；（１３）腫瘍の形成の低減；（１４）原発性、局所性、及び／または転移性がんの根絶、除去、または制御；（１５）転移の数またはサイズの減少；（１６）死亡率の低減；（１７）対象の無がん生存率の増加；（１８）無再発生存率の増加；（１９）寛解状態の対象の数の増加；（２０）入院率の減少；（２１）療法の投与後に、当業者に利用可能な従来の方法、例えば、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、超音波などによって測定したときに、腫瘍のサイズが維持されておりサイズが増加していないか、または腫瘍のサイズの増加が５％もしくは１０％未満である；（２２）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害、及び／またはそれらに関連する症状の進展または発症の予防；（２３）対象の寛解の長さの延長；（２４）がん及び／または遺伝性疾患もしくは障害に関連する症状の数の低減；（２５）がん対象及び／または遺伝性疾患もしくは障害に関連する対象の無症状生存率の増加；及び／または（２６）転移の限定または低減。いくつかの実施形態において、対象が受ける治療／療法は、がんを治癒させないが、疾患の進行または悪化を予防する。特定の実施形態において、対象が受ける治療／療法は、がんの発症／進展を予防しないが、がんの症状の発症を予防することができる。
いくつかの実施形態において、がんの発症または進行の「予防」を、それを必要とする対象に行うこと、またはエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害の発症または進行の「予防」を、それを必要とする対象において行うことは、がんまたは遺伝性疾患もしくは障害を阻害または遮断することである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、任意の量またはレベルで、がんまたは遺伝性疾患もしくは障害を予防または阻害する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、がんまたは遺伝性疾患もしくは障害を、少なくとも約１０％阻害すること（例えば、少なくとも約２０％阻害すること、少なくとも約３０％阻害すること、少なくとも約４０％阻害すること、少なくとも約５０％阻害すること、少なくとも約６０％阻害すること、少なくとも約７０％阻害すること、少なくとも約８０％阻害すること、少なくとも約９０％阻害すること、少なくとも約９５％阻害すること、少なくとも約９８％阻害すること、または少なくとも約１００％阻害すること）によって予防または阻害する。
いくつかの実施形態において、対象は、エピジェネティックな調節不全を含む前がん状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、前がん状態は、遺伝子座のエピジェネティックな調節不全、または１つの突然変異もしくはいくつもの突然変異に関連する。いくつかの実施形態において、前がん状態は、がんに進展するリスクが増大した異常細胞を含む。前がん状態は、様々な方法で評価することができる。例えば、身体検査、血液検査、及び画像スキャン（例えば、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、超音波など）などのスクリーニングは、今までがんを有しているか分かっていない対象にがんが存在するかどうかをチェックすることができる。いくつかの実施形態において、前がん状態の対象を特徴付けることは、がんの示唆的な特徴（例えば、症状または他の陽性検査）を有するか、またはある「病理学的レベル」を有する者が、がんを有しているかどうかをチェックすることを含む。「病理学的レベル」とは、病原体に関連する病理学的レベルを指すことができ、そのレベルは、がんについて上に記載した通りであり得る。がんが病原体に関連する場合、がんのレベルは、ある種の病理学的レベルであり得る。
いくつかの実施形態において、がんの発生を示す任意の遺伝子を使用して、対象が前がん状態によって特徴付けられるかどうかを判定する。複数の実施形態において、以下の遺伝子のいずれかを使用して、対象が前がん状態によって特徴付けられるかどうかを判定する：


Figure 2024517774000001
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行い、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の対象由来の細胞を投与することを含む。ほとんどの疾患または障害は遺伝的要素を有するが、遺伝性疾患または障害の特定には、典型的には以下を含む臨床分析が必要とされる：１）身体検査、２）医学的な家族歴の評価、及び／または３）臨床検査及び検査室検査。例えば、２人以上の家族（例えば、第１度近親者）における同じ状態の発生、複数の流産、死産、及び小児期の死亡は、遺伝性疾患もしくは障害の存在、または発症、または進行を示唆している。いくつかの実施形態において、比較的若年の２人以上の親類に発生する共通の成人状態（例えば、心疾患、がん、認知症）の家族歴も、遺伝的素因を示唆している可能性がある。いくつかの実施形態において、遺伝的疾患もしくは障害の存在、または発症、または進行を示唆する他の臨床症状は、発達遅延／精神遅滞及び先天異常を含み得る。多くの場合、心臓及び顔、ならびに成長問題を含む異形症は、遺伝性突然変異、自然突然変異、催奇形物質への曝露、または未知の要因によって引き起こされる遺伝性疾患を示唆する。ある遺伝的状態は小児期に現れ、他の遺伝的状態は青年期または成人期に現れる。多くの場合、遺伝的疾患または障害は、思春期または妊娠などの事象が症状の発症の引き金を引いたり、または疾患もしくは障害において出現する有毒な代謝物が蓄積するまで、数年間にわたり検出されないままであり得る。
いくつかの実施形態において、遺伝子検査は、染色体構造、タンパク質機能、またはＤＮＡ配列の異常を検出するための細胞遺伝学的及び／または生化学的／分子的検査を含む。細胞遺伝学は一般に、異常に関して染色体全体を検査及び染色することを含み、各染色体の別個のバンドを明らかにして染色体構造を示すことができる。生化学的／分子的検査は、以下を検出することを含む：（１）タンパク質が作製されているかどうか、（２）多すぎるまたは少なすぎるタンパク質が作製されているかどうか、（３）タンパク質が誤って折り畳まれているかどうか、（４）活性部位または他の重要な領域が改変されているかどうか、（５）タンパク質が誤って修飾されているかどうか、（６）タンパク質が誤って局在化しているかどうか（タンパク質が誤って蓄積されているかどうか）、（７）及び／またはタンパク質が誤ってアセンブルされているかどうか。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、がんまたは前がん細胞における活性なヒストンマークの形成をリセットし、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、活性なヒストンマークの形成のリセットは、例えばヒストン交換、例えば、既存のヌクレオソームを新たに合成されたヒストンに置きかえることによる。いくつかの実施形態において、ヒストン交換は、既存のヒストン修飾マークの除去または希釈をもたらす。いくつかの実施形態において、ゲノムワイドなＣｈＩＰ‐ｃｈｉｐアッセイを使用して、がん細胞または前がん細胞における活性なヒストンマークの形成のリセットを特定する。いくつかの実施形態において、非限定的な例として、ヒストン交換は、ゲノムワイドな規模で迅速にヒストンアセチル化のエピジェネティックマークを送達する。いくつかの実施形態において、がん細胞または前がん細胞における活性なヒストンマークの形成のリセットは、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲまたは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲまたは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させ、それによってヒストンを交換し、活性なヒストンマークと置きかえることを可能にすることによって行われる。例えば、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲまたは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すると、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルの回復、複製起点複合体の複製能力の回復、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ３．３、またはそれらの変異体）の再出現によって、がん細胞または前がん細胞における活性なヒストンマークの形成がリセットされる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、がん細胞または前がん細胞における活性なヒストンマークの形成をリセットする。いくつかの実施形態において、本方法は、対象由来の細胞を有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲまたは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含み、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの投与によって、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ３．３、またはそれらの変異体）の再出現によって、がん細胞または前がん細胞における活性なヒストンマークの形成がリセットされる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、活性なヒストンマークの形成をリセットする。いくつかの実施形態において、ヒストンまたはヒストン関連タンパク質に対する抗体を用いるＣｈＩＰアッセイ、ならびにＰＣＲ及びｑＲＴ‐ＰＣＲは、がん細胞または前がん細胞に関連する活性なヒストンマークの形成のリセットを検出する（例えば、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルの測定及び定量化、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質の再出現による）。いくつかの実施形態において、ｑＲＴ‐ＰＣＲ及び鎖特異的ｑＲＴ‐ＰＣＲアッセイは、がん細胞または前がん細胞に関連する活性なヒストンマークの形成のリセットを検出する（例えば、１つ以上のＳＰＥＡＲの発現レベルの測定及び定量化、及び／またはヒストンもしくはヒストン関連タンパク質の再出現による）。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製起点複合体を回復させるか、または人口複製起点複合体を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製の方向を制御する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、（ｉ）複製の有害な方向の進行を遅らせるかもしくは複製の有害な方向を防止し、複製の反対方向を活性化し、及び／または（ｉｉ）トリヌクレオチドリピートの部位を調節し、場合によりトリヌクレオチドリピートのサイズを低減させるかもしくは発現を逆転させる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、複製及び修復の間に生じるトリヌクレオチドリピート（「ＴＮＲ」、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、及びＧＡＡが含まれる）の拡大を逆転させることによって、トリプレット病（「ＴＲＤ」；例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症、運動障害、自閉症）を治療または予防する。いくつかの実施形態において、ＴＲＤは、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病及び／または非ポリグルタミン病である。いくつかの実施形態において、ポリグルタミン病は、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症またはケネディ病）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、またはＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）である。いくつかの実施形態において、非ポリグルタミン病は、ＦＸＳ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、及び早発卵巣不全（ＰＯＦ）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、遺伝的疾患または障害を特徴とする細胞における未病状態に関連する複製起点複合体を回復させ、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または（ｉｉ）対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、複製起点複合体は、（ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与することによって、または（ｉｉ）対象由来の細胞を有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることによって回復される。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節を引き起こす。例えば、阻害剤は、乳癌に関連する、ＲＡＲＢ２、ＭＳＨ２、ＥＳＲ１Ｂ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＭＥＦＦ２、ＲＡＳＳＦ１、ＢＲＣＡ１、ＳＴＲＡＴＩＦＩＮ、及びＲＡＳＳＦ１Ａから選択される１つ以上の遺伝子のレベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、阻害剤は、胃癌、肝臓癌、及び食道癌にそれぞれ関連する、ＲＵＮＸ３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＡＰＣから選択される１つ以上の遺伝子のレベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、阻害剤は、結腸直腸癌に関連する、ＳＥＰＴ９、ｈＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６、ＨＴＬＦ、ＡＬＸ４、ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１、ＮＧＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＲＵＮＸ３、及びＵＢＥ２Ｑ１から選択される１つ以上の遺伝子のレベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、阻害剤は、肺癌に関連する、ＲＡＲＢ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＨＦＲ、ＳＴＲＡＴＩ－ＦＩＮ、ＳＨＯＸ２、ＲＡＳＦ１Ａ、及びＡＰＣ１から選択される１つ以上の遺伝子のレベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＲＡＲＢ２、ＭＳＨ２、ＥＳＲ１Ｂ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＭＥＦＦ２、ＲＡＳＳＦ１、ＢＲＣＡ１、ＳＴＲＡＴＩＦＩＮ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＵＮＸ３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、ＳＥＰＴ９、ｈＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６、ＨＴＬＦ、ＡＬＸ４、ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１、ＮＧＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＲＵＮＸ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＲＡＲＢ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＨＦＲ、ＳＴＲＡＴＩ－ＦＩＮ、ＳＨＯＸ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、及びＡＰＣ１から選択される１つ以上の遺伝子のレベルの調節を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＲＡＲＢ２、ＭＳＨ２、ＥＳＲ１Ｂ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＭＥＦＦ２、ＲＡＳＳＦ１、ＢＲＣＡ１、ＳＴＲＡＴＩＦＩＮ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＵＮＸ３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、ＳＥＰＴ９、ｈＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６、ＨＴＬＦ、ＡＬＸ４、ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１、ＮＧＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＲＵＮＸ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＲＡＲＢ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＨＦＲ、ＳＴＲＡＴＩ－ＦＩＮ、ＳＨＯＸ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、及びＡＰＣ１に関連するプロモーターは過剰メチル化される。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、遺伝子の上方制御である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の上方制御は、ＲＡＲＢ２、ＭＳＨ２、ＥＳＲ１Ｂ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＭＥＦＦ２、ＲＡＳＳＦ１、ＢＲＣＡ１、ＳＴＲＡＴＩＦＩＮ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＵＮＸ３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、ＳＥＰＴ９、ｈＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６、ＨＴＬＦ、ＡＬＸ４、ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１、ＮＧＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＲＵＮＸ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＲＡＲＢ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＨＦＲ、ＳＴＲＡＴＩ－ＦＩＮ、ＳＨＯＸ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、及びＡＰＣ１から選択される。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、遺伝子の下方制御である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現の下方制御は、ＲＡＲＢ２、ＭＳＨ２、ＥＳＲ１Ｂ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＭＥＦＦ２、ＲＡＳＳＦ１、ＢＲＣＡ１、ＳＴＲＡＴＩＦＩＮ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＵＮＸ３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＡＰＣ、ＳＥＰＴ９、ｈＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６、ＨＴＬＦ、ＡＬＸ４、ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１、ＮＧＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＲＵＮＸ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＲＡＲＢ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＨＦＲ、ＳＴＲＡＴＩ－ＦＩＮ、ＳＨＯＸ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、及びＡＰＣ１から選択される。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節は、未処理の状態と比較したときの１つ以上の遺伝子のレベルの回復である。いくつかの実施形態において、遺伝子は、がん遺伝子またはがん原遺伝子である。いくつかの実施形態において、がん遺伝子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＲＡＳ、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＢＣＬ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、及びＴＳＣ１から選択される。いくつかの実施形態において、がん原遺伝子は、ＲＡＳ、ＨＥＲ２、ＭＹＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、及びＢＣＲ－ＡＢＬから選択される。
いくつかの実施形態において、遺伝子はｍｙｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ｍｙｃ遺伝子は、ｃ‐ＭＹＣ（ＭＹＣ）、ｌ‐ｍｙｃ（ＭＹＣＬ）、及びｎ‐ｍｙｃ（ＭＹＣＮ）から選択される。
いくつかの実施形態において、遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。いくつかの実施形態において、腫瘍抑制遺伝子は、Ｒｂ、ｐ５３、ＶＨＬ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、及び／またはＰＴＣＨから選択される。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲに関連するエピジェネティックマークの活性を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、エピジェネティックマークの形成及び／または再利用を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、遺伝子の活性化を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、遺伝子の活性化を引き起こす。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びヌクレオソームリモデリングのうちの１つ以上を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲによって制御される病原性ヌクレオチド拡大の調節を引き起こす。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲと１つ以上のヒストンまたはヒストン関連タンパク質との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲとＯＲＣの１つ以上の構成成分との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する。いくつかの実施形態において、ＯＲＣの１つ以上の構成成分は、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、及びＯＲＣ５、またはそれらの変異体のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、１つ以上のエピジェネティックマークの調節不全である。いくつかの実施形態において、１つ以上のエピジェネティックマークのエピジェネティックな調節不全は、未病状態と比較したときの付加的なエピジェネティックマークの活性化、及び／または未病状態と比較したときのエピジェネティックマークの不活性化を含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティックな調節不全は、改変された複製起点である。いくつかの実施形態において、改変された複製起点は、未病状態と比較したときの付加的な複製起点の活性化、及び／または未病状態と比較したときの複製起点の不活性化を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、エピジェネティックな調節不全に関連するがんに罹患している。いくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、がんは血液癌である。
いくつかの実施形態において、がんは、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫、肝癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓もしくは腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、子宮もしくは子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む）、ならびに他の癌腫及び肉腫、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫に関連する異常な血管増殖、及びメグズ症候群のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２００ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２００～１０，０００ヌクレオチド長、または約２００～５０００ヌクレオチド長、または約２００～１０００ヌクレオチド長、または約２００～５００ヌクレオチド長、または約５０００～１００００ヌクレオチド長、または約１０００～１００００ヌクレオチド長、または約５００～１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約１，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約１，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約２，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約３，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約３，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約４，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約４，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約５，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約５，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約６，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約６，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約７，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約７，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約８，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約８，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約９，０００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約９，５００ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、約１０，０００ヌクレオチド長以上である。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、細胞周期の初期Ｓ期に誘導され、フローサイトメトリーによって検出される。様々な実施形態において、検出は、ワールドワイドウェブのｂｉｏｔｅｃｈ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｓｉｔｅｓ／ｂｉｏｔｅｃｈ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｆｉｌｅｓ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｃｂ０８０４．ｐｄｆに記載される方法を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、初期Ｓ期の間に、主要な「活性な」エピジェネティックマークの形成が、活発に転写される遺伝子のプロモーターに隣接してコードされる、「ＳＰＥＡＲ」として本明細書に開示される細胞周期特異的非コードＲＮＡ（「ｎｃＲＮＡ」）の作用によって駆動される。いくつかの実施形態において、局所的に誘導されるＳＰＥＡＲは、置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚ及び核内因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＴＩＰ６０に結合し、置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚの積み込み／アセチル化をもたらす。この活性なクロマチンコンフォメーションでは、ＲＮＡＰＩＩ複合体がその部位に結合し、遺伝子発現が開始される。
いくつかの実施形態において、モチーフ発見分析をＳＰＥＡＲについて行って、共通の結合モチーフを分析する。様々な実施形態において、モチーフ発見分析は、Ａｃｈａｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ １０，６１（２０１５）（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような計算機による方法である。いくつかの実施形態において、プロモーター遺伝子座はカバレッジ計算に供され、発現レベルに基づいてフィルタリングされる。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、３、５及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む。いくつかの実施形態において、モチーフ９は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドＲＭ９Ａに対応する。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、図３Ｆまたはそれらの変異体から選択される１つ以上のモチーフを含む。
いくつかの実施形態において、ＳＰＥＡＲは、１つ以上のステムループ様構造を含む。
いくつかの実施形態において、阻害剤は小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。いくつかの実施形態において、阻害剤は核酸である。いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する。いくつかの実施形態において、核酸は、ＳＰＥＡＲの一部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。
いくつかの実施形態において、阻害剤の１つ以上のヌクレオチドは化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、化学的修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アルキル‐ＲＮＡ単位、２’‐ＯＭｅ‐ＲＮＡ単位、２’‐アミノ‐ＤＮＡ単位、２’‐フルオロ‐ＤＮＡ単位、ペプチド核酸（ＰＮＡ）単位、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）単位、ＩＮＡ単位、及び２’‐Ｏ‐（２－メトキシエチル）‐ＲＮＡ（２’ＭＯＥ ＲＮＡ）単位から選択される。
いくつかの実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＰＥＡＲの発現及び／または活性を調節する。
いくつかの実施形態において、対象由来の細胞は、生物学的試料に由来する。
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、生検材料、組織、または体液を含む。
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍細胞、培養細胞、幹細胞、及び分化細胞のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のエピジェネティック薬を投与するか、または細胞を１つ以上のエピジェネティック薬と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティック薬は、アザシチジン、エシタビン、ゼブラリン、パノビノスタット、ベリノスタット、ダシノスタット、キシノスタット、テフィノスタット、アセジナリン、エンチノスタット、モセチノスタット、チダミド、酪酸、ピバネクス、フェニル酪酸、及びバルプロ酸から場合により選択される、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、エピジェネティック薬は、ボリノスタット、ロミデプシン、トリコスタチンＡ、及びトラポキシンＡから場合により選択される、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、エピジェネティック調節剤を作製する方法であって、（ａ）エピジェネティック調節剤を、以下によって特定すること：（ｉ）該薬剤が、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用するかどうかを決定すること；（ｉｉ）該薬剤を、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用する能力に基づいてエピジェネティック調節するとして分類すること；及び（ｂ）エピジェネティックな調節不全に関連するがんまたはエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害の治療または予防から選択される療法における使用のために該薬剤を製剤化すること、を含む方法である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、エピジェネティック調節療法に対する対象の応答を評価するための方法であって、対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することを含み、（ｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが低減していることが、療法に対する応答を示し、及び／または（ｉｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが増加しているかもしくは実質的に変化していないことが、療法に対して応答がないかもしくは乏しいことを示す、方法である。いくつかの実施形態において、エピジェネティック調節療法は、エピジェネティック機構を標的とするように設計された薬物、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）、ブロモドメイン及び余剰末端ドメインタンパク質（ＢＥＴ）、タンパク質アルギニンＮ‐メチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）、及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）を含む。いくつかの実施形態において、エピジェネティック調節療法は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、アザシチジン、デシタビン、エナシニブ、及びイボシデニブから選択される薬物を含む。
いくつかの実施形態において、対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することは、ＣｈＩＰアッセイ、シーケンシング（例えば、ＣｈＩＰシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、次世代シーケンシング（例えば、高スループットシーケンシング、ディープシーケンシング）、ＰＣＲ、及びｑＲＴ‐ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態において、対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することは、新生ＲＮＡを捕捉し、捕捉したＲＮＡを高スループットシーケンシングアッセイ（例えば、ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑ）においてシーケンシングして、例えば、ＲＮＡ‐Ｓｅｑリードをゲノムにマッピングするか、またはリードをコンティグにｄｅ ｎｏｖｏでアセンブルし、続いてコンティグをトランスクリプトームにマッピングすることによって転写物のレベルを特定する。ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑでは、細胞を最初に同調させ、Ｓ期へのリリース時に１時間標識する。次いで収集したＲＮＡをクリックケミストリーによってビオチン化し、続いてストレプトアビジンビーズで単離し、ディープシーケンシングしてｎａｓＲＮＡライブラリーを生成する。ＳＰＥＡＲレベルは、遺伝子発現レベルをコード遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）に近い転写物と相関させることによって評価される。
様々な実施形態において、生物学的試料とは、本明細書に記載されるように、関心対象の供給源（例えば、細胞）から得られるか、またはそれに由来する試料を指す。特定の実施形態において、関心対象の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。特定の実施形態において、生物学的試料は、生物学的組織または液体である。生物学的試料の非限定的な例として、骨髄、血液、血球、腹水、（組織または細針）生検試料、細胞を含有する体液、遊離浮遊核酸、痰、唾液、尿、脳脊髄液、腹膜液、胸膜液、糞便、リンパ液、婦人科学的液体、スワブ（例えば、皮膚スワブ、膣スワブ、口腔スワブ、及び鼻腔スワブ）、洗液または洗浄液、例えば、管洗浄液または気管支肺胞洗浄液、吸引液、掻き取ったもの、検体（例えば、骨髄検体、組織生検検体、及び手術検体）、糞便、他の体液、分泌物、及び／または排泄物、ならびにそれらからの細胞などが挙げられる。
様々な実施形態において、「対象」とは、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、限定するものではないが、ヒト、及び非ヒト動物（限定するものではないが、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど（例えば、特定の処理のレシピエントになるもの、または細胞が採取されるもの）が含まれる）が含まれる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
「第１の」、「第２の」などの用語は、様々な要素を説明するために本明細書で使用されることがあるが、これらの要素はこれらの用語によって制限されるべきではないことも理解されよう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するために使用されるに過ぎない。例えば、本開示の範囲から逸脱することなく、第１の主題を第２の主題と呼ぶことができ、同様に第２の主題を第１の主題と呼ぶことができるであろう。第１の主題及び第２の主題は両方とも主題であるが、それらは同じ主題ではない。さらに、「対象」、「使用者」、及び「患者」は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語及びその変形は、リスト内の項目の記載が、本技術の材料、組成物、デバイス、及び方法でも有用であり得る他の類似の項目を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。同様に、「～ことができる」及び「～し得る」いう用語及びそれらの変形は、実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるまたは含み得るという記載が、それらの要素または特徴を含有しない本技術の他の実施形態を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する、または有するなどの用語の同義語としての非制限用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書では本開示を説明及び特許請求するために使用されるが、本技術またはその実施形態は、代わりに、記載の成分「からなる」または「から本質的になる」などのより限定的な用語を使用して説明される場合がある。
別途定義されない限り、本明細書における全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価な任意の方法及び材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。引用した全ての出版物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例１：ＳＰＥＡＲの発現は近隣遺伝子の発現と相関する
本実施例の実験では、Ｈ２Ａ．Ｚのアセチル化形態と非修飾形態との間のエピジェネティックなバランスが、細胞型特異的ＤＮＡメチル化パターンを制御するＤＮＭＴ１相互作用ＲＮＡ（「ＤｉＲ」）に類似したタイプの局所誘導ｎｃＲＮＡによって維持されるかどうかを調査した。ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（「ＣＥＢＰＡ」）遺伝子座から生じるＲＮＡをマッピングすることによって、ＣＥＢＰＡ ＤｉＲ（ｅｃＣＥＢＰＡ）の上流の転写物が明確になった。それをＵｐｐｅｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＵｐＴｒ）と呼ぶ（図１Ａ）。ＵｐＴｒの発現は、初期Ｓ期の間のｅｃＣＥＢＰＡ及びＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡの両方の発現に先行する（図１Ａ）。大半の活性遺伝子は初期Ｓ期に複製を受け、それに続いて適切な活性クロマチンが形成されるので、本実施例の実験では、ＵｐＴｒ（及び他の遺伝子座からの同様の転写物）がクロマチンの再アセンブルに役割を果たすことによって、それぞれのｍＲＮＡの発現を制御するかどうかを調査した。
「Ｓ期初期ＲＮＡ」（「ＳＰＥＡＲ」）として本明細書に開示される、新たに名付けられた同様のＲＮＡのグローバルな出現を確立するために、新生ＲＮＡを捕捉し、シーケンシングした（ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑ）。同調させたヒトＨＬ‐６０細胞を、Ｓ期へのリリース時にリボヌクレオチドホモログ５‐エチニルウリジン（ＥＵ）で１時間標識した。次いで収集されたＲＮＡをクリックケミストリーによってビオチン化し、ストレプトアビジンビーズで単離し、ディープシーケンシングしてｎａｓＲＮＡライブラリーを生成した（図８Ａ、及び図１Ｂ）。ＳＰＥＡＲの４つの別個の群を、発現レベルでランク付けした（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ）。４つの全ての群からの転写物の分析によって、ＳＰＥＡＲはコード遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）の近くで開始し、それらの発現レベルと相関することが明らかになった（図１Ｃ、図８Ｂ、及び図８Ｃ）。ＳＰＥＡＲに調節される遺伝子の中に、がんにおいて最も頻繁に改変されるがん遺伝子であるｃ‐ＭＹＣが特定された。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座から生じるＳＰＥＡＲ（「ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ」）及びＰＵ．１遺伝子座から生じるＳＰＥＡＲ（「ＰＵ．１ ＳＰＥＡＲ」）の例を、それぞれ図１Ｄ及び図８Ｄに示す。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲは、ＵｐＴｒと類似した発現パターンを実証し（図１Ｅ）、ＨＬ‐６０細胞の核内で約１３コピーによって表されることが示された（図８Ｅ及び図８Ｆ）。それらは、プライマー伸長及び５’，３’‐ＲＡＣＥによってマッピングされた（図８Ｅ、図８Ｇ、及び図８Ｈ）。
実施例２：ＳＰＥＡＲはＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０と相互作用する
ＴＳＳとＳＰＥＡＲが近接してことを考慮して、本実施例の実験では、ＳＰＥＡＲの発現とＨ２Ａ．Ｚ／ａｃＨ２Ａ．Ｚ（アセチル化マークを有する変異体ヒストン）の発現との関連性の可能性を分析した。この関連性は、以下によって調査した：（ｉ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）プルダウン実験、それに続く質量分析；及び（ｉｉ）ＲＮＡ免疫沈降、それに続くＲＮＡシーケンシング（ＲＩＰ‐Ｓｅｑ）。ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑによって特定された、遺伝子座ｃ‐ＭＹＣ、ＰＵ．１、ＭＹＢ、ＣＥＢＰＡ、及びＣＴＣＦに対応する５つのＳＰＥＡＲの配列（図８Ａ～８Ｈ）を、プライマー伸長及び５’３’ＲＡＣＥによって検証した（図８Ｇ及び図８Ｈ）。およそ５００ｎｔの長い中断されていない配列セグメント（図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃ）を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター下でクローニングして、ＲＮＰプルダウン実験のためのビオチン化センス及びアンチセンスＳＰＥＡＲプローブを発現させた。両方の鎖からのプローブによって、ＳＰＥＡＲ含有ＲＮＰを特定することができる。すなわち、アンチセンスプローブは天然のＳＰＥＡＲと直接塩基対を形成することによって、センスプローブはそれらと置きかわることによってＳＰＥＡＲ含有ＲＮＰを特定することができる（例えば、図９Ａ参照）。アンチセンス及びセンスＳＰＥＡＲプローブの両方と相互作用する回収されたＲＮＰ、ならびに陰性対照（Ｄ‐ビオチン）を質量分析によって分析した。ＳＰＥＡＲプローブによってプルダウンされたペプチドの中には、いくつかＨ２Ａ．ＦＺ／Ｈ２Ａ．ＦＶに対応するものがあった（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、及び図１０Ｇ）。非常に相同的な形態のＨ２Ａ．ＦＺとＨ２Ａ．ＦＶとを区別することはできず、断片カバレッジが比較的低かったために、アセチル化部位を含有するペプチドを検出されなかった。ＳＰＥＡＲプローブによってプルダウンされた他のペプチドは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、及びＨ１に対応していた。Ｈ２Ａ／Ｈ２Ａ．Ｚまたは他のヒストンに対応するペプチドは、陰性対照プローブによって検出されなかった（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、及び図１０Ｇ）。
本実施例の実験では、ＳＰＥＡＲが、Ｈ２Ａ．Ｚ、及びＨ２Ａ．Ｚをアセチル化する酵素であるヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ＴＩＰ６０との直接相互作用を通してその機能を発揮するかどうかも調査した。ＳＰＥＡＲとＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との相互作用を直接試験するために、Ｈ２Ａ．Ｚ（全形態）、アセチル化Ｈ２Ａ．Ｚ（ａｃＨ２Ａ．Ｚ）、及びＴＩＰ６０に対する抗体を使用してＲＩＰ‐Ｓｅｑを行った（図２Ａ）。重要なことに、ＲＩＰ‐Ｓｅｑピークの有意な重なりが３つの抗体全てを使用した免疫沈降で観察された。すなわち、３つのデータセットのかなりの共局在化がＴＳＳ周囲の領域で観察された（図２Ｂ）。Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０とＳＰＥＡＲとの相互作用の規模を推定するために、ｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑライブラリーを、ＴＩＰ６０、Ｈ２Ａ．Ｚ、及びａｃＨ２Ａ．ＺのＲＩＰ‐Ｓｅｑデータベースとアライメントした（図２Ｃ、図２Ｄ、図９Ａ、図９Ｂ）。Ｈ２ＡＺでは３１２０の遺伝子座、及びａｃＨ２Ａ．Ｚでは４６８３が発現された遺伝子と重なっていることから、対応する遺伝子での活性な発現モードの確立において，ＳＰＥＡＲがＴＩＰ６０及びＨ２Ａ．Ｚ／ａｃＨ２Ａ．Ｚと協働してグルーバルに関与している可能性が高いことが実証される。よって、これらのアライメントから、ＳＰＥＡＲの発現レベルと対応する遺伝子の発現レベル、及び重要なことにそれぞれの遺伝子座におけるａｃＨ２Ａ．Ｚの占有率との直接的な相関が実証される（図２Ｄ；軸はそれぞれ「ＲＮＡ‐Ｓｅｑ発現」及び「ａｃＨ２Ａ．Ｚピークスコア」）。Ｈ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚのデータの比較によって、ＳＰＥＡＲに大きく結び付いているのはＨ２Ａ．Ｚのアセチル化形態であることが含意される。
まとめると、プルダウン及びＲＩＰ実験を含む本実施例の実験から、ＳＰＥＡＲのＨ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０との二重の相互作用が実証される。
実施例３：ＳＰＥＡＲは共通の結合モチーフを持つ
ＳＰＥＡＲ‐Ｈ２Ａ．Ｚ／ＴＩＰ６０の関係をさらに試験するために、ＳＰＥＡＲについてモチーフ発見分析を行って共通の結合モチーフを探した。簡単に説明すると、約１４０００のプロモーター遺伝子座（Ｂｒｏａｄ ＨＭＭ）を、カバレッジ計算に供し、発現レベルに従ってフィルタリングした。モチーフ発見分析の前に、５’及び３’のＳＰＥＡＲの境界をｎａｓＲＮＡ‐Ｓｅｑ及び取得された対応する配列から推測した（詳細については、以降の「方法」；図３Ａ参照）。２５個のモチーフ候補が特定された（図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）。見込みのある候補の中で、３、５、及び９の３つのモチーフが、ＳＰＥＡＲ調節遺伝子座全体で最も有意なエンリッチメントを呈した。重要なことに、同様のモチーフは、最大のクラスの核内ＲＮＡ、すなわち、短鎖散在反復配列及び長鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ）から生じる転写物、またはリボソームＲＮＡには見出されなかった（詳細については以降の「方法」参照）。上位３つの候補の中で、モチーフ９（ＲＮＡオリゴヌクレオチドＲＭ９Ａに対応、図３Ｂ）をｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ配列中にエンリッチされた最も強いモチーフとしてランク付けした。このモチーフは、ａｃＨ２Ａ．ＺのＲＩＰ‐ＳｅｑとＴＩＰ６０のＲＩＰ‐Ｓｅｑとの両方が重なるピークにおいてエンリッチされており（それぞれ５２％及び１３％）、ピークの中心近くに位置していた（図３Ｃ）。これらの結果と一致して、ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＲＥＭＳＡ）を使用して、ＲＭ９ＡがＨ２Ａ．Ｚと共に、及びＴＩＰ６０と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＰを形成できることが示された（図３Ｄ、レーン３、９及び１３；ならびに図３Ｅ、レーン４）。ＲＭ９ＡをＨ２Ａ．ＺのＮ末端配列に対応する合成ペプチドとインキュベートした後に、未修飾及びリジン７（Ｋ７）でアセチル化されたものの両方で、泳動のシフトが観察された（図３Ｄ；右側パネル）。Ｈ２Ａ．Ｚテールペプチドのアセチル化は結合を抑止せず、それによって単純な電荷‐電荷相互作用がＳＰＥＡＲ‐Ｈ２Ａ．ＺまたはＳＰＥＡＲ‐ａｃＨ２Ａ．Ｚ複合体に関与する可能性が除外された。興味深いことに、予測されるステムループ様構造（ＲＮＡｆｏｌｄ、図３Ｆ）の存在は、ＲＭ９ＡがＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０に結合するために必要であると思われる（図３Ｄ）。実際に、予測されるステムループ構造を無効にするＲＭ９Ａの突然変異は、ＲＮＡ‐ＴＩＰ６０複合体の強度及び移動度を変化させた（Ｍｕｔ ＲＭ９Ａ；図３Ｅ、レーン５）。共通の結合モチーフを欠く無関係なオリゴヌクレオチド（ＵＲ１、ＵＲ２、及びＵＲ３）は、ＴＩＰ６０／Ｈ２Ａ．Ｚと検出可能なＲＮＰ複合体を形成せず（図３Ｄ及び図３Ｅ）、よってＴＩＰ６０／Ｈ２Ａ．ＺとＳＰＥＡＲとの間の強い要素は一次構造認識及び二次構造認識の両方であることが裏付けられた。
ＲＮＡが、リモデリング複合体のクロマチンへの結合に重要であり得るかどうか（例えば、ＳＰＥＡＲがＴＩＰ６０のクロマチンへの結合を促進する能力）を評価するために、ＴＩＰ６０結合を、同じ一次配列のＲＮＡ（一本鎖ＲＭ９Ａ）及びＤＮＡ（二本鎖ＤＭ９Ａ）オリゴヌクレオチドと比較した。ＲＥＭＳＡ／ＥＭＳＡの結果から、ＴＩＰ６０の結合はＤＮＡよりもＲＮＡに対する方が強いことが実証された（図３Ｅ、レーン４対レーン６）。同様の弱い複合体形成が、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＵＲ２及びＵＲ３）と同じ一次配列のＤＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖（それぞれＤＭ２及びＤＭ３）とＴＩＰ６０との間で観察された（図３Ｅ、レーン１３及び２０に示す）。
本実施例の実験から、ＴＩＰ６０とＲＮＡとの間の結合が、ＤＮＡへのＴＩＰ６０結合と比較したときに一次構造及び二次構造の両方に依存することが実証される。
結論として、これらの実験結果は、ＳＰＥＡＲとヒストンアセチルトランスフェラーゼＴＩＰ６０及びヒストンＨ２Ａ．Ｚ、特にその修飾形態ａｃＨ２Ａ．Ｚとの相互作用を示唆するものである。
実施例４：ＳＰＥＡＲは、Ｈ２Ａ．Ｚのアセチル化及び交換に関与する
ＳＰＥＡＲがその対応する遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚの積み込みに必要とされるのかどうかを直接調べるために、転写を薬理学的に阻害し、続いてＨ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚ抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った（例えば、図４Ａ参照）。２つの転写阻害剤、アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ；ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ阻害剤）及び５，６‐ジクロロベンズイミダゾール１－β－Ｄ‐リボフラノシド（ＤＲＢ；ＲＮＡＰＩＩ阻害剤）を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩの両方をブロックするのに十分な濃度で使用した。細胞をダブルチミジンブロックで同調させ、リリースしてＳ期にし、その際にＡｃｔＤ／ＤＲＢを添加した。ＡｃｔＤ及びＤＲＢの使用の論理的根拠は、（ｉ）短い時間枠でＳＰＥＡＲ抑制の効果をグローバルに評価すること、（ｉｉ）ＡｃｔＤ及びＤＲＢによってトリガーされる２つの異なる経路から生じる作用を試験すること、ならびに（ｉｉｉ）ＤＲＢ処理の可逆性を利用することである。細胞をこの阻害剤で２時間処理すると、その間にＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０タンパク質の全体的レベルは影響を受けなかったが（図１０Ａ）、コード遺伝子及びＳＰＥＡＲの両方のグローバルな発現レベルが有意に減少した（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。薬物処理の２時間後、細胞を架橋し、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ分析に供した。図４Ｂから、ＳＰＥＡＲの発現が抑制された遺伝子座が、ａｃＨ２Ａ．Ｚのエンリッチメントの減少を示すことが実証され、これによって、ＳＰＥＡＲがこのエピジェネティックマークの正確な配置に関与していることが示された。次いで、ＤＲＢ及びＡｃｔＤによって誘導されるＳＰＥＡＲの阻害から生じる、ＴＳＳ近傍の未修飾Ｈ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚのフットプリントの相対的変化を調査した。薬物処理後の３８，５１２のＴＳＳ（ｈｇ３８ ＵＣＳＣ標準遺伝子表に定義される）周辺におけるＨ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナルのエンリッチメントを、次いでモック処理（ＤＭＳＯ）細胞におけるその占有率と比較した。これらの実験において、ＤＲＢまたはＡｃｔＤのいずれかで処理された試料のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚのエンリッチメントの劇的な減少が観察され、それとは対照的に未修飾Ｈ２Ａ．Ｚの占有レベルにはわずかな変化しか観察されなかった（図４Ｃ；詳細については以降の「方法」参照）。ＤＲＢで処理された細胞は、処理されていない細胞と比較したときに、３，３９４のＴＳＳで少なくとも２倍のａｃＨ２Ａ．Ｚ占有率の低下を示したのに対し、全Ｈ２Ａ．Ｚシグナルでは同様の傾向を示したのは３９８のＴＳＳのみであった。ＡｃｔＤ処理細胞もこのパターンに従い、６，２８３のＴＳＳでａｃＨ２Ａ．Ｚのレベルが未処理の試料と比較して２倍を超えて減少した。対照的に、６５０のＴＳＳは、全Ｈ２Ａ．Ｚの占有率の同等の減少を呈した。処理された試料において、Ｈ２Ａ．Ｚと比較して、ａｃＨ２Ａ．Ｚでは１０倍大きい減少が観察されたことから、ＴＳＳでのＨ２Ａ．Ｚアセチル化の正常なレベルの維持に、すなわち、活性なエピジェネティックマークであるａｃＨ２Ｈ２Ａ．Ｚの生成に、ＳＰＥＡＲが関与していることが示唆された。図４Ｄ（上側及び中央パネル）は、２つの個々の遺伝子座、ｃ‐ＭＹＣとＰＵ．１とを組み合わせたスナップショットの例を図示しており、それにおいて両方ともＡｃｔＤ及びＤＲＢによって悪影響を受けたＳＰＥＡＲが生じることから（図１０Ｃに示す）、Ｈ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚのピークの強度が減少すること、すなわち、ａｃＨ２Ａ．Ｚレベルの減少がより顕著であることを実証している（完全なスナップショットを図１０Ｄ及び図１０Ｅに示す）。ｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１遺伝子座のそれぞれについて、対照（ＤＭＳＯ）に対する薬物処理されたＨ２Ａ．Ｚのピーク強度の比は、［ＤＭＳＯ／ＤＲＢ／ＡｃｔＤ］ｃ‐ＭＹＣ＝１／０．７６／０．６７、及び［ＤＭＳＯ／ＤＲＢ／ＡｃｔＤ］ＰＵ．１＝１／０．８７／０．８２であり；対照（ＤＭＳＯ）に対する薬物処理されたａｃＨ２Ａ．Ｚピーク強度の比は、［ＤＭＳＯ／ＤＲＢ／ＡｃｔＤ］ｃ‐ＭＹＣ＝１／０．６２／０．３６、及び［ＤＭＳＯ／ＤＲＢ／ＡｃｔＤ］ＰＵ．１＝１．０／０．２５／０．１３であった。これらの結果を、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座についての定量的ＣｈＩＰ‐ＰＣＲによって確認した（図４Ｅ）。対照的に、ＳＰＥＡＲに及ぼす薬物の下方制御作用を免れた遺伝子座は、ＳＰＥＡＲのレベルの変化と一致したａｃＨ２Ａ．Ｚの強度比を呈した。例えば、ＭＹＢ遺伝子座は、ＡｃｔＤ及びＤＲＢによって正の影響を受けたＳＰＥＡＲを生じ（図１０Ｃ）、ａｃＨ２Ａ．Ｚピークの強度の増加を呈するが、未修飾Ｈ２Ａ．Ｚピークの強度は有意に変化しない（図４Ｄ下側パネル；ならびに図１０Ｄ及び図１０Ｅ参照）。ＭＹＢでは、対照（ＤＭＳＯ）に対する薬物処理されたａｃＨ２Ａ．Ｚピーク強度の比は、［ＤＭＳＯ／ＤＲＢ／ＡｃｔＤ］ＭＹＢ＝０．６２／０．８９／１．０であり、これは、そのＳＰＥＡＲレベルの増加に対応する（図１０Ｃ）。よって、予想外にも、ＳＰＥＡＲの発現がＡｃｔＤ／ＤＲＢによって正の影響を受ける遺伝子座では、本実施例の実験は、ＳＰＥＡＲレベルが増加すると、対応してａｃＨ２Ａ．Ｚのピークの強度が上昇する様子を例示している。
ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑの結果を確認し、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚの積み込みを追跡するために、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０に対する抗体を用いて新生クロマチン免疫沈降（ｎａｓＣｈＩＰ‐ＰＣＲ）を行った。何故なら、ｎａｓＣｈＩＰ‐ＰＣＲを使用すればヒストンの積み込みを追跡することができるからである。細胞をダブルチミジンブロックで同調させ、リリースしてＳ期にし、ＤＲＢで２時間処理した。培地にＥｄｕ ＤＮＡ類似体を添加して新生クロマチンＤＮＡを収集できるようにした（図４Ａ）。ＤＲＢでの転写の阻害の間、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座は、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のエンリッチメントの減少を示した（図４Ｆ、３つの左側パネル）。ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座のＴＳＳでのアセチル化ａｃＨ２Ａ．Ｚの喪失の程度がさらに高かったことから、これらの実験の結果は、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの発現の抑制と置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚのレベルの低減との間の重要な関連性を提供する。同様の結果が、別の遺伝子座、ＰＵ．１についても得られた（図４Ｆ、右側パネル）。
まとめると、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ実験及びｎａｓＣｈＩＰ‐ＰＣＲ実験の結果は、置換ヒストンＨ２Ａ．Ｚの積み込みにおける転写の役割を明確にする。遺伝子のＴＳＳでの未修飾形態の減少と比較したときのＨ２Ａ．Ｚのアセチル化レベルの確実な低下、ならびに同じ部位でのＴＩＰ６０の喪失から、Ｈ２Ａ．Ｚのアセチル化を媒介する転写の役割が示唆される。
逆の実験では、ＲＮＡｉ媒介下方制御が標的遺伝子座のＴＳＳでのＨ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚレベルの低下、ならびに対応遺伝子の発現の低減をもたらすかどうかを見るために、特定のＳＰＥＡＲのＲＮＡｉ媒介下方制御を試験し、続いてＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ及びＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲ分析を行った。図５Ａの２つのパネルの比較により、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲが約７５％低減すると、同様の規模（約７０％）でｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡ発現が減少することが実証される。対照的に、影響を受けない対照のＰＵ．１ ＳＰＥＡＲは、実質的にＰＵ．１ ｍＲＮＡレベルの変化を伴わない。図５Ｂは、標的及び対照遺伝子座、それぞれｃ‐ＭＹＣ及びＰＵ．１でのＨ２Ａ．Ｚ及びａｃＨ２Ａ．Ｚレベルのスナップショットを示す（完全なスナップショットは図１０Ｆ及び図１０Ｇに示す）。ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲのノックダウンは、非標的対照ＰＵ．１遺伝子のＴＳＳと比較したときに、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子のＴＳＳでのａｃＨ２Ａ．Ｚレベルの有意な減少と関連していた。ＲＮＡｉ／ＣｈＩＰ実験の結果により、ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの発現が、ｃ‐ＭＹＣのＴＳＳでのＨ２Ａ．Ｚアセチル化のレベルと関連していることが実証される。これらの実験結果により、ＳＰＥＡＲの発現と活性化ヒストンマークの積み込みとの間には因果関係があり、結果的に隣接遺伝子の転写活性化をもたらされることが実証される。図５Ｃは、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座についての定量的ＣｈＩＰ‐ＰＣＲを使用したａｃＨ２Ａ．ＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ分析の検証を示す。
全体として、独立した薬理学的方法及びＲＮＡｉ媒介法を使用してＳＰＥＡＲを下方制御すると、エピジェネティックマークａｃＨ２Ａ．Ｚが実質的に低減した。活性ＴＳＳの近傍でのクロマチンからのＨ２Ａ．Ｚのアセチル化形態の喪失は、その天然の活性が低減すること、そして結果的にそれぞれの遺伝子の発現が低減することを含意する（図５Ａ、右側パネル）。
実施例５：ＳＰＥＡＲは、ＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺの動員／積み込みを介してそれぞれのｍＲＮＡの発現を制御する
対応するｍＲＮＡのＳＰＥＡＲ媒介制御がＴＩＰ６０／ａｃＨ２ＡＺ経路を通して実行されることを実証するために、本実施例では、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座に及ぼすＴＩＰ６０阻害の作用を試験した。２つのＴＩＰ６０／ＨＡＴ阻害剤、ＴＨ１８３４及びＭＧ－１４９をＨＬ６０細胞に使用して、Ｈ２Ａ．Ｚアセチル化の全レベルを低減させた（図１１Ａ）。これによって、ＳＰＥＡＲ転写物のレベルがほとんど変化しないのとは対照的に、ｍＲＮＡは有意に下方制御された（図６Ａ）。ＳＰＥＡＲと相互作用するＴＩＰ６０及びａｃＨ２Ａ．Ｚによるｃ‐ＭＹＣ発現の直接制御の可能性を調べるために、ＤＲＢ転写阻害剤の可逆性を利用して、２つのＴＩＰ６０阻害剤の存在下または非存在下での新生ｍＲＮＡ発現のレベルに及ぼす新生ＳＰＥＡＲの制御作用をモニタリングした。この手法の論理的根拠は、ＨＡＴ阻害の間の転写ブロックからリリースされた後に再出現した転写物のみを分析することであった。処理時間が短ければ、ＨＡＴ阻害のいかなる二次的な作用も除外されるはずである。
細胞をダブルチミジンブロックで同調させ、リリースしてＳ期にし、その際にＤＭＳＯ／ＤＲＢを添加した。２時間後（その間、Ｈ２Ａ．Ｚレベルは影響を受けないままであったが、ＳＰＥＡＲ及びｍＲＮＡレベルは低下した、図１０Ａ参照）、細胞を洗浄し、次いでＴＩＰ６０阻害剤の有り無しでさらに２時間インキュベートした。この間隔は、ＴＩＰ６０阻害剤が存在しない場合に、ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡ及びそのＳＰＥＡＲの両方のレベルが回復するのに十分である（図１１Ｂに示される結果）。この培地にＥＵ ＲＮＡ及びＥｄＵ ＤＮＡ類似体を補充して、転写またはアセチル化の薬物誘導阻害を免れた新生ＲＮＡ及び新たに形成されたクロマチンを収集できるようにした。ＴＩＰ６０阻害剤（２００μＭのＭＧ－１４９、及び５００μＭのＴＨ１８３４）が存在する状態で２時間経過した後（その間に、ａｃＨ２Ａ．Ｚのレベルは低下した（図１１Ａ参照））、細胞を架橋し、ｎａｓＣｈＩＰ及び新生ＲＮＡ発現分析（ｎａｓ－ｑＲＴ‐ＰＣＲ）に供した（図６Ｂ）。収集されたＲＮＡをクリックケミストリーによってビオチン化し、ストレプトアビジンビーズで単離し、ｎａｓ－ｑＲＴ‐ＰＣＲによって分析した（詳細については以降の「方法」；図８Ａ；下側パネル参照）。図６Ｃの結果から、ＴＩＰ６０の活性が阻害された場合、ＳＰＥＡＲの発現とｍＲＮＡとの相関がもはや保たれないこと、すなわち、ＳＰＥＡＲのレベルを回復させても、ｃ‐ＭＹＣ ｍＲＮＡの発現を、逆転させたＤＲＢによって規定されるレベルまで救済することができないことが示される。これらのデータは、ｃ‐ＭＹＣのｍＲＮＡ発現を制御するＳＰＥＡＲの機能がＴＩＰ６０のＨＡＴ活性の阻害によって妨害されることを示唆している。
ＳＰＥＡＲが直接ＴＩＰ６０／ａｃＨ２Ａ．Ｚ経路を通してそのｃ‐ＭＹＣ制御機能を実現していることをさらに確認するために、ＮＡＳＣｈＩＰ‐ｑＰＣＲを使用して、転写の阻害（「ＤＲＢ」）、阻害の逆転（「ＤＲＢ ＲＥＶ」）、及び２つのＴＩＰ６０の阻害剤の存在下での阻害の逆転の後に、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、及びＴＩＰ６０のクロマチン占有率の相違を評価した。特に、細胞をＤＲＢ及びＴＩＰ６０の阻害剤で処理した後のｃ‐ＭＹＣ発現の低下が、ＴＩＰ６０、ａｃＨ２Ａ．ＺまたはＨ２Ａ．Ｚのエンリッチメントの減少と相関しているかどうかをチェックすることが重要である。新生ＤＮＡを、Ｈ２Ａ．ＺまたはａｃＨ２Ａ．ＺまたはＴＩＰ６０に対する抗体を用いて免疫沈降させたクロマチンから単離し、クリックケミストリーによってビオチン化し、次いでストレプトアビジンビーズで単離し（詳細については以降の「方法」参照）、最後にｑＰＣＲによってｃ‐ＭＹＣ遺伝子座内の最大エンリッチメントに対応するアンプリコンで分析した（図４Ｅ）。新生ＲＮＡ及びクロマチンを分析することによって、転写及び／またはアセチル化の阻害によって課せられた、遺伝子座内でのｃ‐ＭＹＣ発現ならびにＴＩＰ６０、ａｃＨ２Ａ．Ｚ及びＨ２Ａ．Ｚの占有率の即時的な変化のみを調べた。図６Ｄの中央及び右側パネルから、ＳＰＥＡＲの表現が抑制されたｃ‐ＭＹＣ遺伝子座は、ＴＩＰ６０及びａｃＨ２Ａ．Ｚの両方のエンリッチメントの減少を示し、転写阻害を逆転させるとＴＩＰ６０及びａｃＨ２Ａ．Ｚの両方のエンリッチメントが完全に回復することが実証される。これは、ＳＰＥＡＲがＴＩＰ ６０の動員及びエピジェネティックなアセチル化マークの正確の配置に関与していることを示している。２つのＨＡＴ阻害剤が存在する場合、転写阻害の逆転は、未修飾Ｈ２Ａ．Ｚ及びＴＩＰ６０のエンリッチメントレベルのみを回復することがきるが（図６Ｄ、左右側パネル）、ａｃＨ２Ａ．Ｚのエンリッチメントレベルを回復することはできない（中央パネル）。対照的に、未修飾Ｈ２Ａ．Ｚの分布については大きな変化は観察されなかった（図６Ｄ；左側パネル）。さらに、Ｈ２Ａ．Ｚ、ａｃＨ２Ａ．Ｚ、またはＴＩＰ６０のエンリッチメントは、遺伝子砂漠の遺伝子座内では検出されなかった（図１１Ｃ）。局所的（ｃ‐ＭＹＣ遺伝子座のＴＳＳの近傍；図６Ｄ；左側パネル）だけでなく、実験全体を通したＨ２Ａ．Ｚの全体的なレベルも変化しなかったことを考慮すると（図１１Ａ）、これらの結果から、対応する遺伝子ｃ‐ＭＹＣのｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ媒介制御におけるＴＩＰ６０／ａｃＨ２Ａ．Ｚ経路の主導的役割が確立される。同様の結果がＰＵ．１遺伝子座について得られた（図１１Ｄ及び図１１Ｅ）。ｎａｓＣｈＩＰを使用するこれらの知見は、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑによってグローバルに得られた一般的傾向と一致する。（図４Ｃ）。
総括すると、これらの実験及び実施例に示される結果から、ＴＩＰ６０／ａｃＨ２Ａ．Ｚ経路は、それらの対応する隣接コード遺伝子のＳＰＥＡＲ媒介制御の一般的機構であることが実証される。
実施例６：ＳＰＥＡＲを使用する複製の方向の制御
本実施例の実験では、ＳＰＥＡＲが複製の方向を制御することを示す。本実施例の実験に示すように、複製の方向を変化させることによって、トリヌクレオチドリピートの拡大を逆転させることができる。これは、トリヌクレオチドリピートの拡大によって引き起こされるトリプレット病（「ＴＲＤ」）の治療に意義深い。トリヌクレオチドリピートの拡大は、遺伝子発現の不安定性をもたらすレベルに達するまで３つのヌクレオチドの反復のコピー数が増加する突然変異である。本実施例では、ＳＰＥＡＲがトリヌクレオチドリピートの拡大を逆転させることを示しており、これによってＳＰＥＡＲがトリプレット病を治療することが可能であること示される。図１２Ａ（理論に拘束されることを望むものではないが）、図１２Ｂ、図１２Ｃ、及び図１２Ｄは、ＳＰＥＡＲ様転写の誘導がどのようにトリヌクレオチドリピートのサイズに影響を及ぼすかを示す画像である。これらの実験から、１つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて複製の方向を制御することができ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤は、複製及び修復の間に生じるトリヌクレオチドリピート（「ＴＮＲ」、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、及びＧＡＡが含まれる）の拡大を逆転させることによって、トリプレット病（「ＴＲＤ」；例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症、運動障害、自閉症）の原因を根絶することが可能である。
方法
哺乳動物細胞培養
ヒト白血病細胞株ＨＬ‐６０をＡＴＣＣから得て、グルタミン含有培地中、抗生物質の非存在下、３７℃、５％ＣＯ２を有する加湿雰囲気下で増殖させた。
使用した抗体：
ヒトヒストンＨ２Ａ．Ｚに対するウサギポリクローナル‐ＣｈＩＰ Ｇｒａｄｅ（１：２，０００；Ａｂｃａｍ ａｂ４１７４）、ヒトＨ２Ａ．Ｚに対するヒツジポリクローナル（Ｋ４＋Ｋ７＋Ｋ１１）（１：２，０００；Ａｂｃａｍ ａｂ１８２６２）、ヒトＴＩＰ６０抗体に対するウサギポリクローナル。
ＲＮＡ単離
全ＲＮＡ単離を実施し、本試験で使用する全てのＲＮＡ試料をＤＮアーゼＩ（３μｇの全ＲＮＡ当たり１０ＵのＤＮアーゼＩ；３７℃で１時間；ＲＮアーゼ阻害剤の存在下）で処理した。ＤＮアーゼＩ処理後、ＲＮＡ試料を酸性フェノール（ｐＨ４．３）で抽出して、あらゆる残留する微量のＤＮＡを排除した。ｃＤＮＡ合成は、製造業者の推奨に従って、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または遺伝子特異的プライマーで行った。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で精製した。
ｑＲＴ‐ＰＣＲ
Ｓｙｂｒグリーン反応は、ｉＱ Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎスーパーミックス（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し、以下のパラメータを使用して行った：９５℃（１０分）；９５℃（１５秒）及び６０℃（１分）７２℃（１分）を４０サイクル。ＴａｑＭａｎ分析は、Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ‐ｓｔｅｐ ｑＲＴ‐ＰＣＲマスターミックス（ＵＳＢ）を以下の条件で使用して行った：５０℃（１０分）、９５℃（２分）、次いで９５℃（１５秒）及び６０℃（６０秒）を４０サイクル。
ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲに使用したプライマー：Ｈｕｍａｎ ＭＹＣ ｍＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ００１５３４０８＿ｍ１ Ｈｕｍａｎ ＭＹＢ ｍＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ００９２０５５６＿ｍ１、Ｈｕｍａｎ ＩＲＦ２ＢＰ２ ｍＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ００７６６２５０＿ｇ１、Ｈｕｍａｎ ＲＲＭ２ ｍＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ００３５７２４７＿ｇ、Ｈｕｍａｎ ＣＴＣＦ ｍＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ００９０２００８＿ｍ１、ｒＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ ４３１０８９３Ｅ、Ｈｕｍａｎ ５Ｓ ｒＲＮＡ：ＡＢＩ Ｃａｔ．＃ Ｈｓ０２３８５２５７＿ｇ１。
鎖特異的リアルタイムＲＴ ＰＣＲ（Ｓｙｂｒ）に使用したプライマー：ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ用Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅプライマー：５’‐ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＧＡ ＧＴＡ‐３’（配列番号１）；ＰＣＲプライマー：フォワード：５’‐ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＧ ＣＴＡ‐３’（配列番号２）；リバース：５’‐ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＧＣ ＡＴＡ‐３’（配列番号３）；及びＰＵ．１ ＳＰＥＡＲ用Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅプライマー：５’‐ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＣ‐３’（配列番号４）；ＰＣＲプライマー：フォワード：５’‐ＡＣＴ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＴＡ ＣＡＣ‐３’（配列番号５）；リバース：５’‐ＧＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＴＧ ＣＣ‐３’（配列番号６）。
新生ＲＮＡ／ＤＮＡの捕捉は、製造業者の指示に従って、Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ Ｎａｓｃｅｎｔ ＲＮＡ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をわずかに修正して使用した。簡単に説明すると、１．ＥＵ／ＥｄＵでの細胞の標識化。２００ｍＭのＥＵまたは３０ｍＭのＥｄＵのストック溶液を細胞に添加して、最終濃度をそれぞれ０．５ｍＭまたは３０μＭとした。２．インキュベーション。細胞を１時間または２時間インキュベートした。３．ＲＮＡ／ＤＮＡの単離。細胞を採取し、ＲＮＡ／ＤＮＡを単離し、１４μＬのＨ２Ｏに溶解させた。４．クリック反応によるＲＮＡ／ＤＮＡのビオチン化。Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ反応カクテル（反応当たり５０μＬ）を、製造業者の指示に従って調製した：１×Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ ＥＵバッファー；２ｍＭ ＣｕＳＯ４；１ｍＭビオチンアジド；１３．２５μＬの単離されたＲＮＡ；１０ｍＭ Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ反応バッファー添加剤１；１２ｍＭ Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ反応バッファー添加剤２を含有する混合物を調製した。各構成成分を添加した後、反応カクテルをボルテックスによって穏やかに混合した。Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ反応バッファー添加剤１のストックを添加すると、ＥＵ－ＲＮＡ／ＥｄＵ－ＤＮＡとビオチンアジドとのクリック反応が開始する。その後、Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ（登録商標）反応バッファー添加剤２を添加し、穏やかにボルテックスしながら３０分間インキュベートする。５．ＲＮＡ／ＤＮＡの沈降。１μＬのＵＬＴＲＡＰＵＲＥ（商標）Ｇｌｙｃｏｇｅｎ、５５μＬの７Ｍ酢酸アンモニウム、及び７５０μＬの冷却した１００％エタノールをクリック反応に添加し、－７０℃で少なくとも３０分間インキュベートし、遠心分離後、ペレットを１２５μＬのＨ２Ｏに溶解させた。６．ビオチン化ＲＮＡ／ＤＮＡのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭＹＯＮＥ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁気ビーズとの結合。ＲＮＡ／ＤＮＡ結合反応混合物は、１２５μＬの２×Ｃｌｉｃｋ‐ｉＴ ＲＮＡ結合バッファー、２μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤またはＤＮＡの場合は２μＬの水、１２５μＬの単離されたビオチン化ＲＮＡ／ＤＮＡを含んでいた。ＲＮＡ結合反応混合物を６８～７０℃で５分間加熱し、５０μＬのビーズ懸濁物を加熱したＲＮＡ結合反応混合物中に添加した。ＲＮＡ／ＤＮＡ結合反応物を含有するチューブを、ビーズが沈降しないように穏やかにボルテックスしながら、室温で３０分間インキュベートした。マグネットを使用してビーズを固定化し、５００μＬのＣｌｉｃｋ‐ｉＴ（登録商標）反応洗浄バッファー１で５回洗浄し、５００μＬのＣｌｉｃｋ‐ｉＴ（登録商標）反応洗浄バッファー２で５回洗浄した。最後に、ビーズを５０μＬのＣｌｉｃｋ‐ｉＴ反応洗浄バッファー２に再懸濁させ、捕捉されたＲＮＡを直ちに処理してｃＤＮＡ合成を行った。捕捉されたＤＮＡを５０μＬの沸騰水中に放出し、ｑＰＣＲ分析に使用した。
プライマー伸長及び５’／３’ＲＡＣＥ ＨＬ‐６０細胞株からｃＤＮＡを上記の通りに合成し、尿素‐ＰＡＧＥで泳動した。５’／３’ＲＡＣＥは、製造業者の指示に従ってＥｘａｃｔ ＳＴＡＲＴ（商標）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍＲＮＡ ５’‐＆３’‐ＲＡＣＥ Ｋｉｔを使用して行った。
ダブルチミジンブロック（初期Ｓ期ブロック）は、記載のように実施した。簡単に説明すると、ＨＬ‐６０細胞を一晩増殖させて７０～８０％コンフルエンスにし、１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）＋２．５ｍＭチミジン中で１８時間培養した（第１のブロック）。チミジンを１×ＰＢＳで洗い流し、細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中で増殖させた。８時間後、細胞をチミジンの存在下で１８時間培養し（第２のブロック）、次いで記載のようにリリースした。同調は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｃｅｎｔｅｒフローサイトメトリー施設で、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するヨウ化プロピジウム染色細胞のフローサイトメトリー分析によってモニタリングした。
ＤＲＢ及びアクチノマイシンＤ処理は、記載のように実施した。簡単に説明すると、ダブルチミジンブロックからリリースした後、ＨＬ‐６０細胞を、１００μΜの５，６‐ジクロロベンズイミダゾール１－β－Ｄ‐リボフラノシド（ＤＲＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）または０．８μΜのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で、各時点で示すように処理した。
ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲの下方制御
ｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲを標的とする２７個のｓｉＲＮＡを、ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈによってｃ‐ＭＹＣ ＳＰＥＡＲ ｓｉＰｏｏｌ（ｓｉＳＰＥＡＲ）として設計し、合成した。この配列は、以下の表１に示す。このｓｉＭｙｃを、ヌクレアーゼ不含水に溶解させ、ＨＬ‐６０細胞にトランスフェクトするのに使用した。トランスフェクトは、製造業者の指示に従ってＡｍａｘａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔ‐０１９（Ｎｕｃｌｅｏｅｆｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して行った。簡単に説明すると、２×１０６個の細胞／反応をＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を遠心分離によって収集した。１μＬのｓｉＳＰＥＡＲ及び陰性対照ｓｉＰｏｏｌ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を、反応当たり４μＬのヌクレアーゼ不含水と混合した（ｓｉＰｏｏｌ溶液）。細胞を反応当たり１００μＬの室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁させ、ｓｉＰｏｏｌ溶液と合わせた。ｓｉＳＰＥＡＲ及びｓｉＣｏｎｔｒｏｌの最終濃度は１００ｎＭであった。細胞／ｓｉＳＰＥＡＲ及び細胞／ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの懸濁物を、認定されたキュベット内に移し、Ｎｕｃｌｅｏｏｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔ‐０１９（Ｎｕｃｌｅｏｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ）に３連で通した。５００μＬのプレインキュベートした培養培地を直ちにキュベットに添加し、試料を、５００μＬのプレインキュベートした培養培地を含有する６ウェルプレートのウェルに穏やかに移した。試料を２４時間培養し、次いで電気穿孔を繰り返した。試料をさらに２４時間培養した。生細胞をＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７１４４００３）で採取し、ＲＮＡ／クロマチンを抽出した。
ショートヘアピンＲＮＡ配列は、表１に示す。
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）分画
Ｆｉｃｏｌｌ勾配精製後にカウントした同数の生細胞（約２００万個）を各単離に使用した。１～５． ２×１０６個の細胞から核を単離し、簡単に説明すると、等量の生細胞を、５ｍＭバナジル錯体、１ｍＭ ＰＭＳＦを補充した氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷冷溶解バッファーに再懸濁させた。氷冷溶解バッファーは以下のものである：１×バッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ‐ＮａＯＨ ｐＨ７．６；２５ｍＭ ＫＣｌ；０．１５ｍＭスペルミン；０．５ｍＭスペルミジン；１ｍＭ ＥＤＴＡ；２ｍＭ酪酸ナトリウム）；１．２５Ｍスクロース；１０％グリセロール；５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；０．５％ＮＰ‐４０；新たに補充された、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭロイペプチン、×４００として添加；２ｍＭペプスタチン、×４００として添加；１００ｍＭベンズアミジン、×４００として添加；プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８３６１５３）、錠剤１個／３７５μＬのＨ２Ｏ、×１００として添加；１００ｍＭ ＰＭＳＦ、×１００として添加）、２ｍＭバナジル錯体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び２０単位／ｍＬのＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡｇｕａｒｄ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。試料を０℃で約１０分間インキュベートし、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーに数回かけた。ペレット化した核を０．５ｍｌの溶解バッファーに再懸濁させ、２．２５ｍＬの希釈バッファー（２．１３ｍＬの「クッション」バッファー＋０．１２ｍＬの０．１ｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で希釈し、プロテアーゼ阻害剤を新たに補充し、１本のＳＷ ５５Ｔｉチューブ内に２ｍＬの「クッション」（２００ｍＬの「クッション」バッファー、これは１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；１５ｍＬの２０×バッファーＡ；３０ｍＬのグリセロール；２４０ｍＬの２．５Ｍスクロース；新たに補充されたプロテアーゼ阻害剤からなる）上に重ねて入れ、２４，４００ｒｐｍで６０分間４℃で遠心分離した。ＰＢＳ／１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄した。７．次いで核を１．８ｍｌの細胞骨格バッファー（ＣＳＫ－５０：１０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．８；３００ｍＭスクロース、５０ｍＭ ＮａＣｌ；３ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＥＧＴＡ；５ｍＭバナジル錯体；１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁させた。８． ２０μｌ（２００Ｕ）のＤＮアーゼＩを添加し、３７℃で３０分間のインキュベーションを実施し、氷上で冷却した。９． ２００μｌの２．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（最終２５０ｍＭ）の添加後、核をロッキングプラットフォーム上で４℃で４０分間インキュベートし、２０００ｇで５分間４℃で遠心沈殿させた。１０．上澄み画分は廃棄した。１１．ＲＮＰ含有ペレットを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｌのＲＩＰバッファー＃４（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％デオキシコール酸Ｎａ、０．５％Ｎ‐ラウロイルサルコシン、１×プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁させた。１２．超音波処理によって可溶化した後に、ペレットを氷上で冷却し、５，０００ｇで５分間４℃で遠心沈殿させた。１３．上清‐ＲＮＰ画分（それぞれ約２ｍｌ）を収集した。１４． １．２μｌの２０％ＳＤＳ；０．８μｌの１Ｍ ＤＴＴ溶液を４０μｌのＲＮＰ画分に添加し、少なくとも１分間沸騰させた。１５．予め平衡化したＧ２５カラム（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ ＤＴＴ；０．６％ＳＤＳを有する）で試料を脱塩し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティング分析を行った。
ウェスタンブロッティング分析
各試料当たりおよそ０，２×１０６個の細胞からの全細胞溶解物を、１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。免疫ブロットを以下の一次抗体で、一晩４℃で染色した：Ｈ２Ａ．Ｚ（１：２，０００；Ａｂｃａｍ ａｂ４１７４）、Ｈ２Ａ．Ｚアセチル（Ｋ４＋Ｋ７＋Ｋ１１）（１：２，０００；Ａｂｃａｍ ａｂ１８２６２）またはＴＩＰ６０（１：１０００；Ｂｒｕｎｏ Ａｍａｔｉからの寄贈）。全ての二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を１：５，０００に希釈し、ＴＢＳＴ／５％ＢＳＡと共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標））ＥＣＬシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃３２１０６）を使用して検出した。
タンデム質量分析（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ）
全細胞抽出物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分離し、これをクーマシーブリリアントブルーで染色し、関心対象のタンパク質バンドを励起させた。ゲル片を５５ｍＭ ＤＴＴで還元し、１０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でアルキル化し、ＴＰＣＫ修飾トリプシン／ＬｙｓＣミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）で一晩ｐＨ＝８．３で消化した。消化を１％ＴＦＡで停止し、ペプチドをＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０μＬまで乾燥させた。データ依存分析（ＤＤＡ）を用いるＨＣＤによる高分解能ハイブリッドＱＥｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する、陽イオンモードＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、ペプチド混合物を分析した。ペプチドは、自己充填式長さ１５ｃｍ×内径７５μｍのＣ１８フリットマイクロキャピラリーカラムを使用するＥＡＳＹ‐ｎＬＣナノフローＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３００ｎＬ／分で使用して送達し、分離した。溶媒勾配条件は以下の通りであった：バッファーＡ（０．９％アセトニトリル／０．１％ギ酸／９９．０％水）中３％～３８％のバッファーＢ（１００％アセトニトリル）で９０分間。生ファイルは、ＭａｘＱｕａｎｔバージョン１．５．２．８を用いて、事前設定された標準設定で、多重度１で処理した。カルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニン酸化及びタンパク質Ｎ‐アセチル化を可変修飾とみなした。検索結果は、０．０１の誤発見率でフィルタリングした。リバースヒット及び部位特定のみ、ならびに潜在的な汚染物質は除去した。ＭＳデータは、原稿が受理され次第、ＰＲＩＤＥを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸＣｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託される。
核クロマチン（ＣｈＩＰ）及びＲＮＡ免疫沈降（ｎＲＩＰ）
ＣｈＩＰは以下のように行った。細胞を、１％ホルムアルデヒドで１０分間室温で架橋した。１×１０６個の細胞のペレットを免疫沈降のために使用し、氷上で１０分間溶解させ、Ｂｒａｎｓｏｎ ２５０デジタルソニケーターを使用してクロマチンを断片化した。各ＣｈＩＰを４μｇの抗体で行い、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡ ＤｙｎａｂｅａｄｓとプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓとの５０／５０スラリーを使用して、エンリッチされたクロマチンを捕捉し、次いでこれを洗浄し、その後逆架橋及びプロテイナーゼＫ消化を６５℃で行った。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して、後続のライブラリー構築のためにＣｈＩＰ ＤＮＡをクリーンアップし、単離した。以下の抗体をＣｈＩＰに使用した：Ｈ２Ａ．Ｚ（Ａｂｃａｍ ａｂ４１７４、ロットＧＲ３１７６８２０‐１）、ａｃＨ２Ａ．Ｚ（Ａｂｃａｍ ａｂ１８２６２、ロットＧＲ３０６３９７‐１）、ＴＩＰ６０抗体；及びＩｇＧ（Ａｂｃａｍ ａｂ１７１８７０）。フォールドエンリッチメントを、式２（－ΔΔＣｔ（ＣｈＩＰ／非免疫血清））を使用して計算した。ＣｈＩＰに使用したプライマーセットは、表２に列挙する。ｎＲＩＰを行い、架橋された核を以下のように収集した：１． ６０×１０６個のＨＬ‐６０細胞を、１％ホルムアルデヒド（ホルムアルデヒド溶液、新たに作製したもの：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ ＥＧＴＡ；１１％ホルムアルデヒド）で１０分間室温で架橋した。１／１０容量の２．６６Ｍグリシンを添加し、室温で５分間、氷上で３分間保持することによって、架橋を停止した。３．細胞ペレットを氷冷ＰＢＳ（１ｍＭ ＰＭＳＦを新たに補充したもの）で２回洗浄した。４．細胞ペレットを、以下の細胞溶解バッファー（容量＝４ｍＬ）に再懸濁させた：１×バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．５％ＮＰ‐４０、新たに補充された、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル：Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８３６１５３、錠剤１個／３７５μＬのＨ２Ｏ、×１００として添加）、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、及び０．２ｍＭバナジル錯体（ＮＥＢ）。５．細胞を０℃で１０～１５分間インキュベートし、Ｄｏｕｎｃｅ中でホモジナイズした（内筒Ａで１０回、内筒Ｂで４０回）。６． ２，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することによって核を回収した。７．核を、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．２ｍＭバナジル錯体を補充した、３ｍｌの１×再懸濁バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ‐ＮａＯＨ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ ＭｇＣｌ ２）に再懸濁させた。８．ＤＮアーゼＩ処理（２５０Ｕ／ｍｌ）を３７℃で３０分間行い、ＥＤＴＡ（最終濃度２０ｍＭ）を添加して反応を停止した。９．再懸濁された核を、３０％の出力で２０秒間（３秒ごとに１パルス）、１回超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｅｒ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）。免疫沈降は、次のように行った： １．事前クリア前に、試料を調整して以下のようにした：１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００；０．１％デオキシコール酸ナトリウム；０．０１％ＳＤＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；プロテアーゼ阻害剤；０．２ｍＭバナジル錯体；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ。２．事前クリア工程：約５０μｌの磁気ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＧ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ；＃Ｓ１４２５Ｓまたは＃Ｓ１４３０Ｓ ＮＥＢ）を試料に添加し、インキュベーションをロッキングプラットフォーム上で１時間４℃で実施した。３．ビーズを磁場中で除去した。４．次いで試料を以下の５つのアリコートに分けた：（ｉ）関心対象の抗体：（ｉ）Ｈ２Ａ．Ｚ抗体（ａｂ４１７４）；（ｉｉ）ａｃＨ２Ａ．Ｚ抗体（ａｂ１８２６２）；（ｉｉｉ）ＴＩＰ６０抗体；（ｉｖ）免疫前血清：ＩｇＧ（ａｂ１７１８７０）；（ｖ）抗体なし、血清なし（インプット）。５． ５μｇの抗体または免疫前血清をそれぞれのアリコートに添加し、インキュベーションをロッキングプラットフォーム上で一晩４℃で行った。インプットは、ＳＤＳを添加して２％の最終濃度にした後、－２０℃で保存した。ＩＩ日目。６． ２００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａコーティングされた超常磁性ビーズ（８μｇのＩｇＧを結合させるのに十分）を試料に添加し、４℃で１時間ロッキングプラットフォーム上でインキュベートした。７．磁場中でビーズを免疫沈降バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８．０；１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００；０．５％ＮＰ‐４０、新たに補充された、０．２ｍＭのバナジル錯体及び０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で６回洗浄した。８．ＤＮＡ／ＲＮＡを溶液中に放出して架橋を逆転させるためのプロテイナーゼＫ処理を、２００μｌの：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４；免疫沈降試料の場合０．５％ＳＤＳ中で、並行してインプットでも、５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを使用して５６℃で一晩行った。９．ＩＩＩ日目。ビーズを磁場中で除去した。１０．フェノール（ｐＨ４．３）抽出を、ＮａＣｌ（０．２Ｍの最終濃度）の添加後に行った。１１．エタノール沈降（グリコーゲンの存在下）；－２０℃で３時間。１２．ペレットを１８０μｌのＨ２Ｏに溶解させ、７５℃で３分間加熱し、直ちに氷上で冷却した。１３．試料を、３００Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ阻害剤の存在下で、×１バッファー＃２（ＮＥＢ）中で、３７℃で３０分間、ＤＮアーゼ Ｉ（２５０Ｕ／ｍｌ）で処理した。１４．フェノール（ｐＨ４．３）抽出及びＥｔＯＨ沈殿を繰り返した。１５． ＲＮＡペレットを５０μｌのＨ２Ｏに溶解させた。
ＲＮＡ電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ（ＲＥＭＳＡ）
ＲＮＡオリゴヌクレオチド（１５ｐｍｏｌ）を、［γ‐３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で末端標識した。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで製造業者の指示に従ってＧ‐２５スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して、取り込まれなかった放射能を除去した。標識された試料を、１０％ポリアクリルアミドゲルでゲル精製した。結合反応は、以下のバッファー中、１０μＬの容量で実施した：５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、３％ｖ／ｖグリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ。５μｇの完全長の精製されたＨ２Ａ．Ｚ（Ａｂｃａｍ）及びＴＩＰ６０（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）タンパク質を、１．１ｎＭの３２Ｐ標識ｓｓＲＮＡと共にインキュベートした。全ての反応物を氷上でアセンブルし、次いで室温で３０分間インキュベートした。試料を、６％のネイティブポリアクリルアミドゲル（０．５×ＴＢＥ）に４℃で３時間、１４０Ｖでロードした。様々な濃度（１μΜ～１０ｍＭ）のＨ２Ａ．Ｚ及びＫ７アセチル化Ｈ２Ａ．Ｚペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ）を、最終容量１０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、及び４０Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｉｎ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール中で、一定量のプローブと共にインキュベートした。その後、１μｌのグルタルアルデヒド（最終濃度０．２％）を混合物中に添加し、室温で１５分間インキュベートした。試料を、１０％のネイティブポリアクリルアミドゲル（０．５×ＴＢＥ）に４℃で３時間、１７０Ｖでロードした。全てのゲルをメタノール及び酢酸で固定した後、乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光させた。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは表３に列挙する。
定量化及び統計分析
ＣｈＩＰシーケンシング分析
ＣｈＩＰライブラリーの構築を行い、ＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォーム上で３６ヌクレオチドの読み取り長でペアエンドシーケンシングした。得られたアライメントファイルを１５０ｂｐにトリミングし、アダプタートリミング及び配列品質管理のためにｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ、Ｃｕｔａｄａｐｔ、及びＦａｓｔＱＣで処理した。ＣＨＩＰ‐Ｓｅｑリードを、ＳＴＡＲでｈｇ３８ヒト参照ゲノムにアライメントし、ＳＴＡＲでは「‐‐ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ １」、「‐‐ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ ０．８」、「‐‐ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ １」「‐‐ａｌｉｇｎＥｎｄｓＴｙｐｅ ＥｎｄＴｏＥｎｄ」を使用し、残りの選択肢をデフォルトに設定した。ｄｅｅｐＴｏｏｌｓを使用して、重複したリードを除去し、ライブラリサイズによって正規化し、値を「１００万当たりのカウント」に変換して、ａｃＨ２ＡＺのｂａｍファイルをｂｉｇＷｉｇに変換した。重複したリードを、ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓを使用してＨ２ＡＺライブラリーから除去し、その後、ＤＡＮＰＯＳ２ソフトウェアからのＤＰＯＳアルゴリズムを使用して分析した。得られた平滑化及び分位正規化されたｗｉｇファイルを、ＵＣＳＣからのｗｉｇＴｏＢｉｇＷｉｇツールを使用してｂｉｇＷｉｇファイルに変換した。ＤｅｅｐＴｏｏｌｓを使用して、ＵＣＳＣの既知の規範表にアノテーションされた遺伝子の全ての転写開始点周辺のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナルのヒートマップを定量化し、プロットした。転写開始点周辺の領域のメタプロットは、Ｒで生成した。散布図は、Ｒで関数ｓｍｏｏｔｈＳｃａｔｔｅｒを用いて生成し、入力として、ヒートマップを生成するために使用したマトリックスから抽出したＴＳＳ周辺のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナル下の面積のアークサイン変換値を使用した。ＴＳＳ周辺のエンリッチメントを比較する散布図は、ｍａを使用してｂｉｇＷｉｇにおけるシグナル下の面積を計算し、その後信号を変換することによって生成した。ａｃＨ２ＡＺの場合、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ及びＩｇＧ対照のマッピングされたリードを、ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑピークの統計的有意性を評価するためにＨＯＭＥＲで処理した。ピークサイズは５００ｂｐに設定し、１０００ｂｐの領域内の隣接するピークをつなぎ合わせ、ＣｈＩＰシグナル対ＩｇＧ対照ピークを、ポアソンｐ値閾値１・１０－３及びポアソンタグ閾値３２を使用して、ＣｈＩＰシグナル対ＩｇＧ対照間のピーク倍数変化４で、サイズ１０００ｂｐの領域上でフィルタリングした。
遺伝子ＴＳＳ遺伝子座周辺（＋／－２ｋｂ）のＨ２ＡＺ及びａｃＨ２ＡＺのＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナルのエンリッチメントの比較
エンリッチメントは、ゲノム内の全ての遺伝子について、ＴＳＳ周囲のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑシグナルによって生成された曲線下の面積として計算し、その後逆正弦関数を使用して変換した。得られた値を使用して、ＤＭＳＯ試料のＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ占有率を、ＤＲＢ及びＡＣＴＤ試料に対して比較した。この比較は、色勾配を有する散布図として示されており、この図では、各ＴＳＳがドットであり、高濃度のドットの領域は赤色で示されるのに対して、青色は濃度がないことを意味している。
ＲＩＰシーケンシング分析
免疫沈降されたＲＮＡをシーケンシングのために処理し、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ（商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＭＲＺＧ１２６ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いてＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させた。ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｖ２ ＲＮＡ‐Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＳＳＶ２１１０６ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーを３％アガロースゲルで最終サイズ選択に供した。Ｑｉａｑｕｙ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して２５０～５００ｂｐの断片を切り取り、回収した。シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ‐２０００）によって生成されたペアエンドリードを１５０ｂｐにトリミングし、さらにアダプタートリミング及び配列品質制御のためにｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ、Ｃｕｔａｄａｐｔ、及びＦａｓｔＱＣで処理し、スプライスジャンクションデータベースの構築に使用される断片のオーバーハング長を１５０ｂｐにしてＳＴＡＲを使用して、前処理したシーケンシングファイルをＧＲＣｈ３８ヒト参照ゲノム（リリース８８）にマッピングした。ＲＩＰ及びＩｇＧ対照のマッピングされたリードは、ＲＩＰピークの統計的有意性を評価するために、ＨＯＭＥＲ（ＰＭＩＤ：２０５１３４３２）で処理した。この処理において、長さ１００ｂｐのビンに広がる個々のピークをつなぎ合わせて可変長領域にし、ＲＩＰシグナル対ＩｇＧ対照のピークを、ポアソンｐ値閾値１・１０－３及びポアソンタグ閾値３２を使用して、ＲＩＰシグナル対ＩｇＧ対照間のピーク倍数変化４で、サイズ１０００ｂｐの領域上でフィルタリングした。ＨＯＭＥＲを使用して、統計的に有意なピークを近いコード領域（少なくとも１つの有意なＲＩＰｓｅｑピークと重なる１０４０３の遺伝子座に対応する）とのその距離に基づいてアノテーションした。
ＲＮＡシーケンシング
ＲＮＡをＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ＭＲＣ）で抽出した。ＲＮＡ試料を、ＤＮアーゼＩ（全ＲＮＡ３μｇ当たり１０ＵのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で、３７℃で１時間、ＲＮアーゼＡ阻害剤の存在下で処理した。Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ（商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＭＲＺＧ１２６ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、ＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させた。ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｖ２ ＲＮＡ‐Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＳＳＶ２１１０６ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーを３％アガロースゲルで最終サイズ選択に供した。Ｑｉａｑｕｙ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して２５０～５００ｂｐの断片を切り取り、回収した。ライブラリーをＨｉ‐Ｓｅｑ‐２０００ Ｉｌｌｕｍｉｎａでシーケンシングした。ペアエンドリードを、アダプタートリミング及び配列品質管理のためにｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ、Ｃｕｔａｄａｐｔ、及びＦａｓｔＱＣで前処理し、さらにスプライスジャンクションデータベースの構築に使用される断片のオーバーハング長を１５０ｂｐにしてＳＴＡＲを使用して、ＧＲＣｈ３８ヒト参照ゲノム（リリース８８）にアライメントした。アライメントファイルをＲＳＥＭで分析して、遺伝子の発現レベルを推定した。有意なＲＩＰ‐Ｓｅｑピークの転写を確認するために、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ Ｂｅｄユーティリティを使用してピーク間隔をＲＩＰ‐Ｓｅｑアセンブリと重ね、ＮＧＳＰＬＯＴを使用して転写開始点の領域及びコード領域におけるＳＰＥＡＲと後期遺伝子発現の重なりを生成した。全ての統計分析及び関連するプロットは、アドホックＲスクリプト（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ）上のｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して生成した。
モチーフ発見
ＲＮＡ結合モチーフを、以下の工程に従って特定した：
１）ＳＰＥＡＲの発現についてのフィルタリング、
２）ＲＮＡ‐Ｓｅｑからの５’及び３’のＳＰＥＡＲの境界の予測
３）選択されたＳＰＥＡＲにおける共通のモチーフの探索
合計で、ＨＬ６０（Ｂｒｏａｄ ＣｈｒｏｍＨＭＭ）における１３８９１の予測されるプロモーター遺伝子座をカバレッジ計算に供した。ＳＰＥＡＲをその発現に従ってさらに選択し、上位四分位サブセット（７５パーセンタイル）をさらなる分析のために選択した。モチーフ発見に先立って、５’及び３’のＳＰＥＡＲの境界をＲＮＡ‐Ｓｅｑから推測した。具体的には、カバレッジトラックをスキャンし、ＦｒｉｅｄｍａｎのＳｕｐｅｒＳｍｏｏｔｈｅｒ法（Ｒ、ｓｕｐｓｍｕ）を介して、５’及び３’のＳＰＥＡＲの境界をカバレッジレベルの局所的な低下として特定した。ｆｉｎｄＧｅｎｏｍｅＭｏｔｉｆをＲＮＡモードで使用して（Ｈｏｍｅｒ一式：ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ上でｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ）、選択肢「‐ｌｅｎ １０，２０，３０」を用い、ヒトプロモーターをバックグラウンドとして使用して（モチーフについてスキャンされたものを除く）、合計で１９４２のＳＰＥＡＲを共通モチーフについてスキャンした。モチーフを、有意差（ｐ＜＝ｅ－１０）及びフォールドエンリッチメント（観察対予想≧２００）の両方に従ってフィルタリングし、３つのエンリッチされたモチーフ（それぞれ、ＲＭ３、５、及び９）を特定した。
ａｃＨ２Ａ．ＺのＲＩＰ‐ＳｅｑとＴＩＰ６０のＲＩＰ‐Ｓｅｑとが重なるピークにおいて発見されたモチーフの存在を、重ならないピークをバックグラウンドとして使用して‐ｍｋｎｏｗｎ選択肢を用いてｆｉｎｄＧｅｎｏｍｅＭｏｔｉｆを実行することによって評価した。同じ分析を、ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ、及びｒＲＮＡ転写物について実施した。繰り返し要素をＵＣＳＣ（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）から取得し、≧２ｆｐｋｍで発現された転写物をモチーフスキャン用に選択した。ｒＲＮＡゲノム領域は、ＵＣＳＣ Ｔａｂｌｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｔａｂｌｅ：ｒｍｓｋ、ｒｅｐＣｌａｓｓ：ｒＲＮＡ）から取得した。
統計分析：
全ての統計分析は、Ｒ一式（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ）上、ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用して行った。ＣｈＩＰ‐Ｓｅｑ、ＲＩＰ‐Ｓｅｑ、及びＲＮＡ‐Ｓｅｑの累積リードカウントシグナルに対応する分布の統計比較は、マン・ホイットニー・ウィルコクソン符号付き順位検定を信頼区間（ｐ＜０．０５）で使用して行った。
データ利用性
データは、遺伝子オムニバスデータベースからアクセッションＩＤ番号：ＧＳＥ１１７６６３で入手可能である（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ）、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１１７６６３
トークン入力：ａｚａｔｓｗｃｗｌｚｃｎｄｅｚ。
データベース提出におけるファイル：
ＳＭ３３０５７８４ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＭｙｃ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８５ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８６ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＭｙｃ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８７ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８８ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８９ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９０ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９１ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９２ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９３ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９４ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９５ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９６ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９７ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５７９８ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５７９９ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５８００ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５８０１ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ａ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５８０２ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ Ｔｉｐ６０
ＧＳＭ３３０５８０３ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｒａｂｂｉｔ
ＧＳＭ３３０５８０４ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｓｈｅｅｐ
ＧＳＭ３３０５８０５ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｇｏａｔ
ＧＳＭ３３０５８０６ ＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０
ＧＳＭ３３０５８０７ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０
ＧＳＭ３３０５８０８ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ
ＧＳＭ３３０５８０９ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ
ＧＳＭ３３０５８１０ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ
ＧＳＭ３３０５７８４ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＭｙｃ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８５ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８６ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＭｙｃ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８７ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８８ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７８９ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９０ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９１ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９２ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９３ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５７９４ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９５ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９６ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ＩｇＧ
ＧＳＭ３３０５７９７ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５７９８ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５７９９ ＣｈＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ ｉｎｐｕｔ
ＧＳＭ３３０５８００ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ Ｈ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５８０１ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ａ ａｃＨ２Ａ．Ｚ
ＧＳＭ３３０５８０２ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ Ｔｉｐ６０
ＧＳＭ３３０５８０３ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｒａｂｂｉｔ
ＧＳＭ３３０５８０４ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｓｈｅｅｐ
ＧＳＭ３３０５８０５ ＲＩＰｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＩｇＧ ｇｏａｔ
ＧＳＭ３３０５８０６ ＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０
ＧＳＭ３３０５８０７ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０
ＧＳＭ３３０５８０８ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＭＳＯ‐ｔｒｅａｔｅｄ
ＧＳＭ３３０５８０９ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＤＲＢ‐ｔｒｅａｔｅｄ
ＧＳＭ３３０５８１０ ｎａｓＲＮＡｓｅｑ ＨＬ‐６０ ＡｃｔＤ‐ｔｒｅａｔｅｄ


Figure 2024517774000002
Figure 2024517774000003


Figure 2024517774000004

Figure 2024517774000005
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置きかえられてもよい。よって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
上の説明から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神及び範囲を逸脱することなく、様々な用途及び状況に適合するように、本開示の様々な変更及び修正を行うことができる。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。

Claims (116)

  1. がんの治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳ期初期ＲＮＡ（ＳＰＥＡＲ）の阻害剤を前記対象に投与すること、または
    （ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の前記対象由来の細胞を投与すること
    を含み、
    前記がんが、エピジェネティックな調節不全によって特徴付けられる、前記方法。
  2. がんの発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を前記対象に投与すること、または
    （ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の前記対象由来の細胞を投与すること
    を含み、前記対象が、エピジェネティックな調節不全を含む前がん状態によって特徴付けられる、前記方法。
  3. エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を前記対象に投与すること、または
    （ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の前記対象由来の細胞を投与することを含む、前記方法。
  4. エピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患または障害の発症または進行の予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を前記対象に投与すること、または
    （ｉｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触されていた、有効量の前記対象由来の細胞を投与することを含む、前記方法。
  5. がんまたは前がん細胞における活性なヒストンマークの形成をリセットするための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または
    （ｉｉ）前記対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
  6. 遺伝的疾患または障害によって特徴付けられる細胞における未病状態に関連する複製起点複合体を回復させるための方法であって、
    （ｉ）有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤を対象に投与すること、または
    （ｉｉ）前記対象由来の細胞を、有効量の１つ以上のＳＰＥＡＲもしくは１つ以上のＳＰＥＡＲの阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
  7. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節を引き起こす、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節が、前記遺伝子の上方制御である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節が、前記遺伝子の下方制御である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記ＳＰＥＡＲによって制御される１つ以上の遺伝子の発現レベルの調節が、未処置の状態と比較したときの前記１つ以上の遺伝子のレベルの回復である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記１つ以上の遺伝子が、がん遺伝子またはがん原遺伝子である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記遺伝子がｍｙｃ遺伝子である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記ｍｙｃ遺伝子が、ｃ‐ＭＹＣ（ＭＹＣ）、ｌ‐ｍｙｃ（ＭＹＣＬ）、及びｎ－ｍｙｃ（ＭＹＣＮ）から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
  15. １つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、人工複製起点複合体を生成する、請求項６～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. １つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させて、複製の方向を制御する、請求項６～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. １つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、（ｉ）複製の有害な方向の進行を遅らせるかもしくは複製の有害な方向を防止し、複製の反対方向を活性化し、及び／または（ｉｉ）トリヌクレオチドリピートの部位を調節し、場合により前記トリヌクレオチドリピートのサイズを低減させるかもしくは発現を逆転させる、請求項６～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. １つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤がトリプレット病（「ＴＲＤ」）を治療または予防する、請求項６～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ＴＲＤが、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ‐Ｅ症候群、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症、運動障害、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、または自閉症である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＴＲＤが、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病及び／または非ポリグルタミン病である、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ポリグルタミン病が、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症またはケネディ病）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、またはＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記非ポリグルタミン病が、ＦＸＳ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、及び早発卵巣不全（ＰＯＦ）である、請求項２０に記載の方法。
  23. １つ以上のＳＰＥＡＲを過剰発現させ、１つ以上のＳＰＥＡＲ阻害剤が、トリヌクレオチドリピートの拡大を逆転させることによってＴＲＤを治療または予防する、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記トリヌクレオチドリピートが、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、及びＧＡＡから選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲに関連するエピジェネティックマークの活性を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記阻害剤が、エピジェネティックマークの形成及び／または再利用を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記阻害剤が、遺伝子の活性化を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記阻害剤が、遺伝子の活性化を引き起こす、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記阻害剤が、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びヌクレオソームリモデリングのうちの１つ以上を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ヒストン修飾が、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ヒストン修飾が、ヒストンアセチル化である、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲによって制御される病原性ヌクレオチド拡大の調節を引き起こす、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲと１つ以上のヒストンまたはヒストン関連タンパク質との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４タンパク質、またはそれらの変異体のうちの１つ以上である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、Ｈ２Ａ．Ｚまたはその変異体、及びＨ３．３またはその変異体のうちの１つ以上である、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼが、ＴＩＰ６０またはその変異体である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲとＯＲＣの１つ以上の構成成分との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ＯＲＣの１つ以上の構成成分が、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、及びＯＲＣ５、またはそれらの変形体のうちの１つ以上から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記エピジェネティックな調節不全が、１つ以上のエピジェネティックマークの調節不全である、請求項１～４及び７～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記１つ以上のエピジェネティックマークのエピジェネティックな調節不全が、未病状態と比較したときの付加的なエピジェネティックマークの活性化、及び／または未病状態と比較したときのエピジェネティックマークの不活性化を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記エピジェネティックな調節不全が、改変された複製起点である、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記改変された複製起点が、未病状態と比較したときの付加的な複製起点の活性化、及び／または未病状態と比較したときの複製起点の不活性化を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象が、エピジェネティックな調節不全に関連するがんに罹患している、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記がんが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫、肝癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓もしくは腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、子宮もしくは子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む）、ならびに他の癌腫及び肉腫、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫に関連する異常な血管増殖、及びメグズ症候群のうちの１つ以上である、請求項１、２、５、または４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記ＳＰＥＡＲが、非コードＲＮＡである、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＳＰＥＡＲが、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ＳＰＥＡＲが、約２００ヌクレオチド以上である、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記ＳＰＥＡＲが、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ＳＰＥＡＲが、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ＳＰＥＡＲが、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む、請求項４６～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のステムループ様構造を含む、請求項４６～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記阻害剤が小分子である、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記小分子が、前記ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記阻害剤が核酸である、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記核酸が、前記ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記核酸が、前記ＳＰＥＡＲの一部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記阻害剤の１つ以上のヌクレオチドが化学的に修飾されている、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記化学的修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アルキル‐ＲＮＡ単位、２’‐ＯＭｅ‐ＲＮＡ単位、２’‐アミノ‐ＤＮＡ単位、２’‐フルオロ‐ＤＮＡ単位、ペプチド核酸（ＰＮＡ）単位、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）単位、ＩＮＡ単位、及び２’‐Ｏ‐（２－メトキシエチル）‐ＲＮＡ（２’ＭＯＥ ＲＮＡ）単位から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記阻害剤が、前記ＳＰＥＡＲの発現及び／または活性を調節する、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記対象由来の細胞が、生物学的試料に由来する、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記生物学的試料が、生検材料、組織、または体液を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記生物学的試料が、腫瘍細胞、培養細胞、幹細胞、及び分化細胞のうちの１つ以上を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. １つ以上のエピジェネティック薬を投与するか、または前記細胞を１つ以上のエピジェネティック薬と接触させることをさらに含む、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記エピジェネティック薬が、アザシチジン、エシタビン、ゼブラリン、パノビノスタット、ベリノスタット、ダシノスタット、キシノスタット、テフィノスタット、アセジナリン、エンチノスタット、モセチノスタット、チダミド、酪酸、ピバネクス、フェニル酪酸、及びバルプロ酸から場合により選択される、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記エピジェネティック薬が、ボリノスタット、ロミデプシン、トリコスタチンＡ、及びトラポキシンＡから場合により選択される、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項６７に記載の方法。
  70. エピジェネティック調節剤を作製する方法であって、
    （ａ）エピジェネティック調節剤を、以下によって特定すること：
    （ｉ）前記薬剤が、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用するかどうかを決定すること；
    （ｉｉ）前記薬剤を、１つ以上のＳＰＥＡＲと結合または相互作用する能力に基づいてエピジェネティック調節するとして分類すること；及び
    （ｂ）エピジェネティックな調節不全に関連するがんまたはエピジェネティックな調節不全に関連する遺伝性疾患もしくは障害の治療または予防から選択される療法における使用のために、前記薬剤を製剤化すること、を含む、前記方法。
  71. 前記薬剤が、前記ＳＰＥＡＲに関連するエピジェネティックマークの活性を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記薬剤が、エピジェネティックマークの形成及び／または再利用を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項７０または７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記薬剤が、遺伝子の活性化を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記薬剤が、遺伝子の活性化を引き起こす、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記薬剤が、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びヌクレオソームリモデリングのうちの１つ以上を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項７０～７３のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記ヒストン修飾が、ヒストンアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びタンパク質分解、ならびにクロマチンリモデリングの改変のうちの１つ以上から選択される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ヒストン修飾がヒストンアセチル化である、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 前記薬剤が、前記ＳＰＥＡＲによって制御される病原性ヌクレオチド拡大の調節を引き起こす、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記薬剤が、前記ＳＰＥＡＲと１つ以上のヒストンまたはヒストン関連タンパク質との間の相互作用を低減させるかまたは実質的に排除する、請求項７０～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４タンパク質、またはそれらの変異体のうちの１つ以上である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、Ｈ２Ａ．Ｚまたはその変異体、及びＨ３．３またはその変異体のうちの１つ以上である、請求項７９または８０に記載の方法。
  82. 前記ヒストンまたはヒストン関連タンパク質が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである、請求項７９に記載の方法。
  83. 前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼが、ＴＩＰ６０またはその変異体である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記エピジェネティックな調節不全が、１つ以上のエピジェネティックマークの調節不全である、請求項７０～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記１つ以上のエピジェネティックマークのエピジェネティックな調節不全が、未病状態と比較したときの付加的なエピジェネティックマークの活性化、及び／または未病状態と比較したときのエピジェネティックマークの不活性化を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記エピジェネティックな調節不全が、改変された複製起点である、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記ＳＰＥＡＲが、非コードＲＮＡである、請求項７０～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記ＳＰＥＡＲが、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ＳＰＥＡＲが、約２００ヌクレオチド以上である、請求項８７または８８に記載の方法。
  90. 前記ＳＰＥＡＲが、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記ＳＰＥＡＲが、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記ＳＰＥＡＲが、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む、請求項８７～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む、請求項８７～９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のステムループ様構造を含む、請求項８７～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記薬剤が小分子を含む、請求項７０～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記小分子が、前記ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記薬剤が核酸を含む、請求項７０～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記核酸が、前記ＳＰＥＡＲとヒストンもしくはヒストン関連タンパク質またはＯＲＣとの相互作用を直接的または間接的に調節する、請求項９７または９８に記載の方法。
  100. 前記核酸が、前記ＳＰＥＡＲの一部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項９７～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記薬剤の１つ以上のヌクレオチドが化学的に修飾されている、請求項９７～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記化学的修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、２’‐Ｏ‐アルキル‐ＲＮＡ単位、２’‐ＯＭｅ‐ＲＮＡ単位、２’‐アミノ‐ＤＮＡ単位、２’‐フルオロ‐ＤＮＡ単位、ペプチド核酸（ＰＮＡ）単位、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）単位、ＩＮＡ単位、及び２’‐Ｏ‐（２－メトキシエチル）‐ＲＮＡ（２’ＭＯＥ ＲＮＡ）単位から選択される、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項９７～１００に記載の方法。
  104. 前記薬剤が、前記ＳＰＥＡＲの発現及び／または活性を調節することが可能である、請求項７０から１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. エピジェネティック調節療法に対する対象の応答を評価するための方法であって、前記対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することを含み、
    （ｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが低減していることが、療法に対する応答を示し、及び／または
    （ｉｉ）治療前の状態と比較してＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが増加しているかもしくは実質的に変化していないことが、療法に対して応答がないかもしくは乏しいことを示す、
    前記方法。
  106. エピジェネティック調節療法に対する対象の応答の可能性を予測するための方法であって、前記対象からの生物学的試料中のＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルを評価することを含み、
    （ｉ）ＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが高いことが、前記療法に対する応答の可能性の高さを示し、及び／または
    （ｉｉ）ＳＰＥＡＲの１つ以上のレベルが低いことが、前記療法に対する応答の可能性の低さを示す、
    前記方法。
  107. 前記ＳＰＥＡＲが、非コードＲＮＡである、請求項１０５または１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記ＳＰＥＡＲが、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記ＳＰＥＡＲが、約２００ヌクレオチド以上である、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. 前記ＳＰＥＡＲが、活性遺伝子のプロモーターに隣接する領域にコードされる、請求項１０７～１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記ＳＰＥＡＲが、細胞周期の初期Ｓ期に誘導される、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記ＳＰＥＡＲが、３、５、及び９から選択される１つ以上のモチーフを含む、請求項１０７～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のＲＭ９Ａモチーフを含む、請求項１０７～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 前記ＳＰＥＡＲが、１つ以上のステムループ様構造を含む、請求項１０７～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  115. 前記生物学的試料が、生検材料、組織、または体液を含む、請求項１０５～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記生物学的試料が、腫瘍細胞、培養細胞、幹細胞、及び分化細胞のうちの１つ以上を含む、請求項１１５に記載の方法。

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