JP2024515202A

JP2024515202A - 抗ｇｐｃ３抗体、多重特異性抗体及び使用方法

Info

Publication number: JP2024515202A
Application number: JP2023564466A
Authority: JP
Inventors: イサフラス，ハッサン; シュー，ウェンフォン; ジアン，ウェイ－ドン; キム，フンナム
Original assignee: Shanghai Henlius Biotech Inc
Current assignee: Shanghai Henlius Biotech Inc
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2024-04-05
Also published as: WO2022223019A1; CN117425678A; US20240043558A1; EP4326780A1; AU2022260298A1; IL307923A; CA3216342A1; KR20240000505A

Abstract

本開示は、ＧＰＣ３に結合する抗体及び抗体誘導体並びにその使用方法を提供する。該抗体又は抗体誘導体は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含む。該抗体誘導体は、ＧＰＣ３及び別の抗原、例えば、４－１ＢＢに結合する多重特異性抗体である。

Description

本出願は、２０２１年４月２３日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８９２４８号の優先権を主張している。

本開示は、ＧＰＣ３に結合する抗体及び抗体誘導体並びにその使用方法に関する。いくつかの実施例において、抗体誘導体は、ＧＰＣ３及び追加の抗原（例えば、４－１ＢＢ）に結合する多重特異性抗体である。

ホスファチジルイノシトールプロテオグリカン３（ＧＰＣ３）は、ＧＰＩに連結されるヘパラン硫酸プロテオグリカン及び細胞表面癌胎児性タンパク質であり、７０％を超える肝細胞癌（ＨＣＣ）生検において高度に発現される。ＧＰＣ３陽性ＨＣＣ患者の無病生存率は、ＧＰＣ３陰性ＨＣＣ患者より著しく低い。ＧＰＣ３は、また可溶性ＧＰＣ３（ｓＧＰＣ３）としてＨＣＣ患者の末梢血中に存在するが、健常成人の肝組織、脂肪肝の病理学的サンプル又は肝硬変、肝炎もしくは損傷した肝臓に存在せず、ＧＰＣ３がα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）よりも信頼できる腫瘍マーカーであることを示す。ＧＰＣ３は、また様々な小児癌、例えば、肝細胞癌、大部分の小児肝芽腫、腎芽腫、ラブドイド腫瘍、いくつかの胚細胞腫瘍サブタイプ及び少数の横紋筋肉腫においても発現される。なお、ＧＰＣ３遺伝子突然変異は、肝芽腫と腎芽腫とを含むＧＰＣ３発現癌に進行しやすいＸ連鎖過剰増殖性疾患であるシンプソン・ゴラビ・ベーメル症候群（Ｓｉｍｐｓｏｎ－Ｇｏｌａｂｉ－ＢｅｈｍｅｌＳｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こす。そのため、ＧＰＣ３を標的とする、癌を治療するための治療分子及び方法の開発は当分野において必要とされている。

４－１ＢＢ（ＣＤ１３７及びＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳ）の膜貫通タンパク質である。４－１ＢＢは、活性化されたＮＫ及びＮＫＴ細胞、Ｔ細胞並びに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な免疫細胞に存在する。マウス及びヒトＴ細胞に対する研究により、４－１ＢＢは細胞増殖、生存及びサイトカインの産生を促進し得ることが示された。なお、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、共刺激分子の発現を増加し、細胞溶解性Ｔリンパ球応答を増強することによって、様々なモデルにおいて抗腫瘍効果を果たすことができる。

モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、細胞溶解性Ｔリンパ球及びＣＡＲＴ細胞は、潜在的な治療選択肢として記述されている。ここで、抗ＧＰＣ３／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞リターゲティング抗体（例えば、ＥＲＹ９７４）は、導入され、臨床前の動物モデル及び人試験において試験された。しかしながら、当分野において、ＧＰＣ３関連癌を治療するために、安全で有効な抗ＧＰＣ３単一特異性及び多重特異性抗体は依然として必要とされている。

本開示は、高親和性でＧＰＣ３に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体及び抗体誘導体を提供し、単一特異性抗ＧＰＣ３抗体と、ＧＰＣ３及び一つ又は複数の別の標的に結合する多重特異性抗体とを含む。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含む。本開示は、本明細書に開示される抗体及び抗体誘導体並びにこれらの抗体及び抗体誘導体を含む薬物組成物を調製し使用する方法をさらに提供し、例えば、癌のような疾患及び障害の治療に用いられる。本発明は、ＧＰＣ３に結合する新規単一ドメイン抗体の発見に部分的に基づき、該抗体は、腫瘍細胞を標的とし、及び／又は腫瘍細胞に対する免疫応答を増加することによって、改善された抗腫瘍効果を提供することができる。

本開示は、ＧＰＣ３及び４－１ＢＢに結合する多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施例において、該多重特異性抗体は、ｉ）ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含有する抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）４－１ＢＢに結合する抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体又はＶＨＨは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、１ｘ１０^－７Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、５ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、１ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約５ｘ１０^－８ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。

いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、ＧＰＣ３への結合について、重鎖可変領域を含む参照単一ドメイン抗体と交差競合し、該重鎖可変領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ａ）配列番号１及び５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、ｂ）配列番号２及び６のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、ｃ）配列番号３及び７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここで、該ＣＤＲ１ドメイン、該ＣＤＲ２ドメイン及び該ＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号４、８と１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号４、８及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む。

いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、参照抗４－１ＢＢ抗体と交差競合する抗４－１ＢＢ抗体を含み、該抗体は、ａ）（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又はｂ）（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号６７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号７７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号７８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、ヒト化抗体を含む。

いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、抗４－１ＢＢ抗体を含み、該抗体は、二本の抗体重鎖と、二本の抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、一つ又は複数の抗ＧＰＣ３抗体を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、二つの抗ＧＰＣ３抗体を含む。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される。

いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、リンカーを介して第２の抗原結合部分に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１６～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆの突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

いくつかの実施例において、該多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。いくつかの実施例において、該多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、該多重特異性抗体は、配列番号８１に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８２に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。

本開示は、治療剤に連結される、本明細書に開示される任意の多重特異性抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。いくつかの実施例において、治療剤は、細胞毒素又は放射性同位体である。

本開示は、ａ）本明細書に開示される任意の多重特異性抗体、本明細書に開示される任意の免疫コンジュゲート又は本明細書に開示される任意の免疫応答細胞と、ｂ）薬学的に許容されるキャリア剤とを含む薬物組成物を提供する。

本開示は、本明細書に開示される任意の多重特異性抗体をコードする核酸、本明細書に開示される任意の核酸を含むベクター、及び本明細書に開示される任意の核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。

本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗体を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書に開示される宿主細胞において多重特異性抗体を発現し、宿主細胞から該多重特異性抗体を単離することを含む。

本開示は、被験体の腫瘍負荷を軽減する方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、該方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示される多重特異性抗体、本明細書に開示される免疫コンジュゲート又は本明細書に開示される薬物組成物を投与することを含む。いくつかの実施例において、該方法は、腫瘍細胞の数を減らす。いくつかの実施例において、該方法は、腫瘍サイズを小さくする。いくつかの実施例において、該方法は、被験体の腫瘍を根絶する。いくつかの実施例において、腫瘍は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。いくつかの実施例において、腫瘍は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本開示は、癌を治療及び／又は予防するか、又は癌を有する被験体の生存期間を延長する方法を提供する。いくつかの実施例において、該方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示される多重特異性抗体、本明細書に開示される免疫コンジュゲート又は本明細書に開示される薬物組成物を投与することを含む。いくつかの実施例において、癌は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。いくつかの実施例において、癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本開示は、本明細書に開示される、薬物として用いられる任意の多重特異性抗体及び／又は薬物組成物をさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される、癌の治療に用いられる任意の多重特異性抗体及び／又は薬物組成物をさらに提供する。いくつかの実施例において、癌は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。いくつかの実施例において、癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗体、本明細書に開示される免疫コンジュゲート、本明細書に開示される薬物組成物、本明細書に開示される核酸、本明細書に開示されるベクター又は本明細書に開示される免疫応答細胞を含むキットを提供する。いくつかの実施例において、キットは、新生物を治療及び／又は予防するためのマニュアルをさらに含む。

本明細書に開示されるＧＰＣ３分子及び例示的抗ＧＰＣ３ＶＨＨ抗体をそれぞれ示した概略図である。図１Ａは、ヒトＧＰＣ３分子の構造概略図を記述し、該分子は、５８０個のアミノ酸、及びＣ末端部分に近接する二つのヘパラン硫酸（ＨＳ）側鎖で構成される。ＧＰＣ３は、Ａｒｇ３５８とＣｙｓ３５９との間でフリンプロテアーゼにより開裂され、それによってジスルフィド結合を介して連結される４０ｋＤａのＮ末端サブユニット及び３０ｋＤａのＣ末端サブユニットを産生させる。図１Ｂは、ラマ由来のＶＨＨ－Ｆｃ抗体構造（左図）及びＶＨＨ構造モデル概略図（右図）を示している。同上。フローサイトメトリーによる、二つのトップＶＨＨ－ＦｃクローンとＨｅｐＧ２肝癌細胞株との結合能を示した図である。ＨＮ３ＶＨＨ－Ｆｃを陽性対照として用いた。ＥＬＩＳＡによって測定された、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ、ＨＮ３ＶＨＨ－Ｆｃ及びフコシル化されていない（ＡＦ）１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃと、ヒトＧＰＣ３（３Ａ）、カニクイザルＧＰＣ３（３Ｂ）、マウスＧＰＣ３（３Ｃ）及びヒトＧＰＣ３Ｃ末端ドメイン（３Ｄ）との結合活性を示した図である。同上。同上。同上。フローサイトメトリーによって測定された、ＨｅｐＧ２（４Ａ）及びＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞（４Ｂ）の全細胞に対する抗ＧＰＣ３抗体の結合を示した図である。同上。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、ＨｅＧ２肝癌細胞を標的細胞として用い、細胞溶解率によって測定された、抗ＧＰＣ３抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示した図である。抗ＧＰＣ３ＶＨＨ抗体又はビヒクル対照の処理下でのＨｅｐＧ２肝癌マウスモデルの腫瘍増殖曲線を示した図である。抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性抗体の概略図構造を示した図であり、ここで、抗ＧＰＣ３１Ｂ０１ＶＨＨナノ抗体は、ペプチドリンカーを介して各本の重鎖のＮ末端で抗４－ｌＢＢＩｇＧ抗体と融合する。フローサイトメトリーによって測定された、４－１ＢＢトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（８Ａ）及びＨｅｐＧ２肝癌細胞（８Ｂ）の全細胞に対する抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性抗体の結合を示した図である。同上。ＧＰＣ３＋腫瘍細胞が存在しない（９Ａ）か又は存在する（９Ｂ）場合に、抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性抗体が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力を示した図である。４－１ＢＢ活性化を、ヒト４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて評価した。同上。抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性抗体、対照二重特異性抗体又はビヒクル対照の処理下でのＨｅｐＧ２肝癌マウスモデルの腫瘍増殖曲線を示した図である。抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性抗体、ウリルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）類似体（抗４－１ＢＢ抗体）及びアイソタイプ対照抗体の処理下でのＣＴ－２６結腸癌マウスモデルの測定結果を示した図である。図１１Ａは、腫瘍増殖曲線を示した。図１１Ｂは、抗体の最終投与後７日間の血液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示した。＊：ｐ値＜０．０５であり、＊＊：ｐ値＜０．０１である。図１１Ｃは、処理下のマウスの体重増加率を示した。同上。同上。

限定するものではなく、明確にするために、本開示のテーマの具体的な実施形態は、以下のように分けられる。

１．定義、
２．抗体及び抗体誘導体、
３．使用方法、
４．薬物製剤、及び
５．製品。

１．定義
本明細書で言及される「抗体」という用語は、全長抗体及びその任意の抗原結合断片（即ち抗体断片）を含む。「抗体」は、独立した分子又は抗体誘導体の一部であってもよい。例示的抗体誘導体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体）、別のタンパク質又は非タンパク質部分を含む抗体コンジュゲート（例えば、抗体－薬物コンジュゲート又はポリマーにコーティングされる抗体）及び抗体を含む他の多機能分子を含むが、それらに限らない。

「全長抗体」、「完全抗体」及び「全抗体」は、天然抗体の構造と類似するか又は本明細書により定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。いくつかの実施例において、全長抗体は、二本の重鎖と二本の軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原結合を担当する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれてもよい。二本の鎖における可変領域は、通常、三つの高度に可変なループを含み、これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣ－ＣＤＲ１と、ＬＣ－ＣＤＲ２と、ＬＣ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１と、ＨＣ－ＣＤＲ２と、ＨＣ－ＣＤＲ３とを含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）と呼ばれる。本明細書に開示される抗体及び抗原結合断片のＣＤＲ境界は、周知の慣例、例えば、以下に記載のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ及びＡＨｏの慣例によって定義又は同定されてもよい。重鎖又は軽鎖の三つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるフランキングセグメントの間に挿入され、それらは、ＣＤＲよりも保存性が高く、高可変ループを支持する足場を形成する。重鎖と軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、複数のエフェクター機能を示す。抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体を分類する。抗体の五つの主要なクラス又はアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμ重鎖が存在することを特徴とする。いくつかの主要な抗体クラスは、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）又はＩｇＡ２（α２重鎖）に分けられる。いくつかの実施例において、全長抗体は、グリコシル化したものである。いくつかの実施例において、全長抗体は、そのＦｃ領域に連結されるグリカンを含む。いくつかの実施例において、全長抗体は、分岐鎖グリカンを含む。

本明細書に使用されるように、抗体の「抗原結合部分」、「抗体断片」及び「抗体部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行され得ることが示された。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖとｓｃＦｖ－Ｆｃ）、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨＨ－Ｆｃ、ナノ抗体、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、もしくは抗原に結合する抗体の任意の他の断片又はそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限らない。「ＶＨＨ」、ラクダ科動物から単離された単一ドメイン抗体を指す。いくつかの実施例において、ＶＨＨは、ラクダ科動物重鎖抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、約２５ｋＤａを超えない。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、約２０ｋＤａを超えない。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、約１５ｋＤａを超えない。

参照抗体と「結合について交差競合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、競合アッセイにおいて、参照抗体は、抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［抗体］，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ［コールドスプリング実験室出版社］，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ［ニューヨークコールドスプリング］）において、例示的な競合アッセイが記述されている。

「Ｆｖ」は、最小抗体断片であり、それは、完全な抗原認識部位と、抗原結合部位とを含有する。該断片は、密に非共有結合した一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域の二量体からなる。この二つのドメインの折り畳みから、六つの高可変ループ（重鎖と軽鎖のそれぞれの３つのループ）が放出され、該高可変ループは、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原に対する抗体の結合特異性を付与する。しかしながら、完全な結合部位よりも低い親和性で行われる場合があっても、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異性を有する三つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）でさえ、抗原を認識し、結合することができる。

「一本鎖Ｆｖ」（略語は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」でもある）は、単一のポリペプチド鎖として連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施例において、ｓｃＦｖポリペプチドは、Ｖ_ＨとＶ_Ｌドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、該ポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖに関する概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［モノクローナル抗体の薬理学］，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅによる編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ［シュプラガー出版社］，ニューヨーク，ページ２６９～３１５（１９９４）を参照されたい。

本明細書の目的のために、「受容体ヒトフレームワーク」又は「ヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークに「由来する」受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は、アミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下であってもよい。いくつかの実施例において、ＶＬ受容体フレームワークとＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒト共有フレームワーク配列とは、配列の方面では同じである。

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書に使用されるように、「結合親和性」は、内部結合親和性を指し、それは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）で表されてもよい。親和性は、当分野の既知の通常の方法（本明細書に記載のものを含む）で測定されてもよい。以下、結合親和性を測定するための特定の説明と例示的な実施例を記述する。

「親和性が成熟した」抗体は、このような改変を有しない親抗体に比べて、一つ又は複数のＣＤＲ又は高可変領域（ＨＶＲ）において一つ又は複数の改変を有する抗体を指し、該改変は、抗原に対する抗体の改善した親和性を提供する。

本明細書に使用されるように、「ＧＰＣ３」、「ＧＰＣ３タンパク質」又は「ＧＰＣ３ポリペプチド」は、任意の脊椎動物由来（哺乳動物、例えば、霊長類動物（例えば、ヒトとカニクイザル）を含む）からの任意のＧＰＣ３ポリペプチド、又はその任意の断片を指し、且つ多くとも一個、多くとも二個、多くとも三個、多くとも四個、多くとも五個、多くとも六個、多くとも七個、多くとも八個、多くとも九個又は多くとも十個のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を任意選択的に含んでもよい。該用語は、全長、プロセシングされていないＧＰＣ３及び細胞内でのプロセシングによって産生された任意の形態のＧＰＣ３を含む。該用語は、天然に存在するＧＰＣ３変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体をさらに含む。いくつかの実施例において、ＧＰＣ３ポリペプチドは、以下のＮＣＢＩ参照番号を有する配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は有する：ＮＰ＿００１１５８０８９．１、ＮＰ＿００１１５８０９０．１、ＮＰ＿００１１５８０９１．１、ＮＰ＿００４４７５．１又はＸＰ＿０１６８８４９０２．１（本明細書の相同性は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを用いて確定され得る）。いくつかの実施例において、ＧＰＣ３ポリペプチドは、配列番号１４の全体又は連続部分としてのアミノ酸配列を含むか又は有する。

「ＧＰＣ３のＥＣＤ」という用語は、ＧＰＣ３の細胞外ドメインを指す。いくつかの実施例において、ＥＣＤはＮ末端ＥＣＤである。いくつかの実施例において、ＥＣＤはＣ末端ＥＣＤである。いくつかの実施例において、例示的ＧＰＣ３ポリペプチドのＣ末端ＥＣＤは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含んでもよい。

「抗ＧＰＣ３抗体」及び「ＧＰＣ３に結合する抗体」という用語は、ＧＰＣ３を標的とする診断剤及び／又は治療剤として使用することができるように、十分な親和性でＧＰＣ３に結合することができる抗体を指す。一実施例において、抗ＧＰＣ３抗体と無関係な非ＧＰＣ３タンパク質との結合の程度は、該抗体とＧＰＣ３との結合の約１０％よりも小さく、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）}表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。いくつかの実施例において、ＧＰＣ３に結合する抗体は、以下の解離定数（ＫＤ）を有する。＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約０．１ｎＭ、＜約０．０１ｎＭ又は＜約０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ又はより小さく、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍ）。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、異なる種からのＧＰＣ３に保存されているＧＰＣ３エピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、タンパク質のＥＣＤにおけるＧＰＣ３上のエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、タンパク質のＣ末端ＥＣＤにおけるＧＰＣ３上のエピトープに結合する。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。いくつかの実施例において、本明細書に開示されるキメラ抗体は、ラクダ科動物重鎖可変領域と、ヒトＦｃ領域とを含む。

本明細書に使用されるように、「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の可変領域内の不連続な抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ［米国保健福祉省］，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ［免疫学的意味を有するタンパク質配列］」（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－ＬａｚｉｋａｎｉＢ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２７３：９２７－９４８（１９９７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２６２：７３２－７４５（１９９６）、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］，４５：３８３２－３８３９（２００８）、ＬｅｆｒａｎｃＭ．Ｐ．ら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［発生と比較免疫学］，２７：５５－７７（２００３）、並びにＨｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，３０９：６５７－６７０（２００１）に記述されており、ここで、相互比較の時、アミノ酸残基を含む重複又はサブセットが定義される。しかしながら、いずれか一つの定義を応用して抗体又は移植した抗体又はその変異体を指すＣＤＲは、本明細書で定義されて使用される用語の範囲内であることが意図される。上記各参照文献に定義されているＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、下記表１に入れられて比較に用いられる。ＣＤＲ予測アルゴリズムとインターフェースは、当分野の既知のものであり、例えば、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］，４５：３８３２－３８３９（２００８）、ＥｈｒｅｎｍａｎｎＦ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．［核酸研究］，３８：Ｄ３０１－Ｄ３０７（２０１０）、及びＡｄｏｌｆ－ＢｒｙｆｏｇｌｅＪ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．［核酸研究］，４３：Ｄ４３２－Ｄ４３８（２０１５）を含む。本章節において参照される参照文献の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれ、本出願に用いられ、且つ本明細書の一つ又は複数の請求項に含まれる可能性がある。

表１：ＣＤＲ定義

表現である「例えば、Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「例えば、Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変異体は、上記Ｋａｂａｔらの抗体アセンブラの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応するより少なく又は別のアミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔの残基５２ａに基づくものである）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔの残基８２ａ、８２ｂと８２ｃなどに基づくものである）を含んでもよい。所与の抗体の残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列との相同性領域におけるアラインメントによって確定され得る。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体（例えば、本明細書に開示される単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体）のＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、上記のＬｅｆｒａｎｃらのＩＭＧＴ命名法に基づいて定義される。いくつかの実施例において、全長抗体のＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、上記のＫａｂａｔらのＫａｂａｔ命名法に基づいて定義される。いくつかの実施例において、免疫グロブリン重鎖、例えば、Ｆｃ領域における残基番号付けは、上記Ｋａｂａｔらに記載のＥＵインデックスの番号付けである。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外のそれらの可変ドメイン残基を指す。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ／ＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基のキメラ抗体を指す。いくつかの実施例において、ヒト化抗体は、基本的に少なくとも一つ、典型的に二つの可変ドメインの全てを含み、そのうち、ＨＶＲ／ＣＤＲの全て又は基本的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、且つＦＲの全て又は基本的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含む。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。

「ヒト抗体」は、アミノ酸配列を有する抗体であり、該アミノ酸配列は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応し、及び／又は、本明細書に開示されるヒト抗体の調製のための任意の技術によって調製された。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。当分野の既知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を用いてヒト抗体を産生してもよい。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２２：５８１（１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の調製にも使用可能であるものは、Ｃｏｌｅら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ［モノクローナル抗体と癌療法］，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ページ７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載の方法である。また、ｖａｎＤｉｊｋ及びｖａｎｄｅＷｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．［ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ］，５：３６８－７４（２００１）を参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効になったトランスジェニック動物（例えば、免疫したｘｅｎｏｍｉｃｅ）に抗原を投与することによって調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）技術に関わる米国特許第６，０７５，１８１号と第６，１５０，５８４号を参照されたい）。さらに、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体に関するＬｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，１０３：３５５７－３５６２（２００６）を参照されたい。

「本明細書によって同定されるポリペプチド及び抗体配列に関わるアミノ酸配列同一性パーセント（％）」又は「相同性」を、配列の整列（配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮する）の後、候補配列における、比較されるポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同じであるアミノ酸残基のパーセントと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するという目的のために、当分野の技術における種々の方法で背列を実現させることができ、例えば、公衆に取得可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）又はＭＵＳＣＬＥソフトウェアを用いてもよい。当業者は、比較される配列の全長範囲内に最大整列を実現させる任意のアルゴリズムを含み、測定整列に用いられる適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、配列比較コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥを用いて、アミノ酸配列同一性％の値を生成する（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ［核酸研究］３２（５）：１７９２－１７９７，２００４、Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ［ＢＭＣ生物情報学］５（１）：１１３，２００４）。

「相同」は、二つのポリペプチド間又は二つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。二つの比較配列の一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される時、例えば、二つのＤＮＡ分子のそれぞれの一つの位置がアデニンによって占有される時、該分子は、該位置で相同である。二つの配列間の相同性パーセントは、二つの配列が共有するマッチするか又は相同な位置の数を比較される位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、二つの配列における１０個の位置のうちの６個は、マッチするか又は相同なものであれば、二つの配列は、６０％相同である。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を有する。通常、二つの配列が最大相同性を与えるように整列される時に、比較が行われる。

「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリン分子の一部を指し、それは、免疫グロブリンの別の部分、即ち可変ドメインに対して、保存性がより高いアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列は抗原結合部位を含む。定常ドメインは、重鎖のＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメイン（Ｃ_Ｈと総称される）と、軽鎖のＣ_Ｌドメインとを含む。

任意の哺乳動物種の抗体（例えば、免疫グロブリン）の「軽鎖」は、いずれも、その定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、二つの明らかに異なるタイプのうちの一つとして指定することができ、それぞれｋａｐｐａ（「κ」）及びｌａｍｂｄａ（「λ」）と呼ばれる。

「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）まで延びる。

「ヒンジ領域」は、通常、ＩｇＧにおける、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に対応する領域と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のＳ－Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。

ヒトＩｇＧＦｃ領域（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密にペアリングしていないため、ユニークである。代わりに、二つのＮ連結した分岐炭水化物鎖が、完全な天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。推測によれば、炭水化物は、ドメイン－ドメインペアリングした代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化に寄与することができる。Ｂｕｒｔｏｎ，ＭｏｌｅｃＩｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）。

「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）は、ＣＨ２ドメインとＦｃ領域のＣ末端との間の残基（即ち、約アミノ酸残基３４１から抗体配列のＣ末端まで）を含み、通常、ＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７にある。

本明細書における「Ｆｃ領域」又は「断片結晶可能領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するためのものであり、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界が変化可能であるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域をＣｙｓ２２６位置でのアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル基末端まで延びるものと定義する。例えば、抗体の生産又は精製期間又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換えてエンジニアリングを行うことによって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムの残基４４７に基づくものである）を除去することができる。したがって、完全な抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基を除去した抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群及びＫ４４７残基を付帯するか又は付帯しない抗体混合物を有する抗体群を含んでもよい。本明細書に記載の抗体に用いられる適切な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。なお、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むＦｃＲであり、対立遺伝子変異体又はこれらの受容体のスプライス形式を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）とＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）とを含み、それは、類似するアミノ酸配列を有し、主な区別は、その細胞質ドメインにある。活化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］１５：２０３－２３４（１９９７）を参照されたい。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ［免疫方法］４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅＨａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．［実験室及び臨床医学雑誌］１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。本明細書の「ＦｃＲ」という用語は、他のＦｃＲをカバーし、将来同定されるＦｃＲを含む。

本明細書に使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗体又は抗体誘導体が結合する抗原上の特定の原子又はアミノ酸基を指す。二つの抗体又は抗原結合部分は、抗原に対して競合的結合を有すれば、それらは、抗原内の同じエピトープに結合できる。

本明細書に使用されるように、「特異的に結合」、「特異的に認識」及び「……に対して特異性を有する」という用語は、測定と再現が可能である相互作用を指し、例えば、標的と抗体又は抗体部分との結合であり、これは、ヘテロ分子（生体分子を含む）群が存在する時の標的の存在を決定する。例えば、標的（エピトープであってもよい）を特異的に認識する抗体又は抗体部分は、該標的に結合する抗体又は抗体部分であり、その親和性、アビディティ、レディー及び／又は持続時間は、他の標的との結合よりも長い。いくつかの実施例において、抗体と関係のない標的との結合程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される抗体と標的との結合程度よりも約１０％小さい。いくつかの実施例において、標的に特異的に結合する抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）≦１０^－５Ｍ、≦１０^－６Ｍ、≦１０^－７Ｍ、≦１０^－８Ｍ、≦１０^－９Ｍ、≦１０^－１０Ｍ、≦１０－^１１Ｍ、又は ≦１０^－１２Ｍである。いくつかの実施例において、抗体は、異なる種からのタンパク質の中で保存されているタンパク質のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施例において、特異的結合は、排他的結合を含んでもよいが、これに限定しない。抗体又は抗原結合ドメインの結合特異性は、当分野の既知の方法で実験によって確定されてもよい。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ－検定とペプチド走査を含むが、それらに限らない。

「単離した」抗体（又はコンストラクト）は、その生産環境の成分（例えば、天然又は組換え）から同定、単離及び／又は回収された抗体である。いくつかの実施例において、単離したポリペプチドは、生産環境において全ての他の成分に会合しないか又は実質的に会合しない。

本明細書に記載のコンストラクト、抗体又はその抗原結合断片をコードする「単離した」核酸分子は、その生産環境において、通常、それに関連する少なくとも一つの汚染物核酸分子から同定されて単離された核酸分子である。いくつかの実施例において、単離した核酸は、生産環境に関連する全ての成分に会合しないか又は実質的に会合しない。本明細書に記載のポリペプチドと抗体をコードする単離した核酸分子の形式は、天然に存在する形式又はバックグラウンドと異なる。したがって、単離した核酸分子は、細胞に天然に存在する本明細書に記載のポリペプチドと抗体をコードする核酸と異なる。単離した核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる該核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外又はその天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。

「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において、操作可能に連結されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適用される制御配列は、プロモーター、任意選択的なオペロン配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。

核酸が別の核酸配列と機能的関係にある場合、該核酸は「操作可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダー配列のＤＮＡが、ポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、該プレ配列又は分泌リーダー配列のＤＮＡは、該ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、該プロモーター又はエンハンサーは、該配列に操作可能に連結され、又はリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように局在化されている場合、該リボソーム結合部位は、コード配列に操作可能に連結される。通常、「操作可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、且つ分泌リーダー配列の場合には連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、必ずしも連続的である必要はない。便利な制限部位で連結を行うことで、連結を実現させる。このような部位が存在しなければ、通常の実践に基づいて、合成したオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いる。

本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造とするベクター、及びそれが導入された宿主細胞ゲノムに組み込まれたベクターを含む。いくつかのベクターは、それに操作可能に連結される核酸の発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

本明細書に使用されるように、「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」という用語は、外来核酸を宿主細胞に転移又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」細胞は、外来核酸を用いて、トランスフェクト、形質転換又は形質導入した細胞であり、該細胞は、初代被験体細胞及びその子孫を含む。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換使用可能であり、外来核酸を導入した細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と、「形質導入細胞」とを含み、それは、初代形質転換細胞及びそれから派生した子孫を含むが、継代回数とは無関係である。子孫の核酸含有量は親細胞とは異なる可能性があり、且つ突然変異を含有する可能性がある。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択された機能又は生物学的活性と同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が本明細書に含まれる。

「被験体」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書において、互換使用可能であり、哺乳動物を指し、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類動物又は霊長類動物を含むが、それらに限らない。いくつかの実施例において、被験体は、ヒトである。

薬剤の「有効量」は、必要な投与量と期間内に、必要な治療又は予防効果を効果的に達する量を指す。該特定の投与量は、選択された特定の薬剤、その後の投与方案（他の化合物と組み合わせるか否かに関わらず）、投与時間、結像組織、及びそれを付帯する物理的送達システムのうちの一つ又は複数に応じて変わってもよい。

本出願の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、例えば、疾患状態、年齢、性別及び個体の体重及び該物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが個体において所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変わってもよい。治療有効量はさらに、該物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害作用のいずれもが治療上の有益な効果によって打ち消される量である。治療有効量は、一回又は複数回の投与で送達することができる。

「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに必要な用量及び期間での有効量を指す。典型的には、必須ではなく、予防の投与量は、疾患の前又は初期に被験体において使用されるため、そのような予防有効量は、治療有効量よりも小さい。

本明細書に使用されるように、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ又はｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るための方法である。本出願の目的のために、有益又は所望の臨床結果は、疾患によって引き起こされる一つ又は複数の症状を軽減すること、疾患の程度を減少させること、疾患を安定させること（例えば、疾患の悪化を予防又は遅延させること）、疾患の伝播（例えば、移転）を予防又は遅延させること、疾患の再現を予防又は遅延させること、疾患の進行の速度を遅延又は緩めること、疾患状態を改善すること、疾患の軽減（一部又は全部）を提供すること、疾患の治療に必要な一つ又は複数の他の薬物の投与量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を増加又は改善すること、体重増加を増加させること及び／又は生存期間を延長することのうちの一つ又は複数を含むが、それらに限らない。「治療」は、癌の病理的結果（例えば、腫瘍体積）を減少させることをさらにカバーする。本出願の方法は、これらの治療の方面のうちのいずれか一つ又は複数を考慮する。「治療」は、治療される疾患が治癒されることを必ずしも意味しない。

理解すべきこととして、本明細書に記載の本出願の実施例は、「実施例からなる」及び／又は「実質的に実施例からなる」を含む。

本明細書に使用されるように、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「大体（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定値が許容される誤差範囲内にあることを意味し、これは、該値がどのように測定又は決定されるかによって部分的に決まり、即ち、測定システムによって制限される。いくつかの実施例において、「約」は、当分野の実践によれば、３つ又は３つを超える標準差内にあることを意味してもよい。いくつかの実施例において、「約」は、所定値の多くとも２０％（例えば、多くとも１０％、多くとも５％又は多くとも１％）の範囲を表すことができる。いくつかの実施例において、特に、生物学的システムと方法に対して、該用語は、ある値のオーダー内、例えば、５倍内又は２倍内にあることを意味してもよい。

本明細書に使用されるように、「調節」という用語は、正の方向又は負の方向に変化させることを指す。例示的な調節は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％又は約１００％の変化を含む。

本明細書に使用されるように、「増加」という用語は、正の方向に少なくとも約５％変化させることを指す。変化は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％又はより多くてもよい。

本明細書に使用されるように、「減少」という用語は、負の方向に少なくとも約５％変化させることを指す。変化は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％又はひいては約１００％であってもよい。

本明細に用いられる「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有する。

本明細書と添付される請求項に用いられる時、単数形「一つ／種（ａ）」、「又は（ｏｒ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、文脈が他の状況を明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。

「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域によるそれらの生物学的活性を指し、これは、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御及びＢ細胞活性化が挙げられる。

「免疫コンジュゲート」は、一つ又は複数の異種分子（細胞傷害性剤を含むが、それに限らない）にコンジュゲートされた抗体を指す。

「薬物製剤」という用語は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形式にあり、且つ製剤が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する他の成分を含有しない製剤である。

本明細書に使用されるように、「薬学的に許容されるキャリア剤」は、薬物製剤における活性成分以外の被験体に対して無毒である成分を指す。薬学的に許容されるキャリア剤は、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含むが、それらに限らない。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指し、それは、抗体と抗原との結合に関与する。いくつかの実施例において、天然抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨとＶＬである）は、通常、類似する構造を有し、各ドメインは、四つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）と三つのＣＤＲを含む。（例えば、ＫｉｎｄｔらＫｕｂｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［Ｋｕｂｙ免疫学］，第６１版，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．［Ｗ．Ｈ．フリーマン社］，ページ９１（２００７）．を参照されたい）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。なお、ＶＨ又はＶＬドメインを用いて、抗原に結合する抗体から、特定の抗原に結合する抗体を単離させ、相補型ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

本明細書に使用されるように、「抗原認識受容体」という用語は、抗原へのその結合に応答して免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を指す。抗原認識受容体の非限定的な例は、天然及び修飾されたＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）とキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）とを含む。

本明細書に使用されるように、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを含む分子を指し、該細胞外抗原結合ドメインは、免疫応答性細胞を活性化又は刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインと融合する。いくつかの実施例において、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、抗体又は抗体断片、例えば、ＶＨＨ又はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施例において、抗体（例えば、ＶＨＨ又はｓｃＦｖ）は、膜貫通ドメインと融合し、該膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインと融合する。いくつかの実施例において、抗原に対して高い結合親和性又はアビディティを有するＣＡＲを選択する。

「免疫応答性細胞」は、免疫応答において機能する細胞、又はその祖先もしくは子孫を指す。

２．抗体及び抗体誘導体
本開示は、単離されたモノクローナル抗体及び抗体誘導体を提供し、単一特異性抗ＧＰＣ３抗体と、ＧＰＣ３及び一つ又は複数の別の標的に結合する多重特異性抗体とを含む。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、本開示は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体の発見に部分的に基づき、該単一ドメイン抗体は、抗腫瘍治療に用いることができ、ここで、抗体は、腫瘍細胞の標的化及び／又はＧＰＣ３媒介性シグナル経路の阻害を選択的に行うことによって、腫瘍細胞に対する有益な抗腫瘍作用を誘導する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される単一ドメイン抗体は、アンタゴニスト抗体であり、ＧＰＣ３機能を阻害する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＧＰＣ３タンパク質を発現する腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答を増強することができる。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物抗体又はＶＨＨ抗体を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、そのサイズがＩｇＧ、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ形式の従来の抗体より小さいため、改善した組織浸潤能力を有する。

いくつかの実施例において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体又は人抗体を含む）であってもよく、又はそれを含んでもよい。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体は、ヒト化抗体を含む。いくつかの実施例において、抗体は、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。

いくつかの実施例において、本開示の抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）２断片であってもよい。いくつかの実施例において、抗体は、全長抗体、例えば、完全なＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義される他の抗体タイプ又はアイソタイプである。いくつかの実施例において、本開示の抗体又は抗体誘導体は、任意の（本出願に記載の（例えば、本明細書に詳細に記述された第２．１～２．１２節））特徴が単独に又は組み合わせの形式で組み込まれてもよい。

本開示の抗体及び抗体誘導体は、例えば、新生物又は癌の診断又は治療に用いることができる。いくつかの実施例において、本開示の抗体を用いることでその増殖を阻害することができる腫瘍形成及び癌は、通常、免疫療法に応答する腫瘍形成と癌を含む。いくつかの実施例において、腫瘍形成と癌は、乳癌（例えば、乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば、卵巣細胞癌）及び腎臓細胞癌（ＲＣＣ）を含む。本開示の方法で治療できる他の癌の例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫）、鼻咽癌（ｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭又は頸癌、皮膚癌又は眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外膣、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、乳癌（ｃａｎｃｅｒｏｆｔｈｅｂｒｅａｓｔｇｌａｎｄ）、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、乳癌骨盤癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｂｒｅａｓｔｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管生成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮様癌、扁平上皮癌、石綿（例えば、中皮腫）によって誘導される癌を含む環境によって誘導される癌、及び前記癌の組み合わせが挙げられる。

２．１例示的単一特異性抗体及び多重特異性抗体
２．１．１例示的抗ＧＰＣ３抗体
本開示は、ＧＰＣ３タンパク質に結合する、単離された抗体を提供する。いくつかの実施例において、本開示の抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３のＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３のＣ末端ＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、Ｃ末端ＥＣＤは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、本明細書に記載の抗ＧＰＣ３抗体（例えば、１Ｂ０１）と同じエピトープに結合する。

いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３のシグナル経路に基づくアンタゴニストとして作用し得る。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３タンパク質依存性シグナル経路を遮断するか又は減少させることができる。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、シグナル経路の活性を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％又は約９９．９％低下させることができる。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体を用いた治療は、被験体において、抗腫瘍の効果を示し、それにより腫瘍増殖を減少させ、及び／又は、被験体の生存期間を延長する。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）の、ＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答及び／又は抗腫瘍作用を増加させる。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む抗ＧＰＣ３抗体は、全長抗体に比べて、より小さい分子サイズを有し、その理由は、全長抗体のＦａｂドメインに比べて、単一ドメイン抗体のサイズが小さいことであり、これは、全長抗体に比べて、例えば、腫瘍部位でのより優れた組織浸潤を引き起こすことができる。いくつかの実施例において、全長抗ＧＰＣ３抗体を用いた治療に比べて、抗ＧＰＣ３抗体を用いた治療は、より優れた抗腫瘍効果を示す。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結されない。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－７Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約５ｘ１０^－９Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－９Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１１Ｍ～約１ｘ１０^－７ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－７ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－８ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１１Ｍ～約１ｘ１０^－９ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２ｘ１０^－１０Ｍ～約５ｘ１０^－９ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－９Ｍ～約５ｘ１０^－８ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－９ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＧＰＣ３への結合について、参照抗ＧＰＣ３単一ドメイン抗体と交差競合し、該単一ドメイン抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＧＰＣ３への結合について、参照抗ＧＰＣ３単一ドメイン抗体と交差競合し、該単一ドメイン抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ａ）配列番号１及び５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、ｂ）配列番号２及び６のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、ｃ）配列番号３及び７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。

いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここで、該ＣＤＲ１ドメイン、該ＣＤＲ２ドメイン及び該ＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号４、８と１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号４、８及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号４、８及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施例において、重鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸置換は、保存的置換である。

いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号１２に示す重鎖可変領域配列のフレームワーク配列を含む。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、Ｆｃ領域を含まない。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、Ｆｃ領域をさらに含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの突然変異を含む。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、重鎖可変領域は、リンカーを介してＦｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４～約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１６～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、全長免疫グロブリン、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合が安定したＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨＨ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施例において、抗体は、抗体誘導体としての大きな分子に含まれる。いくつかの実施例において、抗体誘導体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体であり、ここで、多重特異性抗体は、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体部分を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施例において、腫瘍関連抗原は、Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＭＳＬＮ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、上皮糖タンパク質（ＥＧＰ２）、栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ＬｅｗｉｓＡ（ＣＡ１．９．９）、ＬｅｗｉｓＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ＮＧ２Ｄリガンド、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、腎芽細胞腫タンパク質（ＷＴ－１）、１型チロシンキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１）、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施例において、第２の抗原は、免疫チェックポイント調節剤である。いくつかの実施例において、免疫チェックポイント調節剤は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施例において、抗体誘導体又は多重特異性抗体と第２の抗原との結合は、免疫チェックポイント調節剤を阻害する。いくつかの実施例において、第２の抗原は、免疫共刺激分子又はＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体のサブユニットである。いくつかの実施例において、免疫共刺激分子は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施例において、抗体誘導体又は多重特異性抗体と第２の抗原との結合は、免疫共刺激分子を活性化する。いくつかの実施例において、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体のサブユニットは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施例において、抗体誘導体又は多重特異性抗体と第２の抗原との結合は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体を活性化する。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、リンカーを介して第２の抗原結合部分に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４～約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１６～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３抗体は、治療剤又はマーカーにコンジュゲートされる。いくつかの実施例において、マーカーは、放射性同位体、蛍光色素及び酵素からなる群から選択される。

２．１．２例示的抗４－１ＢＢ抗体
本開示は、抗４－１ＢＢ抗体をさらに提供する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗４－１ＢＢ抗体は、高親和性で４－１ＢＢタンパク質に結合する。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、アゴニスト抗体であり、ここで、抗体部分と４－１ＢＢとの結合は、４－１ＢＢにより媒介される免疫シグナル伝達経路を増強することができる。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を活性化することができる。いくつかの実施例において、抗体は、中国特許出願第ＣＮ２０２０１０１２８２９０．３号に開示された任意の抗４－１ＢＢ抗体（抗ＣＤ１３７抗体又は抗ＣＤ１３７コンストラクトとも呼ばれる）であり、該中国特許出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、参照抗４－１ＢＢ抗体と交差競合し、該参照抗体は、ａ）（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又はｂ）（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。

いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。

いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７、６７及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５８、６８及び７８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７、６７及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５８、６８及び７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号６７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号７７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号７８に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列のうちのいずれか一つは、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸置換は、保存的置換である。

いくつかの実施例において、抗４－１ＢＢ抗体は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。

いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗４－１ＢＢ抗体は、ヒト化フレームワークを含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号５７、６７及び７７からなる群から選択される重鎖可変領域配列の重鎖フレームワーク配列を含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号５８、６８及び７８からなる群から選択される重鎖可変領域配列の軽鎖フレームワーク配列を含む。

２．１．３例示的多重特異性抗体
本開示は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体をさらに提供する。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原又は抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体誘導体である。いくつかの実施例において、結合特異性の一つはＧＰＣ３上に存在するエピトープに対するものであり、もう一つは異なる抗原上に存在するエピトープに対するものである。いくつかの実施例において、結合特異性の一つは４－１ＢＢ上に存在するエピトープに対するものであり、もう一つは異なる抗原上に存在するエピトープに対するものである。いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体は、ＧＰＣ３上のエピトープ及び４－１ＢＢ上のエピトープに結合することができる。いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体は、全長抗体、抗体断片及び／又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。

いくつかの実施例において、本明細書に開示される多重特異性抗体は、ＧＰＣ３及び４－１ＢＢに結合する。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二重特異性抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体である。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる結合特異性を有し、例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び５，８３７，２４３号、Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ［免疫学雑誌］．１６３：１２４６－１２５２、Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［ヒト抗体］９：４７－５４、Ｋｅｌｅｒ（１９９７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ［癌研究］．５７：４００８－４０１４を参照されたい。例えば、本開示のテーマは、ＧＰＣ３上に存在する第１のエピトープに対する抗原結合部分と、４－１ＢＢ上に存在する第２のエピトープに対する第２の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体を提供するが、それに限らない。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、本明細書に開示される抗ＧＰＣ３抗体を含有する第１の抗原結合部分と、本明細書に開示される抗４－１ＢＢ抗体を含有する第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達のアゴニストとして用いられ得る。いくつかの実施例において、いかなる理論にも束縛されるものではないが、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体の抗ＧＰＣ３部分は、抗体を腫瘍部位に誘導及び／又は集中させることによって、腫瘍部位付近の免疫細胞の抗腫瘍機能を強化し、及び／又は末梢細胞の毒性及び副作用を低下させることができる。いくつかの実施例において、単一特異性抗ＧＰＣ３抗体又は単一特異性抗４－１ＢＢ抗体を用いた治療に比べて、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体を用いた治療は、より優れた抗腫瘍効果を示す。いくつかの実施例において、単一特異性抗ＧＰＣ３抗体と単一特異性抗４－１ＢＢ抗体との組み合わせを用いた治療に比べて、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体を用いた治療は、より優れた抗腫瘍効果を示す。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ多重特異性抗体は、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分とを含み、該第１の抗原結合部は、ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含む抗ＧＰＣ３抗体を含み、該第２の抗原結合部分は、４－１ＢＢに結合する抗４－１ＢＢ抗体を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、本明細書に開示される抗ＧＰＣ３抗体を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、本明細書に開示される抗４－１ＢＢ抗体を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、中国特許出願第ＣＮ２０２０１０１２８２９０．３号に開示された抗４－１ＢＢ抗体を含み、該中国特許出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む。

いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体は、ヒト化フレームワークを含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号１２の重鎖可変領域配列のフレームワーク配列を含む。

いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ多重特異性抗体は、多価抗体であってもよい。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価のものであってもよい。いくつかの実施例において、抗ＧＰＣ３／抗４－１ＢＢ抗体の第１及び第２の抗原結合部分のそれぞれは、一価、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価のものであってもよい。いくつかの実施例において、第１と第２の抗原結合部分のそれぞれは、一価のものである。いくつかの実施例において、第１と第２の抗原結合部分のそれぞれは、二価のものである。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二価のものである。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、四価のものである。

いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、リンカーを介して第２の抗原結合部分に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１６～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分的抗４－１ＢＢ抗体はＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８１に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８２に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む。

いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二本の抗４－１ＢＢ抗体重鎖と二本の抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含み、各本の抗体重鎖は、抗ＧＰＣ３抗体に連結され、配列番号８１に示すアミノ酸配列を含み、該抗体軽鎖は、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二本の抗４－１ＢＢ抗体重鎖と二本の抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含み、各本の抗体重鎖は、抗ＧＰＣ３抗体に連結され、配列番号８２に示すアミノ酸配列を含み、該抗体軽鎖は、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二本の抗４－１ＢＢ抗体重鎖と二本の抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含み、各本の抗体重鎖は、抗ＧＰＣ３抗体に連結され、配列番号８３に示すアミノ酸配列を含み、該抗体軽鎖は、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二本の抗４－１ＢＢ抗体重鎖と二本の抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含み、各本の抗体重鎖は、抗ＧＰＣ３抗体に連結され、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含み、該抗体軽鎖は、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む。

２．２抗体親和性
いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体は、その標的抗原に対して高い結合親和性を有する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－７Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約５ｘ１０^－９Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－９Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。

いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１１Ｍ～約１ｘ１０^－７ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－７ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－８ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１１Ｍ～約１ｘ１０^－９ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約２ｘ１０^－１０Ｍ～約５ｘ１０^－９ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－９Ｍ～約５ｘ１０^－８ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約１ｘ１０^－９ＭのＫＤで標的に結合する。

抗体又は抗体誘導体のＫＤは、当分野の既知の方法で決定されてもよい。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、Ｏｃｔｅｔ－ＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）}－テストとペプチド走査を含むが、それらに限らない。

いくつかの実施例において、ＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）}表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫＤを測定してもよい。例えば、固定した抗原ＣＭＳチップ上で、約１０個の応答単位（ＲＵ）、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）}－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）} ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州（ＮＪ））を用いて測定を行うが、それに限らない。いくつかの実施例において、サプライヤーのマニュアルに応じて、カルボキシメチル化デキストランシンターセンサチップ（ＣＭＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ社）に対して、Ｎ－エチル－Ｎ′－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化を行う。ｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、そして、５μｌ／分の流速で注入して、コンジュゲートタンパク質の約１０個の応答単位（ＲＵ）を実現させる。抗原を注入した後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のために、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳにおけるＦａｂの二倍の連続希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を約２５μｌ／ｍｉｎの流速で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ^{（登録商標）}評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合と解離センサグラムを同時にフィッティングすることで計算される。平衡解離定数（ＫＤ）を比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算してもよい。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される会合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）が１０^６Ｍ^－ｌｓ^－１を超えると、蛍光消光技術によって会合速度を確定してもよく、該技術は、増加した抗原濃度（例えば、分光器、例えば、パスカット構成の分光光度計（アファフ機器（ＡｖｉｖＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））又は撹拌吸収プールを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ^（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社）により測定される）の存在で、２５℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）における２０ｎＭ抗－抗原抗体（Ｆａｂ形式）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加又は減少を測定する。

２．３抗体断片
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、抗原結合断片又は抗体断片を含む。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＦｖとｓｃＦｖ断片、及び本明細書に記載の他の断片を含むが、それらに限らない。いくつかの抗体断片の概説について、ＨｕｄｓｏｎらＮａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片に関する概説は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｔｉｎ，ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［モノクローナル抗体の薬理学］，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅによる編集，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ［シュプラガー出版社］，ニューヨーク），ページ２６９～３１５（１９９４）を参照されたく、さらに、ＷＯ９３／１６１８５、及び米国特許第５，５７１，８９４号及び５，５８７，４５８号を参照されたい。救済受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂとＦ（ａｂ）_２断片に関する検討は、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

いくつかの実施例において、本開示の抗体は、ダイアボディであってもよい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディとテトラボディはさらに、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）に記述されている。

いくつかの実施例において、本開示の抗体は、単一ドメイン抗体を含んでもよい。単一ドメイン抗体は、抗体の全部又は一部の重鎖可変ドメイン、又は、全部又は一部の軽鎖可変ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（マサチューセッツ州ウォルサムＤｏｍａｎｔｉｓ社（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂｌを参照されたい）。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物単一ドメイン抗体である。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨである。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。

抗体断片は、複数の技術によって調製されてもよく、これらの技術は、本明細書に記載のように、完全な抗体のタンパク質分解消化及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）の生産を含むが、それらに限らない。

２．４キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記述されている。いくつかの実施例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウスに由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。いくつかの実施例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから改変した「クラス転換」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

いくつかの実施例において、本開示の抗体は、ヒト化抗体であってもよい。通常、非ヒト抗体に対してヒト化を行い、ヒトに対する免疫原性を減少させると共に、親非ヒト抗体の特異性と親和性を残す。通常、ヒト化抗体は、一つ又は複数の可変ドメインを含み、ここで、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ、（又はその一部）は、非ヒト抗体から派生し、一つ又は複数のフレームワーク（ＦＲ）（又はその任意の部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部をさらに含んでもよい。いくつかの実施例において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基に由来する抗体）からの該当する残基によって置換され、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善する。

ヒト化抗体及びその調製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．［生物科学の最前線］１３：１６１９－１６３３（２００８）に記述されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、７，５２７，７９１号、６，９８２，３２１号及び７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植が記述された）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」が記述された）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」が記述された）、及びＯｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：６１－６８（２００５）、及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ［英国癌雑誌］，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイド選択」方法が記述された）にさらに記述されている。

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域は、「最適フィッティング」方法で選択されるフレームワーク領域（例えば、ＳｉｍｓらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブクラスのヒト抗体の共有配列に由来するフレームワーク領域（例えば、ＣａｒｔｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒトの成熟した（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．［生物科学の最前線］１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）を含むが、それらに限らない。

２．５ヒト抗体
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、ヒト抗体（例えば、ヒトドメイン抗体又はヒトＤＡｂ）であってもよい。ヒト抗体は、当分野の既知の異なる技術を用いて産生されてもよい。ヒト抗体は、一般的には、ｖａｎＤｉｊｋ及びｖａｎｄｅＷｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ［ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ］．５：３６８－７４（２００１），Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］２０：４５０－４５９（２００８）及びＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記述されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（又はＤＡｂ）を産生できるトランスジェニックマウス又はラットは、当分野の既知のものである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。

抗原攻撃に応答して、完全ヒト抗体又はヒト可変領域を有する完全抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって、ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）を調製することができる。このような動物は、通常、全部又は一部のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有し、それらが内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換しており、又は、染色体外に存在し、又は動物の染色体にランダムに組み込まれる。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説について、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。さらに、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術が記述されている米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ^{（登録商標）}技術が記述されている米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－ＭＭＯＵＳＥ^{（登録商標）}技術が記述されている米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ^{（登録商標）}技術が記述されている米国特許出願公開番号ＵＳ２００７／００６１９００）を参照されたい。このような動物によって産生された完全抗体からのヒト可変領域は、（例えば、異なるヒト定常領域に結合することで）さらに修飾されてもよい。

ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ハイブリドーマに基づく方法で調製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫とマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株は記述されている（例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［モノクローナル抗体の生産技術及び応用］，ページ５１－６３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．［マルセルデッカー社］，ニューヨーク，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体は、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記述されている。別の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からモノクローナルヒトＩｇＭ抗体を生産することが記述された）とＮｉ，ＸｉａｎｄａｉＭｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマが記述された）に記述のそれらの方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）は、ＶｏｌｌｍｅｒｓとＢｒａｎｄｌｅｉｎ，ＨｉｓｔｏｌｏｇｙａｎｄＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ［組織学と組織病理学］，２０（３）：９２７－９３７（２００５）、及びＶｏｌｌｍｅｒｓとＢｒａｎｄｌｅｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＦｉｎｄｉｎｇｓｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ［実験と臨床薬理学の方法と発見］，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記述されている。

ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ヒトファージディスプレイライブラリーから選ばれるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することで産生されてもよい。そして、このような可変ドメイン配列を必要なヒト定常ドメインに結合させてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術に関する記述は、以下のとおりである。

２．６ライブラリーから派生した抗体
組み合わせライブラリーにおいて、所望の活性又は複数の活性を有する抗体をスクリーニングすることで、本開示の抗体を単離することができる。例えば、当分野において、ファージディスプレイライブラリーを産生し、このようなライブラリーにおける、必要な結合特性を有する抗体をスクリーニングする複数の方法が知られている。このような方法は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎらによる編集，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］，２００１）に記述されており、且つ例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，による編集，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］，２００３）、Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）の文献にさらに記述されている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築するための方法が記述されており、例えば、米国特許第７３７１８４９号を参照されたい。

いくつかのファージディスプレイ方法において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、クローンＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子ライブラリーをそれぞれクローニングし、ファージライブラリーにおいて、ランダムに組換えを行い、そして、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］，１２：４３３－４５５（１９９４）における記述に従って抗原結合ファージをスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片をｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片としてディスプレイする。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供することができる。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯＪ［欧州分子生物学会誌］，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載のように、自然ライブラリー（例えば、ヒトから得られる）を、いかなる免疫も必要とすることなくクローニングして、広範囲の非自己及び自己抗原に対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載のように、幹細胞から再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて高度に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を完了することによって、天然ライブラリーを合成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許刊行物は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３及び美国特許公開番号２００５／００７９５７４、２００５／０１１９４５５、２００５／０２６６０００、２００７／０１１７１２６、２００７／０１６０５９８、２００７／０２３７７６４、２００７／０２９２９３６及び２００９／０００２３６０を含む。

ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体又は抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。

２．７抗体変異体
本開示は、開示された抗体のアミノ酸配列変異体をさらに提供する。例えば、該抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性の改善を必要とする可能性がある。抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入するか又はペプチド合成を行うことによって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。このような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含むが、それらに限らない。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行うことで、最終的なコンストラクトを得ることができ、その条件は、最終的な（即ち、修飾した）抗体が必要な特性（例えば、抗原結合）を有することである。

２．７．１置換、挿入及び欠失変異体
いくつかの実施例において、一つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換変異誘発の目的部位は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）とＦＲとを含む。保存的置換は、表２における「好ましい置換」というテーマの下に示される。表２において、「例示的置換」というテーマの下では、より実質的な変化が提供され、且つ以下において、アミノ酸側鎖クラスを参照しながら、さらに記述される。アミノ酸の置換は、目的抗体に導入され、所望の活性（例えば、保持／改善した抗原結合、低下した免疫原性、又は改善したＡＤＣＣ又はＣＤＣ）に対して、生成物をスクリーニングすることができる。

表２．アミノ酸の置換

アミノ酸は、よく見られる鎖側の特性に応じて以下のようにグループ分けすることができる。（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。いくつかの実施例において、非保存的置換は、これらのクラスにおける一つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。

いくつかの実施例において、置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一つ又は複数の高可変領域残基の置換に係る。通常、更なる研究に用いられる、得られた変異体を選択し、親抗体に対して、いくつかの生物学的特性（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）で修飾（例えば、改善）し、及び／又は、親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は、親和性が成熟した抗体であり、この抗体は、生成しやく、例えばファージディスプレイに基づく、親和性が成熟した技術（例えば、本明細書に記載のもの）を用いる。簡単に言えば、一つ又は複数のＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基に対して突然変異を行い、且つ変異体抗体をファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に対してスクリーニングを行う。

ＨＶＲ（又はＣＤＲ）において、改変（例えば、置換）を行い、例えば、抗体親和性を改善することができる。このような改変は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）「ホットポイント」、即ち、体細胞成熟過程に高頻度で突然変異したコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学的方法］２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行われ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬの結合親和性を試験することができる。二次ライブラリーからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎらによる編集，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］，（２００１））に記述されている。親和性成熟のいくつかの実施例において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のうちのいずれか一つによって、多様性を、成熟のために選択された可変遺伝子に導入する。そして、二次ライブラリーを産生する。そして、ライブラリーをスクリーニングし、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）配向方法に関し、ここで、いくつかのＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する。例えば、アラニン走査突然変異誘発又はモデル化を用いて、抗原結合に関与するＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基を特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ－Ｈ３とＣＤＲ－Ｌ３は、常に標的となる。

いくつかの実施例において、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入又は欠失は、一つ又は複数のＨＶＲ（又はＣＤＲ）内に発生してもよい。例えば、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）において、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書による保存的置換）を行ってもよい。このような改変は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）「ホットポイント」又はＣＤＲ外にある可能性がある。以上に提供される変異体ＶＨＨ配列のいくつかの実施例において、各ＨＶＲ（又はＣＤＲ）は、改変されてないものであるか、又は、一つ、二つ又は三つ以下のアミノ酸置換を含むものである。

ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍａｎｄＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載のように、標的変異誘発を行うことができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。このような方法において、ターゲット残基の残基又は残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）を用いて置換を行うことで、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるか否かを決定する。アミノ酸の位置に別の置換を導入することで、初期置換に対する機能的感受性を実証することができる。代替的に又は付加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との接触点を同定するためのものである。このような接触残基と隣接残基は、置換候補として標的化又は排除されてもよい。変異体は、所望の属性を含むか否かを決定するためにスクリーニングされてもよい。

アミノ酸配列の挿入は、長さが一つの残基から百個又はより多くの残基を含むポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端と、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又はポリペプチドとの融合を含む。

２．７．２グリコシル化変異体
いくつかの実施例において、コンストラクトのグリコシル化の程度を増加又は減少させるために、抗体を改変する。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を改変して一つ又は複数のグリコシル化部位を産生又は除去することで、容易に実現可能である。

抗体にＦｃ領域（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が含まれる場合、それに連結される炭水化物は、改変可能である。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、通常、分岐型バイ接触角オリゴ糖を含み、それは、通常、Ｎ－結合によって、Ｆｃ領域Ｃ_Ｈ２ドメインのＡｓｎ２９７に連結される。例えば、ＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びにバイ接触角オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含んでもよい。いくつかの実施例において、抗体におけるオリゴ糖に対して修飾を行って、いくつかの改善した特性を有する抗体変異体を産生することができる。

いくつかの実施例において、抗体は、炭水化物構造を有し、該炭水化物構造は、（直接又は間接に）Ｆｃ領域に付着したフコースを欠く。例えば、このような抗体におけるフコースの含有量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定されたＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体化、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７糖鎖におけるフコースの平均量を計算することにより確定され、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載のとおりである。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約位置２９７に位置するアスパラギン酸残基（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号）を指し、しかしながら、抗体における微小な配列変化のため、Ａｓｎ２９７は、位置２９７の上流又は下流約±３個のアミノ酸、即ち位置２９４から３００に位置する場合もある。このようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。例えば、米国特許第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ２００４／００９３６２１（協和発酵工業株式会社（ＫｙｏｗａＨａｋｋｏＫｏｇｙｏＣｏ．，Ｌｔｄ））を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損型」抗体変異体に関わる刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、ＯｋａｚａｋｉらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化作用欠損型Ｌｅｃ１３ＣＨＯ細胞（ＲｉｐｋａらＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．［生物化学と生物物理学集刊］２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１，Ａｄａｍｓら）、及びノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。

いくつかの実施例において、抗体は、二等分されるオリゴ糖を有し、例えば、ここで、抗体のＦｃ領域に付着したバイ接触角オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃにより二等分される。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。このような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記述されている。オリゴ糖においてＦｃ領域に連結される少なくとも一つのガラクトース残基を有する抗体変異体をさらに提供する。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有してもよい。このような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記述されている。

２．７．３Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施例において、本開示の抗体又は抗体誘導体のＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよく、該配列は、一つ又は複数のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む。いくつかの実施例において、一つ又は複数のアミノ酸修飾を抗体部分のＦｃ領域（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＶＨＨ－Ｆｃ）に導入することによって、Ｆｃ領域変異体を産生することができる。

いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、いくつかの（全部ではない）エフェクター機能を有し、このような機能により、該区域は、応用に適する望ましい候補となり、これらの応用において、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、いくつかのエフェクター機能（例えば、補体とＡＤＣＣ）は、必要でないか又は有害である。インビトロ及び／又はインビボでの細胞傷害アッセイを実施することによって、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことにより、抗体がＦｃγＲ結合能力を有しない（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持できることを保証することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単核細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］９：４５７－４９２（１９９１）のページ４６４の表２にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８２：１４９９－１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．［実験医学雑誌］、１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記述されている。代替的に、非放射性アッセイ方法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ^（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（セルテクノロジー社（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、マウンテンビュー（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ），カリフォルニア州、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６^{（登録商標）}非放射性細胞毒性アッセイ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ウィスコンシン州を参照されたい）を用いてもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とを含む。代替的に又は付加的に、インビボで、例えば、ＣｌｙｎｅｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されたような動物モデルにおいて、目的分子のＡＤＣＣ活性を評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことにより、抗体がＣ１ｑに結合できず、且つそのためＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９とＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑとＣ３ｃのＥＬＩＳＡへの結合を参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ［血液］１０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．とＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ［血液］１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。当分野の既知の方法で、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期アッセイを行ってもよい（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［国際免疫学］１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。

低下したエフェクター機能を有する抗体は、（米国特許第６，７３７，０５６号）Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一つ又は複数の置換を有する抗体を含む。このようなＦｃ突然変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの二つ又はより多くの置換を有するＦｃ突然変異体を含み、残基２６５及び２９７がアラニンによって置換されるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む。

ＦｃＲへの結合性が向上又は低下したいくつかの抗体変異体が記述されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２及びＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］９（２）：６５９１－６６０４（２００１）．を参照されたい）

いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、残基のＥＵ番号に基づく一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域である。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ突然変異及び／又はＬ２３５Ａ突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４Ｆｃ領域である。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、Ｆ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ突然変異を含むＩｇＧ４Ｆｃ領域である。

いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域である。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４での置換を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆの突然変異を含む。

いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。

いくつかの実施例において、Ｆｃ領域内に改変が発生することによって、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の改変（即ち、向上又は低下）を引き起こし、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載のとおりである。

いくつかの実施例において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＶＨＨ－Ｆｃ）変異体は、変異体Ｆｃ領域を含み、該領域は、半衰期を改変し、及び／又は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改変する一つ又は複数のアミノ酸の置換を含む。延長した半減期と新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善した結合を有する抗体は、母体ＩｇＧの胎児への転移を担当し（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］２４：２４９（１９９４））、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記述されている。それらの抗体は、一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含み、ここで、これらの置換は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改変する。このようなＦｃ変異体は、一つ又は複数のＦｃ領域残基において、置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換）を有するそれらの変異体（米国特許第７，３７１，８２６号）を含む。

さらに、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＦｃ領域変異体の他の例に関わるＷＯ９４／２９３５１を参照されたい。

２．７．４システインエンジニアリング抗体変異体
いくつかの実施例において、システインエンジニアリング抗体部分、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」の産生と必要とする可能性があり、ここで、抗体の一つ又は複数の残基は、システイン残基によって置換される。いくつかの実施例において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。システイン残基を用いてそれらの残基を置換することで、反応性チオール基は、抗体のアクセス可能な部位に位置し、本明細書にさらに記載するように、他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分と抗体をコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを産生するために用いられてもよい。いくつかの実施例において、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号）のうちの任意の一つ又は複数の残基は、システインによって置換されてもよい。システインエンジニアリング抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように産生されてもよい。

２．８抗体誘導体
いくつかの実施例において、本明細書に記載の抗体は、当分野に知られており且つ容易に得られる他のタンパク質又は非タンパク質部分を含む抗体誘導体にさらに修飾されてもよい。抗体誘導体化に適した非タンパク質部分は、水溶性ポリマーを含むが、それに限らない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）とデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が挙げられるが、それらに限らない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために調製において優位性を有する可能性がある。該ポリマーは、任意の分子量を有してもよく、且つ分岐状又は非分岐状であってもよい。抗体に連結されるポリマーの数は、変わってもよく、且つ連結されるポリマーが一種よりも多いと、それらは、同じ又は異なる分子であってもよい。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、以下の考慮要因に基づいて決定されてもよく、それらの要因は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体を決定された診断条件のために使用するか否かなどを含むが、それらに限らない。

いくつかの実施例において、抗体は、一つ又は複数の生物活性タンパク質、ポリペプチド又はその断片を含む抗体誘導体にさらに修飾されてもよい。本明細書で互換的に使用されるように、「生物学的活性の」又は「生物学的活性を有する」は、特定の機能を果たすためにインビボで示される生物学的活性を指す。例えば、それは、特定の生物分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡなど）に結合し、そして、このような生物分子の活性を促進又は阻害することを意味する可能性がある。いくつかの実施例において、生物活性タンパク質又はその断片は、活性薬物物質として患者に投与されるタンパク質及びポリペプチドと、疾患又は病態の予防又は治療、及び診断のために使用されるタンパク質及びポリペプチド（例えば、診断試験又はインビトロアッセイに使用される酵素）と、疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質及びポリペプチド（例えば、ワクチン）とを含む。

２．９生産方法
当分野における任意の利用可能な又は既知の技術を用いて本明細書に開示される抗体及び抗体誘導体を産生することができる。例えば、例えば、米国特許第４，８１６，５６７に記載の組換え方法及び組成物を用いて抗体と抗体誘導体を産生することができるが、それに限らない。抗体と抗体誘導体を産生する詳細な手順は、以下の例に詳しく記述される。

本開示のテーマは、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体をコードする単離した核酸をさらに提供する。例えば、単離した核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列、例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードすることができる。

いくつかの実施例において、核酸は、一つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）に存在してもよい。本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、別のＤＮＡセグメントをそれに連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウィルスベクターであり、ここで、別のＤＮＡセグメントをウィルスゲノムに連結することができる。いくつかのベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌複製始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、且つそれにより宿主ゲノムと共に複製する。また、いくつかのベクター発現ベクターは、それらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指導することができる。一般的には、組換えＤＮＡ技術に用いられる発現ベクターは、常に、プラスミド（ベクター）形式である。しかしながら、開示されるテーマは、等価な機能を有する他の発現ベクター、例えば、ウィルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルス）を含むことが意図される。

単一のポリシストロン性発現カセット、単一のベクターの複数の発現カセット又は複数のベクターにおいて、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体の異なる部分を構築することができる。ポリシストロニック発現カセットを産生するエレメントの例として、様々なウィルス及び非ウィルス性内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ－ｌＩＲＥＳ、ＦＧＦ－２ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦＩＲＥＳ、ＩＧＦ－ＩＩＩＲＥＳ、ＮＦ－ｋＢＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１ＩＲＥＳ、ｐ５３ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウィルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウィルスＩＲＥＳ、ピコルナニルスＩＲＥＳ、ポリオウィルスＩＲＥＳ及び脳心筋炎ウィルスＩＲＥＳ）、及び切断可能なリンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａペプチド）が挙げられるが、それらに限らない。レトロウィルスベクターと適切なパッケージング糸との組み合わせも好適であり、ここで、カプシドタンパク質はヒト細胞に感染する機能を有する。様々な両親媒性ウィルスを産生する細胞株は、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］５：４３１－４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］６：２８９５－２９０２）、及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８５：６４６０－６４６４）を含むが、それらに限らない。非両親媒性粒子も好適であり、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４又はＧＡＬＶエンベロープ及び当分野における任意の他の既知のシュードタイプ化粒子を用いる。

いくつかの実施例において、本開示の抗体又は抗体誘導体をコードする核酸及び／又は核酸を含む一つ又は複数のベクターを宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施例において、当分野の既知の任意の方法で、核酸を細胞に導入することができ、これらの方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウィルス又はファージベクターによる感染、細胞融合、染色体によって媒介される遺伝子転移、微小細胞によって媒介される遺伝子転移、スフェロプラスト融合などを含むが、それらに限らない。いくつかの実施例において、宿主細胞は、例えば、以下のベクターで形質転換された宿主細胞を含んでもよく、該ベクターは、単一ドメイン抗体及び／又は単一ドメイン抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む。いくつかの実施例において、宿主細胞は、例えば、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターで形質導入された宿主細胞を含んでもよい。いくつかの実施例において、宿主細胞は、真核細胞であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。

いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を調製する方法は、抗体又は抗体誘導体の発現に適する条件で、抗体又は抗体誘導体をコードする核酸が導入されている宿主細胞を培養することと、宿主細胞及び／又は宿主細胞培地から抗体又は抗体誘導体を任意選択的に回収することとを含んでもよい。いくつかの実施例において、クロマトグラフィー技術により、宿主細胞から抗体又は抗体誘導体を回収する。

本開示の抗体又は抗体誘導体を組換え産生するために、例えば、上述した抗体又は抗体誘導体をコードする核酸を単離させ、一つ又は複数のベクターに挿入して、宿主細胞において、さらに、クローニング及び／又は発現を行うことができる。従来の手順（例えば、抗体又は抗体誘導体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を用いて、これらの核酸を容易に単離して配列決定することができる。抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核又は真核細胞を含む。例えば、特に、フコシル化とＦｃエフェクター機能を必要としない時、細菌において抗体又は抗体誘導体を産生してもよい。細菌において抗体断片とポリペプチドを発現することについて、例えば、米国特許第５，６４８，２３７、５，７８９，１９９及び５，８４０，５２３号を参照されたい。（さらに、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏによる編集，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］，２００３），ページ２４５－２５４に記載の大腸菌における抗体断片の発現を参照されたい）発現した後、抗体又は抗体誘導体は、可溶性画分で細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。

原核生物に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌又は酵母）も、抗体をコードするベクターに適したクローニング又は発現宿主であり、それは、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株と酵母株を含み、それによって部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体又は抗体誘導体を産生する。Ｇｅｍｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２２：１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。グリコシル化抗体を発現するための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）に由来するものであってもよい。無脊椎動物細胞の例としては、植物と昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウィルス株が同定されており、これらは、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施例において、植物細胞培養物は、宿主細胞として用いられてもよい。例えば、米国特許第５，９５９，１７７、６，０４０，４９８、６，４２０，５４８、７，１２５，９７８及び６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^（商標）技術が記述された）を参照されたい。

いくつかの実施例において、脊椎動物細胞は、宿主として用いられてもよい。例えば、懸濁成長に適した哺乳動物細胞株が有用であり得るが、それらに限らない。有用な哺乳動物宿主細胞株の非限定的例は、ＳＹ４０（ＣＯＳ－７）によって形質導入されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児腎臓株（２９３又は２９３細胞、例えば、Ｇｒａｈａｍら，ＪＧｅｎＶｉｒａｌ．［一般ウィルス学雑誌］３６：５９（１９７７）に記述されている）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記述されている）、ザル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ０２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．［ニューヨーク科学アカデミーの年度コメント］３８３：４４－６８（１９８２）に記述されているＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含み、ＤＨＦＫＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］７７：４２Ｉ６（１９８０））と、骨髄腫細胞株（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ及びＳｐ２／０）とを含む。抗体又は抗体誘導体の産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株に関する概説は、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏによる編集，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］），ページ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

いくつかの実施例において、二重特異性及び／又は多重特異性抗体を調製するための技術は、同じ特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアを組換えて発見することであって、そのうちの一方又は両方の重鎖又は軽鎖が異なる特異性を有する抗原結合部分（例えば、単一ドメイン抗体、例えば、ＶＨＨ）に融合することと、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアの組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３０５：５３７（１９８３））、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯＪ［欧州分子生物学会誌］１０：３６５５（ｌ９９１）を参照されたい）と、「ノブホール構造」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）とを含むが、それらに限らない。二重特異性抗体は、静電ステアリング効果のエンジニアリングによって調製されてもよく、それにより抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を調製し（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、二つ以上の抗体又は断片を架橋させ（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を産生し（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を用いて、二重特異性抗体断片を調製し（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用い（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、三重特異性抗体を調製し、例えば、ＴｕｔｔらＪＩｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１４７：６０（１９９１）に記載のとおりである。

本開示の二重特異性及び多重特異性分子は、化学技術（例えば、Ｋｒａｎｚ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］７８：５８０７を参照されたい）、「ｐｏｌｙｄｏｍａ」技術（例えば、米国特許第４，４７４，８９３号を参照されたい）又は組換えＤＮＡ技術により調製されてもよい。さらに、当分野の既知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、構成結合特異性、例えば、第１のエピトープと第２のエピトープの結合特異性をコンジュゲートすることによって、現在では開示されるテーマの二重特異性と多重特異性分子を調製してもよい。例えば、二重特異性と多重特異性分子の各結合特異性は、組換え融合タンパク質技術によって一緒に調製されるか、又は別々に調製され、次いで互いにコンジュゲートされてもよいが、これに限らない。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有結合は、様々なカップリング剤又は架橋剤を使用して行われ得る。架橋剤の非制限的な例として、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．［実験医学雑誌］１６０：１６８６、Ｌｉｕ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８２：８６４８を参照されたい）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓ．Ｍｉｔｔ．［ベリン研究所の報告］（１９８５）第７８期，１１８－１３２、Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］２２９：８１－８３），Ｇｌｅｎｎｉｅ（１９８７）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１３９：２３６７－２３７５）に記載のものを含む。結合特異性が抗体（例えば、二つのヒト化抗体）である場合、それらは、二本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のメルカプト結合によりコンジュゲートされてもよい。いくつかの実施例において、コンジュゲートの前に、ヒンジ領域は、奇数個（例えば、一個）のメルカプト残基を含むように修飾されてもよい。

いくつかの実施例において、二重特異性抗体の二つの結合特異性は、同一のベクターにおいてコードされ、同一の宿主細胞において発現と組み立てられてもよい。二重特異性と多重特異性分子がＭＡｂｘＭａｂ、ＭＡｂｘＦａｂ、ＦａｂｘＦ（ａｂ’）２又はリガンドｘＦａｂ融合タンパク質である場合、該方法は、特に有用である。いくつかの実施例において、本開示の二重特異性抗体は、一本鎖分子、例えば、一本鎖二重特異性抗体、一つの一本鎖抗体と結合決定クラスタとを含む一本鎖二重特異性分子又は二つの結合決定クラスタを含む一本鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性と多重特異性分子は、一本鎖分子であってもよく、又は、少なくとも二つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子及び多重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、及び米国特許第５，４８２，８５８号に記述されている。本明細書は、三つ又はより多くの機能的抗原結合部位（例えば、エピトープ結合部位）を有するエンジニアリング抗体をさらに含み、「タコ抗体」（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）を含む。

いくつかの実施例において、動物系は、本開示の抗体又は抗体誘導体の産生に用いることができる。ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。

マウスにおいて、ハイブリドーマの産生は、非常に完備な手順の確立である。融合のための免疫された脾細胞を単離するための免疫方案と技術は、当分野において既知のものである。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も既知のものである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ［抗体：実験室マニュアル］，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ［コールドスプリング実験室出版社］，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮｅｗＹｏｒｋ［ニューヨークコールドスプリング］を参照されたい）。

２．１０測定
本明細書による本開示の抗体と抗体誘導体について、当分野の既知のものと本明細書による複数のアッセイにより、その物理／化学的性質及び／又は生物学的活性に対して、同定、スクリーニング又は特徴付けを行うことができる。

いくつかの実施例において、既知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はウエスタンブロットアッセイ）によって、本開示の抗体又は抗体誘導体の抗原結合活性を試験することができる。これらのアッセイのそれぞれは、通常、目的複合体に対して特異性を有する、標識された試薬（例えば、抗体）により、特別な意味を有するタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、例えば、抗体又は抗体誘導体を認識してそれに特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体断片により、抗体又は抗体誘導体を検出することができる。代替的に、複数の他の免疫アッセイのうちのいずれか一つにより、抗体又は抗体誘導体を検出してもよい。例えば、該抗体又は抗体誘導体に対して放射性標識を行い、且つ放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）において使用してもよい（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＴｒａｉｎｉｎｇＣｏｕｒｓｅｏｎＲａｄｉｏｌｉｇａｎｄＡｓｓａｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＴｈｅＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙ［放射性免疫アッセイの原理、七回目の放射性リガンド測定技術トレーニングコース（内分泌学会）］，１９８６年３月を参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）カウンター又はシンチレーションカウンターを用いるか又はオートラジオグラフィーのような手段によって、放射性同位体を検出することができる。

いくつかの実施例において、競合アッセイは、ＧＰＣ３への結合について、本開示の抗体と競合する抗体又は抗体誘導体の同定に用いられてもよい。いくつかの実施例において、このよう競合抗体は、本明細書に開示される抗体に結合する同じエピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）に結合する。Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓ［エピトープ位置決め方案］，」ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］第６６巻（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ［ヒューマン出版社］，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ［ニュージャージー州トトワ］）において、抗体に結合するエピトープを位置決めする詳細な例示的方法が提供されている。

競合アッセイの非限定的な例では、ＧＰＣ３に結合する第１の標識抗体又は抗体誘導体と第２の非標識抗体とを含む溶液において、固定したＧＰＣ３をインキュベートし、ＧＰＣ３への結合について第１の抗体と競合する第２の非標識抗体の能力を試験することができる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上澄み液に存在してもよい。対照として、固定したＧＰＣ３を、第１の標識抗体を含むが、第２の非標識抗体を含まない溶液においてインキュベートする。第１の抗体とＧＰＣ３との結合が許容される条件でインキュベートした後、過剰の未結合抗体を除去し、固定したＧＰＣ３に関わる標識の量を測定する。対照サンプルに比べて、試験サンプルにおいて、固定したＧＰＣ３に関わる標識の量が大幅に減少すると、第２の抗体は、ＧＰＣ３への結合について第１の抗体と競合していることを表す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ［抗体：実験室マニュアル］第１４章（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ［コールドスプリング実験室出版社］，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ［ニューヨークコールドスプリング］を参照されたい）。

本開示は、生物学的活性を有する抗ＧＰＣ３抗体又はその抗体誘導体を同定するためのアッセイを提供する。生物学的活性は、例えば、免疫細胞又は免疫活性化レポーター遺伝子（例えば、ＮＦＡＴレポーター遺伝子又はＮＦ－κＢレポーター遺伝子）を含んでもよい。インビボ及び／又はインビボでこのような生物学的活性を有する抗体をさらに提供する。

２．１１免疫コンジュゲート
本開示のテーマは、免疫コンジュゲートをさらに提供し、それは、一つ又は複数の検出プローブ及び／又は細胞傷害剤（例えば、化学治療剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はそれらの断片））、又は放射性同位体にコンジュゲートする本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を含む。例えば、開示されるテーマの抗体又は抗原結合部分は、一つ又は複数の他の結合分子（例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣体）に機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方式で）連結されてもよい。

いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、ここで、抗体は、一つ又は複数の薬物にコンジュゲートし、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、５，４１６，０６４号及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５号を参照されたい）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥとＤＦ（ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、５，７８０，５８８号、及び７，４９８，２９８号を参照されたい）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１及び５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．［癌研究］５３：３３３６－３３４２（１９９３）、並びにＬｏｄｅら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．［癌研究］５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）、ドノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）又はドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）のようなアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら，ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄＣｈｅｍ．［現代薬物化学］１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ［生物有機化学と医薬化学通信］１６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．［生物コンジュゲート化学］１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ［生物有機化学と医薬化学通信］１２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇら，ＪＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．［医薬化学雑誌］４５：４３３６－４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタキセル、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）、及びＣＣ１０６５を含むが、それらに限らない。

いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートする本明細書に記載の抗体を含み、前記酵素活性毒素又はその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－スウェリン、アブリン、ジアンチン、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、ジャトロシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むが、それらに限らない。

いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして、放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載の抗体を含む。複数の放射性同位体は、放射性コンジュゲートの生産に用いられてもよい。非限定的な例として、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に用いられる時、これは、シンチレーション研究に使用される放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ又は１１２３、又は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージングとも呼ばれ、ＭＲＩ）に使用されるスピン標識、例えば、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。

様々な二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジンジメルカプト）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノスルファン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ジスアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、二重窒素誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２、６－ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２、４－ジニトロベンゼン））を使用して、抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートを調製することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］２３８：１０９８（１９８７）に記述されているようにリシン免疫毒素を調製することができる。炭素４－標識化ｌ－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン－五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体をコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害薬物の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーを用いることができる（Ｃｈａｒｉら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．［癌研究］５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）。

本明細書の免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、架橋剤を用いて調製されるこのようなコンジュゲートを明確にカバーするが、それらに限らず、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）（例えば、米国イリノイ州ロスルフドのピアースバイオテク社（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）からのもの）を含むが、それらに限らない。

２．１２抗原認識受容体
本公開のテーマは、本明細書に開示される抗体又は抗体断片を含む抗原認識受容体をさらに提供する。抗原認識受容体は、抗原へのその結合に応答して活性化し、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を刺激又は阻害することができる受容体である。抗原認識受容体の非限定的な例として、天然及び組換えＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）又は阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）が挙げられる。抗原認識受容体の設計と使用方法は、当分野において周知のものであり、且つ文献、例えば、国際公開ＷＯ２０１８／０２７１５５、ＷＯ２０１９／０９９４８３、ＷＯ２０１９／１５７４５４、ＷＯ２０１９／１３３９６９、ＷＯ２０１９／０９９９９３、ＷＯ２０１５／１４２３１４、ＷＯ２０１８／０２７１９７及びＷＯ２０１４０５５６６８に記述されている。

いくつかの実施例において、本開示のテーマは、本明細書に開示される抗体又は抗体断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、エンジニアリングされた受容体であり、目的特異性を免疫エフェクター細胞に移植又は付与することができる。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植することに用いることができ、ベクターによりそのコード配列のトランスファーを促進する。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、「第１世代」ＣＡＲであり、通常、膜貫通ドメインと融合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ又はＶＨＨ）で構成され、該膜貫通ドメインは、細胞質／細胞内シグナル伝達ドメインと融合する。「第１世代」ＣＡＲは、ＨＬＡ媒介性抗原提示にかかわらず、デノボ抗原認識を提供し、単一融合分子におけるそれらのＣＤ３ｚ鎖シグナル伝達ドメインによって免疫応答性細胞（例えば、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化を引き起こすことができる。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、「第２世代」ＣＡＲであり、免疫応答性細胞に追加のシグナルを提供するために、様々な共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、０Ｘ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０／Ｍｙ８８及びＮＫＧＤ２）からＣＡＲの細胞質尾部領域までの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、これにより「第２世代」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ）及び活性化（ＣＤ３ｚ）の両方を提供するものを含む。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、「第３世代」ＣＡＲであり、複数の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ）と活性化（ＣＤ３ｚ）とを含む。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、第２世代ＣＡＲである。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、抗原に結合する細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施例において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ／間隔領域をさらに含む。いくつかの実施例において、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書に開示される抗体又は抗体断片を含む。いくつかの実施例において、抗体又は抗体断片は、ＶＨＨ又はｓｃＦｖを含む。

いくつかの実施例において、本開示のテーマは、本明細書に開示される抗体又は抗体断片を含む組換えＴＣＲを提供する。天然ＴＣＲは、ジスルフィド結合により連結されるヘテロ二量体タンパク質を含むタンパク質複合体であり、該ヘテロ二量体タンパク質は、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される二本の可変鎖で構成される。天然ＴＣＲは、Ｔ細胞表面に存在し、抗原を、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチドとして認識する役割を果たす。いくつかの実施例において、天然ＴＣＲは、α鎖とβ鎖（それぞれＴＲＡとＴＲＢ遺伝子によってコードされる）を含む。いくつかの実施例において、ＴＣＲは、γ鎖とδ鎖（それぞれＴＲＧとＴＲＤ遺伝子によってコードされる）を含む。α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖は、それぞれ、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域の二つの細胞外ドメインを含む。定常領域は、細胞膜に近く、その後に膜貫通領域と短い細胞質尾部領域が続く。可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。各可変領域は、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施例において、ＴＣＲは、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζとの受容体複合体を含む。ＴＣＲ複合体がその抗原及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）に結合する場合、ＴＣＲ複合体を発現するＴ細胞は活性化される。

いくつかの実施例において、組換えＴＣＲは、非天然ＴＣＲである。いくつかの実施例において、組換えＴＣＲは、組換えα鎖及び／又は組換えｂ鎖を含み、ここで、組換えα鎖及び／又は組換えｂ鎖の可変領域の一部又は全体は、本明細書に開示される抗体又は抗体断片に置換される。いくつかの実施例において、抗体又は抗体断片は、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施例において、抗体又は抗体断片は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、組換えＴＣＲは、ＭＨＣ／ＨＬＡ非依存性方式で目的抗原に結合する。いくつかの非限定的な実施例において、抗原の結合は、組換えＴＣＲを含む免疫応答性細胞を活性化することができる。

本開示のテーマは、免疫応答性細胞を提供し、それは、（ａ）本明細書に開示される抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）を含む。いくつかの実施例において、抗原認識受容体は、免疫応答性細胞を活性化することができる。本開示のテーマの免疫応答性細胞は、リンパ系の細胞であってもよい。Ｂ、Ｔ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液における外来性試薬の検出、宿主外来性細胞の検出などを提供する。リンパ系の免疫応答性細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（例えば、それからリンパ球が分化し得るもの）が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、主に細胞媒介性免疫を担うリンパ球であってもよい。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与する。本開示のテーマのＴ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であってもよく、補助Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞（中枢記憶Ｔ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞（ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ／ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）を含む）及び二つのタイプのエフェクター記憶Ｔ細胞、例えば、ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞、制御性Ｔ細胞（阻害Ｔ細胞とも呼ばれる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞及びｇｄＴ細胞を含むが、それらに限らない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ又はキラーＴ細胞）は、感染された体細胞又は腫瘍細胞の死を誘導することができるＴリンパ球サブセットである。患者自体のＴ細胞は、抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）を導入することにより、遺伝子修飾を行って特定の抗原を標的とすることができる。いくつかの実施例において、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。いくつかの実施例において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介性免疫の一部とし、先天性免疫応答の間に機能するリンパ球であってもよい。ＮＫ細胞は、標的細胞に対して細胞傷害作用を果たすために前もって活性化される必要はない。本開示のテーマのヒトリンパ球のタイプは、末梢ドナーリンパ球を含むが、それに限らず、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ら２００３ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ［癌自然コメント］３：３５－４５（遺伝子修飾してＣＡＲを発現する末梢ドナーリンパ球が開示される）、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，ら２００６Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］３１４：１２６－１２９（遺伝子修飾してａとｂヘテロ二量体を含む全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現する末梢ドナーリンパ球が開示される）、Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ら２０００ＪＩｍｍｕｎｏｌ［免疫学雑誌］１６４：４９５－５０４、Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ら２０００ＪＩｍｍｕｎｏｌ［免疫学雑誌］１６４：４３８２－４３９２（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物が開示される）、及びＤｕｐｏｎｔ，Ｊ．，ら２００５ＣａｎｃｅｒＲｅｓ［癌研究］６５：５４１７－５４２７、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｇ．Ａ．，ら２００３Ｂｌｏｏｄ［血液］１０２：２４９８－２５０５（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）又はパルス状樹状細胞を用いた抗原特異性末梢血白血球の選択的インビトロ増幅が開示される）に開示されるものである。いくつかの実施例において、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己由来、非自己由来（例えば、同種異体）、又はインビトロで、エンジニアリングされた前駆細胞もしくは幹細胞から派生したものであってもよい。

３．使用方法
本開示のテーマは、開示される抗体及び抗体誘導体を使用する方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、これらの方法は、本開示の抗体又は抗体誘導体の治療的用途に関する。いくつかの実施例において、これらの方法は、本開示の抗体又は抗体誘導体の診断的用途に関する。

３．１治療方法
本開示は、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を疾患及び障害の治療又は免疫応答の強化に用いる方法及び用途を提供する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体、抗体誘導体又は該抗体、抗体誘導体を含む薬物組成物を被験体（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト））に投与して、疾患及び障害を治療するか又は免疫応答を強化することができる。いくつかの実施例において、これらの疾患及び障害は、免疫チェックポイント阻害及び／又は異常なＧＰＣ３活性に関する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体により治療可能な疾患及び障害は、腫瘍形成（例えば、癌）を含むが、それに限らない。

いくつかの実施例において、本開示は、薬物の調製に用いられる本明細書に記載の抗体又は抗体誘導体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、癌の治療のための薬物の調製に用いられる本明細書に記載の抗体又は抗体誘導体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、被験体の癌の治療に用いられる本明細書に記載の抗体又は抗体誘導体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、被験体の癌の治療に用いられる本明細書による抗体又は抗体誘導体（又はその断片）を含む薬物組成物を提供する。いくつかの実施例において、癌は、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫及び骨髄腫）、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃腫瘍、神経膠芽腫、喉頭癌、黒色腫、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟組織肉腫、及び様々な癌（前立腺癌と小細胞肺癌を含む）であってもよい。適切な癌は、腫瘍学の分野において任意の既知の癌をさらに含み、これは、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、髄芽腫、原発性神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞と大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮細胞癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌、及びそれらの肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝臓癌、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺腫、乳頭状癌、皮脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎仔癌、ウィルムス腫瘍、髄芽腫、髄咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、乳房腫瘍（例えば、導管腺癌と小葉腺癌）、子宮頸部扁平上皮癌と腺癌、子宮上皮癌と卵巣上皮癌、前立腺癌、膀胱移行性扁平上皮癌、ＢとＴリンパ腫（結節性及び分散性）、形質細胞腫、急性と慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫、及び平滑筋肉腫を含むが、それらに限らない。

いくつかの実施例において、癌は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、胆管癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫原発性縦隔Ｂ－細胞リンパ腫（ＮＨＬＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、又は甲状腺癌であってもよい。

いくつかの実施例において、治療されるべき被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非霊長類動物、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施例において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施例において、被験体は、癌を有することが疑われるか、又は癌を有するリスクがあるか、又は異常なＧＰＣ３発現もしくは活性を有する癌又は任意の他の疾患を有すると診断されている。

異常なＧＰＣ３活性を示す多くの癌又は任意の他の疾患の診断方法及びこれらの疾患の臨床的説明は、当分野の既知のものである。このような方法は、例えば、免疫組織化学、ＰＣＲ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含むが、それらに限らない。異常なＧＰＣ３活性又は発現の診断方法に関する他の詳細は、例えば、Ｇｕｐｔａら（２００９）ＭｏｄＰａｔｈｏｌ［現代病理学］．２２（１）：１２８－１３３、Ｌｏｐｅｚ－Ｒｉｏｓら（２０１３）ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ．［臨床病理学雑誌］６６（５）：３８１－３８５、Ｅｌｌｉｓｏｎら（２０１３）ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ［臨床病理学雑誌］６６（２）：７９－８９、及びＧｕｈａら（２０１３）ＰＬｏＳＯＮＥ［米国科学公共図書館－総合］８（６）：ｅ６７７８２に記述されている。

例えば、静脈内、筋肉内又は皮下を含む任意の適切な経路によって投与してもよい。いくつかの実施例において、本明細書による抗体又は抗体誘導体（又はその断片）及び／又は組成物は、第２、第３又は第４の薬剤（例えば、抗腫瘍薬、増殖阻害剤、細胞傷害剤又は化学治療剤を含む）と併用投与されて、異常なＧＰＣ３活性に関する疾患又は障害を治療することができる。このような薬剤は、例えば、ドセタキセル、ゲフィチニブ、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５－フルオロウラシル、及びフォリン酸）、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＦＯＬＦＯＸ－４、注入フルオロウラシル、フォリン酸とオキサリプラチン、アルファルチニブ、ゲムシタビン、カペシタビン、ペメトレキセド、テカルチニブ、エベロリムス、ＣｐＧ－ＯＤＮ、ラパマイシン、レナリドマイド、ベロフィニル、エンドスタチン、ラパチニブ、ＰＸ－８６６、ＩｍｐｒｉｍｅＰＧＧ及びイリノチニブを含む。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体（又はその断片）を別の薬剤にコンジュゲートする。

いくつかの実施例において、本明細書による抗体又は抗体誘導体（又はその断片）及び／又は組成物は、一つ又は複数の他の療法（例えば、放射線療法、手術、化学療法及び／又は標的療法）と併用投与される。いくつかの実施例において、本明細書による抗体、抗体誘導体（又はその断片）及び／又は組成物は、放射線療法と併用投与する。いくつかの実施例において、本明細書による抗体、抗体誘導体（又はその断片）及び／又は組成物は、放射線療法と併用され、本明細書に開示される新生物又は癌の治療に用いられる。

治療されるべき適応症及び当業者に周知の投与に関連する要因に応じて、本明細書による抗体又は抗体誘導体は、毒性と副作用を最小限に抑えながら、該適応症を治療するのに有効な用量で投与される。癌の治療において、典型的な投与量は、例えば、０．００１～１０００μｇの範囲内であってもよく、しかしながら、該例示的な範囲より低いか又は高い投与量は本発明の範囲内である。一日の投与量は、総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ又は総体重の約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇであってもよい。上述したように、治療される患者を定期的に評価することで、治療又は予防効果をモニタリングすることができる。数日以上の繰り返し投与については、症状に応じて、所望の疾患症状の抑制が起こるまで繰り返し治療を行う。しかしながら、他の投与量方案は、有用である可能性があり、且つ本発明の範囲内にある。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、又は組成物の連続注入による投与によって送達されてもよい。

本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を含む薬物組成物は、１日１回、２回、３回又は４回投与されてもよい。組成物は、毎日の投与よりも低い頻度、例えば、毎週６回、毎週５回、毎週４回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、又は６ヶ月毎に１回、投与されてもよい。組成物は、例えば、インプラントに徐放性製剤で投与されてもよく、該インプラントは、ある期間にわたって使用するために該組成物を徐々に放出し、且つ該組成物をより低い頻度、例えば、毎月１回、２－６ヶ月毎に１回、毎年１回、又はさらに単回投与することを許容する。徐放性装置（例えば、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェアなど）は、注射又は種々の位置に外科的に埋め込むことで投与されてもよい。

例えば、腫瘍退縮、腫瘍重量又はサイズ縮小、進行時間、生存期間、無進行生存期間、全体の反応率、応答期間、生活の質、タンパク質発現及び／又は活性によって、癌の治療を評価してもよいが、それらに限らない。例えば、放射線画像化によって反応を測定することを含む、治療効果を決定する方法を用いることができる。

いくつかの実施例において、治療効果を腫瘍増殖阻害パーセント（％ＴＧＩ）として測定し、等式１００－（Ｔ／Ｃｘ１００）を使用して計算され、そのうち、Ｔは、治療される腫瘍の平均相対的腫瘍体積であり、且つＣは、未治療の腫瘍の平均相対的腫瘍体積である。いくつかの実施例において、％ＴＧＩは、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％）、約９４％）、約９５％であってもよく、又は９５％よりも多くてもよい。

３．２診断及びイメージング方法
標識された抗体又は抗体誘導体は、ＧＰＣ３の発現、異常な発現及び／又は活性に関わる疾患及び／又は障害を検出、診断又はモニタリングするように、診断に使用されてもよい。例えば、本明細書による抗体と抗体誘導体は、インサイチュ、インビボ、エクスビボ、及びインビトロ診断アッセイ又はイメージングアッセイに用いられてもよい。ＧＰＣ３ポリペプチド発現を検出するための方法は、（ａ）一つ又は複数の抗体又は抗体誘導体を用いて、個体の細胞（例えば、組織）又は体液におけるポリペプチドの発現を測定することと、（ｂ）該遺伝子発現レベルと標準的遺伝子発現レベルを比較することであって、標準的な発現レベルに比べて、測定される遺伝子発現レベルの増加又は減少が異常な発現を指示することとを含む。

本明細書による別の実施例は、動物（例えば、ヒトのような哺乳動物）において、ＧＰＣ３の発現又は異常な発現に関わる疾患又は障害を診断する方法を含む。これらの方法は、哺乳動物において、ＧＰＣ３分子を検出することを含む。いくつかの実施例において、診断は、（ａ）哺乳動物に有効量の標識された抗体又は抗体誘導体を投与することと、（ｂ）標識された抗体又は抗体誘導体が、被験体のＧＰＣ３を発現する部位に優先的に濃縮する（且つ結合していない、標識された分子をバックグラウンドレベルまで除去する）ことを可能にするために、投与後に、一定の時間待つことと、（ｃ）バックグラウンドレベルを確定することと、（ｄ）バックグラウンドレベルにより高い標識された分子の検出が、被験体がＧＰＣ３の発現又は異常な発現に関わる特定の疾患又は障害に罹患していることを示すように、被験体における標識された分子を検出することとを含む。バックグラウンドレベルは、異なる方法で決定されてもよく、これらの方法は、検出された標識分子の量をこの前に一つの具体的なシステムに対して決定された標準値と比較することを含む。

本明細書による抗体及び抗体誘導体は、当業者に周知の古典的免疫組織学的方法を用いて生物サンプルにおけるタンパク質レベルを測定することに用いられてもよい（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［細胞生物学雑誌］１０１：９７６－９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［細胞生物学雑誌］１０５：３０８７－３０９６（１９８７）を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な、抗体に基づく他の方法は、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）と放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含む。適切な抗体アッセイ標識は、当分野において既知のものであり、且つ酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位体、例えば、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５ｍＩｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、ルミノール、並びに蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン及びビオチン）を含む。

当分野の既知の技術は、本明細による標識された抗体（又はその断片）に応用可能である。このような技術は、二官能性コンジュゲート（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号、５，７１４，６３１号、５，６９６，２３９号、５，６５２，３６１号、５，５０５，９３１号、５，４８９，４２５号、５，４３５，９９０号、５，４２８，１３９号、５，３４２，６０４号、５，２７４，１１９号、４，９９４，５６０号、及び５，８０８，００３号を参照されたい）を用いることを含むが、それに限らない。

代替的に、又は付加的に、細胞における、ＧＰＣ３ポリペプチドをコードする核酸又はｍＲＮＡのレベルは、例えば、ＧＰＣ３をコードする核酸又はその相補的配列に対応する、核酸に基づく探プローブを用いる蛍光インサイツハイブリダイゼーション、（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に開示されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、ＤＮＡブロット法、ＲＮＡブロット法又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によって測定され得る。生体液（例えば、血清）における脱落した抗原を測定することによってＧＰＣ３の過剰発現を研究することもでき、例えば、抗体に基づくアッセイを用いる（さらに、例えば、１９９０年６月１２日に開示された米国特許第４，９３３，２９４号、１９９１年４月１８日に開示されたＷＯ９１／０５２６４、１９９５年３月２８日に開示された米国特許第５，４０１，６３８号、及びＳｉａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］１３２：７３－８０（１９９０）を参照されたい）。上記アッセイに加えて、当業者は、様々なインビボとエクスビボアッセイを得ることができる。例えば、哺乳動物体内の細胞を抗体に曝露し、該抗体として、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で任意選択的に標識され、且つ、例えば、放射性の外部走査、又は、以前に抗体に曝露された哺乳動物から採取されたサンプル（例えば、生検又は他の生物学的サンプル）の分析によって、抗体と細胞との結合を評価することができる。

４．薬物製剤
本開示のテーマは、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体及び薬学的に許容されるキャリア剤を含む薬物製剤をさらに提供する。いくつかの実施例において、薬物組成物は、本開示のテーマの複数（例えば、二つ又はより多く）の抗体及び／又は抗体誘導体の組み合わせを含んでもよい。

いくつかの実施例において、開示される薬物製剤は、所望の純度を有する抗体又は抗体誘導体を、一つ又は複数の任意選択的な薬学的に許容されるキャリア剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ［レーミントン薬物科学］第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．による編集（１９８０））と組み合わせ、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、調製されてもよい。例えば、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８に記載されているが、それに限らない。いくつかの実施例において、水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号とＷＯ２００６／０４４９０８に記載のものを含んでもよく、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。いくつかの実施例において、抗体又は抗体誘導体は、約８０％よりも大きく、約９０％よりも大きく、約９１％よりも大きく、約９２％よりも大きく、約９３％よりも大きく、約９４％よりも大きく、９５％よりも大きく、約９６％よりも大きく、約９７％よりも大きく、約９８％よりも大きく、約９９％よりも大きく、約９９．１％よりも大きく、約９９．２％よりも大きく、約９９．３％よりも大きく、約９９．４％よりも大きく、約９９．５％よりも大きく、約９９．６％よりも大きく、約９９．７％よりも大きく、約９９．８％よりも大きく、又は、約９９．９％よりも大きい純度を有してもよい。

薬学的に許容されるキャリア剤は、通常、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに対して無毒であり、且つ、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）、アスコルビン酸とメチオニン酸とを含む酸化防止剤、防腐剤（例えば、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化フェネチルアンモニウム、フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０個の残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンのようなアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールのような糖、ナトリウムのような塩化されたカウンターイオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含むが、それらに限らない。本明細書における例示的な薬学的に許容されるキャリア剤は、間葉系薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ^{（登録商標）}，ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）をさらに含む。米国特許第２００５／０２６０１８６と２００６／０１０４９６８号において、ｒＨｕＰＨ２０を含むいくつかの例示的なｓＨＡＳＥＧＰと使用方法が記述されている。いくつかの実施例において、ｓＨＡＳＥＧＰは、一つ又は複数の別のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせられる。

キャリア剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適してもよい。投与経路に応じて、活性化合物（例えば、抗ＧＰＣ３抗体）を、酸及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の影響から該化合物を保護するために、材料で被覆してもよい。

本開示の薬物組成物は、併用治療に用いられてもよく、即ち、他の薬剤と併用投与されてもよい。いくつかの実施例において、本明細書に開示される薬物組成物は、一つ以上の活性成分をさらに含んでもよく、これは、治療される特定の適応症に対して必須なものであり、例えば、相補活性を有し且つ互いに不利な影響を発生しないものである。いくつかの実施例において、薬物製剤は、第１の治療剤によって治療される同じ疾患を治療するための第２の活性成分を含んでもよい。このような活性成分は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。例えば、本開示の製剤は、一つ以上の活性成分をさらに含んでもよいが、それらに限らない。これは、治療される特定の適応症に対して必須なものであり、好ましくは、相補活性を有し且つ互いに不利な影響を発生しないものである。例えば、同じ疾患を治療するための第２の治療剤をさらに提供することが望まれる可能性がある。このような活性成分は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。

本開示の組成物は、当分野の既知の様々な方法で投与されてもよい。投与経路及び／又は方式は、必要な結果によって決まる。これらの活性化合物は、迅速な放出から化合物を保護するキャリア剤、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を用いて調製することができる。生分解性と生体適合性を有するポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を用いてもよい。このような製剤を調製する多くの方法は、例えば、ＳｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ［徐放性と制御放出性薬物送達システム］，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，による編集，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．［マルセルデッカー社］，ニューヨーク，１９７８に記述されている。いくつかの実施例において、薬物組成物は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の優れた製造規制（ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））条件で生産される。

本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を含有する徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体又は抗体誘導体の固体疎水性ポリマーを含有する半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）の形式である。いくつかの実施例において、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又は粗エマルジョンにおけるヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセルとポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、活性成分を包埋することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ［レーミントン薬物科学］第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．による編集（１９８０）に開示されている。

いくつかの投与経路によって本開示の抗体又は抗体誘導体を投与するために、該化合物を、その不活性化を防止する材料で被覆するか、又は該化合物と共に投与することを必要とする可能性がある。例えば、適切なキャリア剤（例えば、リポソーム）又は希釈剤において、化合物を被験体に投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水と緩衝水溶液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン及び従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．［神経免疫学雑誌］７：２７）を含む。

薬学的に許容されるキャリア剤は、無菌水溶液又は分散液及び滅菌注射可能溶液又は分散液の一時的な調製のための滅菌粉末を含む。このような媒体及び薬剤を薬学的活性のために使用する物質は、当分野において既知のものである。

任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物に対して適合性を有しない場合を除いて、それを本開示の薬物組成物に用いることを考慮してもよい。補足的な活性化合物を組成物にドープしてもよい。

治療用組成物は、通常、無菌で、実質的に等張性を有し、且つ生産及び貯蔵条件で安定したものでなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として調合されてもよい。該キャリア剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒体であってもよい。適切な流動性は、（例えば）コーティング（例えば、レシチン）の使用によって維持されてもよく、分散液の場合には所望の粒子サイズの維持によって維持され、且つ界面活性剤の使用によって、維持される。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムが含まれることが好ましい。例えば、モノステアレート及びゼラチンのような吸収遅延薬剤を組成物に含有させることによって、これらの注射用組成物の長期吸収を実現させることができる。

滅菌注射溶液は、所望の量の一つ又は複数の本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体を、必要に応じて、適切な溶媒と上に列挙した成分の一つ又は複数との組合せと共にドープし、次いで、滅菌精密濾過（例えば、滅菌濾過膜による濾過）を行うことによって調製されてもよい。通常、分散液は、活性化合物を無菌媒体にドープすることによって調製され、該無菌媒体は、基本分散媒体及び上に列挙したものからの他の所望の成分を含む。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥と凍結乾燥（凍乾）であり、該方法は、その前の滅菌濾過溶液から、活性成分と任意の他の所望の成分の粉末を生成する。

当分野の既知の医療装置を用いて治療性組成物を投与することもできる。例えば、本発明の治療組成物は、針のない皮下注射装置、例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４又は４，５９６，５５６号に開示されている装置と共に投与されてもよい。本開示に用いることができるインプラントとモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分配するための植え込み型マイクロ輸液ポンプを開示した米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬物を投与するための治療装置を開示した米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示した米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流量の植え込み可能な注入機器を開示した米国特許第４，４４７，２２４号、マルチコンパートメントを有する浸透性薬物送達システムを開示した米国特許第４，４３９，１９６、及び浸透性薬物送達システムを開示した米国特許第４，４７５，１９６が挙げられる。多くのこのようなインプラント、送達システム及びモジュールが知られている。

治療用組成物について、本開示の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側と舌下を含む）、直腸、膣内及び／又は非経口投与に適したそれらの製剤を含む。これらの製剤は、単位剤形で好都合に存在してもよく、且つ薬学分野で既知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を生成するためにキャリア剤材料と組み合わせることができる抗体又は抗体誘導体の量は、治療される被験体と特定の投与方式に応じて変わる。単一剤形を生成するためにキャリア剤材料と組み合わせることができる抗体又は抗体誘導体の量は、通常、治療効果をもたらす組成物の量である。通常、該量は、パーセンテージで、約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％、又は約１％から約３０％の活性成分である。

本開示の組成物の局所投与又は経皮投与のための剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液、パッチ剤及び吸入剤が挙げられる。活性化合物を、滅菌条件で、薬学的に許容されるキャリア剤及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合してもよい。

「非経口投与」及び「非経口による投与」という語句は、通常、注射による、経腸投与と局所投与以外の投与モードを指し、且つ静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射と注入を含むが、それらに限らない。

これらの薬物組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、及び様々な抗菌剤と抗真菌剤、例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含み、それによって確保され得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどをこれらの組成物に含ませることも望ましい場合がある。さらに、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムとゼラチンを含み、それによって注射可能な薬物形式の持続的な吸収を引き起こすことができる。

いくつかの実施例において、本開示の抗体又は抗体誘導体を薬物としてヒト及び動物に投与する場合、それらは、単独で、又は薬学的に許容されるキャリア剤と組み合わせて、薬物組成物として投与することができ、該薬物組成物は、例えば、約０．０１％～約９９．５％（又は約０．１％～約９０％）の抗体又は抗体誘導体を含む。

５．製品
現在開示されるテーマは、上記障害の治療、予防及び／又は診断に用いられる材料を含む製品をさらに提供する。

いくつかの実施例において、製品は、容器と、容器上の又は容器に関連するラベル又は包装インサートとを含む。好適な容器の非限定的な例としては、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、様々な材料（例えば、ガラス又はプラスチック）により形成されてもよい。容器は、（それ自体、又は別の組成物との組み合わせで）疾患を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。

いくつかの実施例において、組成物における少なくとも一つの活性剤は、本開示の抗体又は抗体誘導体である。ラベル又は包装インサートは、組成物が選択された病症の治療に使用されることを指示することができる。

いくつかの実施例において、該製品は、（ａ）本開示の抗体又は抗体誘導体を含む組成物が入れられた第１の容器と、（ｂ）他の細胞傷害又は治療剤を含む組成物が入れられた第２の容器とを含んでもよい。いくつかの実施例において、製品は、組成物が特定の病症の治療に使用され得ることを指示する包装インサートをさらに含んでもよい。

代替的に又は付加追加的に、製品は、別の容器、例えば、第２又は第３の容器をさらに含んでもよく、それは、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含むが、それらに限らない。該製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。

配列表

以下の例は、本開示のテーマに関する説明だけであり、いかなる方式で限定のためのものと見なされるべきではない。

例
例１．抗ＧＰＣ３ＶＨＨ抗体の産生及びスクリーニング
Ｃ末端ポリヒスチジンタグ又はＦｃタグで組換えヒトＧＰＣ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質の抗原を構築し、内部で精製した。最終体積が２ｍｌである１ｍｇ免疫原及びＣＦＡ／ＩＦＡアジュバントの混合物を用い、ＧＰＣ３ＥＣＤ－Ｈｉｓを用いてラマに対して免疫接種を行った。免疫前及び５２日目の時点で試験血液から得られた血清を用いて、血清力価及びＧＰＣ３特異性抗体の存在をＥＬＩＳＡによって確認した。そして、全血を収集し、ＰＢＭＣを単離した。そして、ＰＢＭＣから全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素第１の鎖ｃＤＮＡ合成キット（サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）＃１８０９１０５０）を用いて、全ＲＮＡから抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成した。ＶＨ及びＶＨＨ抗体遺伝子の可変領域を、標準方案を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡから増幅し、Ｖセグメントでアニーリングしたフォワードプライマー、並びにＩｇＧ１、２及び３のラマ抗体アイソタイプのＣＨ２領域でアニーリングしたリバースプライマーを用いた。ＩｇＧ２及びＩｇＧ３ラマ抗体からのＶＨＨ遺伝子をゲル抽出によって単離した。二次ネステッドＰＣＲを行って、ゲル精製されたＶＨＨ遺伝子のＶセグメントを増幅し、制限酵素部位５′及び３′を添加して、ファージミドベクターｐＡＤＬ－２３ｃ（抗体設計実験室）にクローニングした。連結されたＤＮＡをＴＧ１エレクトロコンピテント（Ｌｕｃｉｇｅｎ）セル（６０μＬのＴＧ１細胞に１．２μｇのＤＮＡ）に形質導入した。形質導入を１０回繰り返し、１０^８－１０^９個のライブラリーサイズになった。２％グルコース及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有する２ｘＹＴ培地に形質導入物を分散させ、３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、細菌をプレートから掻き落とし、合わせて－８０℃の１５％グリセロール２ｘＹＴ中に貯蔵した。

抗ＧＰＣ３特異性ＶＨＨ抗体を同定するために、ヘルパーファージの存在下で、形質導入されたＴＧ１細胞を２ｘＹＴ培地で培養し、一晩インキュベートした。細胞培養物上澄み液におけるファージを遠心分離によって収穫し、前述のように溶液相パニングを用いてヒトＧＰＣ３抗原結合物のパニングを行った（Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２６（１９９２），ページ８８９、Ｖａｕｇｈａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．［自然生物技術］，１４（１９９６），ページ３０９）。パニング前、Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ形態のＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（サーモフィッシャー社＃Ａ３９２５８）でＧＰＣ３－Ｈｉｓをビオチン化した。そして、ビオチン化されたヒトＧＰＣ３を、ストレプトアビジンにカップリングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（サーモフィッシャー社＃１１２０６Ｄ）にコーティングした。一回のパニング後、ＧＰＣ３の結合物を溶出させ、それをＳＳ３２０細胞の感染に使用した。ＳＳ３２０細胞のコロニーを選択し、Ｙ２Ｔ培地で培養し、ＩＰＴＧを添加してＶＨＨ抗体を分泌した。組換えヒトＧＰＣ３コーティングプレートを用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＶＨＨ抗体を有する上澄み液をスクリーニングした。陽性ヒトＧＰＣ３結合物を選んで配列決定した。組換えヒトＣ末端ＧＰＣ３及びカニクイザルＧＰＣ３タンパク質に対して追加のＥＬＩＳＡスクリーニングを行うために、異なる配列を有するクローンを選んだ。Ｃ末端ＥＣＤは細胞膜により良く付着しているが、Ｎ末端ＥＣＤは開裂され細胞表面から除去される可能性がより高いため、Ｎ末端ＥＣＤに比べて、Ｃ末端ＥＣＤの結合物は優れていた（図１Ａ）。

標準的な方法を用いて、プレート結合ＧＰＣ３タンパク質でＥＬＩＳＡアッセイを行った。簡単に言えば、室温で、１μｇ／ｍＬ組換えヒトＧＰＣ３－Ｆｃ、ＧＰＣ３Ｈｉｓ、ＧＰＣ３Ｃ末端（ＬＳＢＩＯ＃ＬＳ－Ｇ１３１５７－１０）又はカニクイザルＧＰＣ３－Ｈｉｓ（アンディーバイオテクノロジー（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ））とＰＢＳ中で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ高結合（ＣｏｓｔａｒＨｉｇｈＢｉｎｄｉｎｇ））をコーティングした。そして洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）でプレートを四回洗浄し、室温で５％牛乳のＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄した後、細菌上澄み液を加え、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄し、そして室温で、抗ｃ－Ｍｙｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ジャクソン免疫研究社（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、１：１０，０００希釈度）と３０分間インキュベートした。ファージＥＬＩＳＡの場合、ＰＢＳＴ中で１：１０００で希釈された抗Ｍ１３ｍＡｂ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）を室温で３０分間加えた。５回洗浄した後、各ウェルに５０μｌの３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン溶液（１－Ｓｔｅｐ^（商標）ＴｕｒｂｏＴＭＢ、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）を加え、室温で１０分間インキュベートし、５０μｌの１Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍ位置の吸光度を測定した。二つのトップクローン１Ｂ０１及び４Ｆ２を選択してさらに試験した。

インビトロ抗原結合を評価するために、ＶＨＨ二価キメラ抗体を設計した。ラマ－ヒトキメラ二価を形成するために、ヒトＩｇＧ１ＦｃをＶＨＨのＣ末端に融合させた（ＶＨＨ－Ｆｃ、図１Ｂ）。得られたコンストラクトをＥｘｐｉ－ＣＨＯ過渡系で発現させ、内部で精製した。簡単に言えば、遠心分離によって細胞培地を清澄化し、そして０．２ｕｍのフィルタで無菌濾過を行った。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＧＥのＭａｂｓｅｌｅｃｔ）を用いて、清澄化された収穫物を精製した。溶出したタンパク質を、１ＭＴｒｉｓを用いてｐＨ８．５からｐＨ５．５まで中和した。参照抗ＧＰＣ３ＶＨＨ抗体ＨＮ３は、米国国立衛生研究院により開発され、国際公開番号ＷＯ２０１２１４５４６９Ａ１に開示された。ＨＮ３の二価ＶＨＨ－Ｆｃ形態は、対照抗ＧＰＣ３ＶＨＨ抗体として、内部で製造された。

図２は、フローサイトメトリーによる、二つのトップＶＨＨ－ＦｃクローンとＨｅｐＧ２肝癌細胞株との結合能を示した。ＨｅｐＧ２肝癌細胞は、ＧＰＣ３を内因的に発現した。ＨＮ３ＶＨＨ－Ｆｃを陽性対照として用いた。クローン１Ｂ０１は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞株に対する最適な結合活性を示すため、ヒト化及びさらなる特徴付けのために選択された。

例２．ヒト化抗ＧＰＣ３ＶＨＨ－Ｆｃ二価抗体の産生
ＶＨＨ遺伝子は、ＦＲ２におけるいくつかの重要なアミノ酸置換、即ちＶａｌ３７→Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｇｌｙ４４→Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５→Ａｒｇ及びＴｒｐ４７→Ｇｌｙ（Ｋａｂａｔ番号）を除いて、ＩＩＩ族のヒトＶＨ３ファミリーと非常に相同である。１Ｂ０１抗体をヒト化するために、上記２つの重要な残基に加えて、フレームワーク１、２、３及び４における「非ヒト」残基を、最も近いヒトＶＨ配列に置換した。開示されたＩｇＧｂｌａｓｔ、Ａｂｙｓｉｓ及びＩＭＧＴデータベースから、１Ｂ０１可変領域に対して相同性検索を行った。その結果、ＩＧＨＶ３－６４＊０４を用いた。ヒト化１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃコンストラクトを発現ベクター（ＥＭＤミリポア（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）社からのＡＳ－ｐｕｒｏ）にクローニングし、ＥｘｐｉＣＨＯの一過性トランスフェクションによって抗体タンパク質を産生し、タンパク質Ａによって精製した。上記ＨＮ３類似体を陽性対照として用いた。

１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃと様々な形態のＧＰＣ３タンパク質との結合能は図３Ａ～３Ｄに示すとおりである。まず、ＨＮ３類似体に比べて、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ及びその非フコシル化形式（ＡＦ）は、ヒトＧＰＣ３タンパク質とのより強い結合を示した（図３Ａ）。なお、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ及びその非フコシル化形態（ＡＦ）はいずれもカニクイザルＧＰＣ３タンパク質に結合するが、ＨＮ３類似体はカニクイザルＧＰＣ３タンパク質とのいかなる結合も示さなかった（図３Ｂ）。対照的に、ＨＮ３はマウスＧＰＣ３タンパク質に結合するが、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ及びその非フコシル化形態（ＡＦ）はマウスＧＰＣ３タンパク質とのいかなる結合も示さなかった（図３Ｃ）。なお、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ及びその非フコシル化形態（ＡＦ）はＧＰＣ３のヒトＣ末端ＥＣＤとの強い結合を示したが、ＨＮ３はＧＰＣ３のＣ末端ＥＣＤに結合せず（図３Ｄ）、１Ｂ０１及びＨＮ３がＧＰＣ３の異なる領域に結合することを示した。該結果は、前の報告と一致し、ＨＮ３が、ＧＰＣ３のＮ末端及びＣ末端ドメインにより形成された立体構造エピトープに結合することを示した（ＷＯ２０１２１４５４６９Ａ１を参照されたい）。Ｎ末端ドメインがいくつかの生理的条件で開裂され細胞表面から除去され得るため、抗原結合にＮ末端ドメインを必要とする抗体（例えば、ＨＮ３）に比べて、Ｎ末端ドメインに依存せず抗原結合を行う抗体（例えば、１Ｂ０１）は、より良い腫瘍標的化能力を有し得る。

例３．抗ＧＰＣ３抗体１Ｂ０１のインビトロ特徴付け
抗ＧＰＣ３抗体１Ｂ０１の結合活性を評価するため、フローサイトメトリーによって、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３ヒト肝癌細胞株（ＡＴＣＣから購入）に対する抗体の濃度依存性結合を測定し、各細胞株はいずれもＧＰＣ３を内因的に発現する。これらの細胞は、１０％ＦＢＳが補充されているＥａｇｌｅ最小基礎培地（ＥＭＥＭ）中で単層の形態で増殖した。１ｘＰＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）で細胞を二回洗浄し、予熱された（３７℃）０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液と５～７分間インキュベートした。細胞が単離した場合、１０％ＦＢＳ含有完全増殖培地の４倍容積分を加え、１ｘ１０個の細胞／ｍＬでＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）においてピペッティングし細胞を軽く再懸濁することによってトリプシンを中和した。適切な濃度まで希釈された抗ＧＰＣ３抗体を加え、氷上で３０分間反応させた。精製抗体に対して３倍連続希釈（合計８回の希釈）を行い、初期濃度が１００ｎＭであった。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を一回洗浄し、氷上でヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ－Ａｌｅｘａ４８８（ジャクソン免疫化学社（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を加えて、３０分間検出した。インキュベート後、細胞を１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去した。細胞を１００μＬＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、フローサイトメトリーを行った。ＣｙｔｏＦｌｅｘ（ベックマン・コールター社（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ））をフローサイトメトリーとして用いた。

図４Ａ及び４Ｂに示すように、抗ＧＰＣ３抗体１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ及びＨＮ３ＶＨＨ－Ｆｃは、いずれもＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞株に投与量依存的に結合した。１Ｂ０１はＨｅｐＧ２細胞とのより強い結合を示したが、１Ｂ０１及びＨＮ３はＨｅｐＧ２細胞との類似した結合を示した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞に比べて、ＨｅｐＧ２細胞がより高いレベルのＧＰＣ３を発現するため、このような違いはアビディティに起因する。

なお、１Ｂ０１が、ヒト肝癌細胞株に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こす能力をさらに評価した。簡単に言えば、勾配遠心分離によって、ヘパリン化血液サンプルからヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）を単離した。ＢＡＴＤＡビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２」－トリピリジン－６，６」－ジカルボキシレート）ＤＥＬＦＩＡ試薬（解離増強ランタニド蛍光免疫アッセイ、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を用いて、３７℃で１×１０^６個の細胞／ｍｌの密度で標的細胞ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞を３０分間標識し、そして増殖培地で洗浄し、１ウェルあたり５×１０^３個の細胞の細胞密度で接種した。標的細胞を、四つの健康なドナーからのｈＰＢＭＣと共培養し、エフェクターと標的（ＥＴ）との比率が４０倍であった。３７℃で二時間インキュベートした後、ＶａｒｉｏｓｋａｎＬＵＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、時間分解蛍光（ＴＲＦ）によって標的細胞溶解を測定した。抗ＣＤ２０抗体を陰性対照として用いた。

図５に示すように、対照に比べて、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ、そのフコシル化形態（ＡＦ）及びＨＮ３ＶＨＨ－Ｆｃは、いずれも投与量依存性腫瘍溶解を示し、且つＨＮ３類似体に比べて、二つの形態の１Ｂ０１は、低い濃度で、いずれもより強い腫瘍溶解を示した。

例４．抗ＧＰＣ３抗体１Ｂ０１のインビボ抗腫瘍効果
異種移植マウスモデルを用いて、１Ｂ０１のインビボ抗腫瘍効果を測定した。１００μｌＰＢＳ培地及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））（１：１の比率）を含有する溶液中で、５ｘ１０^６個の細胞／ｍＬでＨｅｐＧ２細胞と調製し、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（楽斯科生物科技股▲フン▼有限公司（Ｂｉｏｌａｓｃｏ）、中国台湾台北）の両側の脇腹に皮下移植した。研究が完了するまで、腫瘍を週に二回観察し測定した。腫瘍体積をＴＶ＝０．５ａ×ｂ^２に定義し、ここで、ａは腫瘍の長径であり、ｂは腫瘍の短径である。７～８日目に治療を開始し、この時点で平均腫瘍体積は１５０ｍｍ^３に達した（各群ｎ＝８匹のマウス）。抗体及びビヒクル（食塩水溶液）を週に二回、合計六剤腹膜内投与した。

図６に示すように、２．６ｍｇ／ｋｇの相対的低い投与量下で、ビヒクル対照群に比べて、１Ｂ０１による処理は腫瘍体積を減少させた。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）率は約３０％であった。対照的に、ビヒクル対照群に比べて、同じ投与量のＨＮ３による処理は、腫瘍体積の減少を示さなかった。１Ｂ０１及びＨＮ３は、いずれもはるかに高い投与量下で腫瘍増殖を阻害することができる（データが示されていない）が、低い投与量での結果により、治療的抗体が腫瘍微小環境において高濃度に達しにくい固形腫瘍において、ＨＮ３類似体に比べて、１Ｂ０１は強化された抗腫瘍効果を有し得ることが示された。

例５．ＧＰＣ３及び４－１ＢＢを標的化する二重特異性抗体の産生
４－１ＢＢは、Ｔ細胞上に発現する共刺激受容体である。４－１ＢＢシグナル伝達によって、サイトカイン分泌及び細胞傷害Ｔ細胞の活性を強化するとともに、活性化によって誘導される細胞死及び制御性Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を減少させることができる。４－１ＢＢアゴニスト抗体によって該受容体を活性化してヒト腫瘍負荷を低下させる試みは、腫瘍外毒性及び／又は有効性の欠如によって阻害される。臨床研究では、ＢＭＳにより開発されたアゴニスト抗４－１ＢＢ抗体であるウリルマブは、最初の第Ｉ相試験において許容可能な副作用を示したが、後続の第ＩＩ相試験において患者の約１０％に重篤な肝毒性が認められ、結果として２人の死亡に至った。例えば、Ｙｏｎｅｚａｗａ，Ａ．らＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ［臨床癌研究］，２１（１４）；３１１３－３１２０（２０１５）を参照されたい。対照的に、ファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ）により開発されたアゴニスト抗４－１ＢＢ抗体ウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）は、１０ｍｇ／ｋｇまでの投与量で完全であるが、臨床効果が不十分である。例えば、Ｇｏｐａｌら，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ［臨床癌研究］．２０２０年６月１日；２６（１１）：２５２４－２５３４を参照されたい。

なお、４－１ＢＢアゴニスト抗体によるＴ細胞共刺激は、クラスタ４－１ＢＢに腫瘍標的化機能を付加することによって、腫瘍部位へのその作用を制限することから利益を得ることができる。このような機構は、抗体が生理的４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をシミュレートすることを可能にし、強化された４－１ＢＢシグナル伝達及び腫瘍阻害を引き起こした。これに基づいて、ＧＰＣ３及び４－１ＢＢを標的化する二重特異性抗体を設計した。

図７に示すように、抗ＧＰＣ３／４－１ＢＢ二重特異性分子を産生するように、ショートペプチドリンカーによって１Ｂ０１ＶＨＨ抗体を、前に中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０１２８２９０．３に記述されているアゴニスト抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（クローン２－９変異体）と融合させた。得られたコンストラクト（１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ変異体）をＣＨＯ－Ｓ細胞に発現し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥＭａｂｓｅｌｅｃｔ）及び第２段階アフィニティーカラム（ＣａｐｔｏＳＰ）によって均一まで精製した。ＳＤＳゲル、サイズ排除及びマススペクトルによって最終生成物を分析した。以下の例は、例示的１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体（１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ－２）のインビトロ及びインビボ機能を記述している。

例６．ＧＰＣ３及び４－１ＢＢを標的化する二重特異性抗体のインビトロ特徴付け
フローサイトメトリーを用いて、試験抗体の抗原結合特異性及び親和性を測定した。細胞膜に４－ｌＢＢを外因的に発現するように、ヒト、カニクイザル又はマウス４－ｌＢＢタンパク質を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＭｏＦｌｏ選別機（ベックマン社（Ｂｅｃｋｍａｎ））で安定的な高発現集団を選別し、５００μｇ／ｍＬＧ４１８を含有するＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清に維持した。試験抗体を１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３及び０．００６４ｎＭ（５０ｕＬ／ウェル、一重項）でアッセイプレートの適切なウェルに加えた。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を一回洗浄し、氷上でヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ－Ａｌｅｘａ４８８（ジャクソン免疫化学社）を加えて、３０分間検出した。インキュベート後、細胞を１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去した。細胞を１００ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁させ、フローサイトメトリーを行った。ＣｙｔｏＦｌｅｘ（ベックマン・コールター社）をフローサイトメトリーとして用いた。米国特許第７，２８８，６３８号に開示された抗体配列に基づいて、内部でウリルマブ類似体を合成した。

図８Ａに示すように、親抗４－１ＢＢ単一特異性抗体（クローン２－９）及びウリルマブ類似体に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体は４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との類似した結合を示したが、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ抗体は、これらの細胞がＧＰＣ３を発現しないため、同じ細胞との著しい結合を示さなかった。図８Ｂに示すように、１Ｂ０１ＶＨＨ－Ｆｃ抗体に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体はＨＥＰＧ２細胞との類似した結合を示したが、ＩｇＧ１陰性対照抗体（抗ＲＳＶタンパク質Ｆ抗体）は同じ細胞との著しい結合を示さなかった。

二重特異性抗体がＧＰＣ３に結合する時の４－１ＢＢシグナル伝達を測定するために、ヒト４－１ＢＢ依存性ＮＦ－κＢレポーター細胞株を産生した。ＮＦ－κＢ応答エレメントの制御下で全長ヒト４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する組換えＨＥＫ２９３細胞株を内部で産生した。レポーター細胞を、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）ＡＴＣＣ^{（登録商標）} ３０－２００２^（商標））、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１０ｕｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ^（商標）ピューロマイシン二塩酸塩）及びペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ^（商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）中で培養し、３７℃及び５％ＣＯ_２で保持した。

１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体が、ＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を特異的に活性化する能力を試験するために、４－１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３レポーター細胞株を、ＳＫＨＥＰ１細胞又はＧＰＣ３トランスフェクトＳＫＨＥＰ１細胞（ＳＫＨＥＰ１－ＧＰＣ３）細胞と共培養した。まず、ＳＫ－Ｈｅｐ１又はＳＫ－Ｈｅｐ１－ＧＰＣ３腫瘍細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁させ、１００μＬの体積で９６ウェルプレート（５０，０００個の細胞／ウェル）のウェルに転移した。翌日、増殖培地を除去し、３７℃で様々な抗体の連続希釈液で３０分間処理し、そして過剰な抗体を除去し、フック効果を回避するように、抗体を洗い流した。続いて、４－１ＢＢを発現する３０，０００個のＨＥＫ２９３レポーター細胞／ウェルを５０ｕｌのフェノールレッドＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳに再懸濁させ、各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。インキュベート後、８０μＬの再構成されたＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（プロメガ社）をプレートのウェルに加え、穏やかなピペッティングによって混合し、室温で５分間インキュベートした。そしてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ））によって発光を読み取った。

図９Ａに示すように、ＧＰＣ３を発現しないＳＫＨＥＰ１細胞の存在下で、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体及び抗４－１ＢＢ単一特異性抗体（クローン２－９）は、いずれも１００ｎＭより低い任意の濃度で４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢレポーター遺伝子を著しく活性化することができなかった。対照的に、図９Ｂに示すように、ＧＰＣ３トランスフェクトＳＫＨＥＰ１細胞の存在下で、親抗４－１ＢＢ単一特異性抗体に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体は、はるかに低い濃度で４－１ＢＢ／ＮＦ－κＢレポーター遺伝子を活性化することができる。その結果、抗４－１ＢＢ単一特異性抗体に比べて、腫瘍抗原との結合は、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体のために、４－１ＢＢシグナルを活性化する強化された能力を提供し、且つ抗４－１ＢＢ単一特異性抗体に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＧＰＣ３陽性腫瘍細胞に対してより強く、より特異的な抗腫瘍効果を示したことが明らかになった。

例７．１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍効果及び毒性
後期重症免疫不全（ＡＳＩＤ）マウスモデルにおいて、ＨｅｐＧ２肝癌腫瘍細胞（ＧＰＣ３を内因的に発現する）及びヒトＰＢＭＣを用いて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を試験した。メスＡＳＩＤマウスは、国家実験動物センター（ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒ（ＮＡＬＣ）、中国台湾台北）から入手され、温度及び無菌環境に置かれたケージ中に飼育され、水及び餌を自由に得ることができる。ＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳに懸濁させ、５ｘ１０^６個の細胞／ｍＬで、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤバイオサイエンシズ）を含有する溶液において１：１の比率で調製し、マウス（楽斯科生物科技股▲フン▼有限公司、中国台湾台北）の両側の脇腹に皮下移植した。７～８日目に治療を開始し、この時点で平均腫瘍体積は１００ｍｍ^３に達した（各群ｎ＝８匹のマウス）。二重特異性抗体の抗４－１ＢＢ部分がマウス交差反応性を有しないため、動物モデルにおいて、ヒトＰＢＭＣを用いて、ヒト４－１ＢＢを発現する免疫細胞を提供した。ヒトＰＢＭＣをＡＳＩＤ動物に移植するために、まずマウスを放射線照射し、そしてヒトＰＢＭＣを静脈内注射した。末梢血中の２５％超のヒトＰＢＭＣは、移植後に３週間以上持続した。１０ｍｇ／ｋｇの１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体、関連性のない抗体及び抗４－１ＢＢ抗体を含む対照二重特異性抗体又は食塩水対照（ビヒクル）を、週に二回、合計５剤腹腔内注射した。研究が完了する（４週）まで、腫瘍を週に二回観察し測定した。腫瘍体積をＴＶ＝０．５ａ×ｂ^２に定義し、ここで、ａは腫瘍の長径であり、ｂは腫瘍の短径である。

図１０に示すように、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体はＨｅｐＧ２腫瘍の増殖を阻害するが、対照抗体ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体はそうせず、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体がＧＰＣ３＋腫瘍に対して特異的抗腫瘍作用を有することを示した。

１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を確認するために、ＣＴ２６腫瘍細胞又はＧＰＣ３トランスフェクトＣＴ２６腫瘍細胞（ＣＴ２６－ＧＰＣ３）を担持する同系モデルを用いた。１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢを、前に記述した強力な４－１ＢＢアゴニスト抗体であるウリルマブ類似体と比較した。１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ及びウリルマブがいずれもマウス交差反応性を有しないため、本研究は、ヒト４－１ＢＢノックインマウス（ＨｕＧＥＭＭｈＣＤ１３７ＫＩマウス、集萃薬康生物科技股▲フン▼有限公司（ＧｅｍｐｈａｒｍａｔｅｃｈＣｏ，Ｌｔｄ．）、中国南京）を用いた。ＣＴ２６又はＣＴ２６－ＧＰＣ３腫瘍細胞を、５ｘ１０^５個の細胞／ｍＬで、１００μｌＰＢＳ培地を含有する溶液において調製し、マウス（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、北京）の右後ろ脇腹部に皮下移植した。平均腫瘍サイズが７９．０３ｍｍ^３に達した場合にランダム化を行ってもよい。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスにウリルマブ類似体を投与し、ＣＴ２６－ＧＰＣ３腫瘍を有するマウスに１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体及びアイソタイプ対照抗体を投与した。ランダム化は「マッチング分布」方法／「階層化」方法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ^ＴＭソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）／乱塊法に基づいて行われた。ランダム化後、腫瘍体積をノギスで週に３回二次元的に測定し、ｍｍ^３で式Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２により体積を表し、ここで、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長さ（最長腫瘍サイズ）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最長腫瘍サイズ）である。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ^ＴＭソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を用いて、体重及び腫瘍体積を測定した。抗体を、週に二回、合計五剤腹膜内投与した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、抗腫瘍活性の指標であり、ＴＧＩ（％）＝１００ｘ（１－Ｔ／Ｃ）のように計算された。Ｔ及びＣはそれぞれ、処理群及び対照群の指定日の平均腫瘍体積（又は重量）である。腫瘍が３０００ｍｍ^３を超えた任意のマウスを、標準的なアニマルウェルフェアプログラムに応じて屠殺した。

肝臓の肝毒性を評価するために、メーカーの指示に従って、ＡＬＴ／ＧＰＴ酵素的測定キット（ＢｉｏＳｉｎｏ、中国北京）を用いて、血液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した。抗体処理開始後１４、１７日目に、マウスを瀉血し、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定した。最後の抗体は１２日目に投与された。毒性を評価するために、処理中に体重増加も評価した。

図１１Ａに示すように、対照群に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体及びウリルマブ類似体は、いずれも著しい腫瘍増殖阻害を示した。しかしながら、ウリルマブ類似体に比べて、１Ｂ０１ｘ４１ＢＢ二重特異性抗体処理は、対照群に比べて、血液中のＡＬＴレベルの増加を明らかに低下させた（図１１Ｂ、ＩｇＧ４を対照とし、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ及びウリルマブ類似体で処理したマウスの平均ＡＬＴレベルは、それぞれ２２．００Ｕ／Ｌ、３０．７１Ｕ／Ｌ及び４１．８６Ｕ／Ｌである）。なお、ウリルマブ類似体に比べて、１Ｂ０１ｘ４１ＢＢ二重特異性抗体処理は、対照群に比べて、体重増加（図１１Ｃ）の低下をわずかにした。結果により、ウリルマブ類似体に比べて、１Ｂ０１ｘ４－１ＢＢ二重特異性抗体は、毒性が著しく低下したとともに、腫瘍負荷の低減にも同様に有効であることが示された。

図示及び特許請求された様々な実施例に加えて、開示されたテーマは、本明細書によって開示されて特許請求された特徴の他の組み合わせを有する他の実施例をさらに対象とする。このように、本明細書で提示される特定の特徴は、開示されるテーマが本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含むように、開示されるテーマの範囲内で他の方法で互いに組み合わせられてもよい。開示されたテーマの特定の実施例の上記の説明は、例示及び説明の目的で提供されている。上記の説明は、網羅的であること、又は開示されたテーマを開示されたそれらの実施例に限定することを意図していない。

開示されたテーマの精神又は範囲から逸脱することなく、開示されたテーマの構成と方法に対する様々な修正と変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。そのため、開示されたテーマは、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある修正と変更を含むことが意図される。

様々な刊行物、特許、及び特許出願が、本明細書に援用され、その内容は全体として参照により組み込まれる。

Claims

ＧＰＣ３及び４－１ＢＢに結合する多重特異性抗体であって、
ｉ）ＧＰＣ３に結合する単一ドメイン抗体を含有する抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）４－１ＢＢに結合する抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分とを含む、多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体はＶＨＨを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体又は該ＶＨＨは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、１ｘ１０^－７Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、５ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、１ｘ１０^－８Ｍ又はより小さいＫＤでＧＰＣ３に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、約１ｘ１０^－１０Ｍ～約５ｘ１０^－８ＭのＫＤでＧＰＣ３に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、ＧＰＣ３への結合について、重鎖可変領域を含む参照単一ドメイン抗体と交差競合し、該重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、又は
ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１及び５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２及び６のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３及び７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列、又は最大約３つのアミノ酸置換を含む該アミノ酸配列の変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここで、該ＣＤＲ１ドメイン、該ＣＤＲ２ドメイン及び該ＣＤＲ３ドメインは、それぞれ参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号４、８及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号４、８及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、参照抗４－１ＢＢ抗体と交差競合する抗４－１ＢＢ抗体を含み、該抗体は、
ａ）（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又は、
ｂ）（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号６７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、配列番号７７に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号７８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該抗４－１ＢＢ抗体は、ヒト化抗体を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分は、抗４－１ＢＢ抗体を含み、該抗体は、二本の抗体重鎖と、二本の抗体軽鎖とを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第１の抗原結合部分は、一つ又は複数の抗ＧＰＣ３抗体を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第１の抗原結合部分は、二つの抗ＧＰＣ３抗体を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの各本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項２８に記載の多重特異性抗体。
二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該二本の抗４－１ＢＢ軽鎖のうちの各本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項３０に記載の多重特異性抗体。
二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの各本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項３２に記載の多重特異性抗体。
該二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該二本の抗４－１ＢＢ重鎖のうちの各本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＧＰＣ３抗体に連結される、請求項３４に記載の多重特異性抗体。
該第１の抗原結合部分は、リンカーを介して該第２の抗原結合部分に連結される、請求項１～３５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項３６に記載の多重特異性抗体。
該ペプチドリンカーは、約４～約３０個のアミノ酸を含む、請求項３７に記載の多重特異性抗体。
該ペプチドリンカーは、配列番号１６～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７又は３８に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分の抗４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該第２の抗原結合部分の抗４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む、請求項４０又は４１に記載の多重特異性抗体。
該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆの突然変異を含む、請求項４３に記載の多重特異性抗体。
該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
該ＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む、請求項４４に記載の多重特異性抗体。
該多重特異性抗体は、二重特異性抗体である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号５１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号５３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号５４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号５５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号５６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ｉ）単一ドメイン抗ＧＰＣ３抗体を含む第１の抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体を含む第２の抗原結合部分であって、該抗体は、（１）配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む第２の抗原結合部分とを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
配列番号８１に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
配列番号８２に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
配列番号８３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む、抗ＧＰＣ３抗体に連結される抗４－１ＢＢ抗体重鎖と、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含む抗４－１ＢＢ抗体軽鎖とを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
免疫コンジュゲートであって、治療剤に連結される請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む、免疫コンジュゲート。
該治療剤は、細胞毒素である、請求項５４に記載の免疫コンジュゲート。
該治療剤は、放射性同位体である、請求項５５に記載の免疫コンジュゲート。
薬物組成物であって、ａ）請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項５４～５６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートと、ｂ）薬学的に許容されるキャリア剤とを含む、薬物組成物。
請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸。
請求項５８に記載の核酸を含む、ベクター。
請求項５８に記載の核酸又は請求項５９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を調製する方法であって、請求項６０に記載の宿主細胞において該多重特異性抗体を発現し、該宿主細胞から該多重特異性抗体を単離することを含む、方法。
被験体の腫瘍負荷を軽減する方法であって、該被験体に、有効量の請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項５７に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
該方法は、腫瘍細胞の数を減らす、請求項６２に記載の方法。
該方法は、腫瘍サイズを小さくする、請求項６２又は６３に記載の方法。
該方法は、被験体の腫瘍を根絶する、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法。
該腫瘍は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
該腫瘍は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
癌を治療及び／又は予防する方法であって、該被験体に、有効量の請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項５７に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
癌を有する被験体の生存期間を延長する方法であって、該被験体に、有効量の請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項５７に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
該癌は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す、請求項６８又は６９に記載の方法。
該癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
薬物として用いられる、請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
癌を治療するために用いられる、請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
薬物として用いられる、請求項５７に記載の薬物組成物。
癌を治療するために用いられる、請求項５７に記載の薬物組成物。
該癌は、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す、請求項７３に記載の多重特異性抗体又は請求項７５に記載の薬物組成物。
該癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸部癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７３に記載の多重特異性抗体又は請求項７５に記載の薬物組成物。
請求項１～５３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項５７に記載の薬物組成物、請求項５８に記載の核酸又は請求項５９に記載のベクターを含む、キット。
新生物を治療及び／又は予防するためのマニュアルをさらに含む、請求項７８に記載のキット。