JP2024517719A - Ｂｃｍａを標的としたキメラ型抗原受容体及びその応用 - Google Patents
Ｂｃｍａを標的としたキメラ型抗原受容体及びその応用 Download PDFInfo
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Abstract
【要約】【課題】高圧燃料ポンプローラータペットを提供することを課題とする。【解決手段】ＢＣＭＡを標的としたキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）及びその応用であって、前記ＣＡＲはＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで前記抗体は軽鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるアミノ酸配列を含む。前記ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞および医薬組成物、およびＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を治療する方法。
Description
本願は生物医学分野に関し、具体的にはＢＣＭＡを標的としたキメラ型抗原受容体及びその応用に関する。
ＢＣＭＡ（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、すなわちＢ細胞成熟抗原は、主にＢ細胞の増殖、生存、およびＢ細胞の形質細胞（ＰＣｓ）への成熟分化を制御し、ＰＣｓ分化過程において、ＢＣＭＡ分子は徐々に誘導されて発現する。ＢＣＭＡ分子はＰＣｓおよび形質芽球膜表面でのみ発現し、大部分のＢ細胞、造血幹細胞、およびそのたの正常な組織では発現しないため、ＢＣＭＡ分子はＭＭを治療する最も理想的なターゲット分子の一つとなっている。
キメラ型抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法は近年台頭している精密標的療法であり、現在腫瘍免疫治療の分野で最も注目されている研究方向の一つである。該療法の基本原理は遺伝子工学技術によってＴ細胞を改造し、特異的識別能力を有するＣＡＲ－Ｔ細胞にし、インビトロで増幅培養してから患者体内に再注入し、特定の腫瘍細胞を攻撃して殺傷するというものである。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法はＢＣＭＡを標的とする腫瘍免疫療法に応用できる。
しかしながら現在ＢＣＭＡを標的としたＣＡＲ－Ｔ製品は誕生していない。ＢＣＭＡがＢ細胞悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫において標的を治療する有効性に鑑み、本分野において新たな細胞療法を開発し、ＢＣＭＡに作用することで治療するという目的を実現することは急務である。
本願はＢＣＭＡを標的としたキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、本願のＣＡＲは免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）表面で安定且つ高効率で発現でき、該ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は以下の性質のうち一種または複数を有する：（１）ＢＣＭＡ陽性の標的細胞を殺傷し、殺傷毒性が高く、（２）標的細胞の刺激でサイトカインを大量に分泌し、（３）高い標的増殖能力、および（４）腫瘍の成長を抑制し、腫瘍を解消する。
一方で、本願はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それはＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで前記抗体は軽鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５；（２）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５；および（３）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖可変領域（ＶＨ）であり、前記ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体的ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合するＨ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体的ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＨ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｈ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＨ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｈ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４は以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；（２）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；（３）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；および（４）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖可変領域ＶＨを含み、且つ前記ＶＨ包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５；（２）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６；（３）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６；および（４）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）であり、前記ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１を含み、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体的ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ２を含み、前記Ｌ－ＦＲ２は前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体的ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ３を含み、前記Ｌ－ＦＲ３は前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｌ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、且つ前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＶＨおよびＶＬ、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨおよびＶＬ以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；（２）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（３）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（４）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（５）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；（６）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；（７）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４；および（８）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはｓｃＦｖを含み、且つ前記ｓｃＦｖは前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む。
ある実施形態において、前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＨのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端は直接または間接的に接続される。
ある実施形態において、前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＬのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端は直接または間接的に接続される。
ある実施形態において、前記ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬの間にリンカーペプチドを含み、且つ前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ｓｃＦｖはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９－５６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲは膜貫通ドメインを含み、且つ前記膜貫通ドメインは以下のタンパク質に由来する膜貫通ドメインから選択される：ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４。ある実施形態において、前記膜貫通ドメインはＣＤ８に由来し、且つ前記膜貫通ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲは共刺激ドメインを含み、且つ前記共刺激ドメインは以下のタンパク質に由来する共刺激ドメインから選択される：ＣＤ１３７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳ。ある実施形態において、前記共刺激ドメインはＣＤ１３７に由来し、且つ前記共刺激ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲはヒンジ領域を含み、且つ前記ヒンジ領域はＣＤ８に由来するヒンジ領域を含む。ある実施形態において、前記ヒンジ領域はＣＤ８に由来し、且つ前記ヒンジ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲはシグナルペプチドを含む。ある実施形態において、前記シグナルペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲはＬ６－Ｌｉを含み、前記Ｌ６－Ｌｉは前記細胞内シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する。ある実施形態において、前記Ｌ６－ＬｉはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＣＡＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４－７１および７４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、前記ＣＡＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一項に示されるヌクレオチド配列を含む。
他方では、本願は単離された核酸分子を提供し、前記核酸分子は本願に記載のＣＡＲのヌクレオチド配列をコードする。
ある実施形態において、前記単離された核酸分子はさらにプロモーター遺伝子を含み、前記プロモーター遺伝子は前記的ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の５’末端に位置する。ある実施形態において、前記プロモーター遺伝子は構成的プロモーターである。ある実施形態において、前記プロモーター遺伝子はＥＦ１αプロモーター遺伝子である。
他方では、本願はＣＡＲをコードする核酸分子を提供し、前記ＣＡＲをコードする核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一項に示されるヌクレオチド配列を含む。
他方では、本願はベクターを提供し、前記ベクターは本願に記載の核酸分子を含む。
ある実施形態において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターから選択される。
他方では、本願は免疫エフェクター細胞を提供し、前記免疫エフェクター細胞は本願に記載のＣＡＲ、前記核酸分子、および／または前記ベクターを含む。ある実施形態において、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞から選択される。
他方では、本願は免疫エフェクター細胞を製造する方法を提供し、それは前記免疫エフェクター細胞に本願に記載のベクターを導入することを含む。
他方では、本願は医薬組成物、それは前記ＣＡＲを提供し、前記核酸分子、前記ベクター、および／または前記免疫エフェクター細胞、および薬学的に許容される担体を含む。
他方では、本願は前記ＣＡＲ、前記核酸分子、前記ベクター、前記免疫エフェクター細胞、および／または前記医薬組成物の薬物の調製における使用を提供し、前記薬物はＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を治療するために用いられる。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は癌または悪性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害はＢＣＭＡ陽性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は骨髄腫である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は多発性骨髄腫である。
他方では、本願はＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を治療する方法を提供し、それは必要とする被験者に前記ＣＡＲ、前記核酸分子、前記ベクター、前記免疫エフェクター細胞、および／または前記医薬組成物を使用することを含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は癌または悪性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害はＢＣＭＡ陽性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は骨髄腫である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は多発性骨髄腫である。
他方では、本願は前記ＣＡＲ、前記核酸分子、前記ベクター、前記免疫エフェクター細胞、および／または前記医薬組成物を提供し、それはＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を治療するために用いられる。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は癌または悪性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害はＢＣＭＡ陽性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は骨髄腫である。ある実施形態において、前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害は多発性骨髄腫である。
当業者であれば以下の詳細な説明から本願のその他の様態および利点について容易に洞察できる。以下の詳細な説明では本願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者であれば理解できるように、本願の内容は当業者が発明の精神および範囲から逸脱することなく開示された具体的な実施形態に変更を行うことができる。また、本願の図面および明細書における説明は例示的なものにすぎず、制限するものではない。
本願に関する発明の具体的な特徴は請求項に示される。以下の詳細な説明における例示的な実施方式および図面を参照することによって本願に関する発明の特徴および利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下のとおりである：
図１はＣＡＲレンチウイルスベクターにおけるＣＡＲ各要素の構成およびその接続順の実施形態を示す。
図２は本願に記載のＣＡＲを含む各ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養過程での増幅倍率を示す。
図３は本願に記載のＣＡＲの各ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＣＡＲ陽性細胞比率を示す。
図４は本願に記載のＣＡＲを含む各ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対する殺傷毒性を示し、ここで、Ａ：ＭＭ１ｓ細胞、Ｂ：Ｋ５６２細胞である。
図５は本願に記載のＣＡＲを含む各ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＭ１ｓ細胞の共培養後のＩＦＮ－γ因子の分泌状況を示す。
図６は本願に記載のＣＡＲを含む各ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＭＭ１ｓ細胞に対する標的増幅能力を示す。
図７はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＭＭ１ｓ細胞に対する殺傷毒性を示す。
図８はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＭＭ１ｓ細胞の共培養後のＩＦＮ－γ因子の分泌状況を示す。
図９はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の担癌マウスに対する腫瘍抑制および腫瘍解消能力を示し、ここでＡは実験群であり、Ｂは対照群である。
図１０はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の担癌マウス体内での代謝状況を示し、ここでＡは実験群であり、Ｂは対照群である。
図１１はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の担癌マウス体内で引き起こされるＩＦＮ－γサイトカインの分泌状況を示し、ここでＡは実験群であり、Ｂは対照群である。
図１２はＬ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の担癌マウス体内で引き起こされるＩＬ－２サイトカインの分泌状況を示す。
以下の特定の具体的な実施例によって本願の発明の実施方式を説明し、当業者であれば本明細書に開示された内容から本願のその他の利点および効果を理解できる。
専門用語の定義
本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」は「ＣＤ２６９」、「ＢＣＭ」「ＴＮＦＲＳＦ１７」と置換可能に使用され、一般的にはＢ細胞成熟抗原を指す。ＢＣＭＡタンパク質は腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである。本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」は突然変異を含むタンパク質を含んでもよく、例えば全長野生型ＢＣＭＡの点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含んでもよい。前記ＢＣＭＡはいずれかの脊椎動物から選択され、例えば、霊長類動物（例えば、ヒトまたはサル）、げっ歯類動物（マウスまたはラット）、鳥類および／または家畜などを含んでもよい。本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」はさらに敢然なＢＣＭＡタンパク質の一部を含み、保留関連する生物活性を保持していればよい。本願において、前記ＢＣＭＡはＢＣＭＡであってもよく、それはＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＢＡＢ６０８９５．１である。例えば、ヒトＢＣＭＡは一般的には９９４ヌクレオチド長の一次ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１１９２．２）によってコードされる１８４アミノ酸長のタンパク質である。
本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」は「ＣＤ２６９」、「ＢＣＭ」「ＴＮＦＲＳＦ１７」と置換可能に使用され、一般的にはＢ細胞成熟抗原を指す。ＢＣＭＡタンパク質は腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである。本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」は突然変異を含むタンパク質を含んでもよく、例えば全長野生型ＢＣＭＡの点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含んでもよい。前記ＢＣＭＡはいずれかの脊椎動物から選択され、例えば、霊長類動物（例えば、ヒトまたはサル）、げっ歯類動物（マウスまたはラット）、鳥類および／または家畜などを含んでもよい。本願において、専門用語「ＢＣＭＡ」はさらに敢然なＢＣＭＡタンパク質の一部を含み、保留関連する生物活性を保持していればよい。本願において、前記ＢＣＭＡはＢＣＭＡであってもよく、それはＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＢＡＢ６０８９５．１である。例えば、ヒトＢＣＭＡは一般的には９９４ヌクレオチド長の一次ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１１９２．２）によってコードされる１８４アミノ酸長のタンパク質である。
本願において、専門用語「結合ドメイン」は一般的に（特異的に）標的分子（抗原）の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に結合し、または前記所与の標的エピトープまたは所与の標的部位と相互作用し、または前記所与の標的エピトープまたは所与の標的部位を識別する構造ドメインである。
本願において、専門用語「ＢＣＭＡ結合ドメイン」は一般的にはＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する構造ドメインである。例えば、前記ＢＣＭＡ結合ドメインＢ細胞で発現するＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合できるキメラ型抗原受容体またはそのフラグメント、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでもよい。本願において使用する専門用語「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は置換可能にしようでき、かつ目的の標的抗原（例えばＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を有するＣＡＲの構造ドメインまたはフラグメントを含んでもよい。ＢＣＭＡ結合ドメインは天然由来、合成由来、半合成由来または再構成由来であってもよい。
本願において、専門用語「抗体」は一般的には免疫グロブリンまたはそのフラグメントまたはその誘導体であり、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含み、インビトロまたはインビボで生成されるかに関わらない。該専門用語はマルチクローニング、モノクローナ、単一特異的的、多特異的、非特異的、ヒト化、一本鎖的、キメラ、合成、再構成、ハイブリッド、突然変異および移植の抗体を含むがそれらに限定されない。例えば「完全な抗体」のように、専門用語「完全な」に修飾されない限り、例えば抗原結合フラグメントＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ および抗原結合機能（例えば、特異的結合ＢＣＭＡ）を保持するその他の抗体フラグメントのように専門用語「抗体」も抗体フラグメントを含む。一般的に、抗体はジスルフィド結合によって互いに接続される少なくとも二本の重（Ｈ）鎖および二本の軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリンを含んでもよく、且ついずれかのその抗原結合部分を含む分子を含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域によって構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域によって構成される。ＶＨおよびＶＬ区はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変領域に区分され、それらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保守的な領域内に点在している。各ＶＨおよびＶＬは由三つのＣＤＲおよび四つのＦＲ領域から構成され、それらはＮ末端からＣ末端に以下の順で配列されてもよい：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と互いに作用する結合構造域を含む。
本願において、専門用語「ｓｃＦｖ」は一般的には一本鎖抗体を指し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域によって直接接続するかまたは接続分子（例えば、リンカーペプチド）によって接続されてなる抗体である。前記ｓｃＦｖの構造はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変領域－軽鎖可変領域、軽鎖可変領域－重鎖可変領域、重鎖可変領域－リンカーペプチド－軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域－リンカーペプチド－重鎖可変領域であってもよい。
本願において、専門用語「キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）」は一般的には抗原に結合できる細胞外ドメインおよび少なくとも一つの細胞内ドメインの融合タンパク質を含む。ＣＡＲは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を識別する抗体の抗原結合領域と細胞内シグナルドメイン「免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）」が融合して形成された抗原受容体であってもよい。ＣＡＲの基本構造は一つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合領域（例えば、ｓｃＦｖ）、一つの細胞外ヒンジ領域、一つの膜貫通ドメインおよび一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本願において、前記ＣＡＲは抗体の抗原（例えばＢＣＭＡ）の特異性に基づいて免疫エフェクター細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせることができる。遺伝修飾によってＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は標的抗原を発現する悪性細胞を特異的に識別および解消することができる。
本願において、専門用語「シグナル伝達ドメイン」は一般的に細胞内部に位置してシグナルを伝達できる構造ドメインである。本願において、前記細胞内シグナル伝達ドメインはシグナルを細胞内に伝達することができる。一般的に、シグナル伝達ドメインはタンパク質がターゲットを探す任意の連続したアミノ酸配列を導くために用いられる。例えば、ある実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＯＸ４０細胞内ドメインから選択されても良い。
本願において、専門用語「共刺激」は一般的に指リンパ細胞が第二シグナルを活性化する由来を指し、一般的に適応性免疫に関与する免疫細胞（Ｔ細胞／Ｂ細胞間または抗原提示細胞／Ｔ細胞間）の表面共刺激分子およびその受容体の相互作用によって生じる。例えば、Ｔ細胞の完全な活性化は二重シグナルおよびサイトカインの作用に依存する。Ｔ細胞活性化の第一シグナルはその受容体ＴＣＲと抗原の特異的結合に由来し、すなわちＴ細胞は抗原を識別する；Ｔ細胞活性化の第二シグナルは共刺激分子に由来し、すなわちＡＰＣの共刺激分子とＴ細胞表面の対応する受容体の相互作用である。
本願において、専門用語「共刺激ドメイン」は一般的に共刺激分子と相互作用することによって共刺激を生成できるいずれかのアミノ酸配列である。
本願において、専門用語「ヒンジ領域」は一般的にＣＡＲ構造においてＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）および膜貫通ドメインの間に位置する領域を指す。ヒンジ領域は一般的にＩｇＧファミリーに由来し、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ４であり、さらに一部はＩｇＤおよびＣＤ８に由来する。一般的にヒンジ領域はある程度の柔軟性を有しするため、ＣＡＲ分子とその特異的ターゲットの間の空間的制約に影響を与え、さらにＣＡＲＴ細胞と腫瘍細胞の間の接触に影響を与える。
本願において、専門用語「膜貫通ドメイン」は一般的に細胞表面タンパク質の細胞膜を貫通する配列を指し、それは疎水性ａｌｐｈａ螺旋を含んでもよい。膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに接続され、シグナルを伝達する作用を果たすことができる。膜貫通ドメインは一般的に三つの異なる構造領域を含む：Ｎ末端細胞外領域、中間の保存された膜貫通伸張領域、およびＣ末端細胞質領域。膜貫通ドメインはさらに細胞内領域または細胞質領域を含んでもよい。本願において、膜貫通ドメインは任意のＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質に由来してもよい。
本願において、専門用語「シグナルペプチド」一般的に新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ－末端）にあるリーダー配列を指し、それは翻訳時または翻訳後に新生タンパク質を小胞体に誘導してその後表面発現する。シグナルペプチド一般的に該過程で切除される。シグナルペプチドはポリペプチドの産生に用いられる生物体と異種または同源であってもよい。
本願において、専門用語「Ｌ６－Ｌｉ」一般的に低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質およびレプチンの融合タンパク質であり、Ｌ６－Ｌｉに関連する内容は公開番号ＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１を参照されたい。本願において、前記Ｌ６－ＬｉはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示されるアミノ酸配列を含む。本願において、前記Ｌ６－Ｌｉをコードする核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６に示されるヌクレオチド配列を含む。
本願において、専門用語「プロモーター遺伝子」は一般的に特定の遺伝子を転写することができるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を指す。プロモーター遺伝子はＲＮＡポリメラーゼによって識別され、転写を開始してＲＮＡを合成する。リボ核酸（ＲＮＡ）合成において、プロモーター遺伝子は遺伝子の転写を制御する転写因子と相互作用し、遺伝子発現（転写）の開始時間と発現の程度を制御することができる。プロモーター遺伝子は核心プロモーター遺伝子領域および調整領域を含み、遺伝子発現を制御する調整配列、遺伝子転写の開始部位の上流（ＤＮＡアンチセンス鎖の５’方向）に位置し、自身には翻訳編集機能はない。その作用方式および機能に基づいて三つに分けられる：構成的プロモーター（複数または全ての組織中で持続的活性を保持する）、特異的プロモーター遺伝子（組織特異的または発育時期の特異的）および誘導型プロモーター遺伝子（外部の化学的または物理的シグナルによって調整される）。
本願において、専門用語「特異的結合」は一般的には測定可能なおよび再現可能な相互作用を指し、例えば標的および抗体の間の結合であり、分子（生物分子を含む）の異質な集団が存在する状況で標的の存在を決定できる。例えば標的（それはエピトープであってもよい）に特異的結合する抗体はその結合がその標的より大きい親和性、親和力、でより容易に、および／またはより大きな持続時間で該標的の抗体に結合する。ある実施形態において、抗体特異的結合タンパク質のエピトープは、前記エピトープが異なる種族のタンパク質で保存される。別の実施形態において、特異的結合を含むが排他的に結合する必要はない。
本願において、専門用語「核酸分子」は一般的に任意の長さの単離形式のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似物を指す。ある実施形態において、本願に記載の核酸分子は自然環境から単離されたものであってもよい。ある実施形態において、本願に記載の核酸分子は以下の方法によって産生または合成されたものであってもよい：（ｉ）インビトロで増幅された、例えばポリメラーゼ鎖式反（ＰＣＲ）の増幅によって産生されたもの、（ｉｉ）クローン組換えによって産生されたもの、（ｉｉｉ）例えば酵素切断およびゲル電気泳動によって分級して単離され、精製されたもの、（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたもの。ある実施形態において、前記単離された核酸はＤＮＡ組換え技術によって製造された核酸分子である。本願では、本分野で既知の様々な方法によって前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を製造し、これらの方法は制限フラグメント操作または合成オリゴヌクレオチドによるＰＣＲオーバーラップ伸長を含むがこれらに限定されず、具体的な操作はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．， １９９３を参照されたい。
本願において、専門用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は置換可能に使用され、一般的にアミノ酸残基のポリマーを指す。該専門用語もそのうちの一つのまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似物または擬似物のアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、同源物に適用される。該専門用語は修飾されたアミノ酸ポリマーを含んでもよく、例えば、糖残基を添加することによって糖タンパク質またはリン酸化によって修飾される。ポリペプチドおよびタンパク質は天然に存在するおよび非組換えの細胞または遺伝子工学によって改造されたまたは組換えされた細胞によって産生されてもよく、かつ天然タンパク質を有するアミノ酸配列の分子、または天然配列を有する一つのまたは複数のアミノ酸の欠失、添加および／または置換された分子を含んでもよい。専門用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は特に本願に記載の抗原結合タンパク質の一つのまたは複数のアミノ酸の欠失、添加および／または置換された配列を含む。
タンパク質のアミノ酸配列または核酸分子のヌクレオチド配列に言及する場合、本願はさらにこれらの配列の同源物を含む。本願において、専門用語「同源物」は一般的に野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定の同源性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。専門用語「同源性」は配列の「同一性」と同等の意味である。同源配列は対象配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同じアミノ酸配列を含んでもよい。一般的に、同源物は対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。同源性は相似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に基づいて考慮され、配列の同一性の面で同源性を表すこともできる。本願において、言及されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおけるいずれか一項の１００パーセントの同一性を有する配列は言及されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯの全長において前記１００パーセントの同一性を有する配列を指す。
本願において、専門用語「ベクター」は一般的にあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをその中に挿入してそのタンパク質を得発現する核酸を運ぶ手段を指す。ベクターは宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることによって、それが有する遺伝物質要素は宿主細胞内で発現させることによって発現する。例えば、ベクターは以下を含む：プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；λバクテリオファージまたはＭ１３バクテリオファージおよび動物ウイルスなどのようなバクテリオファージ。ベクターとして使用する動物ウイルスの種類には逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）がある。ベクターは複数の発現を制御する要素を含んでもよく、プロモーター遺伝子配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む。また、ベクターはさらに複製開始部位を含んでもよい。ベクターはさらにウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質外殻のようにその細胞への導入を助ける成分を含む可能性があるが、これらの物質だけではない。
本願において、専門用語「免疫エフェクター細胞」は一般的に免疫反応に参与し、例えば、免疫エフェクターの反応を促進する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の実例はＴ細胞を含み、例えば、α／βのＴ細胞和γ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞および骨髓性食細胞である。
本願において、専門用語「医薬組成物」は一般的に患者、すなわちヒト患者への投与に適した組成物を指す。例えば、本願に記載の医薬組成物は、本願に記載の免疫エフェクター細胞、ＣＡＲ、核酸分子またはベクター、および任意に薬学的に許容される担体を含んでもよい。医薬組成物は有効な生物活性の活性成分形式を含み、かつ前記製剤の投与対象である被験者が受け入れられない毒性のそのた成分を含まない。
本願において、専門用語「薬学的に許容される担体」は一般的に活性成分の生物活性の有効性に干渉しない一種または複数の非毒性材料を指す。このような製剤は一般的に塩、緩衝剤、防腐剤、相容性のベクター、および任意にその他の治療剤を含んでもよい。
本願において、専門用語「ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または病症障害はＢＣＭＡ発現に関連する疾患、またはＢＣＭＡを発現する細胞（各種癌の腫瘍細胞を含む）に関連する障害を含むがこれらに限定されない。正常な体または正常な細胞に比べ、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を有する個体のＢＣＭＡ発現異常（例えば、ＢＣＭＡ過剰発現）、または細胞的ＢＣＭＡ発現異常（例えば、ＢＣＭＡ過剰発現）を有する。
本願において、専門用語「癌または悪性腫瘍」一般的には異常なお細胞の成長によって形成された新生物または充実性病変を指す。本願において、腫瘍は充実性腫瘍または非充実性腫瘍（例えば、血液瘤）であってもよい。
本願において、専門用語「ＢＣＭＡ陽性腫瘍」は一般的に正常な細胞に比べ、ＢＣＭＡタンパク質が過剰発現した腫瘍を指す。例えば、ＢＣＭＡ陽性腫瘍は非充実性腫瘍を含んでもよい。例えば、ＢＣＭＡ陽性腫瘍は骨髄腫を含んでもよい。例えば、ＢＣＭＡ陽性腫瘍は多発性骨髄腫を含んでもよい。
本願において、専門用語「含む」は一般的には明確に指定された特徴を含むことを指すが、その他の要素を排除するものではない。
本願において、専門用語「約」は一般的に指定の数値以上または以下０．５％－１０％の範囲内の変動を指し、例えば指定の数値以上または以下０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％の範囲内の変動を指す。
発明の詳細な説明
一方で、本願はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それはＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
一方で、本願はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それはＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
ＢＣＭＡ結合ドメイン
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列：ＤＩＲＹＶＭＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列：ＤＩＲＹＶＭＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列：ＷＩＮＴＥＴＲＥＰＸ１０ＹＡＹＤＦＲＸ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）を含んでもよく、ここで、Ｘ１０＝ＡまたはＴ、Ｘ１７＝ＧまたはＳである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列：ＤＹＴＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分てもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列：ＬＱＳＲＸ５ＦＰＲＸ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０）を含んでもよく、ここで、Ｘ５＝ＩまたはＲであり、Ｘ９＝ＨまたはＴである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列：ＬＧＸ３ＮＲＸ６Ｘ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９）を含んでもよく、ここで、Ｘ３＝ＲまたはＳ、Ｘ６＝ＡまたはＰ、且つＸ７＝ＡまたはＳである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＳＶＸ９ＧＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８）を含んでもよく、ここで、Ｘ９＝Ｉ、ＰまたはＳ、Ｘ１１＝ＡまたはＩ、Ｘ１２＝ＨまたはＳ、Ｘ１３＝ＦまたはＬ、且つＸ１４＝ＩまたはＬである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つ項に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ順次ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＸ９ＥＸ１１ＫＸ１３ＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ２８ＦＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）を含んでもよく、ここで、前記Ｘ９＝ＡまたはＳ、Ｘ１１＝ＬまたはＶ、Ｘ１３＝ＫまたはＱ、且つＸ２８＝ＳまたはＴである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのＨ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ２が前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示されるアミノ酸配列：ＷＶＲＱＡＸ６ＧＱＧＬＥＷＸ１３Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）を含んでもよく、ここで、前記Ｘ６＝ＰまたはＴ、且つＸ１３＝ＩまたはＭである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのＨ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は前記ＨＣＤＲ２与前記ＨＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示されるアミノ酸配列を含む：ＲＦＸ３ＦＸ５ＬＸ７ＴＳＸ１０ＳＴＡＹＬＸ１６Ｘ１７ＳＳＬＸ２１Ｘ２２ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）。ここで、前記Ｘ３＝ＴまたはＶ、Ｘ５＝ＳまたはＴ、Ｘ７＝ＤまたはＮ、Ｘ１０＝Ａ、ＩまたはＶ、Ｘ１６＝ＥまたはＱ、Ｘ１７＝ＩまたはＬ、Ｘ２１＝ＫまたはＲ、且つＸ２２＝ＡまたはＳである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのＨ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４は以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；（２）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；（３）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；および（４）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＸ９ＥＸ１１ＫＸ１３ＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ２８ＦＡＤＹＴＩＮＷＶＲＱＡＸ４１ＧＱＧＬＥＷＸ４８ＧＷＩＮＴＥＴＲＥＰＸ５９ＹＡＹＤＦＲＸ６６ＲＦＸ６９ＦＸ７１ＬＸ７３ＴＳＸ７６ＳＴＡＹＬＸ８２Ｘ８３ＳＳＬＸ８７Ｘ８８ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＩＲＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６）を含んでもよく、ここで、Ｘ９＝ＡまたはＳ、Ｘ１１＝ＬまたはＶ、Ｘ１３＝ＫまたはＱ、Ｘ２８＝ＳまたはＴ、Ｘ４１＝ＰまたはＴ、Ｘ４８＝ＩまたはＭ、Ｘ５９＝ＡまたはＴ、Ｘ６６＝ＧまたはＳ、Ｘ６９＝ＴまたはＶ、Ｘ７１＝ＳまたはＴ、Ｘ７３＝ＤまたはＮ、Ｘ７６＝Ａ、ＩまたはＶ、Ｘ８２＝ＥまたはＱ、Ｘ８３＝ＩまたはＬ、Ｘ８７＝ＫまたはＲ且つＸ８８＝ＡまたはＳである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ２を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ２は前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるアミノ酸配列：ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ３を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ３は前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列：ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＡＡＩＹＹＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列：ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）を含んでもよい。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含んでもよく、且つ前記Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでもよく、且つ前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＳＶＸ３２ＧＸ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７ＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＧＸ５６ＮＲＸ５９Ｘ６０ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＡＡＩＹＹＣＬＱＳＲＸ９７ＦＰＲＸ１０１ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５）を含んでもよく、ここで、Ｘ３２＝Ｉ、ＰまたはＳ、Ｘ３４＝ＡまたはＩ、Ｘ３５＝ＨまたはＳ、Ｘ３６＝ＦまたはＬ、Ｘ３７＝ＩまたはＬ、Ｘ５６＝ＲまたはＳ、Ｘ５９＝ＡまたはＰ、Ｘ６０＝ＡまたはＳ、Ｘ９７＝ＩまたはＲ、且つＸ１０１＝ＨまたはＴである。例えば、前記配列はＫａｂａｔルールに基づいて区分してもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはＶＨおよびＶＬを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはｓｃＦｖであってもよく、且つ前記ｓｃＦｖは前記ＶＨおよび前記ＶＬを含んでもよい。前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＨのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端は直接接続でき、例えば、インフレーム接続である。前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＨのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端は間接的に接続することができ、例えば、コネクソン（例えばリンカーペプチド）によって接続される。前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＬのＣ末端および前記ＶＨのＮ末端は直接接続でき、例えば、インフレーム接続である。前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＬのＣ末端および前記ＶＨのＮ末端は間接的に接続することができ、例えば、コネクソン（例えばリンカーペプチド）によって接続される。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨを含んでもよく、ＶＬおよびリンカーペプチド、前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるアミノ酸配列を含み、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはＶＨ、ＶＬおよびリンカーペプチドを含んでもよく、前記ＶＬのＣ末端は前記ＶＨのＮ末端にリンカーペプチドによって接続でき、且つ前記リンカーペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＢＣＭＡ構造ドメインはｓｃＦｖを含んでもよく、且つ前記ｓｃＦｖは３９－４９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記ｓｃＦｖはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９－４９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同源性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）
本願において、前記ＣＡＲは細胞外のＢＣＭＡ構造ドメイン以外に、さらに細胞内ドメインを含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲは細胞外のＢＣＭＡ構造ドメイン以外に、さらに細胞内ドメインを含んでもよい。
ある場合において、前記ＣＡＲは細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよく、それは刺激シグナルを提供できる。前記共刺激シグナル伝達ドメインは以下を含んでもよいが、これらに限定されない。：ＣＤ１３７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳ内の共刺激シグナル伝達領域およびその組み合わせで構成された共刺激分子を含んでもよいが、これらに限定されない。例えば、前記共刺激ドメインはＣＤ１３７に由来する共刺激ドメインであってもよい。例えば、前記共刺激ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
ある場合において、前記ＣＡＲは細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよく、それは少なくとも一つのＩＴＡＭモチーフを有する構造ドメインを含んでもよい。前記細胞内シグナル伝達ドメインは活性化シグナルを細胞内部に伝達する。例示的なシグナル伝達ドメインは以下の群からなるシグナル伝達ドメインから選択され、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０活性領域、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ－１２、および前記の変種を含むがこれらに限定されない。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインであってもよい。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
ある場合において、前記ＣＡＲは膜貫通域を含んでもよく、前記膜貫通域は細胞表面タンパク質において細胞膜を横断する配列であり、それは疎水性ａｌｐｈａ螺旋を含んでもよい。膜貫通域はＣＤ２８に由来してもよく、良好な安定性を有する。膜貫通域は任意のＩ型膜貫通タンパク質に由来してもよい。膜貫通域は疏水性螺旋を形成すると予測される合成配列であってもよい。前記膜貫通域は以下の群からなる一種または複数タンパク質に由来する膜貫通域を含んでもよい：ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４。例えば、前記膜貫通域はＣＤ８に由来する膜貫通域であってもよい。例えば、前記膜貫通ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
ある場合において、前記ＣＡＲはヒンジ領域を含んでもよく、前記ヒンジ領域は前記細胞外の標的部分および前記膜貫通域の間に位置する。前記ヒンジ領域は以下からなる群から選択される一種または複数のタンパク質に由来するヒンジ領域を含んでもよい：ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８ ａｌｐｈａ、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０およびＬＩＧＨＴ。例えば、前記ヒンジ領域はＣＤ８に由来してもよい。例えば、前記前記ヒンジ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲは前記ＢＣＭＡ結合ドメインのＮ末端にさらにシグナルペプチドを含んでもよく、例えば、ヒトＣＤ８シグナルペプチドである。例えば、前記シグナルペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、Ｎ末端からＣ末端まで、前記ＣＡＲは順次ＢＣＭＡ標的部分（例えば、前記抗原結合タンパク質、または例えば、前記ｓｃＦｖ）、前記ヒンジ領域、前記膜貫通域、前記共刺激シグナル伝達領域および前記シグナル伝達ドメインを含んでも良い。
例えば、Ｎ末端からＣ末端まで、前記ＣＡＲは順次前記ｓｃＦｖ、前記ＣＤ８ヒンジ領域、前記ＣＤ８膜貫通域、前記ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達領域および前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。例えば、前記ＣＡＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４－７１のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記ＣＡＲのＣ末端はレプチンおよび／またはその機能性フラグメント、および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはそのフラグメントに接続できる。例えば、前記レプチンは分泌型レプチンを含んでもよい。例えば、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６である。
本願において、前記ＣＡＲ、前記レプチンおよび／またはその機能性フラグメント、および／または前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはそのフラグメントは自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ等２Ａペプチド）によって接続できる。
本願において、前記ＣＡＲのＣ末端に、Ｌ６－Ｌｉを接続できる。例えば、前記Ｌ６－ＬｉはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ６－Ｌｉをコードする核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６に示されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
本願において、Ｎ末端からＣ末端まで、前記ＣＡＲは順次ＢＣＭＡ標的部分（例えば、前記抗原結合タンパク質、または例えば、前記ｓｃＦｖ）、前記ヒンジ領域、前記膜貫通域、前記共刺激シグナル伝達領域、前記シグナル伝達ドメインおよび前記Ｌ６－Ｌｉを含んでもよい。
例えば、Ｎ末端からＣ末端まで、前記ＣＡＲは順次前記ｓｃＦｖ、前記ＣＤ８ヒンジ領域、前記ＣＤ８膜貫通域、前記ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達領域、前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび前記Ｌ６－Ｌｉを含んでもよい。例えば、前記ＣＡＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
核酸分子、ベクター、細胞、製造方法および医薬組成物
他方では、本願はさらに単離されたまたは複数の核酸分子を提供し、それは本願に記載のキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）をコードできる。本願に記載の単離されたまたは複数の核酸分子は任意の長さの単離形式のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその天然環境から単離されたまたは人工的に合成された類似物であってもよいが、本願に記載のキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）をコードできる。例えば、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一項に示されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
他方では、本願はさらに単離されたまたは複数の核酸分子を提供し、それは本願に記載のキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）をコードできる。本願に記載の単離されたまたは複数の核酸分子は任意の長さの単離形式のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその天然環境から単離されたまたは人工的に合成された類似物であってもよいが、本願に記載のキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）をコードできる。例えば、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一項に示されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
他方では、本願はさらにベクターを提供し、それは本願に記載の核酸分子を含んでもよい。前記ベクターは宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることによって、それが有する遺伝物質要素は宿主細胞内で発現させることによって発現する。例えば、ベクターは以下を含んでもよい：プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；λバクテリオファージまたはＭ１３バクテリオファージおよび動物ウイルスなどのようなバクテリオファージ。ベクターとして使用する動物ウイルスの種類には逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）がある。または例えばベクターは複数の発現を制御する要素を含んでもよく、プロモーター遺伝子配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む。また、ベクターはさらに複製開始部位を含んでもよい。また、前記ベクターはさらにウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質外殻のようにその細胞への導入を助ける成分を含む可能性があるが、これらの物質だけではない。
他方では、本願はさらに免疫エフェクター細胞を提供し、それは本願に記載のＣＡＲ、前記的核酸分子または本願に記載のベクターを含んでもよい。前記細胞は単一細胞の後代を含んでもよい。天然、偶然または有意の突然変異のため、後代は元の母細胞と完全に同じというわけではない（総ＤＮＡ相補体の形態上またはゲノム上）。ある実施形態において、前記細胞はさらに本発明に記載のベクターを用いてインビトロでトランスエフェクトした細胞を含んでもよい。ある実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞であってもよい。ある実施形態において、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞、例えば、α／βのＴ細胞およびγ／δＴ細胞を含んでもよい；ある実施形態において、前記免疫エフェクター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー Ｔ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞および骨髓性食細胞を含んでもよい。
一方では、本願は修飾された免疫エフェクター細胞を提供し、それはキメラ型抗原受容体および／またはそのコード要素を含み、またはＴ細胞受容体および／またはそのコード要素を含み、且つ前記修飾された免疫細胞はさらに以下を含む：レプチンおよび／またはその機能性フラグメント；および／または、レプチン受容体および／またはその機能性フラグメント。且つ対応する修飾されていない免疫細胞に比べ、前記修飾された免疫細胞において前記レプチン受容体および／またはその機能性フラグメントの発現量は増加する。本願において、前記免疫エフェクター細胞はレプチンおよび／またはその機能性フラグメント、および／または、レプチン受容体および／またはその機能性フラグメント、および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはそのフラグメントを含んでも良い。エフェクター細胞に対する修飾に関する内容はＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１、ＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１の記載が本願にも同様に適用できる。
他方では、本願はさらに本願に記載の免疫エフェクター細胞を製造する方法を提供し、前記方法は免疫エフェクター細胞に本願に記載の単離された核酸分子または本願に記載のベクターを導入することを含んでもよい。
他方では、本願はさらに組成物を提供し、それは本願に記載の免疫エフェクター細胞を含んでもよい。ある実施形態において、前記組成物はさらに任意に薬学的に許容される担体を含んでもよい。ある実施形態において、前記組成物の許容可能な成分は投与する量および濃度ではレシピエントに対して無毒である。本発明の医薬組成物は液体、冷凍および凍結乾燥組成物を含むがこれらに限定されない。ある実施形態において、前記薬学的に許容されるアジュバントは前記免疫エフェクター細胞と相容性のある任意のおよびすべての溶剤、分散媒質、等張化剤および吸収遅延剤を含んでもよく、一般的に安全で、無毒、且つ生物学的にもその他の面で不必要なものではない。
ある実施形態において、前記組成物胃腸外、経皮、口腔内、動脈内、鞘内および／または鼻腔内投与または直接組織内に注射することを含んでもよい。例えば、前記組成物は輸液または注射によって患者または被験者に投与する。ある実施形態において、前記医薬組成物の投与は異なる方式で行ってもよく、例えば静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、局部または真皮内投与である。
治療方法
他方では、本願はさらに本願に記載のキメラ型抗原受容体、本願に記載の核酸分子、本願に記載のベクター、本願に記載の免疫エフェクター細胞および／または本願に記載の組成物薬物の調製における使用を提供し、前記薬物はＢＣＭＡの発現に関連する疾患または障害を治療するために用いられる。
他方では、本願はさらに本願に記載のキメラ型抗原受容体、本願に記載の核酸分子、本願に記載のベクター、本願に記載の免疫エフェクター細胞および／または本願に記載の組成物薬物の調製における使用を提供し、前記薬物はＢＣＭＡの発現に関連する疾患または障害を治療するために用いられる。
本願において、前記ＢＣＭＡの発現に関連する疾患または障害は癌または悪性腫瘍であり、例えば、前記ＢＣＭＡの発現に関連する疾患または障害はＢＣＭＡ陽性腫瘍を含んでもよい。例えば、前記癌または悪性腫瘍は充実性腫瘍または非充実性腫瘍を含んでもよい。例えば、癌または悪性腫瘍は非充実性腫瘍であってもよい。例えば、前記癌または悪性腫瘍は骨髄腫、例えば、前記骨髄腫は多発性骨髄腫であってもよい。
他方では、本願はさらに腫瘍を予防、緩和または治療する方法を提供し、前記方法は必要とする被験者に本願に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞および／または医薬組成物を投与することを含む。本願において、前記投与異なる方式で行ってもよく、例えば静脈内、瘤内、腹膜内、皮下、筋肉内、局部または真皮内投与である。
本願において、前記被験者はヒトおよび非ヒト動物を含んでもよい。例えば、前記被験者はネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラットまたはサルを含むがこれ欄限定されない。いかなる理論に限定されるものでもなく、下の実施例は本願の各技術的解決手段を説明するためのものにすぎず、本願の発明の範囲を制限するために用いられるべきものではない。
実施例
実施例１ ｓｃＦｖフラグメントの産生
組換えヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃおよびＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（原啓生物科技（上海）有限公司）を利用して製造し、ここでヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃはヒトのＢＣＭＡとヒトのＦｃ接続によって形成されたタンパク質を表し、ヒトＢＣＭＡタンパク質のアミノ酸配列はＮＣＢＩ公式サイトＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＡＢ６０８９５．１を参照し、ヒトのＦｃのアミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７に示され、バクテリオファージ天然ヒト由来抗体ライブラリ（原啓生物科技（上海）有限公司が構築）を交互に選別し、計４回選別し、４回選別した後、顕著な富化を観察する。ＥＬＩＳＡを利用して選別したバクテリオファージ抗体クローンを同定する。さらに得られた陽性抗体配列に親和力検査およびシーケンシングを行う。選別した候補抗体を１－２回親和力進化し、および再び親和力検査およびフロー結合活性同定を行い、計８株のヒトＢＣＭＡに特異的結合できるバクテリオファージ抗体クローンを得て、シーケンシング後に軽鎖可変領域（ＶＬ）核酸配列および重鎖可変領域（ＶＨ）核酸配列を得て、ＶＬおよびＶＨ核酸配列間はリンカーペプチド核酸配列（その核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示され、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５に示される）で接続されて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）形式を形成し、それぞれｈＢＣＭＡ－０１、ｈＢＣＭＡ－０２、ｈＢＣＭＡ－１５、ｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３と命名する；陽性対照のｓｃＦｖ配列は特許ＵＳ ２０１７／０２２６２１６ Ａ１のｈｕＢＣＭＡ－１０に由来する。前記９個すべての（ｈｕＢＣＭＡ－１０を含む）ｓｃＦｖの核酸配列を南京金斯瑞生物科技有限公司に委託して遺伝子合成を行い、それぞれｓｃＦｖ核酸配列の５’末端にフォワードプライマー（核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８７に示される）を追加し、ｓｃＦｖ核酸配列３’末端にリバースプライマー（核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８８）を追加し、次の同源組換えの分子構築に使用する。この８個の抗体クローンおよび陽性対照のＶＨおよびＶＬ遺伝子の配列は表１に示すとおりである。
実施例１ ｓｃＦｖフラグメントの産生
組換えヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃおよびＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（原啓生物科技（上海）有限公司）を利用して製造し、ここでヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃはヒトのＢＣＭＡとヒトのＦｃ接続によって形成されたタンパク質を表し、ヒトＢＣＭＡタンパク質のアミノ酸配列はＮＣＢＩ公式サイトＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＡＢ６０８９５．１を参照し、ヒトのＦｃのアミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７に示され、バクテリオファージ天然ヒト由来抗体ライブラリ（原啓生物科技（上海）有限公司が構築）を交互に選別し、計４回選別し、４回選別した後、顕著な富化を観察する。ＥＬＩＳＡを利用して選別したバクテリオファージ抗体クローンを同定する。さらに得られた陽性抗体配列に親和力検査およびシーケンシングを行う。選別した候補抗体を１－２回親和力進化し、および再び親和力検査およびフロー結合活性同定を行い、計８株のヒトＢＣＭＡに特異的結合できるバクテリオファージ抗体クローンを得て、シーケンシング後に軽鎖可変領域（ＶＬ）核酸配列および重鎖可変領域（ＶＨ）核酸配列を得て、ＶＬおよびＶＨ核酸配列間はリンカーペプチド核酸配列（その核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示され、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５に示される）で接続されて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）形式を形成し、それぞれｈＢＣＭＡ－０１、ｈＢＣＭＡ－０２、ｈＢＣＭＡ－１５、ｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３と命名する；陽性対照のｓｃＦｖ配列は特許ＵＳ ２０１７／０２２６２１６ Ａ１のｈｕＢＣＭＡ－１０に由来する。前記９個すべての（ｈｕＢＣＭＡ－１０を含む）ｓｃＦｖの核酸配列を南京金斯瑞生物科技有限公司に委託して遺伝子合成を行い、それぞれｓｃＦｖ核酸配列の５’末端にフォワードプライマー（核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８７に示される）を追加し、ｓｃＦｖ核酸配列３’末端にリバースプライマー（核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８８）を追加し、次の同源組換えの分子構築に使用する。この８個の抗体クローンおよび陽性対照のＶＨおよびＶＬ遺伝子の配列は表１に示すとおりである。
実施例２ ＣＡＲレンチウイルスベクターの構築
ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢから購入）を用いてＣＡＲレンチウイルス核心空ベクタープラスミド（原啓生物科技（上海）有限責任公司が自社構築、以下ＣＡＲレンチウイルスの空ベクターと略称）またはＣＡＲレンチウイルスベクター（Ｌ６－Ｌｉ要素を含む。特許公開番号ＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１、Ｌ６－Ｌｉのアミノ酸配はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示される）（原啓生物科技（上海）有限責任公司が自社構築、以下ＣＡＲ－Ｌ６－Ｌｉレンチウイルスベクターと略称）を二重酵素切断し、前者は７７４９ｂｐ線形化フラグメントを産生し、後者は９６０５ｂｐ線形化フラグメントを産生する。
ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢから購入）を用いてＣＡＲレンチウイルス核心空ベクタープラスミド（原啓生物科技（上海）有限責任公司が自社構築、以下ＣＡＲレンチウイルスの空ベクターと略称）またはＣＡＲレンチウイルスベクター（Ｌ６－Ｌｉ要素を含む。特許公開番号ＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１、Ｌ６－Ｌｉのアミノ酸配はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示される）（原啓生物科技（上海）有限責任公司が自社構築、以下ＣＡＲ－Ｌ６－Ｌｉレンチウイルスベクターと略称）を二重酵素切断し、前者は７７４９ｂｐ線形化フラグメントを産生し、後者は９６０５ｂｐ線形化フラグメントを産生する。
タッピング回収後、使用産生された７７４９ｂｐ線形化フラグメントと実施例１で得られたｓｃＦｖの核酸配列フラグメント（両端の同じアームを含む）を使用し、１：３のモル比で混合し（体積は１０μｌを超えない）、相同組換えを行ってから、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換する。単一クローンのコロニーを選択し、振盪し、プラスミド抽出してシーケンシングに送って挿入されたｓｃＦｖ配列が正確かどうかを検証する。
タッピング回収後、産生された９６０５ｂｐ線形化フラグメントと実施例１におけるｈＢＣＭＡ－２２およびｈｕＢＣＭＡ－１０のｓｃＦｖの核酸配列フラグメント（両端の相同アームを含む）を使用し、１：３のモル比で混合し（体積は１０μｌを超えない）、相同組換えを行ってから、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換する。単一クローンのコロニーを選択し、振盪し、プラスミド抽出してシーケンシングに送って同定する。
ＣＡＲレンチウイルスの空ベクターおよびｈ（ｕ）ＢＣＭＡ－ＸＸ核心プラスミド（以下ｈ（ｕ）ＢＣＭＡ－ＸＸプラスミドと略称）におけるＣＡＲおよびＣＡＲ－Ｌ６－Ｌｉの各部の要素および接続順は図１を参照されたい。各部分の要素のアミノ酸配列および核酸配列は表２を参照されたい。ここでＣＡＲレンチウイルスの空ベクターのＣＡＲ部分は順次シグナルペプチド－ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８膜貫通ドメイン－ＣＤ１３７共刺激ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲベクターはＣＡＲレンチウイルスの空ベクターに基づき、シグナルペプチドおよびＣＤ８ヒンジ領域の間にＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖが挿入され、ＣＡＲ－Ｌ６－ＬｉベクターはＣＡＲベクターに基づき、ＣＤ３ζの３’末端でＬ６－Ｌｉ配列に接続される。各ベクターの５’末端はＥＦ１αプロモーター遺伝子に接続される。各プラスミドベクターにおけるＣＡＲ部分の配列は表３を参照されたい。
実施例３ レンチウイルスのパッケージング
例として、本発明のレンチウイルスベクターを構築するために用いられる系統は第三代に属し、該系統は計３個のプラスミドによって構成され、すなわちＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質およびＲｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号＃１２２６０）、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－ＧをコードするＰＭＤ２．Ｇプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号＃１２２５９）、および核心プラスミドであり、すなわち前記実施例１－２のｓｃＦｖ配列を含む各ＣＡＲレンチウイルスプラスミド（すなわちｈＢＣＭＡ－０１、ｈＢＣＭＡ－０２、ｈＢＣＭＡ－１５、ｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３、ｈｕＢＣＭＡ－１０）で構成される。各ＣＡＲレンチウイルスプラスミドにおけるＣＡＲ遺伝子は伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター遺伝子によってその発現を調整する。
例として、本発明のレンチウイルスベクターを構築するために用いられる系統は第三代に属し、該系統は計３個のプラスミドによって構成され、すなわちＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質およびＲｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号＃１２２６０）、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－ＧをコードするＰＭＤ２．Ｇプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号＃１２２５９）、および核心プラスミドであり、すなわち前記実施例１－２のｓｃＦｖ配列を含む各ＣＡＲレンチウイルスプラスミド（すなわちｈＢＣＭＡ－０１、ｈＢＣＭＡ－０２、ｈＢＣＭＡ－１５、ｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３、ｈｕＢＣＭＡ－１０）で構成される。各ＣＡＲレンチウイルスプラスミドにおけるＣＡＲ遺伝子は伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター遺伝子によってその発現を調整する。
レンチウイルスのパッケージング過程は以下のとおりである：
（１）成長状態が良好な（一般的には２０代以内の細胞を選択する）、約２．５×１０６個の２９３Ｔ細胞を５ｍｌの２９３Ｔ細胞完全培地（ＦＢＳ１０％の高糖ＤＭＥＭを含む）で、均一に混合してから６ｃｍの培養皿に接種し（２０－２４ｈ後に細胞の密集度が８０－９０％であることを確保する）、３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータ内で一晩培養する。
（２）約２０－２４ｈ後に、３００ｕＬの Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を取り、加入合わせて６μｇの三種のプラスミド（質量比でＣＡＲレンチウイルス核心プラスミド：ｐｓＰＡＸ２：ＰＭＤ２．Ｇ＝４：３：２の比率で加える）を加え、均一に混合してから１８ｕＬのＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）を加え、注意深く均一に混合してから、室温で１５－２０ｍｉｎ静置し、その後混合液を注意深く６ｃｍの培養皿に滴下し、注意深く培養皿を振盪し、３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータ内で一晩培養する。
（３）約２０－２４ｈトランスエフェクトしてから、注意深く６ｃｍの培養皿内の上層液体を捨て、その後５ｍＬの２９３Ｔ細胞完全培地をゆっくりと加える。
（４）約４８ｈトランスエフェクトしてから、６ｃｍの培養皿内の上層液体を取り（死亡細胞および破片を含む）、３０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞破片の上層ウイルス液を除去して新しい遠心管に移し、分注し、－８０℃で保存して使用に備える。
（１）成長状態が良好な（一般的には２０代以内の細胞を選択する）、約２．５×１０６個の２９３Ｔ細胞を５ｍｌの２９３Ｔ細胞完全培地（ＦＢＳ１０％の高糖ＤＭＥＭを含む）で、均一に混合してから６ｃｍの培養皿に接種し（２０－２４ｈ後に細胞の密集度が８０－９０％であることを確保する）、３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータ内で一晩培養する。
（２）約２０－２４ｈ後に、３００ｕＬの Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を取り、加入合わせて６μｇの三種のプラスミド（質量比でＣＡＲレンチウイルス核心プラスミド：ｐｓＰＡＸ２：ＰＭＤ２．Ｇ＝４：３：２の比率で加える）を加え、均一に混合してから１８ｕＬのＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）を加え、注意深く均一に混合してから、室温で１５－２０ｍｉｎ静置し、その後混合液を注意深く６ｃｍの培養皿に滴下し、注意深く培養皿を振盪し、３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータ内で一晩培養する。
（３）約２０－２４ｈトランスエフェクトしてから、注意深く６ｃｍの培養皿内の上層液体を捨て、その後５ｍＬの２９３Ｔ細胞完全培地をゆっくりと加える。
（４）約４８ｈトランスエフェクトしてから、６ｃｍの培養皿内の上層液体を取り（死亡細胞および破片を含む）、３０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞破片の上層ウイルス液を除去して新しい遠心管に移し、分注し、－８０℃で保存して使用に備える。
実施例４ ウイルスの力価測定
レンチウイルスの力価の検出は以下の方法で行う：
（１）実施例３のウイルス液を急速解凍する。
（２）成長状態が良好な２９３Ｔ細胞を取り（一般的に２０代以内の培養した細胞）、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、０．２５％のパンクレアチン（ＧＩＢＩＣＯ）を用いて、３７℃で約３分間消化し、細胞が完全に消化されてから一定の体積の２９３Ｔ細胞を完全培地に加えて反応を終了させ、サンプリングして計数し、その後細胞密度を２．０×１０５／ｍＬに調整し、最終濃度が１０ｕｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅを加え、さらに各ウェル２．５ｍＬの接種量で、細胞を６ウェルプレートに接種する。
（３）その後６ウェルプレートにそれぞれ前記ウイルス液を加え、一般的に各ウイルス液を３つの勾配を作成し、２ｕＬ、５ｕＬおよび１０ｕＬであり、且つ１－２個のウイルス液を加えない空白ウェルを追加してフロー検出時の陽性対照にする必要がある。
（４）細胞培養プレートを３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータに静置して培養する。
（５）細胞を４８ｈ静置培養し、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、０．２５％のパンクレアチン（ＧＩＢＩＣＯ）を用いて、３７℃で約３分間消化し、細胞が完全に消化されてから一定の体積の２９３Ｔ細胞を完全培地に加えて反応を終了させ、サンプリングして計数し、その後約５×１０５個の細胞を１．５ｍｌ無菌遠心管に取り、マークをつける。
（６）ＮＢＳ溶液（１％の新生ウシ血清を含むＰＢＳ溶液）で１．２－１．５ｍＬになるまで補充し、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。
（７）各管に１ｍＬのＮＢＳを加え、軽くピペッティングして均一に混合し、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、充分に上清を捨てる。
（８）各管に５０μｌのＮＢＳおよび０．５μｇの ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ａｖｉタンパク質（Ａｃｒｏ、ＢＣ７－Ｈ８２ＦＯ）を加え、用ピペットで軽くピペッティングして均一に混合し（陽性対照には一次抗体を加えない）、４℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
（９）インキュベートが完了したら直接１ｍｌのＮＢＳ再懸濁細胞を加え、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。
（１０）各管に５０μｌのＮＢＳおよび０．５μｌのＮａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎタンパク質（ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標) ６５０）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４３４１）（陽性対照にはこのタンパク質を加えない）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。
（１１）ステップ（９）を繰り返す。
（１２）各管に２００μｌのＮＢＳ再懸濁細胞を加える。
（１３）ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩＩフローサイトメーター上で蛍光発現率を検出し、蛍光はＤｙｌｉｇｈｔ ６５０である。
（１４）データ処理：各試験管の陽性率－陽性対照の陽性率が５％－２０％になった時のみ、結果を使用できる。
レンチウイルスの力価の検出は以下の方法で行う：
（１）実施例３のウイルス液を急速解凍する。
（２）成長状態が良好な２９３Ｔ細胞を取り（一般的に２０代以内の培養した細胞）、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、０．２５％のパンクレアチン（ＧＩＢＩＣＯ）を用いて、３７℃で約３分間消化し、細胞が完全に消化されてから一定の体積の２９３Ｔ細胞を完全培地に加えて反応を終了させ、サンプリングして計数し、その後細胞密度を２．０×１０５／ｍＬに調整し、最終濃度が１０ｕｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅを加え、さらに各ウェル２．５ｍＬの接種量で、細胞を６ウェルプレートに接種する。
（３）その後６ウェルプレートにそれぞれ前記ウイルス液を加え、一般的に各ウイルス液を３つの勾配を作成し、２ｕＬ、５ｕＬおよび１０ｕＬであり、且つ１－２個のウイルス液を加えない空白ウェルを追加してフロー検出時の陽性対照にする必要がある。
（４）細胞培養プレートを３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータに静置して培養する。
（５）細胞を４８ｈ静置培養し、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、０．２５％のパンクレアチン（ＧＩＢＩＣＯ）を用いて、３７℃で約３分間消化し、細胞が完全に消化されてから一定の体積の２９３Ｔ細胞を完全培地に加えて反応を終了させ、サンプリングして計数し、その後約５×１０５個の細胞を１．５ｍｌ無菌遠心管に取り、マークをつける。
（６）ＮＢＳ溶液（１％の新生ウシ血清を含むＰＢＳ溶液）で１．２－１．５ｍＬになるまで補充し、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。
（７）各管に１ｍＬのＮＢＳを加え、軽くピペッティングして均一に混合し、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、充分に上清を捨てる。
（８）各管に５０μｌのＮＢＳおよび０．５μｇの ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ａｖｉタンパク質（Ａｃｒｏ、ＢＣ７－Ｈ８２ＦＯ）を加え、用ピペットで軽くピペッティングして均一に混合し（陽性対照には一次抗体を加えない）、４℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
（９）インキュベートが完了したら直接１ｍｌのＮＢＳ再懸濁細胞を加え、４℃、５００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。
（１０）各管に５０μｌのＮＢＳおよび０．５μｌのＮａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎタンパク質（ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標) ６５０）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４３４１）（陽性対照にはこのタンパク質を加えない）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。
（１１）ステップ（９）を繰り返す。
（１２）各管に２００μｌのＮＢＳ再懸濁細胞を加える。
（１３）ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩＩフローサイトメーター上で蛍光発現率を検出し、蛍光はＤｙｌｉｇｈｔ ６５０である。
（１４）データ処理：各試験管の陽性率－陽性対照の陽性率が５％－２０％になった時のみ、結果を使用できる。
レンチウイルス力価（ＩＵ／ｍＬ）＝ 播種細胞個数×（試験管陽性率－対照管陽性率）／ 接種ウイルス液の体積（ｍＬ）。
検出によると、前記各ｓｃＦｖを含むＣＡＲウイルス力価範囲は５－１５×１０６ ＩＵ／ｍＬである。
実施例５ Ｔ細胞の感染およびＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ増幅
ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ配列を含むＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は以下のとおりである：
（１）Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって、アフェレーシス装置から採集した血液サンプルにおいてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る（アフェレーシスは原啓生物科技（上海）有限責任公司方舟計画の志願者より提供）。
（２）ＰＢＭＣはＣＤ３陽性磁気ビーズ選別によって純度＞９０％のＣＤ３＋Ｔ細胞を得て、Ｔ選別の具体的な方法は製品説明書（ＭＡＣＳ、ＤＳ１３０－０５０－１０１）を参照されたい。
（３）Ｔ細胞完全培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）を用いて培地に５％のＦＢＳを加え、さらに３００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン２（ヒンギル））再懸濁ＣＤ３＋Ｔ細胞を加え、さらに３倍の細胞量で加入洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、４０２０３Ｄ）を加え、その後Ｔ細胞完全培地を補充し、細胞密度を１．０－１．２×１０６／ｍＬに調整し、細胞を３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータで活性培養する（Ｄ０と記録する）。
（４）一般的にＴ細胞を２０－２４ｈ活性化させてから、レンチウイルスの形質導入を行う。
（５）２０－２４ｈ活性化したＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してから、一定体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁してからサンプリングして計数し、ウイルス感染多重度（ＭＯＩ）３－６の比率で、それぞれ加入実施例３において力価を測定したウイルス液を加え、その後ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを最終濃度が５μｇ／ｍｌになるまで加え、さらにＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．６－１．０×１０６／ｍＬに調整し、さらに細胞を３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータに入れて培養し、Ｔ細胞のレンチウイルス感染していない部分を取り、陽性対照群とする。
（６）約２０－２４ｈウイルス形質導入してから、各群のＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してから、一定体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁してからサンプリングして計数し、Ｔ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．５－０．７×１０６／ｍＬに調整する。
（７）その後、１－２日ごとにＣＡＲ－Ｔ細胞に計数処理を行い、実際の状況に基づいてＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．５－１．０×１０６／ｍＬに調整する。
（８）一般的な状況において、Ｄ７を培養する時にＤｙｎａｂｅａｄｓを除去し、総培養周期は１２日前後である。
ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ配列を含むＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は以下のとおりである：
（１）Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって、アフェレーシス装置から採集した血液サンプルにおいてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る（アフェレーシスは原啓生物科技（上海）有限責任公司方舟計画の志願者より提供）。
（２）ＰＢＭＣはＣＤ３陽性磁気ビーズ選別によって純度＞９０％のＣＤ３＋Ｔ細胞を得て、Ｔ選別の具体的な方法は製品説明書（ＭＡＣＳ、ＤＳ１３０－０５０－１０１）を参照されたい。
（３）Ｔ細胞完全培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）を用いて培地に５％のＦＢＳを加え、さらに３００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン２（ヒンギル））再懸濁ＣＤ３＋Ｔ細胞を加え、さらに３倍の細胞量で加入洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、４０２０３Ｄ）を加え、その後Ｔ細胞完全培地を補充し、細胞密度を１．０－１．２×１０６／ｍＬに調整し、細胞を３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータで活性培養する（Ｄ０と記録する）。
（４）一般的にＴ細胞を２０－２４ｈ活性化させてから、レンチウイルスの形質導入を行う。
（５）２０－２４ｈ活性化したＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してから、一定体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁してからサンプリングして計数し、ウイルス感染多重度（ＭＯＩ）３－６の比率で、それぞれ加入実施例３において力価を測定したウイルス液を加え、その後ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを最終濃度が５μｇ／ｍｌになるまで加え、さらにＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．６－１．０×１０６／ｍＬに調整し、さらに細胞を３７℃、ＣＯ２５％のインキュベータに入れて培養し、Ｔ細胞のレンチウイルス感染していない部分を取り、陽性対照群とする。
（６）約２０－２４ｈウイルス形質導入してから、各群のＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してから、一定体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁してからサンプリングして計数し、Ｔ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．５－０．７×１０６／ｍＬに調整する。
（７）その後、１－２日ごとにＣＡＲ－Ｔ細胞に計数処理を行い、実際の状況に基づいてＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度を０．５－１．０×１０６／ｍＬに調整する。
（８）一般的な状況において、Ｄ７を培養する時にＤｙｎａｂｅａｄｓを除去し、総培養周期は１２日前後である。
図２および図３に示されるように、１２日活性培養されたＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の総増幅倍率は１００－１６００倍の間にあり、感染後のＣＡＲ陽性率はいずれも６５％から９０％の間にあり、いずれも細胞学機能の実験に用いることができる。
実施例６ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ標的殺傷活性の評価
ＭＭ１ｓ細胞はＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞であり、Ｋ５６２細胞はＢＣＭＡを発現しない腫瘍細胞である。本実験において、我々はまずルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定して発現する二種類の腫瘍細胞を構築し、さらに腫瘍細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と一定の時間共培養してから、基質によってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性を間接的に検出し（原理はＰｒｏｍｅｇａ， Ｅ２５１０を参照）、さらにＣＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力を確定する。
ＭＭ１ｓ細胞はＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞であり、Ｋ５６２細胞はＢＣＭＡを発現しない腫瘍細胞である。本実験において、我々はまずルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定して発現する二種類の腫瘍細胞を構築し、さらに腫瘍細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と一定の時間共培養してから、基質によってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性を間接的に検出し（原理はＰｒｏｍｅｇａ， Ｅ２５１０を参照）、さらにＣＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力を確定する。
ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅのＭＭ１ｓ－ＬｕｃｉおよびＫ５６２－Ｌｕｃｉを過剰発現する方法は以下のとおりである：
（１）Ｐｒｏｍｅｇａ社からｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］ Ｖｅｃｔｏｒを購入し、その中のｌｕｃ２Ｐ ｒｅｐｏｒｔｅｒ遺伝子（２２８－２００３）をＣＡＲ構造を含まないレンチウイルス核心空ベクタープラスミドにクローニングし（該空ベクターはＧＦＰレポーター遺伝子を含む）、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰレンチウイルス核心プラスミドと定義する。
（２）実施例３の方法に従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ（Ｌｕｃｉ－ＧＦＰと略記）レンチウイルスをパッケージングし、実施例４の方法を参照し、ＧＦＰ蛍光チャネルによってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰレンチウイルスの力価を検出する。
（３）ＭＯＩ＝５－１０に従い、それぞれＭＭ１ｓ細胞およびＫ５６２細胞を感染させ、３－４週安定培養させてから、フロー選別装置によって、ＧＦＰ＋の細胞群を選別し、ＭＭ１ｓ－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰ細胞およびＫ５６２－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰ細胞を構築する。
（１）Ｐｒｏｍｅｇａ社からｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］ Ｖｅｃｔｏｒを購入し、その中のｌｕｃ２Ｐ ｒｅｐｏｒｔｅｒ遺伝子（２２８－２００３）をＣＡＲ構造を含まないレンチウイルス核心空ベクタープラスミドにクローニングし（該空ベクターはＧＦＰレポーター遺伝子を含む）、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰレンチウイルス核心プラスミドと定義する。
（２）実施例３の方法に従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ（Ｌｕｃｉ－ＧＦＰと略記）レンチウイルスをパッケージングし、実施例４の方法を参照し、ＧＦＰ蛍光チャネルによってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰレンチウイルスの力価を検出する。
（３）ＭＯＩ＝５－１０に従い、それぞれＭＭ１ｓ細胞およびＫ５６２細胞を感染させ、３－４週安定培養させてから、フロー選別装置によって、ＧＦＰ＋の細胞群を選別し、ＭＭ１ｓ－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰ細胞およびＫ５６２－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰ細胞を構築する。
Ｄ８－Ｄ１２を培養する期間にＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性検出を行い、予め各群のＣＡＲ陽性率を測定し、０．５－１．０×１０６個の細胞を取る必要があり、検出方法は実施例４の（６）－（１３）を参照されたい。
ＣＡＲレンチウイルスに感染した細胞はエフェクター細胞であり、レンチウイルス感染していないＴ細胞は空白エフェクター細胞であり、ＭＭ１ｓ－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰ細胞およびＫ５６２－Ｌｕｃｉ－ＧＦＰは標的細胞である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性の実験過程は以下のとおりである：
（１）１日前にフロー法で各群のＣＡＲ陽性率を検出する。
（２）殺傷実験の当日、空白エフェクター細胞を補充する方式で、各群のＣＡＲ陽性率を均一に調整し、培地はサイトカインを含まないＣＡＲ－Ｔ培地である。
（３）９６ウェルプレートで殺傷活性実験を行い、エフェクター細胞および標的細胞の比率が３：１、１：１および０．３：１の三種（または３：１および１：１の二種）で、各９６ウェルの標的細胞数２×１０４個に固定し、順次標的細胞およびエフェクター細胞を加え、各群それぞれエフェクター：標的比で３個の複製ウェルを設定し、さらに３個の単独標的細胞孔を陽性対照として設定する必要がある。
（４）一般的に５－６時間殺傷してから殺傷活性検出を行う。まず９６ウェルプレートで細胞懸濁液をピペッティングして均一に混合し、その後１／２体積の細胞懸濁液を９６ウェルホワイトプレートに均等に取り出し、さらに等体積のルシフェラーゼの基質を加え、室温で１０－１５ｍｉｎ光を避け、マイクロプレートリーダー上で対応する蛍光値を読み取る。具体的な検出方法はＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ(登録商標)ルシフェラーゼ検出系統（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｅ２５１０）を参照されたい。
（５）生きているＭＭ１ｓ細胞のみが検出されるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対する殺傷毒性は以下の公式で計算できる：
（１）１日前にフロー法で各群のＣＡＲ陽性率を検出する。
（２）殺傷実験の当日、空白エフェクター細胞を補充する方式で、各群のＣＡＲ陽性率を均一に調整し、培地はサイトカインを含まないＣＡＲ－Ｔ培地である。
（３）９６ウェルプレートで殺傷活性実験を行い、エフェクター細胞および標的細胞の比率が３：１、１：１および０．３：１の三種（または３：１および１：１の二種）で、各９６ウェルの標的細胞数２×１０４個に固定し、順次標的細胞およびエフェクター細胞を加え、各群それぞれエフェクター：標的比で３個の複製ウェルを設定し、さらに３個の単独標的細胞孔を陽性対照として設定する必要がある。
（４）一般的に５－６時間殺傷してから殺傷活性検出を行う。まず９６ウェルプレートで細胞懸濁液をピペッティングして均一に混合し、その後１／２体積の細胞懸濁液を９６ウェルホワイトプレートに均等に取り出し、さらに等体積のルシフェラーゼの基質を加え、室温で１０－１５ｍｉｎ光を避け、マイクロプレートリーダー上で対応する蛍光値を読み取る。具体的な検出方法はＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ(登録商標)ルシフェラーゼ検出系統（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｅ２５１０）を参照されたい。
（５）生きているＭＭ１ｓ細胞のみが検出されるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対する殺傷毒性は以下の公式で計算できる：
図４のＡおよびＢに示されるように、空白エフェクター細胞Ｔ細胞に比べ、各群のＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は発現ＢＣＭＡを発現するＭＭ１ｓ細胞に対していずれも強い殺傷活性を有し、且つ明らかなエフェクター：標的比依存性を示し、ＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞に対し、いかなる殺傷作用もなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞の殺傷作用が特異的であることを証明し、さらに図４から分かるように、三種のエフェクター：標的比で、本願のｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３はいずれも陽性対照ｈｕＢＣＭＡ－１０より強く、エフェクター：標的比１：１で、標的細胞に対する殺傷毒性は２０％より大きく、エフェクター：標的比３：１で、標的細胞に対する殺傷毒性は７０％より大きい。
実施例７ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞インビトロ殺傷後のＩＦＮ－γ分泌状況
実施例６を参照し、９６ウェルプレートで標的細胞殺傷実験を行い、エフェクター細胞および標的細胞の比率は１：３であり、その後各９６ウェルのエフェクター細胞数を２×１０４個に固定し、順次標的細胞およびエフェクター細胞を加え、各群それぞれエフェクター：標的比で３個の複製ウェルを設定し、さらに各群はいずれも３個の単独エフェクター細胞ウェルを設定し、エフェクター細胞のバックグラウンド因子の分泌量を検出する。
実施例６を参照し、９６ウェルプレートで標的細胞殺傷実験を行い、エフェクター細胞および標的細胞の比率は１：３であり、その後各９６ウェルのエフェクター細胞数を２×１０４個に固定し、順次標的細胞およびエフェクター細胞を加え、各群それぞれエフェクター：標的比で３個の複製ウェルを設定し、さらに各群はいずれも３個の単独エフェクター細胞ウェルを設定し、エフェクター細胞のバックグラウンド因子の分泌量を検出する。
標的細胞殺傷後の２４ｈ前後に、９６ウェルプレートを遠心分離し、各ウェルの上層の清澄液を収集し（直ちに検出しない場合、上層の清澄液を－８０℃の冷凍庫で保存する必要がある）。
Ｅｌｉｓａ法でＩＦＮ－γサイトカインの分泌を検出し（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２８５）、方法は以下のとおりである：
（１）予め試薬キット内のＩＦＮ－γ捕獲抗体を９６ウェルに加えて室温で一晩被覆する；
（２）被覆した９６ウェルプレートを緩衝液で洗浄し、ブロッキング液を加え、室温で１ｈブロッキングし、その後緩衝液で洗浄して使用に備える。
（３）説明書に従い、試薬キット中の標準品を勾配希釈し、同時に収集したテスト対照の上層清澄液を５－３０倍に希釈し、その後希釈後の標準品および検出対象のサンプルを前記処理後の９６ウェルプレートに加え、室温で２ｈする。
（４）緩衝液で各ウェルを洗浄し、加入試薬キット内のＩＦＮ－γ検出抗体を加え、室温で２ｈインキュベートする。
（５）緩衝液で各ウェルを洗浄し、加入試薬キット中にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを加え、室温で光を避けて２０ｍｉｎインキュベートする。
（６）緩衝液で各ウェルを洗浄し、基質液ＴＭＢを加え（配合はＲ＆Ｄ、ＤＹ２８５を参照）、室温で光を避けて２０ｍｉｎインキュベートする。
（７）停止液を加え（配合はＲ＆Ｄ、ＤＹ２８５を参照）、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０の対応する数値を読み取る。
（１）予め試薬キット内のＩＦＮ－γ捕獲抗体を９６ウェルに加えて室温で一晩被覆する；
（２）被覆した９６ウェルプレートを緩衝液で洗浄し、ブロッキング液を加え、室温で１ｈブロッキングし、その後緩衝液で洗浄して使用に備える。
（３）説明書に従い、試薬キット中の標準品を勾配希釈し、同時に収集したテスト対照の上層清澄液を５－３０倍に希釈し、その後希釈後の標準品および検出対象のサンプルを前記処理後の９６ウェルプレートに加え、室温で２ｈする。
（４）緩衝液で各ウェルを洗浄し、加入試薬キット内のＩＦＮ－γ検出抗体を加え、室温で２ｈインキュベートする。
（５）緩衝液で各ウェルを洗浄し、加入試薬キット中にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを加え、室温で光を避けて２０ｍｉｎインキュベートする。
（６）緩衝液で各ウェルを洗浄し、基質液ＴＭＢを加え（配合はＲ＆Ｄ、ＤＹ２８５を参照）、室温で光を避けて２０ｍｉｎインキュベートする。
（７）停止液を加え（配合はＲ＆Ｄ、ＤＹ２８５を参照）、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０の対応する数値を読み取る。
各試薬は、ＩＦＮ－γ標準品、捕獲抗体、検出抗体、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰなどの動作濃度を含み、詳細は説明書を参照し（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２８５）、残りの試薬は、緩衝液、ブロッキング液、希釈液、基質液、停止液などの配合を含み、詳細はＲ＆Ｄ、ＤＹ２８５を参照されたい。
最後に４つのパラメータのフィッティング法に基づいて標準曲線と対応するフィッティング公式を得て、フィッティング公式とテスト対象のサンプルの希釈倍数から、テスト対象のサンプルにおけるＩＦＮ－γの濃度を計算する。
図５に示すように、ＭＭ１ｓ細胞の刺激がない状況で、各群のＣＡＲ－Ｔ細胞はいずれもＩＦＮ－γの分泌がなく、ＭＭ１ｓ細胞の刺激下では、本願で選択した陽性対照ｈｕＢＣＭＡ－１０（特許番号：ＵＳ ２０１７／０２２６２１６ Ａ１）に比べ、本願のｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２、ｈＢＣＭＡ－２３が標的細胞を殺傷する時により多くのＩＦＮ－γ分泌を生成し、分泌はいずれも１５００ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに２０００ｐｇ／ｍＬに達する。
実施例８ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖能力
ＭＭ１ｓ細胞はγ線照射後の生存率が極めて低いため、本実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖能力検出は未処理のＭＭ１ｓ細胞を標的細胞として選択する。
ＭＭ１ｓ細胞はγ線照射後の生存率が極めて低いため、本実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖能力検出は未処理のＭＭ１ｓ細胞を標的細胞として選択する。
一般的にＣＡＲ－Ｔ細胞培養は９－１２日前後行い、予め各群のＣＡＲ陽性率を検出し、さらに空白のエフェクターＴＴ細胞で各群のＣＡＲ陽性率が一致するように調整する必要がある（培地はいかなる添加物も含まないＸ－ＶＩＶＯ １５培地）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＭＭ１ｓ細胞を、エフェクター：標的比１：１の比率で１回目の標的刺激を行い、４－５日共培養してから、全ての細胞を収集し、サンプリングして計数し、さらに０．５：１（総ＣＡＲ－Ｔ細胞 ： 新しいＭＭ１ｓ細胞）の比率で、２回目の標的刺激を行い、さらに４－５日共培養し、３回目の標的刺激を行う（二種類の細胞間の比率と２回目の標的刺激は同じである）。３回目の標的刺激の期間に、細胞の成長状況に応じて１－２日ごとに適量のＸ－ＶＩＶＯ １５培地を補充する。
図６に示すように、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は２回の標的刺激をへると、本願のｈＢＣＭＡ－１７、ｈＢＣＭＡ－１９、ｈＢＣＭＡ－２０、ｈＢＣＭＡ－２２およびｈＢＣＭＡ－２３の標的増殖倍数はいずれも高くなる。
実施例９ Ｌ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ標的殺傷活性および殺傷後のＩＦＮ－γの分泌状況
実施例２に記載のように、ｈＢＣＭＡ－２２およびｈｕ－ＢＣＭＡ－１０のｓｃＦｖの核酸配列をＬ６－Ｌｉを含むＣＡＲレンチウイルスベクターに構築し、ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉおよびｈｕ－ＢＣＭＡ－１０－Ｌ６－Ｌｉのレンチウイルスベクターを得る。レンチウイルスをパッケージングし、ウイルス力価を測定し、ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで増幅し、Ｄ８－Ｄ１２の期間にＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性および殺傷後のＩＦＮ－γ分泌量の検出を行い、具体的な操作方法は実施例３－７を参照されたい。
実施例２に記載のように、ｈＢＣＭＡ－２２およびｈｕ－ＢＣＭＡ－１０のｓｃＦｖの核酸配列をＬ６－Ｌｉを含むＣＡＲレンチウイルスベクターに構築し、ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉおよびｈｕ－ＢＣＭＡ－１０－Ｌ６－Ｌｉのレンチウイルスベクターを得る。レンチウイルスをパッケージングし、ウイルス力価を測定し、ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで増幅し、Ｄ８－Ｄ１２の期間にＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性および殺傷後のＩＦＮ－γ分泌量の検出を行い、具体的な操作方法は実施例３－７を参照されたい。
図７に示すように、ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉおよびｈｕ－ＢＣＭＡ－１０－Ｌ６－ＬｉのＣＡＲ－Ｔ細胞はＭＭ１ｓ細胞に対し、３つのエフェクター：標的比での特異的殺傷能力がほぼ一致する。エフェクター：標的比が３：１で、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対する殺傷毒性は約９０％である；エフェクター：標的比が１：１で、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷毒性は約４０％である。同時に図８に示すように、この二組のＣＡＲ－Ｔ細胞はＭＭ１ｓ細胞と共培養後のＩＦＮ－γの分泌能力も、ほぼ一致する。エフェクター：標的比が１：１で、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を４８ｈ共培養すると、ＩＦＮ－γ分泌量を約５０００ｐｇ／ｍＬまで刺激できる；エフェクター：標的比１：６で、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を４８ｈ共培養すると、ＩＦＮ－γ分泌量を約１７５００ｐｇ／ｍＬまで刺激できる。
実施例１０ ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ ＣＡＲ構造でのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の担癌マウスに対する腫瘍除去能力およびマウス体内での代謝状況
６週齢のＮＳＧマウスに、１匹当たり１×１０７ ＭＭ１ｓの細胞を皮下接種すると、１４日後にマウス皮下腫瘍の体積の大きさは約１５０－２５０ｍｍ３になり、マウスを２群に分け（各群マウス８匹）、それぞれ新たに調製したｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群のＣＡＲ－Ｔ細胞（２×１０６ ＣＡＲ＋／匹）および陽性対照のＴ細胞（Ｔ細胞群のマウス１匹当たりの接種細胞数とｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群の２×１０６ ＣＡＲ＋の対応する総細胞数は同じ）を接種し、ＣＡＲ－Ｔ注射後の０日目と定義する。
６週齢のＮＳＧマウスに、１匹当たり１×１０７ ＭＭ１ｓの細胞を皮下接種すると、１４日後にマウス皮下腫瘍の体積の大きさは約１５０－２５０ｍｍ３になり、マウスを２群に分け（各群マウス８匹）、それぞれ新たに調製したｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群のＣＡＲ－Ｔ細胞（２×１０６ ＣＡＲ＋／匹）および陽性対照のＴ細胞（Ｔ細胞群のマウス１匹当たりの接種細胞数とｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群の２×１０６ ＣＡＲ＋の対応する総細胞数は同じ）を接種し、ＣＡＲ－Ｔ注射後の０日目と定義する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の接種が完了してから、毎週２回ノギスで腫瘍の大きさを測定し、マウスの体重を秤量し、マウスの毛の色、排泄物、飲食および摂水、体の運動およびマウスの死亡状況を観察する。ＣＡＲ－Ｔ注射後の７日目、１４日目、２１日の各群のマウス５匹に尾静脈採血を行い、それぞれサイトカイン分泌（Ｔｈ１／２／１７ ＣＢＡＩＦＮ－γおよびＩＬ－２サイトカイン）およびヒトＴ細胞比率（ｈＣＤ３およびＨＣＤ８）を検出し、腫瘍体積が３０００ｍｍ３を超えた場合マウスを殺処理し、９０日目になった時に残りのマウスを全て殺処理し、実験を終了する。
１０．１ フロー検出方法でマウス末梢血中のｈＣＤ３およびＨＣＤ８分子マーカーを検出する
（１） １０ｍｌのヒト用１０ｍｌヒトＥＤＴＡ．Ｋ２採血管（江蘇康捷医療機器有限公司）を用いて、５００ｕｌのＰＢＳを注入し、均一に混合し、その中から２０ｕｌの対応する１．５ｍｌ ＥＰ管内に取り出す；
（２） マウス尾静脈から３０ｕｌ採血し、すなわち合わせて５０ｕｌである；
（３） ３０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離する；上清を１５ｕｌ取ってＣＢＡを測定する（直ちに測定しない場合、必ず－８０℃の冷凍庫に保存する必要がある）；
（４） 残りの３５ｕｌに、４０ｕｌのＰＢＳに補充し、さらに充分に混合し、フロー管内に移す；
（５） 抗体にＡＰＣ－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－ＣＤ３抗体（ＢＤ、５５５３３５）およびＰｅｒｃｐ－ｃｙ５．５－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－ＣＤ８抗体（ＢＤ、３４１０５１）を加える；
（６） ボルテクサーを用いて低速で均一に混合してから、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートする；
（７） 洗浄する必要なく直接２ｍｌの赤血球細胞溶解液（ＢＤ、３４９０２）を加え、ボルテクサーを用いて低速で均一に混合してから、室温で光を避けて１０分間インキュベートする；
（８） ５００ｇで、４分間遠心分離し、上清を捨てる；
（９） 実施例４のＮＢＳ溶液を２ｍｌ加え、ボルテクサーを用いて低速で均一に混合する；
（１０） ５００ｇで、４分間遠心分離する；
（１１） ２００ｕｌのＮＢＳ溶液で細胞を再懸濁して沈殿させ、均一に混合してフロー検出を準備する。
（１） １０ｍｌのヒト用１０ｍｌヒトＥＤＴＡ．Ｋ２採血管（江蘇康捷医療機器有限公司）を用いて、５００ｕｌのＰＢＳを注入し、均一に混合し、その中から２０ｕｌの対応する１．５ｍｌ ＥＰ管内に取り出す；
（２） マウス尾静脈から３０ｕｌ採血し、すなわち合わせて５０ｕｌである；
（３） ３０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離する；上清を１５ｕｌ取ってＣＢＡを測定する（直ちに測定しない場合、必ず－８０℃の冷凍庫に保存する必要がある）；
（４） 残りの３５ｕｌに、４０ｕｌのＰＢＳに補充し、さらに充分に混合し、フロー管内に移す；
（５） 抗体にＡＰＣ－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－ＣＤ３抗体（ＢＤ、５５５３３５）およびＰｅｒｃｐ－ｃｙ５．５－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－ＣＤ８抗体（ＢＤ、３４１０５１）を加える；
（６） ボルテクサーを用いて低速で均一に混合してから、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートする；
（７） 洗浄する必要なく直接２ｍｌの赤血球細胞溶解液（ＢＤ、３４９０２）を加え、ボルテクサーを用いて低速で均一に混合してから、室温で光を避けて１０分間インキュベートする；
（８） ５００ｇで、４分間遠心分離し、上清を捨てる；
（９） 実施例４のＮＢＳ溶液を２ｍｌ加え、ボルテクサーを用いて低速で均一に混合する；
（１０） ５００ｇで、４分間遠心分離する；
（１１） ２００ｕｌのＮＢＳ溶液で細胞を再懸濁して沈殿させ、均一に混合してフロー検出を準備する。
１０．２ ＴＨ１／２／１７ ＣＢＡ（ＢＤ、５６０４８４）のサイトカイン（ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２）を検出する方法
（１） サンプル数に基づいて、必要なｂｅａｄｓ数を計算する；
（２） 捕捉磁気ビーズ懸濁液管（Ａ１－Ａ７）を少なくとも１分間激しくボルテックスする；
（３） １．５ｍｌのＥＰ管を取り、ＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓと表記する；
（４） 所用のＡ１－Ａ７ ｂｅａｄｓ数をＥＰ管内に取る；
（５） 混合したｂｅａｄｓ懸濁液を１分間ボルテックスし、充分に均一に混合する；
（６） ３００ｇで、５分間遠心分離する；
（７） 上清を取り除き、等体積のＳｅｒｕｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒで（試薬キットに付属）ＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓを再懸濁する；
（８） １分間ボルテックスし、室温で光を避けて３０分間インキュベートする；
（９） 新しいＥＰ管を取り、５０ｕｌのマウス血漿サンプルを加え、さらに５０ｕｌのＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓを加え、さらに５０ｕｌのＰＥ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔを加える（試薬キットに付属）；
（１０） ３０ｓボルテックスしてから、室温光を避けて３時間インキュベートする；
（１１） ５００ｕｌのＰＢＳを加え、ボルテックスして均一に混合してから、３００ｇで、 ５分間遠心分離する；
（１２） 上清を取り除き、２００ｕｌのＰＢＳで再懸濁し、充分にボルテックスしてから、フロー管に移し、検出を待つ。
（１） サンプル数に基づいて、必要なｂｅａｄｓ数を計算する；
（２） 捕捉磁気ビーズ懸濁液管（Ａ１－Ａ７）を少なくとも１分間激しくボルテックスする；
（３） １．５ｍｌのＥＰ管を取り、ＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓと表記する；
（４） 所用のＡ１－Ａ７ ｂｅａｄｓ数をＥＰ管内に取る；
（５） 混合したｂｅａｄｓ懸濁液を１分間ボルテックスし、充分に均一に混合する；
（６） ３００ｇで、５分間遠心分離する；
（７） 上清を取り除き、等体積のＳｅｒｕｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒで（試薬キットに付属）ＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓを再懸濁する；
（８） １分間ボルテックスし、室温で光を避けて３０分間インキュベートする；
（９） 新しいＥＰ管を取り、５０ｕｌのマウス血漿サンプルを加え、さらに５０ｕｌのＴＨ１／２／１７ ｂｅａｄｓを加え、さらに５０ｕｌのＰＥ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔを加える（試薬キットに付属）；
（１０） ３０ｓボルテックスしてから、室温光を避けて３時間インキュベートする；
（１１） ５００ｕｌのＰＢＳを加え、ボルテックスして均一に混合してから、３００ｇで、 ５分間遠心分離する；
（１２） 上清を取り除き、２００ｕｌのＰＢＳで再懸濁し、充分にボルテックスしてから、フロー管に移し、検出を待つ。
図９のＡおよびＢに示すように、ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群のＣＡＲ－Ｔ細胞を担癌マウスに注射すると、腫瘍体積が継続的に増大し、Ｄ８時に最大に到達し、この時Ｍｏｃｋ Ｔ群の平均腫瘍体積に近くなる。約２週で、ｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群は腫瘍が消失し始め、４週前後で腫瘍は完全に消失し、Ｍｏｃｋ Ｔ群は３週で、腫瘍体積が３０００ｍｍ３以上に上昇している。
図１０のＡおよびＢにはｈＢＣＭＡ－２２－Ｌ６－Ｌｉ群のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＣＤ３＋細胞を例とし、ｈＣＤ８＋細胞比率の変化傾向はｈＣＤ３＋にほぼ一致しているため、データは表示しない）の担癌マウス体内での増殖代謝状況が示される。異なるマウス体内のＣＡＲ－Ｔ細胞の高速増幅開始点およびピークは同じではなく（ｈＣＤ３ピーク点は１４日から２１日の間に出現する）、平均レベルから見ると、ＣＡＲ－Ｔ注射の１４日目に、ｈＣＤ３＋ Ｔ細胞の含有量の平均値は４０％前後であり、その後次第に低下し、２８日目に、ｈＣＤ３＋ Ｔ細胞の含有量の平均値は５％以下に低下する。４つの検出時点で下Ｍｏｃｋ Ｔ群のＴ細胞増殖は検出されなかった。
腫瘍を抑制し、腫瘍を解消すると同時に、マウス末梢血中で大量のＩＦＮ－γおよび少量のＩＬ－２サイトカインを検出し（ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ１７Ａサイトカイン分泌は検出されなかったため、データは示さない）、図１１のＡに示されるように、異なるマウス体内のＩＦＮ－γサイトカイン分泌開始点およびピーク点も異なり、且つ図１０のＡを組み合わせると分かるように、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌ピークはいずれもＣＡＲ－Ｔ細胞増殖ピークより前にあり、２１日目に、その含有量は３ｐｇ／ｍｌ以下に低下する。４つの検出時点ではＭｏｃｋ Ｔ群のＩＦＮ－γ分泌は検出されなかった。
ＩＬ－２サイトカインの分泌レベルは明らかにＩＦＮ－γ（図１２）より低く、ＣＡＲ－Ｔ注射の７日目にピークに達する（平均値は５０ｐｇ／ｍｌ）、その後急速に下降する。
前記詳細な説明は説明および例示のために提供されたものであり、請求項の範囲を制限するものではない。現在本願に列挙されている実施方式の複数の変形は当業者にとって明らかであり、且つ請求項およびその等価の方式の範囲内に保持される。
一方で、本願はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、それはＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで前記抗体は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）であり、前記ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体は重鎖可変領域ＶＨを含み、且つ前記ＶＨ包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体はＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨおよびＶＬ以下のいずれか一組から選択されるアミノ酸配列を含む：（１）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；（２）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（３）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（４）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；（５）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；（６）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；（７）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４；および（８）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４。
ある実施形態において、前記ｓｃＦｖにおいて、前記ＶＨのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端は直接または間接的に接続される。
本願において、専門用語「Ｌ６－Ｌｉ」は、一般的にＰ２Ａペプチドによってレプチンと連結したＬＲＰ６であり、Ｌ６－Ｌｉに関連する内容は公開番号ＷＯ２０２１０５７９３２Ａ１を参照されたい。本願において、前記Ｌ６－ＬｉはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示されるアミノ酸配列を含む。本願において、前記Ｌ６－Ｌｉをコードする核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６に示されるヌクレオチド配列を含む。
Claims (86)
- キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ＢＣＭＡ結合ドメインを含み、前記ＢＣＭＡ結合ドメインはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで前記抗体は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む、ＣＡＲ。 - 前記抗体が重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
- 前記ＨＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２－２４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が、以下の群から選択される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のいずれかのセットを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＡＲ：
（１）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５；
（２）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５；および、
（３）ＨＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＨＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４およびＨＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５。 - 前記抗体が重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端が前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｈ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２が前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｈ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３が前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｈ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｈ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端が前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｈ－ＦＲ４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｈ－ＦＲ４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｈ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６－２９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０－３２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３－３６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｈ－ＦＲ４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４が以下の群から選択されるアミノ酸配列のいずれかのセットを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ：
（１）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；
（２）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；
（３）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；および
（４）Ｈ－ＦＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、Ｈ－ＦＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０、Ｈ－ＦＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６およびＨ－ＦＲ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７。 - 前記抗体が重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、且つ前記ＶＨがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＨがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＬＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＬＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含み、且つ前記ＬＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＬＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０－１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３－１４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５－１６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が、以下の群から選択される、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のいずれかのセットを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ：
（１）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５；
（２）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６；
（３）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６；および
（４）ＬＣＤＲ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、ＬＣＤＲ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４およびＬＣＤＲ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６。 - 前記抗体が軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１を含み、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端が前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接または間接的に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ２を含み、前記Ｌ－ＦＲ２が前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ３を含み、前記Ｌ－ＦＲ３が前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３の間に位置し、且つ前記Ｌ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９～３０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端が前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に接続され、且つ前記Ｌ－ＦＲ４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記Ｌ－ＦＲ４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体が軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、且つ前記ＶＬがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＬがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５－９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １－４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記抗体がＶＨおよびＶＬを含み、且つ前記ＶＨおよびＶＬが以下の群から選択されるアミノ酸配列のいずれかのセットを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ：
（１）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；
（２）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；
（３）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；
（４）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；
（５）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；
（６）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３；
（７）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４；および
（８）ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４。 - 前記ＢＣＭＡ結合ドメインがｓｃＦｖを含み、且つ前記ｓｃＦｖが前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＨのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端が直接または間接的に接続される、請求項３９に記載のＣＡＲ。
- 前記ＶＬのＣ末端および前記ＶＬのＮ末端が直接または間接的に接続される、請求項３９～４０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖがＶＨおよびＶＬの間にリンカーペプチドを含み、且つ前記リンカーペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９－５６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 膜貫通ドメインを含み、且つ前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５からなる群より選択されるタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記膜貫通ドメインがＣＤ８に由来し、且つ前記膜貫通ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のＣＡＲ。
- 共刺激ドメインを含み、且つ前記共刺激ドメインが、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳからなる群より選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメインを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記共刺激ドメインがＣＤ１３７に由来し、且つ前記共刺激ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のＣＡＲ。
- 細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のＣＡＲ。
- ヒンジ領域を含み、且つ前記ヒンジ領域がＣＤ８に由来するヒンジ領域を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ヒンジ領域がＣＤ８に由来し、且つ前記ヒンジ領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載のＣＡＲ。
- シグナルペプチドを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記シグナルペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のＣＡＲ。
- Ｌ６－Ｌｉを含み、前記Ｌ６－Ｌｉが前記細胞内シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記Ｌ６－ＬｉがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のＣＡＲ。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４－７１および７４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 単離された核酸分子であって、
請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 - さらにプロモーター遺伝子を含み、前記プロモーター遺伝子が前記的ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の５’末端に位置する、請求項５８に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロモーター遺伝子が構成的プロモーターである、請求項５８～５９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
- 前記プロモーター遺伝子がＥＦ１αプロモーター遺伝子である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５－１０２および１０５のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする核酸分子。
- 請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターがプラスミド、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群より選択される、請求項６３に記載のベクター。
- 請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞から選択される、請求項６５に記載の細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞に請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクターを導入することを含む、免疫エフェクター細胞を製造する方法。
- 請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクター、および／または請求項６５～６６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクター、請求項６５～６６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、および／または請求項６８に記載の医薬組成物の、薬物の調製における使用、ここで、前記薬物はＢＣＭＡ発現に関連する疾患および／または障害を治療するために用いられる。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が癌または悪性腫瘍である、請求項６９に記載の使用。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害がＢＣＭＡ陽性腫瘍である、請求項６９～７０のいずれか一項に記載の使用。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の使用。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が骨髄腫である請求項６９～７２のいずれか一項に記載の使用。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が多発性骨髄腫である、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の使用。
- 必要とする被験者に請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクター、請求項６５～６６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、および／または請求項６８に記載の医薬組成物を使用することを含む、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害を治療する方法。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が癌または悪性腫瘍である、請求項７５に記載の方法。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害がＢＣＭＡ陽性腫瘍である、請求項７５～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が骨髄腫である、請求項７５～７８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が多発性骨髄腫である、請求項７５－７９のいずれか一項に記載の方法。
- ＢＣＭＡ発現に関連する疾患および／または障害の治療に用いられる、請求項１～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６３～６４のいずれか一項に記載のベクター、請求項６５～６６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、および／または請求項６８に記載の医薬組成物。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が癌または悪性腫瘍である、請求項８１に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞、および／または医薬組成物。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害がＢＣＭＡ陽性腫瘍である、請求項８１～８２のいずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞、および／または医薬組成物。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が充実性腫瘍および／または非充実性腫瘍である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞、および／または医薬組成物。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が骨髄腫である、請求項８１～８４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞、および／または医薬組成物。
- 前記ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害が多発性骨髄腫である、請求項８１～８５のいずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、免疫エフェクター細胞、および／または医薬組成物。
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