JP2024515999A - Ｒｎａ編集のためのｒｉｓｃのリダイレクトの方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＲＮＡ分子のターゲティングされた部位特異的修飾に有用な、システム、組成物、キット、および方法を提供する。概して、本明細書に記載のシステム、組成物、キット、および方法は、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸を含む。ポリペプチドは、ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む第一のドメインと、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質のＭＩＤドメインを含む第二のドメインとを含む。システム、組成物、キット、および方法はまた、ポリペプチドを標的ＲＮＡにターゲティングするためのオリゴヌクレオチドを含むことができる。標的ＲＮＡを修飾するための方法は、標的ＲＮＡを、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸と、および本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと、接触させる工程を含む。標的ＲＮＡのいくつかの例示的な修飾としては、限定されないが、標的ＲＮＡにおける、アデノシンの部位特異的脱アミノ化、シチジンの脱アミノ化、アデノシンのメチル化（例えば、６位のメチル化）、およびｍ６－アデノシンの脱メチル化が挙げられる。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１８２，２４１号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書に記載される技術は、ＲＮＡ分子のターゲティングした編集に有用な、システム、組成物、キット、および方法に関する。
背景
核酸配列のターゲティングした修飾、例えば、ＲＮＡへの特異的修飾のターゲティングした導入は、遺伝的疾患に対する新しい治療法を提供する可能性がある、遺伝子機能研究のための非常に有望なアプローチである。したがって、ターゲティングしたＲＮＡ修飾のための方法および組成物に対する当技術分野におけるニーズが存在する。本開示は、これらのニーズの一部に対処する。
概要
標的ＲＮＡを修飾するための、システム、組成物、キット、および方法が本明細書に提供される。概して、本明細書に記載のシステム、組成物、キット、および方法は、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸を含む。ポリペプチドは、ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む第一のドメインと、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質のＭＩＤドメインを含む第二のドメインとを含む。
システム、組成物、キット、および方法はまた、ポリペプチドを標的ＲＮＡにターゲティングするためのオリゴヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、１６、１７、または１８のヌクレオチド塩基対の二本鎖（二重鎖）領域を含む。
別の態様では、標的ＲＮＡを修飾するための方法が本明細書に提供される。概して、方法は、標的ＲＮＡを、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸と、および本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと、接触させる工程を含む。標的ＲＮＡのいくつかの例示的な修飾としては、標的ＲＮＡにおけるアデノシンの部位特異的脱アミノ化、シチジンの脱アミノ化、アデノシンのメチル化（例えば、６位のメチル化）、およびｍ６－アデノシンの脱メチル化が挙げられるが、これらに限定されない。
標的細胞との接触は、細胞中であり得ることに留意されたい。さらに、標的ＲＮＡとの接触は、インビトロまたはインビボであり得る。
さらに別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、またはオリゴヌクレオチドを含む細胞が本明細書に提供される。
この特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも一つの図面が含まれる。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払いにより、特許商標庁によって提供される。
ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）および例示的なＡＤＡＲポリペプチドによるＲＮＡ編集の概略図である。 図１－１の説明を参照。
ＲＮＡ編集のための例示的なＧＦＰレポーターアッセイの概略図である。Ｗ５８Ｘ変異体の終止コドン内でアデノシンをイノシンに選択的に編集すると、ｅＧＦＰの翻訳が回復し、正常に影響を受けた細胞で蛍光が点灯する。
一実施形態による、ＲＮＡ編集のための、ＡＤＡＲ－Ａｇｏ２融合ポリペプチド、ならびに例示的なＧＦＰレポーターおよびｓｉＲＮＡ配列の概略図である。
一実施形態による、ＡＤＡＲ－Ａｇｏ２および編集ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す写真である。
ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２がレポーターＲＮＡの配列を変化させることを確認する配列決定結果を示す。
一実施形態による、ＲＮＡ編集のための、ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２融合ポリペプチド、ならびに例示的なＧＦＰレポーターおよびｓｉＲＮＡアンチセンス配列の概略図である。
一実施形態による、ＲＮＡ編集のための、ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２融合ポリペプチド、ならびに例示的なＧＦＰレポーターおよびｓｉＲＮＡアンチセンス配列の概略図である。
ＡＤＡＲ－Ａｇｏ２によるＲＮＡ編集を示す写真である。編集ｓｉＲＮＡ７により、少数の細胞で編集が見られた（図６参照のこと）（Ｃ：Ａアンチセンス１９位でのミスマッチ；１９／２１設計）。
ｈＡｇｏ２のいくつかの例示的な修飾を伴うＲＮＡ編集を示す写真である。Ｎ末端アミノ酸１～５１は、ｓｉＲＮＡ負荷または標的認識のいずれかに重要であり得る。
本明細書に記載されるポリペプチドを用いて内因性標的を編集するためのワークフローの概略図である。
ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２および編集ｓｉＲＮＡがＬｅｕＲＳ（ＬＡＲＳ１）ｍＲＮＡの配列を変えることを確認する、例示的な配列決定結果を示す。 図１１－１の説明を参照。
ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２および編集ｓｉＲＮＡがＷＤＲ５ ｍＲＮＡの配列を変化させることを確認する、配列決定結果を示す。 図１２－１の説明を参照。
異なるヒトＡｇｏを含む例示的なポリペプチドを用いたＲＮＡ編集を示す写真である。示すように、ＲＮＡ編集はＡＤＡＲ－Ａｇｏ１～４で見られた。
ＲＮＡデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質およびＡＤＡＲ）によるＲＮＡ編集の概略図である。
一実施形態による、ＣからＵへのＲＮＡ編集のための、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ａｇｏ２融合ポリペプチド、ならびにｓｉＲＮＡの例示的なレポーターおよびアンチセンス鎖配列の概略図である。
例示的なＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ａｇｏ２融合ポリペプチド、および図１５の編集ｓｉＲＮＡを用いた、ＣからＵへのＲＮＡ編集を確認する例示的な配列決定結果を示す。 図１６－１の説明を参照。
詳細な説明
本明細書に記載される様々な態様は、ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む第一のドメインと、Ａｇｏタンパク質のＭＩＤドメインを含む第二のドメインとを含む、ポリペプチドを含む。例示的な触媒ドメインおよびＡｇｏタンパク質ドメインを、本明細書において以下に記載する。
Ａｇｏドメイン
本明細書に記載されるいずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、アルゴノートタンパク質のＭＩＤドメインを含む。アルゴノートタンパク質は、Ｎ末端（Ｎ）、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）、中間（ＭＩＤ）、およびＰ－ｅｌｅｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ（ＰＩＷＩ）ドメインを含有する、ＰＩＷＩタンパク質スーパーファミリーのタンパク質である。Ａｇｏは、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを結合することができる。Ａｇｏは、ｍＲＮＡを切断するか、翻訳を阻害するか、または標的配列においてｍＲＮＡ分解を誘導するために、これらのＲＮＡを有する標的配列に誘導され得る。概して、こうしたドメインは、構造化されたリンカー領域によっていくつかの配置で連結される。原核生物および真核生物のＡｇｏを含む、この構造レイアウトを有するＡｇｏは、「長い」とみなされる。しかしながら、ＭＩＤおよびＰＩＷＩドメインのみを有する「短い」Ａｇｏのクラスも存在する。ガイドの５’末端は、ＭＩＤドメインの領域に隔離される。この結合に関与する残基はいくらか保存されているが、真核生物のＡｇｏと原核生物のＡｇｏとの間にはいくつかの顕著な差異が存在する。ガイドの３’末端は、ＰＡＺドメインによって結合される。Ａｇｏの触媒領域は、ＰＩＷＩドメイン内に位置するＲＮａｓｅ Ｈ様のフォールドであり、保存されたＤＥＤＸ（Ｘ＝ＤまたはＨ）四分子を触媒作用に利用した。これらの残基に変異があると、アルゴノートは不活性化する。また、本明細書に記載されるタンパク質のアルゴノートファミリーには、Ｈｉｌｉ、Ｈｉｗｉ、Ｈｉｗｉ２、およびＨｉｗｉ３などのタンパク質のＰｉｗｉサブファミリーも含まれる。
哺乳類Ａｇｏファミリーは８つのメンバーを含み、そのうちの４つは遍在的に発現され（Ａｇｏサブファミリー）、残りの４つ（Ｐｉｗｉサブファミリー）は生殖細胞で発現される。Ａｇｏ２は、相補性領域でオリゴヌクレオチド誘導型標的ＲＮＡ切断を実行するＲＩＳＣ複合体の中核にあることが示されているが、Ａｇｏ１、３、および４は、この切断活性を欠くと考えられ、したがって相補性領域での標的ＲＮＡ切断を伴わない、関連するオリゴヌクレオチド誘導型遺伝子サイレンシング経路で機能し得る。同様に、Ａｇｏ２は、翻訳抑制など、そのような切断活性とは無関係に遺伝子サイレンシングにおいて機能し得る。
態様のうちのいずれか一つの一部の実施形態では、Ａｇｏタンパク質は、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、アキフェックス・アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アキフェックス・アエオリクス ＶＦ５株、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アロマトレウム・アロマティカム（Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・バートレッティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、エグジゴバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハロゲオメトリカム・ボリンキエンス（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ ｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、ハロルブルム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、ミクロキスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス・エロンガトゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、サームシネココッカス・エロンガトゥス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｇａｔｕｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・サーモフィルス ＪＬ－１８、またはサーマス・サーモフィルス ＨＢ２７株由来であり得る。
Ａｇｏの例示的な配列は、列挙する寄託番号を用いてＧｅｎｅｂａｎｋで見出すことができる：ヒトＡｇｏ１（ＮＰ０３６３３１）；ヒトＡｇｏ２（ＮＰ０３６２８６）、ヒトＡｇｏ３（ＮＰ０７９１２８）、ヒトＡｇｏ４（ＮＰ０６００９９）Ｈｉｌｉ（ＮＰ０６０５３８）、Ｈｉｗｉ（ＮＰ００４７５５３）、Ｈｉｗｉ２（ＮＰ６８９６４４）、Ｈｉｗｉ３（ＮＰ００１００８４９６）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｄｍ）Ａｇｏ ｌ（ＮＰ７２５３４１）、Ｄｍ Ａｇｏ２（ＮＰ７３００５４）、Ｄｍ Ａｇｏ３（ＡＢＯ２７４３０）、Ａｕｂｅｒｇｉｎｅ（ＣＡＡ６４３２０）、ＰＩＷＩ（ＮＰ４７６８７５）、シロイヌナズナ（Ａｔ）Ａｇｏｌ（ＮＰ８４９７８４）、Ａｔ Ａｇｏ２（ＮＰ１７４４１３）、Ａｔ Ａｇｏ３（ＮＰ１７４４１４）、Ａｔ Ａｇｏ４（ＮＰ５６５６３３）、Ａｔ Ａｇｏ５（Ａｔ２ｇ２７８８０）、Ａｔ Ａｇｏ６（Ａｔ２ｇ３２９４０）、Ａｔ Ａｇｏ７（ＮＰ１７７１０３３）、Ａｔ Ａｇｏ８（ＮＰ１９７６０２３）、Ａｔ Ａｇｏ９（ＣＡＤ６６６３６）、Ａｔ Ａｇｏ １０（ＮＰ１９９１９４）、分裂酵母（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓｐ）Ａｇｏ（ＮＰ５８７７８２）およびカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｌｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｃｅ）Ａｌｇ－１（ｆＮＰ５１０３２２１）。
ＭＩＤドメインは、真核生物または原核生物のＡｇｏ由来であり得ることに留意されたい。いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＭＩＤドメインは、マウスまたはヒトのＡｇｏなどの哺乳類Ａｇｏ由来である。例えば、ＭＩＤドメインは、ヒトＡｇｏ（ｈＡｇｏ）１、ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、またはｈＡｇｏ４由来である。一部の好ましい実施形態では、ＭＩＤドメインは、ｈＡｇｏ２由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＰＡＺドメインをさらに含む。ＰＡＺドメインは、真核生物または原核生物のＡｇｏ由来であり得ることに留意されたい。いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＰＡＺドメインは、マウスまたはヒトのＡｇｏなどの哺乳類Ａｇｏ由来である。例えば、ＰＡＺドメインは、ヒトＡｇｏ（ｈＡｇｏ）１、ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、またはｈＡｇｏ４由来である。一部の好ましい実施形態では、ＰＡＺドメインは、ｈＡｇｏ２由来である。
ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なるＡｇｏ由来であり得る。例えば、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの一方は、Ａｇｏ１由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの他方は、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、またはＡｇｏ４由来であってもよい。別の実施例では、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの一方は、Ａｇｏ２由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの他方は、Ａｇｏ３またはＡｇｏ４由来であってもよい。さらに別の非限定的な例では、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの一方は、Ａｇｏ３由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの他方は、Ａｇｏ４由来であってもよい。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインは、同じＡｇｏ由来である。例えば、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインの両方は、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、またはＡｇｏ４由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインの両方は、Ａｇｏ２由来である。
ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なる種由来であり得る。例えば、ＰＡＺドメインは、真核生物Ａｇｏまたは原核生物Ａｇｏ由来であってもよい。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインは、異なる種由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインまたはＰＡＺドメインのうちの一方は、真核生物Ａｇｏ由来であり、他方は、原核生物Ａｇｏ由来である。一部の他の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインの両方は、真核生物Ａｇｏ由来であってもよい。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインの両方は、哺乳類Ａｇｏ由来であり得る。例えば、ＭＩＤドメインおよびＰＡＺドメインの両方は、Ａｇｏ１由来、Ａｇｏ２由来、Ａｇｏ３由来、またはＡｇｏ４由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＰＩＷＩドメインをさらに含む。ＰＩＷＩドメインは、真核生物または原核生物のＡｇｏ由来であり得ることに留意されたい。いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＰＩＷＩドメインは、マウスまたはヒトのＡｇｏなどの哺乳類Ａｇｏ由来である。例えば、ＰＩＷＩドメインは、ヒトＡｇｏ（ｈＡｇｏ）１、ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、またはｈＡｇｏ４由来である。一部の好ましい実施形態では、ＰＩＷＩドメインは、ｈＡｇｏ２由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＰＩＷＩドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠く。
ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なるＡｇｏ由来であり得る。例えば、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの一方は、Ａｇｏ１由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの他方は、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、またはＡｇｏ４由来であってもよい。別の実施例では、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの一方は、Ａｇｏ２由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの他方は、Ａｇｏ３またはＡｇｏ４由来であってもよい。さらに別の非限定的な例では、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの一方は、Ａｇｏ３由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの他方は、Ａｇｏ４由来であってもよい。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインは、同じＡｇｏ由来である。例えば、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインの両方は、Ａｇｏ１由来、Ａｇｏ２由来、Ａｇｏ３由来、またはＡｇｏ４由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインの両方は、Ａｇｏ２由来である。
ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なる種由来であり得る。例えば、ＰＩＷＩドメインは、真核生物Ａｇｏまたは原核生物Ａｇｏ由来であり得る。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインは、異なる種由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインまたはＰＩＷＩドメインのうちの一方は、真核生物Ａｇｏ由来であり、他方は、原核生物Ａｇｏ由来である。一部の他の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインの両方は、真核生物Ａｇｏ由来であってもよい。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインの両方は、哺乳類Ａｇｏ由来であり得る。例えば、ＭＩＤドメインおよびＰＩＷＩドメインの両方は、Ａｇｏ１由来、Ａｇｏ２由来、Ａｇｏ３由来、またはＡｇｏ４由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＭＩＤドメイン、ＡｇｏのＰＡＺドメイン、およびＡｇｏのＰＩＷＩドメインを含む。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＮ末端ドメインをさらに含む。Ｎ末端ドメインは、真核生物または原核生物のＡｇｏ由来であり得ることに留意されたい。いずれか一つの態様の一部の実施形態では、Ｎ末端ドメインは、マウスまたはヒトのＡｇｏなどの哺乳類Ａｇｏ由来である。例えば、Ｎ末端ドメインは、ヒトＡｇｏ（ｈＡｇｏ）１、ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、またはｈＡｇｏ４由来である。一部の好ましい実施形態では、Ｎ末端ドメインは、ｈＡｇｏ２由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、Ｎ末端ドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠く。
ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なるＡｇｏ由来であり得る。例えば、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの一方は、Ａｇｏ１由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの他方は、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、またはＡｇｏ４由来であってもよい。別の実施例では、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの一方は、Ａｇｏ２由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの他方は、Ａｇｏ３またはＡｇｏ４由来であってもよい。さらに別の非限定的な例では、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの一方は、Ａｇｏ３由来であってもよく、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの他方は、Ａｇｏ４由来であってもよい。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインは、同じＡｇｏ由来である。例えば、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインの両方は、Ａｇｏ１由来、Ａｇｏ２由来、Ａｇｏ３由来、またはＡｇｏ４由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインの両方は、Ａｇｏ２由来である。
ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインは、同じＡｇｏ由来、または異なる種由来であり得る。例えば、Ｎ末端ドメインは、真核生物Ａｇｏまたは原核生物Ａｇｏ由来であってもよい。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインは、異なる種由来である。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインまたはＮ末端ドメインのうちの一方は、真核生物Ａｇｏ由来であり、他方は、原核生物Ａｇｏ由来である。一部の他の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインの両方は、真核生物Ａｇｏ由来であってもよい。一部の実施形態では、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインの両方は、哺乳類Ａｇｏ由来であってもよい。例えば、ＭＩＤドメインおよびＮ末端ドメインの両方は、Ａｇｏ１由来、Ａｇｏ２由来、Ａｇｏ３由来、またはＡｇｏ４由来である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＭＩＤドメイン、ＡｇｏのＰＡＺドメイン、およびＡｇｏのＮ末端ドメインを含む。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＭＩＤドメイン、ＡｇｏのＰＩＷＩドメイン、およびＡｇｏのＮ末端ドメインを含む。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドの第二のドメインは、ＡｇｏのＭＩＤドメイン、ＡｇｏのＰＡＺドメイン、ＡｇｏのＰＩＷＩドメイン、およびＡｇｏのＮ末端ドメインを含む。
Ａｇｏドメイン、例えば、ＭＩＤ、ＰＡＺ、ＰＩＷＩ、および／またはＮ末端ドメインのアミノ酸配列は、天然配列の所望の活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列から配列を変化させるように改変され得ることに留意されたい。したがって、いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチド中のＡｇｏドメイン、例えば、ＭＩＤ、ＰＡＺ、ＰＩＷＩおよび／またはＮ末端ドメインは、当該Ａｇｏドメインの野生型配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、第二のドメインは、哺乳類Ａｇｏと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第二のドメインは、ｈＡｇｏ１、ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ヒトアルゴノートタンパク質の例示的な配列は、列挙する寄託番号を用いてＧｅｎｅｂａｎｋで見出すことができる：ｈＡｇｏ１アイソフォーム１（ＮＰ０３６３３１，１）、ｈＡｇｏ１アイソフォーム１Ｘ（ＮＰ００１１３０４０５１．１）、ｈＡｇｏ１アイソフォーム２（ＮＰ００１３０４０５２．１）、ｈＡｇｏ２アイソフォーム１（ＮＰ０３６２８６．２）、ｈＡｇｏ２アイソフォーム２（ＮＰ００１１５８０９５．１）、ｈＡｇｏ３アイソフォーム３（ＮＰ０７９１２８．２）、ｈＡｇｏ３アイソフォーム３（ＮＰ８０３１７１．１）、ｈＡｇｏ４アイソフォームＸ１（ＸＰ００５２７０６３５．１）、ｈＡｇｏ４アイソフォームＸ２（ＸＰ０１１５３９１８５．１）、ｈＡｇｏ４アイソフォームＸ３（ＸＰ０１１５４９１８６．１）、およびｈＡｇｏ４アイソフォームＸ４（ＸＰ０２４３０９５６３．１）。
一部の実施形態では、第二のドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515999000002
Figure 2024515999000003
一部の実施形態では、第二のドメインは、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の好ましい実施形態では、第二のドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第二のドメインは、ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列、例えば、配列番号２のＤ５９７およびＤ６９９からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第二のドメインは、ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列、例えば、配列番号２のＤ５９７ＡおよびＤ６９９Ａからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
触媒ドメイン
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む。一般的に、触媒ドメインはヌクレアーゼ活性を欠く。本明細書に記載されるシステム、組成物、キットおよび方法に適したＲＮＡ修飾酵素には、以下に限定されないが、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを編集できるもの（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ＡＤＡＲファミリータンパク質、シチジンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣファミリータンパク質、およびＰＰＲタンパク質）、ＲＮＡをメチル化できるもの（例えば、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＭＥＴＴＬ１４、またはＷＴＡＰなどのｍ６Ａメチルトランスフェラーゼ因子のドメイン）、ＲＮＡを脱メチル化できるもの（例えば、ヒトアルキル化修復相同体５またはＡＬＫＢＨ５）、スプライシングに影響を与え得るもの（例えば、ＳＲＳＦ１のＲＳリッチドメイン、ｈｎＲＮＰＡ１のＧｌｙリッチドメイン、ＲＢＭ４のアラニンリッチモチーフ、またはＤＡＺＡＰ１のプロリンリッチモチーフ）、翻訳を活性化できるもの（例えば、ｅＩＦ４Ｅ、ＹＴ５２１－Ｂ相同体ドメインファミリータンパク質１（ＹＴＨＤＦ１、翻訳機構を動員する細胞質ｍ６Ａリーダータンパク質）のＮ末端ドメイン、および他の翻訳開始因子、酵母ポリ（Ａ）結合タンパク質のドメインまたはＧＬＤ２）、翻訳を抑制できるもの（例えば、ＰｕｍｉｌｉｏまたはＦＢＦ ＰＵＦタンパク質、デアデニラーゼ、またはＣＡＦ１）、およびＲＮＡ安定性に影響を与え得るもの（例えば、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはＵＰＦ１、ＥＸＯＳＣ５、およびＳＴＡＵ１のドメイン）が挙げられる。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインは、デアミナーゼのデアミナーゼドメインである。例えば、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、またはＡＤＡＴファミリーデアミナーゼのデアミナーゼドメインである。デアミナーゼは、任意の適切な生物体（例えば、ヒトまたはラット）由来であってもよいことが理解されるべきである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来である。
本開示に関連して使用され得るアデノシンデアミナーゼには、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）として知られる酵素ファミリーのメンバー、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）として知られる酵素ファミリーのメンバー、および他のアデノシンデアミナーゼドメイン含有（ＡＤＡＤ）ファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。いずれか一つの態様の一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ由来である。
ＡＤＡＲは、ＲＮＡの二本鎖部分を特異的に認識し、アデノシン残基をイノシンに変換するアデノシンデアミナーゼである。ＡＤＡＲは、哺乳類ＡＤＡＲであり得る。ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、およびＡＤＡＲ３と表示される３つの哺乳類ＡＤＡＲがある。ＡＤＡＴ１は、アデノシン残基をイノシンに変換する別の酵素である。ＡＤＡＲ１アイソフォームおよびＡＤＡＲ２は、様々な細胞および組織で広く発現し、脳および脾臓で最も発現が高く、５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡ編集に関与する必須ＡＤＡＲである。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲｌ、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３を含む、ヒトＡＤＡＲである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＲ－１およびＡＤＲ－２を含む、線虫ＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｄＡｄａｒを含むショウジョウバエＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｓｑＡＤＡＲ２ａおよびｓｑＡＤＡＲ２ｂを含む、イカＬｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ ＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴタンパク質である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ショウジョウバエＡＤＡＴタンパク質である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤｌ）およびＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）を含む、ヒトＡＤＡＤタンパク質である。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ＡＤＡＲの野生型配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ヒトＡＤＡＲまたは相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ヒトＡＤＡＲタンパク質の例示的な配列は、列挙する寄託番号を用いてＧｅｎｅｂａｎｋで見出すことができる：ｈＡＤＡＲ１アイソフォームａ（ＮＰ００１１０２．３）、ｈＡＤＡＲ１アイソフォームｂ（ＮＰ０５６６５５．３）、ｈＡＤＡＲ１アイソフォームｃ（ＮＰ０５６６５６．３）、ｈＡＤＡＲ１アイソフォームｄ（ＮＰ００１０２０２７８．１）、ｈＡＤＡＲ１アイソフォームｅ（ＮＰ００１３５１９７４．１）、ｈＡＤＡＲ１アイソフォームｆ（ＮＰ００１３５１９７８．１）、ｈＡＤＡＲ２アイソフォーム１（ＮＰ００１１０３．１）、ｈＡＤＡＲ２アイソフォーム２（ＮＰ０５６６４８．１）、ｈＡＤＡＲ２アイソフォーム３（ＮＰ０５６６４９．１）、ｈＡＤＡＲ２アイソフォーム７（ＮＰ００１１５３７０２．１）、ｈＡＤＡＲ２アイソフォーム８（ＮＰ００１３３３６１６．１）およびｈＡＤＡＲ３（ＮＰ０６１１７２．１）。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、触媒ドメインは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２またはｈＡＤＡＲ３のデアミナーゼドメインである。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ポリペプチドで使用するためのデアミナーゼドメインは、修飾ＡＤＡＲ由来であり得る。したがって、一部の実施形態では、第一のドメインは、ヒトＡＤＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）アミノ酸配列のＴ３７５およびＥ４８８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ヒトＡＤＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）アミノ酸配列のＴ３７５ＱおよびＥ４８８Ｑからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＧ３３６、Ｔ３３９、Ｒ３４８、Ａ３５３、Ｖ３５１、Ｖ３５５、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｓ３９７、Ｅ４３８、Ｆ４４２、Ｈ４４３、Ｌ４４４、Ｙ４４５、Ｔ４４８、Ｔ４９０、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｓ４８６、Ｇ４８７、Ｑ４８８、Ｒ５１０、Ｉ５２０、Ｖ５２５、Ｐ５３９、Ｇ５９３、およびＫ５９４からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ３５１、Ｓ３７０、Ｔ３７５、Ｐ４６２、Ｓ４８６、Ｅ４８８、およびＮ５９７からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＧ３３６、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＧ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ａ、Ｇ４８７Ｖ、Ｇ４８７Ｒ、Ｇ４８７Ｋ、Ｇ４８７Ｗ、およびＧ４８７Ｙからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＥ４８８、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＥ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｋ、Ｅ４８８Ｎ、Ｅ４８８Ａ、Ｅ４８８Ｍ、Ｅ４８８Ｓ、Ｅ４８８Ｆ、Ｅ４８８Ｌ、およびＥ４８８Ｗからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ４９０、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ４９０Ｃ、Ｔ４９０Ｓ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｆ、４９０Ｙ、Ｔ４９０Ｒ、Ｔ４９０Ｋ、Ｔ４９０Ｐ、およびＴ４９０Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ４９３、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｒ、Ｖ４９３Ｄ、Ｖ４９３Ｐ、およびＶ４９３Ｇからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＡ５８９、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、Ａ５８９Ｖ変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＮ５９７、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＮ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｎ５９７Ａ、Ｎ５９７Ｅ、Ｎ５９７Ｈ、Ｎ５９７Ｇ、Ｎ５９７Ｙ、およびＮ５９７Ｆからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＳ５９９、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、Ｓ５９９Ｔ変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＮ６１３、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＮ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６１３Ａ、およびＮ６１３Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＡＤＡＲの脱アミノ化活性を改善するために、第一のドメインがｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＧ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ａ、Ｇ４８７Ｖ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｈ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｎ、Ｅ４８８Ａ、Ｅ４８８Ｓ、Ｅ４８８Ｍ、Ｔ４９０Ｃ、Ｔ４９０Ｓ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｒ、Ｖ４９３Ｄ、Ｖ４９３Ｐ、Ｖ４９３Ｇ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｎ５９７Ａ、Ｎ５９７Ｅ、Ｎ５９７Ｈ、Ｎ５９７Ｇ、Ｎ５９７Ｙ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６１３ＡおよびＮ６１３Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
時には、ＡＤＡＲの脱アミノ化活性を低減する必要性があり得る。したがって、一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＥ４８８Ｆ、Ｅ４８８Ｌ、Ｅ４８８Ｗ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｆ、Ｔ４９０Ｙ、Ｔ４９０Ｒ、Ｔ４９０Ｋ、Ｔ４９０Ｐ、Ｔ４９０Ｅ、およびＮ５９７Ｆからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２のＲ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｔ４９０、Ｓ４９５およびＲ５１０からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同なオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２の位置Ｅ４８８、およびＲ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｔ４９０、Ｓ４９５、およびＲ５１０からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２のＲ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｅ４８８Ｑ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、およびＲ５１０Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２の変異Ｅ４８８Ｑ、ならびにＲ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、およびＲ５１０Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１のＧ１００７位、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１のＧ１００７Ａ、Ｇ１００７Ｖ、Ｇ１００７Ｒ、Ｇ１００７Ｋ、Ｇ１００７Ｗ、Ｇ１００７Ｙ、Ｇ１００７Ｌ、Ｇ１００７Ｔ、およびＧ１００７Ｓからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１のＥ１００８位、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１のＥ１００８Ｑ、Ｅ１００８Ｈ、Ｅ１００８Ｒ、Ｅ１００８Ｋ、Ｅ１００８Ｆ、Ｅ１００８Ｗ、Ｅ１００８Ｇ、Ｅ１００８Ｉ、Ｅ１００８Ｖ、Ｅ１００８Ｐ、Ｅ１００８Ｓ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ａ、Ｅ１００８Ｍ、およびＥ１００８Ｌからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515999000004
Figure 2024515999000005
一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号５～７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号５～７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号５～７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号５～７からなる群から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の好ましい実施形態では、第一のドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列、例えば、配列番号６のＧ３３６、Ｔ３３９、Ｒ３４８、Ａ３５３、Ｖ３５１、Ｖ３５５、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｓ３９７、Ｅ４３８、Ｆ４４２、Ｈ４４３、Ｌ４４４、Ｙ４４５、Ｔ４４８、Ｔ４９０、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｓ４８６、Ｇ４８７、Ｑ４８８、Ｒ５１０、Ｉ５２０、Ｖ５２５、Ｐ５３９、Ｇ５９３、およびＫ５９４からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＧ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ａ、Ｇ４８７Ｖ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｈ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｎ、Ｅ４８８Ａ、Ｅ４８８Ｓ、Ｅ４８８Ｍ、Ｔ４９０Ｃ、Ｔ４９０Ｓ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｒ、Ｖ４９３Ｄ、Ｖ４９３Ｐ、Ｖ４９３Ｇ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｎ５９７Ａ、Ｎ５９７Ｅ、Ｎ５９７Ｈ、Ｎ５９７Ｇ、Ｎ５９７Ｙ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６１３ＡおよびＮ６１３Ｅからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列、例えば、配列番号６のＴ３７５、Ｅ４４８およびＥ４８８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列、例えば、配列番号６のＴ３７５Ｑ、Ｅ４４８ＱおよびＥ４８８Ｑからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１アミノ酸配列、例えば、配列番号５のＧ１００７およびＥ１００８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１アミノ酸配列、例えば、配列番号５のＧ１００７Ａ、Ｇ１００７Ｖ、Ｇ１００７Ｒ、Ｇ１００７Ｋ、Ｇ１００７Ｗ、Ｇ１００７Ｙ、Ｇ１００７Ｌ、Ｇ１００７ＴおよびＧ１００７Ｓからなる群から選択される一つまたは複数の位置、またはＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、ｈＡＤＡＲ１アミノ酸配列、例えば、配列番号５のＥ１００８Ｑ、Ｅ１００８Ｈ、Ｅ１００８Ｒ、Ｅ１００８Ｋ、Ｅ１００８Ｆ、Ｅ１００８Ｗ、Ｅ１００８Ｇ、Ｅ１００８Ｉ、Ｅ１００８Ｖ、Ｅ１００８Ｐ、Ｅ１００８Ｓ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ａ、Ｅ１００８ＭおよびＥ１００８Ｌからなる群から選択される一つまたは複数の位置、またはＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ由来である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。例えば、デアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、またはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼ由来である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ＡＰＯＢＥＣの野生型配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣまたは相同もしくはオルソロガスＡＰＯＢＥＣと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ヒトＡＰＯＢＥＣタンパク質の例示的な配列は、列挙する寄託番号を用いてＧｅｎｅｂａｎｋで見出すことができる：ＡＰＯＢＥＣ１アイソフォームａ（ＮＰ００１２９１４９５．１）、ＡＰＯＢＥＣ１アイソフォームｂ（ＮＰ００５８８０）、ＡＰＯＢＥＣ２（ＮＰ００６７８０．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ａアイソフォームａ（ＮＰ６６３７４５）、ＡＰＯＢＥＣ３Ａアイソフォームｂ（ＮＰ００１２５７３３５）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂアイソフォームａ（ＮＰ００４８９１．５）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂアイソフォームｂ（ＮＰ００１２５７３４０．２）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（ＮＰ０５５３２３）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄアイソフォーム１（ＮＰ６８９６３９．２）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄアイソフォーム２（ＮＰ００１３５０７１０）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆアイソフォームａ（ＮＰ６６０３４１．２）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（ＮＰ００１００６６６７．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇアイソフォーム１（ＮＰ０６８５９４．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇアイソフォーム２（ＮＰ００１３３６３６５．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇアイソフォーム３（ＮＰ００１３３６３６６．１）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇアイソフォーム４（ＮＰ００１３３６３６７．１）、およびＡＰＯＢＥＣＣ４（ＮＰ９８２２７９．１）。
一部の実施形態では、第一のドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515999000006
Figure 2024515999000007
Figure 2024515999000008
一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号８～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号８～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号８～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第一のドメインは、配列番号８～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａアミノ酸配列、例えば、配列番号１０のＹ１３２位、または相同もしくはオルソロガスＡＰＯＢＥＣタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａアミノ酸配列、例えば、配列番号１０のＹ３１２ＤおよびＹ１３２Ｒからなる群から選択される１３２位、またはＡＰＯＢＥＣタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ｍ６Ａメチルトランスフェラーゼからの触媒ドメインを含む。例えば、第一のドメインは、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＭＥＴＴＬ１４、および／またはＷＴＡＰなどのｍ６Ａメチルトランスフェラーゼ因子からの触媒ドメインを含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ＲＮＡを脱メチル化することができる酵素からの触媒ドメインを含む。例えば、第一のドメインは、アルキル化修復相同体５またはＡＬＫＢＨ５からの触媒ドメインを含む。
一部の実施形態では、第一のドメインは、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＡＬＫＢＨ５の野生型配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第一のドメインは、ヒトＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰもしくはＡＬＫＢＨ５、またはそれらの相同もしくはオルソロガスなものと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ヒトＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４，ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＡＬＫＢＨ５タンパク質の例示的な配列は、列挙する寄託番号を用いてＧｅｎｅｂａｎｋで見出すことができる：ＭＥＴＴＬ３（ＮＰ０６２８２６．２）、ＭＥＴＴＬ４アイソフォーム１（ＮＰ０７３７５１．３）、ＭＥＴＴＬ４アイソフォーム２（ＮＰ００１２９５３３０．１）、ＭＥＴＴＬ１４（ＡＡＨ０６５６５）、ＷＴＡＰアイソフォーム１（ＮＰ００１２５７４６０．１）、ＷＴＡＰアイソフォーム２（ＮＰ６９０５９６．１）、ＷＴＡＰアイソフォーム３（ＮＰ００１２５７４６１．１）、およびＡＬＫＢＨ５（ＮＰ０６０２２８．３）。
一部の実施形態では、第一のドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515999000009
Figure 2024515999000010
リンカー
いずれかの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、第一のドメインと第二のドメインとの間のリンカーを含む。リンカーは、化学リンカー、単一のペプチド結合（例えば、互いに直接連結される）、または一つまたは複数のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカー（例えば、第一のドメインと第二のドメインとの間に介在するアミノ酸またはアミノ酸配列を有する）であり得る。
いずれかの態様の一部の実施形態では、２つのドメインを連結するために使用されるリンカーは、可撓性リンカーである。本明細書で使用される場合、「可撓性リンカー」は、溶液中に固定構造（二次構造または三次構造）を有さず、したがって、様々な立体構造を自由に採用するリンカーである。一般的に、可撓性リンカーは、その骨格に沿って複数の自由に回転する結合を有する。対照的に、剛性リンカーは、溶液中で比較的明確に定義された立体構造を取るリンカーである。したがって、剛性リンカーは、溶液中に特定の二次構造および／または三次構造を有するリンカーである。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、第一のドメインおよび第二のドメインは、ペプチドリンカーを介して連結される。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸配列を有するペプチドを示し、これは一部の実施形態で合成起源である。ペプチドリンカーは、所与の融合タンパク質のフォールディングに影響を与え得、他のタンパク質と反応／結合し得、これらの特性は、公知の技術によってスクリーニングされ得ることに留意されたい。ペプチドリンカーは、１アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、３５アミノ酸以上、４０アミノ酸以上、４５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、およびそれ以上を含み得る。逆に、ペプチドリンカーは、５０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２５アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、１５アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満を含み得る。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸～約４０アミノ酸を含む。例えば、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸～約３５アミノ酸、約１０アミノ酸～３０アミノ酸、または約１０アミノ酸～約２５アミノ酸を含み得る。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、リンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸を含む。例えば、リンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸を含む。リンカーは、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸を含むことが好ましい。リンカーは、１４、１５、または１６のアミノ酸を含むことがより好ましい。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、リンカーは、１５のアミノ酸を含む。
一部の例示的なペプチドリンカーには、グリシン残基およびセリン残基からなるリンカー、いわゆるＧｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカーが含まれる。本明細書で使用される場合、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙｘ Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｘは、２、３、４、５、または６であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、例えば、配列番号２５～７４である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは、３、４、５、または６である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは、４または５である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、４であり、ｎは、３、４、５、または６である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、４であり、ｎは４または５である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは２である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３または４であり、ｎは、１である。
より例示的なリンカーには、本明細書に記載されるものに加えて、ヒスチジン残基のストリング、例えば、Ｈｉｓ６（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号７５））、リンカーの可撓性を調節するためにＡｌａおよびＰｒｏ対の数を変化させる、ＡｌａおよびＰｒｏからなる配列、ならびに例えば、ＧｌｕおよびＬｙｓを混合する、荷電アミノ酸残基からなる配列が含まれる。可撓性は、リンカー中の残基のタイプおよび数によって制御され得る。例えば、Ｐｅｒｈａｍ，３０ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５０１（１９９１）、Ｗｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，８０ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ７３６（２００５）を参照されたい。
一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列
Figure 2024515999000011
を含み、ＮＥＳ配列（配列番号７８）は太字である。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、リンカーは、化学リンカーであり得る。化学リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換Ｃ１－Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２－Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ２－Ｃ６アルキニル、置換または非置換Ｃ６－Ｃ１２アリール、置換もしくは非置換Ｃ５－Ｃ１２ヘテロアリール、置換もしくは非置換Ｃ５－Ｃ１２ヘテロシクリル、置換または非置換Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキルなどの原子の鎖を含むことができ、式中、一つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、ＮＨ、またはＣ（Ｏ）によって中断または終了することができる。リンカーは、１アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、３５アミノ酸以上、４０アミノ酸以上、４５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、およびそれ以上であり得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、核輸送シグナルを含む。核輸送シグナル（ＮＥＳ）は、核輸送を使用して核膜孔複合体を通して細胞核から細胞質へ輸送することを目的とする、タンパク質中の４つの疎水性残基の短いアミノ酸配列を指す。ＮＥＳは、エクスポーチンによって認識され、結合される。疎水性残基の最も一般的な間隔は、ＬｘｘＫＬｘｘＬｘＬＸ（配列番号７９）であり、式中、Ｘは任意の天然アミノ酸である。一部の例示的なＮＥＳ配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＡ（配列番号７１）、ＣＩＱＱＱＬＧＱＬＴＬＥＮＴＬ（配列番号８０）、ＥＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ（配列番号７３）、ＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号７４）、ＡＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤ（配列番号８１）およびＴＬＷＱＦＬＬＨＬＬＬＤ（配列番号８２）。一部の実施形態では、ＮＥＳは、アミノ酸配列ＳＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号７８）を含む。
存在する場合、ＮＥＳは、ポリペプチド内のどこにでも位置することができる。例えば、ＮＥＳは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または内部位置にあり得る。一部の実施形態では、ＮＥＳは、第一のドメインのＮ末端位置にある。一部の実施形態では、ＮＥＳは、第一のドメインのＣ末端位置にある。一部の実施形態では、ＮＥＳは、第二のドメインのＮ末端位置にある。一部の実施形態では、ＮＥＳは、第二のドメインのＣ末端位置にある。
一部の実施形態では、ＮＥＳは、第一のドメインと第二のドメインとの間にある。言い換えれば、ＮＥＳは、第一および第二のドメインを連結するリンカーの一部である。ＮＥＳが第一のドメインと第二のドメインとの間にある場合、第一のドメインとＮＥＳとの間にリンカーが存在し得る。同様に、第二のドメインとＮＥＳとの間にもリンカーが存在し得る。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを単離または精製するための便利な手段を提供することができる、エピトープまたは親和性タグを含むことができる。多くのエピトープまたは親和性タグが当該技術分野で公知である。これらは、通常、そのサイズに従って３つのクラスに分けられる：小さなタグは、最大１２のアミノ酸を有し、中サイズのタグは、最大６０を有し、大きなタグは、６０超を有する。小さなタグは、Ａｒｇタグ、Ｈｉｓタグ、アビジンビオチン、またはストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ）タグ、フラグタグ、Ｔ７タグ、Ｖ５ペプチドタグ、およびｃ－Ｍｙｃタグを含み、中サイズのタグは、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ペプチド、およびいくつかのセルロース結合ドメインを含む。後者は、最大１８９のアミノ酸を含有することができ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－タグおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－タグのように、大きな親和性タグとみなされる。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、フラグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号７９）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号８０）、ａｃ－ＭｙｃエピトープＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号８１）、ＡＵ１タグ（ＤＴＹＲＹＩ、配列番号８２）、および／または６－ＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号７５）を含む。
存在する場合、エピトープまたは親和性タグは、ポリペプチド内のどこにでも位置することができる。例えば、エピトープまたは親和性タグは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または内部位置にあり得る。一部の実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、第一のドメインのＮ末端位置にある。一部の実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、第一のドメインのＣ末端位置にある。一部の実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、第二のドメインのＮ末端位置にある。一部の実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、第二のドメインのＣ末端位置にある。
一部の実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、第一のドメインと第二のドメインとの間にある。言い換えれば、エピトープまたは親和性タグは、第一および第二のドメインを連結するリンカーの一部である。エピトープまたは親和性タグが第一のドメインと第二のドメインとの間にある場合、第一のドメインとエピトープまたは親和性タグとの間にリンカーが存在し得る。同様に、第二のドメインとエピトープまたは親和性タグとの間にもリンカーが存在し得る。
一部の好ましい実施形態では、エピトープまたは親和性タグは、ポリペプチドのＮ末端にある。
オリゴヌクレオチド（「ｓｉＲＮＡ」）
本明細書に記載される様々な態様は、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。例えば、オリゴヌクレオチドは二本鎖（二重鎖）領域を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第一の鎖および第二の鎖を含む。便宜上、標的ＲＮＡと相補性を有する鎖は、アンチセンス鎖またはガイド鎖とも称される。他の鎖、すなわち、アンチセンス鎖と相補性を有する鎖は、本明細書ではセンス鎖またはパッセンジャー鎖とも称される。
オリゴヌクレオチドが第一および第二の鎖を含む場合、各鎖は、１２～４０のヌクレオチドの長さの範囲であり得る。例えば、各鎖は独立して、長さが１４～４０ヌクレオチド、長さが１７～３７ヌクレオチド、長さが２５～３７ヌクレオチド、長さが２７～３５ヌクレオチド、長さが１７～２３ヌクレオチド、長さが１７～２１ヌクレオチド、長さが１７～１９ヌクレオチド、長さが１９～２５ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、長さが１９～２１ヌクレオチド、長さが２１～２５ヌクレオチド、長さが２１～２３ヌクレオチド、長さが２５～３５ヌクレオチド、長さが２６～３５ヌクレオチド、長さが２７～３４ヌクレオチド、長さが２８～３２ヌクレオチド、または長さが２９～３１ヌクレオチドであり得る。限定されないが、センス鎖およびアンチセンス鎖は、等しい長さまたは等しくない長さであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、センス鎖よりも、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチドだけ長い。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１８～３５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１～２５、１９～２５、１９～２１、２１～２３ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３または３１ヌクレオチドの長さである。
アンチセンス鎖と同様に、センス鎖は、一部の実施形態では、１８～３５ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２１～２５、１９～２５、１９～２１、または２１～２３ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９ヌクレオチドの長さである。一部の好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、２１または２９ヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態では、センス鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、およびアンチセンス鎖は、長さが２３ヌクレオチドである。一部の他の実施形態では、センス鎖は、長さが２９ヌクレオチドであり、およびアンチセンス鎖は、長さが３１ヌクレオチドである。
短い二本鎖オリゴヌクレオチドは、相補的標的ＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断を誘導することができることが当該技術分野で公知である。ＲＩＳＣ媒介切断を低減または阻害するために、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＲＩＳＣ媒介切断を阻害する少なくとも一つの修飾を含むことができる。
ＲＩＳＣ媒介切断を阻害または低減する一つの方法は、標的ＲＮＡに相補的な鎖の（５’末端から数えて）８、９、１０、１１、または１２位で標的ＲＮＡとのミスマッチを導入することである。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）９、１０、または１１位で標的ＲＮＡとのミスマッチを含む。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１０位で標的ＲＮＡとのミスマッチを含む。
Ａ：Ｃミスマッチ
一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的な鎖、例えば、アンチセンス鎖は、（当該鎖の５’末端から数えて）２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７位で標的ＲＮＡとのミスマッチを含む。例えば、アンチセンス鎖が、（５’末端から数えて）２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７位にＣを含み、標的ＲＮＡは、当該Ｃに対して相補的な位置にＡを含む。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖が、（５’－末端から数えて）２４、２５、または２６位にＣを含み、標的ＲＮＡは、当該Ｃに対して相補的な位置にＡを含む。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖が、（５’－末端から数えて）２５位にＣを含み、標的ＲＮＡが、当該Ｃに相補的な位置にＡを含む。
別の非限定的な例では、アンチセンス鎖が、（３’末端から数えて）４、５、６、７、８、９または１０位にＣを含み、標的ＲＮＡは、当該Ｃに対して相補的な位置にＡを含む。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖が、（３’－末端から数えて）７位にＣを含み、標的ＲＮＡは、アンチセンス鎖中の当該Ｃに対して相補的な位置にＡを含む。
標的ループ
理論に拘束されることを意図するものではないが、ＲＮＡ編集、例えば、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ａを用いたＣ脱アミノ化は、標的ＲＮＡ中のループ構造を必要とし得る。したがって、本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、システムのオリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖、例えば、アンチセンス鎖を含み、当該標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡが当該鎖にハイブリダイズするときに一本鎖Ｃヌクレオチドを含むループ構造を形成する。ループ構造は、５～２０のヌクレオチドの長さであり得ることに留意されたい。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ループ構造は、１０～２０のヌクレオチドの長さである。例えば、ループ構造は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７のヌクレオチドの長さである。一部の好ましい実施形態では、ループ構造は、１３、１４、または１５のヌクレオチドの長さである。例えば、ループ構造は、１４のヌクレオチドの長さである。
一本鎖Ｃヌクレオチドは、ループ構造の任意の位置に存在し得る。例えば、一本鎖Ｃヌクレオチドは、ループ構造の５’末端から数えて、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、または１２位に存在し得る。一部の実施形態では、一本鎖Ｃヌクレオチドは、ループ構造の５’末端から数えて、７位、８位、９位、１０位、または１１位に存在し得る。例えば、一本鎖Ｃヌクレオチドは、ループ構造の５’末端から数えて、８位、９位、または１０位に存在し得る。一部の実施形態では、一本鎖Ｃヌクレオチドは、ループ構造の５’末端から数えて、９位に存在する。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ループ構造は、Ｕヌクレオチド５’からＣヌクレオチドを含む。例えば、ループ構造はジヌクレオチド５’－ＵＣ－３’を含む。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ループ構造は、５’－ＡＡＵＣ－３’、５’－ＣＡＵＣ－３’、５’－ＣＣＵＣ－３’、５’－ＣＵＵＣ－３’、５’－ＵＡＵＣ－３’、および５’－ＣＡＣＣ－３’からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端または３’末端から数えて、８位、９位、１０位、１１位、１２位、または１３位の反対側の位置で、ループ構造を形成する。この文脈で使用される「反対側」は、ループ構造を形成する標的配列のヌクレオチドが、標的ＲＮＡと当該鎖との間に形成される塩基対の直後に開始することを意味する。例えば、図１５では、例示的な標的ＲＮＡ（ＷＤＲ５の場合）は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、例示されたアンチセンス鎖の１０位の「反対側」に、ループ構造を形成する。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、８位、９位、１０位、１１位、１２位、または１３位の反対側の位置で、ループ構造を形成する。例えば、標的ＲＮＡは、標的核酸に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、９、１０、１１、または１２位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、１０位または１１位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、９位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、１０位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて、１１位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。
他の実施例では、標的ＲＮＡは、標的核酸に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端から数えて、９位、１０位、１１位、または１２位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端から数えて、１０位または１１位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端から数えて、９位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端から数えて、１０位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。一部の好ましい実施形態では、標的核酸は、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端から数えて、１１位の反対側の位置で、ヘアピン構造を形成する。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ループ構造は、一本鎖領域および二本鎖領域（ステム）を含むヘアピンの形態である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ヘアピンは、３～１５のヌクレオチドの長さの一本鎖領域を含む。例えば、ヘアピンの一本鎖領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ヘアピンの一本鎖領域は、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のヌクレオチドの長さである。例えば、ヘアピンの一本鎖領域は、８、９、１０、１１のヌクレオチドの長さである。一部の好ましい実施形態では、ヘアピンの一本鎖領域は、１０のヌクレオチドの長さである。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ヘアピンのステムは、２～１０塩基対の長さの二本鎖領域を含む。例えば、ヘアピンのステムは、２、３、４、５、６、７、８、または９塩基対の長さの二本鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヘアピンのステムは、２、３、４、５、６、または７塩基対の長さの二本鎖領域を含む。例えば、ヘアピンのステムは、２、３、４、５、６、または７塩基対の長さの二本鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヘアピンは、２または３塩基対の長さの二本鎖領域を含む。
本明細書に記載されるいずれか一つの態様の一部の実施形態では、ヘアピン構造の一本鎖領域を形成する標的ＲＮＡ配列は、パリンドローム配列に隣接している。例えば、ヘアピンの一本鎖領域を形成する配列は、パリンドローム配列に隣接し、パリンドローム配列は、標的ＲＮＡが標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖とハイブリダイズされたときに、ハイブリダイズしてヘアピンの二本鎖領域を形成する。
本明細書に記載されるように、ヘアピンの一本鎖領域は、Ｃヌクレオチドを含む。当該Ｃヌクレオチドは、一本鎖領域内のどこにでも存在し得る。例えば、Ｃヌクレオチドは、一本鎖領域のいずれかの末端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０位にあり得る。
本明細書に記載されるいずれか一つの態様の一部の実施形態では、ヘアピン構造の一本鎖領域は、ヌクレオチド配列５’－ＵＣ－３’を含み、Ｃは、編集位置である。例えば、ヘアピン構造の一本鎖領域は、５’－ＡＡＵＣ－３’、５’－ＣＡＵＣ－３’、５’－ＣＣＵＣ－３’、５’－ＣＵＵＣ－３’、５’－ＵＡＵＣ－３’、および５’－ＣＡＣＣ－３’からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３’－末端Ｃは編集位置である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’－末端でリン酸化される。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖または二重鎖領域を有する。概して、二重鎖領域（二本鎖領域）は、１２～４０ヌクレオチド塩基対の長さである。例えば、ｄｓＲＮＡは、１５～３５ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を有する。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１、２２、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１のヌクレオチド塩基対の長さの二重鎖領域を有する。一部の特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、１９、２０、２１、または２２のヌクレオチド塩基対の長さの二重鎖領域を有する。一部の他の特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２８、２９、３０、または３１のヌクレオチド塩基対の長さの二重鎖領域を有する。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、鎖の３’末端、または５’末端、または両末端に、一つまたは複数のオーバーハング領域（すなわち、一本鎖領域）および／またはオリゴヌクレオチドのキャッピング基を含む。これに限定されるものではないが、オーバーハングは、１～１０ヌクレオチドの長さ、１～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～６ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さであり得る。オーバーハングは、一方の鎖がもう一方よりも長い結果、または同一の長さの二本の鎖が互い違いに配置されている結果であり得る。このオーバーハングは、標的とする配列とミスマッチを形成し得る、または標的とする配列に対して相補的であり得る、または他の配列であり得る。第一および第二の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、結合することもできる。これに限定されるものではないが、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端に存在し得る。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、単一のオーバーハングを含む。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、単一のオーバーハングを有し、オーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に二ヌクレオチドオーバーハングを含む。
二本鎖オリゴヌクレオチドはまた、平滑末端を有し得る。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の末端は平滑末端であり、他方の末端はオーバーハングを有する。これに限定されるものではないが、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置し得、または逆も同様である。概して、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、そして５’末端は平滑である。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有し、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
一部の他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、すなわち二本鎖オリゴヌクレオチドの両端に、２つの平滑末端を有する。
オーバーハング領域中のヌクレオチドは各々独立して、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン、ＧＮＡ、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ、ｈ’ＧＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせなどの修飾された２’－糖を含むが、これらに限定されない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴ（またはＵＵ）は、どちらかの鎖のどちらかの末端でもオーバーハング配列であり得る。センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する２つのヌクレオチドを含有し、オーバーハング領域の２つのヌクレオチドは、同一であり得るか、または異なり得る。
オリゴヌクレオチドへの修飾
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一つまたは複数の核酸修飾を含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、例えば、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の核酸修飾を含むことができる。２つ以上の修飾が存在する場合、それらは、同一、異なる、または同一と異なるのいくつかの組み合わせになり得ることに留意されたい。さらに、オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾はすべて一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、両方の鎖は、少なくとも一つの核酸修飾を含む。両方の鎖が少なくとも一つの修飾を含む場合、修飾は、同一、異なる、または同一と異なるのいくつかの組み合わせであってもよい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチド、すなわち、２’－フルオロ修飾を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、２’－フルオロヌクレオチドはすべて一方の鎖内に存在し得る。
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じる得、各２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上の交互パターンにおいて生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンにおいて２’－フルオロ修飾を含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり得、またセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２、３、４、５、または６の２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、少なくとも４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも５つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも６つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、４、５つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センス鎖は、３つまたは４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されるものではないが、センス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも３つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、少なくとも４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置、または相補的な位置に、２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置、または相補的な位置に、２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、または４つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて、３～９位に、２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の２’－ＯＭｅヌクレオチドを含み得る。
オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、２’－ＯＭｅヌクレオチドはすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも一つの２’－ＯＭｅヌクレオチドを含む。２’－ＯＭｅ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、２’－ＯＭｅ修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じる得、各熱的安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上の交互パターンにおいて生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンにおいて２’－ＯＭｅ修飾を含む。センス鎖上の熱的安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の熱的安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－ＯＭｅ修飾の交互パターンに対して相対的な移動がある場合がある。
アンチセンス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、またはそれ以上の２’－ＯＭｅ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の熱的安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの熱的安定化修飾を含む。
例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４および１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４および１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４および１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。さらに一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４および１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。
センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上の２’－ＯＭｅ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、センス鎖内の２’－ＯＭｅ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センスは、５’末端から少なくとも７、１０および１１位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部の他の実施形態では、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０および１１位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のＬＮＡ修飾を含み得る。
オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、ＬＮＡヌクレオチドはすべて一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくともＬＮＡ修飾を含む。ＬＮＡ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ＬＮＡ修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各ＬＮＡ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも、交互パターン内でＬＮＡ修飾を含む。センス鎖上のＬＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上のＬＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
アンチセンス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＬＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内のＬＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＬＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、センス鎖内のＬＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＬＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’－末端から数えて、３～９位に、２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
オリゴヌクレオチドは、架橋核酸（ＢＮＡ）を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のＢＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、ＢＮＡヌクレオチドはすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくともＢＮＡ修飾を含む。ＢＮＡ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ＢＮＡ修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各ＢＮＡ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも、交互パターン内でＢＮＡ修飾を含む。センス鎖上のＢＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上のＢＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
アンチセンス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＢＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内のＢＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＢＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、センス鎖内のＢＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＢＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’－末端から数えて、３～９位に、２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
オリゴヌクレオチドは、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のＣｅＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、ＣｅＮＡヌクレオチドはすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくともＣｅＮＡ修飾を含む。ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも、交互パターン内でＣｅＮＡ修飾を含む。センス鎖上のＣｅＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上のＣｅＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
アンチセンス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＣｅＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内のＣｅＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＣｅＮＡ修飾を含み得る。これに限定されるものではないが、センス鎖内のＣｅＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＣｅＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’－末端から数えて、３～９位に、２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
オリゴヌクレオチドは、熱的安定化修飾を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の熱的安定化修飾を含むことができる。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、熱的安定化修飾はすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、またはそれ以上の熱的安定化修飾を含む。熱的安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチドで生じ得る。例えば、熱的安定化修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各熱的安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも、交互パターン内に熱的安定化修飾を含む。センス鎖上の熱的安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の熱的安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の熱的安定化修飾の交互パターンに対して相対的な移動がある場合がある。
アンチセンス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の熱的安定化修飾を含み得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２、３、４、５、または６つの熱的安定化修飾を含む。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の熱的安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの熱的安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４および１６位に熱的安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、少なくとも４つの熱的安定化修飾を含む。例えば、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４および１６位に熱的安定化修飾を含む。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも５つの熱的安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４および１６位に熱的安定化修飾を含む。さらに一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも６つの熱的安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４および１６位に熱的安定化修飾を含む。
センス鎖は、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の熱的安定化修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、４、または５つの熱的安定化修飾を含む。例えば、センス鎖は、３つまたは４つの熱的安定化修飾を含む。これに限定されるものではないが、センス鎖内の熱的安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも３つの熱的安定化修飾を含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、１０および１１位に熱的安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、少なくとも４つの熱的安定化修飾を含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０および１１位に熱的安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置、または相補的な位置に、熱的安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置、または相補的な位置に、熱的安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、または４つの熱的安定化修飾のブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０、および１１位に熱的安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４、および１６位に熱的安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に熱的安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾としては、これに限定されないが、２’－フルオロ修飾およびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を含むことができる。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチド上で生じ得る。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖で生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じ得、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一または異なり得、またセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対してシフトを有し得る。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドを含むものであって、当該２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対合されるヌクレオチドと連結させるようになされ得る。例えば、少なくとも２、３、４またはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結によって結合され得、随意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対合するヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結が存在し得る。例えば、３つのヌクレオチドの２つがオーバーハングヌクレオチドであり、３番目が、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得る。好ましくは、これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にあり得る。
一部の実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される２～１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の１～１０ブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むアンチセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５または６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３または４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の２つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端位置の１～１０の範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センスおよび／またはアンチセンス鎖の一方の末端または両末端においてホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を介して連結され得る。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、センスおよび／またはアンチセンス鎖各々の二重鎖の内部領域の１～１０の範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドが、センス鎖の５’末端から数えて二重鎖領域の８～１６位にあるホスホロチオエートメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を介して連結され得、当該オリゴヌクレオチドは、随意に、その末端の１～１０位の範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含み得る。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に１～５つを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１８～２３位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１～５位の範囲内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（５’末端から数えて）センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１または２位に一つを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１位に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、（３’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を含む。
一部の例示的なオリゴヌクレオチドでは、センス鎖は、０、１、２、３、または４個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。例えば、センス鎖は、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一部の例示的なオリゴヌクレオチドでは、アンチセンス鎖は、１、２、３、または４個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。例えば、センス鎖は、（３’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。追加の実施例では、アンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間、（３’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、および（３’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、（３’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、および（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。例えば、センス鎖は、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間、（３’末端から数えて）ヌクレオチドの１位と２位の間、および（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
５’－修飾
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’リン酸化され得るか、または５’末端にホスホリル類似体を含み得る。例示的な５’－リン酸修飾としては、ＲＩＳＣ介在性遺伝子サイレンシングと適合性がある修飾が挙げられる。適切な修飾には、以下が含まれる。５’－一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化または非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）、酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’－アルファ－チオ三リン酸、５’－ガンマ－チオ三リン酸など）の任意の追加の組み合わせ、５’－ホスホロアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）。修飾は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に配置され得る。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端に５’－ビニルホスホネートヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、アンチセンスは、５’－Ｅ－ビニルホスファネートを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’－Ｅ－ビニルホスファネートと、同じアンチセンス鎖配列を有するがＮ－１位が未修飾のｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡの活性を低減または阻害するＮ－１位のヌクレオシドと、同じアンチセンス鎖配列を有するがＮ－１位が未修飾のｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡの活性を低減または阻害するＮ－１位のヌクレオシドとを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端に、５’－モルホリノ、５’－ジメチルアミノ、５’－デオキシ、逆脱塩基、または逆脱塩基ロックド核酸修飾を含む。
Ｉｇとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に結合され得る。さらに、リンカーは、鎖の３’末端、５’末端、または両端でコンジュゲートされ得る。例えば、リンカーは、センス鎖にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リンカーは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一部の他の実施形態では、リンカーは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
一般的に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約４０℃～約８０℃の範囲の融解温度を有する。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃の範囲の下限、および約７０℃、７５℃または８０℃の範囲の上限で融解温度を有する。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約５５℃～約７０℃の範囲、または約６０℃～約７５℃の範囲の融解温度を有する。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約５７℃～約６７℃の範囲の融解温度を有する。一部の特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約６０℃～約６７℃の範囲の融解温度を有する。一部の追加の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約６２℃～約６６℃の範囲の融解温度を有する。
理論に束縛されることを望むものではないが、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から２～９位において）の熱的不安定化修飾は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することができる。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二重鎖の少なくとも一つ（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の熱的不安定化修飾を含む。「熱的不安定化修飾」という用語は、そうした修飾を有していないｄｓＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）よりも、好ましくは１度、２度、３度または４度低い、より低い全体的な融解温度（Ｔｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすこととなる修飾を含む。
一部の実施形態では、熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５、６、７、８もしくは９位、または好ましくは４、５、６、７、もしくは８位に位置する。一部の実施形態では、熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。一部の他の実施形態では、熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。一部の特定の実施形態では、熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。
熱的不安定化修飾として、それだけには限らないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば、２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。
例示的な脱塩基修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられ、
Figure 2024515999000012
式中、ＲはＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、またはＯＭｅであり、Ｒ’はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、またはＯＭｅであり、Ｒ”はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、またはＯＭｅであり、＊はＲ、Ｓ、またはラセミのいずれかを表す。
例示的な不安定化糖修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられ、
Figure 2024515999000013
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
追加の糖修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられ、
Figure 2024515999000014
Figure 2024515999000015
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
一部の実施形態では、熱的不安定化修飾は、以下からなる群から選択され：
Figure 2024515999000016
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、また各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す。
用語「非環式ヌクレオチド」は、非環式のリボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えばリボース炭素間の結合（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’、またはＣ１’－Ｏ４’）のいずれかが存在しない、および／またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも一方（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、またはＯ４’）が独立に、もしくは組み合わせて、ヌクレオチドに存在しない。一部の実施形態では、非環式ヌクレオチドは
Figure 2024515999000017
であり、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり、またＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）。「ＵＮＡ」という用語は、糖の結合のいずれかが除去されて、アンロックド「糖」残基を形成するものである、非環式のアンロックド核酸を指す。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーを包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の炭素－酸素－炭素の共有結合）。別の実施例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の炭素－炭素の共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）、およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非環式誘導体は、ワトソン－クリック対合に影響を及ぼすことなく、より大きな骨格柔軟性を与える。非環式ヌクレオチドは、２’－５’または３’－５’連結を介して連結され得る。
「ＧＮＡ」という用語は、グリコール核酸を指し、これはＤＮＡまたはＲＮＡと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なる。
Figure 2024515999000018
二重鎖の熱的不安定化修飾は、熱的不安定化ヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ二重鎖内の対向する鎖内の対向するヌクレオチドとの間のミスマッチ（すなわち、非相補的な塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得、すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ核酸塩基であるミスマッチ対合内の少なくとも一つの核酸塩基を含み、例えば、２’－デオキシ核酸塩基は、センス鎖内にある。
一部の実施形態においては、アンチセンス鎖のシード領域内の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基へのＷ－Ｃ Ｈ結合が損なわれたヌクレオチドを含む。例示的な標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基へのＷ－Ｃ Ｈ結合が損なわれたヌクレオチドとしては、以下から独立して選択される核酸塩基を含むヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2024515999000019
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）およびミスマッチ修飾の追加の例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号に詳細に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
熱的不安定化修飾はまた、対向し合う塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル核酸塩基およびリン酸修飾を含み得る。
一部の実施形態では、熱的不安定化修飾には、非標準塩基を有するヌクレオチド、例えばこれに限定されないが、対向する鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これら核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／００１１８９５号に記載されるように、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的なそのような核酸塩基の修飾としては、以下がある。
Figure 2024515999000020
一部の実施形態では、熱的不安定化修飾としては、標的ｍＲＮＡ上の塩基と相補的である一つまたは複数の□－ヌクレオチドを含み、例えば以下があり：
Figure 2024515999000021
式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである。
天然のホスホジエステル連結と比較して、ｄｓＲＮＡ二重鎖の熱的安定性を低下させることがわかっている例示的なリン酸修飾としては以下のものがあるが、これらに限定されない。
Figure 2024515999000022
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとしては、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
一部の実施形態では、不安定化修飾は、以下から選択される。
Figure 2024515999000023
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位にある、ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位および＋１位にある、安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１位および＋２位にある、少なくとも２つの安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に熱的安定化修飾を含まない。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位の位置にある、ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々に、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位および＋１位の位置に、２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端に、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１位および＋２位に、少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、同一または異なる修飾で修飾され得、該修飾は、非結合性ホスフェート酸素の一つもしくは両方および／または結合性ホスフェート酸素の一つまたは複数の一つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分、例えば、リボース糖上の２’－ヒドロキシルの変更、ホスフェート部分の「脱リン酸化」リンカーでの大規模な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、およびリボースホスフェート主鎖の置換または修飾、の一つまたは複数を含み得る。
核酸はモノマーのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば、塩基またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非結合のＯの修飾である。一部の場合においては、修飾は、核酸中の対象位置のすべてにおいて生じることとなるが、多くの場合、生じることとならない。例として、修飾は、３’末端または５’末端の位置においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内においてのみ生じ得、またはＲＮＡの一本鎖領域内においてのみ生じ得る。例えば、非結合性Ｏ位におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチド内において生じ得、または二本鎖内および一本鎖領域において、特に末端で、生じ得る。５’末端をリン酸化することが可能である。
それにより、例えば、安定性を増強すること、オーバーハング内に特定の塩基を含めること、または一本鎖のオーバーハング内、例えば、５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング内、または両オーバーハング内に、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング内にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態では、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基のすべてまたは一部が、例えば、本明細書において記載する修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびホスフェート基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾、を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同またはオルソロガスである必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら鎖は、２つ以上の修飾を含有し得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの２つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される２つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド、または２’－アラ－Ｆヌクレオチド（２’－ａｒａ－Ｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で修飾される。ここでも、これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特にＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域における、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書で使用する場合、一つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、一本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じる。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチドごとに一つまたは３つのヌクレオチドごとに一つまたは類似のパターンを指し得る。例えばＡ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する一タイプの修飾を表す場合、当該交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
交互モチーフ内に含有されるこのタイプの修飾は、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の一タイプの修飾を表す場合、交互パターンが、すなわち、一つ置きのヌクレオチド上の修飾が、同一であり得るが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々が、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」、または「ＣＤＣＤＣＤ…」などである交互モチーフの範囲内のいくつかの可能性のある修飾から選択され得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖上の交互モチーフのための修飾パターンに対してシフトされているセンス鎖上の交互モチーフのための修飾パターンを含む。当該移動は、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なるように修飾された基に対応するようになされたものであり得、逆もまた同様である。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖内のアンチセンス鎖と対合される場合には、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例としては、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖間の修飾パターンの完全な移動または部分的な移動が存在する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的との、二重鎖内のミスマッチまたはそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択され得るアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば、非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二重鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖内の５’末端から二重鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
理論に束縛されることを望むものではないが、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドの任意の位置において、ジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）および／またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）連結の３’末端に、４’－修飾または５’－修飾のヌクレオチドを導入することで、ヌクレオチド間連結に対する立体効果を発揮させ得、それによってヌクレアーゼに対してそれを保護または安定化させるということがわかった。
一部の実施形態では、５’－修飾ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドを、ｄｓＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の５’位にあるアルキル基は、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－修飾ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドを、ｄｓＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’位にあるアルキル基は、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、５’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。４’－アルキルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－５’連結（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、またＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’－５’連結修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。一部の実施形態では、センス鎖は、５’－末端から数えて、位置Ｎ－１とＮ－２との間の２’－５’－連結を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｌ糖（例えば、Ｌリボース、２’－Ｈ、２’－ＯＨ、および２’－ＯＭｅを有するＬ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端にＬ糖ヌクレオチドを含む。
方法
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。例えば、標的ＲＮＡを修飾するための方法が本明細書に提供される。概して、方法は、標的分子を、（ａ）本明細書に記載のポリペプチドおよび本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触させること、または（ｂ）本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと複合体化された本明細書に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分（例えば、１５～３０ヌクレオチド長）は、標的配列に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの当該部分は、標的配列とのミスマッチ（例えば、Ａ：Ｃミスマッチ）を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、標的配列のＡに相補的な位置にＣを含む。
標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない、任意の所望のＲＮＡ分子であり得る。一部の好ましい実施形態では、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、疾患または障害に関連する配列を含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、疾患または障害に関連する点変異を含む。例えば、標的ＲＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＧ－＞Ａ点変異を含む。別の例では、標的ＲＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＣ－＞Ｔ点変異を含む。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、タンパク質をコードし、点変異は、コドン内にあり、野生型コドンと比較して、変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの修飾は、変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの修飾は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。一部の実施形態では、疾患または障害が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ性浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性小児神経皮膚症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異ＰＩ３ＫＣＡタンパク質、変異ＣＴＮＮＢ１タンパク質、変異ＨＲＡＳタンパク質、または変異ｐ５３タンパク質に関連する新生物疾患を含む。
一部の実施形態では、接触は、インビトロである。一部の他の実施形態では、接触は、対象においてインビボである。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害を有するか、または疾患または障害と診断されている。
本明細書に記載される方法を使用して、点変異を標的ＲＮＡに導入することもできる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの修飾は、例えば、遺伝子産物の機能喪失につながる点変異の補正において、遺伝的欠陥の補正をもたらす。一部の実施形態では、遺伝的欠陥は、疾患もしくは障害、例えば、リソソーム蓄積障害または代謝疾患、例えば、Ｉ型糖尿病に関連する。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患または障害に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子または対立遺伝子に、不活性化点変異を導入するために使用される。例えば、本明細書に記載される方法を使用して、（例えば、増殖性疾患の治療において）発癌遺伝子ｍＲＮＡに不活性化点変異を導入することができる。一部の実施形態では、不活性化変異は、コード配列に未成熟停止コドンを生成してもよく、これは、切断遺伝子産物、例えば、全長タンパク質の機能を欠く切断タンパク質の発現をもたらす。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。当業者であれば、遺伝子コードの縮重に起因して、所与のポリペプチドが、異なるポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解するであろう。これらの「バリアント」は、本明細書に包含される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、ベクターに動作可能に連結される。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、ベクターはウイルスまたは非ウイルスであり得る。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連付けられた場合に複製でき、遺伝子配列を細胞に伝達できる任意の遺伝子要素を包含する。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ得るが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ベクターは組み換え型であり、例えば、少なくとも２つの異なる源に由来する配列を含む。いずれかの態様の一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる種に由来する配列を含む。いずれかの態様の一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる遺伝子に由来する配列を含み、例えば、融合タンパク質、または少なくとも一つの非天然（例えば、異種）遺伝子制御要素（例えば、プロモーター、サプレッサー、アクチベーター、エンハンサー、応答要素など）に動作可能に連結された発現産物をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターまたはポリヌクレオチドは、コドン最適化され、例えば、核酸配列の天然または野生型配列は、改変または操作されて、改変または操作された核酸が、天然／野生型配列と同じポリペプチド発現産物をコードするが、所望の発現システムにおいて改善された効率で転写および／または翻訳されるように、代替的なコドンを含む。一部の実施形態では、発現システムは、天然／野生型配列（またはかかる生物から得られた細胞）の供給源以外の生物である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターおよび／または核酸配列は、哺乳類または哺乳類細胞、例えばマウス、マウス細胞、またはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターおよび／または核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターおよび／または核酸配列は、酵母または酵母細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターおよび／または核酸配列は、細菌細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターおよび／または核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における発現のためにコドン最適化される。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写制御配列に連結された配列からＲＮＡまたはポリペプチドの発現を方向付けるベクターを指す。発現される配列は、多くの場合、細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有してもよく、したがって、例えば、発現のためにヒト細胞で、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主でなど、２つの生物で維持することを可能にする。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも一つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有し得る。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞に導入する目的で利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが当該技術分野で公知である。
細胞
本開示はまた、本明細書に記載のポリペプチドを含む細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、または本明細書に記載されるプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、単一の細胞ならびに（すなわち、２つ以上の）細胞の集団を指す。一部の実施形態では、細胞はまた、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
宿主細胞は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞であり得る。例示的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物（昆虫を含む）、またはヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、本明細書に記載されるポリペプチドを産生する方法で採用することができる。概して、方法は、抗体またはその抗原結合断片が発現されるような条件下で、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは本明細書に記載されるプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞を培養することと、任意で、培養培地からポリペプチドを回収することと、を含む。ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片と細胞培養培地中の他の物質との間のサイズ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性などの差異を利用する方法を含む、様々な生化学的およびクロマトグラフィー的方法によって濃縮および精製することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
本明細書に記載されるポリペプチドは、細菌、酵母、植物、動物（昆虫を含む）もしくはヒト細胞株などの原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞、またはトランスジェニック動物において組み換え分子として産生され得る。好適な宿主細胞へのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの導入を通してポリペプチドを生成する組み換え方法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ，Ｖｏｌｓ １－８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ ３５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ（１９９４）などに記載されており、その両方の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
キット
本明細書に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、キット内に、例えば、キットの構成要素として提供され得る。例えば、キットは、（ａ）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および任意で（ｂ）情報資料を含む。一部の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドをさらに含む。
情報資料は、本明細書に記載される方法、および／または本明細書に記載される方法のための本明細書に記載されるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの使用に関する、説明、指導、マーケティング、または他の資料であり得る。キットの情報資料の形態は限定されない。一部の実施形態では、情報資料は、抗体、抗原結合断片、または抗体もしくは抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの産生、それらの分子量、濃度、使用期限、バッチ、または産生部位情報などに関する情報を含み得る。一部の実施形態では、情報資料は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、障害および状態を治療、予防、または診断することに関する。
一部の実施形態では、情報資料は、例えば、好適な用量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載の用量、剤形、または投与様式）で、本明細書に記載の方法を実施するのに好適な様式でポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与するための指示を含み得る。別の実施形態では、情報資料は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、好適な対象、例えば、ヒト、例えば、治療を必要とする障害または状態を有する、または治療を必要とする障害または状態のリスクがあるヒトに投与する指示を含み得る。
キットの情報資料の形態は限定されない。多くの場合、情報資料、例えば、命令は、印刷で提供されるが、コンピュータ可読材料などの他の形式であってもよい。
キットの構成要素、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、任意の形態、例えば、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供され得る。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、実質的に純粋および／または滅菌であることが好ましい。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドが液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液が好ましい。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドが乾燥形態として提供される場合、再構成は概して、好適な溶媒の添加によるものである。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液は、キット内に任意に提供され得る。
キットは、キットの構成要素のための一つまたは複数の容器を含み得る。一部の実施形態では、キットは、キットの異なる構成要素のための別個の容器、仕切り、または区画を含む。例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、ボトル、バイアル、またはシリンジに収容してもよく、情報資料は、容器と関連付けて収容してもよい。他の実施形態では、キットの別個の要素は、単一の分割されていない容器内に収容される。例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、ラベルの形態で情報資料が取り付けられたボトル、バイアル、またはシリンジに収容される。一部の実施形態では、キットは、各々がポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの一つまたは複数の単位剤形を含有する、複数の（例えば、パック）個々の容器を含む。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含み、各々が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの単一単位用量を含有する。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分または蒸発の変化に対して不透過性）、および／または遮光性であってもよい。
キットは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの投与に適したデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、スポイト（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブまたは木製スワブ）、または任意のこのような送達デバイスを任意に含む。一部の実施形態では、デバイスは、計量された用量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを分注する移植可能なデバイスである。本開示はまた、例えば、本明細書に記載の構成要素を組み合わせることによって、キットを提供する方法を特徴とする。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを使用して、本明細書に記載の方法を実施するための追加の成分および／または試薬をさらに含み得る。
組成物
本明細書に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、組成物中に製剤化され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、治療用途のための医薬組成物に製剤化することができる。したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容可能な組成物は、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドのうちの一つまたは複数を単独で、または一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に製剤化して含む。
医薬組成物は、固体形態または液体形態で投与するために特別に製剤化することができ、以下に適合されたものを含む：（１）経口投与、例えば、飲薬（水溶液または非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、および全身吸収を対象としたもの、丸薬、粉末、顆粒、舌に塗布するためのペースト、（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤、（３）局所適用、例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏、または徐放性のパッチもしくはスプレー、（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリームまたはフォーム、（５）舌下、（６）眼から、（７）経皮的、または（８）鼻から。皮下または静脈内方法を使用した送達は、特に有利であり得る。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、任意の治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で、動物における細胞の少なくとも亜集団において何らかの望ましい治療効果をもたらすのに有効な、本明細書に記載のコンジュゲートを含む化合物、材料、または組成物の量を意味する。
語句「薬学的に許容可能な」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的な利益／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適であるそれら化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
語句「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書において使用する場合、一つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分への主題化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクルであって、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料など、を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であり、かつ患者に対して有害であってはならないという意味において「許容可能な」ものでなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖類、例えば乳糖、グルコースおよびショ糖など、（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど、（３）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど、（４）トラガカント末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）潤滑剤、例えばマグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど、（８）賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックスなど、（９）オイル、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブオイル、トウモロコシ油およびダイズ油など、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコールなど、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど、（１５）アルギニン酸、（１６）発熱因子なしの水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物、（２２）充填剤、例えばポリペプチド、およびアミノ酸など、（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなど、ならびに（２２）医薬品製剤に採用される他の非毒性の適合性物質。
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、医薬投与に適合性の、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物におけるそれらの使用は意図される。補足的な有効成分もまた組成物に組み込まれ得る。医薬担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
製剤は、単位剤形で好都合に提示することができ、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製することができる。担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる有効成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせられ得る有効成分の量は、概して、治療効果を生成する化合物の量である。概して、１００パーセントのうち、この量は、有効成分の約０．１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約５パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント～約３０パーセントの範囲である。
本明細書に記載の方法で使用するための医薬組成物は、一つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、例えば、エアロゾル、静脈内、経口、または局所経路による投与のために製剤化され得る。組成物は、病変内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内注射、注入、リポソーム媒介送達、局所、くも膜下腔内、歯肉ポケット、直腸、気管支内、鼻腔、経粘膜、腸、経口、眼、または耳への送達用に製剤化され得る。
技術および製剤は、一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射のために、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、液体溶液、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中で製剤化することができる。さらに、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、固体形態で製剤化され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も含まれる。
経口投与については、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製された、例えば、錠剤またはカプセルなどの形態を取ることができる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができ、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示され得る。こうした液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、薬学的に許容可能な油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸塩またはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有し得る。
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御された放出をもたらすように好適に製剤化され得る。頬側投与については、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。吸入による投与については、本明細書に記載の使用のための化合物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。吸入器または送気装置で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、例えば、アンプルまたは複数回投与容器など、防腐剤を添加した単位剤形で提示することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。
前述した製剤に加えて、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドはまた、デポ調製物として製剤化され得る。こうした長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、抗体は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段による場合もある。経粘膜または経皮投与については、浸透させるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。こうした浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用の胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、界面活性剤を使用して浸透を促進することができる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して行うことができる。局所投与については、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で一般的に知られている軟膏、サルベ、ゲル、またはクリームに製剤化され得る。洗浄溶液は、治癒を加速するために、損傷または炎症を治療するために局所的に使用することができる。
組成物は、所望される場合、有効成分を含有する一つまたは複数の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサー装置に提示され得る。パックは、例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書を添付してもよい。
リポソームおよび脂質製剤
本明細書に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドは、膜分子アセンブリ、例えば、リポソームまたはミセルにおける送達のために製剤化され得る。本明細書において使用する場合、用語「リポソーム」は、少なくとも一つの二分子層、例えば、一つの二分子層または複数の二分子層内に整列した両親媒性脂質で構成されたベシクルを指す。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性の内部とを有する単層膜および多重膜のベシクルを含む。水性部分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを含有する。親油性材料は、典型的にはポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを含まないが、一部の実施例では含む場合もある水性の外側部分から、水性の内側部分を隔離する。リポソームは、作用部位への有効成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用されるとリポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む内部水性内容物が細胞内に送達される。場合によっては、リポソームはまた、例えば、コンジュゲートを特定の細胞種に誘導するために、特異的に標的とされる。
本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含有するリポソームは、様々な方法によって調製することができる。一実施例では、リポソームの脂質成分が界面活性剤に溶解され、それによって脂質成分でミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得、また非イオン性であり得る。例示的な界面活性剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを、脂質成分を含むミセルに添加する。凝縮後、界面活性剤は、リポソーム調製物を得るために、例えば、透析などによって、除去される。
必要であれば、凝集反応の際に、例えば、制御された添加によって、凝集を補助する担体化合物を加えることもできる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）。ｐＨはまた、縮重に都合よく調節可能である。
送達ビヒクルの構造的な成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込んだ安定なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達ビヒクルを産生する方法のさらなる説明が、例えば、国際公開第９６／３７１９４号に記載される。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号、米国特許第５，１７１，６７８号、Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５、Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の一つまたは複数の態様を含むことができ、これらは参照によりその全体が組み込まれる。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズの脂質凝集体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理および凍結融解＋押出が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が組み込まれる）。マイクロ流体化は、一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が望ましい場合に使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が組み込まれる）。
ｐＨ感応性であるかまたは負に帯電しているリポソームは、核酸分子と複合体化するのではなく、核酸分子を捕捉する。核酸分子および脂質の両方が、同様の電荷であるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、一部の核酸分子は、これらリポソームの水性内側部分内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、培養液中の細胞単一層に送達するために、ｐＨ感応性リポソームが使用され てきた。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子内において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）２６９－２７４を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が組み込まれる）。
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成され、例えばダイズ製ＰＣおよび卵製ＰＣなどである。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロでリポソームを細胞に導入するための他の方法の例には、米国特許第５，２８３，１８５号、米国特許第５，１７１，６７８号、国際公開第９４／００５６９号、国際公開第９３／２４６４０号、国際公開第９１／１６０２４号、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
一部の実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること、リポソームは広範囲の水および脂質溶解性薬物を組み込むことができること、リポソームはそれらの内部コンパートメント内のカプセル化されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを代謝および分解から保護することができること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。
正に荷電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に荷電した脂質と融合することができる脂質－核酸複合体を形成する小さなリポソームを形成することができる。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用することにより、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成することができる。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、生組織培養細胞内へのアニオン性の核酸の高度な送達に有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームを使用すると、結果として得られる複合体上の正味電荷も正である。この方法において調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に結合し、原形質膜と融合して、機能的核酸を、例えば組織培養細胞内へと効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナポリス、インディアナ州）は、オレオイル部分が、エーテル連結ではなくエステルで連結している点がＤＯＴＭＡと異なる。
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、様々な部分にコンジュゲートしているものが挙げられ、例えば２つのタイプの脂質の一方にコンジュゲートしているカルボキシスペルミンなどが挙げられ、また例えば５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム中へと製剤化されているコレステロールでの脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１）を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに効果的であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が組み込まれる）。特定の細胞系の場合、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含むこれらリポソームは、低い毒性を示すと言われており、またＤＯＴＭＡ含有組成物よりもより効率的なトランスフェクションをもたらす。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ社、ラホヤ、カリフォルニア州）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号および国際公開第９６／３７１９４号に記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に勝るいくつかの利点をもたらす。こうした利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、ならびにポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを上皮細胞に送達するために、ならびにポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を増強するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達が報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６，１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３、Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照されたい。当該文献は、参照によりその全体が組み込まれる）。
非イオン性リポソームシステムは、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムは、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。マウスの皮膚の真皮内に薬物を送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。
本明細書に記載されるコンジュゲートを含むリポソームは、高度に変形可能にすることができる。こうした変形能は、リポソームがリポソームの平均半径より小さい孔を通って浸透することを可能にする。例えば、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なタイプのリポソームである。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤、を標準のリポソーム組成物に加えることによって作製することができる。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドを含むトランスファーソームは、例えば、感染によって皮下に送達され得る。脂質ベシクルは、インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。加えて、脂質特性に起因して、これらトランスファーソームは、自己最適性（例えば、皮膚などにおいて、孔の形状に順応性のある）で、自己修復性であり得、ならびに断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達することができ、また多くの場合、自己負荷性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に従う他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮出願第６１／０１８，６１６号、２００８年１月２日に出願された第６１／０１８，６１１号、２００８年３月２６日に出願された第６１／０３９，７４８号、２００８年４月２２日に出願された第６１／０４７，０８７号、および２００８年５月８日に出願された第６１／０５１，５２８号に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号にも、本発明に従う製剤が記載されている。
界面活性剤。界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記参照）などの製剤において、広い応用が見い出される。コンジュゲート製剤は、界面活性剤を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤化される。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最もよくある手法としては、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用するものがある。親水性基の性質が、製剤中で使用される様々な界面活性剤を分類するのに最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品において広い応用が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルが挙げられる。例えば脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールおよびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどである非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も普及した要素である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、例えばセッケンなどであるカルボン酸エステル、アシル乳酸エステル、アミノ酸のアシルアミド、例えばアルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなどである硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステルなどであるスルホン酸エステル、アシルイセチオン酸エステル、アシルタウリン酸塩、およびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が挙げられる。アニオン性剤のクラスの最も重要な要素は、アルキル硫酸エステルおよびセッケンである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される要素である。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
ミセルおよびその他の膜製剤。本明細書に記載されるコンジュゲートを含む製剤は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、本明細書においては、分子のすべての疎水性部分が内側に向くように両親媒性分子が球状構造で整列され、それによって親水性部分が周囲の水相に接触したままになる、特定のタイプの分子アセンブリとして定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置で存在する。
経皮的な膜を通る送達に好適な混合ミセル製剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの水溶液と、アルカリ金属のＣ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物とを混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリジサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ ｏｘｏ ｃｈｏｌａｎｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ）およびその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、デオキシコール酸塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属のアルキル硫酸塩と同時に加えてもよく、またはそれらを加えた後に加えてもよい。混合ミセルは、原材料の、実質的に任意の種類の混合によって形成されることとなるが、より小さいサイズのミセルを提供するために激しい混合によって形成されることとなる。
一方法では、本明細書に記載のコンジュゲートと少なくともアルカリ金属のアルキル硫酸塩とを含む第一のミセル組成物が調製される。次いで、第一のミセル組成物を、少なくとも３種のミセル形成化合物と混合し、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル組成物は、本明細書に記載のコンジュゲートとアルカリ金属のアルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物のうちの少なくとも一つとを混合して、その後に激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
製剤を安定化させるため、および細菌増殖から保護するために、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを、ミセル形成原材料と共に加えてもよい。グリセリンなどの等張剤を、混合ミセル組成物の形成後に加えてもよい。
ミセル製剤を噴霧剤として送達する場合には、当該製剤を、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、そしてディスペンサーには、噴射剤が装填される。噴射剤は、加圧されており、ディスペンサー中では液体状態である。原材料の比率は、水相および噴射剤の相が一つになるように、すなわち、一相で存在するように、調節される。二相で存在する場合には、例えば、計量弁などによって、内容物の一部を噴出する前に、ディスペンサーを振る必要がある。医薬品の分配用量が、微細な噴霧で計量弁から射出される。
噴射剤は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。
必須の原材料の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔による吸収の場合には、注射でのまたは胃腸管経由の投与のための投与量を、例えば、少なくとも二倍または三倍に、増加させることが望ましいことが多い。
粒子。一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、粒子、例えば、マイクロ粒子に組み込まれ得る。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせなどの他の方法によっても製造され得る。
様々な態様の例示的な実施形態は、以下の番号付けされた実施形態のうちの一つまたは複数によって説明され得る。
実施形態１：
標的ＲＮＡを修飾するためのシステムであって、以下：
（ａ）ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、
（ｉ）ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む第一のドメインであって、ＲＮＡ修飾酵素がヌクレアーゼではない、第一のドメインと、
（ｉｉ）アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質のＭＩＤドメインを含む第二のドメインと
を含む、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸、および
（ｂ）任意で二本鎖であり、少なくとも１７塩基対の二本鎖領域を含む、オリゴヌクレオチド
を含む、システム。
実施形態２：
第二のドメインが、ＡｇｏのＰＡＺドメインをさらに含む、実施形態１に記載のシステム。
実施形態３：
第二のドメインが、ＡｇｏのＰＩＷＩドメインをさらに含む、実施形態１～２のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態４：
ＰＩＷＩドメインが、ヌクレアーゼ活性を欠く、実施形態３に記載のシステム。
実施形態５：
Ａｇｏが、哺乳類Ａｇｏである、実施形態１～４のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態６：
Ａｇｏが、ヒトＡｇｏである、実施形態１～５のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態７：
Ａｇｏが、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４である、実施形態１～６のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態８：
第二のドメインが、
ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列のＤ５９７およびＤ６９９からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態９：
第二のドメインが、
ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列のＤ５９７ＡおよびＤ６９９Ａからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１０：
ＲＮＡ修飾酵素が、ＲＮＡデアミナーゼ、ＲＮＡメチラーゼ、またはＲＮＡデメチラーゼである、実施形態１～９のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１１：
ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインが、ＲＮＡデアミナーゼのデアミナーゼドメインである、実施形態１～１０のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１２：
ＲＮＡデアミナーゼが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）またはシチジンデアミナーゼである、実施形態１１に記載のシステム。
実施形態１３：
ＡＤＡＲが、哺乳類ＡＤＡＲである、実施形態１３に記載のシステム。
実施形態１４：
ＡＤＡＲが、ヒトＡＤＡＲである、実施形態１２または１３に記載のシステム。
実施形態１５：
ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ３である、実施形態１２～１４のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１６：
第一のドメインが、
ヒトＡＤＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）アミノ酸配列のＴ３７５、Ｅ４４８およびＥ４８８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１７：
第一のドメインが、
ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ３７５Ｑ、Ｅ４４８ＱおよびＥ４８８Ｑからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態１８：
シチジンデアミナーゼが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）である、実施形態１２に記載のシステム。
実施形態１９：
シチジンデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４からなる群から選択される、実施形態１８に記載のシステム。
実施形態２０：
第一のドメインが、
ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ３３９、Ｒ３４８、Ａ３５３、Ｖ３５１、Ｖ３５５、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｓ３９７、Ｅ４３８、Ｆ４４２、Ｈ４４３、Ｌ４４４、Ｙ４４５、Ｔ４４８、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｓ４８６、Ｑ４８８、Ｒ５１０、Ｉ５２０、Ｖ５２５、Ｐ５３９、Ｇ５９３、Ｋ５９４およびＥ１００８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２１：
第一のドメインが、
ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ３５１、Ｓ３７０、Ｔ３７５、Ｐ４６２、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｎ５９７およびＥ１００８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態２０に記載のシステム。
実施形態２２：
第一のドメインが、
ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ３５１Ｇ、Ｓ３７０Ｃ、Ｔ３７５Ｓ、Ｐ４６２Ａ、Ｓ４８６Ａ、Ｅ４８８Ｑ、Ｎ５９７ＩおよびＥ１００８Ｑからなる群から選択される一つもしくは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含む、実施形態２１に記載のシステム。
実施形態２３：
第一のドメインが、
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａアミノ酸配列の位置Ｙ１３２、または相同もしくはオルソロガスＡＰＯＢＥＣタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
を含み、任意で、変異が、Ｙ１３２ＲまたはＹ１３２Ｄである、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２４：
ポリペプチドが、第一のドメインと第二のドメインとの間にリンカーを含む、実施形態１～２３のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２５：
ポリペプチドが、核輸送シグナル（ＮＥＳ）配列をさらに含む、実施形態１～２４のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２６：
ＮＥＳ配列が、第一のドメインと第二のドメインとの間に位置する、実施形態２５に記載のシステム。
実施形態２７：
ポリペプチドが、ＦＬＡＧオクタペプチドをさらに含む、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２８：
ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性を欠く、実施形態１～２７のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態２９：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも一つの３’一本鎖オーバーハングを含む、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３０：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、平滑末端を含む、実施形態１～２９のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３１：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖を含み、第一および第二の鎖が独立して、少なくとも１９ヌクレオチドの長さである、実施形態１～３０のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３２：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３３：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、実施形態１～３２のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３４：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、当該鎖が、当該鎖の５’末端から数えて、１０位に、標的ＲＮＡとのミスマッチを含む、実施形態１～３３のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３５：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、当該鎖が、当該鎖の５’末端から数えて、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８位に、Ｃを含み、当該鎖が、当該鎖の５’末端から数えて、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８位に、標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、実施形態１～３４のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３６：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、当該鎖が、当該鎖の５’末端から数えて、２５位に、Ｃを含み、当該鎖が、当該鎖の５’末端から数えて、２５位に、標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、実施形態１～３５のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３７：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、当該鎖が、当該鎖の３’末端から数えて、４、５、６、７、８、９、または１０位に、Ｃを含み、当該鎖が、当該鎖の３’末端から数えて、４、５、６、７、８、９、または１０位に、標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、実施形態１～３６のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３８：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、当該鎖が、当該鎖の３’末端から数えて、７位に、Ｃを含み、当該鎖が、当該鎖の３’末端から数えて、７位に、標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、実施形態１～３７のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３９：
オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの核酸修飾を含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態３９：
オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉切断を阻害することができる少なくとも一つの核酸修飾を含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態４０：
実施形態１～２８のいずれか一つに記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
を含む、キット。
実施形態４１：
キットが、実施形態２９～３９のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４０に記載のキット。
実施形態４２：
実施形態１～２８のいずれか一つに記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
を含む、組成物。
実施形態４３：
組成物が、実施形態２９～３９のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４２に記載の組成物。
実施形態４４：
実施形態１～２８のいずれか一つに記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
を含む、細胞。
実施形態４５：
細胞が、実施形態２８～３９のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４４に記載の細胞。
実施形態４６：
標的ＲＮＡを修飾する方法であって、標的ＲＮＡを実施形態１～３９のいずれか一つに記載のシステムと接触させる工程を含む、方法。
実施形態４７：
ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８：
ＲＮＡが、細胞内にある、実施形態４６または４７に記載の方法。
実施形態４９：
該接触させる工程が、インビトロである、実施形態４６～４８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５０：
該接触させる工程が、インビボである、実施形態４６～４９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５１：
当該標的ＲＮＡを修飾することが、標的ＲＮＡ中のアデノシンの脱アミノ化を含む、実施形態４６～５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５２：
当該標的ＲＮＡを修飾することが、標的ＲＮＡ中のシチジンの脱アミノ化を含む、実施形態４６～５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５３：
当該標的ＲＮＡを修飾することが、標的ＲＮＡ中のアデノシンのメチル化を含む、実施形態４６～５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５４：
当該標的ＲＮＡを修飾することが、標的ＲＮＡ中のアデノシンの脱メチル化を含む、実施形態４６～５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５５：
実施形態４６～５４のいずれか一つによって修飾されたＲＮＡを含む、細胞。
実施形態５６：
オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、標的ＲＮＡが、当該鎖にハイブリダイズされたときにループ構造を形成し、当該ループ構造が、一本鎖Ｃヌクレオチドを含む、実施形態１～３３のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態５７：
当該ループ構造が、５～２０のヌクレオチドの長さである、実施形態５６に記載のシステム。
実施形態５８：
当該一本鎖Ｃヌクレオチドが、ループ構造の５’末端から数えて、６、７、８、９、１０、１１、１２位にある、実施形態５６または５７に記載のシステム。
実施形態５９：
当該ループ構造がヘアピンの形態であり、当該Ｃヌクレオチドがヘアピンの一本鎖領域に存在する、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態６０：
当該ループ構造が、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の３’末端または５’末端から数えて、８、９、１０、１１、１２、または１３位の反対側の位置にある、（例えば、当該ループ構造が、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する当該鎖の５’末端から数えて８、９、１０、１１、１２、または１３位の反対側の位置にある）、実施形態５６～５９のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態６１：
オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの核酸修飾を含む、実施形態５６～６０のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態６２：
オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉切断を阻害することができる少なくとも一つの核酸修飾を含む、実施形態５６～６１のいずれか一つに記載のシステム。
実施形態６３：
実施形態５６～６２のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４０に記載のキット。
実施形態６４：
実施形態５６～６２のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４２に記載の組成物。
実施形態６５：
実施形態５６～６２のいずれか一つに記載の核酸をさらに含む、実施形態４４に記載の細胞。
実施形態６６：
標的ＲＮＡを修飾する方法であって、標的ＲＮＡを実施形態５６～６２のいずれか一つに記載のシステムと接触させる工程を含む、方法。
実施形態６７：
ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８：
ＲＮＡが、細胞内にある、実施形態６６または６７に記載の方法。
実施形態６９：
該接触させる工程が、インビトロである、実施形態６６～６８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７０：
該接触させる工程が、インビボである、実施形態６６～６９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７１：
当該標的ＲＮＡを修飾することが、標的ＲＮＡ中のシチジンの脱アミノ化を含む、実施形態４６～５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７２：
実施形態６６～７１のいずれか一つによって修飾されたＲＮＡを含む、細胞。
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。別段の記載がない限り、または文脈から暗示されない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は特定の実施形態の説明を助けるために提供され、特許請求の範囲に記載された本発明を限定することを意図するものではない。別段の定義がない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野での用語の使用と本明細書に提供されるその定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内に提供される定義が優先するものとする。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語を、ここに集める。
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、「低減する」、「低減」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には、基準レベル（例えば、所与の治療または薬剤の非存在）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上の減少を含むことができる。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害または低減を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較して１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体に対して正常範囲内として受け入れられるレベルまでの低下であり得る。
「増加した」、「増加する」、「強化する」、または「活性化する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、用語「増加した」、「増加する」、「強化する」、「または活性化する」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％までの増加、もしくは１０～１００％の間の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、もしくは２倍～１０倍以上の間の任意の増加を意味することができる。マーカーまたは症状の文脈では、「増加する」とは、そのようなレベルの統計学的に有意な増加である。
本明細書で使用される場合、「対象」とは、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、家ネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、マス、ナマズ、およびサケが挙げられる。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語、「個人」、「患者」、および「対象」は、本明細書では互換的に使用される。
対象は哺乳類であることが好ましい。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患または障害の動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。対象は、男性または女性とすることができる。
対象は、以前に、治療を必要とする状態を罹患しているか、または有していると診断されたか、または特定されている対象であり得る。あるいは、対象は、以前に診断されていない対象であってもよい。特定の状態について検査を「必要とする対象」は、その状態を有する対象、その状態を有すると診断される対象、またはその状態を発症するリスクがある対象であり得る。
「治療する」、「治療すること」、または「～の治療」という用語（およびその文法的変形）によって、対象の状態の重症度が低減され、少なくとも部分的に改善もしくは安定化され、および／または少なくとも一つの臨床症状におけるいくらかの軽減、緩和、減少、もしくは安定化が達成され、および／または疾患もしくは障害の進行に遅延が生じることを意味する。
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびその文法的変形）は、対象における疾患、障害、および／または臨床症状の発症の予防および／または遅延、ならびに／または本発明の方法の非存在下で起こるであろうことと比較して、疾患、障害、および／または臨床症状の発症の重症度の低減を指す。予防は、完全なもの、例えば、疾患、障害、および／または臨床症状の完全欠如であり得る。予防はまた、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で起こるであろうものよりも小さくなるように、部分的であってもよい。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合された、一連のアミノ酸残基を指定するために互換的に使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関わらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関してしばしば使用され、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関してしばしば使用されるが、当該技術分野でのこれらの用語の使用は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片に言及する場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片、および前述の他の等価物、バリアント、断片、および類似体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「野生型」、または「ｗｔ」、または「ＷＴ」、または「天然」という用語は、対立遺伝子変異を含む自然界に存在するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。野生型タンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本明細書に記載される様々な実施形態では、記載される特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在するか否か）、対立遺伝子、相同体、保存的に修飾されたバリアント、および／または保存的に置換されたバリアントが包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされた配列中の単一アミノ酸またはアミノ酸のわずかな割合を変化させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であり、改変は、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持することを認識するであろう。かかる保存的に修飾されたバリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子に加えてあり、それらを除外しない。
「アミノ酸置換」という用語は、所定のアミノ酸配列または天然アミノ酸配列における少なくとも一つの既存のアミノ酸残基を、異なる「置換」アミノ酸で置換することを指す。所与のアミノ酸は、例えば、一つの脂肪族残基を別の脂肪族残基と置換する（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａを互いに）、または一つの極性残基を別の極性残基と置換する（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間）など、類似の生理化学的特徴を有する残基によって置換することができる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換は周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを試験して、天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの所望の活性および特異性が保持されることを確認することができる。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。特定の保存的置換としては、例えば、ＡｌａのＧｌｙ内またはＳｅｒ内；ＡｒｇのＬｙｓ内；ＡｓｎのＧｌｎ内またはＨｉｓ内；ＡｓｐのＧｌｕ内；ＣｙｓのＳｅｒ内；ＧｌｎのＡｓｎ内；ＧｌｕのＡｓｐ内；ＧｌｙのＡｌａ内またはＰｒｏ内；ＨｉｓのＡｓｎ内またはＧｌｎ内；ＩｌｅのＬｅｕ内またはＶａｌ内；ＬｅｕのＩｌｅ内またはＶａｌ内；ＬｙｓのＡｒｇ内、Ｇｌｎ内またはＧｌｕ内；ＭｅｔのＬｅｕ内、Ｔｙｒ内またはＩｌｅ内；ＰｈｅのＭｅｔ内、Ｌｅｕ内またはＴｙｒ内；ＳｅｒのＴｈｒ内；ＴｈｒのＳｅｒ内；ＴｒｐのＴｙｒ内；ＴｙｒのＴｒｐ内；および／またはＰｈｅのＶａｌ内、Ｉｌｅ内またはＬｅｕ内への置換が挙げられる。
「アミノ酸挿入」という用語は、所定のアミノ酸配列または天然アミノ酸配列への一つまたは複数の追加のアミノ酸の挿入を指す。挿入は、１、２、３、４、５、または最大２０のアミノ酸残基であり得る。
「アミノ酸欠失」という用語は、所定のアミノ酸配列または天然アミノ酸配列から少なくとも一つのアミノ酸を除去することを指す。欠失は、１、２、３、４、５、または最大２０のアミノ酸残基であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（またはかかるポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のうちの一つの機能的断片であってもよい。本明細書で使用される場合、「機能性断片」は、本明細書に記載されるアッセイに従って、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持するポリペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載の配列のバリアントであってもよい。一部の実施形態では、バリアントは、保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、天然ヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書で言及される「バリアント」は、天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同またはオルソロガスなポリペプチドであるが、一つまたは複数の欠失、挿入、または置換のために天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有する。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然ＤＮＡ配列または参照ＤＮＡ配列と比較して、ヌクレオチドの一つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持するバリアントタンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。多種多様なＰＣＲベースの部位特異的変異誘発アプローチが当該技術分野で公知であり、当業者によって、人工バリアントを生成および試験するために適用され得る。
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。「核酸」という用語は、遺伝子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、およびｍＲＮＡと互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、および合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。特に限定されない限り、この用語は、天然核酸と類似の結合を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に限定されない限り、特定のヌクレオチド配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換を含有するもの）および相補的配列、ならびに具体的に記載される配列を包含する。
ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖領域、混合一本鎖または二本鎖領域から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する三本鎖領域であってもよい。修飾ポリヌクレオチドは、トリチル化塩基などの修飾塩基、またはイノシンなどの異常な塩基を含む。ＲＮＡおよびＤＮＡに様々な修飾を行うことができる。したがって、ポリヌクレオチドは化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を含む。
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書に提供されるコード配列と同一であってもよく、または異なるコード配列であってもよく、その配列は、遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として、本明細書に提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする。
バリアントＤＮＡまたはアミノ酸配列は、天然配列または参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上同一であり得る。天然配列と変異配列との間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、全世界ウェブ上でこの目的のために一般的に採用される自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、初期設定を伴うＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎ）を使用して、２つの配列を比較することによって決定することができる。
本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、または細胞は、操作され得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの少なくとも一つの態様、例えば、その配列が、自然界に存在する態様とは異なるように人の手によって操作されたときに、「操作された」とみなされる。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの分子、化合物、細胞、および／または粒子間の化学的相互作用を指し、第一の実体は、非標的である第三の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第二の標的実体に結合する。一部の実施形態では、特異的結合は、第二の標的実体に対する第一の実体の親和性を指してもよく、これは第三の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上である。所与の標的に特異的な試薬は、利用されるアッセイの条件下でその標的に特異的結合を示す試薬である。
「統計学的に有意」という用語または「有意」という用語は、統計学的有意性を指し、概して、２つの標準偏差（２ＳＤ）以上の差を意味する。
操作例以外、または別段の示唆がある場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用される場合、「約」という用語は、±１％を意味することができる。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、パーセンテージに関連して使用される場合、「約」という用語は、±５％を意味することができる。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、提示される定義された要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、制限ではなく包含を示す。
用語「からなる」は、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその説明に記載されていない任意の要素は含まれない。
本明細書で使用される場合、「本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規または機能的特徴に実質的に影響を与えない追加的な要素の存在を可能にする。
単数形の用語「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、文脈が別段明確に示さない限り、単語「または」は「および」を含むことが意図される。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。略語「ｅ．ｇ．」は、はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は、「例えば」という用語と同義である。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または実施形態のグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に記載の他の要素との任意の組み合わせで、参照および特許請求することができる。グループの一つまたは複数のメンバーは、利便性および／または特許性のために、グループに含まれてもよく、またはグループから削除されてもよい。そのような包含または削除が起こると、本明細書は、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述された説明を満たすように変更されたグループを含むものとみなされる。
本明細書で別段の定義がない限り、本出願と関連して使用する科学用語および技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１８（ＩＳＢＮ ０９１１９１０１９０，９７８－０９１１９１０４２１）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｗ．Ｗ．Ｎｏｒｔｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１６（ＩＳＢＮ ０８１５３４５０５４，９７８－０８１５３４５０５３）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に記載されており、その内容はすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
他の用語は、本発明の様々な態様の説明内で本明細書に定義される。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または開示された正確な形態に本開示を限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施形態および実施例は、例示の目的で本明細書に記述されているが、関連技術分野の当業者が認識するであろうように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能が所与の順序で提示される一方で、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実行し得るか、または実質的に同時に機能を実行し得る。本明細書に提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献および出願の構成、機能、および概念を採用して、本開示のなおさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能的同等性の考慮により、生物学的または化学的作用に種類または量で影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。これらおよび他の変更は、詳細な説明を考慮して本開示に対して行うことができる。かかるすべての修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせられてもよく、または置換されてもよい。さらに、本開示の特定の実施形態に関連する利点は、これらの実施形態の文脈で説明されてきたが、他の実施形態はまた、こうした利点を示してもよく、すべての実施形態が、本開示の範囲内に入るために必ずしもこうした利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに図示されており、これはいかなる点においても、さらなる制限であると解釈されるべきではない。
実施例１．ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２によるＲＮＡ編集
試薬：
１．プラスミド：
・ｐＡＡＶ－Ｂａｓｉｃ－ｅＧＦＰ－ＷＴ（「ＷＴ－ｅＧＦＰ」）
・ｐＡＡＶ－Ｂａｓｉｃ－ｅＧＦＰ－Ｗ５８Ｘ（「ｅＧＦＰ－Ｗ５８Ｘ」）
・ｐＣＭＶ－３ｔａｇ－６（「空ベクトル」）
・ｐＣＭＶ－３ｔａｇ－６－Ｆｌａｇ－ＡＤＡＲＤＤＥ４４８Ｑ－４ＧＳ１－Ｎｅｓ－ｈＡｇｏ２－Ｄ５９７Ａ／Ｄ６６９Ａ（「ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２」）
２．ｓｉＲＮＡの編集
３．トランスフェクション試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
４．細胞株：Ｈｅｋ２９３
本明細書の編集プロトコルは、図１０によって例示される。その中で、１日目に、ＨＥＫ２９３細胞を、１２ウェルプレートに１ウェル当たり約５０万個播種し、２日目のトランスフェクションのための７０％のコンフルエンスを目標とした。細胞を、ウェル当たり０．３μｇのｅＧＦＰ－Ｗ５８Ｘおよび０．７μｇのＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２、ウェル当たり０．３μｇのＷＴ－ｅＧＦＰおよび０．７のＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２（陽性対照）、または０．３μｇのｅＧＦＰ－Ｗ５８Ｘおよび０．７μｇの空のベクター（陰性対照）のいずれかを使用して、サプライヤープロトコルに従ってＬｉｐｏ３０００でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を一晩維持した。３日目に、細胞培地を新鮮な培地と交換し、細胞剥離を回避した。
細胞培地を変更してから６時間後、サプライヤープロトコルに従って、編集ｓｉＲＮＡ（ウェル当たり２０ｎＭ）をＲＮＡｉＭａｘでトランスフェクトした。その後、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に培地を変更し、蛍光顕微鏡により細胞を撮像した。細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡によって再び撮像した。ＲＮＡ抽出のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後６０時間以内に細胞試料を収集した。ＲＮＡを直ちに抽出するか、または抽出まで細胞ペレットを－８０°Ｃで保存した。
全ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＱｉａｇｅｎ Ｋｉｔで抽出し、その後、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｋ１６５１）で逆転写した。逆転写の全ＲＮＡの量は５００ｎｇであった。５’アダプター（下線）を有する遺伝子特異的プライマーを使用した。ｅＧＦＰについては、プライマーはｅＧＦＰ－ＣＤＮＡ：
Figure 2024515999000024
であった。
逆転写産物を、テンプレートｃＤＮＡ（２μＬ）を使用したサプライヤープロトコルに従って、Ｐｒｉｍｅｒｓｔａｒ ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ、Ｒ０４５Ａ）を用いたＰＣＲによって増幅し、合計４０μＬのＰＣＲ反応を行った。フォワードプライマーはｅＧＦＰ配列であり、リバースプライマーはＲＴに対する遺伝子特異的プライマーの５’アダプターであった。ＰＣＲ産物（およそ２００ｋｂ）を１％アガロースにロードし、ゲルを１５０Ｖで３０分間実行した。得られたＤＮＡを含有するゲル断片を切除し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌキット（ＲＥＦ７４０６０）で精製して、サンガーシーケンシングを介して配列決定された精製ＤＮＡを得た。
実施例２．ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２によるＲＮＡ編集の位置依存性
実施例１の編集プロトコルを使用して、ｅＧＦＰ－Ｗ５８ＸレポーターｍＲＮＡと編集ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖との間のＣ－Ａミスマッチの位置依存性を、表１のｓｉＲＮＡを使用して調べ、Ｃ－Ａミスマッチの位置を「ＭＭミスマッチ」で示し、対応するシトシンを太字にした。編集ｓｉＲＮＡ１～７は、示されたアンチセンス配列（任意のＴをＵに置き換える）と、アンチセンス鎖の１～１９位に完全に一致する（２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す）長さ１９の未修飾リボヌクレオチドの対応するセンス鎖とを有する、完全に未修飾のＲＮＡであった。編集ｓｉＲＮＡ８～１０は、示されたアンチセンス配列（任意のＴをＵに置き換える）と、アンチセンス鎖の１～２３位に完全に一致する（２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す）長さ２３の未修飾リボヌクレオチドの対応するセンス鎖とを有する、完全に未修飾のＲＮＡであった。編集ｓｉＲＮＡ１１および１２は、示されたアンチセンス配列（任意のＴをＵに置き換える）と、アンチセンス鎖の１～２５位に完全に一致する（２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す）長さ２５の未修飾リボヌクレオチドの対応するセンス鎖とを有する、完全に未修飾のＲＮＡであった。
Figure 2024515999000025
 ここで、Ｐは５’－ホスフェートである。
図６に示されるように、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス位置９、１１、および１９に、Ｃ－Ａミスマッチを有する、編集ｓｉＲＮＡ－２、ｓｉＲＮＡ－３、およびｓｉＲＮＡ－７を使用して弱いＲＮＡ編集が観察された。図８は、緑色蛍光が増加した細胞によって図示されるように、編集ｓｉＲＮＡ７で達成されるＲＮＡ編集を示す。図７に示されるように、ｓｉＲＮＡ設計の長さを延長することは、編集ｓｉＲＮＡ－８（位置２１）およびｓｉＲＮＡ－１１（位置２４）による改善された編集をもたらした。
図４に示されるように、ｅＧＦＰ－Ｗ５８ＸおよびＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２の両方をトランスフェクトした細胞への編集ｓｉＲＮＡ－１３（以下および図３を参照）の誘導により、蛍光のターンオンによって示されるように、ｅＧＦＰの翻訳が回復した。Ａ～Ｉの部位特異的編集は、図５に示されるように、相補鎖のサンガー配列決定によって確認され、ピークは、コード鎖におけるＡ～Ｇ編集を示した。
Figure 2024515999000026
 ここで、Ｐは５’－ホスフェートである。
実施例３．修飾ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ融合タンパク質によるＲＮＡ編集
実施例１のＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２融合ポリペプチドの変化を、編集活性に対する効果について調べた。実施例１のプロトコルおよび２９／３１のＳ／ＡＳ設計を有する編集ｓｉＲＮＡ－１３（図３）を使用して、ｈＡｇｏ２のｈＡｇｏ２－ΔＮ５１、ｈＡｇｏ１、ｈＡｇｏ３、もしくはｈＡｇｏ４での置換、またはＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２中のＧＧＧＳ－ＮＥＳ－ＧＳリンカーのＧＧＳＧＧＧＳＳＧＡＡＡＧＳＧＧ（配列番号７７）リンカーでの置換のいずれかをそれぞれ調べた。
図９は、（１）ＷＴ－ｅＧＦＰ陽性対照、（２）ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２、（３）ｈＡｇｏ２－ΔＮ５１置換、および（４）ＧＧＳＧＧＧＳＳＧＡＡＡＧＳＧＧ（配列番号７７）リンカー置換の撮像結果を示す。リンカー置換は許容されるが、ｈＡｇｏ２－ΔＮ５１置換は、編集活性の低下をもたらし、ｈＡｇｏ２のＮ末端アミノ酸１～５１がｓｉＲＮＡ負荷または標的認識のいずれかに重要であり得ることを示す。
図１３は、（０）ＷＴ－ｅＧＦＰ陽性対照、（１）ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ１、（２）ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２、（３）ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ３、および（４）ＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ４の撮像結果を示す。その中で、ＡＤＡＲ－Ａｇｏ１～４の各々でＲＮＡ編集が見られ、すべてのヒトＡｇｏタンパク質が融合構築物中で機能することを示す。
実施例４．内因性ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素１（ＬＡＲＳ１／ＬｅｕＲＳ）およびＷＤリピートドメイン５（ＷＤＲ５）ｍＲＮＡのＲＮＡ編集
編集ｓｉＲＮＡは、２つのヒト遺伝子（ＬＡＲＳ１およびＷＤＲ５）の内因性標的ｍＲＮＡの部位特異的編集のために設計され、アンチセンス１０位（ＡＳ１０）で標的配列へのミスマッチを含有して、スライサー活性を遮断した。表３は、編集部位（標的アデノシンが太字にされている箇所）を、その標的に設計された完全に未修飾のリボヌクレオチド編集ｓｉＲＮＡと共に提供する。各標的ｍＲＮＡ部位は、対応する遺伝子配列として表３に記述され、標的ｍＲＮＡは、各ＴがＵに置換されている。
Figure 2024515999000027
 ここで、Ｐは５’－ホスフェートである。
ＲＮＡ編集は、ＡＤＡＲ－Ａｇｏ２およびサンガー配列決定のために単離されたＲＮＡを用いて行われ、各々が実施例１に従い、ＧＦＰトランスフェクションを省略し、前述の編集ｓｉＲＮＡおよびＰＣＲフォワードプライマーをそれぞれの遺伝子配列に置換した。図１１および図１２は、それぞれＬＡＲＳ１およびＷＤＲ５の単離コード鎖のサンガー配列決定に見られるように、ＲＮＡ編集の成功を示す。
実施例５．ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－ｈＡｇｏ２による内因性ＲＮＡ編集
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ｙ１３２ＤまたはＹ１３２Ｒ）は、ｐＣＭＶ－ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｒ－４ＧＳ１－ＮＥＳ－Ａｇｏ２－Ｄ５９７Ａ＿Ｄ６６９Ａ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｒ」）または ｐＣＭＶ－ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｄ－４ＧＳ１－ＮＥＳ－Ａｇｏ２－Ｄ５９７Ａ／Ｄ６６９Ａ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｄ」）の発現を介して、触媒不活性Ａｇｏ２にＧＧＧＳ－ＮＥＳ－ＧＳリンカーを介して融合された。編集ｓｉＲＮＡを、編集ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列と複合体化されたときに、ＷＤＲ５の標的配列に導入された１４ヌクレオチドループ内のシトシンにおける部位特異的Ｃ－＞Ｕ編集のために設計した。ループは、図１５に示すように、アンチセンス１０位と１１位との間に位置した。編集ｓｉＲＮＡは、表３に示されたアンチセンス配列と、アンチセンス鎖の１～２１位に完全に一致する（２ヌクレオチドの３‘オーバーハングを残す）長さ２１の未修飾リボヌクレオチドの対応するセンス鎖を有する、完全に未修飾のＲＮＡであった。表４では、ループ領域は下線付きであり、標的シトシンは太字である。
Figure 2024515999000028
 ここで、Ｐは５’－ホスフェートである。
ＲＮＡ編集を、実施例１に従って、任意のＧＦＰトランスフェクションを省略し、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２ＲまたはＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２ＤをＡＤＡＲ－ｈＡｇｏ２に置換し、表４の編集ｓｉＲＮＡを使用して行った。対照実験では、いずれの融合タンパク質も存在しない状態で編集ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＷＤＲ５遺伝子配列のＰＣＲフォワードプライマーである実施例１に従って、サンガー配列決定のためにＲＮＡを単離した。図１６は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２ＲＤ（中央）または対照（下）と比較して、相補鎖ＷＤＲ５（上）のサンガー配列決定に見られる、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｒ融合タンパク質の存在下でのＲＮＡ編集の成功を示す。
例示的なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列
ＦＬＡＧ－ＡＤＡＲ－ＧＧＧＧＳ－ＮＥＳ－ｈＡｇｏ１（配列番号１０６）
Figure 2024515999000029
ＡＤＡＲ－４ＧＳ－１－ｈＡｇｏ２－Ｄ５９７Ａ／Ｄ６６９Ａ（配列番号１０７）
Figure 2024515999000030
Figure 2024515999000031
ＡＤＡＲ－４ＧＳ１－ｈＡｇｏ２－Ｄ５９７Ａ／Ｄ６６９Ａ－ΔＮ５１（配列番号１０８）
Figure 2024515999000032
Figure 2024515999000033
ＦＬＡＧ－ＡＤＡＲ－ＧＧＧＧＳ－ＮＥＳ－ｈＡｇｏ３（配列番号１０９）
Figure 2024515999000034
Figure 2024515999000035
ＦＬＡＧ－ＡＤＡＲ－ＧＧＧＧＳ－ＮＥＳ－ｈＡｇｏ４（配列番号１１０）
Figure 2024515999000036
Figure 2024515999000037
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｄ－４ＧＳ１－ＮＥＳ－Ａｇｏ２－Ｄ５９７Ａ／Ｄ６６９Ａ（配列番号１１１）
Figure 2024515999000038
Figure 2024515999000039
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｙ１３２Ｒ－４ＧＳ１－ＮＥＳ－Ａｇｏ２－Ｄ５９７Ａ＿Ｄ６６９Ａ（配列番号１１２）
Figure 2024515999000040
Figure 2024515999000041
本出願全体を通して引用される、文献参照、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む、すべての特許およびその他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記述および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供される。この点に関して、発明者らが、先行する発明によって、またはいかなる他の理由によっても、かかる開示を先取りする権利を有していないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文書の日付または内容の表現に関するすべての記述は、申請者が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性を認めるものではない。
一部の実施形態では、第一のドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515999000062
Figure 2024515999000063
Figure 2024515999000064
一部の例示的なペプチドリンカーには、グリシン残基およびセリン残基からなるリンカー、いわゆるＧｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカーが含まれる。本明細書で使用される場合、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙｘ Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｘは、２、３、４、５、または６であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、例えば、配列番号２５である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは、３、４、５、または６である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは、４または５である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、４であり、ｎは、３、４、５、または６である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、４であり、ｎは４または５である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３であり、ｎは２である。本明細書に記載される様々な態様の一部の実施形態では、ｘは、３または４であり、ｎは、１である。
いずれか一つの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、フラグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１１５）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１１６）、ａｃ－ＭｙｃエピトープＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号１１７）、ＡＵ１タグ（ＤＴＹＲＹＩ、配列番号１１８）、および／または６－ＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号７５）を含む。

Claims (63)

  1. 標的ＲＮＡを修飾するためのシステムであって、以下：
    ａ．ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、
    ｉ．ＲＮＡ修飾酵素の触媒ドメインを含む第一のドメインであって、前記ＲＮＡ修飾酵素がヌクレアーゼではない、第一のドメインと、
    ｉｉ．アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質のＭＩＤドメインを含む第二のドメインと
    を含む、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸、および
    ｂ．任意で二本鎖であり、少なくとも１７塩基対の二本鎖領域を含む、オリゴヌクレオチド
    を含む、システム。
  2. 前記第二のドメインが、ＡｇｏのＰＡＺドメインをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記第二のドメインが、ＡｇｏのＰＩＷＩドメインをさらに含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のシステム。
  4. 前記ＰＩＷＩドメインがヌクレアーゼ活性を欠く、請求項３に記載のシステム。
  5. 前記Ａｇｏが哺乳類Ａｇｏである、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記ＡｇｏがヒトＡｇｏである、請求項５に記載のシステム。
  7. Ａｇｏが、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４である、請求項５に記載のシステム。
  8. 前記第二のドメインが、
    ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列のＤ５９７およびＤ６９９からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記第二のドメインが、
    ヒトＡｇｏ２アミノ酸配列のＤ５９７ＡおよびＤ６９９Ａからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡｇｏタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項８に記載のシステム。
  10. 前記ＲＮＡ修飾酵素が、ＲＮＡデアミナーゼ、ＲＮＡメチラーゼ、またはＲＮＡデメチラーゼである、請求項１に記載のシステム。
  11. 前記ＲＮＡ修飾酵素の前記触媒ドメインが、ＲＮＡデアミナーゼのデアミナーゼドメインである、請求項１０に記載のシステム。
  12. 前記ＲＮＡデアミナーゼが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）またはシチジンデアミナーゼである、請求項１１に記載のシステム。
  13. 前記ＡＤＡＲが哺乳類ＡＤＡＲである、請求項１２に記載のシステム。
  14. 前記ＡＤＡＲがヒトＡＤＡＲである、請求項１３に記載のシステム。
  15. 前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ３である、請求項１３に記載のシステム。
  16. 前記第一のドメインが、
    ヒトＡＤＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）アミノ酸配列のＴ３７５、Ｅ４４８およびＥ４８８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  17. 前記第一のドメインが、
    ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ３７５Ｑ、Ｅ４４８ＱおよびＥ４８８Ｑからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項１６に記載のシステム。
  18. 前記シチジンデアミナーゼが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）である、請求項１２に記載のシステム。
  19. 前記シチジンデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４からなる群から選択される、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記第一のドメインが、
    ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＴ３３９、Ｒ３４８、Ａ３５３、Ｖ３５１、Ｖ３５５、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｓ３９７、Ｅ４３８、Ｆ４４２、Ｈ４４３、Ｌ４４４、Ｙ４４５、Ｔ４４８、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｓ４８６、Ｑ４８８、Ｒ５１０、Ｉ５２０、Ｖ５２５、Ｐ５３９、Ｇ５９３、Ｋ５９４およびＥ１００８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  21. 前記第一のドメインが、
    ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ３５１、Ｓ３７０、Ｔ３７５、Ｐ４６２、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｎ５９７およびＥ１００８からなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記第一のドメインが、
    ｈＡＤＡＲ２アミノ酸配列のＶ３５１Ｇ、Ｓ３７０Ｃ、Ｔ３７５Ｓ、Ｐ４６２Ａ、Ｓ４８６Ａ、Ｅ４８８Ｑ、Ｎ５９７ＩおよびＥ１００８Ｑからなる群から選択される一つまたは複数の位置、または相同もしくはオルソロガスＡＤＡＲタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記第一のドメインが、
    ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａアミノ酸配列の位置Ｙ１３２、または相同もしくはオルソロガスＡＰＯＢＥＣタンパク質中の対応する位置に、変異を有する、アミノ酸配列
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  24. 前記変異がＹ１３２ＲまたはＹ１３２Ｄである、請求項２３に記載のシステム。
  25. 前記ポリペプチドが、前記第一のドメインと前記第二のドメインとの間にリンカーを含む、請求項１に記載のシステム。
  26. 前記ポリペプチドが、核輸送シグナル（ＮＥＳ）配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  27. 前記ＮＥＳ配列が、前記第一のドメインと前記第二のドメインとの間に位置する、請求項２６に記載のシステム。
  28. 前記ポリペプチドが、ＦＬＡＧオクタペプチドをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  29. 前記ポリペプチドがヌクレアーゼ活性を欠く、請求項１に記載のシステム。
  30. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも一つの３’一本鎖オーバーハングを含む、請求項１に記載のシステム。
  31. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、平滑末端を含む、請求項１に記載のシステム。
  32. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖を含み、前記第一および第二の鎖が独立して、少なくとも１９ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のシステム。
  33. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１に記載のシステム。
  34. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１に記載のシステム。
  35. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記鎖が、前記鎖の５’末端から数えて、１０位に、前記標的ＲＮＡとのミスマッチを含む、請求項１に記載のシステム。
  36. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記鎖が、前記鎖の５’末端から数えて、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８位に、Ｃを含み、前記鎖が、前記鎖の５’末端から数えて、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８位に、前記標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、請求項１に記載のシステム。
  37. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記鎖が、前記鎖の５’末端から数えて、２５位に、Ｃを含み、前記鎖が、前記鎖の５’末端から数えて、２５位に、前記標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、請求項３６に記載のシステム。
  38. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記鎖が、前記鎖の３’末端から数えて、４、５、６、７、８、９、または１０位に、Ｃを含み、前記鎖が、前記鎖の３’末端から数えて、４、５、６、７、８、９、または１０位に、前記標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、請求項１に記載のシステム。
  39. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記鎖が、前記鎖の３’末端から数えて、７位に、Ｃを含み、前記鎖が、前記鎖の３’末端から数えて、７位に、前記標的ＲＮＡとのＡ：Ｃミスマッチを含む、請求項３８に記載のシステム。
  40. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する鎖を含み、前記標的ＲＮＡが、前記鎖にハイブリダイズされたときにループ構造を形成し、前記ループ構造が、一本鎖Ｃヌクレオチドを含む、請求項１に記載のシステム。
  41. 前記ループ構造が、５～２０のヌクレオチドの長さである、請求項４０に記載のシステム。
  42. 前記一本鎖Ｃヌクレオチドが、前記ループ構造の５’末端から数えて、６、７、８、９、１０、１１、１２位にある、請求項４０に記載のシステム。
  43. 前記ループ構造がヘアピンの形態であり、前記Ｃヌクレオチドが、前記ヘアピンの一本鎖領域に存在する、請求項４０に記載のシステム。
  44. 前記ループ構造が、前記標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する前記鎖の前記３’末端または５’末端から数えて、８、９、１０、１１、１２、または１３位の反対側の位置にある、請求項４０に記載のシステム。
  45. 前記ループ構造が、前記標的ＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する前記鎖の前記５’末端から数えて、８、９、１０、１１、１２、または１３位の反対側の位置にある、請求項４０に記載のシステム。
  46. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの核酸修飾を含む、請求項１に記載のシステム。
  47. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉切断を阻害することができる少なくとも一つの核酸修飾を含む、請求項１に記載のシステム。
  48. 請求項１に記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
    を含む、キット。
  49. 請求項３０に記載の核酸をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
  50. 請求項１に記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
    を含む、組成物。
  51. 請求項３０に記載の核酸をさらに含む、請求項５０に記載の組成物。
  52. 請求項１に記載の、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸
    を含む、細胞。
  53. 請求項３０に記載の核酸をさらに含む、請求項５２に記載の細胞。
  54. 標的ＲＮＡを修飾する方法であって、前記標的ＲＮＡを請求項１に記載のシステムと接触させる工程を含む、方法。
  55. 前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記標的ＲＮＡが、細胞内にある、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記接触させる工程がインビトロである、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記接触させる工程がインビボである、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記標的ＲＮＡを前記修飾することが、前記標的ＲＮＡ中のアデノシンの脱アミノ化を含む、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記標的ＲＮＡを前記修飾することが、前記標的ＲＮＡ中のシチジンの脱アミノ化を含む、請求項５４に記載の方法。
  61. 前記標的ＲＮＡを前記修飾することが、前記標的ＲＮＡ中のアデノシンのメチル化を含む、請求項５４に記載の方法。
  62. 前記標的ＲＮＡを前記修飾することが、前記標的ＲＮＡ中のアデノシンの脱メチル化を含む、請求項５４に記載の方法。
  63. 請求項５４に記載の方法によって修飾されたＲＮＡを含む、細胞。
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