JP2024517654A - レチノイン酸受容体アルファと阻害剤との相互作用を安定化することによる、シャペロン媒介オートファジーを増加させる方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、レチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）とコリプレッサー核受容体コリプレッサー１（ＮＣｏＲ１）との相互作用を、ＲＡＲα－ＮＣｏＲ１相互作用を安定化させるのに十分な量のシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）アクチベーターとＲＡＲαを接触させることによって安定化する方法を提供する。ＲＡＲα／コリプレッサー相互作用を安定化することにより、神経変性障害を発症するリスクがある対象において神経変性障害を予防することができ、又は神経変性障害の初期症候若しくはバイオマーカーを有する対象において神経変性障害の進行を遅らせることができる。本開示はまた、網膜変性障害の初期症候又はバイオマーカーを有する対象における網膜変性障害の進行の予防又は遅延を維持する方法を提供する。神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）であり得る。網膜変性障害は網膜色素変性であり得る。【選択図】図３Ｆ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１７７，６７４号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

タンパク質恒常性の喪失は、複数の加齢性変性障害の基礎となる。シャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）活性は、タンパク質毒性に対する細胞防御に不可欠であるが、年齢と共に低下する。

タンパク質恒常性の維持は、正常な細胞機能及び絶えず変化する細胞外環境への適応に不可欠である。シャペロン及びタンパク質分解系は、タンパク質恒常性ネットワークの主要な構成要素である。加齢に伴い、これらのタンパク質恒常性経路のいくつかの機能が徐々に低下することが、高齢者を苦しめる変性状態の経過を加速させることが提唱されている。本発明者らは以前に、リソソームにおけるサイトゾルタンパク質の分解のための選択的機構であるシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）が、げっ歯類及びヒト由来のほとんどの組織において加齢に伴い減少することを示した。さらに、ＣＭＡは、パーキンソン病又はタウオパチーなどの神経変性疾患に蓄積する病原性タンパク質の毒性作用に対して脆弱である。これらの状態におけるＣＭＡの阻害は、罹患組織におけるタンパク質毒性にさらに寄与し、タンパク質恒常性不全を長引かせる。

加齢におけるＣＭＡ活性の低下は、主に、シャペロンＨｓｃ７０によってリソソームに送達される基質タンパク質の受容体であるリソソーム関連膜タンパク質タイプ２Ａ、ＬＡＭＰ２Ａ（Ｌ２Ａ）のレベルの低下に起因する。ＣＭＡの制限段階である受容体への基質の結合は、基質によって使用される多量体転座複合体へのＬ２Ａ集合を誘発し、分解のためにリソソーム内腔に到達させる。遺伝子操作（Ｌ２Ａ過剰発現）による老齢げっ歯類におけるＣＭＡの低下の防止は、器官機能の維持に有効であることが証明されている。遺伝的Ｌ２Ａアップレギュレーションはまた、パーキンソン病関連神経毒性のモデルにおいて保護的である。したがって、ＣＭＡ活性化は、その阻害が病原的役割を有する疾患において有益であり得る。ＣＭＡは、網膜におけるタンパク質恒常性維持にとって中心的であり、他のタイプのオートファジーが機能しなくなり始めるため加齢に伴うタンパク質毒性傷害に対する主要な防御となることが証明されている

以前の研究において、本発明者らは、ＣＭＡがレチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）を介したシグナル伝達の負の調節下にあることを同定し、このタイプのオートファジーに対するＲＡＲα媒介阻害を遮断することによってインビトロでＣＭＡをアップレギュレートすることができるファースト・イン・クラス小分子を開発した。ＲＡＲαの一般的な阻害剤及びアンタゴニストは、ＣＭＡの活性化にも有効であるが、ＲＡＲαがこの経路のアクチベーターであるため、マクロオートファジーなどの他の種類のオートファジーに悪影響を及ぼす。他の形態のオートファジーに影響を及ぼすことなくＣＭＡを選択的に活性化する小分子が必要とされている。本開示は、その必要性を満たし、さらなる利点を提供する。

本開示は、レチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）とコリプレッサー核受容体コリプレッサー１（ＮＣｏＲ１）との相互作用を安定化する方法であって、ＲＡＲαを、ＲＡＲα－ＮＣｏＲ１相互作用を安定化させるのに十分な量のシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）アクチベーターと接触させることを含む方法を提供する。

一実施形態では、本開示は、神経変性障害の初期症候又はバイオマーカーを有する対象における神経変性障害の進行を予防又は遅延させる方法であって、インビボでのＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを投与することを含む方法を提供する。

本開示はさらに、網膜変性障害の初期症候又はバイオマーカーを有する対象における網膜変性障害の進行の予防若しくは遅延を維持する方法であって、対象の網膜におけるＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することを含む方法を提供する。

本開示はまた、インビトロでのＲＡＲαとＮＣｏＲ１との間の相互作用を安定化させるのに十分な対象の網膜中のＣＭＡアクチベーターの濃度を達成するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することを含む、対象の網膜中のタンパク質恒常性を維持する方法を提供する。

本開示はさらに、加齢性の神経変性障害又は網膜変性障害の処置を必要とする対象の神経又は網膜中のＬａｍｐ ２Ａレベルを増加させる方法であって、対象の網膜又は神経におけるＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化させるのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＣＭＡアクチベーターは、ＲＡＲα内のＴｈｒ ２３３と水素結合することができるアクチベーターである。

ＣＭＡアクチベーターは、以下のＲＡＲα（ヒトコンセンサス配列）アミノ酸：Ｐｒｏ ４０７、Ｌｅｕ ４０９、Ｉｌｅ４１０、Ｐｒｏ４０８及びＩｌｅ ２３６の少なくとも１つと、並びに／又は以下のＲＡＲα（ヒトコンセンサス配列）アミノ酸：Ｌｅｕ ２６６、Ｉｌｅ２７０、Ｐｈｅ３０２、及びＬｅｕ３０５の少なくとも１つと、疎水性相互作用することができるアクチベーターであることもできる。

ＣＡ３９及びＣＡ７７は、用量依存的様式でＣＭＡを活性化する。不活性ＲＡＲαの結合ポケットにおけるＣＡ３９（左）及びＣＡ７７（右）の分子ドッキング。 リボンにおける不活性ＲＡＲαの結合ポックにおけるＡＲ７の結合ポーズの詳細図であり、ＲＡＲα相互作用残基を棒で強調している。ＡＲ７は、ヘリックスｈ３、ｈ１０及びｈ１２によって形成される不活性なＲＡＲαに存在する疎水性ポケットを占める。 ＣＡ３９及びＣＡ７７との予測されたＲＡＲαアミノ酸相互作用。 漸増濃度のＣＡ３９及びＣＡ７７を１２時間（左）又は２４時間（右）添加後の、ＫＦＥＲＱ－ＰＳ－Ｄｅｎｄｒａを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＣＭＡ活性の定量。４回の独立した実験においてｎ＞２，５００個の細胞。 漸増濃度の化合物を１２時間、２４時間及び培地からそれらを洗浄（ｗ）後１２時間添加後の、同じ細胞におけるＣＭＡ活性の定量。３回の独立した実験においてｎ＞１，５００個の細胞。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置Ａｎｏｖａ（Ｄ，Ｅ）、引き続いてボンフェローニスの多重比較事後検定を使用した。未処理サンプルとの有意差をｅに示し、異なるインキュベーションプロトコルの間をｆに示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意差なし。 マクロオートファジー活性に対するＣＡ３９及びＣＡ７７の効果の欠如。長い半減期の細胞内タンパク質のタンパク質分解を、ＮＩＨ３Ｔ３の方法の下で記載されるように３Ｈ－ロイシンによる４８時間の代謝標識の際に添加なし（なし）で測定し、又は１０μＭのＣＡ３９若しくはＣＡ７７の存在下で指示された時間培養した。ｎ＝３の独立した実験（三連ウェルを使用）。 ２０μＭのＣＡ３９又はＣＡ７７と１６時間インキュベートしたＮＩＨ３Ｔ３中のＬＣ３の免疫ブロット。示される場合、リソソームプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を実験終了の６時間前にインキュベーション培地に添加した。代表的な免疫ブロット（左）及び未処理（なし）細胞（右）と比較したＬＣ３－ＩＩの分解速度（フラックス）の定量化。ｎ＝４の独立した実験。 ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ－ＬＣ３レポーターを安定に発現し、漸増濃度のＣＡ３９、ＣＡ７７又はマクロオートファジーアクチベーターラパマイシンで１６時間処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるマクロオートファジー活性の定量。ｍＣｈｅｒｒｙ^＋斑点（オートファジー空胞、ＡＶ）、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＧＦＰ^＋斑点（オートファゴソーム、ＡＰＧ）及びｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＧＦＰ^－斑点（オートリソソーム、ＡＵＴ）の量の定量化。３つの異なる実験においてｎ＞１，１００。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置Ａｎｏｖａ（図２Ｂ）又は二元配置Ａｎｏｖａ（図２Ａ、図２Ｃ）、引き続いてボンフェローニスの多重比較事後検定を使用した。未処理サンプルとの有意差をＡ、Ｃに示し、凡例の薬物をＡに示す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意差なし。 ＣＡ化合物は、ＲＡＲαとＮＣｏＲ１との相互作用を促進することによって別個の転写効果を誘導する。（上）ＣＭＡネットワークの示された構成要素の発現におけるＡＲ７誘導性変化。（下）スキームはＣＭＡネットワークを示しており、変化する構成要素が太字で強調されている。値を未処理細胞と比較して表す。ｎ＝３の異なる実験（Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．（２０１９）１８：ｅ３０００３０１から改変）。値を未処理細胞と比較して表す。ｎ＝３の異なる実験。 ＣＬＥＡＲネットワークの示された構成要素の発現のＡＲ７誘導性変化（マクロオートファジー及びリソソームの例を示す）。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。１つのサンプルｔ及びウィルコクソン検定を図３Ａで使用した。 示された化合物で処理した細胞における発現の有意な（ｐ＜０．０１）変化を示す追加の遺伝子のベン図。 ＣＡ３９及びＣＡ７７の分子ドッキングは、ＮＣｏＲ１ペプチドに結合したＲＡＲαの不活性（左）な立体配座内で適合性である。ＲＡＲα活性な立体配座を比較のために示す。ＡＴＲＡは活性な立体配座にのみ結合する。ＣＡ３９（オレンジ色）及びＣＡ７７の仮定の結合ポーズは、立体衝突（黒色破線円）のためにＲＡＲαの活性な立体配座内で適合せず、明瞭化のためにのみ示されている。 添加なし（リガンドなし）又は１０μＭのＢＭＳ６１４、ＣＡ３９及びＣＡ７７の存在下でインキュベートしたＲＡＲα及びＮＣｏＲ１ペプチドを用いた蛍光偏光アッセイにおけるＥＣ５０（μＭ）。 添加なしで、又はＣＡ３９（１０μＭ）若しくはビオチン－ＣＡ（１０μＭ）の存在下で２４時間インキュベートしたＮＩＨ３Ｔ３のストレプトアビジンプルダウン（上）又は全細胞溶解物（下）のＮＣｏＲ１及びＲＡＲαの免疫ブロット。ＩＰ：免疫沈降。この実験を３回繰り返した。 添加なし（なし）、又は２０μＭのＣＡ３９若しくはＣＡ７７の存在下で２４時間インキュベートした、ＮＩＨ３Ｔ３細胞対照（レンチウイルス空ベクターで形質導入）又はＮＣｏＲ１のノックダウン（ＫＤ）（ｓｈＲＮＡを有するレンチウイルスで形質導入）におけるＣＭＡ活性。左：代表画像。核がＤＡＰＩで強調されている。挿入は、より高い倍率を示す。右：細胞あたりの斑点の数の定量化。３つの異なる実験においてｎ＞２，５００。挿入は、対照及びＫＤ細胞におけるＮＣｏＲ１の免疫ブロットを示す。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。１つのサンプルｔ及びウィルコクソン検定を図３Ａ及び図３Ｃで使用し、二元配置Ａｎｏｖａ、引き続いてボンフェローニスの多重比較事後検定を図３Ｇで使用した。図３Ｇにおけるスタートは、未処理との有意差を示す。遺伝子型効果を挿入に示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。 ＣＡ化合物によって誘導される転写変化。ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７での処置時に有意に（ｐ＜０．０１）アップレギュレート又はダウンレギュレートされた遺伝子の画分。 ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７での処置時に発現が改変された転写物のタイプ。 遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７での処置時に有意に変化した。下は、ノード拡大によって添加されたタンパク質を含む、遺伝子セット濃縮及びノード拡大分析（ＳＴＲＩＮＧデータベースを使用）による、それらのクラスタリングを示す。 ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７での処理時に発現が変化した１１個のタンパク質に割り当てられたノードの機能群。 ＣＡ化合物のインビトロ及びインシリコＡＤＭＥ。ＣＡ３９及びＣＡ７７のインビトロ溶解度、（示された種からの肝ミクロソームにおける）代謝安定性、及び透過性評価。実験条件についての方法を参照されたい。化合物の性質及び研究を盲検化した観察者によって、特性に関するコメントを追加した。 ＣＡ３９のインシリコＱｉｋＰｒｏｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）分析及びＡＤＭＥ予測。 ＣＡ７７のインシリコＱｉｋＰｒｏｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）分析及びＡＤＭＥ予測。 ＣＡ化合物は、インビボで複数の組織においてＣＭＡを活性化する。マウスにおけるｐ．ｏ．（経口、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）及びｉ．ｖ．（静脈内、１ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）投与後の血漿中の示された時間におけるＣＡ３９及びＣＡ７７のレベル。ｎ＝３匹のマウス／時点。 マウスにおけるｐ．ｏ．（経口、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）及びｉ．ｖ．（静脈内、１ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）投与後の脳中の示された時間におけるＣＡ３９及びＣＡ７７のレベル。ｎ＝３匹のマウス／時点。 （３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）ＣＡ３９を３日間連続して毎日ｉ．ｐ．注射したＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス由来の血液から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞における直接蛍光。核はＤａｐｉによって青色で強調されている。右：高倍率画像。矢印：斑点。 細胞あたりＣＭＡ斑点＞３を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（ＣＭＡ＋）。条件当たりｎ＝５匹のマウス。 ＣＡ３９及びＣＡ７７（１０μＭ）の存在下で２４時間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＬＡＭＰ－２Ａ（Ｌ２Ａ）のｍＲＮＡレベル。ハウスキーピング遺伝子アクチンによる正規化後の無処理細胞（なし）に対する値を表す。２つの独立した実験からの生物学的三連。 図６Ｃと同様にＣＡ３９及びＣＡ７７をｉ．ｐ．注射したＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス由来の肝臓の代表的な画像。核はＤａｐｉによって青色で強調されている。挿入：切片のより高い倍率。矢印：斑点。 肝臓における細胞あたりの斑点の平均数の定量化。ｎ＝４匹の異なるマウス由来の１２切片。 図６Ｃと同様にＣＡ３９及びＣＡ７７をｉ．ｐ．注射したＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス由来の中脳の代表的な画像。核はＤａｐｉによって青色で強調されている。挿入：ＭＡＰＫ２と共染色した切片のより高い倍率。矢印：斑点。 図６Ｈと同じ脳領域におけるＬＡＭＰ－２Ａ（Ｌ２Ａ）のｍＲＮＡレベル。ｎ＝４匹のマウス／条件。 図６Ｃと同様に処置したＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス由来の平坦に取り付けられた網膜の代表的な画像である。核がＤＡＰＩで強調されている。下：より高い倍率の箱形領域。挿入：より高い倍率画像。右：細胞あたりのＤｅｎｄｒａ^＋斑点の数の定量。ｎ＝２つの独立した実験からの１４視野。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置Ａｎｏｖａと引き続いてＳｉｄａｋの多重比較事後検定を図６Ａ、Ｂで使用し、対応のない両側ｔ検定を図６Ｄ及び図６Ｇで使用し、１つのサンプルｔ及びウィルコクソン検定を６Ｅで使用し、一元配置Ａｎｏｖａと引き続いてボンフェローニの多重比較事後検定を図６Ｉ及び図６Ｋで使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。 網膜における細胞あたりの斑点の平均数の定量化。ｎ＝４匹の異なるマウス由来の１２切片。 ＣＡ化合物は、良好な血液脳関門透過性及び薬物動態を有する。マウスにおけるｐ．ｏ．（経口、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）及びｉ．ｖ．（静脈内、１ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）投与後の血漿におけるＣＡ３９及びＣＡ７７の薬物動態（ＰＫ）パラメータ。 マウスにおけるｐ．ｏ．（経口、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）及びｉ．ｖ．（静脈内、１ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）投与後の脳におけるＣＡ３９及びＣＡ７７の薬物動態（ＰＫ）パラメータ。 図７Ａと同様のｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．による投与後の示された時間におけるＣＡ３９及びＣＡ７７の脳対血漿（Ｂ／Ｐ）比。ｎ＝３匹のマウス／時点。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置Ａｎｏｖａとそれに続くＳｉｄａｋの多重比較事後検定を図７Ｃで使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。 インビボでのＣＡ化合物の毒性評価。ビヒクル（Ｖｅｈ）又はＣＡ７７構造類似体（ＣＡ７７ｄ）の５ヶ月間の毎日の経口投与の終了時のマウス血球数。値は、各群ｎ＝６匹のマウスの平均値＋ｓ．ｅ．ｍ．である。 同じマウス由来のＨ＆Ｅ染色された肝臓切片の代表的な画像。ｎ＝５匹のマウス、全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。 同じマウス由来のＨ＆Ｅ染色された腎臓切片の代表的な画像。ｎ＝５匹のマウス、全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。 同じマウス由来のＨ＆Ｅ染色された肺切片の代表的な画像。ｎ＝５匹のマウス、全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置Ａｎｏｖａとそれに続くボンフェローニの多重比較事後検定及び対応のないｔ検定の両方をＡに適用したところ、ビヒクル処置マウスとＣＡ処置マウスとの間に統計的差異は認められなかった。 ３つの器官における同定された特徴の病理学的スコアリング。 ３つの器官における同定された特徴の病理学的スコアリング。 ３つの器官における同定された特徴の病理学的スコアリング。臨床関連（ＣＲ）値を参照として示す。器官ごとの個々の特徴のヒートマップ（図８Ｅ）、各器官の全ての特徴の平均スコアリング（図８Ｆ）又は動物ごとの組織学的特徴の平均（図８Ｇ）を示す。群あたりｎ＝３匹のマウス。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置Ａｎｏｖａ（図８Ｆ）又は一元配置Ａｎｏｖａ（図８Ｇ）、引き続いてテューキーの多重比較事後分析を使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意差なし。 ＣＡ化合物は、細胞及び組織において細胞保護性である。示された化合物２μＭ（左）又は１０μＭ（右）で１２時間処理した後の、示された濃度のパラコート（ＰＱ）に曝露したＮＩＨ３Ｔ３の細胞生存率。ＰＱ単独（なし）又は化合物の存在下での処理は１２時間続いた。ｎ＝３の独立した実験。 示された濃度のパラコート（ＰＱ）及び２μＭ（左）又は１０μＭ（右）の示された化合物に１２時間同時に曝露したＮＩＨ３Ｔ３の細胞生存率。ｎ＝３の独立した実験。 添加なし（右眼；ビヒクル）又はＣＡ７７の存在下（左眼）で２４時間維持したｒｄ１０マウス由来の全マウント網膜における桿体及び錐体の示されたマーカーの免疫染色。右：各動物の左右の眼由来の網膜における桿体アレスチンについて染色された平均面積（左）又は視野あたりのオプシン陽性数（右）の定量化。ｎ＝８匹のマウス（３つの独立した実験からの代表的な実験）。全ての値は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。Ａ及びＢでは、ホット試験後の二元配置Ａｎｏｖａ、引き続いてボンフェローニスの多重比較事後検定を使用した。処理間の有意差が凡例に示され、所与のＰＱ濃度についての処理間の特異的差が図に示されている。９Ｃにおける３つの独立した実験からのデータを＾０．２５及び＾０．７５変換して、それぞれアレスチン面積又はオプシン数に対するビヒクル及びＣＡ７７の効果を比較し、続いて対応のある両側ｔ検定を行った。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。 ＣＡ化合物はｒｄ１０網膜変性を防止する。ビヒクルのみ又は４０ｍｇ／ｋｇ ｂｗのＣＡ７７の毎日のｉ．ｐ．注射でＰ１８からＰ２５まで処置したｒｄ１０マウスの網膜における外顆粒層（ＯＮＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の厚さの比。３つの独立した実験から、ｎ＝８（ビヒクル）及び９（ＣＡ処置）。 Ａと同様に処理したｒｄ１０の側頭中央網膜の桿体（トランスデュシン）及び錐体（オプシン）マーカー。核がＤＡＰＩで強調されている。 Ｂで使用されるマーカーを用いて網膜全体で測定された外側セグメント（ＯＳ）長の定量化。ｎ＝４つの領域／動物、４匹のマウス／条件。 同じ動物におけるｒｈｏのｍＲＮＡレベル。ｎ＝１０。 同じ網膜におけるＧＦＡＰについての免疫染色の代表的な画像。ｎ＝４。 Ａと同様に処置したマウスの網膜における示されたタンパク質の免疫ブロット。４匹の異なるマウスを示す。右：ｎ＝４の異なるマウスにおけるＬ２Ａのデンシトメトリー定量。値は任意の単位で表される。 Ａと同様にビヒクル又はＣＡ７７を投与したｒｄ１０マウスのＰ３３における網膜電図パラメータ。示した波の振幅をプロットした。個々の値及び平均＋ｓ．ｅ．ｍ．を示す。二元配置Ａｎｏｖａ、引き続いてボンフェローニの多重比較事後検定をＡで使用し、対応のない両側ｔ検定を他の全てで使用した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。 実験マウスモデル及び網膜色素変性患者においてＮＣｏＲ１発現が低下している。示されている出生後（Ｐ）日の野生型（ＷＴ）マウス及びｒｄ１０マウス由来の網膜におけるＮＣｏＲ１のタンパク質レベル。２２からのデータ。値はＺスコアで表す。遺伝子型及び時間あたりｎ＝４匹のマウス。 ＷＴ型マウス（２匹）及びｒｄ１０マウス（３匹）の網膜におけるＮＣｏＲ１についての免疫ブロット。ポンソー染色をローディング対照として示す。 ｐ２５での野生型（ＷＴ）マウス及びｒｄ１０マウス由来の全マウント網膜におけるＮＣｏＲ１の免疫染色。核がＤＡＰＩで強調されている。マージされたＤａｐｉ及びＮＣｏＲ１画像（上）又はＮＣｏＲ１画像のみ（下）。下：内顆粒層（ＩＮＬ）（上）及び神経節細胞層（ＧＣＬ）（下）におけるＮＣｏＲ１レベルの差を示すための四角で囲まれた領域の高倍率画像。 ビヒクルのみ又は４０ｍｇ／ｋｇ ｂｗのＣＡ７７の毎日のｉ．ｐ．注射でＰ１８からＰ２５まで処置したＷＴ及びｒｄ１０マウスにおけるＮＣｏＲ１ ｍＲＮＡレベル。値は、ＷＴビヒクルの倍数として表される。ｎ＝４（ＷＴ）及び７（ｒｄ１０）マウス。 オルガノイド分化の示された日（図１１Ｄ）における健常（対照）及びＰＤＥ６Ｂ変異を有する網膜色素変性患者（ＲＰ）からの網膜オルガノイドにおけるＣＭＡ転写ネットワークの示された遺伝子の発現のヒートマップ。患者サンプルの場合、Ｄ９０～Ｄ１８０は、中期疾患の特徴及び後期疾患のＤ２３０を示す。ＣＭＡ指数を下に示す。Ｇａｏ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．（２０２０）８：１２８からのデータ。 ｅと同じサンプルにおけるＣＭＡ活性化指数。 ｅと同じサンプルにおけるＮＣｏＲ１対ＲＡＲα ｍＲＮＡレベルの比。ＲＮＡを、２つの独立した分化から３～５個のオルガノイドから単離した。 Ｄ１８０での健常（対照）及びＲＰ２に変異を有する網膜色素変性患者（ＲＰ）由来の網膜オルガノイドにおけるＮＣｏＲ１（左）、ＲＡＲα（中央）及びＮＣｏＲ１対ＲＡＲα比のｍＲＮＡレベル。Ｌａｎｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０２０）１５：６７－７９からのデータ、診断あたりｎ＝３個体。二元配置Ａｎｏｖａを１１Ａで使用し、一元配置Ａｎｏｖａとテューキーの多重比較事後検定を１１Ｄで使用し、対応のあるｔ検定を１１Ｈで使用した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。

本発明を詳細に説明する前に、本開示で使用される特定の用語の定義を提供することが有用であり得る。化合物は、標準的な命名法を使用して記載される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。文脈によって明らかに禁忌でない限り、各化合物名は、化合物の遊離酸又は遊離塩基形態並びに化合物の全ての薬学的に許容され得る塩を含む。

「ａ」及び「ａｎ」という用語は、量の限定を示すものではなく、むしろ参照される項目の少なくとも１つの存在を示す。「又は」という用語は、「及び／又は」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンド移行句は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という中間移行句及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」というクローズドエンド句を包含する。これらの３つの移行句のうちの１つ、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」若しくは「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの代替の移行句を記載する請求項は、文脈又は技術によって明確に除外されない限り、任意の他の移行句で書くことができる。値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図しているにすぎず、各別個の値は、あたかもそれが本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。全ての範囲の端点は、範囲内に含まれ、独立して組み合わせることができる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。ありとあらゆる例又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、特許請求されていない要素を本明細書で使用される本発明の実施に不可欠なものとして示すと解釈されるべきではない。他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

「医薬組成物」は、ＣＭＡアクチベーターの化合物又は塩などの少なくとも１つの活性剤と、担体などの少なくとも１つの他の物質とを含む組成物である。医薬組成物は、場合により１つ又は複数の追加の活性剤を含有する。特定される場合、医薬組成物は、ヒト又は非ヒト薬物についての米国ＦＤＡのＧＭＰ（優良製造規範）基準を満たす。

レチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）と核受容体コリプレッサー１（ＮＣｏＲ１）などのコリプレッサーとの相互作用の安定化は、ＲＡＲα／コンプレッサー（ｃｏｍｐｒｅｓｓｏｒ）相互作用の安定性の増加を決定するのに適した任意の試験によって決定することができる。例えば、ＣＭＡアクチベーターの存在下におけるＲＡＲαとコリプレッサーとの共免疫沈降を、ＣＭＡアクチベーターの非存在下におけるＲＡＲαとコリプレッサーとの共免疫沈降よりも増加させることは、ＲＡＲαとコリプレッサーとの相互作用が安定化されることを示し得る。ＣＭＡ活性化に関連する遺伝子の発現の増加はまた、ＲＡＲα／コリプレッサー相互作用の安定化を示す。

「ＣＭＡ遺伝子発現をアップレギュレートする」とは、ＣＭＡに関連する１つ又は複数の遺伝子の発現が増加することを意味する。例えば、ＣＭＡに関連する少なくとも１つのエフェクター又はアクチベーター遺伝子の発現が増加する。ＣＭＡ遺伝子発現は、ＣＭＡアクチベーターの投与前のＣＭＡ遺伝子発現と比較して、ＣＭＡアクチベーターを投与された対象においてアップレギュレートされ得る。ＣＭＡ遺伝子発現をアップレギュレートすることは、ＬＡＭＰ２Ａ、ＨＳＣ７０、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ４０、ＥＥＦ１Ａ１、ＰＨＬＰＰ１、及びＲＡＣ１から選択される少なくとも１つのエフェクター遺伝子の遺伝子発現が、ＣＭＡアクチベーターの投与前の患者におけるエフェクター遺伝子の発現と比較してＣＭＡアクチベーターを投与された対象において増加すること、又はＮＦＡＴＣ１、ＮＣＯＲ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＲ－２、ＲＡＲα、及びＲａｂ１１から選択される少なくとも１つのアクチベーター遺伝子の発現レベルが、ＣＭＡアクチベーターの投与前の患者におけるアクチベーター遺伝子の発現と比較して対象において増加することを意味し得る。

本発明者らは、ＣＭＡの選択的活性化のための固有の機構を同定した。本発明者らは、ＣＭＡアクチベーター（ＣＡ）がレチノイン酸受容体アルファ（ＣＭＡの既知の内因性阻害剤）とそのコリプレッサーＮＣｏＲ１との間の相互作用を安定化し、選択的ＣＭＡ活性化をもたらすＲＡＲα転写プログラムの個別のサブセットの変化をもたらすことを見出した。ＣＡ分子は、インビボでＣＭＡを活性化し、網膜色素変性マウスモデルにおいて網膜変性を改善する。本開示は、網膜変性を予防又は処置する方法を含む。本発明者らの知見は、ＣＭＡ活性化の薬理学的標的化の機構を明らかにし、網膜変性及び他の加齢性変性過程を処置及び／又は予防する方法を提供する。

いかなる特定の機構にも拘束されることを望むものではないが、比較構造分析及び分子動力学は、ＣＭＡ選択性が、これらの新規な小分子がＲＡＲαリガンド結合ドメインのＨ１２立体配座に結合し、これを安定化し、これを開き、それによって、コリプレッサーの動員を促進することの優先性と関連し得ることを示唆した。小分子は、一般にカルボキシル基を使用してＲＡＲαリガンド結合ドメインとの静電相互作用を形成する他のＲＡＲαアンタゴニスト及びアゴニストと比較して、非標準的な結合様式を使用すると予測される。

新規ＣＭＡアクチベーターは、末梢及び中枢神経系標的化に有利な良好な生体内分布及び薬物動態特性を示す。これらの化合物は、ＲＡＲαとそのコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化する。ＣＭＡアクチベーターのこの新規な作用機構は、ＲＡＲα転写プログラムの個別のサブセットのみの選択的調節をもたらし、したがってＣＭＡに対する選択性を付与する。本発明者らは、化合物が顕著な毒性なしにインビボでＣＭＡを効率的に活性化するという証拠を提供する。本発明者らはまた、新規ＣＭＡアクチベーターの全身又は局所のいずれか、例えば硝子体内注射のインビボ投与が、失明をもたらす不治状態である網膜色素変性症に臨床的に関連する網膜変性の実験的マウスモデルにおいて網膜変性を効率的に減少させ、視覚機能を保つことを実証する。この研究は、網膜変性状況におけるＣＭＡ調節の転写機構を薬理学的に標的とするための概念実証を提供する。

現在、アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害の診断は、精神的な衰えを特定することに依存しており、その時点で著しい脳損傷が行われている。同様に、パーキンソン病（ＰＤ）は、震え若しくは振戦、動きの鈍化（運動緩慢）、腕及び脚の凝り若しくは硬直、並びに／又はバランスの問題（姿勢不安定性）などの症候によって識別される。ＰＤは、症候が経時的に悪化する進行性疾患である。本明細書に記載の方法は、対象が無症候性であるか、又は加齢性神経変性疾患の初期症候段階にある場合に、必要とする対象において加齢性神経変性疾患の進行を予防又は遅延させることを提供する。早期介入は、症候の進行を予防し、後期加齢性神経変性障害への進行を遅延させるのに役立ち得る。

一態様では、必要とする対象において加齢性神経変性障害の進行を予防又は遅延させる方法は、対象における神経変性障害の初期症候又はバイオマーカーを同定することと、治療有効量のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することとを含む。一態様では、対象は、無症候性であるか、又は加齢性神経変性障害の初期症候段階にある。

ＣＭＡアクチベーターを投与することにより、対象におけるβアミロイド及び／又はタウ病理の進行を減少させることができ、及び／又は対象における既存のβアミロイド及び／又はタウ病理を減少させることができる。本明細書に記載される実験の前に、ＣＭＡ調節がβアミロイド及び／又はタウ病理に影響を及ぼすことは予想されなかった。本方法は場合により、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び／又は磁気共鳴（ＭＲ）画像法によってβアミロイド及び／又はタウ病理の進行を決定することをさらに含む。２－（４－Ｎ－［^１１Ｃ］メチルアミノフェニル）－６－ヒドロキシベンゾチアゾールとしても知られる^１１Ｃ標識ピッツバーグ化合物－Ｂ（［^１１Ｃ］ＰｉＢ）、^１８Ｆ－ＡＶ－４５又は４－｛（Ｅ）－２－［６－（２－｛２－［２－（１８Ｆ）フルオロエトキシ］エトキシ｝エトキシ）－３－ピリジニル］ビニル｝－Ｎ－メチルアニリンとしても知られる［^１８Ｆ］フロルベタピル（［^１８Ｆ］ＦＢＰ）、［^１８Ｆ］フロルベタベン（［^１８Ｆ］ＦＢＢ）、及び［^１８Ｆ］フルテメタモール（［^１８Ｆ］ＦＭＴ）は、βアミロイド｛ＥＴイメージングのための放射性トレーサである。ＰＥＴリガンド［^１８Ｆ］ＡＶ－１４５１はタウ陽性封入体に結合する。対象の血漿又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタウタンパク質（総タウ又はリン酸化タウ）又はβアミロイド（例えば、Ａβ４２）のレベルを使用して、βアミロイド及び／又はタウ病理の進行を判定することもできる。

医薬製剤
本明細書に開示される化合物は、ニート化学物質として投与することができるが、好ましくは医薬組成物として投与される。したがって、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体と共に、ＣＭＡアクチベーターの化合物又は薬学的に許容され得る塩を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、単位剤形中に約０．１ｍｇ～約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ～約８００ｍｇ、又は約２００ｍｇ～約６００ｍｇのＣＭＡアクチベーターの化合物と、場合により約０．１ｍｇ～約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ～約８００ｍｇ、又は約２００ｍｇ～約６００ｍｇの追加の活性剤とを含有する剤形である。

本明細書中に開示される化合物は、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入又はスプレーによって、舌下に、経皮的に、頬側投与によって、直腸に、点眼液として、硝子体内注射によって、又は他の手段によって、従来の薬学的に許容され得る担体を含有する投与単位製剤で投与され得る。医薬組成物は、任意の薬学的に有用な形態として、例えば、エアロゾル、クリーム、ゲル、丸薬、カプセル、錠剤、シロップ、経皮パッチ、又は局所若しくは硝子体内注射用の点眼液として製剤化され得る。錠剤及びカプセルなどのいくつかの剤形は、適切な量の活性成分、例えば所望の目的を達成するための有効量を含有する適切なサイズの単位用量に細分される。

担体は、賦形剤及び希釈剤を含み、処置される患者への投与に適したものにするために十分に高い純度及び十分に低い毒性のものでなければならない。担体は不活性であってもよく、又はそれ自体の医薬上の利点を有してもよい。化合物と共に使用される担体の量は、化合物の単位用量あたりの投与のための実用的な量の材料を提供するのに十分である。

担体のクラスとしては、結合剤、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、香味料、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、錠剤化剤及び湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの担体は、２つ以上のクラスに列挙されてもよく、例えば、植物油は、いくつかの製剤では潤滑剤として、他の製剤では希釈剤として使用されてもよい。例示的な薬学的に許容され得る担体としては、糖、デンプン、セルロース、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン；タルク、及び植物油が挙げられる。本開示の化合物の活性を実質的に妨害しない任意の活性剤を医薬組成物に含めてもよい。

医薬組成物／組み合わせは、経口投与用に製剤化することができる。これらの組成物は、０．１～９９重量％（ｗｔ．％）のＣＭＡアクチベーター、通常少なくとも約５ｗｔ．％のＣＭＡアクチベーターを含有する。いくつかの実施形態は、約２５ｗｔ．％～約５０ｗｔ．％又は約５ｗｔ．％～約７５ｗｔ．％の、式の化合物を含有する。

処置方法
本開示はまた、必要とする対象においてシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）を選択的に活性化する方法であって、対象においてＣＭＡを活性化するのに有効な量のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することを含む方法を提供する。

対象は、例えば、タウオパチー（前頭側頭型認知症、アルツハイマー病）、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜変性（乾性又は湿性黄斑変性、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、緑内障、レーバー先天性黒内障）、糖尿病、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪症、アルコール性脂肪肝、腎不全及び慢性腎疾患、気腫、散発性封入体筋炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、線維症（肝臓、腎臓又は肺）、リソソーム蓄積症、心血管疾患、及び免疫老化などの神経変性疾患を有し得る。リソソーム蓄積障害には、シスチン症、ガラクトシアリトーシス及びムコリピトーシスが含まれるが、これらに限定されない。対象はまた、癌又はループスなどのＣＭＡがアップレギュレートされる疾患又は状態を有し得る。対象は、化合物を投与する前に、正常な対象と比較してＣＭＡが減少している可能性がある。好ましくは、化合物はマクロオートファジー又は他のオートファジー経路に影響を及ぼさない。マクロオートファジーでは、タンパク質及び細胞小器官が二重膜小胞に隔離され、分解のためにリソソームに送達される。ＣＭＡでは、タンパク質基質が選択的に同定され、サイトゾルシャペロンとの相互作用を介してリソソームに標的化され、転座複合体を介してリソソーム膜を通過する。

本開示はまた、酸化ストレス、低酸素、タンパク質毒性、遺伝毒性傷害又は損傷及び／又は脂肪毒性から細胞を保護するのに有効な量で、本明細書に開示される化合物のいずれか又はＣＭＡアクチベーターの組み合わせを対象に投与することを含む、必要とする対象において酸化ストレス、低酸素、タンパク質毒性、遺伝毒性傷害又は損傷及び／又は脂肪毒性から細胞を保護する方法を提供する。対象は、例えば、酸化ストレス及び酸化の増加並びにタンパク質毒性の傾向の背景に関連している慢性状態の１つ又は複数を有し得る。保護される細胞は、例えば、心臓細胞、腎臓及び肝臓細胞、神経及びグリア、筋細胞、線維芽細胞及び／又は免疫細胞を含み得る。化合物は、例えば、シャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）を選択的に活性化することができる。一実施形態では、化合物はマクロオートファジーに影響を及ぼさない。

特定の態様では、対象は軽度認知障害に罹患している。本明細書で使用される場合、軽度認知障害は、加齢による予想される認知低下と認知症のより深刻な低下との間の段階である。物忘れ、思考がまとまらない、又は会話についていけない、判断が難しい、慣れ親しんだ環境で迷子になる、及び判断力が乏しいことは、軽度認知障害の徴候であり得る。軽度認知障害は、アルツハイマー病又は他の形態の認知症に進行し得る。

例示的な加齢性神経変性疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、進行性皮質下グリオーシスなどが挙げられる。

加齢性神経変性疾患がＡＤである場合、本明細書に記載の方法の対象は認知症に罹患していなくてもよい。ＡＤの例示的な初期症候としては、記憶喪失及び／又は混乱、集中困難、毎日の作業の完了困難、時間及び／又は場所の混乱、視覚画像及び／又は空間的関係の困難、会話困難、物体の置き間違え、判断力の低下、活動からの離脱、気分及び人格の変化が挙げられる。ＡＤの例示的なバイオマーカーは、対象の血漿又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタウタンパク質（総タウ又はリン酸化タウ）又はβアミロイド（例えば、Ａβ４２）である。

レビー小体型認知症では、認知、記憶、及び運動に関与する脳の領域の神経細胞にレビー小体と呼ばれるタンパク質沈着物が発生する。レビー小体型認知症の初期症候としては、小さな喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ）、夢を見ているときに行動する、幻覚、混乱、注意力の維持困難、記憶喪失、筆跡の変化、筋硬直、転倒及び眠気が挙げられる。現在、レビー小体型認知症について検証されたバイオマーカーはない。

ＰＤは、運動に影響を及ぼす進行性神経系障害である。ＰＤの例示的な初期症候としては、指、親指、手又は顎のわずかな振戦；小さい筆跡（小字症とも呼ばれる）；匂いの喪失；睡眠中の突然の動きを含む睡眠困難；移動又は歩行の困難性；便秘；柔らかい又は低い音声；顔マスキング；眩暈又は意識消失；及び／又は立ったままで前屈み、体を傾ける、又はたるませることが挙げられる。現在、ＰＤについて検証された臨床バイオマーカーはない。

ハンチントン病は、脳内の神経細胞の進行性変性を引き起こす遺伝的障害である。ハンチントン病の初期症候としては、集中困難、記憶喪失、うつ病、ぎこちなさ、小さな不随意運動及び気分変動が挙げられる。変異ハンチントンタンパク質（ｍＨｔｔ）は、ハンチントン病のバイオメーカーである。ハンチントン変異を有する対象は、本明細書中に記載される方法によって処置され得る。

ＡＬＳは、自発運動の制御に関与する神経細胞が関与する稀な進行性疾患である。ＡＬＳの初期症候としては、腕、脚、肩又は舌における筋単収縮；筋痙攣；硬直した筋肉；腕、脚、首又は横隔膜の筋力低下；不明瞭な鼻声；咀嚼又は嚥下の困難が挙げられる。現在、ＡＬＳのための検証されたバイオマーカーは存在しない。

ＦＴＤは、ピック病と呼ばれることもあり、脳の前葉及び側頭葉の神経細胞が失われる神経障害の群である。ＦＴＤの初期症候としては、人格及び行動の変化並びに／又は言語障害が挙げられる。臨床的に、ＦＴＤとＡＤとを区別することは困難である。

脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）は、小脳がゆっくりと変性する進行性障害であり、しばしば脳幹及び中枢神経系の他の部分の変性変化を伴う。ＳＣＡの初期症候は、協調及びバランスの問題、発話及び嚥下の困難、筋硬直、眼球運動を制御する筋肉の衰弱、及び認知障害である。ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７及びＳＣＡ１７は、伸長したポリグルタミン域をコードするＣＡＧトリヌクレオチド反復伸長の同じ病原性機構を共有する。ＳＣＡの血清バイオマーカーはない。

本開示はまた、神経変性障害のリスクがある対象を処置する方法を提供する。神経発生障害のリスクがある対象は、障害の有病率よりも神経変性障害を発症する確率が有意に高く、障害を発症する確率が示される。例えば、１０００人に１人が障害を発症する場合、障害を発症する確率は０．１％である。障害を発症する危険因子を有する対象は、障害を発症する確率が０．１％を超えるであろう。リスク因子には、神経変性障害の発症に関連することが知られている遺伝子変異を有するなどの遺伝的リスク因子、環境リスク因子、及び生活様式リスク因子が含まれ得る。

一実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、医学的処置を受けているヒト患者である。対象はまた、コンパニオン、例えばコンパニオン動物、例えばネコ及びイヌ、又は家畜動物などの非ヒト哺乳動物であってもよい。

診断又は研究用途のために、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、及び近交系ブタなどのブタを含む多種多様な哺乳動物が適切な対象となる。さらに、インビトロ診断及び研究用途などのインビトロ用途では、上記の対象の体液（例えば、血液、血漿、血清、細胞間質液、脳脊髄液、唾液、糞便及び尿）並びに細胞及び組織サンプルが使用に適している。

医薬組成物の有効量は、疾患若しくは障害の進行を阻害する、疾患若しくは障害の退縮を引き起こす、疾患若しくは障害の症候を軽減する、又は疾患若しくは障害のマーカーのレベルを有意に変化させるのに十分な量であり得る。

本明細書中に記載される化合物又は医薬組成物の有効量はまた、対象に投与された場合、十分な濃度のＣＭＡアクチベーターを提供するであろう。十分な濃度は、ＣＭＡ媒介疾患若しくは障害又はＣＭＡアクチベーターが有効である他の疾患若しくは障害を予防又は闘うのに必要な患者の体内のＣＭＡアクチベーターの濃度である。そのような量は、例えば化合物の血中濃度をアッセイすることによって実験的に、又はバイオアベイラビリティを計算することによって理論的に確認され得る。

処置方法は、一定の投与量のＣＭＡアクチベーターを対象又は患者に提供することを含む。約０．１ｍｇ～約１４０ｍｇ／キログラム体重／日の各化合物の投与量レベルは、上記の症状の処置に有用である（約０．５ｍｇ～約７ｇ／患者／日）。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる化合物の量は、処置される患者及び特定の投与様式に応じて変化する。投薬単位形態は、一般に、約１ｍｇ～約５００ｍｇの各活性化合物を含有する。特定の実施形態では、２５ｍｇ～５００ｍｇ又は２５ｍｇ～２００ｍｇのＣＭＡアクチベーターが、患者に毎日提供される。投与頻度はまた、使用される化合物及び処置される特定の疾患に応じて変動し得る。しかし、ほとんどの疾患及び障害の処置には、１日４回以下の投与計画を使用することができ、特定の実施形態では、１日１回又は２回の投与計画が使用される。

しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、及び排泄速度、薬物の組み合わせ、並びに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む様々な要因に依存することが理解されよう。

一実施形態では、本発明は、処置を必要とすると同定された患者のリソソーム蓄積症を処置する方法であって、有効量のＣＭＡアクチベーターを患者に提供することを含む方法を提供する。ＣＭＡアクチベーターは、唯一の活性剤として単独で、又は１つ又は複数の他の活性剤と組み合わせて投与され得る。

一般的な方法
動物、細胞及び試薬
動物：野生型（ＷＴ）及びＰｄｅ６変異についてホモ接合性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（網膜変性のｒｄ１０マウスモデル）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｃ５７ＢＬ／６ ＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウスを、ＦＶＢ ＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと８世代にわたって戻し交配することによって作製した。この試験では、雄及び雌の両方の動物を等しい分布群で使用した。しかし、二元配置ＡＮＯＶＡの性別及び処置の混合モデルを独立変数とし、対応する尺度を従属変数とした統計分析後に分析されたパラメータのいずれにも有意差がないため、両方の性別からの結果をプールした。全ての動物を、標準的な固形飼料及び水に自由にアクセスできるバリア管理施設（１９～２３℃ ３０～６０％相対湿度；１２時間の明／暗サイクル）に収容した。ＣＡ化合物の動物投与のために、３０％ ＰＥＧ ４００、６５％グルコース溶液（５％）、５％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する製剤を使用して、それらを溶解した。５％ ＤＭＳＯを添加し、１時間超音波処理することによってＣＡ化合物を新たに調製した。ＣＡ化合物によるＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウスの処置を、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ又はビヒクルの毎日のｉ．ｐ．注射によって３日間連続して行い、最後の注射の６時間後に組織を回収した。ｒｄ１０マウスの場合、動物に、Ｐ１８からＰ２５にＣＡ７７（４０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）を毎日注射した。Ｐ２６で、マウスを屠殺し、眼を、免疫蛍光のために４℃のＰＢＳ中４％ ＰＦＡで一晩固定し、又は網膜を解剖し、生化学のために直ちに凍結した。ビヒクル又は処置群における動物の分布をランダムに行った。全ての動物研究及び手順は倫理規則に従っており、欧州連合のガイドライン及びＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って行われ、アルベルト・アインシュタイン医学校の施設内動物管理使用委員会、ＣＳＩＣ Ｂｉｏｅｔｉｃａ Ｃｏｍｉｔｅによって承認され、Ｃｏｍｕｎｉｄａｄ ｄｅ Ｍａｄｒｉｄ，ＰＲＯＥＸ２３２／１７によって承認された。

細胞：ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞及びＮ２ａ神経芽細胞腫細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ゲノムＰＣＲによって検証した。初代ヒト線維芽細胞（ＧＭ０１６５１）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した。全ての細胞株を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８色素を用いたＤＮＡ染色プロトコルを使用してマイコプラズマ汚染について試験した。ＮＣｏＲ１のノックダウンは、標準的な手順に従って、Ｓｉｇｍａ Ｍｉｓｓｉｏｎライブラリーからのレンチウイルス媒介ｓｈＲＮＡ（ＳＨＣＬＮＧ－ＮＭ＿０１１３０８）を使用して行った。ノックダウンの効率を免疫ブロットによって試験した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者の説明書に従って異なるストレス因子（ｓｔｒｅｓｓｏｒ）の添加の２４時間後に測定した。

抗体：一次抗体は以下の供給源に由来した：（使用のための希釈及びクローンが括弧内に示される）：ウサギ抗ＬＣ３Ｂ（１／１０００、ＭＢＬ ｐｍ０３６）、マウス抗β－アクチン（１／１００００シグマ、Ａ４７００）、マウス抗ＭＡＰ２（１／１０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１４０６）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１／１０００、ＤＡＫＯ、Ｚ０３３４）、ウサギ抗ＲＡＲα（１／１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２５５４）、マウス抗ビジュアルアレスチン（１／２００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃ－３，Ｓｃ－１６６３８３）及びウサギ抗オプシンＲ／Ｇ（１／１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５４０５）、ウサギ抗トラスジン（１／２００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｓｃ－３８９）、ウサギ抗ＮＣｏＲ１（１／１００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５９４８）、ウサギ抗Ｌ２Ａ（１／２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５１～２２００）。全ての二次抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。この研究で使用した全ての抗体は商業的供給源からのものであり、多重希釈法に従って検証し、抗原をノックアウトした動物由来の細胞株又は組織を使用することによって利用可能な場合には検証した。

ヒト網膜組織
健康な個体及び網膜色素変性患者由来のヒト組織からのデータは、以前に公開された研究から得られ、この研究の完了のためにヒト組織の動員又は収集は行わなかった。網膜オルガノイドを生成するためのヒト組織の供給源は、元の研究で詳述されている（Ｇａｏ，Ｍ．Ｌ，ｅｔ．ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，（２０２０）８：１２８，Ｌａｎｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０２０）１５：６７－７９）。簡潔には、Ｇａｏ患者において、単核細胞を収集し、プラスミドベースのリプログラミングシステムに供してヒトｉＰＳＣを作製し、その後、三系統分化のためのプロトコルに供した。Ｌａｎｅでは、皮膚線維芽細胞を単離するために同意皮膚生検を得て、２人の無関係なＲＰ患者及び２人の対照からｉＰＳＣを作製した。両方の研究において、ヒトサンプルの収集は、それぞれの国の研究倫理委員会によって承認された。

オートファジー測定
長い半減期のタンパク質の細胞内タンパク質分解：コンフルエントな細胞を［^３Ｈ］ロイシン（２μＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４８時間標識し、次いで、広範囲に洗浄し、過剰の非標識ロイシンを含む培地で維持した。タンパク質分解は、異なる時間に採取した培地のアリコートからトリクロロ酢酸で沈殿させ、各時間における酸沈殿性放射能が酸可溶性放射能に変換された量として計算した。

マクロオートファジー活性：ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＰＦ－ＬＣ３^３２を発現するレンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、固定し、フラックスを、二重蛍光斑点（オートファゴソーム）から赤色蛍光斑点のみ（オートリソソーム）への変換として決定した。２０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ／ １００μＭロイペプチンと共に６時間インキュベートした細胞におけるＬＣ３の免疫ブロットによって、非処理細胞におけるＬＣ３の強度を阻害剤で処理した細胞におけるものから割り引くことによって、フラックスも測定した。

ＣＭＡ活性：細胞に、以前のようにＫＦＥＲＱ－ＰＳ－Ｄｅｎｄｒａレポーターを有するレンチウイルスを形質導入した。細胞を３．５ｍＡ（電流定数）発光ダイオード（ＬＥＤ：Ｎｏｒｌｕｘ、４０５ｎｍ）に３分間曝露することによって光活性化し、次いで、ガラス底９６ウェルプレートに播種した。所望の時間に、細胞を４％ ＰＦＡで固定し、高含有率顕微鏡（Ｏｐｅｒｅｔｔａシステム、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて画像化した。製造業者のソフトウェアを使用して、ウェルあたり９つの独立した視野で最低１，２００個の細胞で画像を定量化した。この研究で使用された細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ２ａ）は蛍光レポーターを安定に発現し、形質導入された細胞の割合は通常＞８５％であるが、本発明者らは、核によって細胞の数を同定するが、関連するサイトゾル緑色蛍光を有しない核を無視するようにプログラムを設定した。これは、形質導入の効率が約６５％である初代ヒト細胞の場合に特に重要であった。視野あたりの細胞の割合を焦点の範囲外にする可能性がある細胞体積又はプレートへの接着の薬物誘導性変化に対するコンファンディング効果を回避するために、本発明者らは、各細胞型について未処理ウェルで検出された細胞の平均数の少なくとも１／１０（ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ２ａ細胞の場合は３～４個の斑点／細胞及び初代ヒト線維芽細胞の場合は５個の斑点／細胞）を有する細胞のみを計数する閾値を設定する。ＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス由来の組織中のＣＭＡを測定するために、目的の器官をピクリン酸固定緩衝液（２％ホルムアルデヒド、ＰＢＳ中０．２％ピクリン酸、ｐＨ７．０）中４℃で１２時間固定し、次いで、７０％エタノールで洗浄し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。組織を３０％スクロースに浸漬し、次いで、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０ Ｓ）で切片化するためにＯＣＴに包埋した。３０分間の風乾後、切片を使用するまで－２０℃で保存した。スライス片をＤＡＰＩ－Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇにマウントして、細胞核を強調し、細胞あたりの斑点の定量化を可能にした。ＡｐｏＴｏｍｅ．２スライダーを取り付けた、×６３対物レンズ及び１．４開口数を有するＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）を用いて、又はＨＣＸ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＣＳ×６３．０ １．４０ ＮＡ油対物レンズ及びＬｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ（ＬＡＳ Ｘ）を用いて共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５；Ｌｅｉｃａ）を用いて、画像をｘ－ｙ－ｚ平面で取得した。

ＣＭＡアクチベーターの化学合成
全ての化学試薬及び溶媒は、商業的供給源（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｆｉｓｈｅｒ）から入手し、特に断らない限り、さらに精製することなく使用した。使い捨てシリカカートリッジ（４、１２、２４ｇ）を使用して、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ ２００ｉでクロマトグラフィを行った。アルミニウムを裏打ちしたＳｉｌｉｃｙｃｌｅシリカゲルプレート（膜厚２５０μｍ、インディケーターＦ２５４）で分析用薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行った。二重波長（２５４及び３６５ｎｍ）ＵＶランプを使用して、及び／又はＣＡＭ（モリブデン酸セリウムアンモニウム）若しくはＫＭｎＯ_４染色で染色して、化合物を可視化した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ ３００及びＤＲＸ ６００分光計で記録した。内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．００／０．００ｐｐｍ）又は残留溶媒（ＣＤＣｌ_３：７．２６／７７．１６ｐｐｍ；ｄｍｓｏ－ｄ６：２．５０／３９．５２ｐｐｍ）に対する^１Ｈ及び^１３Ｃ化学シフト（δ）を報告する。マススペクトル（ＥＳＩ－ＭＳ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ２０１０ＥＶ（特に明記しない限り、直接注入）で記録した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、アルベルト・アインシュタイン医学校のプロテオミクス施設のＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ高分解能質量分析計で記録した。

ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７の合成は以前に開示された。

ＲＡＲα ＬＢＤの発現及び精製。
ヒトＲＡＲαのヒスチジンタグ付きリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（残基１７６～４２１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。細胞を、ＯＤ_６００が約０．８に達するまで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。イソプロピル－ｂ－ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．８ｍＭの最終濃度まで添加することによってＴ７ポリメラーゼの発現を誘導し、細胞を２０℃で一晩インキュベートした。細胞培養物を８，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。１リットルのＲＡＲα ＬＢＤからの細胞ペレットを、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤錠剤であるＯＮＥ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）．を補充した５０ｍＬ溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。懸濁液を高圧ホモジナイザーを用いて溶解し、３５，０００ｘｇ、４℃で４５分間遠心分離した。上清を濾過し、調製した５ｍｌのＮｉ^２＋親和性カラム（ＨＩＳ ＰＵＲ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂、ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にロードし、溶解緩衝液で予備平衡化した。カラムを１５ｍＬの溶解緩衝液で３回洗浄した。結合したタンパク質を、２００ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮し、ＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａ－１５ １０Ｋ遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＦＰＬＣ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で緩衝液交換した。タンパク質を、ＦＰＬＣ緩衝液で予備平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して将来精製した。精製したＲＡＲα画分をプールし、５ｍＭのＤＴＴを加え、タンパク質を４℃で保存した。

蛍光偏光結合アッセイ
ＮＣｏＲ１のフルオレセインタグ付きペプチドＦＩＴＣ－Ａｈｘ－ＲＬＩＴＬＡＤＨＩＣＱＩＩＴＱＤＦＡＲ（配列番号１）（ＦＩＴＣ－ＮＣｏＲ１）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔにより９５％超の純度で提供した。蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を、確立された手順を使用して行った。直接結合等温線を、小分子（１０μＭ）を含む又は含まないＦＩＴＣ－ＮＣｏＲ１（５ｎＭ）を、１０μＭから開始して各工程で２倍に希釈したＲＡＲα ＬＢＤの段階希釈と共にインキュベートすることによって生成させた。アッセイ用緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロールであった。蛍光偏光を、Ｆ２００ ＰＲＯマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）で３０分で測定し、励起波長を４７０ｎｍに設定し、発光を５３０ｎｍで測定した。ＥＣ_５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して競合結合曲線の非線形回帰分析によって計算した。

分子ドッキング及び構造解析
ＡＲ７、ＣＡ３９、及びＣＡ７７構造をＣｈｅｍＤｒａｗで描画し、ＬｉｇＰｒｅｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用してｓｄｆフォーマットから三次元全原子構造に変換した。各リガンドについて、最大４つの立体異性体が生成され、ｐＨ７及びｐＨ２についてイオン化状態及び互変異性体が生成され、幾何学的配置が最適化され、エネルギーがドッキング前に最小化された。小分子アンタゴニストＢＭ６１４（ＰＤＢ ＩＤ：１ＤＫＦ）と複合体を形成したＲＡＲα－ＲＸＲヘテロ二量体の構造をドッキングに使用した。ＲＡＲα－ＲＸＲ構造を、ＭＡＥＳＴＲＯタンパク質調製モジュール（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用して調製した。アンタゴニストの構造をＲＡＲα部位から除去し、ヘテロ原子から５Åを超える距離にある水分子を除去し、全ての失われたプロトンを生成し、水素を最良の水素結合ネットワーク結合のために最適化し、形式電荷を割り当て、拘束エネルギー最小化によって構造を穏やかに最小化した。リガンド結合ポケットをＢＭＳ６１４ポーズの５Å以内に定義し、受容体グリッドサイズ及び中心をＢＭＳ６１４の位置及びサイズに基づいて生成した。ドッキングにおける受容体の柔軟性を説明するために、タンパク質原子については０．２５以下の部分原子電荷の絶対値を有する非極性原子のファンデルワールス半径のスケーリングを１に設定し、０．１５以下の部分原子電荷を有するリガンド非極性原子については０．８に設定した。ドッキングは、超精密（ＸＰ）モードを使用してＧｌｉｄｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用してリガンドフレキシブルモードで行った。３つ全ての分子をＢＭＳ６１４結合部位にドッキングした。ＭＡＥＳＴＲＯ及びＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）を使用して構造を分析した。

インビトロ及びインシリコＡＤＭＥ
以下の条件におけるインビトロ溶解度：Ａ）ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ／ＢＳＡ ０．１％ ｐＨ６、Ｂ）ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ／ＢＳＡ ０．１％ ｐＨ７．４、Ｃ）ＴＲＩＳ／ＢＳＡ ０．１％ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、及び指示された用量で、ＮＥＰＨＥＬＯｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ装置（ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたネフェロメトリーにより測定した。ヒト、マウス及びラットの肝臓ミクロソームにおけるインビトロ安定性及びＣａＣｏ－２細胞（ｐＨ６．５／７．４）アッセイを用いた双方向透過性アッセイを用いた透過性を、標準的な方法論を用いて行い、ＳＩＭＭ－ＳＥＲＶＩＥＲ ｊｏｉｎｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＣＡ３９（左）及びＣＡ７７（右）についてのＱｉｋＰｒｏｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）分析及びＡＤＭＥ予測によって計算されたインシリコＡＤＭＥ特性。

薬物動態学的分析
ＩＣＲ（ＣＤ－１）雄マウスを研究前に少なくとも３時間絶食させて水を自由に利用可能にした。動物を、制御された環境、目標条件：温度１８～２９℃、相対湿度３０～７０％に収容した。温度及び相対湿度を毎日監視した。電子時間制御照明システムを使用して、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを提供した。各表示時点について３匹のマウスに、３０％ ＰＥＧ－４００、６５％ Ｄ５Ｗ（水中５％デキストロース）、５％ Ｔｗｅｅｎ－８０ビヒクルを使用して、３０ｍｇ／ＫｇのＣＡ３９若しくはＣＡ７７を経口経管栄養により、又は１ｍｇ／ＫｇのＣＡ３９若しくはＣＡ７７を静脈内注射により投与した。マウスを屠殺し、脳サンプルを０時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間に採取し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してＣＡ３９又はＣＡ７７レベルについて分析した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３を使用して薬物動態パラメータを計算した。実験は、ＳＩＭＭ－ＳＥＲＶＩＥＲ ｊｏｉｎｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行った。

網膜の処理及び染色
エクスビボ網膜培養：眼を除去した後、全ての無関係の組織を神経網膜から除去し、これを次いで、光受容体を逆さまにしてミリセル支持インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れ、１μＭインスリン（ＳＩＧＭＡ、Ｉ ２６４３－２５ｍｇ）を含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間維持した。示される場合、網膜を１０ □Ｍ ＣＡ７７と共に示される時間インキュベートした。次いで、網膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で一晩固定し、処理した。

全マウント網膜の染色：最初の２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によるＲＴでの１時間の透過処理及びその後のブロッキング溶液（ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）とのインキュベーションの後、ビジュアルアレスチン（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びオプシンＲ／Ｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する抗体を使用して、４℃で一晩免疫染色を行った。次いで、網膜を洗浄し、Ａｌｅｘａ ５６８又は６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔにマウントし、ＳＰ５共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で共焦点顕微鏡法によって可視化した。

凍結切片及び免疫蛍光法：網膜切片における凍結切片及び免疫蛍光法を以前に記載されたように実施した^１０。この研究で使用した一次抗体は、トランスデュシン（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びオプシンＲ／Ｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。切片を共焦点顕微鏡法（ＴＣＳ ＳＰ５；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって可視化した。

ＯＮＬ厚さ及び外側セグメント長の定量化：ＯＮＬ厚さの定量化のために、ＤＡＰＩ画像を、ＤＭＩ６００Ｂ顕微鏡及びＨａｍａｍａｔｓｕ ＣＣＤ ９１００－Ｏ２カメラに連結された蛍光顕微鏡多次元システムＬｅｉｃａ ＡＦ６０００ ＬＸにおいて４０倍で撮影した。動物あたり少なくとも２つの切片、好ましくは中央切片を分析した。網膜に沿って均等に分布した網膜あたり８つの画像を取得した。画像ごとに３つの測定を行い、比率ＯＮＬ／ＩＮＬをＩｍａｇｅＪツールで定量化した。画像取得にはＬｅｉｃａ ＬＡＳ－Ｘを使用し、画像処理にはＩｍａｇｅＪ（ｖ．２．１．０）を使用した。ＯＳ長の測定では、全ての写真に共通の固定位置を考慮し、ＩｍａｇｅＪ直線ツールを使用してＯＳ長を測定した。

ＥＲＧ記録
マウスを一晩暗順応させ、その後の操作を暗赤色光で行った。ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）溶液の腹腔内注射でマウスを麻酔し、３７℃の加熱パッド上で維持した。瞳孔を１％トロピカミド（Ｃｏｌｉｒｃｕｓｉ Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄａ；Ａｌｃｏｎ Ｃｕｓｉ）の液滴で拡張させた。電気的記録を最適化するために、角膜電極を配置する直前に局所液滴（２％メトセル；ヘトリンゲン）を各眼に滴下した。フラッシュ誘導性ＥＲＧ応答を、Ｇａｎｚｆｅｌｄ刺激装置で生成された光刺激に応答して右眼から記録した。光強度は、光度計を用いて眼の位置（Ｍａｖｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＳＢ；Ｎｕｒｅｎｂｅｒｇ）で測定した。４～６４回の連続した刺激が平均化され、スコトピック条件における光フラッシュの間隔は、薄暗いフラッシュでは１０秒、最高強度では６０秒までであった。明順応条件下では、光フラッシュ間の間隔は１秒に固定された。ＥＲＧ信号を増幅し、増幅器（ＣＰ５１１ ＡＣアンプ；Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて０．３～１０００Ｈｚで帯域フィルタリングした。電気信号は、電力実験室データ取得ボード（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２０ｋＨｚでデジタル化した。角膜レンズ（Ｂｕｒｉａｎ－Ａｌｌｅｎ電極；Ｈａｎｓｅｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に固定した電極と口の中に位置する基準電極との間で、グランド電極を尾に位置させてバイポーラ記録を行った。暗順応下で、暗順応閾値応答（ＳＴＲ）を－４ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ・ｍ^－２の光フラッシュに対して記録した。－２ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ・ｍ^－２ｓの光フラッシュに対する桿体応答を記録し、１．５ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ・ｍ^－２の光フラッシュに応答する混合応答を記録した。振動電位（ＯＰ）は、１００～１０，０００Ｈｚの記録周波数範囲において１．５ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ・ｍ^－２の白色フラッシュを用いて分離した。明順応下で、３０ ｃｄ・ｍ^－２の桿体飽和バックグラウンドでの２ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ・ｍ^－２の光フラッシュに対する錐体媒介応答を記録した。ＳＴＲ、桿体応答（ｂ－桿体）、混合応答（ａ－混合及びｂ－混合）及びＯＰの波振幅を、動物の実験条件に対してマスクした観察者によってオフラインで測定した。

ｍＲＮＡ定量
ｍＲＮＡ－ｑＰＣＲ：個々の網膜からＲＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して網膜からの全ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造業者の指示に従って逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ－ｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを備えたＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）で行った。以下のプローブを使用した：Ｍｍ０１１８４４０５＿ｍ１（ロドプシン）、Ｆ－５’－ＣＴＴＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣ ＣＣＣ－３’（配列番号２）、Ｒ－５’－ＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴ－３’（配列番号３）（ｌａｍｐ２ａ）Ｆ－５’－ＡＡ ＧＧＡＣＴＣＣＴＡ ＴＡＧＴＧＧＧ ＴＧＡＣＧＡ－３’（配列番号４）、Ｒ－５’－ＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧ－３’（配列番号５）（マウスβ－アクチン）。

マイクロアレイ：処理細胞の全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、ＲＮｅａｓｙクロマトグラフィ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。各条件からのＣｙ３標識ＲＮＡ（０．６μｇ）をＡｇｉｌｅｎｔマウス８×６０Ｋにハイブリダイズさせた。オリゴパッケージを用いてデータを処理し、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法を用いて正規化した。遺伝子セットをフィルタリングして、Ｅｎｔｒｅｚ又はＧＯアノテーションのない遺伝子（５５６８２個のうち２１９１２個の遺伝子）及びＩＱＲ＞０．５を有する遺伝子を除去した。完全なマイクロアレイのＧｏｍｅｚ－Ｓｉｎｔｅｓらの生データは、原稿が受け入れられるとＧＥＯに堆積される。経路分析は、ＳＴＲＩＮＧデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ７００ｄｂ．ｏｒｇ／）を使用して行った。

共免疫沈降及び免疫ブロット
共免疫沈降：細胞を氷上で１５分間、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５％ ＮＰ－４０、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤に溶解し、次いで１６，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清をプロテインＡ／Ｇセファロースで事前に清澄化し、次いで、連続的に揺らしながら４℃で一次抗体と一晩インキュベートした。プロテインＡ／Ｇセファロースをチューブに添加し、同じ条件で１時間インキュベートした後、サンプルを遠心し、上清（ＦＴ、フロースルー）及びビーズ（ＩＰ、免疫沈降物）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロットに供した。

免疫ブロット：細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、２％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）、１０ｍＭのＤＴＴ、及び０．００５％のブロモフェノールブルーを含有する緩衝液中のＲＩＰＡ及び神経網膜において溶解した。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてＬｏｗｒｙ法を用いて決定した。５０マイクログラムのタンパク質（細胞溶解物用）又は１５マイクログラムの神経網膜用タンパク質を、ＡｎｙＫＤ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分離した。次いで、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移し、５％脱脂乳を含有するＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％（ｖ／ｖ））中で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体及び二次抗体でプローブした。適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して抗原シグナルを検出し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。濃度測定分析を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。

末梢器官及び血球数の組織病理学
ＣＡ処置動物の肝臓、肺及び腎臓を解剖し、１％ ＰＦＡ中で一晩固定し、パラフィン包埋した。組織を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、処置群に対して盲検の専門病理学者が分析して、これらの器官における毒性の存在の可能性についてスコア付けした。臨床的に関連する所見に６を割り当ててスコアリング１～６を使用した。パラメータごと及び器官ごとの個々のスコアリング及び器官ごとの平均スコアリングを行った。ビヒクル又はＣＡを投与したマウス群の血球数を、Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｒｃｙｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔを使用して、毎月採取した尾血液及び組織切開の瞬間に分析した。

ＣＭＡ活性化指標の算出
ＣＭＡ指数は、Ｌｙ（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）１５：１３５０－１３５９）、Ｇａｏ（２０２０）、及びＬａｎｅ（２０２０）からのデータセットを使用して計算した。簡潔には、ＣＭＡネットワークの各要素に重みを割り当てた。ＬＡＭＰ－２ＡはＣＭＡのレート制限成分であるため、２の重みが与えられた。１つおきの要素は１の重みを受けた。次に、全ての要素は、ＣＭＡ活性に対する所与の要素の既知の効果に基づいて、＋１又は－１である方向スコアに帰属された。次いで、ＣＭＡネットワークの各要素の発現数の加重／指向平均としてスコアを計算した。

統計分析及びサンプルサイズ決定
全ての数値結果は、平均値±標準誤差として報告され、特に明記しない限り、最低３つの独立した実験からのデータを表す。群間の差の統計的有意性を、平均の両側対応のないスチューデントｔ検定による単一比較の場合に決定した。多重平均比較の場合、統計的有意性を決定するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くボンフェローニ事後検定を使用した。ビヒクル又はＣＡで処理した対側網膜における酸化ストレスに対する耐性の研究では、図の凡例に示すようにデータ変換を適用した。統計分析を全てのアッセイで実施し、有意差をグラフ表示に示す。正規性及び等分散性の仮定が満たされない場合、本発明者らはノンパラメトリック試験を適用した。対照に対して正規化されたデータを用いた研究では、本発明者らは、１つのサンプルｔ検定を用い、仮定した対照平均は１であった。全ての試験について、有意水準はｐ＜０．０５（両側）であった。実験ごとに使用した動物の数は、以前の結果に基づく電力分析によって計算した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの「ＳＥＬＥＣＴ ＢＥＴＷＥＥＮ ＲＡＮＧＥ」関数を使用して、各処置群に動物をランダムに帰属させた。技術的な理由がない限り、又はマウスが獣医によって非常に健康状態が悪いと判定されない限り、マウスを分析から除外しなかった。培養処理群の細胞を含む研究では、ウェル又はチューブの位置決め効果を説明するために、ウェルとプレートとの間でランダムに帰属させた。本発明者らは、それらのシステムを使用する本発明者らの以前の研究に基づいて、技術的変動性及び培養条件の変化を説明するために実験反復回数を決定する。各実験は、少なくとも３つの独立した反復で実施した。培養中の細胞における実験を、手順の再現性を確認するために異なる日に行った。全ての独立した複製が成功した。外れ値をＲＯＵＴ法によって決定した（Ｑ＝１％）。調査員は、データ収集及び分析中に処置を盲検化し、分析がプロットのために完了したときに盲検解除を行った。基本的なデータ処理は、Ｍｉｃｒｏｓｏｌｆｔ Ｅｘｃｅｌ ３６５（ｖ．２１０１）で行った。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ９－Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ）を用いてデータ分析を行った。画像分析及び定量化を、ＩｍａｇｅＪ（ｖ．２．１．０）を使用して行った。

実施例１．ＲＡＲαを標的化する新規小分子は選択的ＣＭＡ活性化を促進する
以前に報告されたＡＲ７は、ＲＡＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合し、インビトロでＣＭＡを選択的に活性化する（Ａｎｇｕｉａｎｏ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１３）９：３７４－３８２．）。同じく以前に報告されたＣＡ３９及びＣＡ７７は、ＣＭＡのより強力なアクチベーター（ＡＲ７の＞４０％ ＣＭＡ）であり、顕著な毒性はなく、基礎ＣＭＡ及び誘導性ＣＭＡの両方をアップレギュレートすることができる。

本明細書中に記載されるように行われるＣＡ３９及びＣＡ７７の分子ドッキング研究は、一貫して、ヘリックスｈ３、ｈ１０及びｈ１２の接合部によって形成されるＲＡＲα結合ポケットにおける結合を支持し、ＡＲ７と同様に、コリプレッサー及びコアクチベーターのＲＡＲαへの動員を調節するオープン立体配座においてｈ１２を安定化させた（図１Ａ、図１Ｂ）。ＲＡＲαポケット残基とのそれぞれ疎水性相互作用又は極性相互作用を増加させるために、ＣＡ３９及びＣＡ７７をベンゾオキサジン足場に基づいて設計した。実際、両方の化合物は、Ｔｈｒ２３３を有するそのアミド基とＰｒｏ４０４付近の水分子との間に広範囲の疎水性接触及びＣＡ７７水素結合を形成する（図１Ａ、１Ｃ）。
本発明者らは、ＣＡ３９及びＣＡ７７が、ＡＲ７よりも高い効力で時間及び用量依存的様式でＣＭＡを活性化すること、並びにＡＲ７とは対照的に、培地から化合物を洗い流した１２時間後に活性化が依然として顕著であったことを確認した（図１Ｄ、図１Ｅ。両方の化合物はまた、神経関連細胞を含む他のマウス細胞型及びＡＲ７の活性化効果が非常に離散的であったヒト細胞においてＣＭＡを効率的に活性化する（データは示さず）。興味深いことに、神経関連細胞においてＣＡ７７によって誘発されたＣＭＡの活性化は持続し、化合物が培地から除去された後もさらに増加し、これらの細胞に対するより堅牢で長期の活性化効果を示した。ＣＡ３９及びＣＡ７７は、ＣＭＡアップレギュレーションに関連する長寿命タンパク質の細胞内分解速度の予想される増加を誘導したが、タンパク質分解の増加が化合物の添加後最初の１２時間だけ持続したＡＲ７とは対照的に、タンパク質分解は、ＣＡ３９及びＣＡ７７の添加後２４時間もアップレギュレートされたままであり（図２Ａ）、典型的なＲＡＲαアンタゴニストについて以前に記載されたマクロオートファジーに対する阻害効果を有しなかった（図２Ｂ、２Ｃ）。３つの化合物のいずれかを添加した後、本発明者らは、マクロオートファジーに依存するタンパク質分解の割合（マクロオートファジー阻害剤ＭＲＴに感受性）、ＬＣ３－ＩＩのリソソーム分解速度、又は蛍光タンデムレポーターｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ－ＬＣ３を使用して検出されたオートファゴソーム及びオートリソソームの数に有意差を見出さなかった。したがって、ＣＡ３９及びＣＡ７７は、このオートファジー経路に対するそれらの選択性を依然として維持しながら、ＡＲ７よりも強力なＣＭＡアクチベーターである。
実施例２．ＣＡは、ＲＡＲα転写プログラムのサブセットを選択的に調節する
ＡＲ７、ＣＡ３９及びＣＡ７７分子によるＣＭＡの活性化の機構及び選択性の根拠を解明するために、本発明者らは、選択的ＲＡＲαアンタゴニストであるＢＭＳ６１４又は元のＡＲ７分子で処理した細胞の比較トランスクリプトーム分析を行った（データは示さず）。ＢＭＳ６１４で処理した細胞のトランスクリプトームの顕著な変化とは対照的に、ＡＲ７処理は、ＣＭＡネットワークの現在受け入れられている１７の構成要素のうち８つを含む遺伝子の個別の画分の発現の変化のみを誘導した（図３Ａ）。（Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．（２０１９）１８：ｅ３０００３０１）１７個のＣＭＡ構成要素の定量的ｑＰＣＲにより、ＣＭＡエフェクターのアップレギュレーション及びＣＭＡ阻害剤の発現低下の両方として現れる、ＣＡ化合物の添加時の発現の変化が確認された。この分析はまた、ＡＲ７と新しいＣＡ（ＣＡ３９及びＣＡ７７）との間の遺伝子発現の変化の大きさの違いを実証し、前のセクションで後者について記載したより高いＣＭＡ活性化能を説明することができた。実際、本出願人らは最近、ＣＭＡに関与する遺伝子のサブセットの発現を分析し、ＣＭＡ活性化スコアを計算することによって（ＣＭＡネットワーク内の各構成要素に重み及び方向性を追加することによって）ＣＭＡ活性の差を推測できることを実証した。観察されたＣＡ誘導性転写変化を使用して、本発明者らは、ＡＲ７と比較した場合、予測ＣＭＡスコアがＣＡ３９及びＣＡ７７についてより高いことを見出した。本発明者らは、マクロオートファジー及びリソソーム系のエフェクター及びレギュレーターの発現における有意なアップレギュレーションを見出さなかった（ＣＬＥＡＲネットワーク；図３Ｂに示される選択された遺伝子）。ＣＡ３９及びＣＡ７７を用いた同様の分析により（図３Ｃ、図４Ａ、及び図４Ｂ）、８個のＣＭＡ関連遺伝子の他に、２６個の追加の遺伝子（１１個のコード及び残りの非コード又はアンチセンス）のみが化合物によって調節されたことが確認された（１４個は３つ全ての化合物、１２個は２つの化合物、第３の化合物と同じ方向に変化）。これらのタンパク質及び非コードＲＮＡのいくつかは、遺伝子セット濃縮及びノード拡大解析（ＳＴＲＩＮＧデータベースを使用）が、Ｇタンパク質共役シグナル伝達、小胞融合、中間フィラメントの組織化及びＡＴＰ生成などのＣＭＡと相互作用し得る経路上に配置され、それらの全てがストレスに対する細胞応答に関与するので、まだ未知のＣＭＡエフェクター／レギュレーターであり得る（図４Ｃ及び図４Ｄ）。

全体として、本発明者らのデータは、予測されるように、ＣＡ分子が、ＣＭＡネットワークの構成要素が高度に表されているＲＡＲα調節遺伝子の非常に特異的なサブセットのみに影響を及ぼすことを裏付けている。これらの知見は、従来のＲＡＲαアンタゴニストとＣＡ化合物との間の大きな違いを強調し、非常に異なる作用機序を指し示している。

実施例３．ＣＡはＮＣｏＲ１とＲＡＲαとの結合を安定化する
ＣＡ化合物の個別の転写の影響及び不活性な立体配座でＲＡＲαを安定化させるそれらの能力は、それらがコリプレッサー分子とＮＣｏＲ１などのＲＡＲαとの相互作用を増強し得ると考えさせた。したがって、コリプレッサー／受容体相互作用に対するＣＡ化合物の選択的効果は、ＲＡＲα調節遺伝子の非常に小さなサブセットのみの変化を説明し得る。ＮＣｏＲ１に結合したＲＡＲα結晶構造にドッキングすると、化合物の結合ポーズは、ＲＡＲαに結合するＮＣｏＲ１と適合するが、立体衝突のためにＮＣｏＲ１又はＣＡ化合物に結合することができない活性なＲＡＲα立体配座とは適合しないことが示唆された（図３Ｄ、１Ａ）。実際、ＣＡ３９及びＣＡ７７は、蛍光偏光アッセイにおいてＲＡＲαへのＮＣｏＲ１ペプチド結合を増強し（図３Ｅ）、細胞のＲＡＲα及びＮＣｏＲ１は、ドッキング及び結合データと一致して、以下に示すビオチン化ＣＡ化合物との相互作用後に共免疫沈降することができた（図３Ｆ）。ＮＣｏＲ１のノックダウンは、ＣＭＡ活性を有意に減少させ、ＣＭＡに対するＣＡ３９及びＣＡ７７の活性化効果を完全に消失させ（図３Ｇ）、したがってＣＡ化合物の効果がＮＣｏＲ１依存性であることを裏付けた。

本発明者らは、ＣＭＡに対するＣＡ化合物の選択性は、コリプレッサーＮＣｏＲ１とのＲＡＲα相互作用を安定化させ、したがって、ＡＴＲＡ基質の結合及びコアクチベーターの動員を必要とするその活性な立体配座を採用するＲＡＲαを妨げる能力に起因すると結論する。

実施例４．ＣＡ化合物はインビボでＣＭＡを活性化する
ＣＡ３９及びＣＡ７７は、合理的な溶解性を有する薬物様の特性を有し、ヒト肝ミクロソームとの代謝安定性が高～中程度であり、ＣＡ７７は膜透過性も高い（図５Ａ）。ＡＤＭＥ特性予測を使用するＱｉｋｐｒｏｐ分析は、ＣＮＳ活性、経口バイオアベイラビリティ、透過性について陽性のＣＡの両方をスコア化し、ＨＥＲＧ Ｋ＋チャネル遮断活性を示す可能性は低い（図５Ｂ）。

１ｍｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）投与及び３０ｍｇ／ｋｇの経口投与（ＰＯ）によるインビボ薬物動態（ＰＫ）研究は、ＣＡ３９及びＣＡ７７が静脈内又は経口投与された場合に良好な体内分布を有し、ＰＯによって投与された場合の血漿中半減期が、ＣＡ３９及びＣＡ７７についてそれぞれ７．５時間及び２．２時間、並びにＣＡ３９及びＣＡ７７についてそれぞれ８．２時間及び０．６時間であったことを示した（図６Ａ及び図７Ａ）。両方の分子が脳血液関門を効率的に通過し、特にＣＡ７７について有意な脳曝露を示し、脳における半減期は、ＣＡ３９についてはＩＶで８時間及びＰＯで１０時間、ＣＡ７７についてはＩＶで１．８時間及びＰＯで４．２時間であった（図６Ｂ及び図７Ｂ）。それらの高い脳対血漿比（図７Ｃ）及びより安定なＣＡ７７誘導体（ＣＡ７７．１；血漿半減期３時間及び経口投与した場合のＡＵＣ脳／血漿５．７３）の慢性（５ヶ月）連日経口投与時のマウスにおける末梢血又は主要器官（肝臓、肺、腎臓）毒性の欠如（図８）は、これらの化合物が中枢神経系（ＣＮＳ）慢性疾患を標的とするのに適したリード化合物であることを裏付けている。

拡散サイトゾルパターンから蛍光斑点への蛍光分布の変化としてＣＭＡ活性を視覚化することを可能にするＣＭＡレポーターの全身発現を有するトランスジェニックマウスモデル（ＫＦＥＲＱ－Ｄｅｎｄｒａマウス）を使用して、本発明者らは次に、ＣＡ３９及びＣＡ７７が末梢血細胞及び複数の器官の両方においてインビボで同等の効力でＣＭＡを活性化する能力を実証した（図６Ｃ～６Ｋ）。ＣＭＡアップレギュレーション及びＬ２Ａ ｍＲＮＡレベルの増加が、処置マウスの単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞において検出され、ＣＭＡ活性化薬物の投与中に標的関与について試験するための簡便な方法を提供した（図６Ｃ～６Ｅ）。ＣＭＡ活性及びＬ２ＡｍＲＮＡレベルの両方もまた、ＣＡ分子の投与時に肝臓及び中脳において有意に増加した（図６Ｆ～６Ｊ）。ＣＡの全身投与もまた、網膜におけるＣＭＡをアップレギュレートするのに有効であり、網膜の外顆粒層の細胞（桿体及び錐体）におけるこの経路の顕著な活性化を伴った（図６Ｆ、６Ｈ）。

実施例５．ＣＡは酸化ストレスに対する細胞保護効果を有する
ＣＭＡは、酸化ストレスに応答してアップレギュレートされ、インビトロ及びインビボの両方でこの傷害に対して保護的であることが示されている。これらの条件下でのＣＭＡの活性化の有益な効果は、リソソーム分解を介して酸化タンパク質を選択的に除去する能力と、細胞代謝活性を低下したフリーラジカル産生に調整する能力との組み合わせである。本発明者らは、培養細胞及び組織外植片における酸化ストレスパラダイムを使用して、これらの状況におけるＣＡ化合物の細胞保護効果を試験した。

本発明者らは、培養細胞を増加する濃度の酸化促進剤パラコート（ＰＱ）に曝露し、ＣＡ３９が、ＡＲ７についても以前に示されたように、傷害前に投与された場合には細胞死を減少させるが（図９Ａ）、傷害後に添加された場合にはＡＲ７よりも有意に高い保護を示す（図９Ｂ）ことを確認した。

ＣＡの保護効果が全組織においても顕著であったかどうかを試験するために、本発明者らは、網膜色素変性の実験モデルであるｒｄ１０マウスの網膜外植片においてＣＡ７７を使用した。Ｒｄ１０マウスは、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子にミスセンス変異を有し、ヒトにおける疾患進行と同様の光受容体細胞死及び視力喪失を示す。Ｌ２Ａのアップレギュレーションは、他のオートファジー経路の構成要素ではなく、ＣＭＡが長期飢餓に対する網膜応答の一部としてアップレギュレートされ得ることを提唱している。全網膜外植片へのＣＡ７７の投与は、反対側の未処理網膜外植片（図９Ｃ）と比較した場合、桿体の数の有意な保存（桿体アレスチン陽性）及び錐体（オプシン陽性）についてもより高い保存をもたらした。

これらの結果は、新規のＣＭＡアクチベーターの細胞保護効果の改善を支持し、組織全体で機能するそれらの能力を実証する。

実施例６．ＣＡの全身投与は網膜変性を改善する
ＣＡ３９及びＣＡ７７の好ましいインビボＰＫ特性（図６Ａ、図６Ｂ及び図６の拡張データ）、動物全体においてＣＭＡを活性化するそれらの能力（図６）、及びｒｄ１０網膜外植片におけるそれらの顕著な保護効果（図９Ｃ）は、インビボで網膜色素変性モデルにおけるそれらの治療可能性を評価するために本発明者らを動機づけた（図１０）。このモデルでは、光受容体喪失は、ｐ２２でピークになる急性の桿体細胞死から始まり、その後、より進行性の錐体細胞死が続く^２０。介入を臨床的に妥当なものにするために、本発明者らは、最大の桿体死のピーク付近（ｐ１８～ｐ２５）で処置を開始した。本発明者らは、ＣＡ７７（４０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ）を１週間にわたって毎日腹腔内注射したｒｄ１０マウス由来の網膜が、光受容体核に対応する有意に厚い外顆粒層（ＯＮＬ）を示し、より少ない細胞損失を示すことを見出した（図１０Ａ）。

桿体（トランスデュシン）並びに赤色及び緑色円錐（オプシンＲ／Ｇ）のマーカーを用いた免疫染色もまた、ビヒクルを投与されたマウスと比較して、ＣＡ７７処置マウスにおける光受容体の外側セグメントの長さの増加を明らかにした（図１０Ｂ、１０Ｃ）。これらの動物における光受容体特異的タンパク質（すなわち、図１０Ｄに示されるロドプシン）のより高いｍＲＮＡレベルは、より高い細胞保存をさらに確認した。本発明者らはまた、疾患進行のさらなるマーカーとして網膜炎症のレベルを比較した。図１０Ｅに示すように、ＣＡ７７処置マウス由来の網膜は、アストロサイト及び活性化ミュラー細胞の周知のマーカーであるＧＦＡＰのレベルが著しく低い。Ｌ２Ａの免疫ブロットは、薬物が制限ＣＭＡ構成要素の網膜レベルを有意に増加させるのに有効であったことを実証し、したがって標的関与を確認した（図１０Ｆ）。

視覚機能の保存に関連する網膜構造のＣＡ７７媒介性改善を確認するために、網膜電図（ＥＲＧ）を実施した。Ｐ１８からＰ３３でＣＡ７７を投与されたマウスは、有意により高い振幅のそれらのｂ－混合、ｂ－ｐｈｏｔ及びフリッカー波（図１０Ｇ）を示し、網膜機能に対する介入の有益な効果を裏付けた。ＣＡ７７を投与したマウスと投与しなかったマウスとの間で、測定された他の光応答に有意差は観察されなかった。

次に、本発明者らは、ＣＡ化合物を、臨床診療における好ましい送達経路である硝子体内送達することによる、より並進的なアプローチを評価した。Ｐ１８でのＣＡ７７（４０μＭ）の単回硝子体内注射の７日後のｒｄ１０マウス網膜の分析により、ビヒクル処置マウスと比較して薬物処置マウスにおいて、凍結切片及びプラスチック包埋切片の両方において、網膜のＯＮＬ／ＩＮＬ比がより厚く、ＯＳ及びＯＮＬの保存がより良好であることが明らかになった。桿体及び錐体アレスチンによる光受容体染色は、ｒｄ１０マウスの網膜におけるＣＡ７７の細胞保護効果をさらに裏付けた。単回硝子体内注射の７日後に決定されたｒｄ１０動物では、ＣＡ７７投与後にもグリオーシスが有意に改善され、視力が維持された。

興味深いことに、ｒｄ１０マウス由来の網膜のプロテオミクス研究からのデータを変性前、変性ピーク及び変性後の時点で分析すると、ＮＣｏＲ１の網膜レベルの有意な減少が明らかになった（図１１Ａ）。本発明者らはまた、ＮＣｏＲ１についての免疫ブロット及び免疫染色によって、対照網膜と比較してｒｄ１０網膜におけるこのタンパク質の非常に顕著な減少を確認した（図１１Ｂ、１１Ｃ）。ｒｄ１０網膜におけるＮＣｏＲ１レベルの低下は、主に、この遺伝子の転写ダウンレギュレーションの結果であると思われる（図１１Ｄ）。この研究に記載されたＣＡ７７の作用機序から予想されるように、薬物はいずれの実験群においてもＮＣｏＲ１の発現レベルを変化させず、ＣＡがＮＣｏＲ１／ＲＡＲα相互作用を安定化し、したがって残りのＮＣｏＲ１タンパク質の効果を最大化することによってＣＭＡ活性を回復することができることをさらに裏付けている。

最後に、ヒト疾患におけるＣＡの可能性のある翻訳値を調べるために、本発明者らは、ＲＰ特徴を再現することが示された患者特異的網膜オルガノイドにおける以前の研究からのデータを使用して、ＣＭＡ関連遺伝子及びＮＣｏＲ１発現の状態を分析した。ＣＭＡ活性の直接測定はヒト網膜では不可能であるが、ＣＭＡに関与する遺伝子のサブセットの発現を分析し、ＣＭＡ活性化スコアを計算することによって（ＣＭＡネットワーク内の各構成要素に重み及び方向性を追加することによって）ＣＭＡ活性の差を推測できる。本発明者らは、ＣＭＡ活性化指数がヒト網膜オルガノイド成熟（１５０日までに完全に発達すると考えられる）と共に増加するが、ＰＤＥ６Ｂ変異（ｒｄ１０マウスモデルと同じ変異）を有するＲＰ患者由来の網膜オルガノイドは、全ての段階でＣＭＡ活性化指数の顕著な減少を示す（図１１Ｅ、１１Ｆ）ことを見出した。コリプレッサー対受容体の比（ＮＣｏＲ１対ＲＡＲα比）の顕著な増加は、健康なヒト網膜オルガノイドにおいて成熟の初期段階で観察されたＣＭＡのアップレギュレーションに大きく影響した（図１１Ｅ、１１Ｇ、黒線）。対照的に、網膜オルガノイドが完全成熟に達するにつれてより顕著になるＮＣｏＲ１／ＲＡＲα発現比の低下が、ＲＰ患者の網膜オルガノイドで観察された（図１１Ｅ、１１Ｇ、緑色線）。本発明者らは、代わりにＲＰ２変異を有するＲＰ患者由来のヒトｉＰＳＣ由来網膜オルガノイドを使用した第２の研究の分析で、ＮＣｏＲ１発現の減少及びＲＡＲαの増加並びにＮＣｏＲ１／ＲＡＲα発現比の全体的な減少に向かう同様の傾向を観察し、これはＸ連鎖ＲＰの全症例の約１５％を占める（図１１Ｈ）。これらの知見は、ＮＣｏＲ１／ＲＡＲα発現比の低下及びその後のより低いＣＭＡ活性がＲＰ患者において共通の特徴であり得ること、及びこの研究に記載されているような、コリプレッサーと受容体との相互作用を安定化する介入が、ヒト疾患において正常なＮＣｏＲ１／ＲＡＲαトーンを回復させるのに成功し得ることを裏付けている。

Claims (21)

1. レチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲα）とコリプレッサー、核受容体コリプレッサー１（ＮＣｏＲ１）との相互作用を安定化する方法であって、前記ＲＡＲαを、前記ＲＡＲα－ＮＣｏＲ１相互作用を安定化させるのに十分な量のシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）アクチベーターと接触させることを含む方法。
2. 前記ＲＡＲαを、神経変性障害の危険因子を有すると同定された対象においてインビボで前記ＣＭＡアクチベーターと接触させる、請求項１に記載の方法。
3. インビトロでのＲＡＲα／ＮＣｏＲ１相互作用に対する十分な濃度のＣＭＡアクチベーターを対象に投与することを含む、ＣＭＡ遺伝子発現をアップレギュレートする方法。
4. 対象におけるＣＭＡ遺伝子発現をアップレギュレートする方法であって、ＣＭＡに関連する少なくとも１つのエフェクター又はアクチベーター遺伝子の発現をアップレギュレートするのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを投与することを含む方法。
5. ＬＡＭＰ２Ａ、ＨＳＣ７０、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ４０、ＥＥＦ１Ａ１、ＰＨＬＰＰ１、及びＲＡＣ１から選択される少なくとも１つのエフェクター遺伝子の遺伝子発現が、前記ＣＭＡアクチベーターの投与前の患者における前記エフェクター遺伝子の発現と比較して前記対象において増加するか、又はＮＦＡＴＣ１、ＮＣＯＲ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＲ－２、ＲＡＲα、及びＲａｂ１１から選択される少なくとも１つのアクチベーター遺伝子の発現レベルが、前記ＣＭＡアクチベーターの投与前の前記患者における前記アクチベーター遺伝子の発現と比較して前記対象において増加する、請求項４に記載の方法。
6. 神経変性障害の初期症候又はバイオマーカーを有する対象における前記神経変性障害の進行を予防又は遅延させる方法であって、インビボでのＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを投与することを含む方法。
7. 前記バイオマーカーがβアミロイド又はタウであり、前記方法が、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び／又は磁気共鳴（ＭＲ）画像法によってβアミロイド及び／又はタウ病理の進行を決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、及び進行性皮質下グリオーシスである、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記神経変性障害がＡＤであり、前記対象が認知症を患っていない、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記神経変性疾患がＡＤであり、前記初期症候が認知機能の低下、不安、脱抑制、運動障害、記憶喪失及び／又は混乱、集中困難、毎日の作業の完了困難、時間及び／又は場所の混乱、視覚画像及び／又は空間的関係の困難、会話困難、物体の置き間違え、判断力の低下、活動からの離脱、嗅覚機能障害、気分及び人格の変化である、請求項６又は７に記載の方法。
11. 前記神経変性疾患がＡＤであり、前記バイオマーカーが、前記対象の血漿又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中のタウタンパク質（総タウ又はリン酸化タウ）又はβアミロイド（例えば、Ａβ４２）である、請求項６又は７に記載の方法。
12. 網膜変性障害の初期症候又はバイオマーカーを有する対象における前記網膜変性障害の進行の予防若しくは遅延を維持又は視力を保つ方法であって、前記対象の網膜におけるＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを前記対象に投与することを含む方法。
13. 前記網膜変性障害が網膜色素変性である、請求項１２に記載の方法。
14. 対象の網膜中のタンパク質恒常性を維持する方法であって、インビトロでのＲＡＲαとＮＣｏＲ１との間の相互作用を安定化させるのに十分な前記対象の網膜中のＣＭＡアクチベーターの濃度を達成するのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを前記対象に投与することを含む方法。
15. 加齢性の神経変性障害又は網膜変性障害の処置を必要とする対象の神経又は網膜中のＬａｍｐ ２Ａレベルを増加させる方法であって、
    前記対象の網膜又は神経におけるＲＡＲαとコリプレッサーＮＣｏＲ１との相互作用を安定化させるのに十分な量のＣＭＡアクチベーターを前記対象に投与することを含む方法。
16. 前記ＣＭＡアクチベーターが、前記ＲＡＲα内のＴｈｒ ２３３と水素結合することができるアクチベーターである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ＣＭＡアクチベーターが、以下のＲＡＲα（ヒトコンセンサス配列）アミノ酸：Ｐｒｏ ４０７、Ｌｅｕ ４０９、Ｉｌｅ４１０、Ｐｒｏ４０８及びＩｌｅ ２３６の少なくとも１つと、並びに／又は以下のＲＡＲα（ヒトコンセンサス配列）アミノ酸：Ｌｅｕ ２６６、Ｉｌｅ２７０、Ｐｈｅ３０２、及びＬｅｕ３０５の少なくとも１つと、疎水性相互作用することができるアクチベーターである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 投与される前記ＣＭＡアクチベーターの前記量が、毎日０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＣＭＡアクチベーターの前記量が、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１８ヶ月間、前記患者に毎日投与される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記対象がヒト患者である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ＣＭＡアクチベーターが、経口、静脈内、非経口、鼻腔内、舌下、頬側又は眼用剤形として投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。